JP2018519818A - 肺疾患及び肺損傷を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

肺疾患及び肺損傷を治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

脂質粒子に複合体化された、又は封入されたRNA干渉（RNAi）化合物を含有する組成物が提供される。当該脂質粒子は、脂質ナノ粒子、リポソーム、又はそれらの組み合わせである。当該脂質粒子は、カチオン性脂質、リン脂質、ステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体、及び複合脂質を含有する。本発明はまた、本発明のRNAi−脂質粒子を含有する組成物を使用して、例えば肺線維症及びサルコイドーシスなどの肺疾患又は肺障害を治療する方法を提供する。当該方法は、例えばネブライザー、乾燥粉末吸入器、又は定量吸入器などの吸入送達デバイスを介して、その必要のある患者の肺に、当該RNAi組成物のうちの１つ以上を投与することを含む。
【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2015年7月9日に出願された米国仮特許出願明細書第62/190,583号の優先権の利益を主張するものであり、当該出願の内容は参照によりその全体で本明細書に援用される。
配列表に関する記載
本出願に関連した配列表は、紙の複製の代わりにテキスト形式で提供されるものであり、ここに本明細書に参照により援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、INMD_125_01WO_SeqList_ST25.txtである。テキストファイルは19kbであり、2016年7月7日に作成され、EFS-Webを介して電子的に提出される。
低分子干渉RNA（siRNA：small interfering RNA）を介したRNA干渉（RNAi：RNA interference）は、標的特異的な様式でメッセンジャーRNA（mRNA）を標的とするものであり、特定の遺伝子のサイレンシングを可能とし、標的型である（概要は図１を参照のこと）。正確なメカニズムはいまだ不明であるが、RNAiは、RNaseIII様酵素のダイサー（dicer）によって長い二本鎖RNAをsiRNAへ切断することで始まると考えられている。siRNAは通常、約17〜約30のヌクレオチド塩基対（bps）、例えば、約20〜約27bps、又は約21〜約24bpsの長さの二本鎖RNA（ds-RNA）である。一部の例においては、siRNAは、2-ヌクレオチドの3’オーバーハング及び5’リン酸塩及び3’ヒドロキシル末端を含有している。siRNAの1つの鎖が、RNA誘導型サイレンシング複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）として知られるリボヌクレオタンパク質複合体に組み込まれる。RISCはこのsiRNA鎖を使用して、当該組み込まれたsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的なmRNA分子を特定し、その後、これら標的mRNAを切断、又はその翻訳を阻害する。RISCに組み込まれるsiRNA鎖は、ガイド鎖又はアンチセンス鎖としても知られている。他方のsiRNA鎖は、センス鎖としても知られており、siRNAから除外され、標的mRNAに対し少なくとも部分的に相同である。本出願明細書の文脈において、「RNAi」又は「siRNA」という用語は、短いヘアピンRNA（shRNA）とマイクロRNA（miRNA）もまた含有する。
siRNAはすべてのmRNA標的に対し設計することができるため、これら化合物の治療応用の幅は非常に広い。siRNA化合物は臨床的に成功する可能性があるにもかかわらず、その有効性には障害がある。
siRNAは、in vivoでのヌクレアーゼ消化に感受性である。さらに、裸の状態のsiRNA構築物は、細胞膜を超えた拡散又は移送の能力が制限される。それゆえ、siRNAを取り込ませることができる送達システムが必要とされる。ウイルスベクターは、効率的に大量のsiRNAを発現することができるが、毒性と、免疫原性の問題を抱えている。さらに、これらのベクターの注入では、例えば特定の細胞型及び組織に関連した特定の疾患に対して効果を発揮する、細胞レベルでのsiRNA特異的標的化を行うことはできない。
そのため、特定の細胞型及び組織にsiRNA構築物を送達するための組成物及び方法が必要とされている。本発明は、このニーズ及び他のニーズに取り組むものである。
本発明は、脂質粒子と複合体化されたRNAi化合物、又は脂質粒子により封入されたRNAi化合物を含有する組成物を提供するものであり、この場合において当該組成物は、様々な肺細胞において、効率的な取り込みを示し、ならびに標的mRNAの発現及び／又は活性の低下を示す。
１つの実施形態において、本発明は、脂質粒子と複合体化された核酸化合物、又は脂質粒子ににより封入された核酸化合物を含有する組成物を提供し、この場合において当該脂質粒子は、以下を含有する：（a）当該組成物中に存在する総脂質の約40モル％〜約70モル％を構成するカチオン性脂質；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約55モル％を構成する中性脂質；及び（c）当該組成物中に存在する総脂質の約0.3モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質。
本発明の組成物は乾燥粉末、懸濁液、又は噴霧スプレーとして製剤化され得る。一部の実施形態において、組成物は、例えばヒドロカーボン推進剤（hydrocarbon propellant）などの推進剤をさらに含有してもよい。
本発明は、その必要のある患者における肺疾患又は肺障害を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に記載される組成物の治療有効量を患者の肺に投与することを含む。１つの実施形態において、肺疾患又は肺障害は、肺線維症である。他の実施形態において、肺疾患はサルコイドーシスである。
１つの態様によると、本発明組成物の投与によって、肺疾患又は肺障害において過剰発現されているmRNA、もしくは肺疾患又は肺障害に遺伝的に関連しているmRNAの発現及び／又は活性が下方制御される。
特定の実施形態において、本発明は、組成物及び方法を提供するものであり、この場合において当該RNAi化合物は、TNFα、COL1A1、プロリルヒドロキシラーゼ、又はアネキシンA11をコードするmRNAを標的とする。
１つの実施形態において、有効量の組成物は、吸入を介して患者の肺に投与される。
RNAi及びsiRNAの作用方式を記載している。出典https://www.scbt.com/gene_silencers.html マクロファージ及び線維芽細胞における、本発明の脂質ナノ粒子の取り込みを示す。 COL1A1の発現に対する、様々なsiRNA脂質ナノ粒子製剤の効果を示す。 siRNA脂質ナノ粒子製剤を使用した、COL1A1の発現における標的特異的低下を示す。 siRNA脂質ナノ粒子製剤を使用した、P4HA1の発現における標的特異的低下を示す。 siRNA脂質ナノ粒子製剤を使用した、ANXA11の発現における標的特異的低下を示す。 蛍光顕微鏡下での、マクロファージ及び線維芽細胞における、脂質ナノ粒子の取り込みを示す。 サルコイドーシスのin vivoマウスモデルにおける、肺線維症の誘導の概略を示す。
本発明は、部分的に、RNAi−脂質ナノ粒子組成物をその必要のある患者へ吸入送達することにより、炎症又は感染に関与する肺貪食細胞の標的化を介して限局性肺疾患の治療を行うことができるという発見に基づいている。
貪食は、例えば細菌や細胞残渣などの固形物の脈管性内部化を含むエンドサイトーシスの特定の形態である。本発明は、宿主組織の損傷又は感染に関連した貪食細胞（例えば、マクロファージ、線維芽細胞）の１つ以上により取り込まれるよう設計されたリポソーム又は脂質ナノ粒子を含有する脂質ベースの組成物を提供することにより、薬物送達ビヒクルとしての粒子を貪食する免疫系の能力を利用するものである。吸入及び取り込みを介した送達が行われると、組成物は核酸化合物を細胞に送達させ、１つ以上の標的メッセンジャーRNA（mRNA）の発現又は活性を制御する。
ヒト及び他の動物の貪食細胞は、貪食時にどのように効力を発するかによって、「プロフェッショナル」又は「非プロフェッショナル」と呼ばれる。プロフェッショナルな貪食細胞には、例えば好中球、単球、マクロファージ、肥満細胞、好酸球、好塩基球、及び樹状細胞などの多くのタイプの白血球が含まれる。貪食細胞は外来性物質に対する宿主防御の極めて重要な要素であるが、上述のように、その反応は宿主の組織損傷とも関連する場合がある。
例えば、好中球は、受容体介在性の呼吸バースト及び脱顆粒の発生に伴う炎症の誘導に関与する貪食細胞の種類である。脱顆粒は肺障害、リウマチ性関節炎、及び敗血性ショックにおいて因子として関与している。好中球の脱顆粒は、細胞内シグナル伝達経路の活性化に依存しており、当該経路は、非冗長性のシグナル伝達経路に対し選択的及び依存性であり得る（Lacy 2006, Allergy Asthma, Clin. Immuno. 2(3):98-108）。
嚢胞性線維症（CF：cystic fibrosis）の患者において、好中球は、気道上皮被覆液（ELF：epithelial lining fluid）中の炎症性細胞群のおよそ70％を占めることと比較し、正常な肺の場合の炎症性細胞群では、およそ1％である（Kellyら, 1998, Expert Opin. Ther. Targets 12, pp. 145-157）。好中球は、細菌の除去には効果が無いこと、及び例えば肺タンパク質を切断及び破壊するプロテアーゼの分泌などによって、肺の構造マトリクスの破壊に主要な役割を果たしていることが示されている。従って、疾患部位での好中球の機能を阻害することによって、CF患者に効果的な療法が提供されるであろう。
肺の貪食細胞、例えば肺の単球及び線維芽細胞は、創傷治癒ならびに侵入微生物の除去に重要な役割を果たしている。しかしながら、これら細胞の反応が制御不能な状態又は脱制御状態になると、例えば肺線維症及び／又はサルコイドーシスなどの肺障害が最終的に発症する場合がある。肺線維症は、治療に対し難治性で、死亡率の高い肺疾患である。肺線維症は、瘢痕形成により生じる肺構造の進行性で不可逆的な破壊により特徴づけられる肺障害の混成群を含み、それらは最終的には臓器機能不全、ガス交換の乱れ、及び呼吸器不全による死がもたらされる。特発性肺線維症（IPF：Idiopathic pulmonary fibrosis）は、特に重篤型の肺線維症であり、病因は判明しておらず、診断後の平均余命は2〜6年である（Wynn, JEM, 208 (7): 1339-1350, 2011。参照により本明細書にその全体が援用される）。肺線維症はまた、ウイルス感染の後、ならびに放射線治療、化学療法、及び揮発性環境毒素への暴露後にも発症する場合がある。また、慢性移植片対宿主病に罹患している一部の骨髄移植レシピエントにおいて、ならびに強皮症及びリウマチ性関節炎のような慢性炎症性疾患を有する個体の一部においても、肺線維症が発生する。現在のところ、進行性肺線維症に対し利用可能な、唯一の効果的治療は、肺移植である。損傷を受けた組織の修復は、基本的な生物的メカニズムであり、このメカニズムによって、生存にとって極めて重要なプロセスである、損傷後に死んだ細胞又は損傷を受けた細胞の秩序だった置換が可能となる。しかしながら、このプロセスが脱制御状態になると、永続的な線維性の「瘢痕」の発現が生じ得る。当該瘢痕は、組織損傷部位での細胞外マトリクス（ECM：extracellular matrix）成分（例えばヒアルロン酸、フィブロネクチン、グロテオグリカン、及び間質コラーゲン）の過剰な蓄積が特徴である。結果として、線維症又は繊維成長はしばしば、脱制御状態の創傷治癒反応と定義される。
本発明は、１つの実施形態において、肺線維症患者、例えばIPF患者における、マクロファージもしくは線維芽細胞の制御不能状態の反応または脱制御状態の反応を抑制するsiRNA組成物を提供するものである。例えば、１つの実施形態において、siRNA組成物は、以下に詳細に検討されているように、様々なタイプのコラーゲン及び／又はコラーゲン合成酵素を標的とするsiRNAを含有している。他の実施形態において、siRNA組成物は、以下に詳細に検討されているように、サイトカイン又はサイトカイン受容体siRNAを含有している。
創傷修復には４つの異なる段階がある。血栓／凝固段階、炎症段階、線維芽細胞の移動／増殖段階、そして最終的な再構成段階であり、そこで正常な組織構造が回復される。組織損傷後の最も早い段階で、上皮細胞及び／又は内皮細胞が炎症性メディエーターを放出し、それらによって抗線溶−凝固カスケードが開始され、凝固及び暫定的なECMの発現が誘導される。血小板凝集と、それに引き続く脱顆粒も同様に、血管拡張及び透過性の亢進を促進し、それによって、損傷部位への炎症性細胞（例えば、好中球、マクロファージ、リンパ球、及び好酸球）の効率的なリクルートが可能となる。好中球は、創傷治癒の最も早い段階では、最も多い炎症性細胞であるが、好中球の脱顆粒後は急速にマクロファージに取って代わられる。この初期の白血球移動段階の間、活性化マクロファージと好中球が創傷部位を切り取り、すべての侵入生物体を排除する。それらはまた、様々なサイトカインとケモカインを産生し、それらによって炎症性反応が増幅され、線維芽細胞の増殖とリクルートが誘導される。筋線維芽細胞は、局所的間葉系細胞である、骨髄前駆細胞（線維化関連細胞と呼ばれる）をはじめとする様々な源から、上皮間葉転換（EMT：epithelial-mesenchymal transition）と呼ばれるプロセスを介してリクルートされる。EMTにおいて上皮細胞は、線維芽細胞様細胞に分化形質転換する。線維芽細胞は活性化されると、ECM成分を分泌するα−平滑筋アクチン−発現筋線維芽細胞へと形質転換する。最終的に、創傷成熟／再構成段階において、筋線維芽細胞は、創傷収縮を促進する。創傷収縮は、創傷の辺縁が中心へと移動し、上皮／内皮細胞が一時的なマトリクスへと分割及び移動し損傷組織を再生させるプロセスである。線維症は、創傷が重度である場合、組織損傷刺激が持続している場合、又は修復プロセスが脱制御状態になる場合に発症する。従って、創傷治癒プロセスの多くの段階がうまく行かず、瘢痕形成の原因となってしまう可能性があり、これが肺線維症の複雑な性質の理由である。肺線維症発症に役割を果たすメカニズムの一部は、Wynn, JEM, 208(7): 1339-1350, 2011；及びToddら, Fibrogenesis & Tissue Repair, 2012, 5(11)に検討されており、それら両文献とも、参照により本明細書にその全体で援用される。
サルコイドーシスは、多系統の免疫障害であり、身体中、特に肺内、眼内、及び皮膚内において、類上皮肉芽腫の形成を生じさせる。罹患した個体の免疫系は、細胞数及び細胞シグナル伝達に著しい変化を示し、肺においてはCD3及びCD4陽性T細胞が増加する。サルコイド肺内の活性化T細胞もまた、インターロイキン-2受容体（IL-2R）をはじめとする数種のサイトカイン受容体を過剰発現していること、ならびにインターロイキン-2及びインターフェロン-γ（IFNγ）をはじめとするサイトカインの産生量が増加していることが示されている。さらに、単球及びマクロファージは、サルコイド肉芽腫の形成に深く関与しており、免疫反応をさらに増強させる広範なサイトカインも分泌する。例えば肺胞マクロファージは、T細胞増殖を誘導することが示されている腫瘍壊死因子α（TNFα）、及びインターロイキン-15を分泌する。そこで、本発明は、サルコイド肺中に存在する単球及びマクロファージにより取り込まれることができるsiRNA組成物の吸入を介したサルコイドーシスの治療を提供するものである。
本明細書に提示されるsiRNA組成物は、ヌクレアーゼ消化からsiRNAを保護し、肺貪食細胞による効率的な取り込みが可能な脂質ナノ粒子組成物である。１つの実施形態において、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、及び例えばPEG化脂質などの複合脂質を含有する。
１つの実施形態において、本発明は、脂質粒子と複合体化された核酸化合物、又は脂質粒子ににより封入された核酸化合物を含有する組成物を提供し、この場合において当該脂質粒子は、以下を含有する：（a）当該組成物中に存在する総脂質の約40モル％〜約70モル％を構成するカチオン性脂質；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約55モル％を構成する中性脂質；及び（c）当該組成物中に存在する総脂質の約0.3モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質。
他の実施形態において、本発明は、脂質粒子と複合体化された核酸化合物、又は脂質粒子ににより封入された核酸化合物を含有する組成物を提供するものであり、この場合において当該脂質粒子は、以下を含有する：（a）当該組成物中に存在する総脂質の約40モル％〜約70モル％を構成するカチオン性脂質；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約20モル％を構成するリン脂質；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約45モル％を構成するコレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約0.3モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質。
さらに他の実施形態において、本発明は、脂質粒子と複合体化された核酸化合物、又は脂質粒子ににより封入された核酸化合物を含有する組成物を提供するものであり、この場合において当該脂質粒子は、以下を含有する：（a）当該組成物中に存在する総脂質の約40モル％〜約70モル％を構成するカチオン性脂質；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約20モル％を構成するリン脂質；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約45モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質。
様々な実施形態において、本発明により提供される組成物は、脂質粒子により複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有し、この場合において当該RNAi化合物は、mRNAを標的とし、そのmRNAに対応するタンパク質は、例えば肺線維症又はサルコイドーシスなどの肺疾患／障害の発症に重要な役割を果たしている。１つの実施形態において、本発明により提供される組成物は、脂質粒子により複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有し、この場合において当該RNAi化合物は、肺疾患／障害において過剰発現されているmRNAを標的としている。他の実施形態において、本発明により提供される組成物は、脂質粒子により複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有し、この場合において当該RNAi化合物は、mRNAを標的とし、そのmRNAに対応する遺伝子は、例えばアネキシンA11など、肺疾患／障害に遺伝的に関連したヌクレオチド多型を有している。
１つの実施形態において、本発明により提供される組成物は、脂質粒子により複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有し、この場合において当該RNAi化合物は、mRNAを標的とし、そのmRNAに対応するタンパク質の機能は、例えば炎症反応、顆粒球中の顆粒の脱顆粒（例えば、好中球の脱顆粒）、又は肺の感染部位への免疫細胞もしくは顆粒球のリクルート（走化性）などの貪食細胞の反応と関連している。他の実施形態において、本発明により提供される組成物は、脂質粒子により複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有し、この場合において当該RNAi化合物は、mRNAを標的とし、そのmRNAに対応するタンパク質の機能は、例えばコラーゲンなどのECM成分の合成などの線維芽細胞の反応と関連している。
例示的な実施形態において、本発明により提供される組成物は、サイトカインもしくはケモカインのmRNA（例えばTNFα）、コラーゲン合成に関与するmRNA（例えば、COL1A1 mRNA、又はプロリルヒドロキシラーゼmRNA）、及び／又は、その対応する遺伝子が肺疾患／障害に遺伝的に関連づけられているヌクレオチド多型を有するmRNA（例えば、アネキシンA11）、を標的とするRNAi化合物を含有する。
組成物の「有効量」又は「治療有効量」は、例えば干渉RNAなどの核酸化合物、又は同化合物を含有する組成物の、干渉RNAの非存在下で検出される正常な発現レベルと比較して標的配列の発現が阻害されているなどの所望される効果を生じさせるために十分な量である。標的遺伝子又は標的配列の発現の阻害は、対照と比較し、干渉RNAを用いて得られる値が、約90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、又は0%であるときに、達成される。標的遺伝子又は標的配列の発現を測定するための適切なアッセイとしては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、in situハイブリダイゼーション法、ELISA法、免疫沈降法、酵素機能法などの当分野の当業者に公知の技術を使用したタンパク質又はRNAのレベルの検査法、ならびに当分野の当業者に公知の表現型アッセイが挙げられる。
本明細書において使用される場合、「脂質粒子により複合体化された、又は封入された」とは、完全な封入、部分的な封入、又はその両方で核酸化合物（例えば、干渉RNA）を提供する脂質粒子を指し、又は核酸化合物で複合体化された脂質粒子もしくは核酸化合物とともに凝集された脂質粒子を指す。
「複合脂質」という用語は、非脂質部分に結合された脂質を指す。かかる複合脂質としては、限定されないが、ポリアミドオリゴマー（例えば、ATTA−脂質複合体）、例えばジアルキルオキシプロピルに結合されたPEG、ジアシルグリセロールに結合されたPEG、コレステロールに結合されたPEG、ホスファチジルエタノールアミンに結合されたPEG、セラミドに結合されたPEG（例えば、米国特許第5,885,613号を参照のこと。当該開示は、すべての目的にしたいその全内容が参照により本明細書に援用される）、カチオン性PEG脂質などのPEG−脂質複合体、及びそれらの混合物が挙げられる。PEGは、脂質に直接複合体化されていてもよく、又はリンカー部分を介して脂質に連結されていてもよい。例えば、非エステル含有リンカー部分、及びエステル含有リンカー部分などをはじめとする、脂質とPEGの結合に適した任意のリンカー部分を使用することができる。
「中性脂質」という用語は、選択されたｐHで非荷電又は中性両イオン性の形態のいずれかで存在する脂質種を指す。生理学的ｐHで、かかる脂質としては例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質、及び例えばセラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、トコフェロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールなどの他の脂質が挙げられる。
「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質ならびに任意の他の中性脂質又はアニオン性脂質を指す。「非カチオン性脂質」という用語は、リン脂質、コレステロール、トコフェロール、及びそれらの誘導体を含む。
「カチオン性脂質」という用語は、例えば生理学的ｐH（例えば、約7.0のpH）など、選択されたpHで正味の正電荷を有する多くの脂質種のうちのいずれかを指す。例えば少なくとも2個又は3個の不飽和部位など、複数の不飽和部位を伴うアルキル鎖を含有するカチオン性脂質が、高い膜流動性を有する脂質粒子の形成に特に有用であることは驚くべき発見であった。多くのカチオン性脂質、及び関連アナログもまた本発明に有用であり、米国特許出願公開20060083780、及び米国特許出願公開20060240554、米国特許第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号、第5,283,185号、第5,753,613号、及び第5,785,992号、ならびに国際特許出願公開WO 96/10390に記載されている。それら開示内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。
脂質粒子
本発明は、脂質粒子により複合体化された核酸化合物又は封入された核酸化合物を含有する組成物、及び本発明組成物を使用し、１つ以上の肺疾患／障害を治療又は改善する方法を提供するものである。
１つの実施形態において、組成物の脂質粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、及び複合脂質を含有する。例えば、１つの実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約40モル％〜約70モル％を構成するカチオン性脂質；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約55モル％を構成する中性脂質；及び（c）当該組成物中に存在する総脂質の約0.3モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質、を含有する。
様々な実施形態において、中性脂質は、リン脂質、コレステロールもしくはその誘導体、トコフェロールもしくはその誘導体、又はそれらの混合物を含有する。特定の実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、コレステロールもしくはその誘導体（例えば、コレステロールヘミスクシナートなど）の混合物を含有するか、又はからなる。他の実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、トコフェロールもしくはその誘導体（例えば、トコフェロールヘミスクシナートなど）の混合物を含有するか、又はからなる。
１つの実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約40モル％〜約70モル％を構成するカチオン性脂質；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約20モル％を構成するリン脂質；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約45モル％を構成するコレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約0.3モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質、を含有する。
他の実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約40モル％〜約70モル％を構成するカチオン性脂質；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約20モル％を構成するリン脂質；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約45モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質、を含有する。
様々な実施形態において、カチオン性脂質は、米国特許第7,341,738号、第8,058,069号、第9,006,417号、及び第9,139,554号に記載されるカチオン性脂質のうちの１つ以上を含有する。それら文献の開示内容は、すべての目的に対し、その全内容が参照により本明細書に援用される。 学説に拘束されることは望まないが、カチオン性脂質の使用は、負に荷電したRNAiと正に荷電した脂質の間の静電相互作用によって、RNAi化合物の粒子への凝縮を促進すると考えられている。
特定の実施形態において、カチオン性脂質は、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)である。
