JPH08208457A - ステロールリポソームの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 水溶性活性物質のより高い服用量の投与を提
供するためおよび水不溶性の活性物質の投与を容易とす
るために、生体内投与に適したステロールベシクルへ生
物学的活性物質を有効に捕捉する方法を提供する。 【解決手段】閉鎖されたベシクルを形成し得るステロー
ルのジカルボン酸類、ポリカルボン酸類、ヒドロキシ酸
類、アミノ酸類及びポリアミノ酸類から選択される有機
誘導体の塩形態を完全に閉鎖されたベシクルを形成する
のに十分な量で、水性相に添加し、ステロールベシクル
中に捕捉されるべき化合物をさらに水性相へ添加し、そ
してマルチラメラベシクルの乳白色の懸濁液が形成され
るまで混合物を振盪することからなる生物活性剤を含有
するステロールリポソームの調製方法、及び得られたマ
ルチラメラベシクルの乳白色の懸濁液をさらに音波処理
する、生物活性剤を含有するユニラメラベシクルである
ステロールリポソームの調製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、二重層を形成し得
るステロールの有機酸誘導体の塩形態から成る生物活性
剤を含有するステロールリポソームの調製方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】

１．リポソーム リポソームは内包された水性相を含有する完全に閉鎖さ
れた二重層膜である。リポソームは、種々のマルチラメ
ラベシクル（水性相によって互いに離された同中心的な
膜二重層群によって特徴づけられるタマネギ状構造）ま
たはユニラメラベクシル（単一の膜二重層を有する。）
である。リポソーム調製の２つのパラメータは、ベシク
ル径と脂質濃度の作用である。 （１）脂質の与えられた量によって囲まれた容積として
定義される、捕捉容量は、全脂質のモル当り（ｍｏｌ
~¹）の捕捉リットルの単位として表わされる。捕捉容量
は、ベシクルの脂質組成および媒質のイオン組成によっ
てもまた影響されるリポソームの半径に依存する。
（２）二重層によって隔離された水性成分の画分として
定義される、内包能は、パーセンテージとして表わされ
る。内包能は、脂質濃度に直接比例し、より多くの脂質
が存在する場合、より多くの溶質がリポソーム中へと隔
離され得る（ディーマーとアステター、１９８３年、リ
ポソームプレパレーション：メソッズ アンド メカニ
ズムス、リポソーム中、エム．オストロ編、マルセル
デッカー インコーポレーテッド、ニューヨーク、第２
７〜５１頁［Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ｕｓｔｅｒ，１９
８３，ＬｉｐｏｓｏｍｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｉｎＬｉｐ
ｏｓｏｍｅｓ，ｅｄ．Ｍ．Ｏｓｔｒｏ，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ｐｐ．２７−５１］を
参照のこと。）。リポソーム調製に関する元来の方法
（バングハムら、１９６５年、ジャーナルオブ モレキ
ュール バイオロジー １３：２３８−２５２［Ｂａｎ
ｇｈａｍｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：
２３８−２５２］は、有機溶媒中にリン脂質を懸濁さ
せ、そして次に反応容器中にリン脂質の粘稠な沈殿物を
残して乾燥するまで蒸発させることを含むものであっ
た。次に水性相の適当な量が添加され、混合物が「膨
潤」し、そしてマルチラメラベシクル（以下ＭＬＶと呼
称する。）から成る生成リポソームが、機械的手段によ
り分散させられた。生成した膜二重層の構造は、脂質の
疎水性（非極性）「テール」が二重層の中心へ向って配
向し、一方親水性（極性）「ヘッド」が水性相へ向って
配向したようなものとなっている。この技法は、パパハ
ジョプーロスとミラー［ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏ
ｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ］（１９６７年、バイオヒミ
カ エトバイオフィジカ アクタ １３５：６２４−６
３８［１９６７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ．１３５：６２４−６３８］）によって述べられ
た微小な音波処理されたユニラメラベクシル（以下ＳＵ
Ｖと呼称する。）の発展の基礎となった。しかしなが
ら、ＭＬＶとＳＵＶの双方ともモデルシステムとしては
限界があるものであった。

【０００３】捕捉容量ないしは内包能を増大させる試み
において、リン脂質二重層からなるリポソームの調製に
関するいくつかの方法が発展してきてはいるが、すべて
の方法は、有機溶媒の使用を必要としている。これらの
いくつかの方法を以下に簡単に記す。内包能を増加させ
るための努力は、リポソーム前駆体すなわちミセル、す
なわち、極性ヘッド基が水性相に指向するように配向さ
れた脂質分子の単一層によって囲繞された水性相を含む
ベシクルを最初に形成することを包含するものである。
リポソーム前駆体は、内包されるべき水性溶液を有機溶
媒中の極性脂質の溶液中へ添加し、そして音波処理する
ことで形成される。このリポソーム前駆体は、次に、過
剰の脂質の存在下第二の水性相中へ乳化させられ、そし
て蒸発させられる。脂質二重層によって内包された水性
相から成る、生成リポソームは水性相中に分散させられ
る（エム、シュナイダー［Ｍ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］に
対して１９８０年９月２３日に発行された米国特許第
４，２２４，１７９号を参照のこと。）。内包能を最大
にするための他の試みにおいて、パパハジョプロース
（１９８０年１１月２５日発行の米国特許第４，２３
５，８７１号）は、逆相蒸発ベシクル［ｒｅｖｅｒｓｅ
−ｐｈａｓｅ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｖｅｓｉｃｌ
ｅ］（以下、ＲＥＶと呼称する。）としてもまた知られ
ているオリゴラメラ脂質ベシクルを形成するための「逆
相蒸発方法［ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｅｖａｐｏ
ｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ］」を述べている。この
方法によると、内包されるべき水性脂質は、有機溶媒中
の極性脂質混合物へと添加される。次に均質な油中水
［ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ］型エマルジョンが形成さ
れ、そしてゲルが形成されるまで有機溶媒が蒸発させら
れる。ゲルは次に、水性媒体中のゲル様混合物を分散さ
せることにより、懸濁液へ転化される。生成されたＲＥ
Ｖは、多くのユニラメラベクシル（ラージユニラメラベ
クシル、ＬＵＶ）と、大きな内的水性空間を有するわず
か二、三の同中心的二重層によって特徴づけられるわず
かのオリゴラメラベシクルから成る。薬剤供給系へのリ
ポソームの使用の可能性に関して、多くの記載がなされ
ている。例えば、イゥ−ヤァ ラーマンとエリザベス
エイ．セルニー［Ｙｅｕｈ−Ｅｒｈ Ｒａｈｍａｎ ａ
ｎｄ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ａ．Ｃｅｒｎｙ］に対して
１９７６年１１月２３日に発行された米国特許第３，９
９３，７５４号や、バリー ディー．シェアーズ［Ｂａ
ｒｒｙ Ｄ．Ｓｅａｒｓ］に対して１９７９年３月２０
日に発行された米国特許第４，１４５，４１０号を参照
されたい。リポソーム薬剤供給系においては、医薬は、
リポソーム形成の間に捕捉され、そして次に治療される
べき患者へと投与される。この医薬は、水にあるいは非
極性溶媒に可溶である。このような記述の代表的なもの
は、パパハジョプーロスとスゾカ［Ｓｚｏｋａ］に対し
て１９８０年１１月２５日発行された米国特許第４，２
３５，８７１号およびエム．シュナイダーに対して１９
８０年９月２３日に発行された米国特許第４，２２４，
１７９号である。生体内に使用するリポソームを調製す
る場合、（１）リポソームの調製の間の有機溶媒を使用
する必要性をなくすこと、および（２）捕捉物質のより
大きな容量と濃度が、一服用量当りに供給されることが
可能となるよう、内包能および捕捉容量を最大化するこ
とが、有利となるであろう。

【０００４】２ 水溶性ステロール 種々のステロールとそれらの水溶性誘導体が、化粧用、
薬学用および診断学用の目的のために用いられている。
水溶性ステロールとしては例えば、分枝脂肪酸コレステ
ロールエステル、ステロールエステルおよびＰＥＧ−植
物ステロールが化粧用調製品において使用されている
（欧州特許出願第２８，４５６号、米国特許第４，３９
３，０４４号ならびにシュライダー、ドラッグ アンド
コスメティック インダストリー、１９８３年９月第
３３頁および１９８３年１０月第４６頁［Ｓｃｈｒａｄ
ｅｒ，Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８３，ｐ．３３
ａｎｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８３，ｐ．４６］）。サ
ッカーとキューン［Ｔｈａｋｋａｒ ａｎｄ Ｋｕｅｈ
ｎ］（１９６９年、ジャーナル オブ ファラマシュー
ティカル サイエンス５８（７）：８５０−８５２［１
９６９，Ｊ．Ｐｈａｒｍ，Ｓｃｉ．５８（７）： ８５
０−８５２）は、１〜５％濃度のステロイド非イオン性
界面活性剤、特に、エトキシ化コレステロール（すなわ
ち、ＰＥＧ−コレステロール）の水性溶液を用いてのス
テロイドホルモンの安定化を開示している。しかしなが
ら、生体内での可溶化ステロイドホルモンの有効性ある
いは利用は示されていない。いくつかの水溶性コレステ
ロールが調製されそして生物学的流体中のコレステロー
ル値の測定に関する水溶性標準として用いられている
（米国特許第３，８５９，０４７号、米国特許第４，０
４０，７８４号、米国特許第４，０４２，３３０号、米
国特許第４，１８３，８４７号、米国特許第４，１８
９，４００号および米国特許第４，２２４，２２９
号）。シニツズキーら［Ｓｈｉｎｉｔｚｋｙ ｅｔ．ａ
ｌ．］（１９７９年、プロスィーデング オブ ザ ナ
ショナル アカデミーオブ サイエンスィズ オブ ザ
ユナイテット ステート オブ アメリカ７６：５３
１３〜５３１６［１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５３１３〜５３１６］は
低濃度のコレステロールおよびコレステリルヘミサクシ
ネートを含有する組成培地媒体中に腫瘍細胞を培養し
た。細胞膜内へのコレステロールまたはコレステリルヘ
ミサクシネートの取込みは、膜流動性を減少し、そして
膜−脂質ミクロビスコシティーを増加した。コレステロ
ールおよびその他のステロールはまた、脂質二重層の物
理的特性を変えるためにリン脂質リポソーム膜内へ取込
まされている。例えば、最近の抜粋において、エレンズ
ら［Ｅｌｌｅｎｓ ｅｔ．ａｌ．］（１９８４年、バイ
オフィジィックス ジャーナル ４５：７０ａ［１９８
４，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：７０ａ］） はホスフ
ァチジルエタノールアミンおよびコレステリルヘミサク
シネートから成る脂質ベシクルの安定性におけるＨ+ の
効果について論議している。事実、ブロッカホフとラム
サミー［Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ ａｎｄ Ｒａｍｓａ
ｍｍｙ］（１９８２年、バイオチミカ エト バイオフ
ィズィカ アクタ ６９１：２２７〜２３２［１９８
２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．］）
は、安定化する親水性アンカーが供給されるならが二重
層が完全にコレステロールから成るもので構成され得る
ことを報告している。マルチラメラおよびユニラメラコ
レステロールリポソームは上述した周知の方法におい
て、有機溶媒中に分散されたコレステロール誘導体（す
なわち、コレステロール ホスフォコリン、コレステロ
ール−ポリエチレングリコール、またはコレステロール
−ＳＯ₄ ）を乾燥するまで蒸発させ、反応容器中に沈殿
した脂質フィルムを残すことで調製された。この脂質フ
ィルムはマイクロチップを有する超音波ホモジナイザー
を用いて２ｍｌ水下で音波処理された。マルチラメラベ
シクルの形成には１０分間の音波処理が必要とされ、一
方スモールユニラメラベクシルの形成には４時間の音波
処理が必要とされた。このマルチラメラリポソーム生成
懸濁液は乳白色で、一方ユニラメラリポソームの懸濁液
は透明であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、水溶性
活性物質のより高い服用量の投与を提供するためおよび
水不溶性の活性物質の投与を容易とするために、生体内
投与に適したステロールベシクルへ生物学的活性物質を
有効に捕捉する方法は、これまでに明らかとはされてお
らず、これらの方法を提供することが本発明の課題であ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ステロールの
有機酸誘導体の塩形態からなる二重層からなる生物活性
剤を含有するステロールリポソームの調製方法に関する
ものである。即ち本発明は、（１）閉鎖されたベシクル
を形成し得るステロールのジカルボン酸類、ポリカルボ
ン酸類、ヒドロキシ酸類、アミノ酸類及びポリアミノ酸
類から選択される有機誘導体の塩形態を完全に閉鎖され
たベシクルを形成するのに十分な量で、水性相に添加
し、ステロールベシクル中に捕捉されるべき化合物をさ
らに水性相へ添加し、そしてマルチラメラベシクルの乳
白色の懸濁液が形成されるまで混合物を振盪することか
らなる生物活性剤を含有するステロールリポソームの調
製方法、（２）ステロールベシクル中に捕捉されるべき
化合物が水溶性である（１）記載の方法、（３）ステロ
ールベシクル中に捕捉されるべき化合物が水不溶性であ
る（１）記載の方法、（４）閉鎖されたベシクルを形成
し得るステロールのジカルボン酸類、ポリカルボン酸
類、ヒドロキシ酸類、アミノ酸類及びポリアミノ酸類か
ら選択される有機誘導体の塩形態を完全に閉鎖されたベ
シクルを形成するのに十分な量で、水性相に添加し、ス
テロールベシクル中に捕捉されるべき化合物をさらに水
性相へ添加し、そして得られたマルチラメラベシクルの
乳白色の懸濁液を、ユニラメラベシクルの懸濁液を形成
するために、さらに音波処理するものである生物活性剤
を含有するステロールリポソームの調製方法、（５）ス
テロールベシクル中に捕捉されるべき化合物が水溶性で
ある（４）記載の方法、および（６）ステロールベシク
ル中に捕捉されるべき化合物が水不溶性である（４）記
載の方法、に関するものである。

