DE3586242T2

DE3586242T2 - Steroid-liposome.

Info

Publication number: DE3586242T2
Application number: DE8585902251T
Authority: DE
Inventors: E Bolcsak; W Janoff; C Popescu; A Tremblay; L Weiner
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1984-04-12
Filing date: 1985-04-11
Publication date: 1993-01-28
Anticipated expiration: 2005-04-12
Also published as: DK573585A; EP0185680B1; DE3586242D1; HK71492A; JP2706642B2; EP0185680A4; WO1985004578A1; JPH08208457A; EP0185680A1; CA1262093A; SG76792G; IL74912A; US4721612A; CA1262093C; DK573585D0

Description

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Einschluß von Verbindungen in Liposomen, die aus Salzformen organischer Säurederivate von Sterolen bestehen, die zur Bildung von Bilayern in der Lage sind.
Sterole wie Cholesterol oder andere Lipide, an die ein hydrophiler Rest wie z. B. eine Salzform einer organischen Säure, gebunden ist, können zur Herstellung von Suspensionen multilamellarer oder kleiner unilamellarer Vesikel verwendet werden. Die Sterolliposomen der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne den Einsatz organischer Lösungsmittel hergestellt werden. Diese Vesikel können wasserlösliche Verbindungen, teilweise wasserlösliche Verbindungen und wasserunlösliche Verbindungen als Einschluß enthalten.
Die hier beschriebenen Sterolvesikel sind besonders nützlich für den Einschluß von biologisch aktiven Verbindungen oder pharmazeutischen Verbindungen, die in vivo verabreicht werden können. Alternativ dazu können die Sterolliposomen der vorliegenden Erfindung in vitro verwendet werden. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Cholesterol-Hemisuccinatliposomen in vitro verwendet werden in zweiwertigen Kation-abhängigen Assaysystemen.

2. Hintergrund der Erfindung

2.1. Liposome

Liposome sind vollständig geschlossene Bilayer-Membranen, die eine eingekapselte wäßrige Phase enthalten. Liposome können eine Vielzahl multilamellarer Vesikel (Onium-ähnliche Strukturen, gekennzeichnet durch konzentrische Membran-Bilayer, die jeweils durch eine wäßrige Schicht getrennt sind) oder unilamellarer Vesikel (besitzen eine Einzelmembran-Bilyaer) darstellen.
Zwei Parameter der Liposomenpräparationen sind Funktionen der Vesikelgröße und der Lipidkonzentration:
(1) Das Einschlußvolumen, definiert als das Volumen, das durch eine gegebene Menge an Lipid umschlossen ist, wird ausgedrückt als Einheit der Liter, die pro Mol des Gesamtlipids eingeschlossen sind (1 Mol&supmin;¹). Das Einschlußvolumen hängt vom Radius der Liposomen ab, der wiederum durch die Lipidzusammensetzung des Vesikels und die ionogene Zusammensetzung des Mediums beeinflußt wird.
(2) Die Einkapselungseffektivität, definiert als der Bruchteil des durch die Bilayer abgesonderten wäßrigen Abschnittes, wird als Prozentsatz angegeben. Die Einkapselungseffektivität ist zu der Lipidkonzentration direkt proportional; wenn mehr Lipid vorhanden ist, kann mehr gelöster Stoff innerhalb der Liposomen abgesondert werden (siehe Deamer und Uster, 1983, Liposom- Herstellung : Methoden und Mechanismen, in Liposome, Hrsg. M. Ostro, Marcel Dekker, Inc., N. Y., S. 27 - 51).
Das Originalverfahren zur Liposomenherstellung (Bangham et al., 1965, I. Mol. Biol. 13: 238 - 252) war verbunden mit dem Suspendieren von Phosphorlipiden in einem organischen Lösungsmittel, das dann bis zur Trockne abgedampft wurde, wobei ein wachsartiger Rückstand von Phosphorlipid im Reaktionsbehälter zurückblieb. Anschließend wurde eine entsprechende Menge einer wäßrigen Phase hinzugegeben, man ließ das Gemisch "anschwellen", und die erhaltenen Liposomen, die aus multilamellaren Vesikeln (nachfolgend als MLVs bezeichnet) bestanden, wurden durch mechanische Mittel dispergiert. Die Struktur der erhaltenen Membran-Bilayer ist so, daß die hydrophoben (unpolaren) "Schwanzstücke" des Lipids sich in Richtung auf die Mitte der Bilayer orientieren, während die hydrophilen (polaren) "Köpfe" sich in Richtung zur wäßrigen Phase orientieren. Diese Technik gab die Basis ab für die Entwicklung der kleinen beschallten unilamellaren Vesikel (nachfolgend als SUVs bezeichnet), beschrieben durch Papahadjopoulus und Miller (1967, Biochim. Biophys. Acta., 135 : 624 - 638). Sowohl MLVs als auch SUVs sind allerdings als Modellsysteme eingeschränkt.
Bei den Versuchen, das umkapselte Volumen oder die Einkapselungseffektivität zu erhöhen, sind eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Liposomen, umfassend Phosphorlipid-Bilayer, entwickelt worden; allerdings erfordern alle diese Verfahren den Einsatz organischer Lösungsmittel. Einige dieser Verfahren sind unten kurz beschrieben.
Ein Versuch, die Einkapselungseffektivität zu erhöhen, führte zuerst zur Bildung von Liposomvorläufern oder Micellen, d. i. Vesikel, enthaltend eine wäßrige Phase, umgeben durch eine Monolayer von Lipidmolekülen, die so orientiert sind, daß die polaren Kopfgruppen in Richtung der wäßrigen Phase gerichtet sind. Liposomvorläufer werden gebildet durch Zugabe der zu umkapselnden wäßrigen Lösung zu einer Lösung von polarem Lipid in einem organischen Lösungsmittel und Beschallung desselben. Die Liposomvorläufer werden anschließend in einer zweiten wäßrigen Phase in Gegenwart von überschüssigem Lipid emulgiert und eingedampft. Die erhaltenen Liposomen, bestehend aus einer wäßrigen Phase, umkapselt durch eine Lipid-Bilayer, werden in einer wäßrigen Phase dispergiert (siehe US-A-4224179, veröffentlicht 23. September 1990 für M. Schneider).
In einem weiteren Versuch, die Einkapselungseffektivität auf ein Maximum zu bringen, beschreibt Papahadjopoulus (US-A- 4235871, veröffentlicht 25. November 1980) ein "Umkehrphasen- Verdampfungsprozeß" zur Herstellung von oligolamellaren Lipidvesikeln, die auch als Umkehrphasen-Verdampfungsvesikel (hier nachfolgend als REVs bezeichnet) bekannt sind. Entsprechend dieses Verfahrens wird das zu umkapselnde wäßrige Material zu einem Gemisch eines polaren Lipids in einem organischen Lösungsmittel hinzugegeben. Anschließend wird eine homogene Emulsion des Typs Wasser-in-Öl gebildet, und das organische Lösungsmittel wird verdampft, bis sich ein Gel gebildet hat. Das Gel wird anschließend in eine Suspension durch Dispergieren des Gel-ähnlichen Gemisches in einem wäßrigen Medium umgewandelt. Die hergestellten REVs bestehen meist aus unilamellaren Vesikeln (große unilamellare Vesikel oder LUVs) und einigen oligolamellaren Vesikeln, die nur durch wenige konzentrische Bilayer mit einem großen inneren wäßrigen Raum gekennzeichnet sind.
Zu den Möglichkeiten der Herstellung von Liposomen für Arzneimittelträgersysteme ist viel geschrieben worden. Siehe zum Beispiel die Offenbarungen in US-A-3993754, veröffentlicht 23. November 1976 für Yeuh-Erh Rahman und Elizabeth A. Cerny und das US-A-4145410 veröffentlicht 20. März 1979 für Barry D. Sears. In einem Liposom-Arzneimittelträgersystem wird das Medikament während der Liposombildung eingeschlossen und anschließend dem zu behandelnden Patienten verabreicht. Das Medikament kann in Wasser oder in einem nIcht-polaren Lösungsmittel löslich sein. Typisch für diese Offenbarungen sind das US-A-4235871, veröffentlicht 25. November 1980 für Papahadjopoulus und Szoka sowie US-A-4224179, veröffentlicht 23. September 1980 für M. Schneider. Bei der Herstellung von Liposomen zum Einsatz in vivo würde es vorteilhaft sein, (1) die Notwendigkeit des Einsatzes organischer Lösungsmittel während der Herstellung der Liposomen zu eliminieren; und (2) die Einkapselungseffektivität und das umschlossene Volumen auf ein Maximum zu bringen, so daß ein größeres Volumen und eine größere Konzentration des eingeschlossenen Materials pro Dosis zugeführt werden kann.