一部の実施形態において、カチオン性脂質は、以下のカチオン性脂質のうちの１つ以上を含有する：1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン (DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン (DLenDMA)、2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン (DLin-K-C2-DMA; "XTC2")、2,2-ジリノレイル-4-(3-ジメチルアミノプロピル)-[1,3]-ジオキソラン (DLin-K-C3-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-(4-ジメチルアミノブチル)-[1,3]-ジオキソラン (DLin-K-C4-DMA)、2,2-ジリノレイル-5-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキサン(DLin-K6-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-N-メチルペピラジノ-[1,3]-ジオキソラン (DLin-K-MPZ)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン (DLin-K-DMA)、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン (DLin-C-DAP)、1,2-ジリノレイオキシ-3-(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin-DAC)、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパン(DLin-MA)、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン (DLinDAP)、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン (DLin-S-DMA)、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン (DLin-2-DMAP)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩(DLin-TMA.Cl)、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩(DLin-TAP.Cl)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N-メチルピペラジノ)プロパン(DLin-MPZ)、3-(N,N-ジリノレイルアミノ)-1,2-プロパンジオール(DLinAP)、3-(N,N-ジオレイルアミノ)-1,2-プロパンジオ(DOAP)、1,2-ジリノレイルオキソ-3-(2-N,N-ジメチルアミノ)エトキシプロパン(DLin-EG-DMA)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウム塩化物(DODAC)、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン (DODMA)、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン (DSDMA)、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩化物(DOTMA)、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウム臭化物(DDAB)、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩化物(DOTAP)、3-(N--(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(DC-Chol)、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物(DMRIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、3-ジメチルアミノ-2-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(シス,シス-9,12-オクタデカジエノキシ)プロパン(CLinDMA)、2-[5'-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシ)-3'-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(シス,シス-9',1- -2'-オクタデカジエノキシ)プロパン(CpLinDMA)、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン (DOcarbDAP)、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン (DLincarbDAP)、又はそれらの混合物。
他の実施形態において、カチオン性脂質は、以下のカチオン性脂質のうちの１つ以上を含有する：米国特許第9,006,417号に記載されるMC3、LenMC3、CP-LenMC3、γ-LenMC3、CP-γ-LenMC3、MC3MC、MC2MC、MC3エーテル、MC4エーテル、MC3アミド、Pan-MC3、Pan-MC4、Pan MC5、又はそれらの混合物。これら脂質の合成法もまた米国特許第9,006,417号に記載されている。
１つの実施形態において、カチオン性脂質は、脂肪酸のアンモニウム塩、リン脂質、及びグリセリドを含む。脂肪酸としては、飽和又は不飽和のいずれかの12〜26炭素原子の炭素鎖長の脂肪酸を含む。一部の特定の例は、以下を含む：ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ラウリルアミン、及びステアリルアミン、ジラウロイルエチルホスホコリン（DLEP）、ジミリストイルエチルホスホコリン（DMEP）、ジパルミトイルエチルホスホコリン（DPEP）、及びジステアロイルエチルホスホコリン（DSEP）、N-（2,3-ジ-（9-（Z）-オクタデセニルオキシ）-プロパ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩化物（DOTMA）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、及び1,2-ビス（オレオイルオキシ）-3-（トリメチルアンモニオ）プロパン（DOTAP）。
これらカチオン性脂質の多くは、市販されている。例えば、DODAPは、Avanti Polar Lipids社から市販されている。さらに、例えばDLin-K-C2-DMA (XTC2)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLin-K6-DMA、及びDLin-K-MPZなどのカチオン性脂質の合成、ならびにさらなるカチオン性脂質は、2008年10月9日に出願された米国仮特許出願61/104,212に記載されている。当該出願の開示内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。さらに、例えばDLin-K-DMA、DLin-C-DAP、DLin-DAC、DLin-MA、DLinDAP、DLin-S-DMA、DLin-2-DMAP、DLin-TMA.Cl、DLin-TAP.Cl、DLin-MPZ、DLinAP、DOAP、及びDLin-EG-DMAなどのカチオン性脂質の合成、ならびにさらなるカチオン性脂質は、2008年12月31日に出願された国際特許出願PCT/US08/88676に記載されている。当該出願の開示内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。例えばCLinDMAなどのカチオン性脂質の合成、ならびにさらなるカチオン性脂質は、米国特許出願公開20060240554に記載されている。当該出願の開示内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約40モル％〜約70モル％を構成する。一部の他の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約45〜約65モル％、約50〜約60モル％、約55〜約65モル％、約50〜約65モル％、約45〜約50モル％、約55〜約60モル％、又は約65〜約70モル％を構成する。
さらに一部の他の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約40〜約65モル％、約40〜約60モル％、約40〜約55モル％、約40〜約50モル％、又は約40〜45モル％を構成する。
さらに一部の他の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約45〜約70モル％、約45〜約65モル％、約45〜60モル％、約45〜約55モル％、又は約45〜約50モル％を構成する。
一部の他の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約50〜約70モル％、約50〜約65モル％、約50〜約60モル％、約55〜約70モル％、約55〜約65モル％、約55〜約60モル％、約60〜約70モル％、又は約65〜約70モル％を構成する。
特定の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約55〜約58モル％、例えば約55、55.1、55.2.、55.3、55.4、55.5、55.6、55.7、55.8、55.9、56、56.1、56.2、56.3、56.4、56.5、56.6、56.7、56.8、56.9、57、57.1、57.2、57.3、57.4、57.5、57.6、57.7、57.8、57.9、又は58モル％を構成する。例示的な実施形態において、カチオン性脂質はDODAPであり、組成物中に存在する総脂質の約55〜約58モル％の量で存在する。他の例示的な実施形態において、DODAPは、組成物中に存在する総脂質の約57.1モル％の量で存在する。
他の特定の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約48〜約52モル％、例えば約48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、又は52モル％を構成する。例示的な実施形態において、カチオン性脂質はDODAPであり、組成物中に存在する総脂質の約48〜約52モル％の量で存在する。他の例示的な実施形態において、DODAPは、組成物中に存在する総脂質の約50モル％の量で存在する。
１つの実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約50モル％の量で存在する。他の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約57モル％の量で存在する。
一部の実施形態において、カチオン性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約45モル％、約57.1モル％、又は約70モル％の量で存在する。
様々な実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約25モル％〜約55モル％を構成する。1つの実施形態において、本発明組成物中に存在する中性脂質は、１つ以上の中性脂質の混合物を含有する。中性脂質としては、限定されないが、例えばホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、例えばコレステロール又はその誘導体などのステロール、トコフェロール（例えば、メチル化フェノールであり、それらの多くが、ビタミンE活性を有している）又はその誘導体、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが挙げられる。
１つの実施形態において、中性脂質は、リン脂質、コレステロールもしくはその誘導体、トコフェロールもしくはその誘導体（例えば、α-トコフェロール）、又はそれらの混合物であってもよい。例示的な実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、コレステロールもしくはその誘導体（例えば、コレステロールヘミスクシナートなど）の混合物を含有するか、又はからなる。他の例示的な実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、トコフェロールもしくはその誘導体（例えば、トコフェロールヘミスクシナートなど）の混合物を含有するか、又はからなる。特定の実施形態において、トコフェロールは、α-トコフェロール又はその誘導体（例えば、α-トコフェロールヘミスクシナート）である。
一部の他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約30〜約50モル％、約35〜約45モル％、約45〜約55モル％、約40〜約50モル％、約25〜約30モル％、約30〜約35モル％、約35〜約40モル％、約40〜約45モル％、約45〜約50モル％、及び約50〜約55モル％を構成する。
一部の他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約25〜約50モル％、約25〜約45モル％、約25〜約40モル％、約25〜約35モル％、約25〜約30モル％、約30〜約55モル％、約30〜約50モル％、約30〜約45モル％、約30〜約40モル％、約30〜約35モル％、約35〜約55モル％、約35〜約50モル％、約35〜約45モル％、又は約35〜約40モル％を構成する。
一部の他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約40〜約55モル％、約40〜約50モル％、約40〜約45モル％、約45〜約55モル％、約45〜約50モル％、又は約50〜約55モル％を構成する。
一部の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約40〜約50モル％の量で存在する。
１つの実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、例えば約40、40.1、40.2、40.3、40.4、40.4、40.5、40.6、40.7、40.8、40.9、41、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、又は42モル％などのその間の値を含む約40モル％〜約42モル％を構成する。１つの実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、コレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体の混合物を含有し、又はからなり、当該混合物は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値を含む約40〜約42モル％を構成する。例示的な実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、例えばコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）などのコレステロール誘導体の混合物を含有し、又はからなり、当該混合物は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値を含む約40〜約42モル％を構成する。他の例示的な実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、例えばトコフェロールヘミスクシナート（THS）などのトコフェロール誘導体の混合物を含有し、又はからなり、当該混合物は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値を含む約40〜約42モル％を構成する。
一部の他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の、例えば約41、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、42、42.1、42.2、42.3、42.4、42.5、42.6、42.7、42.8、42.9、又は約43モル％などの約41モル％〜43モル％の量で存在する。
他の実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、コレステロール又はトコフェロール又はその誘導体を含有し、又はからなり、当該混合物は、組成物中に存在する総脂質の例えば約47、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9、49、49.1、49.2、49.3、49.4、49.5、49.6、49.7、49.8、49.9、又は50モル％などのその間の値を含む約47〜約50モル％を構成する。例示的な実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、例えばコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）などのコレステロール誘導体の混合物を含有し、又はからなり、当該混合物は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値を含む約47〜約50モル％を構成する。他の例示的な実施形態において、中性脂質は、リン脂質と、例えばトコフェロールヘミスクシナート（THS）などのトコフェロール誘導体の混合物を含有し、又はからなり、当該混合物は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値を含む約47〜約50モル％を構成する。
１つの実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約41.4モル％の量で存在する。他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約42.5モル％の量で存在する。さらに他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約28.5モル％の量で存在する。さらに一部の他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約49モル％の量で存在する。さらに他の実施形態において、中性脂質は、組成物中に存在する総脂質の約53.5モル％の量で存在する。
ある実施形態において、組成物の脂質粒子は、カチオン性脂質、リン脂質、コレステロールもしくはその誘導体（例えばCHEMS）、又はトコフェロール又はその誘導体（例えばTHS）、及び複合脂質を含有する。例示的な実施形態において、組成物の脂質粒子は、カチオン性脂質、リン脂質、CHEMS、及び複合脂質を含有する。他の例示的な実施形態において、組成物の脂質粒子は、カチオン性脂質、リン脂質、THS、及び複合脂質を含有する。さらに他の例示的な実施形態において、組成物の脂質粒子は、カチオン性脂質、リン脂質、α-THS、及び複合脂質を含有する。
リン脂質としては、限定されないが、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルセリン（PS)、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、及びホスファチジン酸（PA）が挙げられる。１つの実施形態において、リン脂質は、卵リン脂質、大豆リン脂質、又は水素化卵リン脂質及び水素化大豆リン脂質である。１つの実施形態において、リン脂質は、12〜26個の炭素原子の鎖を含有するグリセロール位の2及び3の脂肪酸と、コリン、グリセロール、イノシトール、セリン、エタノールアミン、ならびに対応するホスファチジン酸を含有するグリセロールの1位の異なる頭部基のエステル結合を含有する。これら脂肪酸上の鎖は、飽和又は不飽和であってもよく、リン脂質は、異なる鎖長、及び異なる不飽和度の脂肪酸から構成されてもよい。ある実施形態において、リン脂質は、ジステアロイルホスホエタノールアミン（DSPE）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイルホスホエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（PSPC）、ジホスファチジルグリセロール（DPG）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、又はそれらの混合物を含有する。
特定の実施形態において、リン脂質は、ホスファチジルコリン（PC）又はホスファチジルエタノールアミン（PE）である。特定の実施形態において、ホスファチジルコリン又はホスファチジルエタノールアミンは、ジアステロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC)、又はジステアロイルホスホエタノールアミン（DSPE）からなる群から選択される。
様々な実施形態において、リン脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約4モル％〜約20モル％を構成する。一部の他の実施形態において、リン脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び下位範囲を含む約4〜約17モル％、約4〜約15モル％、約4〜約12モル％、約4〜約8モル％、約7〜約17モル％、約7〜約15モル％、約7〜約12モル％、約10〜約15モル％、約10〜約20モル％、約10〜約17モル％、約12〜約20モル％、約12〜約18モル％、約15〜約20モル％、約15〜約18モル％、又は約15〜約17モル％を構成する。
様々な実施形態において、リン脂質は、組成物中に存在する総脂質の約4〜約15モル％、約4〜約10モル％、約10〜約15モル％、約15〜約20モル％、又は約10〜約20モル％を構成する。
１つの実施形態において、リン脂質は、組成物中に存在する総脂質の、例えば約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、又は8モル％などのその間の値を含む約4モル％〜約8モル％を構成する。他の実施形態において、リン脂質は、組成物中に存在する総脂質の、例えば約15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、又は17モル％などのその間の値を含む約15モル％〜約17モル％を構成する。さらに他の実施形態において、リン脂質は、組成物中に存在する総脂質の、例えば約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、又は16.5モル％などのその間の値を含む約4モル％〜約17モル％を構成する。
一部の実施形態において、組成物の脂質粒子は、リン脂質の混合物を含有し、又はからなる。これらの実施形態において、リン脂質は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値を含む約75、80、85、90、95、又は約100モル％を構成する。例示的な実施形態において、脂質粒子は、約60、70又は80モル％のリン脂質1を含有し、及び約40、30又は20モル％のリン脂質2を含有する。例えば、１つの実施形態において、脂質粒子は、約60、65、70、75又は80モル％の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（ドデカニル）（NA-DOPE）及び約40、35、30、25又は20モル％のDOPCを含有し、又はからなる。
一部の実施形態において、本発明の脂質粒子は、ステロールを含有する。本発明での使用のためのステロールとしては、限定されないが、コレステロール、コレステロールヘミスクシナートをはじめとするコレステロールのエステル、硫酸水素コレステロール及び硫酸コレステロールをはじめとするコレステロールの塩、エルゴステロール、エルゴステロールヘミスクシナートをはじめとするエルゴステロールのエステル、硫酸水素エルゴステロール及び硫酸エルゴステロールをはじめとするエルゴステロールの塩、ラノステロール、ラノステロールヘミスクシナートをはじめとするラノステロールのエステル、硫酸水素ラノステロール及び硫酸ラノステロールをはじめとするラノステロールの塩、が挙げられる。様々なステロール、及びたとえばコレステロールヘミスクシナートなどのその水溶性誘導体を使用して、リポソームが形成される；例えば、参照によりその全体で援用米国特許第4,721,612号を参照のこと。
一部の実施形態において、本発明の脂質粒子は、例えばトコフェロールなどのメチル化フェノールを含有する。１つの実施形態において、脂質粒子は、例えばα-トコフェロールなどのビタミンE活性を有するメチル化フェノールを含有する。本発明での使用のためのトコフェロールとしては、トコフェロール、トコフェロールヘミスクシナート（例えばα-トコフェロールヘミスクシナート）をはじめとするトコフェロールのエステル、硫酸水素トコフェロール及び硫酸トコフェロールをはじめとするトコフェロールの塩が挙げられる。その全体で参照により援用される国際特許出願公開WO85/00968は、α-トコフェロール及びそのある誘導体を含有するリポソーム中に封入することによる、薬剤の毒性を減少させる方法を記載している。また、様々なトコフェロール及びその水溶性誘導体を使用して、リポソームが形成されている。参照によりその全体で援用される国際特許出願87/02219を参照のこと。これら公表文献中に記載される方法は、本明細書の用途に適している。
特定の実施形態において、本発明の脂質粒子で使用されるステロールは、コレステロールヘミスクシナート（CHEMS）である。他の特定の実施形態において、本発明の脂質粒子で使用されるトコフェロールは、トコフェロールヘミスクシナート（THS）である。さらに他の特定の実施形態において、本発明の脂質粒子は、CHEMSとTHSの混合物を含有してもよい。
様々な実施形態において、ステロール、トコフェロール又はそれらの誘導体は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び範囲を含む約25モル％〜約45モル％を構成する。一部の他の実施形態において、ステロール、トコフェロール又はそれらの誘導体は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び範囲を含む約25〜約40モル％、約25〜約35モル％、約25〜約30モル％、約30〜約45モル％、約30〜約40モル％、約30〜約35モル％、約35〜約45モル％、又は約35〜約40モル％を構成する。ある実施形態において、ステロール、トコフェロール又はそれらの誘導体は、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び範囲を含む約34〜約45モル％、又は約34〜約39モル％を構成する。
１つの実施形態において、コレステロール、トコフェロール、CHEMS又はTHSは、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び範囲を含む約25モル％〜約45モル％を構成する。一部の他の実施形態において、コレステロール、トコフェロール、CHEMS又はTHSは、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び範囲を含む約25〜約40モル％、約25〜約35モル％、約25〜約30モル％、約30〜約45モル％、約30〜約40モル％、約30〜約35モル％、約35〜約45モル％、又は約35〜約40モル％を構成する。ある実施形態において、コレステロール、トコフェロール、CHEMS又はTHSは、組成物中に存在する総脂質の、その間の値及び範囲を含む約34〜約45モル％、又は約34〜約39モル％を構成する。
例示的な実施形態において、コレステロール、トコフェロール、CHEMS又はTHSは、組成物中に存在する総脂質の約34.1、34.2、34.3、34.4、34.5、34.6、34.7、34.8、34.9、35、35.1、35.2、35.3、35.4、35.5、35.6、35.7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36.4、36.5、36.6、36.7、36.8、36.9、37、37.1、37.2、37.3、37.4、37.5、37.6、37.7、37.8、37.9、38、38.1、38.2、38.3、38.4、38.5、38.6、38.7、38.8、38.9、又は39モル％を構成する。他の例示的な実施形態において、コレステロール、トコフェロール、CHEMS又はTHSは、組成物中に存在する総脂質の約25、34.3、34.4、35.4、38.5、又は45モル％を構成する。
組成物の脂質粒子は、複合脂質をさらに含有する。１つの実施形態において、複合脂質は、PEG化脂質である。１つの実施形態において、PEG化脂質は、PEG400〜PEG5000を含有する。例えば、PEG化脂質は、EG400、PEG500、PEG1000、PEG2000、PEG3000、PEG4000、又はPEG5000を含有してもよい。さらなる実施形態において、PEG化脂質の脂質成分は、コレステロール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイルホスホエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、ジミリストイルグリセロールグリセロール（DMG）、ジホスファチジルグリセロール（DPG）、又はジステラロイルグリセロール（DSG）を含有する。一部の実施形態において、PEG化脂質は、DMG-PEG2000、コレステロール-PEG2000、又はDSPE-PEG2000である。
その分子量（MW）に応じて、PEGは、当分野においてポリエチレンオキシド（PEO）又はポリオキシエチレン（POE）とも呼称される。PEG化脂質は、分枝状又は非分枝状のPEG分子を含んでもよく、及び特定のPEG MWには限定されない。例えば、PEG化脂質は１つの実施形態において、300g/モル、400g/モル、500g/モル、1000g/モル、1500g/モル、2000g/モル、2500g/モル、3000g/モル、3500g/モル、4000g/モル、4500g/モル、5000g/モル又は10,000g/モルの分子量を有するPEG分子を含有する。１つの実施形態において、PEGは、1000g/モル又は2000g/モルのMWを有している。
例えばPEG化脂質などの複合脂質は、正味荷電（例えば、カチオン性又はアニオン性）を有していてもよく、又は正味で中性であってもよい。本発明のPEG化脂質構成要素で使用される脂質は、合成、半合成、又は天然脂質であってもよく、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、セラミド、トコフェロール、ステロール、脂肪酸、又は例えばアルブミンなどの糖タンパク質が挙げられる。１つの実施形態において、脂質は、ステロールである。さらなる実施形態において、ステロールは、コレステロールである。他の実施形態において、脂質は、本明細書に記載されるリン脂質である。様々な実施形態において、本明細書に提示される組成物のPEG化脂質は、ジステアロイルホスホエタノールアミン（DSPE）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイルホスホエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、ジミリストイルグリセロール（DMG）、ジホスファチジルグリセロール（DPG）、又はジステラロイルグリセロール（DSG）を含有する。
様々な実施形態において、複合脂質は、ポリエチレングリコール（PEG）複合脂質を含有する。１つの実施形態において、PEG複合脂質は、PEG-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール（PEG-DMG）である。一部の実施形態において、PEGは、約2000ダルトンの平均分子量を有している。
様々な実施形態において、複合脂質は、組成物中に存在する総脂質の、例えば約0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、又は2.0モル％などの約0.3モル％〜約2モル％を構成する。一部の実施形態において、複合脂質は、組成物中に存在する総脂質の、例えば約1、1.1、1.2、1.3、1.4、又は約1.5モル％などの約1〜約1.5モル％を構成する。例示的な実施形態において、複合脂質は、DMG-PEG2000である。