【０００７】化合物の捕捉は、本明細書において、リポ
ソームの水性成分中への水溶性化合物の捕捉またはステ
ロール二重層内への水不溶性化合物の捕捉として定義さ
れる。本発明のステロールリポソームは、捕捉した化合
物の生体内投与に特に有用であり、この場合、ステロー
ルの有機酸誘導体の生体適合性塩形態がリポソームの調
製に用いられるべきである。実際、生体内投与に関し
て、ステロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン塩（トリス−塩）形態がベシクル二
重層構成成分として特に有用である。ステロールベシク
ルを調製する方法は、水性緩衝溶液に、水性成分を捕捉
する完全に閉塞された二重層を形成するのに十分な量
の、閉塞二重層を形成し得るステロールの有機酸誘導体
の塩形態を添加することを包含するものである。マルチ
ラメラベシクルの懸濁液はこの混合物を振盪することに
よって形成される。水性緩衝溶液が溶液中に該塩の対イ
オンをも含んでいるとすると、ベシクルの形成は促進さ
れる。さらにまた、ステロールの有機酸誘導体の解離化
塩形態が中性ｐＨで負に帯電されるとすると、水性緩衝
溶液は本質的に二価または多価カチオンが存在しないも
のとされるべきである。同様にステロールの有機酸誘導
体の解離化塩形態が中性ｐＨで正に帯電されるとする
と、水性緩衝溶液は本質的に二価または多価アニオンが
存在しないものとされるべきである。懸濁液へのエネル
ギーの適用、例えば音波処理、またはフレンチ加圧セル
（フレンチプレス［Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ］）を通
してのもしくは適当な孔径を有する多孔性フィルターを
通してのベシクルの押出しは、マルチラメラステロール
ベシクルをユニラメラベクシルへと転化させるであろ
う。本発明のステロールベシクル中へ水溶性化合物、部
分水溶性化合物または水不溶性化合物を捕捉させるため
には、いくつかの方法が可能である。ステロール二重層
中へ分配されるもの（例えば、水不溶性化合物）または
水溶性化合物のいずれであっても、ベシクル形成の間に
この物質をベシクル中に捕捉するために、ベシクル形成
以前に水性相へ添加することができる。あるいはまた、
水不溶性または脂溶性である化合物は、ベシクルが形成
された後に、ステロールベシクルの懸濁液に添加される
ことができ、この場合、化合物はステロール二重層中に
分配される。他の実施態様において、水溶性化合物およ
びステロールの有機酸誘導体の塩形態は、この双方を可
溶とする（相互可溶とする）ために有機溶媒へ添加する
ことができる。有機溶媒は、次に、水不溶性化合物とス
テロール誘導体の均質な分配物を含有するフィルムを残
して蒸発される。水不溶性化合物を捕捉するステロール
リポソームは、水性緩衝溶液がフィルムへ振盪しながら
添加された時に形成される。本発明のステロールリポソ
ームは、水不溶性の生物学的活性物質または水中にわず
かに溶ける生物学的活性物質を捕捉するのに用いられる
場合に、特に有利である。これは、水不溶性薬剤の生体
内投与を可能とし、そしてさらに、これは、服用量：容
量比の変化を許容するゆえに、高濃度の水不溶性化合物
の生体内投与を可能とするものである。本発明のステロ
ールベシクルは、水溶性の生物学的活性物質を捕捉する
のに用いられる場合にも同様の利点を提供する。さら
に、本発明のステロールベシクルは生体外的な診断学的
検定法において用いられ得る。

【０００８】本発明は、いくつかの利点を提供する、す
なわちステロールベシクルは、（１）容易にかつ迅速に
形成される、（２）リン脂質−ＭＬＶと比較して高い内
包能を有する、（３）その調製に有機溶媒の使用を必要
としない（本発明のステロールベシクルは有機溶媒を用
いても調製することはできるが）、そして（４）生体内
に投与された場合、放出されそして新陳代謝される生物
学的に活性物質なあるいは薬剤を捕捉することができ
る。生体内での捕捉物質の運命は、投与の様式に依存す
る。本発明は、水溶性、部分水溶性をもしくは水不溶性
化合物のリポソーム中への捕捉、即ち閉塞した二重層を
形成し得るステロールの有機酸誘導体の塩形態よりなる
二重層への捕捉方法およびそれによって得られる組成物
に関するものである。本発明のステロールリポソーム
は、（１）水性成分中に水溶性化合物を捕捉する、ある
いは（２）ステロール二重層中へと分配する水不溶性化
合物を捕捉する、あるいはまた（３）水溶性化合物と水
不溶性化合物の双方を１つのリポソーム調製物中へ捕捉
するように調製され得る。水性溶液中で完全に閉鎖され
た二重層（すなわちリポソーム）を形成し得るステロー
ルの有機酸誘導体の任意の塩形態が本発明の実施におい
て用いられ得る。ステロールの有機酸誘導体の特定の塩
形態の好適性は、水溶性化合物が外部環境と接触してな
いために、水溶性化合物を捕捉するその能力の如何にか
かっている。任意のリポソームの水性成分中での捕捉が
生じたことを明確に測定するために、以下の基準が確立
されている（セサとウェイシュマン、１９７０年 ジャ
ーナル オブ バイオロジー アンド ケミストリー
２４５：３２９５［Ｓｅｓｓａ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍ
ａｎ，１９７０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３
２９５］を参照のこと。）：（ａ）ゲル濾過によって検
定された際に捕捉された化合物と遊離の化合物が完全に
分離されていなければならない、（ｂ）最外郭のベシク
ル二重層と捕捉した化合物との間の疎水性相互作用また
は荷電−荷電相互作用があってはならない。というの
は、この相互作用が分子ふるいによるリポソームからの
遊離化合物の分離を達成することを妨害し、それによっ
て見せかけの捕捉ないしは内包能を不自然に増加させる
ためである。この可能性を回避するために、あらかじめ
形成されたリポソームの懸濁液に添加された水溶性化合
物が、あらかじめ形成されたリポソームと相互に溶出し
ないことを示すべきである。（ｃ）洗浄剤あるいは他の
膜摂動剤の使用によるゲル濾過されたリポソームの破裂
は、リポソームピークと一致する位置から遊離分子で溶
出する位置への、捕捉された分子のゲル濾過パターンに
おけるシフトを誘導するものでなければならない。

【０００９】一般に、有機酸の付加により変性され得る
任意のステロールが、本発明の実施において用いられ得
る。例えばこのようなステロールとしては、コレステロ
ール、ビタミンＤ、植物ステロール類（シトステロー
ル、カンペステロール、スチグマステロールおよび同様
のものが含まれるが、何らこれらに限定されるものでは
ない。）、ステロイドホルモン類および同様のものが含
まれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
ステロールを誘導体化するのに用いられ得る有機酸は、
カルボン酸類、ジカルボン酸類、ポリカルボン酸類、ヒ
ドロキシ酸類、アミノ酸類およびポリアミノ酸類を含む
が、もちろんこれらに限定されるものではない。塩形態
は有機酸の水溶解性を高めるゆえに、任意の有機酸がス
テロールを誘導体化するために用いられ得る。しかしな
がら、有機酸部分自身が水溶性である場合には、ある利
点が得られる。このような水溶性有機酸部分は、酢酸、
プロピオン酸、酪酸、吉草酸および同様のものなどのよ
うな水溶性脂肪族カルボン酸類（注：炭素数４個までの
酸は水と混和する、炭素数５個の遊離酸は部分的に溶解
し、より長い鎖を有する遊離酸は実質的に不溶性とな
る。）；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン
酸、ピメリン酸、マレイン酸および同様のものなどのよ
うな水溶性脂肪族ジカルボン酸類（注：より短い鎖のも
のは、水中で幾分かより溶解する。水中での溶解性のボ
ーダラインは炭素数６ないし７で起こる。）；そしてヘ
ミメリチン酸、トリメシン酸、サクシンイミドおよび同
様なものなどのような水不溶性芳香族ジカルボン酸類；
ポリカルボン酸類；グリコール酸、乳酸、マンデル酸、
グリセリン酸、リンゴ酸、洒石酸、クエン酸および同様
のものなどのような水溶性ヒドロキシ酸（注：カルボニ
ル基の第α位の炭素に付着した分枝鎖を有するα−ヒド
ロキシ酸は加水分解をより受けにくく、そしてそれゆ
え、本発明の実施において有利である。）；ならびに任
意のアミノ酸類およびポリアミノ酸類が含まれるが、も
ちろんこれらに限定されるわけではない。有機酸は、周
知の方法（例えば米国特許第３，８５９，０４７号、米
国特許第４，０４０，７８４号、米国特許第４，０４
２，３３０号、米国特許第４，１８３，８４７号、米国
特許第４，１８９，４００号を参照のこと。）を用いて
エステルまたはエーテル結合を介してステロールの水酸
基へと結合されることができる。誘導体化ステロールの
塩形態は、ステロールの有機酸誘導体と塩の対イオン
（例えば、塩の遊離塩基）の双方を適当な揮発性溶媒中
に溶解し、そして該溶媒を蒸発あるいは同様の技法によ
り除去し、ステロールの有機酸誘導体の塩形態からなる
残留物を残すことにより調製され得る。用いられ得る対
イオンとしては、トリス（［ｔｒｉｓ］ トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン）、２−アミノ−２−メチ
ル−１，３−プロパンジオール、２−アミノエタノー
ル、ビス−トリスプロパン、トリエタノールアミンおよ
び同様なものが含まれ（もちろんこれらに限定されるわ
けではない。）、相応する塩が形成される。実際、ミコ
ナゾール遊離塩基および同様のものなどのようなイオン
化可能な生物学的活性剤の遊離塩基が対イオンとして用
いられ得る。

【００１０】本発明のステロールリポソームは、二重層
を形成し得るステロールの有機酸誘導体の塩形態を、該
誘導体化ステロールがベシクル（すなわち、捕捉した水
性成分を含有する完全に閉鎖した二重層）を形成するの
に十分な量存在するように、水性相へ添加することによ
り調製され得る。この調製物は、次にマルチラメラコレ
ステロールベシクルの乳白色の懸濁液が形成されるまで
振盪される。好ましい実施態様においては、水性相は、
ベシクル形成を促進するように溶液中に該塩を含むべき
である。さらにまた、ステロールの有機酸誘導体の解離
塩形態が中性ｐＨで負に荷電されている場合には、水性
緩衝溶液は本質的に多価カチオンの存在しないものでな
ければならない。同様に、有機酸誘導体の解離塩形態が
中性ｐＨにおいて正に荷電されている場合には、水性緩
衝溶液は、本質的に多価アニオンの存在しないものでな
ければならない。マルチラメラベシクル形成に関する報
告された方法（例えば、ブロッカホフとラムサミー、１
９８２年、バイオチミカ エト バイオフィズィカ ア
クタ ６９１：２２７〜２３２［Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆ
ｆ ａｎｄ Ｒａｍｓａｎｎｙ，１９８２，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ａｃｔａ．６９１：２２７−２
３２］のリン脂質ベシクルまたはコレステロールリポソ
ーム）との完全な差異として、本発明のステロールマル
チラメラベシクルの形成に関する方法は、有機溶媒の使
用を必要としない。さらにまた、ブロッカホフとラムサ
ミーの方法（上記）とは異なり、ステロールマルチラメ
ラベシクルを形成するために音波処理を必ずしも必要で
はない。事実、本発明のステロールマルチラメラベシク
ルの乳白色の懸濁液の音波処理、あるいは後の音波処理
を伴なうフレンチプレス（エスエルエム−アミンコ［Ｓ
ＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ］、アラバマ、イリノイ州）の使用
は、マルチラメラステロールベシクルの乳白色の懸濁液
をユニラメラステロールベクシルの透明な懸濁液へと転
化するために用いることができる。同様に直径１００ｎ
ｍに等しいあるいはこれ以下の孔径を有するフィルター
を通しての適当な圧力下でのマルチラメラステロールベ
シクルの多段階押出しは、ユニラメラステロールベクシ
ルを得るために用いることが可能である。この押出し技
法は、参考のため本明細書で引用している「ユニラメラ
ベクシル調製のための押出し技法［Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ］」に関す
るキューリスら［Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．］によっ
て１９８４年６月２０日に出願された同時係属出願一連
番号第６２２，６９０号中に詳細に述べられている。