2.2. Wasserlösliche Sterole

Eine Vielzahl von Sterolen und deren wasserlösliche Derivate sind für kosmetische, pharmazeutische und diagnostische Zwecke eingesetzt worden. Von den wasserlöslichen Sterolen sind zum Beispiel verzweigte Fettsäurecholesterolester, Steroidester und PEG-Phytosterole in kosmetischen Präparationen verwendet worden (EP-A-28456; US-A-4393044; und Schrader, Drug. and Cosmetic Industry, September 1983, S. 33 und Oktober 1983, S. 46). Thakkar und Kuehn (1969, I. Pharm. Sci. 58 (7) : 850 - 852) offenbaren die Solubilisierung von Steroidhormonen unter Verwendung wäßriger Lösungen steroider nicht-ionischer oberflächenaktiver Mittel, speziell ethoxyliertes Cholesterol (d. i. PEG-Cholesterol), bei einer Konzentration von 1 bis 5 %. Allerdings wurde die Effektivität oder Verwendbarkeit der solubilisierten Steroidhormone in vivo nicht demonstriert. Eine Anzahl wasserlöslicher Cholesterole ist hergestellt und verwendet worden als wasserlösliche Standards für die Bestimmung von Cholesterolspiegeln in biologischen Flüssigkeiten (US-A-3859047; US-A-4040784; US-A-4042330; US-A-4183847; US-A- 4189400; und US-A-4224229). Shinitzky et al., (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 5313 - 5316) inkubierten Turmorzellen in einem Gewerbekulturmedium, enthaltend eine geringe Konzentration von Cholesterol- und Cholesteryl-Hemisuccinat. Der Einschluß von Cholesterol- oder Cholesteryl-Hemisuccinat in die Zellmembran verringert die Membranfließfähigkeit und erhöht die Membran-Lipidmikroviskosität.
Cholesterol und andere Sterole sind auch in Phosphorlipid- Liposommembranen eingeschlossen worden, um die physikalischen Eigenschaften der Lipid-Bilayer zu verändern. Zum Beispiel diskutierten in einem kürzlichen Abstract Ellens et al. (1984, Biophys. J. 45 : 70a) die Wirkung von H&spplus; auf die Stabilität von Lipidvesikeln, die zsammengesetzt sind aus Phosphatidylethanolamin und Cholesteryl-Hemisuccinat. Tatsächlich berichteten Brockerhoff und Ramsammy (1982, Biochim. Biophys. Acta. 691 : 227 - 232), daß Bilayer konstruiert werden können, die vollständig aus Cholesterol bestehen, vorausgesetzt ein stabilisierender hydrophiler Anker wird angewandt. Multilamellare und unilamellare Cholesterolliposomen wurden in oben beschriebener üblicher Weise hergestellt durch Eindampfen bis zur Trockne von Cholesterolderivaten (d. i. Cholesterolphosphocholin, Cholesterol-polyethylenglycol oder Cholesterol- SO&sub4;), die in einem organischen Lösungsmittel dispergiert waren unter Zurücklassung eines auf dem Reaktionsbehälter abgeschiedenen Lipidfilmes. Die Lipidfilme wurden unter 2 ml Wasser beschallt unter Verwendung eines Ultraschallhomogenisators mit einer Mikrospitze. Die Bildung multilamellarer Vesikel erforderte 10 Minuten Beschallung, während die Bildung kleiner unilamellarer Vesikel vier Stunden Beschallung erforderte. Die erhaltenen Suspensionen multilamellarer Liposome waren milchig, während die Suspensionen der unilamellaren Liposomen transparent waren.
Allerdings wurde die Fähigkeit des effektiven Einschlusses bioaktiver Mittel in Sterolvesikeln, die für die Verabreichung in vivo geeignet sind für die Verabreichung höherer Dosen wasserlöslicher Mittel und um die Verabreichung wasserunlöslicher Mittel zu erleichtern, bisher nicht ausreichend erforscht.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für den Einschluß verschiedener Verbindungen in Liposome, die Bilayer, die Salzformen der organischen Säurederivate von Sterolen umfassen. Der Einschluß einer Verbindung wird hier definiert als die Einkapselung einer wasserlöslichen Verbindung in den wäßrigen Teil des Liposoms, oder den Einschluß einer wasserunlöslichen Verbindung innerhalb der Sterol-Bilayer. Die Sterolliposomen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich für die Verabreichung der eingeschlossenen Verbindungen in vivo, wobei in einem solchen Falle eine biokompatible Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols eingesetzt werden sollte, um die Liposomen herzustellen. Tatsächlich sind für die in vivo-Verabreichung die Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salz (Tris-Salz)-Form von organischen Säurederivaten von Sterolen besonders nützlich als Ingrediens der Vesikel-Bilayer.
Das Verfahren zur Herstellung der Sterolvesikel schließt ein die Zugabe eines wäßrigen Puffers einer Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols, das in der Lage ist zur Bildung geschlossener Bilayer in einer Menge, die ausreichend ist, vollständig geschlossene Bilayer zu bilden, die einen wäßrigen Abschnitt einschließen. Eine Suspension multilamellarer Vesikel wird durch Schütteln des Gemisches gebildet. Die Bildung von Vesikeln wird gefördert, wenn der wäßrige Puffer ebenso das Gegenion des Salzes in der Lösung enthält. Darüber hinaus sollte, wenn die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivates eines Sterols bei neutralem pH negativ geladen ist, der wäßrige Puffer im wesentlichen frei von zweiwertigen oder mehrwertigen Kationen sein. Ähnlich sollte, wenn die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivates eines Sterols positiv bei neutralem pH geladen ist, der wäßrige Puffer im wesentlichen frei von mehrwertigen Anionen sein. Die Anwendung von Energie zur Suspension, z. B. Beschallung oder Extrudierung der Vesikel durch eine Druckzelle (French Press) oder durch einen porösen Filter entsprechender Porengröße wandelt die multilamellaren Sterolvesikel in unilamellare Vesikel um.
Um eine wasserlösliche Verbindung, eine teilweise wasserlösliche Verbindung oder eine wasserunlösliche Verbindung in den Sterolvesikeln der vorliegenden Erfindung einzuschließen, ist eine Vielzahl von Versuchen möglich. Verbindungen, die sich entweder in den Sterol-Bilayern (z. B. wasserunlösliche Verbindungen) verteilen oder wasserlösliche Verbindungen, können der wäßrigen Phase vor der Bildung der Vesikel hinzugesetzt werden, um das Mittel in den Vesikeln während der Bildung einzuschließen. Alternativ dazu können Verbindungen, die wasserunlöslich oder lipidlöslich sind der Suspension von Sterolvesikeln nach der Bildung der Vesikel hinzugegeben werden, wobei sich in diesem Falle die Verbindung in den Sterol-Bilayern verteilt. In einer anderen Ausführungsform kann eine wasserlösliche Verbindung und die Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols zu einem organischen Lösungsmittel hinzugegeben werden, so daß beide solubilisiert (co-solubilisiert) werden. Das organische Lösungsmittel kann anschließend abgedampft werden, wobei ein Film zurückbleibt, der eine homogene Verteilung der wasserunlöslichen Verbindung und des Sterolderivates enthält. Sterol-Liposome, die die wasserunlöslichen Verbindungen einschließen, werden gebildet, wenn ein wäßriger Puffer dem Film unter Schütteln hinzugesetzt wird.
Die Sterolliposomen der vorliegenden Erfindung sind besonders vorteilhaft, wenn sie dazu eingesetzt werden, wasserunlösliche bioaktive Mittel zu umschließen oder solche, die wenig in Wasser löslich sind. Dies ermöglicht die Verabreichung in vivo von wasserunlöslichen Arzneimitteln; und darüber hinaus gestattet es die Verabreichung in vivo von hohen Konzentrationen wasserunlöslicher Verbindungen, da es eine Veränderung des Verhältnisses Dosis : Volumen gestattet. Die Sterolvesikel der vorliegenden Erfindung offerieren ähnliche Vorteile, wenn sie dazu verwendet werden, wasserlösliche bioaktive Mittel einzuschließen. Zusätzlich können die Sterolvesikel der vorliegenden Erfindung in diagnostischen Untersuchungen in vitro verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher Steroidliposomen, umfassend vollständig geschlossene Bilayer im wesentlichen enthaltend eine Salzform eines organischen Säurederivates von einem Sterol.
Die vorliegende Erfindung bringt eine Reihe von Vorteilen mit sich, indem die Sterolvesikel:
(1) leicht und schnell gebildet werden;
(2) eine hohe Einkapselungseffektivität haben im Vergleich mit Phospholipid-MLVs;
(3) nicht die Verwendung von organischen Lösungsmitteln für ihre Herstellung erfordern (obgleich die Sterolvesikel der vorliegenden Erfindung unter Verwendung organischer Lösungsmittel hergestellt werden können); und
(4) ein bioaktives oder pharmazeutisches Mittel einschließen können, welches, wenn es in vivo verabreicht wird, freigesetzt und metabolisiert wird. Das Schicksal des eingeschlossenen Mittels in vivo hängt von der Art der Verabreichung ab.

4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt grafisch die umgekehrte Beziehung des umkapselten Gelösten (Chromium) und die Konzentration von Cholesterol- Hemisuccinat, das zur Herstellung der multilamellaren Liposomen verwendet wurde.
Fig. 2 zeigt die Röntgenbeugungsbilder, erhalten für vier unterschiedliche CHS-MLV-Präparationen.
Fig. 3 erläutert die Daten der elektronischen Spinresonanz für CHS-multilamellare Vesikel und EPC-multilamellare Vesikel.
Fig. 4 zeigt grafisch die Anschwellprofile von Cholesterol- Hemisuccinatliposomen und Ei-Phosphatidyl-Liposomen in wäßrigen Puffern verschiedener Tonizität.
Fig. 5 erläutert grafisch die Effektivität von Indomethacin, eingeschlossen in Cholesterol-Hemisuccinatliposomen bei der Verringerung der Gelenkschwellung, wenn es intramuskulär verabreicht wird.
Fig. 6 erläutert die Organverteilung von ¹&sup4;C-Diazepam, intravenös verabreicht bei der Maus entweder nicht verkapselt (frei) oder verkapselt in CHS-SUVs.
Fig. 7 A, B und C erläutert die Organverteilung von &sup5;¹Chromium, intravenös verabreicht bei der Maus entweder verkapselt in CHS-MLVs (Fig. 7 A) oder verkapselt in EPC-SPLVs (Fig. 7 B) oder unverkapselt (Fig. 7 C).