特定の実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約50モル％〜約57.5モル％を構成するカチオン性脂質（例えば、DODAP）；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約16.5モル％を構成するリン脂質（例えば、DSPC、DOPC、DSPE）；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約45モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質（例えば、DMG-PEG2000）、を含有する。
一部の実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約50モル％〜約57.5モル％を構成するカチオン性脂質（例えば、DODAP）；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約16.5モル％を構成するリン脂質（例えば、DSPC、DOPC、DSPE）；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約34モル％〜約45モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質（例えば、DMG-PEG2000）、を含有する。
他の一部の実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約50モル％〜約57.5モル％を構成するカチオン性脂質（例えば、DODAP）；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約16.5モル％を構成するリン脂質（例えば、DSPC、DOPC、DSPE）；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約34モル％〜約39モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質（例えば、DMG-PEG2000）、を含有する。
さらに他の一部の実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約50モル％〜約57.5モル％を構成するカチオン性脂質（例えば、DODAP）；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約16.5モル％を構成するリン脂質（例えば、DSPC、DOPC、DSPE）；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約34.3モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質（例えば、DMG-PEG2000）、を含有する。
さらに他の一部の実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約50モル％〜約57.5モル％を構成するカチオン性脂質（例えば、DODAP）；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約16.5モル％を構成するリン脂質（例えば、DSPC、DOPC、DSPE）；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約25モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質（例えば、DMG-PEG2000）、を含有する。
さらに他の一部の実施形態において、組成物の脂質粒子は、（a）当該組成物中に存在する総脂質の約50モル％〜約57.5モル％を構成するカチオン性脂質（例えば、DODAP）；（b）当該組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約16.5モル％を構成するリン脂質（例えば、DSPC、DOPC、DSPE）；（c）当該組成物中に存在する総脂質の約45モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び（d）当該組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質（例えば、DMG-PEG2000）、を含有する。
一部の実施形態において、本発明の組成物及び／又は脂質粒子は、アニオン性脂質（負に荷電した脂質）が無い。しかしながら、もしアニオン性脂質が存在する場合、かかる脂質としては、ホスファチジル−グリセロール（PG）、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルイノシトール（Pi）、及びホスファチジルセリン（PS）が挙げられる。例としては、DMPG、DPPG、DSPG、DMPA、DPP A、DSPA、DMPI、DPPI、DSPI、DMPS、DPPS、及びDSPSが挙げられる。
本明細書に提示される組成物は、例えば脂質成分もしくは脂質粒子に複合体化された、又は封入された、RNAi化合物などの核酸化合物を含む。RNAi化合物は、脂質又は脂質成分又は脂質粒子に「複合体化」されている。及びRNAi化合物の少なくとも約1重量％が、複合体の一部として、例えばマイクロ粒子、ナノ粒子、ミセル、又はリポソームの一部としてのいずれかで、脂質と関連づけられている（例えば、封入又は結合されている）任意の組成物、溶液又は懸濁液が記載される。１つの実施形態において、複合体は、１つ以上の静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合により、又は脂質によるRNAi化合物の例えばミセルもしくはリポソーム内の封入により、形成される。例えば、脂質複合体化組成物は、１つの実施形態において、複数のリポソームを含有し、及びRNAi化合物は、水層（リポソームにより封入されている）にあっても、疎水性二重層にあっても、リポソーム二重膜の界面頭部基領域にあっても、又はそれらの組み合わせにあってもよい。１つの実施形態において、その必要のある患者へ組成物を投与する前に、組成物中のRNAi化合物の少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%又は少なくとも約95%が、脂質複合体化される。１つの実施形態において、関連性は、ろ紙を通した分離により測定される。この場合において当該ろ紙に、脂質と脂質に関連づけられた薬剤は保持され（すなわち、保持物中にあり）、そして遊離薬剤はろ過物中にある。
１つの実施形態において、脂質粒子は、RNAi化合物に複合体化されている。１つの実施形態において、複合体は、マイクロ粒子、ナノ粒子、ミセル、もしくはリポソーム、又はそれらの組み合わせである。
１つの実施形態において、脂質複合体は、リポソーム又は複数のリポソームであり、RNAi化合物は、当該リポソームの表面と関連づけられているか、又は当該リポソーム（又は複数のリポソーム）の水性内部に存在している。リポソームは、封入水性体積を包含する完全に密閉された脂質二重膜である。リポソームは、単層小胞（１つの膜二重層を保有）又は多重小胞（複数の膜二重層により特徴づけられる玉ねぎ様の構造であり、それぞれ、水層によって隣同士が分離されている）又はそれらの組み合わせであってもよい。二重層は、疎水性の「尾」領域と、親水性の「頭」領域を有する２つの脂質単層から構成される。膜二重層の構造は、脂質単層の疎水性（非極性）の「尾」が二重層の中心に向いている一方で、親水性の「頭」が水層に向いている。
１つの実施形態において、共に製剤化される場合、RNAi化合物と脂質成分は、複数の脂質粒子（例えば、マイクロ粒子又はナノ粒子）を形成する。１つの実施形態において、複数の脂質粒子の平均直径は、約20nm〜約2μm、例えば約50nm〜約1μm、約200nm〜約1μm、約100nm〜約800 nm、約100nm〜約600nm、又は約100nm〜約500nmである。
脂質粒子の１つの実施形態において、RNAi化合物（例えば、１つ以上のsiRNA、１つ以上のshRNA、１つ以上のmiRNA、又はそれらの組み合わせ）化合物は、5モル％〜99モル％で組成物中に存在している。さらなる実施形態において、化合物は、40モル％〜95モル％で組成物中に存在している。さらなる実施形態において、siRNA化合物は、40モル％〜60モル％で組成物中に存在している。１つの実施形態において、siRNA化合物は、約40モル％又は約45モル％で組成物中に存在している。
一部の実施形態において、本明細書に提示される組成物、システム及び方法は、脂質複合体化されたRNAi化合物又はリポソーム封入されたRNAi化合物を含有する。本発明の全体を通して提供される医薬組成物で使用される脂質は、合成、半合成、又は天然の脂質であってもよい。上述のように、RNAi化合物が使用される場合、カチオン性脂質は、静電相互作用を介してそれと複合体化されることができる。
１つの実施形態において、組成物は、天然の肺サーファクタントの主要な構成物質であるジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）を含んでもよい。
学説に拘束されることは望まないが、カチオン性脂質及びホスファチジルコリンとしてかかる脂質を含有する脂質マイクロ粒子、ナノ粒子、又はリポソームは肺の細胞（例えば、好中球、マクロファージ、及び線維芽細胞）によるRNAi化合物の取り込みに役に立ち、及び肺におけるRNAi化合物の維持を補助する。
例えば干渉RNAなどの活性剤又は治療剤が、脂質粒子中に複合体化されている、又は完全もしくは部分的に封入されている本発明の脂質粒子は、限定されないが、連続混合法又は直接希釈法などをはじめとする当分野に公知の任意の方法により形成されることができる。脂質粒子の例示的な製造方法は、米国特許第8,058,069号に記載されており、当該特許はすべての目的に対し参照により本明細書に援用される。
例えば、ある実施形態において、本発明の脂質粒子は、例えば干渉RNAなどの核酸を含有する水溶液を第一の容器に提供すること、第二の容器に有機脂質溶液を提供すること、及び当該有機脂質溶液と水性溶液を混合させ、その有機脂質溶液と水性溶液の混合によって、実質的に瞬時に核酸（例えば干渉RNA）を封入するリポソームを製造すること、を含む方法などの、連続混合法を介して製造される。この方法と、この方法を行うための装置は、米国特許出願公開20040142025に詳細に記載されており、当該出願はすべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。
例えば混合チャンバー内において、脂質と緩衝液を混合環境内に連続的に導入する動作によって、脂質溶液と緩衝液の連続希釈が生じ、それによって混合時に実質的に瞬時にリポソームが製造される。本明細書において使用される場合、「脂質溶液と緩衝液の連続希釈」という文言（及びその変化形）は、一般的に、脂質溶液が充分な力を伴う水和過程で充分に急速に希釈され、小胞の形成を生じさせることを意味する。核酸を含有する水性溶液と、有機脂質溶液を混合させることにより、その有機脂質溶液は、緩衝溶液（すなわち、水性溶液）の存在下で連続的に段階的に希釈され、核酸−脂質粒子が形成される。
連続混合法を使用して形成された脂質粒子は、典型的には、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、又は約70nm〜約90nmのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、任意で大きさをそろえて均一な粒子サイズとなる。
他の実施形態において、本発明の脂質粒子は、直接希釈法を介して製造され、当該方法は、リポソーム溶液を形成すること、及び直ちに当該リポソーム溶液を、制御された量の希釈緩衝液を含有する回収管へと直接導入することを含む。好ましい態様において、回収管は、回収管の内容物を攪拌し、希釈を促進するよう構成された１つ以上の構成要素を含む。１つの態様において、回収管中に存在する希釈緩衝液の量は、実質的に、そこに導入されるリポソーム溶液の量に等しい。非限定的な例として、リポソームの45％エタノール溶液を、等量の希釈緩衝液を含有する回収管に導入することで、小さな粒子が有益に生成される。
さらに他の実施形態において、本発明の脂質粒子は、直接希釈法を介して製造され、当該方法において、希釈緩衝液を含有する第三の容器は、第二の混合領域に流動的に連結されている。この実施形態において、第一の混合領域で形成されたリポソーム溶液は、直ちに第二の混合領域中の希釈緩衝液と直接混合される。好ましい態様において、第二の混合領域は、リポソーム溶液と希釈緩衝液が、180°の反対方向に流れながら出会うよう配置されたT-コネクターを含む。しかしながら、例えば約27°〜約180°などのより浅い角度を提供するコネクターを使用してもよい。ポンプ機器は、第二の混合領域に制御可能な緩衝液流を送る。１つの態様において、第二の混合領域に提供される希釈緩衝液の流速は、第一の混合領域からそこに導入されるリポソーム溶液の流速と実質的に等しくなるよう制御される。この実施形態によって、第二の混合領域中でリポソーム溶液と混合する希釈緩衝液の流れを有益により制御することが可能になり、それによって、第二の混合プロセスにおいて緩衝液中のリポソーム溶液の濃度を有益により制御することも可能となる。かかる希釈緩衝液の流速の制御によって、低い濃度で、小さな粒子サイズの形成が有益に可能となる。
これらの方法と、これら直接希釈法を行うための装置は、米国特許出願公開20070042031に詳細に記載されており、当該出願はすべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。
直接希釈法を使用して形成された脂質粒子は、典型的には、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、又は約70nm〜約90nmのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、任意で大きさをそろえて均一な粒子サイズとなる。
もし必要な場合、本発明の脂質粒子は、リポソームのサイジング（大きさをそろえること）に利用可能な任意の方法により、大きさをそろえることができる。サイジングは、所望されるサイズ範囲、及び粒子サイズを比較的狭い分布とするために行われてもよい。
所望されるサイズに粒子の大きさをそろえるための、いくつかの技術が利用可能である。リポソームに使用され、本発明粒子に等しく適用可能な１つのサイジング方法は、米国特許第4,737,323号に記載されており、当該公開内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。 槽又はプローブソニケーションのいずれかにより粒子懸濁液をソニケートすることにより、約50nm未満のサイズの粒子にまで、サイズが漸減する。ホモジナイゼーションはもう１つの方法であり、当該方法は、大きな粒子断片を小さな断片へとせん断する力に依っている。典型的なホモジナイゼーション法において、粒子は、選択された粒子サイズまで、典型的には約60〜約80nmとなるまで、標準的なエマルションホモジナイザーを通って再循環する。両方法において、粒子サイズの分布は、従来的なレーザービーム粒子サイズ識別又はQELSによりモニターすることができる。
ポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜の小孔を通した粒子の押出もまた、粒子サイズを比較的良好な規定サイズ分布にまで減少させる有効な方法である。典型的には、所望される粒子サイズ分布が得られるまで、懸濁液を１回以上、膜を通して循環させる。小孔膜を通して粒子を上手く押出し、段階的なサイズ減少を得てもよい。
一部の実施形態において、組成物中のRNAi化合物は、例えば米国特許出願 09/744,103に記載されるようにあらかじめ圧縮されている。当該出願の開示内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。
他の実施形態において、当該方法はさらに、本組成物を使用した細胞のリポフェクションの達成に有用な非脂質ポリカチオンの添加を含む。適切な非脂質ポリカチオンの例としては、ヘキサジメトリンブロミド（hexadimethrine bromide）（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー Aldrich Chemical Co.から、POLYBRENE.RTM.の商標名で販売されている）、又はヘキサジメトリンの他の塩が挙げられる。他の適切なポリカチオンとしては、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リシン、ポリ-D-リシン、ポリアリルアミン、及びポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の添加は、粒子が形成された後が好ましい。
リポソームは、様々な方法により作製することができ、本発明は、特定のタイプのリポソーム製造方法に限定されない。１つの実施形態において、米国特許出願公開2008/0089927又はWO2013/177226に記載されている方法のうちの１つ以上を本明細書において使用し、RNAi化合物封入脂質組成物（リポソーム分散）が作製される。米国特許出願公開2008/0089927、及び国際特許出願2013/177226 の開示内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により援用される。
１つの実施形態において、リポソーム組成物は、１つ以上の脂質を有機溶媒に溶解させて、脂質溶液を形成させることにより生成され、及びsiRNAコアセルベートは、脂質溶液とsiRNA水溶液の混合から形成される。さらなる実施形態において、有機溶媒はエタノールである。よりさらなる実施形態において、１つ以上の脂質は、リン脂質、及びステロール又はトコフェロールを含有する。１つの実施形態において、リン脂質は、正味中性又は正味カチオン性である。
１つの実施形態において、リポソームは、ソニケーション、押出、ホモジナイゼーション、膨張、電鋳、インバーテッドエマルション（inverted emulsion）、又は逆蒸発法により作製される。Banghamの方法(J. Mol. Biol. (1965))は、一般的な多重膜小胞（MLV）を作製する。Lenk らの (米国特許第4,522,803号、第5,030,453号、及び第5,169,637号。各々、すべての目的に対しその全内容が参照により援用される）、Fountain ら (米国特許第4,588,578号。その全内容が参照により援用される）及びCullisら (米国特許第4,975,282号。その全内容が参照により援用される）は、多重膜リポソームを製造する方法を開示しており、それらリポソームは、各々の水性区画内に、実質的に等しい膜間溶質分布を有している。米国特許第4,235,871号は、その全内容が参照により援用され、逆相蒸発によるオリゴ膜状リポソームの調製を開示している。各方法は、本発明を用いた使用に適合可能である。
単層小胞は、例えば米国特許第5,008,050号及び米国特許第5,059,421号の押出法など多くの技術によりMLVから作製されることができる。当該特許の各開示内容は、すべての目的に対し参照により本明細書に援用される。ソニケーション及びホモジナイゼーションを使用して、大きなリポソームから小さい単層リポソームを製造することもできる（例えば、Paphadjopoulosら (1968); Deamer 及び Uster (1983)；及びChapmanら (1968)を参照のこと。各文献は、すべての目的に対しその全内容が参照により援用される）。
Bangham ら (J. Mol. Biol. 13, 1965, pp. 238-252。その全内容が参照により援用される）のリポソーム調製は、有機溶媒中でリン脂質を懸濁させること、次いでそれを乾燥するまで蒸発させ、反応管上にリン脂質膜を形成させることを含む。次に、適切な量の水層を加え、60回混合させて、「膨張」させリポソームを得る。得られたリポソームは、多重膜小胞（MLV）からなり、機械的手段により分散される。この調製により、Papahadjopoulosら(Biochim. Biophys. Acta. 135, 1967, pp. 624-638、参照によりその全内容が援用される）に記載される小さなソニケート化単層小胞、及び大きな単層小胞の開発の基礎が提供される。
大きな単層小胞（LUV）を作製するための技術、例えば逆相蒸発法、注入法、及び洗浄剤希釈などを使用して、本明細書に提示される医薬組成物における使用のためのリポソームを製造することができる。これら方法、及びリポソームを製造するための他の方法に関する概説は、参照により本明細書に援用される、テキストのLiposomes, Marc Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1に見出され得る。また、Szoka, Jr.ら(Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 1980, p. 467)を参照のこと。当該文献もまた、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。
本明細書に記載される組成物の作製に適合可能な他のリポソーム作製方法としては、逆相蒸発小胞（REV：reverse-phase evaporation vesicles）を形成させるものが挙げられ、例えば、その全内容が参照により援用される米国特許第4,235,871号を参照のこと。実質的に同等の層状溶質分布を有すると特徴づけられている他種のリポソームを使用することもできる。この種のリポソームは、安定複層小胞（SPLV：stable plurilamellar vesicles）と命名されており、米国特許第4,522,803号に規定されている。当該特許はその全内容が参照により援用される。当該リポソームは、その全内容が参照により援用される米国特許第4,588,578号に記載される単相小胞を含み、及び上述の凍結融解多層小胞（FATMLV：frozen and thawed multilamellar vesicles）を含む。
１つの実施形態において、組成物は、光散乱法により計測される、およそ0.005ミクロン〜およそ3.0ミクロン、例えば約0.1μm〜約1.0μmの範囲の平均直径を有する脂質粒子を複数含有する。１つの実施形態において、組成物中の複数の粒子の平均直径は、約50nm〜約2μm、約50nm〜約1.5μm、約50nm〜約1μm、50nm〜約900nm、約50nm〜約800nm、約50nm〜約700nm、約50nm〜約600nm、約50nm〜約500nmである。他の実施形態において、組成物中の複数の粒子の平均直径は、約200nm〜約1.8μm、約200nm〜約1.7μm、約200nm〜約1.6μm、約200nm〜約1.5μm、約200nm〜約1.4μm、約200nm〜約1.3μm、約200nm〜約1.2μm、又は約200nm〜約1.1μmである。
１つの実施形態において、複数の脂質粒子は、複数のリポソームを含有する。１つの実施形態において、複数のリポソームは、光散乱法により計測される、およそ0.01ミクロン〜およそ3.0ミクロン、例えば約0.2〜約1.0ミクロンの範囲の平均直径を有する。１つの実施形態において、組成物中の複数のリポソームの平均直径は、150nm〜約2μm、約200nm〜約1.9μm、約200nm〜約1.8μm、約200nm〜約1.7μm、約200nm〜約1.6μm、約200nm〜約1.5μm、約200nm〜約1.4μm、約200nm〜約1.3μm、約200nm〜約1.2μm、約200nm〜約1.1μm、約200nm〜約1μm、200nm〜約900nm、約200nm〜約800nm、約200nm〜約700nm、約200nm〜約600nm、約200nm〜約500nmである。
投与量を最小化させ、患者の投与時間を減少させるために、１つの実施形態において、RNAi化合物と脂質成分のリポソーム封入又は複合体化の高効率化、及び脂質とRNAi化合物の比率を可能な限り低い値とすることが重要である。１つの実施形態において、脂質成分とRNAi化合物の重量比は、2：1（「脂質成分とRNAi化合物」又は「脂質成分：RNAi化合物」）又はそれ未満（例えば、約2：1.0〜約0.01：1.0、又は約2：1.0〜約0.1：1.0）である。他の実施形態において、脂質成分とRNAi化合物の重量比は、1.5：1.0（「脂質成分とRNAi化合物」又は「脂質成分：RNAi化合物」）又はそれ未満（例えば、約1.5：1.0〜約0.01：1.0、又は約1.5：1〜約0.1：1.0）である。他の実施形態において、脂質成分とRNAi化合物の重量比は、1.0：1.0（「脂質成分とRNAi化合物」又は「脂質成分：RNAi化合物」）又はそれ未満（例えば、約1.0：1.0〜約0.01：1.0、又は約1.0：1.0〜約0.1：1.0）、又は約1.0：1.0〜約0.5：1.0である。
一部の実施形態において、組成物中のRNAi化合物と脂質の比率（質量／質量の比率）は、約0.01〜約0.2、約0.02〜約0.1、約0.03〜約0.1、又は約0.01〜約0.08の範囲である。開始材料の比率もまた、この範囲内にある。他の実施形態において、調製物は、10mgの総脂質当たり、400μgの核酸を使用する。又は約0.01〜約0.08の核酸と脂質の質量比、より好ましくは約0.04の質量比を使用し、これは核酸50μg当たり、総脂質1.25mgに相当する。他の好ましい実施形態において、粒子は、約0.08の核酸：脂質の質量比を有する。
他の実施形態において、組成物中の脂質とRNAi化合物の比率（質量／質量の比率）は、1(1:1)〜約100(100:1)、約5(5:1)〜約100(100:1)、約1(1:1)〜約50(50:1)、約2(2:1)〜約50(50:1)、約3(3:1)〜約50(50:1)、約4(4:1)〜約50(50:1)、約5(5:1)〜約50(50:1)、約1(1:1)〜約25(25:1)、約2(2:1)〜約25(25:1)、約3(3:1)〜約25(25:1)、約4(4:1)〜約25(25:1)、約5(5:1)〜約25(25:1)、約5(5:1)〜約20(20:1)、約5(5:1)〜約15(15:1)、約5(5:1)〜約10(10:1)、約5(5:1)、6(6:1)、7(7:1)、8(8:1)、9(9:1)、(10:1)、11(11:1)、12(12:1)、13(13:1)、14(14:1)、又は15(15:1)の範囲である。開始材料の比率もまた、この範囲内にある。
１つの実施形態において、組成物は、脂質成分と複合体化された本明細書に記載されるRNAi化合物（例えば、siRNA、shRNA、又はmiRNA）を１つ以上、及び疎水性添加物を含有するマイクロ粒子又はナノ粒子を複数含有する。１つの実施形態において、疎水性添加物（例えば、少なくとも部分的に疎水性である添加物）は、炭化水素、テルペン化合物、又は疎水性脂質（例えば、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ステロール、ステロールエステル、アルキルエステル、酢酸ビタミンA、トリグリセリド、リン脂質）である。炭化水素は、芳香族、アルカン、アルケン、シクロアルカン、又はアルキンであってもよい。１つの実施形態において、炭化水素は、アルカン（すなわち、飽和炭化水素）である。他の実施形態において、炭化水素は、C15-C50炭化水素である。さらなる実施形態において、炭化水素は、C15、C20、C25、C30、C35、C40、C45 又はC50炭化水素である。さらに他の実施形態において、疎水性添加物は、C15-C25炭化水素、C15-C35炭化水素、C15-C45炭化水素、C15-C20炭化水素、C20-C25炭化水素、C25-C30炭化水素、C30-C35炭化水素、C35-C40炭化水素、C40-C45炭化水素、又はC45-C50炭化水素である。
疎水性添加物は、組成物中に存在するとき、１つの実施形態において、25モル％〜50モル％、例えば30モル％〜50モル％、35モル％〜45モル％で存在する。よりさらなる実施形態において、疎水性添加物は、約40モル％又は約45モル％で組成物中に存在している。
１つの実施形態において、RNAi化合物（例えば、１つ以上のsiRNA、１つ以上のshRNA、１つ以上のmiRNA、又はそれらの組み合わせ）化合物、脂質成分、及びテルペン化合物（例えば、疎水性添加物）を含有する組成物が提供される。さらなる実施形態において、組成物は、脂質成分として例えばPEG化カチオン性脂質などのカチオン性脂質を含有する。テルペン化合物（疎水性添加物）は、１つの実施形態において、炭化水素（例えば、イソプレン、スクアラン又はスクアレン）である。他の実施形態において、テルペン化合物は、ヘミテルペン(C5H8)、モノテルペン(C10H16)、セスキテルペン(C15H24)、ジテルペン(C20H32)(例えば、カフェストール、カーウェオール、センブレン、タキサジエン)、セスタテルペン(C25H40)、トリテルペン(C30H48)、セスクアテルペン(C35H56)、テトラテルペン(C40H64)、ポリテルペン(例えば、トランス二重結合を伴うポリイソプレン)又はノルイソプレノイド（例えば、3-オキソ-α-イオノール、7,8-ジヒドロイオノン誘導体）である。テルペン化合物は、他の実施形態において、以下の表3に提示される化合物のうちの１つから選択される。１つの実施形態において、疎水性添加物は、スクアランである。
RNAi化合物及びその標的
「干渉RNA」又は「RNAi」又は「干渉RNA配列」という用語は、（干渉RNA配列に対し相補的なmRNAの分解を調節することにより、又は翻訳を阻害することにより）標的遺伝子又は標的配列の発現を低下させることができる、又は阻害することができる一本鎖RNA（例えば成熟miRNA）又は二本鎖RNA（すなわち、例えばsiRNA、aiRNA、又はプレ−miRNAなどの二重鎖RNA）を指す。従って、干渉RNAは、標的mRNA配列に対し相補的な一本鎖RNAを指し、又は２つの相補的な鎖により形成された二本鎖RNA、もしくは１つの自己相補鎖により形成された二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子又は標的配列に対し実質的な、又は完全な同一性を有していてもよく、又はミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含有してもよい。干渉RNAの配列は、全長標的遺伝子に対応していてもよく、又はその部分配列に対応していてもよい。