【００１１】先に説明したようにステロールの任意の有
機酸誘導体のトリス−塩形態は、本発明の実施において
有効に用いられる。例をあげると、例えばステロールヘ
ミサクシネートまたはステロールヘミサクシネート類の
混合物などのような、ステロールヘミジカルボン酸のト
リス−塩形態は、生体内に投与されるステロイドリポソ
ームのベシクル二重層を形成するのに特に有用である。
例えば、コレステロールヘミサクシネートを用いた場
合、２．５〜７０μｍｏｌの、トリス−塩形態が、トリ
ス−ＨＣｌ［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ］（トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン ハイドロクロライド）を含有す
る２．０ｍｌの水性緩衝溶液へベシクルを形成するよう
に添加される。この場合、水性緩衝溶液は本質的に二価
または多価カチオンの存在しないものでなければならな
い。本発明によると、水溶性化合物、水不溶性化合物あ
るいはわずかに可溶な化合物の、ステロールの有機酸誘
導体の塩形態から構成されるリポソーム中への捕捉は、
いくつかの方法によって達成されることができる。 （１）水不溶性化合物は、ステロールの有機酸誘導体の
適当な塩形態を用いて上記したようにして調製されたス
テロールリポソーム（マルチラメラステロールベシクル
またはユニラメラステロールベクシルのいずれか）の懸
濁液へ添加されることができる。該化合物は、ステロー
ル二重層へ分配されるゆえ、リポソーム中へ捕捉され
る。この実施態様は通常以下のように実行される。すな
わち、水不溶性化合物は適当な有機溶媒中に溶解され、
続いて蒸発が行なわれ、フィルムすなわち該化合物の残
留物を残すものである。そして、予め形成されたステロ
ールリポソームの水性懸濁液が該残留物へ添加された
際、該残留物はステロールリポソームの二重層中に捕捉
される。好ましい実施態様においては、ユニラメラステ
ロールベクシルが用いられるべきである。マルチラメラ
ステロールベシクルが用いられた場合には、水不溶性化
合物はリポソームの最外殻の二重層中に捕捉され、不変
化の最内殻の二重層を残すこととなり、ステロール成分
の不必要な使用という結果に終るためである。 （２）水不溶性化合物とステロールの有機酸誘導体の塩
形態は双方とも有機溶媒中に共溶解されることができ、
続いて、蒸発が行なわれ、水不溶性化合物とステロール
誘導体との均質な分配物からなるフィルムを残すもので
ある。捕捉した化合物を含有するマルチラメラステロー
ルベシクルの懸濁液が、振盪を行ないながら該フィルム
に水性相を加えることによって形成される。このマルチ
ラメラベシクルは前記したようにユニラメラベクシルに
転化されることができる。 （３）水溶性化合物または水不溶性化合物は、ステロー
ルベシクルの調製において用いられる水性相中に該化合
物を添加することで、ステロールリポソーム中に捕捉さ
れることができる。すなわち、該化合物は、水性相に、
ステロールの有機酸誘導体の塩形態を添加する前にまた
は同時に添加され得る。この場合、水不溶性化合物は、
ベシクル形成の間にこれが二重層中へ分配された際に捕
捉されたものとなり、一方水溶性化合物は、ベシクル形
成の間にステロールベシクルの水性成分中に捕捉された
ものとなる。いずれの場合も、マルチラメラベシクルは
前記したようにしてユニラメラベクシルに転化されるこ
とができる。 （４）もし生物学的活性物質が、イオン化され得るもの
である場合、生物学的活性物質の遊離塩基は、ステロー
ルの有機酸誘導体の塩形態を調製するための対イオンと
して用いられ得る。ステロールリポソームは、ステロー
ルの有機酸誘導体の生物学的活性物質−塩形態を用い
て、本明細書において前述した任意の方法によって調製
され得る。例えば、抗真菌性化合物であるミコナゾール
の遊離塩基は、本発明のこの実施態様において塩誘導体
を形成するために用いられ得る。以上述べた４つの方法
のいずれかを用いることで、水溶性化合物および水不溶
性化合物の双方が１つのステロールリポソーム調製物中
に捕捉され得る。

【００１２】本発明のステロールベシクルを用いての水
不溶性化合物の捕捉に関して上記された方法によれば、
いったん二重層中へ水不溶性化合物が分配すれば、ベシ
クルを損なわずにとどめておく必要はない。実際、ひと
たび化合物が二重層中へ分配すると、ベシクルは、捕捉
した水性の化合物の漏出ないしは放出を導きながら撹乱
ないしは崩壊されることが考えられうる。このような
「漏れやすい」ベシクルは捕捉した水不溶性化合物を搬
送するためには用いることができるが、水溶性物質の内
包ないし搬送には用いるべきではない。

【００１３】

【発明の実施態様】本発明の一実施態様によると、ステ
ロールリポソームは、コレステロールヘミサクシネート
のトリス−塩形態を用いて以下のようにして調製され
る：コレステロールヘミサクシネートのトリス−塩形態
４．５〜２００ｍｇが０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．
１４Ｍ ＮａＣｌを含有する水性緩衝溶液１ｍｌ当りに
ついて添加される。混合物は振盪されそしてコレステロ
ールヘミサクシネートマルチラメラベシクルの乳白色懸
濁液が形成される。ベシクルは遠心分離によってペレッ
ト化することができ、そして水性緩衝溶液を用いて繰返
し洗浄される。コレステロールヘミサクシネートマルチ
ラメラベシクル（ＣＨＳ−ＭＬＶ）の懸濁液はコレステ
ロールヘミサクシネートユニラメラベクシル（ＣＨＳ−
ＳＵＶ）を形成するために、音波処理（例えば浴型音波
処理器において）され得る。あるいはまた、ＣＨＳ−Ｍ
ＬＶは、４００００ｐｓｉでフレンチ圧力ふるい（フレ
ンチプレス）を濾過させられる。もしくはＣＨＳ−ＭＬ
Ｖは３００〜４００ｐａで２つの１００ｎｍヌクレオポ
ア［Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ］（商標名）フィルターを通
過させられて，ＣＨＳ−ＳＵＶを形成する。コレステロ
ールヘミサクシネートベシクル（ＭＬＶかＳＵＶのいず
れか）は２価のカチオンの存在下において不安定であ
る、すなわち、２価のカチオンにさらすことで、捕捉し
た水性成分および水溶性化合物を放出する。これゆえ、
ベシクルの調製においてあるいは貯蔵の間に用いられる
水性媒体は、本質的に２価のカチオンの存在しないもの
であるべきである。

【００１４】本発明の方法により捕捉される化合物は、
種々の方法で用いることができる。例えば、化合物が生
物学的活性物質である場合、ステロールリポソームに捕
捉された化合物は、生体内に投与され得る。これは、通
常、水溶液中に不溶またはほとんど溶けない生物学的活
性物質の生体内投与を容易にする。ステロールの有機酸
誘導体の塩形態から構成されたリポソーム中への捕捉
は、より高い服用量：容量比でこのような不溶性化合物
の投与を容易なものにし得る。実際、本発明のステロー
ルベシクルは、該ベシクルが生体内供給のための１ない
しそれ以上の生物学的活性物質を捕捉するのに用いられ
得るゆえ、生体内で特に有利に使用される。さらにま
た、本発明のベシクルは、これらが有機溶媒を用いるこ
となく調製され得るゆえ、生体内に使用された際に、従
来の脂質ベシクルないしはリポソーム以上の利点を与え
る。捕捉した作用物質の生体内での運命は、投与の経路
または様式に依存する。例えばステロールリポソームに
捕捉された作用物質が静脈内的に投与された場合、作用
物質の生体内におけるクリアランスは、捕捉されていな
い作用物質、またはリン脂質から構成された従来のリポ
ソーム（すなわち、ＭＬＶ、ＳＵＶ、ＲＥＶ、ＬＵＶ）
中に捕捉された作用物質とは異なる経路を伴う。一方、
ステロールリポソームに捕捉された作用物質の筋内投与
は、該作用物質の生体内における持続された放出をもた
らす。

【００１５】実質的に任意の生物学的活性物質が、本発
明のステロールリポソーム中へ捕捉されることができ
る。このような作用物質としては、例えば抗細菌性物
質、抗ウィルス性物質、抗真菌性物質、抗寄生虫性物
質、抗腫瘍性物質、抗代謝剤、ポリペプチド、ペプチ
ド、タンパク質、毒素、酵素、ホルモン、神経伝達物
質、糖タンパク、リポタンパク、免疫グロブリン、イム
ノモジュレーター、血管拡張剤、染料、放射線標識、放
射線不透過性化合物、蛍光化合物、受容体結合分子、抗
炎症剤、抗緑内障剤、散瞳性化合物、局所麻酔剤、麻
薬、ビタミン、核酸、ポリヌクレオチドなどが含まれる
が、もちろんこれらのに限定されるものではない。２な
いしそれ以上の化合物を同時に捕捉することは、これら
の化合物が相補的なあるいは相乗的な効果をもたらす場
合に特に望ましい。ステロールリポソームに捕捉された
作用物質は、接種もしくは注射（例えば、静脈内、腹腔
内、筋内、皮下、耳内、関節内、乳房内等）、局所適用
（例をあげると、例えば眼、皮膚などのような部位上
に、耳内に、あるいは創傷および火傷などのような傷の
上に）、および上皮または粘膜皮膚内面（例えば鼻の、
口内の、膣の、直腸の、胃腸の粘膜など）を通じての吸
収などのような（もちろんこれに限定されるわけではな
い。）任意の好ましい経路によって生体内に投与され
る。これらの使用の他の例において、ステロールリポソ
ームに捕捉された化合物は、他の脂質のベシクルないし
リポソーム、ゲル、オイル、エマルジョンおよび同様の
ものなど（もちろんこれらに限定されるわけではな
い。）のような広い範囲の物質中へ取り込まれ得る。例
えば、捕捉化合物を有するステロールリポソームの懸濁
液は、任意の種類のリポソーム調製物（例えば、リン脂
質のＭＬＶ，ＳＵＶ，ＬＵＶ，ＲＥＶなど）における成
分である水性相に添加される。これによってリン脂質リ
ポソーム中へ上記化合物を捕捉することができる。上記
以外の他の使用については、調製物の特別の特性によっ
ており、当業者が容易に想像し得るものである。例えば
これらの二価カチオン感応性ゆえに、本発明のコレステ
ロールヘミサクシネートリポソームは、二価カチオンに
対して感応性の指示染料を捕捉することにより、生体外
における比色的な診断学的検定法に用いることができ
る。

【００１６】本発明におけるステロールリポソームにお
いては、有機酸の塩形態などのような親水性部が付着さ
れており、例えばコレステロールあるいは他の脂質のな
どのようなステロールが、マルチラメラベシクル［ｍｕ
ｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ］またはスモ
ールユニラメラベシクル［ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅ
ｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ］の懸濁液の調製に用いるこ
とができる。本発明のステロールリポソームは、有機溶
媒を用いてあるいは用いずに調製され得る。これらのベ
シクル（小胞体）は、水溶性化合物、部分水溶性化合物
および水不溶性化合物を捕捉し得る。本発明におけるス
テロールベシクルは、生体内に［ｉｎ ｖｉｖｏ］投与
され得る生物学的に活発な化合物ないしは薬学的な化合
物の捕捉に特に有用である。あるいはまた、本発明のス
テロールリポソームは、生体外的に［ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ］に用いられ得る。例えば、本明細書中に述べられる
コレステロールヘミサクシネートリポソームは、生体外
において二価カチオン依存検定システムに用いられ得
る。

【００１７】

【実施例】以下の例は、説明の目的のためのものであ
り、本発明の範囲を限定するものではない。水溶性化合物を捕捉するコレステロールヘミサクシネー
トリポソーム 以下、アルセナゾIII 、イヌリンまたはクロムを捕捉す
るコレステロールヘミサクシネートリポソームの調製を
述べるものである。内包能および捕捉容量などのような
パラメーターが評価されている。このコレステロールベ
シクルのカルシウム依存不安定性が表示される。コレス
テロールヘミサクシネートベシクルの冷凍エッチング電
子顕微鏡像、Ｘ線回折像および電子スピン共鳴吸収につ
いて、また述べられている。 例１ コレステロールヘミサクシネートの種々の塩形態
を用いて調製されたリポソーム 以下の文節は、コレステロールヘミクシネートの種々の
塩形態を用いてのＣＨＳリポソームの調製を述べるもの
である。コレステロールヘミサクシネートのトリス−塩
形態（以下トリス−塩ＣＨＳと呼称する。）を含むすべ
ての例において、トリス−塩ＣＨＳは、シグマバイオケ
ミカルズ、セントルイス、ミズリー州［Ｓｉｇｍａ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］か
ら購入され、精製されずに用いられたか、あるいは以下
のようにして合成されたもののいずれかであった。トリ
ス塩基の３．３モル溶液３０ｍｌが、エーテル中のコレ
ステロールヒドロゲン サクシネート（アイシーエス、
クリーブランド、オハイオ州［ＩＮＣ、Ｃｌｅｖｅｌａ
ｎｄ，Ｏｈｉｏ］）の６７Ｍモル溶液１．５リットルに
添加された。得られた溶液は、しめった残留物となるま
で回転蒸発されそして１２時間凍結乾燥された。得られ
たトリス−塩ＣＨＳは、酢酸エチルから３度再結晶化さ
れた。残留酢酸エチルは減圧下（０．１ｍｍＨｇ）５６
℃に加熱することによって除去された。