5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren und Zusammensetzung für die Verkapselung von wasserlöslichen, teilweise wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Verbindungen in Liposomen, die Bilayer, oder die Salzformen organischer Säurederivate von Sterolen enthalten, die in der Lage sind zur Bildung geschlossener Bilayer. Dementsprechend können Sterolliposome der vorliegenden Erfindung hergestellt werden durch (1) Einschluß einer wasserlöslichen Verbindung in dem wäßrigen Abschnitt; oder (2) Einschluß einer wasserunlöslichen Verbindung, die sich in den Sterol-Bilayern verteilt; oder (3) sowohl Verkapselung einer wasserlöslichen Verbindung als auch Verkapselung einer wasserunlöslichen Verbindung in einer Liposompräparation.
Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung kann eine beliebige Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols verwendet werden, das in der Lage ist, vollständig geschlossene Bilayer in wäßrigen Lösungen (d. i. Liposome) zu bilden. Ob eine spezielle Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols geeignet ist, hängt von seiner Fähigkeit ab, eine wasserlösliche Verbindung abzusondern, so daß die Verbindung nicht mit der äußeren Umgebung in Kontakt kommt.
Um definitiv zu bestimmen, daß der Einschluß innerhalb des wäßrigen Abschnittes eines beliebigen Liposomen eingetreten ist, sind die folgenden Kriterien festgelegt worden (siehe Sessa und Weissmann, 1970, J. Biol. Chem. 245 : 3295: (a) es muß eine klare Trennung der freien Form der abgesonderten Verbindung vorliegen, wie durch Gelfiltration bestimmt; (b) es darf keine hydrophobe Wechselwirkung oder keine Wechselwirkung von Charge zu Charge zwischen der äußersten Vesikelbilayer und der eingeschlossenen Verbindung geben, da dies zu einer Störung führen kann, die Trennung der freien Verbindung von den Liposomen durch Molekularsiebe zu erreichen, wodurch künstlich die scheinbare Absonderungs- oder Einkapselungseffektivität erhöht wird. Um diese Möglichkeit zu eliminieren, muß darauf gesehen werden, daß die zu einer Suspension von vorher gebildeten Liposomen hinzugegebene wasserlösliche Verbindung nicht mit den vorgebildeten Liposomen co-eluiert; (c) das Zerreißen der Gel-filtrierten Liposome durch Einsatz eines Detergens oder anderer Membranstörmittel muß eine Erhöhung in den Gelfiltrationsbildern des abgesonderten Moleküls von einer Position hervorrufen, die zeitlich mit dem Liposomenpeak für eines zusammenfällt, das mit dem freien Molekül co-eluiert.
Im allgemeinen kann bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung ein beliebiges Sterol eingesetzt werden, das durch die Anlagerung einer organischen Säure modifiziert werden kann. Zum Beispiel gehören zu derartigen Sterolen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Cholesterol, Vitamin D, Phytosterole (einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Sitosterol, Campesterol, Stigmasterol und ähnliche), Steroidhormone und ähnliche.
Organische Säuren, die dazu verwendet werden können, die Sterole zu derivatisieren, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Carbonsäuren, Dicarbonsäuren, Polycarbonsäuren, Hydroxysäuren, Aminosäuren und Polyaminosäuren. Da die Salzformen die Wasserlöslichkeit der organischen Säuren erhöhen, kann eine beliebige organische Säure dazu verwendet werden, die Sterole zu derivatisieren; allerdings kann ein Vorteil dadurch erreicht werden, wenn die organische Säuregruppe selbst wasserlöslich ist. Zu solchen wasserlöslichen organischen Säuregruppen gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, wasserlösliche aliphatische Carbonsäuren wie Essig-, Propion-, Butyr-, Valeriansäure und ähnliche (Beachte: Säuren mit bis zu vier Kohlenstoffatomen sind mit Wasser mischbar; die freie Säure mit fünf Kohlenstoffatomen ist teilweise löslich und die längerkettigen freien Säuren sind praktisch unlöslich); wasserlösliche aliphatische Dicarbonsäuren wie Malon-, Succin-, Glutar-, Adipin-, Pimelin-, Maleinsäure und ähnliche (Beachte: Die kürzerkettigen Säuren sind bemerkenswert mehr löslich in Wasser; die Löslichkeitsgrenze in Wasser tritt auf bei C&sub6; bis C&sub7;); und wasserunlösliche aromatische Dicarbonsäuren wie Hemimellitin-, Trimesinsäure, Succinimid und ähnliche; Polycarbonsäuren; wasserlösliche Hydroxysäuren wie Glycol-, Milch-, Mandel-, Glycerin-, Malon-, Wein-, Citronensäure und ähnliche (Beachte: a-Hydroxysäuren, enthaltend eine verzweigte Kette, die an das a-Kohlenstoff der Carbonylgruppe gebunden ist, unterliegen weniger der Hydrolyse, und daher sind sie vorteilhaft bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung); und eine beliebige der Aminosäuren-und Polyaminosäuren.
Die organische Säure kann an eine Hydroxylgruppe des Sterols über eine Ester- oder eine Etherbindung gebunden sein bei Einsatz üblicher Verfahren (siehe zum Beispiel US-A-3859047; US-A-4040784; US-A-4042330; US-A-4183847; und US-A-4189400). Die Salzformen der derivatisierten Sterole können durch Lösen sowohl des organischen Säurederivates des Sterols und des Gegenions des Salzes (z. B. die freie Base des Salzes) in einem entsprechend flüchtigen Lösungsmittel hergestellt werden, und anschließend wird das Lösungsmittel durch Verdampfung oder eine ähnliche Technik entfernt, wobei ein Rückstand verbleibt, der aus der Salzform des organischen Säurederivates des Sterols besteht. Zu Gegenionen, die eingesetzt werden können, gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Tris, 2- Amino-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Aminoethanol, Bis-Trispropan, Triethanolamin und ähnliche, um das entsprechende Salz zu bilden. Tatsächlich kann die freie Base eines ionisierbaren bioaktiven Mittels wie die freie Base von Miconazol freie Base und ähnliches als Gegenion eingesetzt werden.
Die Sterolliposomen der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch Zugabe zu einer wäßrigen Phase einer Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols, das zur Bildung von Bilayern in der Lage ist, so daß das derivatisierte Sterol in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, Vesikel zu bilden (das sind vollständig geschlossene Bilayer, enthaltend einen eingeschlossenen wäßrigen Abschnitt). Die Präparation wird dann so lange geschüttelt, bis eine milchige Suspension multilamellarer Sterolvesikel gebildet wird. In der bevorzugten Ausführungsform sollte die wäßrige Phase das Salz in Lösung enthalten, um die Vesikelbildung zu erleichtern. Wenn weiterhin die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivates des Sterols bei neutralem pH negativ geladen ist, sollte der wäßrige Puffer im wesentlichen frei von mehrwertigen Kationen sein. Ähnlich sollte der wäßrige Puffer im wesentlichen frei von mehrwertigen Anionen sein, wenn die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivates bei neutralem pH positiv geladen ist.
In vollständigem Gegensatz zu den berichteten Verfahren zur Bildung multilamellarer Vesikel (z. B. Phospholipidvesikel oder der Cholesterol-Liposomen von Brockerhoff und Ramsammy (1982, Biochim. Biophys. Acta. 691 : 227 - 232), erfordert das Verfahren zur Bildung der multilamellaren Sterolvesikel gemäß der vorliegenden Erfindung nicht die Verwendung organischer Lösungsmittel. Weiterhin ist im Unterschied zu der Methode von Brockerhoff und Ramsammy (oben) eine Beschallung nicht erforderlich, um die multilamellaren Sterolvesikel zu bilden. Vielmehr kann die Beschallung der milchigen Suspension der multilamellaren Sterolvesikel der vorliegenden Erfindung oder die Verwendung einer French Press (SLM-Aminco, Burbana, ILL) gefolgt von einer Schallanwendung dazu eingesetzt werden, die milchige Suspension der multilamellaren Sterolvesikel in eine klare Suspension unilamellarer Sterolvesikel umzuwandeln. Ähnlich können mehrfache Extrudierungen der multilamellaren Sterolvesikel bei mäßigen Drücken durch einen Filter mit einer Porengröße von gleich oder kleiner als 100 nm Durchmesser dazu benutzt werden, unilamellare Sterolvesikel zu erhalten. Diese Extrudierungstechnik ist im Detail beschrieben in der gleichfalls anhängigen Patentanmeldung Serial Nr. 622690, eingereicht am 20. Juni 1984 durch Cullis et al. unter dem Titel "Extrudierungstechnik zur Herstellung unilamellarer Vesikel", die durch Bezugnahme darauf hier einbezogen wird.
Wie bereits vorher erläutert, kann die Tris-Salzform eines beliebigen organischen Säurederivates eines Sterols vorteilhaft bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Zum Beispiel ist die Tris-Salzform einer Sterol-Hemidicarbonsäure wie ein Sterolhemisuccinat oder ein Gemisch von Sterolhemisuccinaten insbesondere nützlich zur Bildung der Vesikel-Bilayer der Steroidliposomen, die in vivo zu verabreichen sind. Wenn zum Beispiel Cholesterol-Hemisuccinat verwendet wird, können 2,5 bis 700 uMol der Tris-Salzform zu 2,0 ml wäßrigem Puffer, der Tris-HCl enthält (Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid), hinzugegeben werden, um Vesikel zu bilden; in diesem Falle sollte der wäßrige Puffer im wesentlichen frei von zweiwertigen oder mehrwertigen Kationen sein.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann der Einschluß von wasserlöslichen Verbindungen, wasserunlöslichen Verbindungen oder schwerlöslichen Verbindungen in Liposomen, die aus der Salzform organischer Säurederivate von Sterolen bestehen, auf mehreren Wegen bewirkt werden:
(1) Eine wasserunlösliche Verbindung kann zu einer Suspension von Sterolliposomen (entweder multilamellare Sterolvesikel oder unilamellare Sterolvesikel) gegeben werden, die wie oben beschrieben hergestellt wird unter Einsatz einer entsprechenden Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols.