当分野の当業者であれば、原則として、siRNAのいずれかの鎖が、RISCに組み込まれ、ガイド／アンチセンス鎖として機能し得ることを認識するであろう。siRNAの設計（例えば、所望されるガイド鎖の5’末端でのsiRNA二重鎖の安定性の低下など）は、所望されるガイド鎖のRISCへの組み込みを有利にすることができることに注意されたい。
siRNAのアンチセンス鎖は、当該アンチセンス鎖がRISCに組み込まれるという点でsiRNAの活性誘導剤であり、これによって、RISCが、切断又は翻訳抑制に対して、アンチセンスsiRNAに少なくとも部分的に相補的な標的mRNAを特定することができる。ガイド鎖に対し少なくとも部分的に相補的な配列を有するmRNAのRISC関連切断は、mRNAの定常状態レベルの低下をもたらし、及びこのmRNAにコードされる対応タンパク質の定常状態レベルの低下をもたらす。あるいは、RISCは、標的mRNAの切断を伴わずに、翻訳抑制を介して対応タンパク質の発現を低下させる。
１つの態様において、本発明は、脂質粒子に複合体化された、又は封入されたRNA干渉（RNAi）化合物を含有する医薬組成物を提供する。RNAi化合物は、メッセンジャーRNA（mRNA）を標的とし、当該mRNAの対応するタンパク質の機能は、例えば炎症反応（例えば、１つ以上の脂質メディエーターの放出）、顆粒球中の顆粒の脱顆粒（例えば、好中球の脱顆粒）、又は肺感染部位への免疫細胞もしくは顆粒球のリクルートなどの、貪食細胞反応に関連づけられている。例えば、１つの実施形態において、RNAi化合物が提供され、当該RNAi化合物は、mRNAを標的とし、当該mRNAの対応するタンパク質の機能は、例えば好酸球、好塩基球、肥満細胞、又は好中球細胞などの顆粒球の脱顆粒と関連づけられている。
RNAi化合物により標的化されたmRNAは、本明細書において「標的mRNA」とも呼称され、干渉RNA鎖（例えば、siRNA鎖）に対し相補的な配列、又は実質的に相補的な配列を含有するmRNAを意味する。標的mRNAは、非ヒト動物のmRNA、又はヒトのmRNAであってもよい。標的mRNAは、当該干渉RNAがサイレンシングとして機能する限り、又は標的mRNAとRISC複合体を形成するよう機能する限り、干渉RNA鎖に対し100％相補的である必要はない。１つの実施形態において、干渉RNA鎖（例えば、siRNA鎖）は、標的mRNAに対し、100％相補的、少なくとも約99%相補的、少なくとも約95%相補的、少なくとも約90%相補的、少なくとも約85%相補的、少なくとも約80%相補的、少なくとも約75%相補的、又は少なくとも約70%相補的である。標的mRNAは本明細書に記載される。
本発明の干渉RNAは、１つの実施形態において、標的mRNAの切断に対し、触媒的な様式で作用する。言い換えると、本明細書に記載されるsiRNA組成物は、不足当量的な量で、標的mRNAの阻害を生じさせることができる。１つの実施形態において、本発明組成物中に存在するsiRNA化合物は再利用され、１個のsiRNA分子は、少なくとも約500個又は少なくとも約1000個のmRNA分子の切断を誘導することができる。従って、アンチセンス療法と比較し、非常に少ないsiRNAが、かかる切断条件下で治療効果をもたらすために必要とされる。
本明細書において使用される場合、「siRNA」という用語は、別段の記載がない限り、二本鎖RNAi化合物（干渉RNA化合物）を指す。本発明のsiRNAは、２つのヌクレオチド鎖を含有する二本鎖核酸分子であり、各鎖は、約17個〜約30個のヌクレオチド（例えば、約17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30個のヌクレオチド）を有する。「siRNA」分子に加えて、他のRNAi化合物も、本発明での使用に適している。RISCと相互作用し、RNA干渉経路を活性化することができる他の干渉RNA分子の例としては、短いヘアピン型RNA（shRNA）、一本鎖siRNA、マイクロRNA（miRNA）、及びダイサー−基質の27mer二重鎖が挙げられる。本発明の目的に対し、RISCと相互作用し、RNA干渉経路に関与することができる任意のRNA又はRNA様分子（例えば、化学的修飾、DNA置換、又は非天然ヌクレオチドを有するRNA分子）は、本明細書において本発明RNAi化合物と呼称される。
１つの実施形態において、組成物の核酸化合物は、RNA干渉（RNAi）化合物である。RNAi化合物としては、低分子干渉RNA（siRNA）、短いヘアピン型RNA（shRNA）、及びマイクロRNA（miRNA）が挙げられる。
１つの実施形態において、RNAi化合物は、siRNA、shRNA、又はmiRNAであり、例えば非特異的mRNAサイレンシングを防ぐために、約30ヌクレオチドの長さよりも短い。１つの実施形態において、本発明のRNAi化合物は、約15〜約29ヌクレオチドの長さである。１つの実施形態において、本発明のsiRNA配列は、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、又は約29ヌクレオチドの長さである。本発明のsiRNA配列は、例えば、化学的に又は改変モチーフを含有するように改変されていてもよい。（例えば、Braaschら (2003)；Chiuら (2003)；国際特許出願公開WO2004/015107及びWO02/44321、米国特許第5,898,031号及び第6,107,094号、米国特許出願公開2005/0080246及び2005/0042647を参照のこと。これらの各々は、すべての目的に対しその全内容が参照により援用される）。例えば、siRNAオリゴヌクレオチドは、5’-リン酸部分又は2’-O-メチル修飾の含有で改変されていてもよい。
１つの実施形態において、RNAi化合物は、二本鎖RNAi化合物又は一本鎖RNAi化合物として組成物中に存在する（例えば、干渉RNAを内生的に発現する必要のないsiRNA化合物として）。
本明細書において記載される場合、１つの実施形態において標的細胞は貪食細胞である。１つの実施形態において、標的細胞は顆粒球である。さらなる実施形態において、標的細胞は好中球である。さらに他の実施形態において、標的細胞は、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、マクロファージ、単球、又は樹状細胞から選択される。１つの実施形態において、細胞は単核貪食細胞である。さらなる実施形態において、単核貪食細胞は、単球又はマクロファージである。よりさらなる実施形態においては、マクロファージは肺胞マクロファージである。
１つの実施形態において本明細書に提示される組成物は、脂質粒子に複合体化されたRNAi化合物を１つ以上含有する。例えば、2個以上のsiRNA、2個以上のshRNA、又はsiRNAとshRNAの組み合わせが、組成物中に存在していてもよい。１つの実施形態において組成物は、１つ以上のsiRNA、shRNA、又はmiRNAに複合体化された脂質粒子を含有する。
RNAi化合物は、非改変リボヌクレオチド、又は非改変リボヌクレオチドと、リボヌクレオチド及び／又は非天然リボヌクレオチドの組み合わせを含有してもよい。
様々な実施形態において、本発明の組成物は、mRNAを標的とするRNAi化合物を含有しており、当該mRNAに対応するタンパク質産物は、肺疾患／障害の発症に重要な役割を果たしている。一部の実施形態において、本発明の組成物は、肺線維症又はサルコイドーシスの発症に関与するmRNAを標的とするRNAi化合物を含有している。
例えば、特発性肺線維症（IPF）は、肺組織における正常ではない過剰なコラーゲンの沈着を含む／が関与する、異常な創傷治癒過程の結果であると考えられている。従って、１つの実施形態において、本発明の組成物は、コラーゲン合成過程に関与する１つ以上のmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する。
COL1A1遺伝子は、I型コラーゲンのプロ−アルファ１鎖をコードすることが知られており、当該I型コラーゲンの三重ヘリックスは、２つのアルファ１鎖と１つのアルファ２鎖を含有している。１つの実施形態において、本発明の組成物は、COL1A1のmRNAを標的とする例えばsiRNAなどのRNAi化合物を含有する。他の実施形態において、本発明の組成物は、例えばCOL1A2のmRNAを標的とするsiRNAなどの、アルファ２鎖を標的とするsiRNAを含有する。
実験から、例えばIII型コラーゲン、IV型コラーゲン、及びV型コラーゲンなどの他の型のコラーゲンもまた、肺線維症の発症に関連していることが示されている。従って、ある実施形態において、本発明は、例えばCOL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、又はCOL5A3 mRNAを標的とするsiRNAを含有する組成物など、III型、IV型、又はV型のコラーゲンを標的とするsiRNAを含有する組成物を提供する。
他の実施形態において、本発明の組成物は、コラーゲン合成の重要な酵素であり、２つの同一のアルファサブユニットと、２つのベータサブユニットから構成されるプロリル 4-ヒドロキシラーゼをコードするmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する。プロリル 4-ヒドロキシラーゼは、新たに合成されたプロコラーゲン鎖の適正な三次元フォールディングに必須な4-ヒドロキシプロリンの形成を触媒する。例示的な実施形態において、RNAi化合物は、いくつかの異なる型のアルファサブユニットのうちの１つをコードするP4HA1 mRNAを標的とする。
TGFβは、肺線維症の発症に関与している。従って、１つの実施形態において、本発明の組成物は、TGFβ又はTGFβの受容体を標的とするsiRNAを含有する。
サルコイドーシスは、患者の肺をはじめとする様々な器官におけるサルコイド肉芽腫の形成を含んでいる。単球及びマクロファージは、サルコイド肉芽腫の形成に関与しており、また免疫反応をさらに増強させる広範なサイトカインも分泌する。例えば、肺胞マクロファージは、腫瘍壊死因子α（TNFα）を分泌する。TNFαは、サルコイド肉腫の形成と維持の両方に重要な役割を果たすと考えられている。従って、１つの実施形態において、本発明の組成物は、TNFαのmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する。
さらに、全ゲノム関連解析（genome wide association study）によって、近年、サルコイドーシスに対する感受性と連鎖している可能性のある遺伝的因子として、アネキシンA11遺伝子における一塩基多型（SNP）が特定された。１つの実施形態において、本発明の組成物は、アネキシンA11のmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する。１つの実施形態において、RNAi化合物は、サルコイドーシスに対する感受性と連鎖している、様々な型のアネキシンA11のmRNAを標的としている。
１つの実施形態において、本発明の組成物は、本明細書に記載されるサイトカイン及びケモカインの受容体を標的とするRNAi化合物を含有する。例えば、１つの実施形態において、組成物は、TNFαの受容体を標的とするRNAi化合物を含有する。他の実施形態において、組成物は、IL-6受容体、IFNγ受容体、IL-12受容体、又はIL-17受容体を標的とするRNAi化合物を含有する。
さらに他の一部の実施形態において、RNAi化合物は、任意の数のmRNAを標的としてもよく、当該mRNAの対応するタンパク質は、例えば炎症反応、肺感染部位への免疫細胞もしくは顆粒球の脱顆粒又はリクルート（すなわち、走化性）などの貪食細胞の過程と関連している。貪食細胞は、多くの肺疾患に関与しており、及び、貪食細胞には好中球、好塩基球、好酸球、肥満細胞、マクロファージ又は単球、樹状細胞、及び線維芽細胞が含まれる。例えば組成物は、本明細書に記載されるリポソーム組成物、又は脂質ナノ粒子組成物である。
患者の肺における炎症は、持続性で過剰な好中球の浸潤が特徴である。好中球及び他の貪食細胞もまた、多量の破壊的なオキシダーゼ及びプロテアーゼを放出することが判明している。１つの態様において、本発明は、貪食細胞の脱顆粒を阻害することによる、CFにおける肺損傷を治療及び／又は予防するための組成物、システム、及び方法を提供する。１つの態様において、本明細書に記載される組成物、システム、及び方法を使用して、例えば好中球の脱顆粒を妨げるなど、顆粒球の脱顆粒メカニズムを妨げることによって、その必要のある患者における肺損傷又は肺疾患を治療する。
１つの実施形態において、組成物は、顆粒（例えば、細胞シグナル伝達化合物）の産生又は顆粒の脱顆粒を調節する、又はシグナル伝達するタンパク質である、顆粒球の顆粒の構造成分をコードするmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する。
１つの実施形態において、顆粒球は、好中球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、又は単球である。
１つの実施形態において、RNAi化合物は、mRNAを標的とし、当該mRNAの対応するタンパク質の機能は、貪食細胞の脱顆粒と関連している。さらなる実施形態において、貪食細胞の脱顆粒は、好中球の脱顆粒である。さらなる実施形態においては、好中球の脱顆粒は、一次顆粒の脱顆粒を含有する。しかしながら、脱顆粒は、一次顆粒に限定されない。むしろ、他の実施形態において、RNAi化合物は、mRNAを標的とし、そのmRNAの対応するタンパク質の機能は、好中球における二次顆粒、三次顆粒、又は分泌小胞の脱顆粒と関連している。
例えば、好中球の脱顆粒の場合、１つの実施形態において、本発明のRNAi化合物は、一次顆粒、二次顆粒、三次顆粒、又は分泌小胞の脱顆粒の過程と関連付けられているタンパク質をコードするmRNAを標的とする。
１つの実施形態において、RNAi化合物は、mRNAを標的とし、そのmRNAの対応するタンパク質の機能は、一次好中球顆粒の脱顆粒と関連しており、それら顆粒は例えばエラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、カテプシン及びディフェンシンなどの毒性メディエーターを貯留している。好中球の脱顆粒のメカニズムは、Lacy (2006).Allergy, Asthma, and Clinical Immunology 2, pp. 98-108に提示されている。当該文献はすべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。1つの実施形態において、好中球の脱顆粒における機能を有しているとLacyに記載されている標的のうちの１つ以上のmRNA発現が、本発明のRNAi化合物のうちの１つ以上の標的となる。
特定の例において、肺傷害の始まりと増幅は、肥大した炎症反応の結果である。炎症は、損傷又は感染に対する生理的な防御反応であり、修復の促進が意図されているが、時折、炎症反応がさらなる損傷と臓器機能不全を生じさせる場合がある。例えば、炎症性慢性肺障害、慢性閉塞性肺疾患（COPD：chronic obstructive pulmonary disease）、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、及び嚢胞性線維症は、大規模な炎症反応から生じる重度な肺の機能不全の症候群である。これら慢性炎症性肺障害の組織学的な特徴のうちの１つは、肺の微小血管系における好中球の蓄積である（Korkmaz ら、2010）。Pharmacol. Rev. 62, pp. 726-759。当該開示内容は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される。本発明は、脂質成分及びRNAi化合物を含有するRNAi組成物を提供することにより、特に例えば表４〜７に参照されるこれら障害のうちの１つ以上に効果的な治療に関するニーズに対処するものであり、当該RNAi化合物の標的は、炎症部位への好中球のリクルート（又は他の貪食細胞のリクルート）に関与するタンパク質、例えばサイトカインもしくはケモカインなどの炎症性分子、又は好中球脱顆粒に関与するタンパク質（例えば、細胞融合タンパク質又は小胞タンパク質）をコードするmRNAである。
好中球は、最も豊富に存在するタイプの白血球であり（40％〜75％）、自然免疫系の必須部分を担っている。好中球は様々な肺障害の発症に寄与している。好中球の破壊的な特性は、肺疾患の微小環境状況において、非常に有害である。従って、学説に拘束されることは望まないが、本明細書に提示される組成物は、好中球顆粒からの毒性メディエーターの放出を阻害することにより、肺疾患又は肺損傷の治療に有効であると考えられる。
好中球は、複数のメディエーターを含有しており、それらは顆粒から放出される。一次顆粒内には、少なくとも以下のメディエーターが存在し得る：エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、カテプシンG、α-ディフェンシン、及びアズロシジン１。１つの実施形態において、本発明のRNAi化合物は、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、カテプシンG、α-ディフェンシン、及びアズロシジン１のmRNAを標的とする。siRNAは、当分野の当業者に公知の方法に従い設計されてもよく、又は商品を購入してもよい。例えば、エラスターゼ（カタログ番号はsc-36042、sc-36042-PR、sc-36042-SH、sc-36042-V）、MPO (カタログ番号はsc-43942、sc-43942-PR、sc-43942-SH、sc-43942-V)、カテプシンG(カタログ番号はsc-41478、sc-41478-PR、sc-41478-SH、sc-41478-V)、α-ディフェンシン(カタログ番号はsc-40476、sc-40476-SH、sc-40476-V) 及びアズロシジン1 (カタログ番号はsc-42966、sc-42966-PR、sc-42966-SH、sc-42966-V)のRNAi化合物が、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手可能であり、本明細書に記載される組成物及び方法での使用に適している。
好中球はまた、少なくともIFN-γ、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターロイキン-17(IL-17)、インターフェロン-γ（IFN-γ）、及びインターフェロン-α（IFN-α）を含む多くの炎症性メディエーターを分泌する。これらタンパク質をコードするmRNAもまた、本明細書に提示されるRNAi組成物及び方法での標的化に適している。
マクロファージは、侵入病原体に対する防御の最前線を担う自然免疫細胞である。マクロファージは、貪食過程で、細胞残渣、外来性物質、及び微生物を取り込み、消化するタイプの白血球である。ヒトのマクロファージは、直径が約21μmmであり、組織において単球の分化により産生される。肺胞マクロファージは、肺胞に存在するタイプのマクロファージであり、一部の実施形態において、これら細胞により発現されるmRNAは、本発明のRNAi化合物により標的化される。例えば、１つの実施形態において、肺胞マクロファージのmRNAを標的とするRNAi化合物が提供される。
外来性物質の認識、貪食、及び外来性物質の破壊に加えて、マクロファージは抗原提示にも関与しており、ならびに酵素、酵素阻害物質、サイトカイン、ケモカイン、補体成分、凝固因子、及びアラキドン酸中間体をはじめとする広範な産物の分泌にも関与している（Parameswaran 及び Patial. (2010). Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 20, pp. 87-103。当該文献は、すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される）。かかる因子の分泌とは別に、マクロファージはまたこれらの産物に対して反応し、それによって免疫応答を増強させる。マクロファージは様々な肺障害の発症に寄与し、マクロファージが介在する炎症の破壊的な特性は、肺疾患の微小環境状況において非常に有害である。例えば、肺胞マクロファージの数は、炎症性肺疾患の患者の肺において、リクルート、増殖、及び生存の増強の結果として、著しく増加している。これら細胞は炎症性メディエーター、酸化物質、タンパク質、及びタンパク質分解酵素を分泌している。かかる分泌産物、及び炎症部位へのマクロファージのリクルートのメディエーターを、本明細書に記載される組成物及び方法を介して標的化することにより、様々な肺障害の治療に対する治療戦略が提供される。
マクロファージのメディエーター及びエフェクターとしては、TNF-α、IL-12、IFN-γ、IFN-α、IL-6、IL-8、IL-8受容体(CXCR1及びCXCR2)、IL-10、IL-17、IL-1β、TGF-β、iNOS、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP：macrophage inflammatory protein)、及びC-Cケモカイン受容体5型(CCR5：C-C chemokine receptor type 5)が挙げられる。１つの実施形態において、これらメディエーター／エフェクターのうちの１つをコードするmRNAが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法により標的化される。他の実施形態において、TNF-α、IL-12、IFN-γ、IFN-α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-1β、又はTGF-βの受容体をコードするmRNAが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法により標的化される。
単球は、骨髄により産生され、その後約1〜3日間、血流中を循環するタイプの白血球である。その後、通常は、身体中の組織内へと移動する。血流から他の組織へと移動した単球は、その後、組織在住型マクロファージ又は樹状細胞へと分化する。しかしながら、血流中のそれら単球もまた、貪食、抗原提示、及びサイトカイン産生を行うことができる。それゆえ、一部の疾患には関与している。単球のメディエーター及びエフェクターとしては、少なくともTNF-α、インターロイキン（IL）-12、インターフェロン（IFN）-γ、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-10、IL-8、IL-8受容体(CXCR1及びCXCR2)、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）、及びCCR5が挙げられる。１つの実施形態において、これらメディエーター／エフェクターのうちの１つをコードするmRNAが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法により標的化される。
樹状細胞は単球から誘導され、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）などの様々な肺障害の発症に関与している。樹状細胞介在性炎症の破壊的な特性は、肺疾患の微小環境状況において、非常に有害である。樹状細胞のメディエーター及びエフェクターとしては、少なくともTNF-α、IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-8受容体(CXCR1及びCXCR2)、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)、及びCCR5が挙げられる。それら分子の各々は上記に検討されており、各mRNAは、本明細書に提示されるRNAi組成物のうちの１つを用いて標的化され、例えば肺損傷、又は例えば表４、表５、表６又は表７に明記される肺障害のうちの１つなどの肺障害を治療することができる。
好酸球は、脊椎動物における多細胞性寄生体及び特定感染体との攻防に寄与する免疫系の構成要素のうちの１つである。また肥満細胞とともに、アレルギー及び喘息と関連したメカニズムを制御する。また、それらは感染症、薬物誘導性肺炎、吸入毒物、全身性疾患（例えば、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（正式には、チャーグ-ストラウス症候群）、レフラー症候群）、及びアレルギー性気管支肺アスペルギルス症をはじめとする多くの好酸球性肺疾患に関与している。また好酸球は、熱帯性肺好酸球増多症、好酸球増多症候群、及び一部の肺癌にも寄与している。
好酸球は、少なくともロイコトリエンB4受容体1(BLT1)、ロイコトリエンB4受容体2(BLT2)、システイニルロイコトリエン受容体1及び2(CysLT1及びCysLT2)、ならびに血小板活性化因子受容体(PAFR)を含む脂質メディエーターの受容体を含有する。好酸球は、顆粒から放出されるメディエーターを含有し、当該メディエーターとしては、少なくともエラスターゼ、及びカテプシンGが挙げられる。好酸球は、走化性に関与するメディエーター及び／又はエフェクターを含有し、それらとしては、少なくともMIP-1α (CCL3)、RANTES (CCL5)、CCR5 (CCL3、4、及び5の受容体)、エオタキシン-1 (CCL11)、及びIl-8が挙げられる。好酸球は、少なくともTNF-α、IL-12、IL-6、IL-5、IL-13、IL-10、及びTGF-βを含む炎症性メディエーターを分泌する。１つの実施形態において、これらメディエーター／エフェクターのうちの１つをコードするmRNAが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法により標的化される。
肥満細胞は、ヒスタミン及びヘパリンに富んだ多くの顆粒を含有する。肥満細胞は、好塩基球と外観及び機能の両方が非常に類似している。それらは、肥満細胞が、例えば粘膜組織などの組織在住型であり、一方で好塩基球は血液中に存在するという点で異なっている。肥満細胞は、刺激され、直接的損傷により脱顆粒することができ、イムノグロブリンE（IgE）受容体を架橋することができ、又は補体タンパク質を架橋することができ、様々な疾患の炎症を調節し得る。肥満細胞は、少なくとも以下のメディエーター又はエフェクターを放出する：ヒスチジンデカルボキシラーゼ（HDC）、ヒスタミンH4受容体、ロイコトリエンB4受容体2(BLT 2)、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、及びIL-3。１つの実施形態において、これらメディエーター／エフェクターのうちの１つをコードするmRNAが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法により標的化される。
好塩基球は、最も稀な顆粒球であり、循環白血球の約0.01％〜0.3％である。肥満細胞と同様、好塩基球もヒスタミンを貯蔵及び放出して、好塩基球性炎症を調節する。好塩基球は特に、致死性の喘息に関与している。好塩基球は少なくとも以下のメディエーター又はエフェクターを放出する：ヒスチジンデカルボキシラーゼ(HDC)、histamine H4受容体、RANTES (CCL5)、IL-4、及びエラスターゼ。１つの実施形態において、これらメディエーター／エフェクターのうちの１つをコードするmRNAが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法により標的化される。
一次好中球顆粒に含有されるエラスターゼは、例えば細菌外膜タンパク質（複数含む）と毒性因子（複数含む）を破壊するなど、炎症反応の間に利用されるが、これもまた破壊的である。エラスターゼはタイトジャンクションを破壊し、組織にタンパク質分解性のダメージを与え、サイトカイン及びアルファタンパク質分解酵素を壊し、イムノグロブリンAとG（IgA及びIgG）を切断し、そして補体カスケードの構成要素であるC3biと、貪食に関与するもう１つの補体分子に対する好中球上の受容体であるCR1の両方を切断する。IgA、IgG、C3bi、及びCR1の切断によって、貪食により細菌を殺す好中球の能力が低下する。従って、本発明のRNAi化合物を用いた好中球のエラスターゼ放出の標的化は、学説に拘束されることは望まないが、本明細書に記載される肺障害の治療に有益な効果を有すると考えられる。エラスターゼのmRNA配列は当分野に公知であり、例えばAH001514.1（配列番号１）、NM_001972.2（配列番号２）、Y00477.1（配列番号３）、及び NM_002087.3（配列番号４）がある。従って、これらmRNAのうちの１つを標的とするsiRNA化合物の設計は、当分野の当業者の技術範囲内である。エラスターゼmRNAに対し特異的な市販のRNAi化合物の１つの例は、上述されている。
ミエロペルオキシダーゼ（MPO）は、慢性炎症性疾患で細胞外に放出されたときに、組織損傷の局所メディエーターである。MPOは、好中球の呼吸バーストの間に、過酸化水素（H2O2）と塩素アニオン（Cl-）から次亜塩素酸、又は非塩素ハライドから同等物を産生する。さらに、酸化剤として過酸化水素を使用してチロシド（tyroside）をチロシルラジカルに酸化する。次亜塩素酸とチロシルラジカルは細胞毒性がある。そのため、それらは好中球によって、細菌及び他の病原体を殺傷するために使用される。しかし同時に、それらは宿主組織に対し破壊的でもある。従って、本発明のRNAi化合物を用いたMPOの好中球放出の標的化は、学説に拘束されることは望まないが、本明細書に記載される肺障害の治療に有益な効果を有すると考えられる。
カテプシンGは一次好中球顆粒内に貯蔵されているセリンプロテアーゼであり、リソソームタンパク質分解酵素群に属している。それらは取り込まれた病原体の排除、サイトカイン及びケモカインのタンパク質分解性修飾、細胞表面受容体の活性化及び切断、ならびにアポトーシスをはじめとする好中球の広範な機能に関与している。カテプシンGは、急性肺損傷（ALI：acute lung injury）において直接的に、組織損傷を誘発し、透過性の変化をもたらす。従って、本発明のRNAi化合物を用いたカテプシンGの好中球放出の標的化は、学説に拘束されることは望まないが、ALIをはじめとする本明細書に記載される肺障害の治療に有益な効果を有すると考えられる。
α−ディフェンシン（1、1B、3、4）は、毛細血管−上皮バリアを破壊することにより、肺損傷を生じさせ得る。さらに、炎症性肺疾患を有する患者の血漿及びBAL液において、α−ディフェンシン値の上昇が判明しており、嚢胞性線維症の患者の唾液においては、1mg/mLに達している。従って、本発明のRNAi化合物を用いたα−ディフェンシンの好中球放出の標的化は、学説に拘束されることは望まないが、本明細書に記載される肺障害の治療に有益な効果を有すると考えられる。
アズロシジン1は、アズール顆粒に存在する抗生物質タンパク質であり、単球の遊走能と抗細菌活性を有している。また、多機能な炎症性メディエーターでもある。上述のように、本発明は1つの実施形態において、アズロシジン1のmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する組成物を提供する。