【００１８】例１−１ トリス−塩コレステロールヘミ
サクシネート−ＭＬＶ トリス−塩ＣＨＳ（５４ｍｇ）が０．０１Ｍ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ中のアル
セナゾIII（４．５ｍＭ、最終濃度）の溶液１ｍｌに添
加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの乳白色の懸濁液が機械的振
盪によって形成された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０
００×ｇで１５分間遠心分離されて、ペレット化され、
そして得られたペレットは０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．３），０．１４Ｍ ＮａＣｌの１０ｍｌを用
いて３度洗浄された。得られたペレットは、アルセナゾ
IIIの捕捉を示す赤色を呈していた。 例１−２ ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン
ジオールコレステロールヘミサクシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシネート（５０ｍｇ）の２−ア
ミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール塩が０．
０１Ｍ ２−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオ
ール−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．０７Ｍ ＫＣｌ，
０．０７Ｍ ＮａＣｌ中のアルセナゾIII（４．５ｍ
Ｍ、最終濃度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−Ｍ
ＬＶの懸濁液はガラス製ビーズを用いての旋回混合によ
って、形成された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０００
×ｇで１５分間遠心分離されて、ペレット化され、そし
て得られたペレットは第６．１．１節で述べた様にして
３度洗浄された。得られたペレットは、アルセナゾIII
の捕捉を色示していた。 例１−３ ２−アミノエタノールコレステロールヘミサ
クシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシネート（５０ｍｇ）の２−ア
ミノエタノール塩が０．０１Ｍ ２−アミルエタノール
−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），０．０７Ｍ ＫＣｌ，０．０
７Ｍ ＮａＣｌ中のアルセナゾIII（４．５ｍＭ、最終
濃度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの懸
濁液はガラス製ビーズを用いての旋回混合によって形成
された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０００×ｇで１５
分間遠心分離されて、ペレット化され、そして得られた
ペレットは、第６．１．１節において述べる様にして３
度洗浄された。得られたぺレットは、アルセナゾIIIの
捕捉を示す赤色を呈していた。

【００１９】例１−４ ビス−トリス−プロパンコレス
テロールヘミサクシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシネート（５０ｍｇ）のビス−
トリス−プロパン塩が０．０１Ｍビス−トリス−プロパ
ン−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），０．０７Ｍ ＫＣｌ，０．
０７Ｍ ＮａＣｌ中のアルセナゾIII（４．５ｍＭ、最
終濃度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの
懸濁液はガラス製ビーズを用いての旋回混合によって形
成された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０００×ｇで１
５分間遠心分離されて、ペレット化され、そして得られ
たペレットは、例１−１において述べる様にして３度洗
浄された。得られたぺレットは、アルセナゾIIIの捕捉
を示す赤色を呈していた。 例１−５ トリエタノールアミン コレステロール ヘ
ミサクシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシネート（５０ｍｇ）のトリエ
タノールアミン塩が０．０１Ｍトリエタノールアミン−
ＨＣｌ（ｐＨ７．３），０．０７Ｍ ＫＣｌ、０．０７
Ｍ ＮａＣｌ中のアルセゾIII（４．５ｍＭ、最終濃
度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの懸濁
液は１０，０００×ｇで１５分間遠心分離され、ペレッ
ト化され、そして得られたペレットは第６．１．１節に
述べる様にして３度洗浄された。得られたぺレットは、
アルセナゾIIIの捕捉を示す赤色を呈していた。 例１−６ ミコナゾールコレステロールヘミサクシネー
ト−ＭＬＶ ミコナゾールの遊離塩基が以下のようにして調製され
た。すなわち、ＮａＯＨの水溶液がエーテル中のミコナ
ゾール−ニトレートの懸濁液中へ滴定さた。エーテル相
は、採取され、そしてエーテルは、ミコナゾール遊離塩
からなるオイルを残して蒸発される。該オイルは次にコ
レステロールヒドロゲンサクシネートを含有するエタノ
ールへ添加された。エタノールは、ミコナゾールコレス
テロールヘミサクシネートの塩形態からなるフィルムを
残して蒸発される。次に、該フィルムに食塩水が添加さ
れる。延長的な旋回混合の後に、ベシクルが溶液中に観
察された。 例１−７ 音波処理により調製されたコレステロールヘ
ミサクシネート−ＳＵＶ アルセナゾIIIを用いない以外は、上記例１−１、１−
２、１−３、１−４、および１−５述べたものと同様に
して、ＣＨＳ−ＭＬＶが調製された。それぞれのベシク
ルの最終ペレットは、それが調製された緩衝溶液の２ｍ
ｌ中へ再懸濁され、そして乳白色の懸濁液が透明とな
り、ＣＨＳ−ＭＬＶのＣＨＳ−ＳＵＶへの転化を示すま
で浴型音波処理器において音波処理された。 例１−８ 押出し技法により調製されたコレステロール
ヘミサクシネート−ＳＵＶ ＣＨＳが、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、１０ｍＭヘペス
［ＨＥＰＥＳ］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
中へ分散させられた。この物質は、３０ｎｍヌクレオポ
アフィルターを通して１０回押出され、ＣＨＳ−ＳＵＶ
を得た。

【００２０】例２ コレステロールヘミサクシネートＭ
ＬＶ中へのイヌリンの捕捉 捕捉される作用物質として ³Ｈ−イヌリンを取込んだコ
レステロールヘミサクシネートマルチラメラベシクル
（ＣＨＳ−ＭＬＶ）は、以下の様にして調製された。³
Ｈ−イヌリン（１．０ｍＣｉ／ｍｌ、ニューイングラン
ド ヌクレア［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ］、ボストン、マサチューセッツ州）は、０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣ
ｌ ２ｍｌ中へ溶解された。次にトリス−塩ＣＨＳ４０
ｍｇが該溶液へ添加され、そして得られた混合物は振盪
により機械的に分散された。マルチラメラベシクル形成
を示す乳白色の懸濁液が形成された。この懸濁液は、２
時間静置され、この時間経過時に懸濁液は０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ
を用いて最終濃度の１０ｍｌへと希釈された。１つの１
０μｌアリコット（［ａｌｉｑｕｏｔ］、分割物）の放
射能は、該アリコットをシンチレーション流体（オムニ
フルア［Ｏｍｍｉｆｌｏｕｒ］（ニューイングランド
ヌクレア、ボストン、マサチューセッツ州）４０ｇ、ト
ルエン６ｌ、エチレングリコールモノエチルエーテル４
ｌ）１０ｍｌ中に添加し、そして０．４００にウィンド
ウをセットしてベックマンＬ６８００リクイド シンチ
レーションカウンター［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ６８００
ｌｉｑｕｉｄ ｓｃｉｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔ
ｅｒ］を用いて放射能測定をすることにより、２４，６
２５ｃｐｍ／１０μｌであると測定された。１分間あた
りのカウント数（ｃｐｍ）における放射能はケンチング
補正のＨ＃方法［ｔｈｅ Ｈ＃ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ
ｑｕｅｎｃｈ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ］を適用すること
によって１分間あたりの崩壊に変換された（ホロック、
ディーエル ザ ナンバー コンセプト、ベックマン
インストルメンツ、１９７７［Ｈｏｒｒｏｃｋ，Ｄ．
Ｌ． Ｔｈｅ Ｎｕｍｂｅｒ Ｃｏｎｃｅｐｔ，Ｂｅｃ
ｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，１９７７］）。こ
のＣＨＳ−ＭＬＶは次に１０，０００×ｇで１５分間遠
心分離されてペレット化された。得られたペレットは該
ペレットを０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、
０．１４Ｍ ＮａＣｌを用いて最終濃度の１０ｍｌ中に
再懸濁させ、そして１０，０００×ｇで１５分間遠心分
離して再ペレット化することによって３度洗浄された。
ベシクルの洗浄されたペレットは、最終容量１０ｍｌと
なるように０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ中へ再懸濁された。１０μｌアリ
コットの放射能は３，４４２ｃｐｍ／１０μｌであると
測定された。それゆえ、最初の ³Ｈ−イヌリンの全体の
１４％がＣＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉された。

【００２１】例２−１ コレステロールヘミサクシネー
ト−ＭＬＶおよび卵ホスファチジルコリン−ＭＬＶにお
けるイヌリン内包能 コレステロールヘミサクシネートの変動濃度からなるＭ
ＬＶ中に捕捉されたイヌリンの内包能が、卵ホスファチ
ジルコリンの変動濃度からなるＭＬＶ中に捕捉されたイ
ヌリンの内包能と比較された（注．任意のリポソームに
関する内包能は、二重層によって隔離された水性成分の
画分と定義され、そしてそれはパーセンテージで表わさ
れる。上記２−１参照のこと。）。卵ホスファチジルコ
リン（ＥＰＣ）またはトリス−塩ＣＨＳのいずれかで構
成されるマルチラメラベシクルは、内包能を比較するた
めに全く同じ処方を用いて調製された。従って ³Ｈ−イ
ヌリン（２１７．０ｍＣｉ／ｍｇ）５μｌを有する。
０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４
Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌ中の４０、８０、１６
０、３２０もしくは４００ｍｇの濃度のトリス−塩ＣＨ
Ｓが旋回混合され、そして２時間放置され、捕捉された
化合物として ³Ｈ−イヌリンを有するＣＨＳ−ＭＬＶが
形成された。０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液の追加的な３ｍｌ
が該懸濁液に添加され、懸濁液は室温下１晩放置され
た。次に、０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液約３．０ｍｌが全
容量を１０ｍｌまでにするために添加された。卵ホスフ
ァチジルコリン（アバンティ、バーミンガム、アラバマ
州［Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ］）か
ら構成されるマルチラメラベシクル（ＥＰＣ−ＭＬＶ）
は以下の処方により調製された。４０、８０、１６０、
３２０もしくは４００ｍｇ／ｍｌのＥＰＣが、このリン
脂質を完全に溶解するのに十分な量のクロロホルム中に
懸濁された。クロロホルムは乾燥するまで蒸発され、試
験管にワックス状の沈殿物が残された。次に ³Ｈ−イヌ
リン（２１７．０ｍＣｉ／ｍｇ）５μｇを有する０．０
１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌが添加され、この混合物は
「膨張」させられ、得られたＥＰＣ−ＭＬＶは延長され
た旋回混合により分散させられた。追加的な０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣ
ｌ緩衝溶液３ｍｌが該懸濁液に添加され、懸濁液は室温
下一晩放置された。次に０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液を用いて、
全容量を１０ｍｌとした。ＣＨＳ−ＭＶＳおよびＥＰＣ
−ＭＬＶによる ³Ｈ−イヌリン内包能が以下のようにし
て測定された。成分のそれぞれ最初の混合物の２０μｌ
における放射能が、前記したようにシンチレーションカ
ウンティングによって計測された。形成の後、リポソー
ムは、懸濁液を１０，０００×ｇで１０〜２０分間遠心
分離することによってペレット化され、それぞれのペレ
ットは、０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液１０ｍｌ中で４度洗浄さ
れ、そして最終容量１０ｍｌの０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．３）、０．１４ＮａＣｌ緩衝溶液へ再懸濁
された。この最終的に洗浄されたサンプルの２０μｌア
リコットの放射能が測定された。この最終的なサンプル
において計測された最初の放射能の分数が、脂質ベシク
ル中に捕捉された ³Ｈ−イヌリンを表わした。表１に示
すように、内包能における増加は、ＣＨＳ濃度における
増加に比例しているが、より重要なことは２０〜２００
ｍｇ／ｍｌＣＨＳを用いて調製されたＣＨＳ−ＭＬＶ
は、同濃度のリン脂質を用いて調製されたＥＰＣ−ＭＬ
Ｖのものよりも、より高いイヌリン内包能を示したこと
である。

【００２２】 表 １ リン脂質ベシクルとコレステロールヘミサクシネートベシクルに おけるイヌリンの内包能の比較 脂質の濃度(mg／ml） 捕捉された ³Ｈ−イヌリン（％） ＥＰＣ−ＭＬＶ a ＣＨＳ−ＭＬＶ b ２０ ２ １０ ４０ ４ １４ ８０ ５ ２９ １６０ ８ ３８ ２００ １１ ６０ ａ： 卵ホスファチジルコリン マルチラメラ ベシクル ｂ： コレステロール ヘミサクシネート マルチラメラベシクル ＣＨＳ−ＭＬＶの内包能が、水性緩衝溶液中でＣＨＳが
遊離 ³Ｈ−イヌリンと接触した時間の量によって影響さ
れるか否かを測定するために、ＣＨＳ−ＭＬＶが以下の
ようにして調製された。トリス−塩ＣＨＳ８０ｍｇある
いは３００ｍｇが ³Ｈ−イヌリン（２１７ｍＣｉ／ｍｇ
比放射能）１０μｌを含有する０．０１Ｍ トリス−Ｈ
Ｃｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液２０ｍｌ中に旋回
混合され、これによりそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌおよび１
５０ｍｇ／ｍｌ ＣＨＳの濃度を用いたＣＨＳ−ＭＬＶ
を形成した。２つの脂質濃度のそれぞれ５つのサンプル
が調製され、ＣＨＳ−ＭＬＶ懸濁液は、０．０１Ｍ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩
衝溶液２．０ｍｌ中で室温下放置された。以下の時間間
隔、すなわち０、１５、３０、６０および１２０分で、
サンプルは同じ緩衝溶液を用いて１０ｍｌ容量とされ
た。それぞれのサンプルの最初の１０μｌアリコット
は、前記したようなシンチレーションカウンティングの
ために取り除かれた。サンプルは次に１０，０００×ｇ
で１０分間遠心分離され、それぞれのペレットは緩衝溶
液１０ｍｌ中で４度洗浄された。最終的なペレットは最
終容量１０ｍｌへと緩衝溶液中へ懸濁され、それぞれの
最終的サンプル１０μｌアリコットの放射能が、それぞ
れの時間点での最初のサンプルの放射能と比較された。
この結果は、試験された脂質のいずれの濃度においても
５つの時間点に関する内包能における顕著な違いが全く
なかったことを示すものであった。これは、調製物に対
して添加された最初の ³Ｈ−イヌリンの約１２％もしく
は２０％の捕捉は、それぞれＣＨＳ４０ｍｇ／ｍｌもし
くは１５０ｍｇ／ｍｌでの接触時間に関係なく起ること
を示している。これは、卵ホスファチジルコリンを用い
て調製された従来のＭＬＶとは異なり、「膨脹時間」
は、ＣＨＳ−ＭＬＶの調製においては不必要であること
を示すものである。