Die Verbindung wird eingeschlossen in die Liposomen, da sie sich in den Sterol-Bilayern verteilt. Diese Ausführungsform kann vorteilhaft wie folgt durchgeführt werden: Die wasserunlösliche Verbindung kann in einem entsprechenden organischen Lösungsmittel gelöst werden, das anschließend verdampft wird unter Zurücklassung eines Filmes oder eines Rückstandes der Verbindung. Wenn eine wäßrige Suspension vorher gebildeter Sterolliposomen zu dem Rückstand hinzugegeben wird, wird der Rückstand in den Bilayern der Sterolliposomen eingeschlossen. In der bevorzugten Ausführungsform sollten unilamellare Sterolvesikel verwendet werden; wenn multilamellare Sterolvesikel verwendet werden, kann die wasserunlösliche Verbindung in den äußersten Bilayern der Liposomen eingeschlossen werden, wobei die innersten Bilayer unverändert bleiben, was zu einem unnötigen Einsatz des Sterolbestandteiles führt.
(2) Eine wasserunlösliche Verbindung und die Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols können beide co-solubilisiert werden in einem organischen Lösungsmittel, das anschließend verdampft wird, wobei ein Film zurückbleibt, der aus einer homogenen Verteilung der wasserunlöslichen Verbindung und des Sterolderivates besteht. Eine Suspension multilamellarer Sterolvesikel, enthaltend die umschlossene Verbindung, wird mit einer wäßrigen Phase gebildet und dem Film unter Schütteln hinzugesetzt. Die multilamellaren Vesikel können in unilamellare Vesikel wie vorher beschrieben umgewandelt werden.
(3) Eine wasserlösliche Verbindung oder eine wasserunlösliche Verbindung können in dem Sterolliposomen eingeschlossen werden durch Zugabe der Verbindung zur wäßrigen Phase, die bei der Herstellung der Sterolvesikel verwendet wird; d. h. die Verbindung kann zu der wäßrigen Phase vor oder gleichzeitig mit der Zugabe der Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols hinzugegeben werden. In diesem Falle wird eine wasserunlösliche Verbindung eingeschlossen, wenn sie sich in den Bilayern während der Vesikelbildung verteilt; wohingegen eine wasserlösliche Verbindung in dem wäßrigen Abschnitt der Sterolvesikel während der Vesikelbildung eingeschlossen wird. In beiden Fällen können die multilamellaren Vesikel in unilamellare Vesikel wie vorher beschrieben umgewandelt werden.
(4) Wenn das bioaktive Mittel ionisierbar ist, kann die freie Base des bioaktiven Mittels als Gegenion verwendet werden, um die Salzform des organischen Säurederivates eines Sterols zu bilden. Die Sterolliposomen können hergestellt werden durch eine beliebige oben beschriebene Methode unter Verwendung der Salzform des bioaktiven Mittels des organischen Säurederivates des Sterols. Zum Beispiel kann die freie Base von Miconazol, einer fungiziden Verbindung, verwendet werden, um die Salzderivate in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Unter Einsatz einer der vier oben beschriebenen Methoden können sowohl eine wasserlösliche Verbindung als auch eine wasserunlösliche Verbindung in einer Sterol-Liposom-Präparation eingeschlossen werden.
Nach den oben beschriebenen Verfahren für den Einschluß von wasserunlöslichen Verbindungen unter Verwendung der Sterolvesikel der vorliegenden Erfindung, ist es nicht erforderlich, daß die Vesikel intakt bleiben, da eine wasserunlösliche Verbindung sich in den Bilayern verteilt. Tatsächlich ist es denkbar, daß, wenn die Verbindung sich in den Bilayern verteilt, die Vesikel gestört oder zerrissen werden, was zu einem Entweichen oder einer Freisetzung der wäßrigen umschlossenen Verbindungen führt. Obgleich diese "entweichenden" Vesikel dazu verwendet werden könnten die umschlossenen wasserunlöslichen Verbindungen abzugeben, sollten sie nicht dazu verwendet werden, eine wasserlösliche Substanz einzuschließen oder abzugeben.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Sterolliposome hergestellt unter Verwendung der Tris-Salzform von Cholesterol-Hemisuccinat wie folgt: 4,5 bis 200 mg der Tris-Salzform von Cholesterol-Hemisuccinat wurden hinzugegeben pro ml oder wäßriger Puffer, enthaltend 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl. Das Gemisch wurde geschüttelt und es bildete sich eine milchige Suspension multilamellarer Cholesterol-Hemisuccinat- Vesikel. Die Vesikel können durch Zentrifugieren relletisiert und wiederholt mit wäßrigem Puffer gewaschen werden. Die Suspension von multilamellaren Cholesterol-Hemisuccinat-Vesikeln (CHS-MLVs) kann beschallt werden (z. B. in einem Beschallungsgerät vom Bad-Typ) um kleine unilamellare Cholesterol-Hemisuccinat-Vesikel zu bilden (CHS-SUVs). Alternativ dazu können die CHS-MLVs durch eine French-Druckzelle (eine French Press) mit 40000 psi passiert werden, oder die CHS-MLVs können durch zwei 100 nm Nucleopore -Filter mit 300 bis 400 pa passiert werden, um CHS-SUVs zu bilden. Die Cholesterol-Hemisuccinat-Vesikel (MLVs oder SUVs) sind in Anwesenheit zweiwertiger Kationen instabil; d. h. nachdem sie zweiwertigen Kationen ausgesetzt werden, werden die eingeschlossenen wäßrigen Abschnitte und wasserlöslichen Verbindungen freigegeben. Somit sollte das wäßrige Medium, das während der Herstellung oder Lagerung der Vesikel verwendet wird, im wesentlichen frei von zweiwertigen Kationen sein.
Die Verbindungen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden, können auch auf verschiedenen Wegen verwendet werden. Wenn zum Beispiel die Verbindung ein bioaktives Mittel ist, kann die von Sterolliposomen eingeschlossene Verbindung in vivo verabreicht werden. Dies gestattet die in vivo-Gabe bioaktiver Mittel, die normalerweise unlöslich oder schwerlöslich in wäßrigen Lösungen sind. Der Einschluß in Liposomen, bestehend aus der Salzform organischer Säurederivate von Sterolen, gestattet in leichter Weise die Verabreichung derartiger unlöslicher Verbindungen bei einem höheren Verhältnis von Dosis : Volumen. Tatsächlich werden die Sterolvesikel der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaft in vivo angewandt, da die Vesikel dazu benutzt werden können, eine oder mehrere bioaktive Mittel für die in vivo-Gabe einzuschließen. Weiterhin zeigen die Vesikel der vorliegenden Erfindung einen Vorteil gegenüber konventionellen Lipidvesikeln oder Liposomen, wenn sie in vivo angewandt werden, da sie ohne Verwendung organischer Lösungsmittel hergestellt werden können. Das Schicksal des eingeschlossenen Mittels in vivo nangt von dem Weg oder der Art der Verabreichung ab. Wenn zum Beispiel das in Sterolliposomen eingeschlossene Mittel intravenös verabreicht wird, folgt die Freigabe des Mittels in vivo einem Weg, der sich von dem eines nicht eingeschlossenen Mitels oder dem eines Miztenis unterscheidet, das in konventionellen Liposormen eingeschlosse st, die aus Phospholipiden bestehen (d.h. MLVs, SUVs, REVs, LUVs) andererseits führt die intramuskuläre Verabreichung der in Sterolliposomen eingeschlossenen Mitte zu einer verzogerten Freisetzung des Mittels in vivo.
In Grunde genommen kann ein beliebiges bioaktives Mittel in den Sterolliposomen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden. Zu derartigen Mitteln gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, antibakterielle Mittel, antivirale Mittel, antifungale Mittel, antiparasitäre Mittel, tumorizide Mittel, Antimetaboliten, Polypeptide, Peptide, Proteine, Toxine, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter, Glycoproteine, Lipoproteine, Imunglobuline, Imunmodulatoren, Vasodilatoren, Farbstoffe, Isotopen-markierte Verbindungen, strahlenundurchlässige Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, Rezeptor-bindende Moleküle, entzündungswidrige Mittel, Antiglaukommittel, mydriatische Verbindungen, Lokalanästetika, Narkotika, Vitamine, Nucleinsäuren, Polynucleotide usw. Der Einschluß von zwei oder menreren Verbindungen gleichzeitig kann insbesondere gewünscht sein, wenn derartige Verbindungen komplementäre oder synergistische Wirkungen hervorrufen.
Das in Sterolliposomen eingeschlossene Mittel kann in vivo auf einem beliebigem Weg verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt: Impfen oder Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subcutan, intraaural, intraartikulär, intramammär und ähnliche), topische Applikation (z. B. auf Flächen wie den Augen, der Haut, in Ohren oder auf Wunden und Verbrennungen) und durch Absorption über epithelische oder mucokutane Abdeckungen (z. B. nasal, oral, vaginal, rektal, gastrointestinale Mucosa und ähnliche).
In einem anderen Beispiel ihrer Verwendung kann die in Sterolliposomen eingeschlossene Verbindung in einen breiten Materialbereich eingearbeitet werden, einschließlich, nicht jedoch darauf beschränkt, in andere Lipidvesikel oder Liposomen, Gele, Öle, Emulsionen und ähnliche. Zum Beispiel kann die Suspension von Sterolliposomen, die die eingeschlossene Verbindung enthalten, der wäßrigen Phase als Bestandteil in einem beliebigen Typ von Liposompräparationen zugesetzt werden (z. B. Phospholipid-MLVs, -SUVs, -LUVs, -REVs und andere). Dies gestattet den Einschluß der Verbindungen in die Phospholipidliposomen.
Andere Verwendungen können sich in Abhängigkeit von den besonderen Eigenschaften einer Präparation die Fachleute auf diesem Gebiet vorstellen. Wegen ihrer Sensibilität gegenüber zweiwertigen Kationen können zum Beispiel die Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen der vorliegenden Erfindung dazu eingesetzt werden, Indikatorfarbstoffe zu umschließen, die empfindlich gegenüber zweiwertigen Kationen sind, die für die Verwendung in colorimetischen diagnostischen Asays in vitro eingesetzt werden können.
Die folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Erläuterung gegeben und stellen keine Beschränkung des Schutzumfanges der Erfindung dar.