好中球の三次顆粒の中に、メタロプロテアーゼ9（MMP9）が存在し得る。当初、例えばマトリクスメタロプロテイナーゼ（MMP）などのマトリクスを分解することができるタンパク質分解酵素の活性は、過剰なマトリクスを分解するものと予測されていた。しかしながら、一部のMMPは、線維化促進機能を有する場合がある。MMP9は、そのような線維化促進プロテアーゼの１つである。MMP9は、細胞外マトリクス（ECM）構成要素の分解を介して、肺組織の損傷を生じさせる。MMP9は、正常な生理学的プロセス、ならびに病的なプロセスにおいて、細胞外マトリクス（ECM）の破壊に関与している。MMP9は、細胞外マトリクスの分解、IL-1βの活性化、及び数種のケモカインの切断により、好中球の機能に貢献している。１つの実施形態において、本明細書に提示されるRNAi組成物は、MMP9のmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する。RNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、MMP9のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、RNAi化合物は、購入することもできる。市販のMMP9のRNAi化合物の１つの例は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-29400、sc-29400-PR、sc-29400-SH、sc-29400-V)。
他の線維化促進MMPとしては、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、及びMMP-13が挙げられる。１つの実施形態において、本発明は、RNAi化合物が、前述の線維化促進MMPのうちの１つを標的とする組成物を提供する。
好中球の脱顆粒は、少なくともβ-アレスチン、Hck、VAMP-7、SNAP-23、及びシンタキシン-4により調節されている。従って、１つの実施形態において、本明細書に提示されるRNAi組成物は、βアレスチンのmRNA、HckのmRNA、VAMP-7のmRNA、SNAP-23のmRNA、及び／又はシンタキシン-4のmRNAを標的とするRNAi化合物を含有する。
β-アレスチンは、好中球の一次顆粒及び二次顆粒の脱顆粒を生じさせるシグナル伝達経路の活性化に必要とされる。細胞質型リンタンパク質グループとして、β-アレスチンは、活性化Gタンパク質共役受容体（GPCR）を、その関連ヘテロ三量体Gタンパク質から切り離し、CXCR1受容体の細胞質尾部に直接結合させる。β-アレスチンはまた、IL-8活性化好中球において一次顆粒及び二次顆粒と関連しており、Hck（一次顆粒）及びFgr（二次顆粒）にそれぞれ結合する。ゆえに、β-アレスチンは、ケモカイン活性化の間、細胞内の２つの部位で作用する。それら部位は、１つは細胞膜内の受容体部位、２つ目は顆粒膜上の部位である。従って、RNAi化合物を介したβ-アレスチンの発現阻害は、好中球の一次顆粒と二次顆粒の脱顆粒の阻害をもたらすと考えられる。β-アレスチンのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、β-アレスチンのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、β-アレスチンのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のβ-アレスチンのRNAi化合物の１つの例は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-29741、sc-29741-PR、sc-29741-SH、sc-29741-V)。
ヒト（Homo sapiens）の造血細胞キナーゼ（Hck：hemopoietic cell kinase）は、チロシンキナーゼのSrcファミリーに属するチロシン-タンパク質キナーゼである。好中球の遊走と、好中球の脱顆粒において重要な役割を果たしている。Hckは、シグナル伝達の活性化後、一次顆粒へと位置を変え、顆粒の移行を介在する。HckのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、HckのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、HckのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のHckのRNAi化合物の１つの例は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-35536、sc-35536-PR、sc-35536-SH、sc-35536-V)。
小胞関連膜タンパク質7（VAMP-7：Vesicle associated membrane protein 7）は、細胞膜上への顆粒の結合プロセスを介在する、顆粒膜上の結合タンパク質である。すべての一次顆粒、二次顆粒、及び三次顆粒に関与している。従って、RNAi化合物を介したVAMP-7の発現阻害は、顆粒結合プロセスの阻害による、好中球脱顆粒の阻害をもたらすと考えられる。VAMP-7のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、VAMP-7のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、VAMP-7のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のVAMP-7のRNAi化合物は、Life Technologies社(カタログ番号：139515、139516、139517)から入手することができる。
シナプトソーム関連タンパク質23（SNAP-23：Synaptosomal-associated protein 23）は、細胞膜上の顆粒の結合プロセスを介在する細胞膜上の結合タンパク質であり、シンタキシン-4と複合体を形成する。SNAP-23は、一次、二次、及び三次の好中球顆粒の結合に関与している。従って、RNAi化合物を介したSNAP-23タンパク質の発現阻害は、顆粒結合プロセスの阻害による、好中球脱顆粒の阻害をもたらすと考えられる。SNAP-23のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、SNAP-23のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、SNAP-23のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のSNAP-23のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-72219、sc-72219-PR、sc-72219-SH、sc-72219-V)。
シンタキシン-4は、細胞膜上の顆粒の結合プロセスを介在する細胞膜上の結合タンパク質であり、SNAP-23と複合体を形成する。SNAP-23は、一次、二次、及び三次の好中球顆粒の結合に関与している。従って、RNAi化合物を介したシンタキシン-4タンパク質の発現阻害は、顆粒結合プロセスの阻害による、好中球脱顆粒の阻害をもたらすと考えられる。シンタキシン-4のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、シンタキシン-4のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、シンタキシン-4のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のシンタキシン-4のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-36590、sc-36590-PR、sc-36590-SH、sc-36590-V)。
例えば好中球などの顆粒球の走化性によって、特定の組織内への顆粒球の浸潤及び局在が可能となる。１つの実施形態において、１つ以上の走化性因子のmRNAが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法により標的化される。
インターロイキン−8（IL-8）の受容体（例えば、CXCR1及びCXCR2）は、例えば好中球、マクロファージ、単球及び樹状細胞などの様々な貪食細胞上で発現されている。IL-8は、それら自然免疫細胞を惹きつけ、局所炎症部位に遊走させる化学誘引物質である。IL-8の結合は、（i）標的細胞（例えば、顆粒球）において走化性を誘導し、感染部位へと遊走させ、及び（ii）顆粒球の脱顆粒過程を誘導する、と考えられている。従って、１つの実施形態において、本発明のRNAi組成物は、IL-8をコードする、又はその受容体のうちの１つをコードするmRNAを標的とする。ゆえに、RNAi化合物を介したIL-8又はIL-8受容体タンパク質の発現阻害は、感染部位への顆粒球のリクルートの阻害、ならびに顆粒球の脱顆粒の阻害をもたらすと考えられる。IL-8又はIL-8受容体のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、IL-8又はIL-8受容体のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。 あるいは、又はさらに、IL-8又はIL-8受容体のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のIL-8のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)(IL8カタログ番号：sc-39631、sc-39631-PR、sc-39631-SH、sc-39631-V；CXCR1カタログ番号：sc-40026、sc-40026-PR、sc-40026-SH、sc-40026-V；CXCR2カタログ番号：sc-40028、sc-40028-PR、sc-40028-SH、sc-40028-V)から入手可能である。
Gβ2は、好中球指向性の細胞遊走及び浸潤を介在する、好中球において発現される主要なGβサブユニットのうちの１つである。１つの実施形態において、好中球指向性細胞遊走及び浸潤をRNAi組成物を用いて阻害することにより、本明細書に記載される肺障害又は肺損傷のうちの１つが治療される。Gβ2のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、Gβ2のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、Gβ2 のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のGβ2 のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-41764、sc-41764-PR、sc-41764-SH、sc-41764-V)。
本明細書に提示されるように、１つの実施形態において、siRNA-脂質組成物中に存在するsiRNA化合物は、mRNAを標的としており、当該mRNAの対応するタンパク質の機能は、炎症メディエーターとしての機能である。１つの実施形態において、炎症メディエーターは、サイトカイン又はケモカインである。さらなる実施形態において、炎症メディエーターは、サイトカインである。さらなる実施形態において、サイトカインは腫瘍壊死因子-α（TNF-α）である。他の実施形態において、サイトカインは、インターロイキンである。さらに別の実施形態において、サイトカインは、走化性サイトカインである。さらに別の実施形態において、TNF-αに対する受容体は、本発明の組成物及び方法により標的化される。
IFN-γは、ウイルス、一部の細菌、及び原生動物の感染に対する自然免疫及び獲得免疫に関与する炎症促進性サイトカインである。IFN-γはまた、マクロファージの活性化物質であること、ならびに単球及び好中球を炎症部位にリクルートすることが報告されている。異常なIFN-γの発現は、多くの炎症及び自己免疫疾患と関連付けられている。IFN-γは、活性化好中球ならびにT細胞から放出される。１つの実施形態において、IFN-γのmRNAは、本明細書に記載されるRNAi組成物のうちの１つを用いて標的化される。他の実施形態において、IFN-γ受容体のmRNAは、本明細書に記載されるRNAi組成物のうちの１つを用いて標的化される。IFN-γのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、IFN-γのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、IFN-γのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のIFN-γのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-39606、sc-39606-PR、sc-39606-SH、sc-39606-V)。
TNF-αは、全身性の炎症に関与する炎症促進性サイトカインであり、急性相の免疫反応に寄与している。例えば、上述の好中球など、多くの細胞がTNF-αを産生しているが、マクロファージが主要なTNF-αの産生源であり、TNF-αに対し、高度に反応性でもある。例えばマクロファージによるTNF-α産生などのTNFα産生の脱制御は、様々なヒトの疾患と関連している。TNF-αは炎症反応を促進し、同様に、炎症関連の発症をもたらす。ゆえに、１つの実施形態において、本発明は、RNAi経路を介したTNF-α産生の低下に役立つものである。他の実施形態において、本発明は、RNAi経路を介したTNF-α受容体の産生の低下又は活性の減弱に役立つものである。
１つの実施形態において、TNF-αのmRNAは、本明細書に記載されるRNAi組成物のうちの１つを用いて標的化される。TNF-αのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、TNF-αのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、TNF-αのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のTNF-αのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-37216、sc-37216-PR、sc-37216-SH、sc-37216-V)。
インターロイキン17（IL-17）サイトカインファミリーには、6種類のメンバーが存在し、IL-17A (一般的にIL-17とも呼称される)、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E (IL-25としても知られる)、及びIL-17Fが含まれる。IL-17ファミリーのメンバーは、マクロファージから分泌され、細胞外病原体による免疫系への侵入に反応する炎症促進性サイトカインとして機能し、病原体の細胞マトリクスの破壊を誘導する。IL-17ファミリーのメンバーは、例えばアレルギー性喘息など、喘息の発症において炎症促進性の機能を有している。気道におけるIL-17Fの過剰発現は、気道の好中球増多症、多くのサイトカインの誘導、気道過敏性の上昇、及び粘液分泌過多と関連している。
１つの実施形態において、１つ以上のIL-17のmRNAが、本明細書に記載されるRNAi組成物のうちの１つを用いて標的化される。IL-17のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、IL-17のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、IFN-γのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のIL-17のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-39649、sc-39649-PR、sc-39649-SH、sc-39649-V)。１つの実施形態において、IL-17ファミリーのメンバーに対する受容体をコードするmRNAが、本明細書に記載されるRNAi組成物のうちの１つを用いて標的化される。
インターフェロン-α（IFN-α）は、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球により産生されるI型インターフェロンファミリーである。ヒトにおいては、13の異なるIFN-α遺伝子が存在し、IFN-α1、-α2、-α4、-α5、-α6、-α7、-α8、-α10、-α13、-α14、-α16、-α17、及び -α21と指定されている。肺胞マクロファージは、RNAウイルスの肺感染における、主要なIFN-αの産生源であることが報告されている。IFN-αは、好中球を活性化することができ、同様に、好中球数を増加させることもできる。異常なIFN-αの産生は、免疫機能障害の原因となり、組織の炎症及び臓器障害を介在する。１つの実施形態において、IFN-αのmRNAは、本明細書に記載されるRNAi化合物のうちの１つを用いて標的化される。他の実施形態において、IFN-α受容体のmRNAは、本明細書に記載されるRNAi化合物のうちの１つを用いて標的化される。IFN-αのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、IFN-αのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、IFN-αのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のIFN-αのRNAi化合物は、Novus Biologicals, LLC社(コロラド州リトルトン) (IFN-α2、カタログ番号：H00003440-R01；IFN-α6、カタログ番号：H00003443-R01；IFN-α8、カタログ番号：H00003445-R01；IFN-α13、カタログ番号：H00003447-R01)から入手可能である。
IL-3は、多能性造血前駆細胞から骨髄前駆細胞への分化を刺激するサイトカインである。また、骨髄細胞系（顆粒球、単球、及び樹状細胞）のすべての細胞の分化も刺激する。そして液性免疫と獲得免疫の調節因子でもある。IL-4は、ナイーブヘルパーT細胞からTh2細胞への分化を誘導し、ならびにTh1細胞、マクロファージ（IFN-γ）、及び樹状細胞（IL-12）のサイトカイン産生を減少させる。IL-4の過剰産生は、アレルギーと関連がある。IL-4は、M2マクロファージの活性化を促進し、M1細胞へのマクロファージの古典的活性化を阻害する。リペアマクロファージ（M2：repair macrophages）の増加は、IL-10とTGF-βの分泌と一体であり、病的な炎症の減退をもたらす。活性化M2細胞によるアルギナーゼ、プロリン、ポリアミナーゼ、及びTGF-βの放出は、創傷治癒に密接に関連しており、及び有害な場合には線維症と密接に関連している。IL-5は、好酸球活性化のメディエーターである。IL-5は、アレルギー性鼻炎、及びアレルギー性喘息をはじめとする重度なアレルギー性疾患の原因と関連しており、それら疾患において循環型好酸球、気道組織型好酸球、及び誘発喀痰好酸球の数の大幅な増加が観察されている。
１つの実施形態において、本発明は、脂質成分に複合体化された、又は封入されたIL-3 mRNA、IL-4 mRNA、及び／又はIL-5 mRNAを標的とするRNAi化合物を含有する組成物を提供することにより、RNAi経路を介して、IL-3、IL-4、及び／又はIL-5の産生を減少させることに役立つものである。他の実施形態において、本発明は、IL-3、IL-4、及び／又はIL-5に対する受容体をコードするmRNAを標的とする組成物及び方法を提供する。１つの実施形態において、組成物を使用して、患者のアレルギー性鼻炎及び／又はアレルギー性喘息が治療される。
IL-3、IL-4、及び／又はIL-5のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、IL-3、IL-4、及び／又はIL-5のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、IL-3、IL-4、及び／又はIL-5のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のIL-3、IL-4、及びIL-5のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)（IL3カタログ番号：sc-39621、sc-39621-PR、sc-39621-SH、sc-39621-V；IL-4カタログ番号：sc-39623、sc-39623-PR、sc-39623-SH、sc-39623-V；IL-5カタログ番号：sc-39625、sc-39625-PR、sc-39625-SH、sc-39625-V)から入手可能である。
IL-13及びIL-4は、30％の配列類似性を示し、類似した構造を有している。IL-13は、免疫細胞に対し効果を有しており、その効果は、密接に関連したIL-4サイトカインの効果と類似している。IL-13はまた、多くの組織におけるアレルギー性炎症及び線維症発症により誘導される生理学的変化のメディエーターである。１つの実施形態において、本発明は、脂質成分及びRNAi化合物を含有するRNAi組成物を提供することにより、RNAi経路を介して、IL-13の産生を減少させることに役立つものであり、この場合において当該RNAi化合物は、IL-13 mRNAを標的としている。IL-13のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、本明細書において例示され、及び当分野の当業者に公知のIL-13のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、IL-13のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のIL-13のRNAi化合物は、OriGene社(メリーランド州ロックビル)(カタログ番号：TR312195)から入手可能である。他の実施形態において、本発明は、IL-13受容体のmRNAを標的とする組成物及び方法を提供する。
IL-6は、T細胞及びマクロファージから分泌される炎症促進性サイトカインであり、例えば感染及び外傷の後、特に火傷又は炎症をもたらす他の組織損傷後などの免疫反応を刺激する。IL-6は、多くの疾患において炎症プロセス及び自己免疫プロセスを刺激する。IL-6はまた、T細胞によるIL-17産生の活性化シグナルに寄与する。IL-12は、例えばマクロファージ及び樹状細胞などの貪食細胞により産生される炎症促進性サイトカインであり、Th1細胞へのナイーブT細胞の分化に関するシグナル伝達を制御する。T細胞及びナチュラルキラー（NK）細胞からのインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）及び腫瘍壊死因子-アルファ（TNF-α）の産生を刺激し、そしてIL-4介在性のIFN-γ発現抑制を減少させる。インターロイキン-１β（IL-1β）は、活性化マクロファージにより産生される炎症促進性サイトカインである。好中球の血管外遊出を生じさせる内皮細胞上の付着因子の発現を増加させる。IL-1βもまた、2型シクロオキシゲナーゼの誘導、及び一酸化窒素の合成を生じさせる。IL-8は、自然免疫細胞を惹きつけ、局所炎症部位へと遊走させる化学誘引物質であり、それらがその環境に近づくと、今度はIL-8は好中球の脱顆粒プロセスのシグナル伝達を誘発させる。これらの機能は、細胞の膜表面上のIL-8受容体であるCXCR1及びCXCR2へのIL-8の結合を介して行われる。IL-10は、M2マクロファージ及び一部のタイプのT細胞により産生される抗炎症性サイトカインである。免疫調節及び炎症において、複合的で多面的な効果を伴う機能を有しており、炎症促進性のTh1サイトカインの合成を阻害することができる。しかしながら、Th2細胞及び肥満細胞への促進性があり、その過剰刺激により例えば線維症などの疾患が生じる場合がある。１つの実施形態において、本発明は、脂質成分とRNAi化合物を含有するRNAi組成物を提供することにより、RNAi経路を介して、これらサイトカインの産生を減少させることに役立つものであり、この場合において当該RNAi化合物は、前述のインターロイキンのmRNAのうちの１つを標的としている。さらなる実施形態において、インターロイキンのmRNAは、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、又はIL-1βのmRNAである。他の実施形態において、本発明は、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、又はIL-1βに対する受容体をコードするmRNAが、本発明の組成物及び方法により標的化される。本明細書に記載される他のRNAi化合物と同様に、これらは、当分野の当業者により、例えば、本明細書において例示され、及び当分野の当業者に公知の各サイトカインmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、サイトカインのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のサイトカインRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)（IL-6カタログ番号：sc-39627、sc-39627-PR、sc-39627-SH、sc-39627-V；IL-12カタログ番号：sc-39640、sc-39640-PR、sc-39640-SH、sc-39640-V；IL-1β：sc-39615、sc-39615-PR、sc-39615-SH、sc-39615-V；IL-8：sc-39631、sc-39631-PR、sc-39631-SH、sc-39631-V；IL-10：sc-39635、sc-39635-PR、sc-39635-SH、sc-39635-V)から入手可能である。
TGF-βは、細胞増殖、分化、アポトーシス、細胞サイクル、胚形成、成長、創傷治癒、組織修復、血管形成、及び腫瘍成長を制御する多機能タンパク質である。TGF-β1は、肺をはじめとする多くの器官において、線維症誘導の重要なサイトカインの１つとして関与している（Laiら (2009). J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 28, pp. 109-119。本明細書においてすべての目的に対しその全内容が参照援用される）。本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載される組成物及び方法のうちの１つ以上におけるTGF-βのRNAi化合物、又はTGF-βの受容体のRNAi化合物の、例えば肺線維症又は間質性肺疾患（ILD）などの肺障害の治療のための使用を包含する。TGF-βのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、TGF-βのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、TGF-βのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のTGF-βのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-270322、sc-270322-PR、sc-270322-SH、sc-270322-V)。
C-Cケモカイン受容体5型（CCR5）は、RANTES（CCL5としても知られる走化性サイトカインタンパク質）、ならびにマクロファージ炎症性タンパク質（MIP：macrophage inflammatory protein）1α及び1β（それぞれ、CCL3及びCCL4としても知られる）に結合することができる走化性受容体であり、炎症を介在すると報告されている。従って、本明細書に提示される組成物及び方法は、RNAi経路を介したCCR5 mRNAの標的化に有用である。CCR5のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、CCR5のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、CCR5のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のCCR5のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-35062、sc-35062-PR、sc-35062-SH、sc-35062-V)。
RANTES（CCL5）は、T細胞、好酸球、及び好塩基球に対し走化性であり、それらを炎症部位へとリクルートする。T細胞によって放出される特定のサイトカイン（例えば、IL-2及びIFN-γ）の補助で、CCL5は、特定のナチュラルキラー（NK）細胞の増殖及び活性化を誘導し、CHAK（CC-ケモカイン-活性化キラー）細胞を形成させることもできる。 RANTESは、喘息患者の気道分泌物中に存在することが示されている（Culleyら (2006). J. Virol. 80, pp. 8151-8157。すべての目的に対しその全内容が参照により援用される）。RANTESは、急性肺同種移植片拒絶において重要な役割を果たしていることも報告されている。従って、１つの実施形態において、本発明は、RANTESのmRNAを標的とするRNAi化合物を提供する。さらなる実施形態において、RNAi組成物を使用して、肺移植を受けた患者、又は喘息患者を治療する。本明細書の他の実施形態において提示されるRNAi組成物のうちの１つを用いたRANTESの標的化は、表4、表5、表6、及び／又は表7に明記される肺障害のうちの１つの治療に使用される。RANTESのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、RANTESのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、RANTESのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のRANTESのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-44066、sc-44066-PR、sc-44066-SH、sc-44066-V)。