【００２３】例３ コレステロールヘミサクシネート−
ＳＵＶにおけるイヌリンの捕捉 捕捉された作用物質として ³Ｈ−イヌリンを含有するコ
レステロールヘミサクシネートから構成されたスモール
ユニメラベシクル（ＣＨＳ−ＳＵＶ）は次のようにして
調製された。１．０ｍＣｉ／ｍｌ ³Ｈ−イヌリン（ニュ
ーイングランドヌクレア、ボストン、マサチューセッツ
州）の１００μｌが、トリス−塩ＣＨＳ１００ｍｇある
いは２００ｍｇのいずれかが添加される０．０１Ｍ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ
２．５ｍｌ溶解された。ガラス製ビーズを用いての旋回
混合の後、混合物は、ビーズからピペット中へ吸引さ
れ、そして透明となるまで、すなわち約２時間、音波処
理された。懸濁液の透明化は、ＣＨＳ−ＭＬＶのスモー
ルユニラメラベシクルへの転化を示す。ＣＨＳ−ＳＵＶ
懸濁液中のＣＨＳの最終濃度はそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌ
および８０ｍｇ／ｍｌであった。イヌリン捕捉を明らか
とするために（上記第５節参照）、ＣＨＳ−ＳＵＶは、
以下のようなゲル濾過により未捕捉のイヌリンから分離
された。それぞれのリポソーム懸濁液は、０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ
緩衝溶液で平衡化され校正された、分子量４０，０００
〜１５，０００，０００ドルトンの操作範囲を有するバ
イオーゲル Ａ−１５ｍ［Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ−１５ｍ］
１００〜２００メッシュアガロースカラム（バイオ−レ
ッド ラボラトリーズ［Ｂｉｏ−Ｒｅｄ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ］、リッチモンド、カリフォルニア州）に
別々に適用された。次にカラムから溶出された１ｍｌ分
画は採取されそしてそれぞれの分画の１０μｌアリコッ
トの放射能が、前記したようにして測定された。隔離さ
れたイヌリンの存在しない透明な分離物がゲル濾過によ
って得られ、これゆえＣＨＳ−ＳＵＶ中へのイヌリンの
捕捉が示された。この分析は、イヌリンの約１％がＣＨ
Ｓ−ＳＵＶ中に捕捉されたことを示していた。

【００２４】例４ コレステロールヘミサクシネートＭ
ＬＶ中へのクロムの捕捉 捕捉された作用物質として⁵¹Ｃｒを取込むコレステロー
ルヘミサクシネートマルチラメラベシクルは、以下のよ
うにして調製された。トリス塩ＣＨＳ １５．０μｍｏ
ｌ、４０．０μｍｏｌ、６５．８μｍｏｌ、１００．０
μｍｏｌ、１７５．０μｍｏｌ、２６３．２μｍｏｌ、
５２６．４μｍｏｌもしくは６５８．０μｍｏｌが⁵¹Ｃ
ｒ（ニューイングランド ヌクレア、ボストン、マサチ
ューセッツ州）の痕跡量を含有する、０．０１Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３ ５ｍ
ｌへ添加され、そして室温下で２時間放置され、捕捉し
たＣｒを含有するＣＨＳ−ＭＬＶの懸濁液が得られた。 例４−１ コレステロールヘミサクシネート−ＭＬＶ中
へのクロムの内包能 第６．４節において調製されたＣＨＳ−ＭＬＶの内包能
を測定するために、それぞれの調製物のサンプルが蒸溜
水中で３度煮沸された透析バッグ（トーマスサイエンテ
ィフィス［Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、カ
タログ番号第３７８７−Ｄ２２号、１２，０００ドルト
ンの分子量除去）中へピペットにより入れられた。透析
バッグ中のサンプルは、ガンマカウンター（ティーエム
アナリテック［Ｔｍ Ａｎａｌｙｔｉｃ］、モデル番
号第１１９１号）にて最初に計測された。サンプルは次
に、１：１５０よりも大きい保持物：透析物比において
同じ０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．３緩衝溶液に対してそれぞれ２０時間透析
された。透析物は最初の６時間においては２時間毎に満
たされた。内包能は、残存した最初のカウントのパーセ
ンテージを計算することにより決定された。表２に示す
ように、内包能における増加は、ＣＨＳ濃度の増加に比
例するものである。 表 ２ コレステロールヘミサクシネートベシクル中へのクロムの内包能 ＣＨＳの濃度（μmol) 捕捉された⁵¹Ｃｒ（％） １５．０ １４．７９ ４０．０ １５．２０ ６５．８ １５．０９ １００．０ １６．１０ １６５．０ ２０．１３ ２６３．０ ２７．９０ ５２６．４ ４０．７４ ６５８．０ ４８．０３ 例４−２ コレステロールヘミサクシネート中への捕捉
容量：クロム捕捉およびコレステロールヘミサクシネー
ト濃度 例４−１において述べるようにして調製されたＣＨＳベ
シクルの捕捉容量が、次の計算式、 を用いて捕捉容量を計算することによって、それぞれの
コレステロールヘミサクシネートの濃度に関して測定さ
れた。図１に図示された結果は、トリス−塩ＣＨＳの濃
度が増加するに従いより少ないクロム／モル（脂質）が
捕捉された。ゆえに、内包能における増加は、脂質濃度
における増加に比例しているが、捕捉容量は、脂質濃度
の増加に従い減少する。１つの点当りの試みの回数は、
それぞれの点の横のカッコ内に示す。

【００２５】例５ コレステロールヘミサクシネートリ
ポソームの超微細構造 イヌリンが用いられない以外は例１において述べるよう
にしてコレステロールヘミサクシネートのトリス−塩を
用いて調製された、ＣＨＳ−ＭＬＶおよびＣＨＳ−ＳＵ
Ｖのサンプルが、凍結エッチング電子顕微鏡（凍結エッ
チング法に関しては、プフェニンガーら、１９７５年、
ジャーナル オブ セル バイオロジーズ６５：１５〜
２８［Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７５，
Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６５：１５−２８］を参照の
こと。）のために調製された。ＣＨＳ−ＭＬＶ凍結エッ
チング化調製物の電子顕微鏡は、少なくとも１つのラメ
ラによって結合された不連続単位、すなわちリポソーム
ないしは脂質ベシクルを見せるものであった。直径８０
０〜１０，０００ｎｍの範囲にわたる、ＣＨＳ−ＭＬＶ
の大きさのかなりの不均質性があった。より大きなベシ
クルは、１つのあるいは２、３の外核ラメラを有するも
の、および多くのラメラを有するものなどを含むいくつ
かの分類に類別され得るものであった。より大きなベシ
クルの多くは、水性画室を示し得る、木目のような外観
を内部に有する実質的な空間を有していた。多くの例に
おいて、小さなベシクルあるいは小さなベシクルの群
は、より大きなベシクルの内側にはっきりして、幾分か
遊離したもので、時々は４もしくは５層の深さであっ
た。このはっきりした「隠蔽［ｎｅｓｔｉｎｇ］」は負
に帯電したリン脂質を用いて調製された従来のリポソー
ムにおいて普通に観察されるものである。随時的に、密
接に並べられたラメラのゾーンが観察されることができ
た。これらは従来のリン脂質ＭＬＶのラメラとすべての
点において同様のものであった。調べられた音波処理さ
れたサンプルはまた、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の多
くの微小な球状体を含んでいた。これらのベシクルはリ
ン脂質ＭＬＶの音波処理により調製されたＳＵＶに多分
匹敵する。より微小なＣＨＳ−ベシクルは裂くことがで
きないので内部またはこれらの成分ラメラの構造を識別
することは不可能であった。３０ｎｍフィルターを通過
して押出された（１０回）、平均直径約６５ｎｍを有す
るＣＨＳベシクルが観察された。これはフレンチプレス
法により調製された極端に小さい（平均直径約２５ｎｍ
またはそれ以下）ＣＨＳベシクルと対比される。

【００２６】 例６ コレステロールヘミサクシネートのＸ線回折分析 種々のＣＨＳ−ＭＬＶ調製物のＸ線回折が、他のもの
（グルーナー、エス．エム、１９７７年、物理学博士論
文、プリンストンユニバーシティ、プリンストンニュー
ジャージー州 ０９５４０ アメリカ合衆国［Ｇｒｕｎ
ｅｒ，Ｓ．Ｍ．，１９７７，ｐｈＤｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒ
ｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｉｎｃｅ
ｔｏｎ ＮＪ ０９５４０ ＵＳＡ］；レイノルズ、ゼ
オ．ティー．，ミリック、ジェイ．アール．およびグル
ーナー、エス．エム．、１９７８年、リバイズド サイ
エンティフィックインストラクションズ ４９：１２４
１〜１２４９［Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｇｅｏ．Ｔ．Ｍｉｌ
ｃｈ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｇｒｕｎｅｒ，Ｓ．Ｍ．，１９
７８，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒ．４９：１２４１−
１２４９］；テルコック、シー．ピー．ティー．、バリ
ー、エム．ビー．、ファーレン、エス．ビー．、キュー
リス、ピー．アール．およびグルーナー、エス．エ
ム．、１９８４年、バイオケミカリー、２３：２６９６
〜２７０３［Ｔｉｌｃｏｃｋ，Ｃ．Ｐ．Ｔ．，Ｂａｌｌ
ｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｆａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｃｕｌｌｉ
ｓ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄ Ｇｒｕｎｅｒ，Ｓ．Ｍ．，１９８
４，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３：２６９６−２７０３］）に
述べられた２次元画像−増幅Ｘ線検知装置を用いて行な
われた。Ｘ線反復間隔は±０．５Åとして表わされた。
ＣＨＳ分散液は、エポキシの栓により密封された１．５
ｍｍのガラス製Ｘ線キャピラリー中に保たれた。標本は
ゆっくりとまたは活発に水和された。ゆっくりとした水
和に関しては、緩衝溶液は、シリンジを介してＸ線キャ
ピラリーの底部における乾燥ＣＨＳ上へ積み重ねられ
た。このキャピラリーは次に、脂質水ペーストからの空
気泡を消すためにテーブルトップ遠心機中でしばらく遠
心分離された。キャピラリーは、次に密封されそして５
℃で少なくとも４時間平衡化された。活発な水和は、乾
燥ＣＨＳを緩衝溶液および２個のガラス製混合ビーズと
試験管中にて渦動することによって行なわれた。１つの
アリコットが次にＸ線キャピラリーへと移された。Ｘ線
回折は、水和されたＣＨＳがマルチラメラ構造を形成し
ていることを示した。図２ａおよび図２ｂは、それぞれ
６８．９重量％および５９．１重量％のＣＨＳから成る
ゆっくりと水和された標本から得られた低角度回折を示
す。回折の最高４つまでの均等な間隔を保たれた秩序置
換［ｏｒｄｅｒ］は視認でき、それぞれ６８．１Åおよ
び７９．８Å、反復、のマルチラメラ配列で一致してい
た。この秩序置換はシャープでかつよく分析されてお
り、格子がほとんど無秩序置換［ｄｉｓｏｒｄｅｒ］を
含んでいないことを示していた。これらの濃縮されたＣ
ＨＳ標本は、視認出来る過剰な緩衝溶液を有しない均一
なペースト様外観を有し、水性含量の増加に従って反復
間隔が増加する事実と一致する。極めて高い水性濃度に
おいては、ゆっくりと水和されたＣＨＳ標本は、水和さ
れた脂質の頂部上に過剰な緩衝溶液の明らかに視認でき
る溜りを示す。こういうサンプル（全重量の２０．２％
ＣＨＳ）からの回折は図２ｃに示される。より高角度の
回折ピークの広がることは、格子における少なからぬ無
秩序置換を暗示するものである。回折における無秩序置
換は限定的な格子割当を困難とするが、図２ｃにおいて
示されたように、ラメラ適合がなされると、反復は約８
６Åであり、脂質二重層間の広い水性空間を暗示するも
のであった。ゆっくりした水和を用いる代わりに、２
０．７％ＣＨＳ標本が、乾燥脂質を緩衝溶液と旋回的に
混合することによって調製される場合、得られる標本
は、均一な乳白色の外観を有していた。図２ｄに示すよ
うに、低角度回折は、鋭く限定された格子のほとんど形
跡を有しない散乱の広いバンドを示すものであった。同
様の回折特色が、ラメラ間の水性幅が広く変化したマル
チラメラ系から期待できる。希釈ＣＨＳ分散液のＸ線回
折は、ラメラ間力が弱いマルチラメラ系から発生するも
のとして、最も矛盾なく解釈される。例えば希釈卵ホス
ファチジルコン分散液などのような、他の脂質系におい
ては、Ｘ線回折パターンは、重量的にほとんど脂質であ
る鋭く限定されたラメラ格子を示す（ランド、１９８１
年、マニュアル リヴュー オブ バイオフィジックス
アンド バイオエンジニアリング１０：２１７〜３１
４［Ｒａｎｄ，１９８１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０：２１７−３１４］）。こ
の明確な格子反復は、脂質層分離の関数である格子電位
におけるかなり鋭い極小の結果である。電位対距離曲線
が浅いくぼみしか有していない場合には、弱いラメラ間
力および少なからぬ格子無秩序置換を予想するものであ
る。これはＣＨＳベシクルでの場合であるらしい。