6. Beispiel: Wasserlösliche Verbindungen einschließende Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen

Die folgenden Unterabschnitte beschreiben die Herstellung von Cholesterol-Hemisuccinat-Vesikeln, die ArsenazoIII, Inulin oder Chromium einschließen. Parameter, wie die Einkapselungseffektivität und das Einschlußvolumen werden eingeschätzt; die Calcium-abhängige Instabilität der Cholesterolvesikel wird demonstriert. Die Gefrier-Ätz-Elektronenmikroskopie, Röntgenbeugung und Elektronenspinresonanz der Cholesterol-Hemisuccinat-Vesikel wird ebenfalls beschrieben.

6.1. Liposome, hergestellt unter Verwendung verschiedener Salzformen von Cholesterol-Hemisuccinat

Die folgenden Unterabschnitte beschreiben die Herstellung von CHS-Liposomen unter Verwendung verschiedener Salzformen von Cholesterol-Hemisuccinat.
In allen Beispielen, die die Tris-Salzform von Cholesterol- Hemisuccinat betreffen, nachfolgend hier als Tris-Salz CHS bezeichnet, wurde das Tris-Salz CHS entweder von Sigma Biochemicals, St. Louis, Mo gekauft und ohne Reinigung verwendet oder wie folgt synthetisiert: 30 ml einer 3,3 molaren Lösung der Tris-Base wurde zu 1,5 Litern einer 67 M molaren Lösung von Cholesterolhydrogensuccinat (ICN, Cleveland, Ohio) in Ether hinzugegeben. Die erhaltene Lösung wurde rotationsverdampft bis zu einem feuchten Rückstand und für 12 Stunden lyophilisiert. Das erhaltene Tris-Salz CHS wurde dreimal aus Ethylacetat umkristallisiert. Das restliche Ethylacetat wurde durch Erhitzen auf 56ºC unter Vakuum (0,1 mm Hg) entfernt.

6.1.1. Tris-Salz Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Das Tris-Salz CHS (54 mg) wurde zu einer 1 ml Lösung von Arsenazo III (4,5 mM, Endkonzentration) in 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl, gegeben. Durch mechanisches Schütteln wurde eine milchige Suspension von CHS-MLVs gebildet. Die CHS-MLVs wurden pelletisiert durch Zentrifugieren bei 10000 x g für 15 Minuten, und das erhaltene Pellet wurde dreimal gewaschen unter Einsatz von 10 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl. Das erhaltene Pellet hatte eine rote Farbe, die den Einschluß von Arsenazo III anzeigte

6.1.2. 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Das 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiolsalz von Cholesterol-Hemisuccinat (50 mg) wurde zu einer 1 ml Lösung von Arsenazo III (4,5 mM Endkonzentration) in 0,01 M 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-HCl (pH 7,3), 0,07 M KCl, 0,07 M NaCl gegeben. Die Suspension der CHS-MLVs wurde durch wirbelndes Vermischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch Zentrifugieren bei 10000 x g für 15 Minuten pelletisiert, und das erhaltene Pellet wurde dreimal wie in Abschnitt 6.1.1. beschrieben gewaschen. Das erhaltene Pellet hatte eine rote Farbe, die den Einschluß von Arsenazo III anzeigt.

6.1.3. 2-Aminoethanol-Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Das 2-Aminoethanolsalz von Cholesterol-Hemisuccinat (50 mg) wurde zu einer 1 ml Lösung von Arsenazo III (4,5 mM Endkonzentration) in 0,01 M 2-Aminoethanol-HCl (pH 7,3), 0,07 M KCl, 0,07 M NaCl gegeben. Die Suspension der CHS-MLVs wurde durch wirbelndes Vermischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch Zentrifugieren bei 10000 x g für 15 Minuten pelletisiert, und das erhaltene Pellet wurde dreimal wie in Abschnitt 6.1.1. beschrieben gewaschen. Das erhaltene Pellet hatte eine rote Farbe, die den Einschluß von Arsenazo III anzeigt.

6.1.4. Bis-Tris-Propan-Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Das Bis-Tris-Propan-Salz von Cholesterol-Hemisuccinat (50 mg) wurde zu einer 1 ml Lösung von Arsenazo III (4,5 mM Endkonzentration) in 0,01 M Bis-Tris-Propan-HCl (pH 7,3), 0,07 M KCl, 0,07 M NaCl gegeben. Die Suspension der CHS-MLVs wurde durch wirbelndes Vermischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch Zentrifugieren bei 10000 x g für 15 Minuten pelletisiert, und das erhaltene Pellet wurde dreimal wie in Abschnitt 6.1.1. beschrieben gewaschen. Das erhaltene Pellet hatte eine rote Farbe, die den Einschluß von Arsenazo III anzeigt.

6.1.5. Triethanolamin-Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Das Triethanolaminsalz von Cholesterol-Hemisuccinat (50 mg) wurde zu einer 1 ml Lösung von Arsenazo III (4,5 mM Endkonzentration) in 0,01 M Triethanolamin-HCl (pH 7,3), 0,07 M KCl, 0,07 M NaCl gegeben. Die Suspension der CHS-MLVs wurde durch wirbelndes Vermischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch Zentrifugieren bei 10000 x g für 15 Minuten pelletisiert, und das erhaltene Pellet wurde dreimal wie in Abschnitt 6.1.1. beschrieben gewaschen. Das erhaltene Pellet hatte eine rote Farbe, die den Einschluß von Arsenazo III anzeigt.

6.1.6. Miconazol-Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Die freie Base von Miconazol wurde wie folgt hergestellt: Eine wäßrige Lösung von NaOH wurde in einer Suspension von Miconazolnitrat in Ether titriert. Die Etherphase wurde gesammelt, und der Ether wurde verdampft unter Zurücklassung eines Öls, bestehend aus der freien Base von Miconazol. Das Öl wurde anschließend zu Ethanol gegeben, der Cholesterol-Hydrogensuccinat enthielt. Das Ethanol wurde verdampft unter Zurücklassung eines Filmes, enthaltend die Salzform des Miconazol-Cholesterol-Hemisuccinat. Anschließend wurde zu dem Film eine Salzlösung gegeben. Nach extensivem, wirbelndem Vermischen wurden Vesikel in der Lösung beobachtet.

6.1.7. Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs, hergestellt durch Beschallung

CHS-MLVs wurden hergestellt wie in den Abschnitten 6.1.1., 6.1.2., 6.1.3., 6.1.4. und 6.1.5., mit Ausnahme dessen, daß Arsenazo III weggelassen wurde. Jedes am Ende erhaltene Vesikelpellet wurde resuspendiert in 2 ml Puffer, in dem es hergestellt worden war, und in einem Badbeschallungsgerät solange beschallt, bis die milchige Suspension klar wurde als Zeichen für die Umwandlung der CHS-MLVs in CHS-SUVs.

6.1.8. Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs, hergestellt durch Extrudierungstechniken

CHS wurde in 10 mM HEPES, 150 mM NaCl (pH 7,5) mit einer Konzentration von 100 mg/ml dispergiert. Dieses Material wurde zehnmal durch einen 30 nm Nucleopore-Filter extrudiert, wobei man CHS-SUVs erhielt.

6.2. Einschluß von Inulin in Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs

Multilamellare Cholesterol-Hemisuccinat-Vesikel (CHS-MLVs), die ³H-Inulin als das eingeschlossene Mittel enthielten, wurden wie folgt hergestellt: ³H-Inulin (3,7 x 10&sup7; Bq/ml = 1,0 mCi/ml, New England Nuclear, Boston, MA) wurde gelöst in 2 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl. Anschließend wurden 40 mg der Tris-Salz CHS zu der Lösung hinzugegeben, und das er haltene Gemisch wurde mechanisch durch Schütteln dispergiert. Eine milchige Suspension bildete sich als Anzeichen für die Bildung multilamellarer Vesikel. Die Suspension wurde zwei Stunden ungestört stehengelassen, wonach die Suspension auf ein Endvolumen von 10 ml verdünnt wurde unter Verwendung von 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl. Die Radioaktivität eines 10 ul Aliquoten wurde bestimmt mit 24625 cpm/10 ul durch Zugabe des Aliquoten zu 10 ml Szintillationsflüssigkeit (40 g Omnifluor (New England Nuclear, Boston, MA), 6 l Toluen, 4 l Ethylenglycolmonoethylether) und die Radioaktivität wurde bestimmt mittels eines Beckmann L6800-Flüssigszintillationszählers mit bei 0,400 gesetzten Fenstern. Die Radioaktivität in Zählimpulsen pro Minute (cpm) wurde in Zerfällen pro Minute (dpm) durch Einsatz der H#-Methode der Löschkorrektur umgewandelt (Horrock, D. L. The Number Concept, Beckmann Instruments, 1977). Die CHS-MLVs wurden anschließend pelletisiert durch Zentrifugieren bei 10000 x g für 15 Minuten. Das erhaltene Pellet wurde dreimal gewaschen durch Resuspendieren des Pellets in 10 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl und nochmaliges Pelletisieren durch Zentrifugieren bei 10000 x g für 15 Minuten. Das gewaschene Vesikelpellet wurde resuspendiert in 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl bis zu einem Endvolumen von 10 ml; die Radioaktivität eines 10 ul Aliquoten wurde bestimmt mit 3442 cpm/10 ul. Daher wurden insgesamt etwa 14 Prozent des eingesetzten ³H-Inulins in den CHS-MLVs eingeschlossen.