エオタキシン（エオタキシン-1又はCCL11とも指定される）は、隣接するシステイン残基の対が特徴であるケモカインのC-Cファミリー又はβファミリーのメンバーである。エオタキシン-1は、CCR2、CCR3、及びCCR5に結合する。しかしながら、エオタキシン-1は、その受容体に対し高度に選択的であり、そのため、CCR3を発現していない好中球及び単球に対しては不活性である。ヒトのエオタキシン受容体であるCCR3は、好酸球、好塩基球、及びTH2細胞上に発現されている。エオタキシン-1は、好酸球を選択的にリクルートする化学誘引物質であり、それゆえ、アレルギー性反応に関与している。COPD患者血清中にも存在することが示されている（Janz-Rozykら (2000). Mediators of Inflammation 9, pp. 175-179。すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される）。従って、１つの実施形態において、エオタキシンのmRNAは、本明細書に提示されるRNAi組成物によって、例えば、表4、表5、表6、及び／又は表7に明記される肺障害の治療に対して標的化される。他の実施形態において、エオタキシンRNAi組成物を使用して、COPD患者、又は喘息患者を治療する。エオタキシン-1のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、エオタキシン-1のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、RANTESのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のエオタキシン-1RNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-43753、sc-43753-PR、sc-43753-SH、sc-43753-V)。
マクロファージ炎症性タンパク質1α及び1β（MIP-1α及び-1β）、及びマクロファージ炎症性タンパク質2(MIP-2)は、およそ6〜8kdの、多くの炎症活性及び免疫制御活性を示すヘパリン結合タンパク質であり、走化性サイトカインのファミリーに属している（Driscoll (1994). Exp. Lung Res. 20, pp. 473-490。すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される）。それらはヒトの顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）を活性化し、それによって急性炎症を生じさせ得る。MIP発現の増加は、細菌性敗血症、珪肺、及び酸化誘導性肺損傷のモデルにおいて観察されている。ヒトにおける試験から、MIP-1αが、サルコイドーシス及び特発性肺線維症と関連した炎症性細胞反応に寄与していることが示されている（Driscoll (1994). Exp. Lung Res. 20, pp. 473-490。すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される）。
１つの実施形態において、本発明は、MIP-1α、MIP-1β、又はMIP-2のmRNAを標的とするRNAi化合物を含む、例えばサルコイドーシス又は特発性肺線維症などの炎症性細胞反応と関連した肺障害の治療のためのRNAi組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、MIP-1α、MIP-1β、又はMIP-2を標的とするRNAi化合物を含む、細菌性敗血症、珪肺、及び例えば、酸化誘導性肺損傷などの肺損傷の治療のためのRNAi組成物を提供する。MIPのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、MIPのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、MIPのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のMIPのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(MIP-1αのカタログ番号：sc-43933、sc-43933-PR、sc-43933-SH、sc-43933-V；MIP-1βのカタログ番号：sc-43932、sc-43932-PR、sc-43932-SH、sc-43932-V)。
顆粒球−マクロファージ刺激因子（GM-CSF）は、白血球増殖因子のサイトカインとして機能する。GM-CSFは、幹細胞を刺激して、顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）及び単球を産生させる。GM-CSFは、一部の炎症部位で高レベルで存在し、GM-CSF発現を阻害すると、炎症又は損傷が減少し得る。本発明は１つの実施形態において、、脂質成分と、GM-CSFのmRNAを標的とするRNAi化合物を含有するRNAi組成物、ならびにRNA組成物の肺送達を介して患者を治療する方法を提供することにより、肺においてGM-CSFのmRNAを標的とするものである。GM-CSFのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、本明細書において例示され、及び当分野の当業者に公知の各GM-CSFのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、GM-CSFのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のGM-CSFのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-39391、sc-39391-PR、sc-39391-SH、sc-39391-V)。また本明細書において、GM-CSFの受容体を標的とする組成物が提供される（本明細書に提示される方法及び組成物に使用され得る例示的なsiRNA化合物に関しては、Santa Cruz Biotechnology社のカタログ番号：sc-35501、sc-35501-PR、sc-35501-SH、sc-35501-Vを参照のこと）。
誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）は、マクロファージで発現される一酸化窒素合成酵素の誘導型アイソフォームである。この酵素はL-アルギニンからの一酸化窒素（NO）産生を触媒し、防御メカニズムとしての多量のNOを産生する。iNOSの発現は、自己免疫性の病因を有する疾患で報告されている。NO放出制御のかく乱は、ほとんどすべての炎症性疾患の病態生理と関連している（(Hesslingerら (2009). Biochem Soc. Trans. 37(Pt 4), pp. 886-891。すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される）。本発明は１つの実施形態において、様々な肺障害における炎症作用を阻害するために、RNAi組成物を用いてiNOS mRNAを標的化する。iNOSのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、iNOSのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、iNOSのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のiNOSのRNAi化合物は、OriGene社(メリーランド州ロックビル)(カタログ番号：TG302918)から入手可能である。
ヒスチジンデカルボキシラーゼ（HDC：Histidine decarboxylase）は、ヒスチジンからヒスタミンを産生する反応を触媒する酵素である（補因子のビタミンB6を使用する）。ヒスタミンは好塩基球及び肥満細胞により放出され、炎症反応に関与している。学説に拘束されることは望まないが、ヒスタミンは、免疫系の障害及びアレルギーに関与し得ると考えられている。例えば、肥満細胞症は、過剰なヒスタミンを産生する肥満細胞が増殖する稀な疾患である。従って、本発明は１つの実施形態において、肥満細胞症、喘息、及び／又は他の肺障害（例えば、表4、表5、表6、又は表7に明記される肺障害のうちの１つ）の治療を目的とした、脂質成分と、HDC RNAi化合物を含有するRNAi組成物に関する。HDCのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、HDCのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、HDCのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のHDCのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラスから入手することができる(カタログ番号：sc-45375、sc-45375-PR、sc-45375-SH、sc-45375-V)。
ヒスタミンのH4受容体は、好塩基球又は肥満細胞のいずれかから放出されたヒスタミンに反応し、好酸球の形状変化、ならびに好塩基球及び肥満細胞の走化性の調節に関与している。本発明は１つの実施形態において、異常なヒスタミンH4受容体発現に関連した障害の治療を目的とした、脂質成分と、ヒスタミンH4受容体のRNAi化合物を含有するRNAi組成物に関する。例えば、１つの実施形態において、肺障害は、表4、表5、表6、又は表7に明記される肺障害のうちの１つである。ヒスタミンH4受容体のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、ヒスタミンH4受容体のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、ヒスタミンH4受容体のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のヒスタミンH4受容体のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-40025、sc-40025-PR、sc-40025-SH、sc-40025-V)。
システイニルロイコトリエン（cys-LTs：cysteinyl leukotrienes、例えば、LTC4、LTD4、及びLTE4)は、CysLT1及びCysLT2の受容体と名付けられている、２つの構造的に異なるGタンパク質共役受容体を通じて作用する強力な生物活性脂質のファミリーである。システイニルロイコトリエン（CysLTs）は、喘息における気道閉塞及び炎症の発現に寄与している（Fullmerら (2005). Pediatr. Allergy Immunol. 16, pp. 593-601。すべての目的に対しその全内容が参照により本明細書に援用される）。従って、本発明は１つの実施形態において、肺の炎症、喘息、及び／又は他の肺障害（例えば、表3、表4、表5、又は表6に明記される肺障害のうちの１つ）の治療を目的とした、脂質成分と、CysLT1、及び／又はCysLT2のRNAi化合物を含有するRNAi組成物に関する。CysLT1、及び／又はCysLT2 のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、CysLT1、及び／又はCysLT2 のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、CysLT1、及び／又はCysLT2 のRNAi化合物は、購入することもできる。CysLT1、及び／又はCysLT2のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(CysLT1 カタログ番号：sc-43712、sc-43712-PR、sc-43712-SH、sc-43712-V；CysLT2 カタログ番号：sc-43713、sc-43713-PR、sc-43713-SH、sc-43713-V)。
血小板活性化因子（PAF：Platelet-activating factor）は、肺の炎症に関与するリン脂質炎症メディエーターである。例えば、急性肺損傷（ALI）を有する患者において、PAF値が増加していることが示されている。PAFの受容体は、血小板活性化因子受容体（PAFR：platelet-activating factor receptor）という名称である。本明細書の実施形態は、例えば、肺障害の治療のための、PAFR RNAi組成物を目的とする。１つの実施形態において、肺障害は、炎症と関連している。他の実施形態において、肺障害は、急性肺損傷である。さらに他の実施形態において、肺障害は、表4、表5、表6、又は表7に明記される肺障害のうちの１つである。PAFRのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、PAFRのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、PAFRのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のPAFRのRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-40165、sc-40165-PR、sc-40165-SH、sc-40165-V)。
脂質メディエーターは、細胞外刺激に反応して特定の生合成経路を介し局所的に産生されるある種の生物活性脂質である。この種の化合物は、多くの生理学的プロセスに寄与し、その脱制御は様々な疾患、特に炎症と関連している。ロイコトリエンは、あるタイプの脂質メディエーターであり、喘息及びアレルギー反応に関与しており、炎症反応が持続するよう作用する。本発明は１つの実施形態において、顆粒球、特に好中球上に存在する脂質メディエーターの受容体mRNAを標的とするRNAi化合物を含有するRNAi組成物を包含する。
好中球は、少なくともロイコトリエンB4受容体1（BLT1）及びロイコトリエンB4受容体2（BLT2）を含有する、脂質メディエーターの受容体を含有する。従って、本発明は１つの実施形態において、BLT1 mRNA又はBLT2 mRNAを標的とするRNAi化合物を含有するRNAi組成物を包含する。BLT1は、ロイコトリエンB4と呼ばれる脂質メディエーターに結合し、好中球機能のその下流シグナル伝達を生じさせる。BLT2は、脂質メディエーターのロイコトリエンB4に結合し、好中球機能のその下流シグナル伝達を生じさせる。１つの実施形態において、BLT1又はBLT2のmRNAは、本明細書に記載されるRNAi組成物のうちの１つを用いて標的化される。BLT1又はBLT2のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、BLT1又はBLT2のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、BLT1及び／又はBLT2のRNAi化合物は、購入することもできる。BLT1及びBLT2のRNAi化合物は、公開されている。例えば、Hirataら (2013). Lipids Health Dis. 12, p. 122を参照のこと。当該文献は、その全体で本明細書に参照により援用される。そのHirata配列は、本明細書における使用に適しており、以下である：
・ BLT1: 5'-CAACCUACACUUCCUAUUA-3'(センス)（配列番号５）及び
5'-UAAUAGGAAGUGUAGGUUG-3'（アンチセンス）（配列番号６）。
・ BLT2: 5'-GGGACUUAACAUACUCUUA-3'(センス)（配列番号７）及び
5'-UAAGAGUAUGUUAAGUCCG-3'（アンチセンス）（配列番号８）。
プロテイナーゼ3（PR3：Proteinase 3）は、好中球により産生されるセリンプロテアーゼであり、１つの実施形態において、PR3のmRNAは、本発明のRNAi組成物により標的化される。PR3は、例えばIL-8、IL-32、IL1-β、TNF-αなどの多くの炎症性分子を転換又は活性化する。また、抗好中球細胞質抗体（ANCA：anti-neutrophil cytoplasmic antibodies）により認識される抗原のうちの１つであり、肺損傷を含む多発性血管炎を伴う肉芽腫症疾患（正式には、「ウェゲナー肉芽腫症」）において発見されている。PR3のRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、PR3のmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、PR3のRNAi化合物は、購入することもできる。市販のPR3のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(カタログ番号：sc-42968、sc-42968-PR、sc-42968-SH、sc-42968-V)。
血管内皮増殖因子（VEGF：Vascular endothelial growth factor）は、多機能なサイトカインであり、炎症、血管新生、及び血管形成の間の内皮細胞の変化を調節することが示されている。研究により、好中球誘導型VEGFが、急性炎症及び慢性炎症の間の血管反応を制御し得ることが示されている。１つの実施形態において、VEGF受容体（VEGFR）（例えば、VEGFR-1 (Flt-1)又はVEGFR-2 (Flk-1)）のmRNAが、本発明のRNAi組成物により標的化される。学説に拘束されることは望まないが、RNAi経路を介して、肺の炎症部位でVEGFとその受容体との結合を減弱又は解離させることは、炎症性肺障害治療の有効な手段であると考えられている。実際に、気管支喘息においてVEGFの血清濃度は高く、このことから、喘息性炎症におけるVEGFの関与が示唆されている。VEGFRのRNAi化合物は、当分野の当業者により、例えば、VEGFRのmRNA配列の知識と、RNAi設計原理を用いて、設計されることができる。あるいは、又はさらに、VEGFRのRNAi化合物は、購入することもできる。市販のFlt-1及びFlk-1のRNAi化合物は、Santa Cruz Biotechnology社(テキサス州ダラス)から入手することができる(Flt-1のカタログ番号： sc-29319、sc-29319-PR、sc-29319-SH、sc-29319-V；Flk-1のカタログ番号：sc-29318、sc-29318-PR、sc-29318-SH、sc-29318-V)。
本明細書に提示されるRNAi組成物を用いた標的化に適用可能なmRNAの一部の要約を表1に提示する。
上述のように、本明細書に記載される標的mRNAのmRNA配列は、本発明のRNAi化合物の設計に有用である。本明細書に記載される特定の標的に対する参照ヒトmRNA配列を、以下の表2に提示する。ヒトmRNAの参照配列番号が本明細書に提示されているが、本発明は、非ヒトmRNAを標的とする組成物もまた包含する。
治療方法
本発明の１つの態様において、肺疾患又は肺障害を治療するための方法が提供される。
１つの実施形態において、肺障害を治療する方法は、その必要のある患者の肺に、本明細書に記載される組成物のうちの１つ以上を投与することを含む。１つの実施形態において、肺障害は、表4、表5、表6、表7、又はそれらの組み合わせに明記される肺障害のうちの１つである。
特定の実施形態において、本発明は、その必要のある患者の肺に、本発明の組成物を１つ以上投与することを含む、肺線維症を治療する方法を提供する。例示的な実施形態において、肺線維症を治療する方法は、その必要のある患者の肺に、脂質粒子に複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有する本発明に従う組成物を投与することを含み、この場合においてRNAi化合物は、コラーゲン合成に関与する（例えば、COL1A1、P4HA1など）mRNA、又はサイトカイン産生に関与する（例えば、TNFα、TGFβなど）mRNAを標的とする。
特定の実施形態において、本発明は、その必要のある患者の肺に、本発明の組成物を１つ以上投与することを含む、サルコイドーシスを治療する方法を提供する。例示的な実施形態において、サルコイドーシスを治療する方法は、その必要のある患者の肺に、脂質粒子に複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有する本発明に従う組成物を投与することを含み、この場合においてRNAi化合物は、コラーゲン合成に関与する（例えば、COL1A1、P4HA1など）mRNA、又はサイトカイン産生に関与する（例えば、TNFα、TGFβなど）mRNAを標的とする。他の実施形態において、サルコイドーシスを治療する方法は、その必要のある患者の肺に、脂質粒子に複合体化された、又は封入されたRNAi化合物を含有する本発明に従う組成物を投与することを含み、この場合においてRNAi化合物は、アネキシンA11のmRNAを標的とする。
本発明のRNAi組成物の投与により、非処置細胞と比較し、標的mRNAの発現及び／又は活性の低下がもたらされる。例えば、本発明組成物の投与によって、肺疾患又は肺障害において過剰発現されているmRNAの１つ以上、もしくは肺疾患又は肺障害に遺伝的に関連しているmRNAの１つ以上の発現及び／又は活性が下方制御される。
１つの実施形態において、本発明組成物の投与によって、貪食細胞反応と関連したタンパク質をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）の発現及び／又は活性が下方制御される。一部の実施形態において、貪食細胞は、マクロファージ及び／又は線維芽細胞である。
一部の実施形態において、組成物の投与によって、サイトカインをコードするmRNA、コラーゲン合成に関連するタンパク質をコードするmRNA、及び／又はリン脂質結合タンパク質をコードするmRNAの発現及び／又は活性が下方制御される。例示的な実施形態において、本発明組成物の投与によって、TNFα、COL1A1、プロリルヒドロキシラーゼ、及びアネキシンA11をコードするmRNAの発現及び／又は活性が下方制御される。
１つの実施形態において、本発明のRNAi組成物の投与により、標的mRNAによりコードされるタンパク質の発現及び／又は活性の低下がもたらされる。例えば、１つの実施形態において、本発明組成物の投与によって、例えばTNFα及びTGFβなどの炎症性サイトカインの産生が下方制御される。他の実施形態において、本発明組成物の投与によって、コラーゲン合成が下方制御される。
一部の実施形態において、本発明組成物は、患者の細胞において、例えばCOL1A1、P4HA1、TNFα、TGFβ、及びアネキシンA11のmRNAなどの標的mRNAの発現及び／又は活性を、非処置細胞に対し、その間の値を含む約、又は少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%又は100%まで低下させ、又は阻害する。
特定の実施形態において、組成物によりもたらされる標的mRNA（例えば、COL1A1、P4HA1、TNFα、TGFβ、及びアネキシンA11）の発現及び／もしくは活性における低下又は阻害は、非処置細胞に対し、その間の値及び下位範囲を含む、約5〜90%、5〜80%、5〜70%、5〜60%、5〜50%、5〜40%、5〜30%、5〜20%、5〜10%、10〜90%、10〜80%、10〜70%、10〜60%、10〜50%、10〜40%、10〜30%、20〜80%、約20〜70%、約20〜60%、約20〜50%、約20〜40%、約30〜80%、約30〜70%、約30〜60%、約30〜50%、約40〜80%、約50〜80%、約50〜70%、又は約50〜60%である。
一部の他の実施形態において、非処置細胞と比較し、標的mRNA（例えば、COL1A1、P4HA1、TNFα、TGFβ、及びアネキシンA11）の発現及び／又は活性において、約、又は少なくとも約2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、又は約10倍の低下がある。
一部の実施形態において、本発明組成物は、患者の器官において、貪食細胞及びリンパ球の、線維性プラーク及び／又はサルコイド肉芽腫へのリクルートを低下させ、又は阻害する。例えば、１つの実施形態において、患者の器官において、貪食細胞及び／又はリンパ球の、線維性プラーク及び／又はサルコイド肉芽腫へのリクルートにおいて、治療前のリクルート又は非治療患者と比較して、その間の値を含む、約、又は少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90% 、又は100%の低下がある。他の実施形態において、貪食細胞及び／又はリンパ球の、線維性プラーク及び／又はサルコイド肉芽腫へのリクルートにおいて、その間の値及び下位範囲を含む、約5〜90%、5〜80%、5〜70%、5〜60%、5〜50%、5〜40%、5〜30%、5〜20%、5〜10%、10〜90%、10〜80%、10〜70%、10〜60%、10〜50%、10〜40%、10〜30%、20〜80%、約20〜70%、約20〜60%、約20〜50%、約20〜40%、約30〜80%、約30〜70%、約30〜60%、約30〜50%、約40〜80%、約50〜80%、約50〜70%、又は約50〜60%の低下がある。
一部の実施形態において、本発明組成物は、貪食細胞及びリンパ球の、線維性プラーク及び／又はサルコイド肉芽腫から、患者の他の器官への移動を低下させ、又は阻害する。例えば、１つの実施形態において、治療前の移動と比較して、又は非治療患者と比較して、貪食細胞及び／又はリンパ球の移動において、その間の値を含む、約、又は少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%又は100%の低下がある。他の実施形態において、治療前の移動と比較して、又は非治療患者と比較して、貪食細胞及び／又はリンパ球の移動において、その間の値及び下位範囲を含む、約5〜90%、5〜80%、5〜70%、5〜60%、5〜50%、5〜40%、5〜30%、5〜20%、5〜10%、10〜90%、10〜80%、10〜70%、10〜60%、10〜50%、10〜40%、10〜30%、20〜80%、約20〜70%、約20〜60%、約20〜50%、約20〜40%、約30〜80%、約30〜70%、約30〜60%、約30〜50%、約40〜80%、約50〜80%、約50〜70%、又は約50〜60%の低下がある。
一部の実施形態において、本発明組成物は、治療前の産生と比較して、又は非治療患者と比較して、患者におけるTh1サイトカイン／ケモカインの産生を低下させる、又は阻害する。例えば、１つの実施形態において、治療前の産生と比較して、又は非治療患者と比較して、Th1サイトカイン／ケモカインの産生において、その間の値を含む、約、又は少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%又は100%の低下がある。他の実施形態において、治療前の産生と比較して、又は非治療患者と比較して、Th1サイトカイン／ケモカインの産生において、その間の値及び下位範囲を含む、約5〜90%、5〜80%、5〜70%、5〜60%、5〜50%、5〜40%、5〜30%、5〜20%、5〜10%、10〜90%、10〜80%、10〜70%、10〜60%、10〜50%、10〜40%、10〜30%、20〜80%、約20〜70%、約20〜60%、約20〜50%、約20〜40%、約30〜80%、約30〜70%、約30〜60%、約30〜50%、約40〜80%、約50〜80%、約50〜70%、又は約50〜60%の低下がある。
１つの実施形態において、本発明組成物は、治療前の線維性瘢痕又はプラークと比較し、又は非治療患者と比較して、肺線維症の線維性瘢痕又は線維性プラークを、例えば、その間の値を含む、約又は少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%又は100%まで低下させる。胸部X線、CTスキャン、及び／又は肺生検を使用して、患者の線維性瘢痕／プラークをモニターしてもよい。
１つの実施形態において、本発明組成物は、治療前のサルコイド肉芽腫と比較し、又は非治療患者と比較して、患者のサルコイド肉芽腫を、例えば、その間の値を含む、約又は少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%又は100%まで低下させる。胸部X線、CTスキャン、及び／又は肺生検を使用して、患者のサルコイド肉芽腫の状態をモニターしてもよい。
他の実施形態において、本発明組成物は、治療前の酸素飽和度と比較し、又は非治療患者と比較して、患者の血中酸素飽和度を、例えば、その間の値を含む、約又は少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%又は100%まで改善する。酸素測定法を使用して、酸素飽和度をモニターしてもよい。
様々な実施形態において、本発明の組成物は、吸入を介して患者の肺に投与される。例えば、吸入を介した肺への投与は、定量吸入器（MDI：metered dose inhaler）、ネブライザー、又は乾燥粉末吸入器を介して投与することを含む。従って、１つの態様において、本発明は、その必要のある患者の肺に、吸入を介して本発明の組成物を１つ以上投与することを含む、肺線維症又はサルコイドーシスを治療する方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明の組成物は、鼻腔内投与又は器官内投与で、患者の肺に投与される。鼻腔内投与は、定量吸入器（MDI）、ネブライザー、又は乾燥粉末吸入器を介して投与することを含む。従って、１つの態様において、本発明は、その必要のある患者の肺に、本発明の組成物を１つ以上、鼻腔内投与又は器官内投与することを含む、肺線維症又はサルコイドーシスを治療する方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明の組成物を使用した治療の必要のある患者は、肺の既往歴を有していてもよい。例えば、１つの実施形態において、本発明の組成物を使用した治療の必要のある患者は、嚢胞性線維症の患者、気管支拡張症の患者、又は細菌もしくはウイルスによる肺感染を伴う患者である。嚢胞性線維症の患者、気管支拡張症の患者、又は細菌もしくはウイルスによる肺感染を伴う患者は、最終的に、例えば肺線維症又はサルコイドーシスなどの追加の肺疾患を発症する場合がある。
一部の実施形態において、本発明の組成物を使用した治療の必要のある患者は、サルコイドーシスと関連した肺線維症を有していてもよい。
一部の実施形態において、本発明の組成物を使用して、その必要のある患者の肺癌を治療してもよい。