【００２７】図２ｄの標本は、図２ａの６８．１Å反復
に比較される、約８６Å反復を有している。このこと
は、過剰の緩衝溶液の存在下において、ＣＨＳリポソー
ムが脂質に対する水の高い割合を有していることを示
す。同様の結果が、他の帯電脂質系において観察できる
（ランド，１９８１年，上記）。

【００２８】例７ コレステロールヘミサクシネート
リポソームの電子スピン共鳴分析 卵ホスファチジルコリン（アバンティ ポーラ リピッ
ズ［Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓｐ］、バ
ーミンガム、アラバマ州）から調製されたマルチラメラ
ベシクルはスピン標識化され、そして本質的には前記し
たようにして調製された、同様にスピン標識化されたト
リス−塩ＣＨＳ−ＭＬＶと比較された。ＥＰＣ−ＭＬＶ
の場合には、５、７、９、１０、１２または１６ドキシ
ルステアレート（モレキュラープローブス［Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］、ジャンクション シティ
オレゴン州）の１モルパーセントが、クロロホルム中の
脂質４０ｍｇに添加され、そして得られた溶液は回転蒸
発によって薄いフィルムとなるまで乾燥された。次にト
リス−ＨＣｌ緩衝溶液２ｍｌが、このフィルムが完全に
懸濁されるまで渦動することによりフィルムを水和する
ために用いられた。得られたＥＰＣ−ＭＬＶは分光学の
前に２度洗浄された。ＣＨＳ−ＭＬＶの場合には、エタ
ノール中の適当なスピン標識が、試験管側面に薄いフィ
ルムを形成するまで乾燥され、そしてここにトリス−塩
ＣＨＳ粉末４０ｍｇおよびトリス−ＨＣｌ緩衝溶液２ｍ
ｌが添加された。この懸濁液は渦動され、そして得られ
たリポソームは２度洗浄された。すべての電子スピン共
鳴実験は、アイビーエムインストルメンツ ＥＲ１００
Ｄ ＥＳＲ スペクトロメーター［ＩＢＭ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ ＥＲ１００Ｄ ＥＳＲ ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍｔｅｒ］を用いて行なわれた。秩序パラメーター［ｏ
ｒｄｅｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒ］（Ｓ）は、他のもの
（グリッフィスとジスト、スピン ラベリング、ベルリ
ナー、エル．ジェイ（編）、アカデミック プレス、ニ
ューヨーク、１９７６年中［Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ａｎｄ
Ｊｕｓｔ ｉｎ、Ｓｐｉｎ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ、Ｂ
ｅｒｌｉｎｅｒ、Ｌ．Ｊ（ｅｄ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．１９７６）に述べられるように
して算定された。図３は、５、６、７、９、１０、１２
または１６ドキルステアレートでこれらの調製物をスピ
ン標識化することによって限定されるＣＨＳ−ＭＬＶお
よびＥＰＣ−ＭＬＶの秩序パラメーター特性を示す。Ｅ
ＰＣ二重層に関しては、すでに報告されているように、
二重層中への炭素数の増加に伴い、秩序パラメーターが
減少する。ＣＨＳ二重層の超分子構造は、顕著に異なる
ものである。すなわち、ＥＰＣ二重層よりもＣＨＳ二重
層が劇的により剛直であるのみならず、ＣＨＳ系は５０
番から９０番の炭素の位においてある増加を活発に示
し、以前に報告されているものとは全く異なる物理的お
よび化学的二重層構造を示すものである。

【００２９】例８ コレステロールヘミサクシネートリ
ポソームの等張膨脹 以下の一連の実験において、コレステロールヘミサクシ
ネートおよびリン脂質のマルチラメラベシクルの等張膨
脹挙動が比較された。 （１） ＣＨＳ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、０．１Ｍ ＫＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌ中のトリス−
塩ＣＨＳ４０ｍｇを用いて例１において述べたようにし
て調製された。 （２） ＥＰＣ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、０．１Ｍ ＫＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌ中のＥＰＣ５
１．８ｍｇを用いて例２−１において述べたようにして
調製された。 （３） ＥＰＣおよび卵ホスファチジン酸（ＥＰＡ）か
ら構成される脂質二重層を有するマルチラメラベシクル
が、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１Ｍ ＫＣｌ緩衝
溶液２２．０ｍｌ中のＥＰＣ４１．１ｍｇおよびＥＰＡ
９．７９ｍｇを用いて、ＥＰＣ−ＭＬＶ調製に関して例
２−１において述べられた方法を用いて調製された。得
られたＭＬＶ（ＥＰＣ：ＥＰＡ−ＭＬＶ）は、それぞれ
が８：２のモル比のＥＰＣ：ＥＰＡで構成されていた。 旋回混合の後、ＭＬＶのそれぞれの懸濁液（すなわち、
ＣＨＳ−ＭＬＶ，ＥＰＣ−ＭＬＶおよびＥＰＣ：ＥＰＡ
−ＭＬＶ）が調製に用いられた緩衝溶液中で２時間室温
下に放置された。それぞれのリポソーム調製物の２０μ
ｌアリコットが、次に、０．０５５Ｍから０．５Ｍまで
の範囲の濃度のＫＣｌを含む０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ
緩衝溶液の連続群１．０ｍｌへ添加された。１．５時間
の平衡化の後、５５０ｎｍの波長でのサンプルの吸光度
を計測することにより光散乱が測定された。結果はベシ
クルがさらされる媒体のＫＣｌ濃度の逆数に対して吸光
度がプロットされるものである図４に図示される。増加
した吸光度は、脂質ベシクルの膨脹を示す。曲線Ｂおよ
びＤは、予期したように、リン脂質ＭＬＶ（すなわちＥ
ＰＣ−ＭＬＶおよびＥＰＣ：ＥＰＡ−ＭＬＶ）が理想浸
透圧計であるようにふるまったことを示す。しかしなが
ら曲線Ｃは、ＣＨＳ−ＭＬＶが閉鎖したベシクル構造と
してふるまうが、これらは、低張および高張媒体におい
ては非理想的挙動を示すことを示唆している。図４に示
した、この挙動はブロッカホフとラムサミー（１９８２
年、バイオヒミカ エト バイオフィジカ アクタ ６
９１：２２７〜２３２［１９８２，Ｂｉｏｃｈｉ．Ｂｉ
ｏｐｈｉｓ．Ａｃｔａ．６９１：２２７〜２３２］）の
コレステロールリポソームにおいて観察されるものとは
全く異なるものである。

【００３０】例９ 難溶性化合物を捕捉するコレステロ
ールヘミサクシネートリポソーム 水にわずかに溶解する化合物のＣＨＳ−リポソーム中へ
の捕捉が、ウシ成長ホルモン、インスリンおよびチロシ
ン（ｔｙｌｏｓｙｎ）に関して実証された。 例９−１ コレステロールヘミサクシネート−ＳＵＶ中
に捕捉されたウシ成長ホルモン 約１９１のアミノ酸の単鎖から成る単純タンパクであ
る、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）は、部分水溶性であ
る。通常溶解度は、ｐＨ８．０で１〜１．５ｍｇ／ｍｌ
である。ＢＧＨは、クロロホルムのような有機溶媒中に
沈澱する。

【００３１】ＣＨＳ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）、０．１４ＭＮａＣｌ緩衝溶液１．
０ｍｌ中のトリス−塩ＣＨＳ２７ｍｇを用いて第６．２
節において述べるようにして調製された。ＣＨＳ−ＭＬ
Ｖ調製物は、音波処理化ＣＨＳ−ＭＬＶを形成するため
に、透明となるまで音波処理され、そして次にＢＧＨ
（エリ リリー アンド カンパニー［Ｅｌｉ Ｌｉｌ
ｌｙ ＆ Ｃｏ．］、インディアナポリス、インディア
ナ州）５，１０，１５，２５，３０または１６６ｍｇの
いずれかが、音波処理化ＣＨＳ−ＭＬＶ懸濁液の別々の
アリコットへ加えられた。懸濁液は、延長的に旋回混合
され、ＣＨＳ−ＳＵＶ二重層中へのタンパクの分配を起
こした。音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶ懸濁液は、１日、２
日および２１日に沈澱物の存在に関して目視的に観察さ
れた。沈澱物は観察されず、室温下で２１日間試験され
たすべての濃度でウシ成長ホルモンはＣＨＳリポソーム
中に捕捉されたままであったことを示した。 例９−２ コレステロールヘミサクシネート−ＳＵＶ中
に捕捉されたインスリン 亜鉛−インスリン（ポリペプチドホルモンの１つであ
る。）は、希釈酸またはアルカリに容易に溶解するが、
ｐＨ４．５〜７．０の水性相に実質的に不溶である。実
際、マクロ集塊を形成するインスリン溶液の傾向は、長
期間インスリン供給系の発達において障害であった。Ｃ
ＨＳ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、０．１４ＭＮａＣｌ緩衝溶液１．０ｍｌ中のトリ
ス−塩ＣＨＳ２７ｍｇを用いて、第６．２節に述べるよ
うにして調製された。ＣＨＳ−ＭＬＶ調製物は、音波処
理化ＣＨＳ−ＳＵＶを形成するために透明となるまで音
波処理され、そして亜鉛−インスリン粉末（ウシ膵臓イ
ンスリン、シグマケミカルカンパニー、セントルイス、
ミズーリー州［Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］）が４７ｍｇに至るまで、Ｃ
ＨＳ−ＳＵＶ懸濁液へ添加された。懸濁液は、延長的に
旋回混合され、インスリンのＣＨＳ−ＳＵＶ中への分配
を起こした。音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶは、１日、２日
および２１日に沈澱物の存在に関して目視的に観察され
た。沈澱物は観察されず、室温下で少なくとも２１日
間、５ｍｇ／ｍｌの濃度でインスリンは捕捉されたまま
であったことを示した。

【００３２】例９−３ コレステロールヘミサクシネー
ト−ＳＵＶ中に捕捉されたチロシン チロシンは、水に２５℃で５ｍｇ／ｍｌ溶解してそして
低級アルコール類、エステル類およびケトン類、塩素化
炭化水素類ならびにエーテルにもまた可溶である抗生物
質である。スモールユニラメラベシクルは以下のように
調製された。チロシン−塩基（エリ リリー アンドカ
ンパニー，インディアナポリス、インディアナ州）１０
０ｍｇおよびトリス−塩ＣＨＳ２００ｍｇが、リン酸緩
衝化食塩水（ｐＨ７．４）４ｍｌ中にて旋回混合され
た。得られたＣＨＳ−ＭＬＶの乳白色懸濁液は、プロー
ブチップ音波処理器［ｐｒｏｂｅ ｔｉｐ ｓｏｎｉｃ
ａｔｏｒ］を用いて１５分間音波処理された（予防処置
として、氷浴が、混合物の温度を低下させつづけるよう
に試験管のまわりに配置された。）。混合物は、次に１
時間４５分の間、浴型音波処理器中へ移された。２時間
の音波処理期間の後、チロシンを捕捉したＣＨＳ−ＳＵ
Ｖが、１０，０００×ｇで１０分間の懸濁液の遠心分離
によって、小さなペレットと乳白光を発する上澄みを形
成することによって懸濁液から分離された。上澄み中の
音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶはチロシン−塩基（エリ リ
リー アンド カンパニー，インディアナポリス，イン
ディアナ州）１００ｍｇを水の同容量に添加した懸濁液
と目視的に比較された。チロシン−塩基の懸濁液におい
ては沈澱物が形成されたが、ＣＨＳ−ＳＵＶチロシン調
製物においては沈澱物は形成されなかった。これゆえチ
ロシンは少なくとも４８時間捕捉されたままであった。

【００３３】例１０ 脂質溶性化合物の捕捉へのコレス
テロールヘミサクシネートの使用 脂質に対して可溶である生物学的活性物質の捕捉が、イ
ンドメタシンおよびジアゼパムに関して実証された。 例１０−１ コレステロールヘミサクシネート−ＭＬＶ
中に捕捉されたインドメタシン プロスタグランジン阻止剤の１つである、インドメタシ
ンの遊離酸は、エタノール、エーテル、アセトンおよび
ひまし油に可溶である。生物学的活性剤としてインドメ
タシンの変化する量を取込むＣＨＳ−ＭＬＶは、以下の
ようにして調製された。丸底フラスコ中に、トリス−塩
ＣＨＳ２７ｍｇ、インドメタシン１〜５ｍｇおよび¹⁴Ｃ
−インドメタシン（２２．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ，ニュー
イングランド ヌクレア，ボストン，マサチューセッツ
州）１０μｌが混ぜ合せられた。すべての成分を溶解す
るのに十分な量のメタノールが添加された。混合物は次
に、容器上に薄いフィルムを形成させるために回転蒸発
され、そしてすべてのメタノールの除去を保証するため
に一晩真空乾燥された。次にＣＨＳ−ＭＬＶが、それぞ
れのフラスコに０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液１．０ｍｌを添加
することにより形成された。懸濁液は、ガラス製ビーズ
を用いて旋回混合され、そして２時間静置された。２時
間の後、ＣＨＳＳ−ＭＬＶ中に捕捉されたインドメタシ
ンの相対量が次のようにして測定された。０．０１Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４ＭＮａＣｌ緩衝
溶液９．０ｍｌがそれぞれのサンプルへ添加され、そし
て混合物は、１０，０００×ｇで１０〜２０分間遠心分
離された。得られたペレットは、０．０１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液１
０ｍｌ中で３度洗浄され、そして最終容量１．０ｍｌの
０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ緩衝溶媒中へ懸濁された。「標準」は、最初
の混合物中に放射線標識化インドメタシンのみを添加す
る（すなわち、インドメタシン１〜５ｍｇは、ＣＨＳ−
ＭＬＶ標準調製から除外された。）以外はサンプルと同
様の方法で調製された。それぞれのサンプルからの濾過
された２０μｌアリコット中に含まれる放射能がシンチ
レーション流体１０ｍｌ中でカウントされた。「標準」
のインドメタシンの種々の濃度を含むサンプルとの比較
は、捕捉されたインドメタシンのパーセンテージの決定
をなさせるものであった。結果は表３に表わされる。 表 ３ ＣＨＳ−ＭＬＶ中へのインドメタシンの捕捉 インドメタシン濃度 ＣＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉された （ｍｇ／ｍｌ） ¹⁴Ｃ−インドメタシン（％） １ ７８ ２ ７０ ３ ３７ ４ ２８ ５ ３４ 結果は、最高７８％までのインドメタシンがＣＨＳ−Ｍ
ＬＶ中に捕捉され得ることを示している。