6.2.1. Einkapselungseffektivität von Inulin in Cholesterol- Hemisuccinat-MLVs und Ei-Phosphatidylcholin-MLVs

Die Einkapselungseffektivitäten von Inulin, das in MLVs eingeschlossen ist, bei unterschiedlichen Konzentrationen von Cholesterol-Hemisuccinat wurden verglichen mit den Einkapselungseffektivitäten von Inulin, das eingeschlossen ist in MLVs bei unterschiedlichen Konzentrationen von Ei-Phosphatidylcholin. (Beachte: Die Elnkapselungseffektivität für ein beliebiges Liposom ist definiert als der Anteil des durch Bilayer abgesonderten wäßrigen Abschnittes; und wird als Prozentsatz ausgedrückt, siehe Abschnitt 2.1. oben).
Es wurden multilamellare Vesikel hergestellt, bestehend aus entweder Ei-Phosphatidylcholin (EPC) oder Tris-Salz CHS, unter Verwendung identischer Abläufe, um die Einkapselungseffektivitäten zu vergleichen. Dementsprechend wurde Tris-Salz CHS bei einer Konzentration von 40, 80, 160, 320 oder 400 mg in 2,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer mit 5 ul ³H-Inulin (8 x 10&sup9; Bq/mg = 217,0 mCi/mg) wirbelnd vermischt und zwei Stunden stehen gelassen. Dabei bildete sich CHS-MLVs mit ³H- Inulin als eingeschlossene Verbindung. Ein zusätzlicher 3 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer wurde der Suspension hinzugesetzt, die bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen wurde. Anschließend wurden etwa 3,0 ml 0,01 M Tris- HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer hinzugegeben, um das Gesamtvolumen auf 10 ml zu bringen.
Multilamellare Vesikel, bestehend aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC-MLVs) (Avanti, Birmingham, AL) wurden nach folgendem Ablauf hergestellt: 40, 80, 160, 320 oder 400 mg/ml EPC wurde in ausreichend Chloroform suspendiert, um das Phospholipid vollständig zu lösen. Das Chloroform wurde bis zur Trockne abgedampft, wobei ein wachsartiger Rückstand auf dem Teströhrchen verblieb. Anschließend wurden 2,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer mit 5 ul ³H-Inulin (217,0 mCi/mg) hinzugegeben, man ließ das Gemisch "anschwellen", und die erhaltenen EPC-MLVs wurden durch extensives wirbelndes Mischen dispergiert. Zusätzliche 3 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer wurden zu der Suspension hinzugegeben, die bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen wurde. Anschließend wurde das Gemisch auf ein Gesamtvolumen von 10 ml mit 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer gebracht.
Die Einkapselungseffektivität von ³H-Inulin durch die CHS-MLVs und EPV-MLVs wurde wie folgt bestimmt: Die Radioaktivität in dem 20 ul Aliquoten von jedem Anfangsgemisch der Bestandteile wurde durch Szintillationszählung, wie vorher beschrieben, bestimmt. Nach Bildung wurden die Liposomen pelletisiert durch Zentrifugieren der Suspension für 10 bis 20 Minuten bei 10000 x g, jedes Pellet wurde viermal mit 10 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer gewaschen und auf ein Endvolumen van 10 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer resuspendiert. Die Radioaktivität eines 20 ul Aliquoten dieser zum Schluß gewaschenen Probe wurde bestimmt. Der Anteil der anfänglichen Radioaktivität, die in dieser Schlußprobe gemessen wurde, repräsentierte das ³H-Inulin, das in den Lipidvesikeln eingeschlossen war.
Wie in Tabelle I erläutert, ist ein Anstieg der Einkapselungseffektivität proportional einem Anstieg der CHS-Konzentration, jedoch noch wichtiger ist, daß die unter Verwendung von 20 bis 200 mg/ml CHS hergestellten CHS-MLVs eine höhere Einkapselungseffektivität für Inulin zeigten, als die EPC-MLVs, die unter Verwendung der gleichen Konzentration von Phospholipid hergestellt wurden. Tabelle I Vergleich der Einkapselungseffektivitäten von Inulin in Phospholipidvesikeln und in Cholesterol-Hemisuccinatvesikeln Konzentration Lipid (mg/ml) % eingeschlossenes ³H-Inulin a multilamellare Ei-Phosphatidylcholinvesikel b multilamellare Cholesterol-Hemisuccinatvesikel
Um zu bestimmen, ob die Einkapselungseffektivität von CHS-MLVs durch die Zeit beeinflußt wurde, mit der CHS in Kontakt war mit freiem ³H-Inulin in wäßrigen Puffer, wurden die CHS-MLVs wie folgt hergestellt: Entweder 80 oder 300 mg Tris-Salz CHS wurde wirbelnd vermischt in 20 ml 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl-Puffer, enthaltend 10 ul ³H-Inulin (8 x 10&sup9; Bq/mg = 217,0 mCi/mg spezifische Radioaktivität), wodurch CHS-MLVs unter Einsatz einer Konzentration von 40 und 150 mg/ml CHS entsprechend gebildet wurden.
Fünf Proben mit jeweils den beiden Lipidkonzentrationen wurden hergestellt, und die CHS-MLVs-Suspensionen ließ man bei Raumtemperatur in dem 2,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer stehen. Zu den folgenden Zeitintervallen: 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten, wurden die Proben auf 10 ul mit dem gleichen Puffer gebracht. Ein anfängliches 10 ul Aliquotes einer jeden Probe wurde für die Szintillationszählung, wie vorher beschrieben, entfernt. Die Proben wurden anschließend bei 10000 x g für 10 Minuten zentrifugiert, und jedes Pellet wurde viermal in 10 ml Puffer gewaschen. Das End-Pellet wurde in Puffer auf ein Endvolumen von 10 ml suspendiert, und die Radioaktivität eines 10 ul Aliquoten einer jeden Endprobe wurde verglichen mit der Anfangsprobe zum gleichen Zeitpunkt. Die Ergebnisse zeigten keine signifikante Differenz bei der Einkapselungseffektivität für die fünf Zeitpunkte der beiden getesteten Lipidkonzentrationen. Dies bedeutet, daß der Einschluß von etwa 12 % oder 20 % des anfänglichen ³H-Inulin, das zu der Präparation zugegeben worden war, ungeachtet der Kontaktzeit bei 40 oder 150 mg/ml CHS auftrat. Dies zeigt, daß anders als bei üblichen MLVs, hergestellt unter Verwendung von Ei-Phosphatidylcholin, keine "Schwellzeit" bei der Herstellung von CHS-MLVs erforderlich ist.

6.3. Einschluß von Inulin in Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs

Kleine unilamellare Vesikel, bestehend aus Cholesterol-Hemisuccinat (CHS-SUVs), das ³H-Inulin als eingeschlossenes Mittel enthielt, wurden wie folgt hergestellt: 100 ul ³H-Inulin (3,7 x 10&sup7; Bq/ml = 1,0 mCi/ml, New England Nuclear, Boston, MA) wurden gelöst in 2,5 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl, zu dem entweder 100 oder 200 mg Tris-Salz CHS hinzugegeben wurde. Nach wirbelndem Vermischen mit Glasperlen wurde das Gemisch von den Glasperlen in der Pipette abgezogen und bis zur Klarheit beschallt, d. h. für etwa zwei Stunden. Das Aufklaren der Suspension zeigt eine Umwandlung von CHS-MLVs zu kleinen unilamellaren Vesikeln. Die Endkonzentrationen von CHS in den CHS-SUV-Suspensionen betrug entsprechend 40 mg/ml und 80 mg/ml.
Um den Inulineinschluß zu demonstrieren (siehe Abschnitt 5 oben) wurden die CHS-SUVs von dem nichteingeschlossenen Inulln durch Gelfiltration wie folgt abgetrennt: Jede Liposomsuspension wurde separat auf eine Bio-Gel A-15m, 100-200-Mesh-Agarosesäule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) gegeben mit einem Operationsbereich von 40000 bis 15 Millionen Daltons Molekulargewicht, äquilibriert und kalibriert mit 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer. Anschließend wurden die aus der Säule eluierten 1 ml Fraktionen gesammelt, und die Radioaktivität eines 10 ul Aliquoten jeder Fraktion wurde bestimmt, wie vorher beschrieben. Eine klare Trennung des freien vom abgesonderten Inulin wurde erhalten durch Gelfiltration, wodurch der Einschluß des Inulins in den CHS-SUV angezeigt wurde. Diese Analyse zeigte, daß etwa 1 % des Inulins in den CHS-SUVs eingeschlossen war.

6.4. Einschluß von Chromium in Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Multilamellare Cholesterol-Hemisuccinatvesikel mit &sup5;¹Chromium als eingeschlossenes Mittel wurden wie folgt hergestellt: 15,0, 40,0, 65,8, 100,0, 175,0, 263,2, 526,4 oder 658,0 uMol der Tris-Salz CHS wurden zu 5 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl hinzu gegeben, die Spurenmengen von &sup5;¹Chromium (New England Nuclear, Boston, MA) enthielt, und man ließ diese bei Raumtemperatur zwei Stunden stehen, was zu einer Suspension von CHS-MLVs, enthaltend eingeschlossenes &sup5;¹Chromium führte.