好中球は、特に慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性肺損傷（ALI）、嚢胞性線維症（CF）、気管支拡張症、及び浸潤性肺疾患をはじめとする様々な肺障害と関連し得る。好塩基球は致死性の喘息と関連し得る。好酸球は、アレルギー性喘息；例えば感染症、薬物誘導性肺炎、吸入毒物、全身性疾患（例えば、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、及びレフラー症候群）などの好酸球性肺疾患；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；熱帯性肺好酸球増多症；好酸球増多症候群；及び肺癌と関連し得る。肥満細胞は、喘息、COPD、呼吸器感染症、及び肺線維症をはじめとする様々な肺障害と関連し得る。マクロファージは、COPD、CF、及びサルコイドーシスをはじめとする様々な肺障害と関連し得る。樹状細胞は、COPD、アレルギー性喘息、及びアレルギー性鼻炎をはじめとする様々な肺障害と関連し得る。本発明は、その必要のある患者への本発明のRNAi組成物のうちの１つ以上の投与を介して、上述の疾患の１つ以上を治療する方法を提供する。さらに、本明細書に提示される方法により治療可能な様々な肺障害を、表４〜７に提示する。
本明細書に提示される組成物、健常な個体と比較して、肺貪食細胞レベルが上昇している患者の治療に対し有用である。この目的に対し、本明細書に提示される組成物は、１つの態様において、その必要のある患者に投与され、すなわち、RNAiによって、対象のタンパク質のうちの１つの産生を阻害する。例えば、１つの実施形態において、本明細書に記載される組成物のうちの１つ以上の有効量が、その必要のある患者、例えば嚢胞性線維症の患者、又はα1−AT欠乏症の患者を介して投与される。１つの実施形態において、本明細書に記載される組成物のうちの１つの有効量がその必要のある患者に送達され、肺損傷が治療もしくは予防され、及び／又は気管支拡張症が治療もしくは予防される。例えば、１つの実施形態において、気管支拡張症に関して患者を治療する方法が提供される。当該方法は１つの実施形態において、気管支拡張症に罹患している患者の肺に、本明細書に記載される組成物、例えば脂質（例えば、カチオン性脂質）に複合体化されたsiRNAを含有する組成物のうちの１つ以上の有効量を投与すること、を含む。さらなる実施形態において、患者は、嚢胞性線維症（CF）の患者である。他の実施形態において、本明細書に記載される組成物のうちの１つの有効量が、α1-AT欠乏症の治療の必要のある患者に投与される。
「治療すること」（treating）という用語は、以下を含む：（１）状態、障害、又は病気に苦しむ可能性のある、又は罹患しやすい素因があるが、当該状態、障害、もしくは病気の臨床症状又は不顕性症状をまだ経験していない、又はまだ示していない対象において発現する、状態、障害、又は病気の臨床症状の出現を予防又は遅延させること；（２）状態、障害、又は病気を阻害すること（すなわち、少なくとも１つのその臨床症状又は不顕性症状に関し、疾患の発現を停止、低下、もしくは遅延させること、又は維持治療の場合においては、その再発を停止、低下、又は遅延させること）；及び／又は（３）病気を緩和すること（例えば、状態、障害又は病気、又はその臨床症状もしくは不顕性症状のうちの少なくとも１つの軽減をもたらすこと）。治療される対象に対する利益は、統計的に有意であるか、又は対象もしくは医師に少なくとも知覚可能である。
本明細書において使用される場合、「予防」とは、感染もしくは疾患の完全な防御、又はその感染もしくは疾患の症状の発現の防御；感染又は疾患又はその症状の発現の遅延；又はその後に発現した感染又は疾患又はその症状の重篤度の低下、を意味し得る。
様々な肺障害が、本明細書に提示される方法及び組成物により治療され得る。例えば、１つの実施形態において、組織損傷に関連した肺障害に関し、その必要のある患者を治療する方法が提供される。他の実施形態において、炎症性肺障害に関し、その必要のある患者を治療する方法が提供される。
１つの実施形態において、肺障害は、表4〜7のうちのいずれか１つに明記される障害のうちの１つである。
１つの実施形態において、COPDに関して患者を治療する方法が提供される。当該方法は１つの実施形態において、MDI、DPI、又はネブライザーを介して本明細書に記載される組成物のうちの１つ以上の有効量を、COPD患者の肺に投与することを含む。
他の実施形態において、白血球増加症、炎症性肺疾患、肺組織損傷、肺気腫、急性呼吸窮迫障害又は急性肺損傷の治療の必要のある患者を治療するための方法が本明細書において提示される。当該方法は１つの実施形態において、例えばMDI、DPI、又はネブライザーを介して、本明細書に記載される組成物のうちの１つ以上を、吸入によってその必要のある患者に投与することを含む。
組成物は、１つの実施形態において、（i）好中球の脱顆粒、又は例えば単球、好酸球、好塩基球もしくは肥満細胞などのいくつかの他の顆粒球の脱顆粒を原因とする肺損傷を治療又は予防するために、CFの患者の肺に直接投与される、（ii）α1-AT欠乏症を示す患者に対し直接投与される、又は（iii）気管支拡張症、慢性感染症、又は健常な個体のレベルと比較して高いレベルの肺貪食細胞を生じさせる任意の他の肺障害の治療のために、患者に直接投与される。
１つの実施形態において、α1-抗トリプシン欠乏症を有する患者が、本明細書に提示される組成物及び方法を用いて治療される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、α1-抗トリプシンの有効量と共に投与される。
当分野の当業者であれば、組成物の投薬量及び投与頻度が、標的mRNA、RNAi化合物の有効性、疾患の重篤度、患者の年齢及び体重によって変化することを理解するであろう。
例示的な投与頻度としては、毎日、一日おき、週に1回、週に2回、又は週に3回、組成物の有効量を投与することが挙げられる。
１つの実施形態において、その必要のある患者に対しRNAi組成物の送達を行う前に、組成物中に存在するRNAi化合物の約70％〜約100％が、リポソーム複合体化されており、又は脂質ナノ粒子中に存在する。他の実施形態において、その必要のある患者に対しsiRNA組成物の送達を行う前に、組成物中に存在するsiRNAの約80%〜約99%、又は約85%〜約99%、又は約90%〜約99%、又は約95%〜約99% 、又は約96%〜約99%が、リポソーム複合体化されており、又は脂質ナノ粒子中に存在する。他の実施形態において、その必要のある患者に対しsiRNA組成物の送達を行う前に、組成物中に存在するsiRNAの約98％が、リポソーム複合体化されており、又は脂質ナノ粒子中に存在する。
他の実施形態において、その必要のある患者の肺に対し、例えばネブライザーを介したエアロゾル化を介して、組成物の送達を行うことで、リポソーム複合体化された（又は脂質ナノ粒子及び／又は脂質マイクロ粒子の場合では、脂質−複合体化された）RNAi化合物の約20％〜約50％が、当該リポソーム（又は脂質粒子）に対するせん断応力によって放出される。他の実施形態において、組成物の送達を行うことで、リポソーム複合体化された（又は脂質ナノ粒子及び／又は脂質マイクロ粒子の場合では脂質−複合体化された）RNAi化合物の約25％〜約45％、又は約30％〜約40％が、当該リポソーム（又は脂質粒子）に対するせん断応力によって放出される。
組成物、及び送達デバイス
本明細書に提示されるように、本発明は、異常な好中球のエラスターゼ発現及び／又は活性に関連した疾患又は障害の治療のための組成物、システム、及び方法を提供する。治療方法は、１つの実施形態において、例えば嚢胞性線維症の患者などの、その必要のある患者の肺に、本明細書に記載される組成物のうちの１つの送達を行うことを含む。
本発明組成物は、肺投与用に適合された任意の用量調剤デバイスにおいて使用され得る。従って、１つの態様において、本発明は、本明細書に記載される組成物のうちの１つ以上と、吸入送達デバイスを備えたシステムを提供する。デバイスは、１つの実施形態において、例えば容器、バルブ、及びアクチュエーターなどの構造要素の精度と、組成物との適合性の最適な計測を確認するよう構築され、及び機械ポンプシステム、例えば、定量ネブライザー、粉末吸入器、定量吸入器（MDI）、ソフトミスト吸入器、又はネブライザーのシステムなどをベースとしてもよい。例えば、肺送達デバイスとしては、ジェットネブライザー、電子ネブライザー、ソフトミスト吸入器、及びカプセルベースの乾燥粉末吸入器が挙げられ、それらはすべて、本発明組成物出の使用に適合可能である。
一部の実施形態において、肺投与／吸入投与／経鼻投与／鼻腔内投与用の本発明組成物は、乾燥粉末製剤、懸濁液製剤、ナノ懸濁液製剤、マイクロ懸濁液製剤、又は噴霧スプレーの形態で製剤化される。
特定の実施形態において、肺投与／吸入投与／経鼻投与／鼻腔内投与用に製剤化された本発明組成物は、例えばヒドロカーボン推進剤などの推進剤を含有する。
組成物は１つの実施形態において、対象の肺への送達のための組成物のエアロゾルミストを提供するネブライザーを介して投与される。ネブライザー型の吸入送達デバイスは、水性溶液又は懸濁液として本発明組成物を含有してもよい。吸入用組成物の噴霧化スプレーの作製において、ネブライザー型送達デバイスは、超音波的に駆動されてもよく、圧縮空気により駆動されてもよく、他の気体により駆動されてもよく、電子的に駆動されてもよく、又は機械的に駆動されてもよい。超音波ネブライザーデバイスは通常、電気化学的に振動する表面を介して組成物の液膜上に急速に振動波形を押し付けることにより作動する。所与の振幅で波形は不安定になり、それによって、液膜が崩壊し、組成物の小液滴が生成される。空気又は他の気体により駆動するネブライザーデバイスは、高圧の気流が局所的な圧力低下を生じさせ、それによって液体組成物がキャピラリー作用を介して気流内へと引き付けられるという事に基づいて作動する。この微細な液体流は、その後、せん断力により崩壊する。
ネブライザー型の吸入送達デバイスは、通常は水性溶液又は懸濁液として本発明組成物を含有してもよい。例えば組成物は、生理食塩水中に懸濁され、吸入送達デバイス中にロードされてもよい。吸入用組成物の噴霧化スプレーの作製において、ネブライザー送達デバイスは、超音波的に駆動されてもよく、圧縮空気により駆動されてもよく、他の気体により生駆動されてもよく、電子的に駆動されてもよく、又は機械的（例えば、振動メッシュ又は開口プレートなど）に駆動されてもよい。振動メッシュネブライザーは、微細粒子の低速エアロゾルを生成し、従来的なジェットネブライザー又は超音波ネブライザーよりも早い速度で、治療溶液及び懸濁液を噴霧化する。従って、振動メッシュネブライザーを用いると、治療時間は、ジェットネブライザー又は超音波ネブライザーと比較して短くなり得る。本明細書に記載される方法での使用に適した振動メッシュネブライザーとしては、Philips Respironics I-Neb（登録商標）、Omron MicroAir、Nektar Aeroneb（登録商標）、及びPARI eFlow（登録商標）が挙げられる。本明細書に記載される組成物と使用することができる他のデバイスとしては、ジェットネブライザー（例えば、PARI LC Star, AKITA）、ソフトミスト吸入器、及びカプセルベースの乾燥粉末吸入器（例えば、PH&T Turbospin）が挙げられる。
ネブライザーは、ポータブルで携帯型のデザインであってもよく、及び自給的電気装置に備えられていてもよい。ネブライザーデバイスは、規定の開口サイズの２つの同時排出チャンネルを有するノズルを含有していてもよく、それを通って液体組成物が加速され得る。これによって、２つの流れの固着、及び組成物の噴霧化が生じる。ネブライザーは、機械的なアクチュエーターを使用して、規定の開口サイズの複合オリフィスノズルに液体組成物を通過させ、吸入用組成物のエアロゾルを生じさせてもよい。単回投与ネブライザーの設計において、組成物の単回用量を含有するブリスターパックが使用されてもよい。
デバイスは、単回用量の本発明組成物を含有してもよく、及び単回用量の本発明組成物を送達するために使用されてもよい。又はデバイスは、複数回用量の本発明組成物を含有してもよく、及び複数回用量の本発明組成物を送達するために使用されてもよい。
本発明において、ネブライザーを使用して、例えば肺膜内への粒子の配置に関し、粒子のサイジングが最適であることを確保してもよい。
定量吸入器（MDI）を、本発明組成物用の吸入送達デバイスとして使用してもよい。このデバイスは加圧されており（pMDI）、その基本構造は、絞り弁、アクチュエーター、及び容器を備えている。推進剤を使用して、デバイスから組成物を発射させる。適切な推進剤、例えば、MDI送達に関しては、フルオロカーボン、クロロフルオロカーボン（CFC：chlorofluorocarbons）、ヒドロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、ヒドロフルオロアルカン推進剤（例えば、HFA-134a及びHFA-227）、窒素、及び酸化二窒素、又はそれらの組み合わせなどの気体から選択されてもよい。
組成物は、加圧された推進剤（複数含む）の液体中に懸濁された規定サイズの粒子からなっていてもよく、又は組成物は、加圧された液体推進剤（複数含む）の溶液又は懸濁液に溶解していてもよい。使用される推進剤は主に、例えば134a及び227などの大気になじみやすいヒドロフルオロカーボン（HFC：hydroflourocarbon）である。吸入送達デバイスは１つの実施形態において、例えば、ブリスターパックを介して単回用量を送達し、又は複数回用量の設計であってもよい。吸入システムの加圧定量吸入器は、息で作動し、正確な用量の液体含有組成物を送達することができる。確実に正確な投与を行うために、組成物の送達は、マイクロプロセッサーによりプログラム化され、吸入サイクルの特定のポイントで発生するようになっていてもよい。MDIは、ポータブル及び携帯型であってもよい。
噴霧化されると、噴霧化組成物（又は「エアロゾル化組成物」とも呼称される）は、エアロゾル化した粒子の形態となる。エアロゾル化組成物は、例えばエアロゾル化組成物に関連した「空気動力学的中央粒子径：mass median aerodynamic diameter」又は「微粒子割合」を測定することによる、エアロゾルの粒子サイズにより特徴づけられることができる。「空気動力学的中央粒子径」又は「MMAD」は、水溶エアロゾル液滴の空気動力学的分離に関し標準化され、及び例えば、アンダーソンカスケードインパクター（ACI：Anderson Cascade Impactor）又は次世代インパクター（NGI：Next Generation Impactor）などのインパクター測定により決定される。気体の流速は、１つの実施形態において、ACIに関しては28リットル／分であり、NGIに関しては、15リットル／分である。
「幾何標準偏差」又は「GSD（Geometric standard deviation）」は、空気動力学的粒子サイズ分布の広がりの単位である。低GSDは、液滴サイズ分布の狭さの特徴であり（均一なサイズの液滴）、呼吸器系へのエアロゾルの標的化に有利である。本明細書に提示される噴霧化組成物の平均液滴サイズは、１つの実施形態において、5μm未満又は約1μm〜約5μmであり、1.0〜2.2の範囲、又は約1.0〜約2.2、又は1.5〜2.2、又は約1.5〜約2.2の範囲のGSDを有する。
「微粒子割合」又は「FPF（Fine particle fraction）」は、本明細書において使用される場合、カスケードインパクションにより測定されたときに、5μm未満の直径の粒子サイズを有するエアロゾルの割合を指す。FPFは通常、パーセンテージとして表される。
１つの実施形態において、噴霧化組成物の空気動力学的中央粒子径（MMAD）は、アンダーソンカスケードインパクター（ACI）又は次世代インパクター（NGI）により測定されたとき、約1μm〜約5 μm、又は約1μm〜約4 μm、又は約1μm〜約3 μm、又は約1μm〜約2 μmである。他の実施形態において、噴霧化組成物のMMADは、例えばACI又はNGIなどのカスケードインパクションにより測定されたときに、約5μm以下、約4μm以下、約3μm以下、約2μm以下、又は約1μm以下である。
１つの実施形態において、医薬組成物のエアロゾルのMMADは、カスケードインパクションにより測定されたときに、約4.9μm未満、約4.5μm未満、約4.3μm未満、約4.2μm未満、約4.1μm未満、約4.0μm未満、又は約3.5μm未満である。
１つの実施形態において、医薬組成物のエアロゾルのMMADは、カスケードインパクション（例えば、ACI又はNGIにより）測定されたときに、約1.0μm〜約5.0μm、約2.0μm〜約4.5μm、約2.5μm〜約4.0μm、約3.0μm〜約4.0μm、又は約3.5μm〜約4.5μmである。
１つの実施形態において、エアロゾル化組成物のFPFは、ACI又はNGIにより測定されたときに約50％以上、ACI又はNGIにより測定されたときに約60％以上、又はACI又はNGIにより測定されたときに約70％以上である。他の実施形態において、エアロゾル化組成物のFPFは、NGI又はACIにより測定されたときに約50％〜約80％、又は約50％〜約70％、又は約50％〜約60％である。
１つの実施形態において、定量吸入器（MDI）を、本発明組成物用の吸入送達デバイスとして使用する。かかる状況において、RNAi化合物は、MDIへとロードされる前に、推進剤（例えば、ヒドロフルオロカーボン）中に懸濁液として製剤化される。上述のようにMDIの基本構造は、絞り弁、アクチュエーター、及び容器を備えている。推進剤を使用して、デバイスから組成物を発射させる。組成物は、加圧された推進剤（複数含む）の液体中に懸濁された規定サイズの粒子からなっていてもよく、又は組成物は、加圧された液体推進剤（複数含む）の溶液又は懸濁液に溶解していてもよい。使用される推進剤は主に、例えば134a及び227などの大気になじみやすいヒドロフルオロカーボン（HFC）であり、他の共溶媒を含有してもよい。吸入システムのデバイスは、例えば、ブリスターパックなどを介して単回用量を送達してもよく、又は複数回用量の設計であってもよい。吸入システムの加圧定量吸入器は、息で作動し、正確な用量の液体含有組成物を送達することができる。確実に正確な投与を行うために、組成物の送達は、マイクロプロセッサーによりプログラム化され、吸入サイクルの特定のポイントで発生するようになっていてもよい。MDIは、ポータブル及び携帯型であってもよい。
１つの実施形態において、乾燥粉末吸入器（DPI）を、本発明組成物用の吸入送達デバイスとして使用する。１つの実施形態において、DPIは、NGI又はACIにより測定されたときに、約1μm〜約10μm、又は約1μm〜約9μm、又は約1μm〜約8μm、又は約1μm〜約7μm、又は約1μm〜約6μm、又は約1μm〜約5μm、又は約1μm〜約4μm、又は約1μm〜約3μm、又は約1μm〜約2μmの直径のMMADを有する粒子を生成する。他の実施形態において、DPIは、NGI又はACIにより測定されたときに、約1μm〜約10μm、又は約2μm〜約10μm、又は約3μm〜約10μm、又は約4μm〜約10μm、又は約5μm〜約10μm、又は約6μm〜約10μm、又は約7μm〜約10μm、又は約8μm〜約10μm、又は約9μm〜約10μmのMMADを有する粒子を生成する。
１つの実施形態において、DPIにより生成された粒子のMMADは、NGI又はACIにより測定されたときに、約1μm以下、約9μm以下、約8μm以下、約7μm以下、6μm以下、5μm以下、約4μm以下、約3μm以下、約2μm以下、又は約1μm以下である。
１つの実施形態において、DPIにより生成された粒子のMMADは、NGI又はACIにより測定されたときに、約9.9μm未満、約9.5μm未満、約9.3μm未満、約9.2μm未満、約9.1μm未満、約9.0μm未満、約8.5μm未満、約8.3μm未満、約8.2μm未満、約8.1μm未満、約8.0μm未満、約7.5μm未満、約7.3μm未満、約7.2μm未満、約7.1μm未満、約7.0μm未満、約6.5μm未満、約6.3μm未満、約6.2μm未満、約6.1μm未満、約6.0μm未満、約5.5μm未満、約5.3μm未満、約5.2μm未満、約5.1μm未満、約5.0μm未満、約4.5μm未満、約4.3μm未満、約4.2μm未満、約4.1μm未満、約4.0μm未満、又は約3.5μm未満である。
１つの実施形態において、DPIにより生成された粒子のMMADは、約1.0μm〜約10.0μm、約2.0μm〜約9.5μm、約2.5μm〜約9.0μm、約3.0μm〜約9.0μm、約3.5μm〜約8.5μm、又は約4.0μm〜約8.0μmである。
１つの実施形態において、DPIにより生成された粒子組成物のFPFは、ACI又はNGIにより測定されたときに、約40％以上、ACI又はNGIにより測定されたときに約50％以上、ACI又はNGIにより測定されたときに約60％以上、又はACI又はNGIにより測定されたときに約70％以上である。他の実施形態において、エアロゾル化組成物のFPFは、NGI又はACIにより測定されたときに、約40％〜約70％、又は約50％〜約70％、又は約40％〜約60％である。
本発明方法に従い、本明細書に記載される組成物は、吸入送達デバイスを介して、その必要のある患者の肺に送達される。本明細書に記載される吸入送達デバイスのいずれかを使用してもよく、例えばMDI、ネブライザー、又は乾燥粉末吸入器を使用して、本明細書に記載される組成物のうちの１つ以上の有効量を、その必要のある患者、例えばCF患者、又はα1-AT欠乏症の患者に対し、送達してもよい。
学説に拘束されることは望まないが、本明細書に記載される吸入送達法は、siRNAの全身性の不活化を回避する。さらに、本明細書に記載される吸入法は、肺の貪食細胞に対する、組成物の効率的で直接的な送達を提供する。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに解説される。しかしながら、これらの実施例は上述の実施形態のように解説であり、本発明の範囲を制限するとは決してみなされないことに注意されたい。
実施例１−siRNAの設計及び合成
siRNA標的配列は、対象遺伝子に特異的であり、約20〜50％のGC含有率を有している。例えば、以下の条件を満たすsiRNAが、哺乳類細胞において有効な遺伝子サイレンシングを行うことができる。（１）センス鎖の5’末端がG/C；（２）アンチセンス鎖の5’末端がA/U；（３）アンチセンス鎖の5’末端部分の最初の7塩基中に少なくとも5個のA/U；（４）9個よりも多いG/U残基の連続配列が無い。一般的に、mRNAの標的部位は、開始コドンの少なくとも50〜200塩基下流にして、制御性タンパク質が結合するであろう領域を回避する。
オリゴヌクレオチドは、標的配列に加え、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列と、最小プロモーター配列の上流に6個の追加のヌクレオチドを含有しており、それによって効率的なT7 RNAポリメラーゼ結合を可能としている。ヌクレアーゼフリーの水に最終濃度100ピコモル／μLでDNAオリゴヌクレオチドを再懸濁する。DNAオリゴヌクレオチドの各ペアを混合し、その２つのDNAオリゴヌクレオチドを各々10μL、ヌクレアーゼフリーの水を30μL、及び2xオリゴアニーリング緩衝液を50μLで、総量100μLを混合することにより、センス鎖RNA又はアンチセンス鎖RNAの鋳型が生成される。この混合物を3〜5分間、90〜95℃で加熱して、その後、室温までゆっくりと冷却させる。アニーリングされたオリゴヌクレオチドの最終濃度はおよそ10ピコモル／μLである。
大量のsiRNAを合成するために、10μLのRiboMAX（商標）(Promega社)、2.0μLのアニーリング化オリゴヌクレオチド鋳型DNA（10ピコモル／μL）、6.0μL、及び2.0μLのT7酵素を室温で混合し、総量20μLとする。20μLの反応物を、必要に応じてスケールアップしてもよい（最大で総量500μL）。この混合物を30分間、37℃でインキュベートする。
DNA鋳型を除去してsiRNAをアニーリングするために、転写反応後に1μLのRNaseフリーのDNaseを各転写反応物に添加し、混合物を30分間、37℃でインキュベートすることにより、DNaseを用いた消化を行って、DNA鋳型を除去することができる。別個のセンス反応物とアンチセンス反応物を混合し、10分間、70℃でインキュベートする。次いでこの混合物を室温まで冷却させる（およそ20分）。この工程によって、別個の短いセンスRNA鎖とアンチセンスRNAがアニーリングして、siRNAが生成される。
siRNAを精製するために、0.1体積の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と、1体積のイソプロパノールをこのsiRNAに加え、混合物を氷上に5分間置く。反応物は濁って見える。この混合物を、遠心機において、10分間、トップスピードで遠心する。上清を吸引し、沈殿物を0.5mLの冷70％エタノールで洗浄する。洗浄後にすべてのエタノールを除去する。沈殿物を15分間、室温で空気乾燥させる。その後、元の反応量の2〜5倍体積のヌクレアーゼフリーの水に再懸濁させる。
実施例２−リポソーム製剤及びナノ粒子製剤の調製
本発明のリポソーム及び脂質ナノ粒子により複合体化された、又は封入されたsiRNAの取り込みと活性を検証するために、製剤1〜17を調製した。それら製剤を表８に要約する。
表８：siRNAナノ粒子製剤の要約
DODAP: 1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン; DSPC: 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン; Chol: コレステロール; DMG-PEG2000: 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール; NA-DOPE: 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ドデカニル) ; DOPC: 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン; DSPE: 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン; CHEMS: コレステロール ヘミ-スクシナート; THS: トコフェロール ヘミ-スクシナート; tRNA: トランスファーリボ核酸; siRNA: 低分子干渉リボ核酸。
約45〜70モル％の広範囲な割合のカチオン性脂質が、安定したナノ粒子へのtRNA及びsiRNAの両方の封入を支援する。これら粒子を、細胞取り込みアッセイ及び／又は遺伝子発現アッセイにおいてさらに検証し、貪食細胞へと入る能力、及び標的遺伝子の発現を低下させる能力を確認する。
実施例３−貪食細胞によるsiRNAの取り込み
肺に存在する貪食細胞によるリポソーム製剤及びナノ粒子製剤の細胞取り込みを比較するために、マクロファージ及び線維芽細胞による粒子のin vitro取り込みが測定された。取り込みアッセイを行う前に、THP-1単球を、50ng/mLの酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA：phorbol myristate acetate）とともに24時間インキュベーションした後、新鮮なRPMI培地中で24時間インキュベーションすることによりマクロファージへと分化させた。取り込みアッセイに関しては、2％ウシ胎児血清（FBS）を含有するOpti-MEM培地中で培養された分化したマクロファージ又はWI-38線維芽細胞を、AF647標識粒子（最終脂質濃度は140μg/mL）とともに1〜4時間インキュベーションして、そっと回収し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。siRNAのサロゲートとして、tRNAを使用してAF647標識ナノ粒子を生成し、取り込み実験で使用した。個々の細胞への粒子取り込みは、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）により定量され、培地1mL当たりで添加された蛍光標識総量に対して標準化され、標準化されたメジアン蛍光強度（MFI：median fluorescence intensity）を算出した。
NA-DOPE及びDOPCから構成される製剤#3が、マクロファージ及び線維芽細胞の両方への最も高い取り込みを示した（図２）。様々なモル比のDODAP、DSPC、CHEMS、DMG-PEG2000、及びRNA(製剤#6、#11、及び#12)又はDODAP、DSPE、コレステロール、DMG-PEG2000、及びRNA (製剤#5及び#7)を含有する他の製剤もまた、マクロファージと線維芽細胞の両方への良好な取り込みを示した（図２）。
製剤#2は、マクロファージと線維芽細胞の両方への貧弱な取り込みを示した（図２及び図７）一方で、製剤#13は、マクロファージと線維芽細胞の両方への良好な取り込みを示した（図７）。
実施例４−siRNA製剤の活性
続いて、いくつかのナノ粒子製剤を、siRNAを（ｔRNAの代わりに）用いて作製し、線維芽細胞におけるCOL1A1遺伝子発現を低下させる能力に関して評価した。WI-38線維芽細胞は、48時間培養され、リポフェクタミン（LFC）、又はCOL1A1を標的とする13〜100ピコモルのsiRNAを含有する様々なsiRNA製剤とともにさらに24時間、新鮮な培地中でインキュベートされ、その後、RLT溶解緩衝液（Qiagen社）で回収された。QiaShredderカラム(Qiagen社)を使用して細胞をホモジナイズし、RNeasy Mini Kits (Qiagen社)を使用してRNAを抽出し、総RNAを、NanoDrop分光光度計(Thermo社)を使用して定量した。RNAは、RNase阻害剤とともにHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Fisher Scientific社)を用いてcDNAへと転換され、COL1A1発現を、CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad社)を使用して測定した。各サンプルに対し、COL1A1発現は、β-アクチン（ACTB）遺伝子発現に対し標準化され、次いで、非処置線維芽細胞における発現レベルに対して標準化された。COL1A1を標的とするsiRNAの配列、及びCOL1A1発現を検出するためのリアルタイムPCRプライマーの配列は、表９に示す。
表９：siRNA、及びリアルタイムPCRプライマー配列の要約
COL1A1を標的とする裸のsiRNAは、非処置線維芽細胞と比較し、COL1A1の遺伝子発現を低下させなかった（図３）。リポフェクタミン（LFC）中で製剤化された50、100又は500ピコモルの同じsiRNAは、非処置線維芽細胞に対し、60％超までCOL1A1の発現を低下させた（図３）。製剤#2は、線維芽細胞においてCOL1A1発現を減少させず（図３）、これは、製剤#2は、線維芽細胞への取り込みが貧弱であったことと一致した。製剤#3、#11及び#12は、線維芽細胞への良好な取り込みを示したが、線維芽細胞において、COL1A1の発現を低下させなかった（図３）。対照的に、製剤#6は、非処置線維芽細胞と比較して、80%近くまでCOL1A1発現を低下させた（図３）。