【００３４】例１０−１−２ インドメタシンを含有す
るコレステロールヘミサクシネートベシクルの微細構造 捕捉されたインドメタシンが膜ベシクルを変化させるも
のであるか否かを調べるために、インドメタシンの存在
下調製されたＣＨＳ−ＭＬＶ（８−１−１参照のこ
と。）が前述したようにして凍結エッチング電子顕微鏡
に関して調査分析された。凍結エッチング電子顕微鏡に
おいて、低拡大条件下、「空の［ｅｍｐｔｙ］」ＣＨＳ
−ＭＬＶは、含有されたインドメタシンを有するＣＨＳ
−ＭＬＶと区別がつかなかった。すなわち、このもの
が、このものあるいは他のものに対して独特であるとし
て識別できる明らかな特色がなかった。しかしながら、
高拡大条件下では、インドメタシンを含有するＣＨＳ−
ＭＬＶの「二重層」は検知できる。インドメタシンは水
不溶性薬剤でありかつエタノール、エーテル、アセト
ン、および他の非極性溶媒に可溶であるので、脂質の存
在において、インドメタシンは水から隔離されるように
配置されるであろう。電子顕微鏡によって観察された二
重層の調査は、二重層の厚さは、交差破砕において変わ
ることを示していた。これは、インドメタシンが、実際
に二重層の脂質部位に分配され、これによって付加的な
厚みと非常に不均一な配列を与えるらしいことを提唱す
るものであった。すなわち、厚さは、１つの二重層が破
砕ラインに沿って追跡された際に変化した。この結果
は、薬剤が二重層の脂質部位に隔離されるような溶解性
を有するそれらの薬剤におそらく固有のものである。

【００３５】例１０−２ コレステロールヘミサクシネ
ート−ＳＵＶ中に捕捉されたジアゼパム 鎮静剤またはトランキライザーの１つであるジアゼパム
（すなわち、ヴァリアム［Ｖａｌｉｕｍ］）は、クロロ
ホルム、ベンゼン、アセトンおよびアルコールに可溶で
あるが、水にはほんのわずか溶解するにすぎない。ジア
ゼパムを取込むＣＨＳ−ＳＵＶは、次のようにして調製
された。ジアゼパム２，３，４または５ｍｇが ³Ｈ−ジ
アゼパム（７５．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ニューイングラン
ドヌクレア，ボストン，マサチューセッシ州）５μｌを
含んでいる試験管へ添加された。該薬剤を溶解するのに
十分な量のメタノール（最大２ｍｌのメタノール）がそ
れぞれの試験管に加えられた。混合物は次に薄いフィル
ムになるまで回転蒸発され、そしてすべてのメタノール
の除去を保証するために一晩真空下で乾燥された。乾燥
フィルムは音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶ（ＣＨＳ５０，１
００、または２００ｍｇ／ｍｌを用いて以下に述べるよ
うにして調製された。）の懸濁液１ｍｌ中に再懸濁液さ
れ、ガラス製ビーズを用いて旋回混合し、そして０．２
２μｍミリポア［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］フィルター（ミ
リポアコーポレーション［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒ
ｐ．］，ニューヨーク，ニューヨーク州）を用いて濾過
された。ＣＨＳ−ＳＵＶは以下の処方に基づき調製され
た。トリス−塩ＣＨＳ５０，１００または２００ｍｇが
０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ緩衝溶液１．０ｍｌと旋回混合された。プロー
ブ音波処理器を用いて、混合物は、５５０ｎｍの波長で
計測した約０．４０の光学密度（すなわち「透明な」溶
液）となるまで音波処理され、そして次に音波処理器の
プローブの先端からとれたかもしれないチタンを除去す
るために１，０００×ｇで遠心分離された。ＣＨＳ−Ｓ
ＵＶの懸濁液は次に試験管からデカンテーションされ
た。音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶによって捕捉され得たジ
アゼパムの相対量は、サンプルの「標準」調製物との比
較によって測定された。「標準」調製物は、放射線標準
化ジアゼパムのみを添加する（すなわち、ジアゼパム２
〜５ｍｇはＣＨＳ−ＳＵＶ標準調製からは除外され
た。）以外はサンプルと同様の方法において調製され
た。いずれの場合においても、濾過された懸濁液の１０
μｌアリコット中に含まれる放射能はシンチレーション
流体１０ｍｌ中でカウントされた。結果は表４に示され
る。

【００３６】 表 ４ 音波処理化ＣＨＳ−ベシクル中へのジアゼパムの捕捉 ジアゼパム濃度 捕捉された ³Ｈ−ジアゼパム（％） （ｍｇ／ｍｌ） ＣＨＳ濃度（ｍｇ／ｍｌ） ５０ １００ ２００ ２ ８６ １００ １００ ３ ７９ ９５ ８９ ４ ５８ １００ １００ ５ ５３ １００ １００ 結果は、ＣＨＳ１００ｍｇ／ｍｌおよび２００ｍｇ／ｍ
ｌは、用いられたジアゼパムの最高濃度である１００％
を捕捉することを示すものである。ＣＨＳ１００ｍｇ／
ｍｌおよび２００ｍｇ／ｍｌは共に十分にジアゼパムを
捕捉するゆえ、１００ｍｇ／ｍｌがジアゼパムの捕捉に
関するＣＨＳのより理想的な濃度である。

【００３７】例１１ 血清中のアミノグリコシド濃度を
測定するためのコレステロールヘミサクシネートリポソ
ームの使用 かなりの低濃度のＣＨＳ−ベシクル（１μｇ／ｍｇＣＨ
Ｓ未満）がリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中の懸濁液か
ら赤血球細胞（ＲＢＣ）を強く凝集したものが観察され
た。ＣＨＳ−ベシクルはＣａ++および他のカチオン、例
えばアミノグリコシド抗生物質類などにより沈澱される
ので、ＣＨＳ−ベシクルは、（ａ）ＣＨＳ−ベシクルの
固定量が沈澱される抗生物質を含む血清の希釈度を測定
し、そして（ｂ）抗生物質含有血清への添加の後に沈澱
されていない残存する遊離ベシクルの濃度を赤血球凝集
滴定により測定する、ことで血清中のアミノグリコシド
抗生物質の濃度を測定することに用いられ得る。いずれ
の立場においても、抗生物質の正確な量は抗生物質の既
知濃度から導き出された標準曲線での比較を行なうこと
により得られうる。基礎実験は以下に述べられる。すな
わち、ＰＢＳ中の硫酸ゲンタマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）
２４μｌが血清中に連続的に希釈された（すなわち、血
清の２５μｌアリコット）。次に０．０１Ｍ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液
中で２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ７．４でトリス−塩
ＣＨＳを音波処理することによって調製されたＣＨＳ−
ユニラメラベシクルの２４μｌアリコットがそれぞれの
サンプルに添加された。室温で１０分間経過の後、それ
ぞれの混合物の混濁度が記録された。５０μｇあるいは
それ以上のゲンタマイシンを含む混合物のみが、視認で
きる沈澱を示し、ＣＨＳベシクルがゲンタマイシンと相
互作用したことを示した。次に沈澱した物質は、ペレッ
ト化されそして上澄み液は、ニワトリ赤血球細胞を用い
ての赤血球凝集によるＣＨＳ−ＳＵＶの濃度を測定する
ために用いられた。赤血球凝集検定は、９６Ｕ型ミクロ
ウェルプレート［９６Ｕ−ｓｈａｐｅｄｍｉｃｒｏｗｅ
ｌｌ ｐｌａｔｅ］中でＰＢＳ５０μｌにベシクル懸濁
液を連続的に希釈し、そして次にＰＢＳ中の０．５％Ｒ
ＢＣ４０μｌをそれぞれのくぼみに加えることにより行
なわれた。４℃で６０分間経過の後、赤血球凝集は反転
鏡を用いて観察された。比較対象（ＣＨＳベシクルの存
在しないＲＢＣ）は全く赤血球凝集を示さなかった。予
備実験において濁りを起こしたものを除いた、ＣＨＳを
含むすべてのサンプルはＲＢＣを強く赤血球凝集した。
この結果は、ＣＨＳのみを含む比較対照の懸濁液と比較
して、かなり少量のベシクルが赤血球凝集に有効である
ために、ＣＨＳベシクルがゲンタマイシンと相互作用し
たことを示すものであった。

【００３８】例１２ コレステロールヘミサクシネート
リポソームの生体内投与 以下の分節は、本発明のコレステロールヘミサクシネー
トリポソームを用いての生物学的活性物質の生体内投与
に関する方法および組成物を述べるものである。捕捉さ
れた生物学的活性物質の医学的効果が測定され、そして
選択された臓器での薬剤分布が適当なもので追跡され
た。 例１２−１ コレステロールヘミサクシネートリポソー
ム中に捕捉されたインドメタシンを用いての関節炎の治
療 雄の白色ニュージランドウサギ（２〜２．５ｋｇ）が、
フロイント完全アジュバンド中で乳化された２０ｍｇ／
ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（マイルズラボラト
リーズ［Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］，エ
ルクハート，インディアナ州）１ｍｌを用いて２週間間
隔で２回皮内に免疫された。第３週目に、ウサギは関節
炎を起こさせるために右膝関節中へ食塩水１．０ｍｌ中
ＢＳＡ１０ｍｌの単回関節内注射を受けた。左膝関節は
比較対照として取扱われた。関節の直径は、０．０１ｍ
ｍ精度のフォウラー［ｆｏｗｌｅｒ］ダイアル式カリパ
スを用いて計測された。ＢＳＡを注入された関節は膨脹
し、そして代表的には比較対照関節よりも３〜４ｍｍ大
きく計測された。第４週目において、ウサギは、関節炎
を起こさせるために、食塩水中のＢＳＡの別の関節内注
射を受けた。ＣＨＳ２７０．０ｍｇおよびインドメタシ
ン１０ｍｇを用いて第８．１節において述べられたよう
にして、ＣＨＳ−ＭＬＶが調製され、インドメタシンの
最終濃度１．０ｍｇ／ｍｌを得た。炎症誘導の３日間
後、ＢＳＡを注入された動物はＣＨＳ−ベシクル中に捕
捉されたインドメタシン１ｍｇ／ｍｌの単回関節内注射
を受けた（全投与量１ｍｇ／動物）。関節膨脹は他の１
０日間計測された。図５にグラフ的に図示された結果
は、ＣＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉されたインドメタシンは関
節内投与された際に関節膨脹を減少させることに有効で
あることを示す。 例１２−２ コレステロールヘミサクシネートＳＵＶ中
に捕捉されたジアゼパムの生体内投与 マウスは、例１０−２において述べたようにして調製さ
れたＣＨＳ−ＳＵＶ中に捕捉されたジアゼパムの５００
μｇ／ｋｇ（体重）を静脈内にあるいは筋内に接種され
た。該ジアゼパムは、捕捉された薬剤の活性の保持を示
すものであるマウスにおける鎮静効果（マウスは接種後
に睡眠におちいる。）を有していた。 例１２−２−１ 静脈内接種後の臓器分布 捕捉されたジアゼパムを含有するＣＨＳ−ＳＵＶは、第
８．２節において述べられるようにして調製された。浴
型音波処理器における音波処理の後、５５０ｎｍの波長
で計測された懸濁液の吸光度は０．３７０であった。次
にＣＨＳ−ＳＵＶ懸濁液の４４．２μｌアリコットが、
¹⁴Ｃ−ジアゼパム（比活性は、エタノール中の１００μ
Ｃｉ／ｍｌとして供給された１８１μＣｉ／ｍｇに等し
い。）の４０μＣｉが窒素条件下乾燥されたものである
ガラス製試験管中へ添加された。５分間の旋回混合の
後、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１
４ＭＮａＣｌ緩衝溶液１．２８２ｍｌが該溶液中へ添加
され、ジアゼパム０．１６７ｍｇ／μｌのマウスに対す
る治療学的投与量を生じる、懸濁液の３０倍希釈物を得
た。ＣＨＳ−ＳＵＶ−¹⁴Ｃ−ジアゼパム懸濁液の０．１
ｍｌアリコットが意識のある拘束された３５ｍｇスイス
ウェブスター［Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ］マウスの
尾静脈中へ注射された。比較対照マウスは、等価投与量
の捕捉されていない¹⁴Ｃ−ジアゼパムを同様に接種され
た。注入後１，２または５時間目に、マウスは脊髄脱臼
により犠牲とされそして内臓（腎臓、肺、脾臓、肝臓、
腸、脳、心臓、脾臓および脂肪）および血液サンプルが
除去された。臓器は計量されそしてそれぞれの小さなサ
ンプル（２０〜４０μｇ）がマイムとコーベルグ［Ｍａ
ｈｉｍａｎｄ Ｋｏｈｂｅｒｇ］の方法（１９６６年，
アナリティカル バイオケミカリー１６：５００［１９
６６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６：
５００］）によって消化されそして脱色された。サンプ
ルは次に、化学ルミネッセンスが放射能計測前に静まる
ことをなさせるために、５日間暗順応された。