6.4.1. Einkapselungseffektivität von Chromium in Cholesterol- Hemisuccinat-MLVs

Um die Einkapselungseffektivität der CHS-MLVs, hergestellt in Abschnitt 6.4., zu bestimmen, wurden Proben jeder Präparation in Dialyseschläuche pipettiert (Thomas Scientific, Katalognr. 3787 - D22, Molekulargewichtsschnitt von 12000 Daltons), die dreimal in destilliertem Wasser gekocht worden waren. Die Proben in den Dialyseschläuchen wurden anfänglich in einem Gammazähler gezählt (TmAnalytic, Modell Nr. 1191). Die Proben wurden dann für 20 Stunden gegen den gleichen 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer in Retentat: Dialysat-Verhältnissen von größer als 1 : 150 dialysiert; das Dialysat wurde für die ersten sechs Stunden alle zwei Stunden geändert. Die Einkapselungseffektivität wurde durch Berechnen des Prozentsatzes der beibehaltenen anfänglichen Zählimpulse bestimmt.
Wie aus Tabelle II zu entnehmen, ist der Anstieg bei der Einkapselungseffektivität proportional zu einem Anstieg bei der CHS-Konzentration, Tabelle II Einkapselungseffektivität von Chromium in Cholesterol-Hemisuccinatvesikeln Konzentration von CHS (uMol) % eingeschlossenes &sup5;¹Chromium

6.4.2. Eingenommenes Volumen in Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs : Chromiumeinschluß und Cholesterol-Hemisuccinat-Konzentration

Das eingenommene Volumen von Cholesterol-Hemisuccinatvesikeln, hergestellt wie in Abschnitt 6.4.1. beschrieben, wurde für jede Konzentration von Cholesterol-Hemisuccinat durch Berechnung des eingenommenen Gelösten nach der folgenden Beziehung bestimmt:
% Einschluß x wäßriges Anfangsvolumen/ uMol CHS
Die in Fig. 1 erläuterten Daten zeigen, daß weniger Chromium/ Mol Lipid eingeschlossen wird, wenn die Konzentration von Tris-Salz CHS ansteigt. Somit wird, obgleich ein Anstieg bei der Einkapselungseffektivität proportional zum Anstieg der Lipidkonzentration ist, das angenommene Gelöste weniger, so wie die Lipidkonzentration fällt. Die Anzahl der Versuche pro Punkt sind in Klammern in der Nähe eines jeden Punktes angezeigt.

6.5. Ultrastruktur von Cholesterol-Hemisuccinatliposomen

Proben für CHS-MLVs und CHS-SUVs, hergestellt unter Verwendung des Tris-Salzes von Cholesterol-Hemisuccinat gemäß der Beschreibung in Abschnitt 6.1. mit Ausnahme des Weglassens von Inulin, wurden für die Gefrier-Ätz-Elektronenmikroskopie präpariert (für das Gefrier-Ätzverfahren siehe Pfenninger et al., 1975, J. Cell Biol. 65 : 15 - 28).
Die Elektronenmikroskopie der CHS-MLV gefriergetrockneten Präparation ließ diskrete Einheiten erkennen, gebunden durch wenigstens eine Lamelle, d. h. Liposomen oder Lipidvesikel. Es gab eine breite Heterogenität der Größe der CHS-MLVs, die im Bereich von 800 bis 10000 nm im Durchmesser lag.
Die größeren Vesikel konnten in einer Anzahl von Klassen eingeordnet werden, einschließlich solche mit einer oder wenigen äußeren Lamellen und solche mit vielen Lamellen. Die meisten der größeren Vesikel hatten im Inneren wesentliche Flächen mit einer genarbten (oder körnigen) Erscheinungsform, was möglicherweise die wäßrigen Kammern anzeigte. In vielen Fällen waren kleine Vesikel oder Gruppen kleiner Vesikel mehr oder weniger frei im Inneren der größeren Vesikel sichtbar, manchmal vier oder fünf Schichten tief. Dieses scheinbare "Einnisten" wird normalerweise bei üblichen Liposomen beobachtet, die mit einem negativ geladenen Phospholipid hergestellt werden.
Hin und wieder können Zonen eng nebeneinander liegender Lamellen beobachtet werden. Dies scheint in jeder Hinsicht den Lamellen üblicher Phospholipid-MLVs ähnlich.
Die überprüften beschallten Proben enthielten auch viele kleine Kügelchen, die im Bereich von 50 nm bis 500 nm lagen. Diese Vesikel sind gegebenenfalls mit SUVs vergleichbar, die durch Beschallung von Phospholipid-MLVs hergestellt wurden. Da sich die kleineren CHS-Vesikel nicht spalten ließen, war es unmöglich, die Struktur des Inneren oder ihre Lamellenkomponenten wahrzunehmen. Bei den CHS-Vesikeln, die durch das 30 nm Filter extrudiert worden waren (zehnmal), wurden Vesikel mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 65 nm beobachtet. Dies steht ein Gegensatz zu den CHS-Vesikeln, hergestellt durch das Verfahren mit der French Press, die extrem klein waren (durchschnittlicher Durchmesser von 25 nm oder weniger).

6.6. Röntgenbeugungsanalyse von Cholesterol-Hemisuccinatliposomen

Die Röntgenbeugung verschiedener CHS-MLV-Präparationen wurde durchgeführt unter Verwendung des zweidimensionalen Intensiv- Röntgendetektors, der anderweitig beschrieben wurde (Gruner, S.M. 1977, PhD thesis, Princeton Universität, Princeton NJ 09540 USA; Reynolds, Geo. T., Milch, J. R. und Gruner, S.M., 1978, Rev. Sci. Instr. 49:1241-1249; Tilcock, C.P.T., Bally, M.B., Farren, S.B., Chullis, P.R. und Gruner, S.M., 1984, Biochem, 23:2696-2703). Röntgenwiederholabstände wurden ausgedrückt als ± 0,05 nm (± 0,5 Å). CHS-Dispersionen wurden in 1,5 mm Röntgen-Glaskapillaren gehalten, die mit Epoxystopfen verschlossen waren. Die proben wurden entweder vorsichtig oder stark hydratisiert. Für die vorsichtige Hydrierung wurde der Puffer über eine Spritze auf den trockenen CHS am Boden der Röntgenkapillare beschichtet. Die Kapillare wurde anschließend flüchtig in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, um Luftbläschen aus der Lipid-Wasserpaste zu entfernen. Die Kapillaren wurden anschließend verschlossen, und man ließ sie für wenigstens vier Stunden bei 5 ºC äquilibieren. Die starke Hydratisierung erfolgte durch Verwirbeln des trockenen CHS mit Puffer, und zwei Mischperlen aus Glas in eine Teströhrchen. Anschließend wurde ein Aliquotes in eine Röntgenkapillare übertragen.
Die Röntgenbeugung zeigte, daß hydratisiertes CM multilamellare Strukturen bildet. Fig. 2 a und 2 b zeigen die schwache Winkelbeugung, die bei den vorsichtig hydratisierten Proben sich ergab, die aus 63,9 % und 59,1 % CHS entsprechend zusammengesetzt waren (% = Gewichtsprozent). Bis zu vier mit gleichen Abständen auftretende Beugungspositionen sind sichtbar, die mit den multilamellaren Anordnungen von 6,81 nm (68,1 Å) und 7,98 nm (79,8 Å), die sich wiederholen, übereinstimmen. Die Positionen waren scharf und gut zu trennen, ein Anzeichen dafür, daß das Gitter nur eine senr geringe Gitterstörung aufwies. Diese konzentrierten CHS-Proben hatten eine gleichmäßige pastenähnliche Erscheinungsform mit keinem sichzbaren überschüssigen Puffer, was in Übereinstimmung mit der Tatsache stand, daß der Wiederholabstand sich in dem Maße erhöhte, wie sich der Wassergehalt erhöhte. Bei sehr hohen wäßrigen Konzentrationen zeigten die vorsichtig hydrierten CHS-Proben ein klar sichtbares Zentrum von überschüssiger Pufferlösung an der Spitze des hydratisierten Lipids. Die Beugung einer solchen Probe (20,2 % CHS des Gesamtgewichts) ist in Fig. 2 c zu sehen. Die Verbreiterung der Beugungspeaks mit größerem Winkel ist ein Anzeichen für eine beträchtliche Unordnung im Gitter. Die Störung im Gitter macht eine definitive Gitterfestlegung schwierig, wenn jedoch eine lamellare Form erzielt wurde, wie in Fig. 2 c angezeigt, betrug die Wiederholung etwa 8,6 nm (86 Å), was auf große wäßrige Abstände zwischen den Lipid-Bilayern schließen läßt.
Wenn anstelle der vorsichtigen Hydratisierung eine 20,7 % CHS- Probe durch Mischen des trockenen Lipids verwirbelnd mit dem Puffer hergestellt wurde, dann hatte die erhaltene Probe ein gleichmäßig milchiges Aussehen. Wie in Fig. 2 d zu sehen, zeigte die Beugung mit kleinem Winkel ein breites Streuband mit wenig Beweiskraft für ein scharf definiertes Gitter. Ein ähnliches Beugungsbild würde von einem multilamellaren System zu erwarten sein, bei dem die interlamellare wäßrige Dicke im breiten Maße variiert. Die Röntgenbeugung der verdünnten CHS- Dispersionen wird am übereinstimmendsten interpretiert, wie es sich bei einem multilamellaren System darstellt, bei dem die interlamellaren Kräfte gering sind. Für andere Lipidsysteme, wie verdünnten Ei-Phosphatidylcholindispersionen, zeigen die Röntgenbeugungsbilder eine scharf definiertes lamellares Gitter, welches auf das Gewicht bezogen, am meisten lipid ist (Rand, 1981 Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 10:277-314). Diese gut definierte Gitterwiederholung ist ein Ergebnis eines relativ scharfen Minimums im Gitterpotential als Funktion der Lipidschichttrennung. Wenn das Potential gegen die Entferungskurve nur eine flache Vertiefung bildet, kann man schwache zwischenlamellare Kräfte erwarten und beträchtliche Gitterstörungen. Dies scheint der Fall bei den CHS-Vesikeln zu sein.
Die Probe von Fig. 2 d hatte einen etwa 8,6 nm (86 Å) Wiederholungsabstand im Vergleich mit dem von 6,81 nm (68,1 Å) von Fig. 2 a. Dies zeigt, daß in Gegenwart von überschüssigem Puffer CHS-Liposomen ein großes Wasser-zu-Lipidverhältnis haben. Ähnliche Ergebnisse werden mit anderen beladenen Lipidsystemen beobachtet (Rand, 1981 siehe oben).