COL1A1発現に対する製剤#6の効果が、標的遺伝子の特異的ノックダウンに起因することを確認するために、線維芽細胞を、リポフェクタミン（LFC）、又はCOL1A1を標的とするsiRNA、無関係な遺伝子を標的とするsiRNA、もしくはtRNAのいずれかを含有する製剤#6とともに24時間インキュベーションし、COL1A1の発現を測定した。tRNAも、非特異的siRNA製剤のいずれも、COL1A1の発現を低下させなかった一方で、標的特異的siRNAを含有する製剤は、COL1A1の発現を低下させた（図４）。
同様の実験を行い、P4HA1及びANXA11のmRNAを指向するsiRNAを含有する製剤#6及び#13の標的特異的ノックダウンを検証した。対照siRNAを含有する製剤は、P4HA1及びANXA11のmRNAの発現を低下させなかった一方で、標的特異的siRNAを含有する製剤は、P4HA1及びANXA11の発現を低下させた（図５及び６）。
これらの発見から、ナノ粒子封入siRNAは、貪食細胞により取り込まれ、標的遺伝子の発現を効率的に低下させることが示される。
実施例５−サルコイドーシスのin vivoマウスモデルにおける、肉芽腫形成に対するsiRNA製剤の効果
ナノ粒子封入siRNAの、肉芽腫形成を減少させる能力、及び肺の組織病理を改善する能力を、サルコイドーシスのマウスモデルにおいて検証する。サルコイドーシスの例示的なマウスモデルは、McCaskillら, Am J Respir Cell Mol Biol., 2006 Sep; 35(3):347-356に記載されている。当該文献は、すべての目的に対し参照により本明細書に援用される。具体的には、プロピオニバクテリウム アクネス（Propionibacterium acnes）（PA）は、サルコイドーシスの推定病原菌として示唆されているグラム陽性の嫌気性細菌である。マウスにサルコイドーシスを誘導するために、加熱殺菌されたPAを、C57BL/6及び／又はBALB/cマウスに腹腔内注射する。腹腔内注射を行った２週間後、PA感作マウスを、加熱殺菌PAを用いて気管内チャレンジする（例えば、0.5mg：0.05mlの10mg/ml懸濁液）。PBSで感作され、PBSでチャレンジされたC57BL/6及びBALB/cマウス（PBS/PBS）を、対照として使用する。さらに、数匹のマウスを、PAに感作するが、チャレンジしない（腹腔内PA／気管内PBS）、又は感作しないがチャレンジする（腹腔内PBS／気管内PA）のいずれかとし、感作単独、ならびにチャレンジ単独の影響を決定する。
本発明に従うsiRNA製剤を、様々な時点でマウスに投与し、例えば肉芽腫形成の低下などの、サルコイドーシスの病態生理の改善における、製剤の効果を決定する。例えば、試験siRNA製剤及び対照siRNA製剤を、腹腔内感作後、5日目、7日目、10日目、12日目、及び／又は14日目に注入し、ならびに気管内チャレンジ後、2日目、5日目、7日目、10日目、14日目、21日目、及び／又は28日目に注入する。
McCaskillらは、PAでチャレンジされたマウスは、Th1サイトカイン／ケモカインの上昇、肺洗浄液中のリンパ球及びマクロファージの数の増加、ならびにTリンパ球及びBリンパ球及び類上皮組織球から構成される気管支血管周囲の肉芽腫性炎症、により特徴づけられる細胞性免疫反応を発現したことを示した。それらはすべて、サルコイドーシスに似た病態生理である。
マウスを特定の時点で殺処分し、例えばMcCaskillらに記載されるマーカーなどの、様々な病理学的マーカー及び免疫学的マーカーを検証して、サルコイドーシスの病態生理に対するsiRNA製剤の効果を決定する。さらに、生存に関してマウスをフォローし、生存率に対するsiRNA製剤の効果を決定する。
実施例６−サルコイドーシスと関連した肺線維症（PF）のin vivoマウスモデルにおける、siRNA製剤の効果
サルコイドーシスに関連したPFの病態生理を改善するsiRNA製剤の能力を、マウスモデルにおいて検証する。サルコイドーシスに関連したPFの例示的なマウスモデルは、Jiangら, Oncotarget, 2016 May; doi:10.18632/oncotarget.9397 [出版に先立ち、オンライン公開されている]に記載されている。当該文献は、すべての目的に対し参照により本明細書に援用される。このモデルにおいて、プロピオニバクテリウム アクネス（Propionibacterium acnes）（PA）を用いて反復チャレンジを行うことにより、持続的な炎症が誘導され、サルコイドーシスが生じ、その後にマウスにPFが発生する。
0日目に、0.25mLの2mg/mL加熱殺菌PA懸濁液（総量は0.5mg）を、マウスに腹腔内注射する。14日目に、1%ペントバルビタールナトリウムを用いてマウスを麻酔し、0.05mLの10mg/mL加熱殺菌PA懸濁液（総量は0.5mg）を用いて、気管内経路を介してチャレンジする。PA接種と、気管内チャレンジにより、肺にサルコイド-肉芽腫症が誘導される。2回目のチャレンジのために、サルコイドーシスのマウスに、28日目、もう1度気管内に0.05mLの10mg/mL 加熱殺菌PA懸濁液（総量は0.5mg）を用いてブースターチャレンジを与える。これらのマウスは、サルコイド-線維症群と指定される。28日目に0.05mLの滅菌PBSを投与されたマウスは、14日目に1回のPAチャレンジが行われた後、自然な疾病経過を減速させることが期待される。これらのマウスは、サルコイド-寛解群と指定される。滅菌PBSを用いて接種及びチャレンジされたマウス（PBS/PBS/PBS）は、陰性対照として使用される。マウスモデルの概略に関しては図８を参照のこと。
本発明に従うsiRNA製剤を、様々な時点でマウスに投与し、例えば肺線維症及び肉芽腫形成の低下などの、サルコイドーシスに関連したPFの病態生理の改善における、製剤の効果を決定する。例えば、試験siRNA製剤及び対照siRNA製剤を、腹腔内感作後、5日目、7日目、10日目、12日目、及び／又は14日目に注入し、ならびに気管内チャレンジ後、2日目、5日目、7日目、10日目、14日目、21日目、及び／又は28日目に注入し、ならびに気管内ブースター投与後、2日目、5日目、7日目、10日目、14日目、21日目、及び／又は28日目に注入する。
マウスを特定の時点で殺処分し、例えばMcCaskillら、及びJiangらに記載されるマーカーなどの、様々な病理学的マーカー及び免疫学的マーカーを検証して、サルコイドーシス及び肺線維症の病態生理に対するsiRNA製剤の効果を決定する。さらに、生存に関してマウスをフォローし、生存率に対するsiRNA製剤の効果を決定する。
実施例７−肺線維症（PF）のin vivoマウスモデルにおける、siRNA製剤の効果
PFの病態生理を改善するsiRNA製剤の能力を、広く使用されている肺線維症の実験モデルにおいて検証する。当該検証では、マウスにブレオマイシンが気管内注入される。このモデルは、Izbickiら, Int J Exp Pathol. 2002 Jun; 83(3): 111-119、及びMoore and Hogaboam, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008 Feb; 294(2): L152-60に記載されている。両文献は、すべての目的に対し参照により本明細書に援用される。
硫酸ブレオマイシンの単回投与（例えば動物1匹当たり、0.1mL生理食塩水中、0.06mg）を、０日目にマウスに気管内注入する。対照動物は、0.1mLの生理食塩水のみが与えられる。
本発明に従うsiRNA製剤を、様々な時点でマウスに投与し、PFの病態生理の改善における、製剤の効果を決定する。例えば、検証siRNA製剤及び対照siRNA製剤は、気管内注入後、1日目、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、及び／又は14日目に注射される。
マウスを特定の時点で殺処分し、例えばIzbickiらに記載されるマーカーなどの、様々な病理学的マーカー及び免疫学的マーカーを検証して、肺線維症の病態生理に対するsiRNA製剤の効果を決定する。さらに、生存に関してマウスをフォローし、生存率に対するsiRNA製剤の効果を決定する。
* * * * * * * * *
記載される本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、当分野の当業者であれば、様々な変更を行うことができ、及び本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく均等により置換され得ることを理解するはずである。さらに、多くの改変を行い、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの工程（複数含む）を、記載される本発明の主旨及び範囲に適合させることができる。かかる改変のすべては、本明細書に添付される請求の範囲内にあることが意図される。
本明細書において参照される特許、特許出願、特許出願公開、学術論文及びプロトコールは、すべての目的に対し、その全内容が参照により援用される。

Claims (81)

  1. 脂質粒子と複合体化された核酸化合物、又は脂質粒子ににより封入された核酸化合物を含有する組成物であって、前記脂質粒子は、以下を含有する：
    （a）前記組成物中に存在する総脂質の約40モル%〜約70モル%を構成するカチオン性脂質；
    （b）前記組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約55モル％を構成する中性脂質；及び
    （c）前記組成物中に存在する総脂質の約0.3モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質。
  2. 脂質粒子と複合体化された核酸化合物、又は脂質粒子ににより封入された核酸化合物を含有する組成物であって、前記脂質粒子は、以下を含有する：
    （a）前記組成物中に存在する総脂質の約40モル%〜約70モル%を構成するカチオン性脂質；
    （b）前記組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約20モル％を構成するリン脂質；
    （c）前記組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約45モル％を構成するコレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体；及び
    （d）前記組成物中に存在する総脂質の約0.3モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質。
  3. 脂質粒子と複合体化された核酸化合物、又は脂質粒子ににより封入された核酸化合物を含有する組成物であって、前記脂質粒子は、以下を含有する：
    （a）前記組成物中に存在する総脂質の約40モル%〜約70モル%を構成するカチオン性脂質；
    （b）前記組成物中に存在する総脂質の約4モル％〜約20モル％を構成するリン脂質；
    （c）前記組成物中に存在する総脂質の約25モル％〜約45モル％を構成するコレステロールヘミスクシナート（CHEMS）又はトコフェロールヘミスクシナート（THS）；及び
    （d）前記組成物中に存在する総脂質の約1モル％〜約1.5モル％を構成する複合脂質。
  4. 前記カチオン性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約45〜約65モル%、約50〜約60モル%、約55〜約65モル%、約50〜約65モル%、約45〜約50モル%、約55〜約60モル%、及び約65〜約70モル%からなる群から選択される量で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記中性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約30〜約50モル%、約35〜約45モル%、約45〜約55モル%、約40〜約50モル%、約25〜約30モル%、約30〜約35モル%、約35〜約40モル%、約40〜約45モル%、約45〜約50モル%、及び約50〜約55モル%からなる群から選択される量で存在する、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記カチオン性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約50〜約60モル%の量で存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記カチオン性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約50〜約55モル%の量で存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記カチオン性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約55〜約60モル%の量で存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記カチオン性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約50モル%の量で存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記カチオン性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約57モル%の量で存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記中性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約40〜約50モル%の量で存在する、請求項１及び４〜９のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記中性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約41〜約43モル%の量で存在する、請求項１及び４〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記中性脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約49モル%の量で存在する、請求項１及び４〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記中性脂質が、１つ以上の中性脂質の混合物を含有する、請求項１及び４〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記中性脂質が、リン脂質と、コレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体の混合物を含有する、請求項１及び４〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記リン脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約4モル%〜約20モル%を構成する、請求項２、３及び１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記リン脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約4〜約15モル%、約4〜約10モル%、約10〜約15モル%、約15〜約20モル%、及び約10〜約20モル%からなる群から選択される量で存在する、請求項２、３及び１５〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記リン脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約4〜約8モル%、又は約15〜約17モル%の量で存在する、請求項２、３及び１５〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記リン脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約4モル%の量で存在する、請求項２、３、及び１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記リン脂質が、前記組成物中に存在する総脂質の約7.1モル%の量で存在する、請求項２、３、及び１５〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記コレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体が、前記組成物中に存在する総脂質の約25モル%〜約45モル%を構成する、請求項２、及び１５〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記コレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体が、前記組成物中に存在する総脂質の約30〜約45モル%、約25〜約35モル%、約25〜約30モル%、約35〜約45モル%、約35〜約40モル%、約25〜約40モル%、約30〜約35モル%、及び約40〜約45モル%からなる群から選択される量で存在する、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記コレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体が、前記組成物中に存在する総脂質の約34.3又は約34.4モル%を構成する、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記コレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体が、前記組成物中に存在する総脂質の約25モル%を構成する、請求項２１に記載の組成物。
  25. 前記コレステロール又はトコフェロール又はそれらの誘導体が、前記組成物中に存在する総脂質の約45モル%を構成する、請求項２１に記載の組成物。
  26. 前記コレステロール誘導体が、コレステロールヘミスクシナート（CHEMS）であり、又は前記トコフェロール誘導体が、トコフェロールヘミスクシナート（THS）である、請求項２及び４〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記CHEMS又はTHSが、前記組成物中に存在する総脂質の約30〜約45モル%、約25〜約35モル%、約25〜約30モル%、約35〜約45モル%、約35〜約40モル%、約25〜約40モル%、約30〜約35モル%、及び約40〜約45モル%からなる群から選択される量で存在する、請求項３に記載の組成物。
  28. 前記CHEMS又はTHSが、前記組成物中に存在する総脂質の約34.3モル%又は約34.4モル%を構成する、請求項３又は２７に記載の組成物。
  29. 前記CHEMS又はTHSが、前記組成物中に存在する総脂質の約25モル%を構成する、請求項３又は２７に記載の組成物。
  30. 前記CHEMS又はTHSが、前記組成物中に存在する総脂質の約45モル%を構成する、請求項３又は２７に記載の組成物。
  31. 前記カチオン性脂質が、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン（DODAP）を含有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記リン脂質が、以下からなる群から選択される、請求項２、３及び１５〜３１のいずれか１項に記載の組成物：1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC); 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ドデカニル) (NA-DOPE); 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC); 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE);又はそれらの混合物。
  33. 前記複合脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）複合脂質を含有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記PEG複合脂質が、PEG-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール（PEG-DMG）である、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記PEGが、約2000ダルトンの平均分子量を有する、請求項３３又は３４に記載の組成物。
  36. 前記組成物が、約50モル%〜約57.5モル%のDODAP、約4モル%〜約17モル%のリン脂質；約25モル%〜約45モル%のCHEMS又はTHS；及び約1モル%〜1.5モル%のPEG-DMGを含有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  37. 前記核酸化合物が、RNA干渉（RNAi）化合物である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 前記RNAi化合物が、低分子干渉RNA（siRNA）、短いヘアピンRNA（shRNA）、及びマイクロRNA（miRNA）からなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記RNAi化合物が、貪食細胞反応と関連するタンパク質をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）を標的とする、請求項３７又は３８に記載の組成物。
  40. 前記RNAi化合物が、サイトカイン、コラーゲン合成と関連するタンパク質、及び／又はリン脂質結合タンパク質をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）を標的とする、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
  41. 前記RNAi化合物が、TNFαをコードするメッセンジャーRNA（mRNA）を標的とする、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
  42. 前記RNAi化合物が、COL1A1をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）を標的とする、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 前記RNAi化合物が、プロリルヒドロキシラーゼをコードするメッセンジャーRNA（mRNA）を標的とする、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
  44. 前記RNAi化合物が、アネキシンA11をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）を標的とする、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
  45. 乾燥粉末として製剤化される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 懸濁液として製剤化される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  47. 噴霧スプレーとして製剤化される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  48. 推進剤をさらに含有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  49. 前記推進剤が、ヒドロカーボンである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  50. その必要のある患者における肺疾患又は肺障害を治療する方法であって、前記方法は、請求項１〜４９のいずれか１項に記載される組成物の治療有効量を前記患者の肺に投与することを含む、前記方法。
  51. 前記肺疾患又は肺障害は、表4、表5、表6、又は表7に明記される肺疾患又は肺障害のうちの１つである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記肺疾患又は肺障害が、サルコイドーシスである、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記肺疾患又は肺障害が、肺線維症である、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記肺疾患又は肺障害が、感染性疾患である、請求項５０に記載の方法。
  55. 前記感染性疾患が、細菌感染症又はウイルス感染症である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記肺疾患又は肺障害が、嚢胞性線維症である、請求項５０に記載の方法。
  57. 前記肺疾患又は肺障害が、肺癌である、請求項５０に記載の方法。
  58. 前記組成物の投与が、貪食細胞反応と関連したタンパク質をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）の発現及び／又は活性を下方制御する、請求項５０〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記貪食細胞が、マクロファージである、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記貪食細胞が、線維芽細胞である、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記組成物の投与が、肺疾患又は肺障害において過剰発現されているmRNA、もしくは肺疾患又は肺障害に遺伝的に関連しているmRNAの発現及び／又は活性を下方制御する、請求項５０〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記組成物の投与が、サイトカイン、コラーゲン合成に関連するタンパク質、及び／又はリン脂質結合タンパク質をコードするmRNAの発現及び／又は活性を下方制御する、請求項５０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記組成物が、TNFα標的siRNAを含有する、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記組成物が、COL1A1標的siRNAを含有する、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記組成物が、プロリルヒドロキシラーゼ標的siRNAを含有する、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記組成物が、アネキシンA11標的siRNAを含有する、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記組成物の投与が、炎症性サイトカインの産生を下方制御する、請求項５０〜６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記組成物の投与が、コラーゲン合成を下方制御する、請求項５０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記組成物の有効量は、吸入を介して前記患者の肺に投与される、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記組成物の有効量は、気管内投与、鼻内投与、又は鼻腔内投与で前記患者の肺に投与される、請求項５０〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記組成物の有効量は、乾燥粉末吸入器を介して前記患者の肺に投与される、請求項５０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記組成物の有効量は、ネブライザーを介して前記患者の肺に投与される、請求項５０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記組成物の有効量は、定量吸入器を介して前記患者の肺に投与される、請求項５０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記組成物の有効量は、毎日投与される、請求項５０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記組成物の有効量は、１週間に１回投与される、請求項５０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記組成物の有効量は、１週間に２回投与される、請求項５０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記組成物の有効量は、１週間に３回投与される、請求項５０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記患者は、嚢胞性線維症の患者である、請求項５０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記患者は、肺気腫を有する、請求項５０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記患者は、慢性閉塞性肺疾患を有する、請求項５０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記患者は、急性呼吸窮迫症候群を有する、請求項５０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
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