【００３９】この実験の結果は図６に示される。ＣＨＳ
−ＳＵＶに捕捉されたジアゼパムを接種されたマウスに
おいては、薬剤は、脾臓中には蓄積しておらず、ＣＨＳ
−ＳＵＶ中に捕捉されたジアゼパムは、リン脂質リソー
ムに捕捉された薬剤が静脈内的に生体内投与された際と
同様の挙動をしないことを示している。

【００４０】例１２−３ コレステロールヘミサクシネ
ート−ＭＬＶ中に捕捉されたクロムの生体内投与 ＣＨＳベシクルが、生体内投与された際に、そのまま残
存するか否かを測定するために、遊離水性標識の臓器分
布が、ＣＨＳベシクル中に捕捉された水性標識の臓器分
布と比較して、マウスへの静脈内注射の後に測定され
た。このために、捕捉されていない⁵¹クロム（⁵¹Ｃ
ｒ）、ＣＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉された⁵¹Ｃｒおよびリン
脂質ベシクル中に捕捉されたＣｒ⁵¹の臓器分配が比較さ
れた。追随する処方は次の通りである。（ａ）捕捉されていない⁵¹Ｃｒ ⁵¹Ｃｒは０．９％殺菌
食塩水中の⁵¹ＣｒＯ₂~（ニューイングランドヌクレア，
ニュートン，マサチューセッツ州）として供給される。
⁵¹Ｃｒ注射剤は、０．９％食塩水中の⁵¹Ｃｒ １００μ
ｌを０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、０．１４
ＮａＣｌ、５％デキストロースを用いて最終容量１．５
ｍｌへ希釈することで調製された。雄の４０ｇスイスウ
ェブスターマウス１６匹がそれぞれ尾静脈を介して０．
１ｍｌ（約７００，０００ｃｐｍ）の静脈内注射を受け
た。（ｂ）ＣＨＳ−ＭＬＶ中の⁵¹Ｃｒ は、極微量の⁵¹Ｃｒ
（殺菌０．９％食塩水中の⁵¹ＣｒＯ₂~ ）を含有する
０．０１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．３、０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５％デキストロース中に、乾燥トリス−塩ＣＨ
Ｓ粉末を溶解することによって調製された。混合物は旋
回混合され、そしてすぐ後に３０分間音波処理された。
前記したように遠心分離によるペレット化および３度洗
浄した後に、最終的ペレットはＣＨＳ１０ｍｇ／ｍｌの
最終濃度に再懸濁され、そしてニコップ準弾性光散乱分
析［Ｎｉｃｏｐ ｑｕｅｓｉｅｌａｓｔｉｃ ｌｉｇｈ
ｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ］によっ
て直径１ミクロンで計られた。雄の４０ｇスイスウェブ
スターマウス１２匹がそれぞれ尾静脈を介して０．１ｍ
ｌ（約１２０，０００ｃｐｍ）の静脈内注射を受けた。 （ｃ）ＥＰＣ−ＳＰＬＶ中の⁵¹Ｃｒは、参考のため本明
細書で引用している、「安定なプルリラメラベシクル、
その調製および使用」と題されたレンクら［Ｌｅｎｋ
ｅｔ ａｌ．］によって１９８３年３月２４日に出願さ
れた同時係属米国出願番号第４７６，４９６号中に詳述
に述べられる一般的方法によって調製された。このため
に、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）６５ｍｇをクロ
ロホルム中に溶解しそしてフィルムを形成するようにＥ
ＰＣを乾燥させることによって、バッチ５ｍｌが調製さ
れた。フィルムは、エーテル１０ｍｌ中に再懸濁され、
そして、０．９％食塩水（ｐＨ８）中の⁵¹ＣｒＯ₂~
０．３ｍｌが加えられた。混合物は、次に音波処理によ
り乳化され、一方同時にＮ₂ガス条件下でエーテルを蒸
発した。得られた安定なプルリラメラベシクル（ＳＰＬ
Ｖ）は０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、０．１
４Ｍ ＮａＣｌ、５％デキストロース５ｍｌ中に再懸濁
され、そして遠心分離によりペレット化された。ペレッ
トは捕捉されていない⁵¹Ｃｒを除去するために３度洗浄
され、そして最終的ペレットは０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．３、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、５％デキスト
ロース５ｍｌ中に再懸濁された。ＥＰＣの最終濃度は１
３ｍｇ／ｍｌであった。雄の４０ｇスイスウエブスター
マウス１２匹は、それぞれ尾静脈を介して０．１ｍｌ
（約１００，０００ｃｐｍ）の静脈内注射を受けた。
１，２，５および２４時間後に、リポソーム調製物で処
理されたそれぞれのグループから３匹のマウスおよび捕
捉されていない⁵¹Ｃｒで処理されたグループから４匹の
マウスが脊髄脱臼により犠牲とされた。臓器が除去さ
れ、０．９％食塩水ですすがれ、計量されそして試験さ
れたそれぞれの臓器中に残存する投与量のパーセンテー
ジおよび投与量／グラムのパーセンテージを測定するた
めに前記したようにしてカウントされた。図７に示す結
果は、捕捉されていないクロム（図７Ｃ参照）は迅速に
排泄され、試験されたいずれの臓器中にも集中していな
いことを実証する。ＥＰＣおよびＣＨＳに捕捉されたク
ロムは、注射の２４時間後に計測しうる値をとどめてお
り、ＣＨＳベシクルが、ＥＰＣ−ＳＰＬＶと同様に、生
体内にそのままとどまることを示していた。さらに、
０．５〜１．０ミクロン間の平均直径を有するＥＰＣ−
ＳＰＬＶ（１３ｍｇ／ｍｌ）は、肝臓、肺および脾臓中
に蓄積され（図７Ｂ参照）、すなわちリポソーム分布の
代表的パターンを示す。等モルのＣＨＳベシクルは主に
肝臓中に蓄積され、そして肺および脾臓にはかなりより
少ない程度であった（図７Ａ参照）。２種のリポソーム
調製物の生体内の分布パターンによる違いが示される。

【００４１】例１２−４ コレステロールヘミサクシネ
ートＭＬＶ中に捕捉されたヒト成長ホルモンの生体内投
与 ¹²⁵ Ｉ−ヒト成長ホルモン（ＨＧＨニューイングラン
ド、ヌクレア、ボストン，マサチューセッツ州）を取込
んだＣＨＳ−マルチラメラベシクルは以下のようにして
調製された。トリス−塩ＣＨＳが、 ¹²⁵Ｉ−ＨＧＨ（ニ
ューイングランドヌクレア、ボストン、マサチューセッ
ツ州）１μＣｉ／ｍｌを含有する０．０１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中
へ、トリス−塩ＣＨＳ最終濃度２５ｍｇ／ｍｌを得るよ
うに添加された。この懸濁液はガラス製ビーズを用いて
旋回混合された。得られたＣＨＳ−ＭＬＶは、最初の放
射能カウント数と比較することにより測定して¹²⁵Ｉ−
ＨＧＨの１０％を捕捉していた。雌のスイスウェブスタ
ーマウス１２匹のグループは、ＣＨＳ−ＭＬＶに捕捉さ
れた¹²⁵Ｉ−ＨＧＨの懸濁液０．５ｍｌを後肢に筋内的
に注射された。マウス１２匹の比較対象グループは、
０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝
溶液中の遊離¹²⁵Ｉ−ＨＧＨ ０．５ｍｌを注射され
た。双方のグループのそれぞれの動物は、約３５，００
０ｃｐｍ／動物を受けた。注射後の週期的間隔で、マウ
スは犠牲とされ、後肢が解剖され、そして残存する全放
射能のパーセンテージが測定された。表５のデータは、
ＣＨＳ−ＭＬＶ中へ取込まれた場合、¹²⁵Ｉ−ＨＧＨの
保持が実質的に増加することを実証する。これゆえ、筋
内的に注射される場合、ＣＨＳ−リポソームに捕捉され
た薬剤は、持続様式で解放される。 表 ５ 投与されたＭＬＶに捕捉された¹²⁵Ｉ−ヒト成長ホルモンの持続 接 種 物 肢中に残存する放射能（％） （数：１２匹） 時間（時間） ３ ２４ ７２ １６８ 比較対照 a ¹²⁵ I −ＨＧＨ ５ 0.７ 0.２ 0.３ ＣＨＳ−ベシクル中の ¹²⁵Ｉ−ＨＧＨ b ５６ ３７ ２９ ２２ ａ．動物は、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ中の¹²⁵Ｉ−ヒト成長ホルモン０．５ｍｌを受
けた。 ｂ．動物は、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ中のＣＨＳ−ベシクル（２５ｍｇ／ｍｌ ＣＨ
Ｓ）中の¹²⁵Ｉ−ヒト成長ホルモン０．５ｍｌを受け
た。

【００４２】

【発明の効果】ステロールの本発明の特定の有機酸の塩
形態からなるステロールリポソームの調製方法により水
不溶性化合物をステロールベシクル中へ効率よく捕捉す
ることができ、水不溶性活性物質の高い服用量での投与
を容易にすることができる。

【００４３】

【図面の簡単な説明】

【図１】捕捉された溶質（クロム）とマルチラメラリポ
ソームを調製するのに用いられたコレステロールヘミサ
クシネートの濃度との逆比例関係をグラフで示したもの
である。

【図２】４つの異なるＣＨＳ−ＭＬＶ（コレステロール
ヘミサクシネート−マルチラメラベシクル）調製物に関
して得られたＸ線回折パターンを表わすものである。

【図３】ＣＨＳ−マルチラメラベシクルおよびＥＰＣ−
マルチラメラベシクル（卵ホスファチジルコリン−マル
チラメラベシクル）に関する電子スピン共鳴データを表
わすものである。

【図４】種々の緊張力の水性緩衝溶液中でのコレステロ
ールヘミサクシネートリポソームおよび卵ホスファジル
コリンリポソームの膨潤特性を示すものである。

【図５】筋内的に投与された際の、コレステロールヘミ
サクシネートリポソーム中に捕捉されたインドメタシン
の関節膨脹を減少させる効果をグラフで示すものであ
る。

【図６】マウスに静脈内的にＣＨＳ−ＳＵＶに内包され
ないで（遊離）あるいは内包されて投与された¹⁴Ｃ−ジ
アゼパムの臓器分布を示すものである。

【図７Ａ】マウスに静脈内的に投与された⁵¹Ｃｒの臓器
分布を示す図であり、その投与形態がＣＨＳ−ＭＬＶに
内包されたものである。

【図７Ｂ】マウスに静脈内的に投与された⁵¹Ｃｒの臓器
分布を示す図であり、その投与形態がＥＰＣ−ＳＰＬＶ
に内包されたものである。

【図７Ｃ】マウスに静脈内的に投与された⁵¹Ｃｒの臓器
分布を示す図であり、その投与形態がＥＰＣ−ＳＰＬＶ
に内包されないで投与されたものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャノフ、アンドリュー エス アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19067 ヤードレイ サウス クレセント ブルバード 1807 (72)発明者 ポペスク、マーシー シー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08536 プレインスボーロ パークウェイ アベニュー ５ (72)発明者 ウェイナー、アラン エル アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08536 プレインスボーロ フォックス ラン ドライブ 39−06 (72)発明者 ボルクサク、ルイズ イー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08648 ローレンスヴィール タワープレ ース 11 (72)発明者 トゥレムブレイ、ポール エイ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08619 ハミルトン ノッチングガム ウ ェイ 2633

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】閉鎖されたベシクルを形成し得るステロー
   ルのジカルボン酸類、ポリカルボン酸類、ヒドロキシ酸
   類、アミノ酸類及びポリアミノ酸類から選択される有機
   誘導体の塩形態を完全に閉鎖されたベシクルを形成する
   のに十分な量で、水性相に添加し、ステロールベシクル
   中に捕捉されるべき化合物をさらに水性相へ添加し、そ
   してマルチラメラベシクルの乳白色の懸濁液が形成され
   るまで混合物を振盪することからなる生物活性剤を含有
   するステロールリポソームの調製方法。
2. 【請求項２】ステロールベシクル中に捕捉されるべき化
   合物が水溶性である特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】ステロールベシクル中に捕捉されるべき化
   合物が水不溶性である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
4. 【請求項４】閉鎖されたベシクルを形成し得るステロー
   ルのジカルボン酸類、ポリカルボン酸類、ヒドロキシ酸
   類、アミノ酸類及びポリアミノ酸類から選択される有機
   誘導体の塩形態を完全に閉鎖されたベシクルを形成する
   のに十分な量で、水性相に添加し、ステロールベシクル
   中に捕捉されるべき化合物をさらに水性相へ添加し、そ
   して得られたマルチラメラベシクルの乳白色の懸濁液
   を、ユニラメラベシクルの懸濁液を形成するために、さ
   らに音波処理するものである生物活性剤を含有するステ
   ロールリポソームの調製方法。
5. 【請求項５】ステロールベシクル中に捕捉されるべき化
   合物が水溶性である特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. 【請求項６】ステロールベシクル中に捕捉されるべき化
   合物が水不溶性である特許請求の範囲第４項記載の方
   法。