6.7. Elektronenspinresonanz-Analyse von Cholesterol-Hemisuccinatliposomen

Multilamellare Liposomen aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) wurden Spin-markiert und mit ähnlich markierten Tris-Salz CHS-MLVs verglichen, die im wesentlichen wie vorher beschrieben hergestellt wurden. Im Falle von EPC MLVs wurden 1 Molprozent von entweder 5, 7, 9, 10, 12 oder 16 -Doxylstearat (Molecular Probes, Iunction City, OR) zu 40 mg Lipid in Chloroform hinzugegeben, und die erhaltene Lösung zu einem dünnen Film durch Rotationsverdampfung getrocknet. Anschließend wurden 2 ml Tris-HCl-Puffer dazu verwendet, diesen Film zu hydratisieren durch Verwirbeln bis der Film vollständig suspendiert war. Die erhaltenen EPC-MLVs wurden zweimal vor der Spektroskopie gewaschen.
Im Falle von CHS-MLVs wurden 1 Mol-% der entsprechenden Spinmarkierung in Ethanol zu einem dünnen Film auf der Seite eines Teströhrchens getrocknet, zu dem 40 mg Tris-Salz CHS-Pulver und 2 ml Tris-HCl-Puffer hinzugegeben wurden. Diese Suspension wurde verwirbelt und die erhaltenen Liposomen zweimal gewaschen. Alle Elektronenspinresonanz-Experimente wurden mit einem IBM Instruments ER100D ESR-Spektrometer durchgeführt. Das Positionsparameter (S) wurde berechnet wie anderweitig beschrieben (Griffith und Jist in "Spin Labelling", Berliner, L. I. (Hrsg.) Academic press, N.Y. 1976).
Fig. 3 zeigt die Positionsparameterprofile von CHS-MLVs und EPC-MLVs, wie durch Spinmarkierung dieser Präparationen beschrieben mit entweder 5, 6, 7, 9, 10, 12 oder 16-Doxylstearat. Für die EPC-Bilayer fallen die Positionsparameter mit ansteigender Kohlenstoffanzahl in der Bilayer, wie vorher berichtet. Die supramolekulare Struktur von CHS-Bilayern ist bemerkenswert unterschiedlich: nicht nur ist die Bilayer entscheidend fester als die EPC-Bilayer, sondern CHS-Systeme zeigen aktuell ein Anstieg der Position vom 50. zum 90. Kohlenstoff, was auf eine insgesamt unterschiedliche physikalische und chemische Bilayerstruktur hinweist, als das vorher berichtet wurde.

6.8. Isotonisches Anschwellen von Cholesterol-Hemisuccinatliposomen

In der folgenden Reihe von Experimenten wurde das isotonische Anschwellverhalten von Cholesterol-Hemisuccinat und multilamellaren Phospholipidvesikeln verglichen:
(1) CHS-MLVs wurden hergestellt wie in Abschnitt 6.1. beschrieben unter Verwendung von 40 mg Tris-Salz CBS in 2,0 ml 0,01 M Tris-HCl, 0,1 M KCl-Puffer.
(2) EPC-MLVs wurden hergestellt wie in Abschnitt 6.2.1. beschrieben unter Verwendung von 51,8 mg EPC in 2,0 ml 0,01 M Tris-HCl, 0,1 M KCl-Puffer.
(3) Multilamellare Vesikel mit einer Lipid-Bilayer, bestehend aus EPC und Ei-Phosphatidinsäure (EPA), wurden unter Einsatz des Verfahrens, wie es im Abschnitt 6.2.1. für die EPC-MLV- Präparation beschrieben wurde, hergestellt unter Verwendung von 41,1 mg EPC und 9,79 mg EpA in 2,0 ml 0,01 M Tris-HCl, 0,1 M KCl-Puffer. Die erhaltenen MLVs (EPC:EPA-MLVs) bestanden aus EPC:EPA in einem 8:2 molaren Verhältnis.
Nach dem wirbelnden Vermischen wurde jede Suspension der MLVs (d. h. die CHS-MLVs, die EPC-MLVs und die EPC:EPA-MLVs) bei Raumtemperatur zwei Stunden in dem Präparationspuffer stehengelassen. Ein 20 ul Aliquotes jeder Liposompräparation wurde dann zu 1,0 ml einer Reihe von 0,01 M Tris-HCl-Puffern gegeben mit KCl-Konzentrationen im Bereich von 0,055 M biS 0,5 M. Nach der Äquilibrierung für eine halbe Stunde wurde die Lichtstreuung durch Messen der Absorption der Proben bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind grafisch in Fig. 4 erläutert, wobei die Absorption gegen die Umkehr der KCl-Konzentrationen des Mediums aufgetragen ist, dem die Vesikel ausgesetzt sind. Die ansteigende Absorption weist auf ein Anschwellen der Lipidvesikel hin. Die Kurven B und D demonstrieren, daß, wie erwartet, die Phospholipid-MLVs (d. h. EPC-MLVs und EPC:EPA-MLVs) sich als ideale Osmometer zeigten. Die Kurve C zeigt allerdings, daß obgleich CHS-MLVs als geschlossene vesikuläre Strukturen auftreten, sie kein ideales Verhalten in hypo- und hypertonischen Medien zeigen. Dieses Verhalten, wie in Fig. 4 angezeigt, ist vollständig unterschiedlich zu dem bei den Cholesterol-Liposomen von Brockerhoff und Ramsammy (1982, Biochim. Biophys. Acta. 691:227-232) beobachtet.

7. Beispiel: von Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen eingeschlossene gering lösliche Verbindungen

Der Einschluß von Verbindungen, die gering in Wasser löslich sind, in CHS-Liposomen wird für Rinderwachstumshormon, Insulin und Tylosin demonstriert.

7.1. In Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs eingeschlossenes Rinderwachstumshormon

Rinderwachstumshormon (BGH), ein einfaches Protein, das aus einer einzelnen Kette von etwa 191 Aminosäuren besteht, ist teilweise wasserlöslich. Die normale Löslichkeit beträgt 1 bis 1,5 mg/ml bei pH 8,0. BGH fällt in organischen Lösungsmitteln wie Chloroform aus.
Es wurden CHS-MLVs hergestellt, wie in Abschnitt 6.2. beschrieben, unter Verwendung von 27 mg Tris-Salz CHS in 0,01 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,14 M NaCl-puffer. Die CHS-MLV-Präparation wurde bis zur Klarheit beschallt, um beschallte CHS-SUVs zu bilden, und anschließend wurde entweder 5, 10, 15, 25, 30 oder 166 mg BGH (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) hinzugegeben, um Aliquote der beschallten CHS-SUV-Suspension abzutrennen. Die Suspensionen wurden extensiv wirbelnd miteinander vermischt, was zu einer Verteilung des Proteins in den CHS-SUV- Bilayern führte. Die beschallten CHS-SUV-Suspensionen wurden visuell auf Vorhandensein eines Niederschlages nach einem, zwei und 21 Tagen beobachtet. Es wurde kein Niederschlag beobachtet, was ein Anzeichen dafür war, daß das Rinderwachstumshormon in den CHS-Liposomen bei allen Konzentrationen, die für 21 Tage bei Raumtemperatur getestet worden waren, eingeschlossen blieb.

7.2. In Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs eingeschlossenes Insulin

Zink-Insulin, ein Polypeptidhormon, ist, obgleich in verdünnter Säure oder Alkali leicht löslich, in wäßrigen Phasen von pH 4,5 bis 7,0 praktisch unlöslich. In der Tat ist die Tendenz von Insulinlösungen, Makroaggregate zu bilden, ein Hindernis bei der Entwicklung von Langzeit-Insulinabgabesystemen.
Es wurden CHS-MLVs wie in Abschnitt 6.2. beschrieben hergestellt unter Verwendung von 27 mg Tris-Salz CHS in 1,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,14 M NaCl-Puffer. Die CHS-MLV-Präparation wurde bis zur Klarheit beschallt, um beschallte CHS-SUVs zu bilden, und es wurden 47 mg Zink-Insulinpulver (Borine Pancreatic Insulin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zu der CHS-SUV-Suspension hinzugegeben. Die Suspension wurde extensiv wirbelnd vermischt, was zur Verteilung des Insulins in den CHS-SUV-Bilayern führte. Die beschallten CHS-SUVs wurden visuell auf das Vorhandensein eines Niederschlages nach 1, 2 und 21 Tagen beobachtet. Es wurde kein Niederschlag beobachtet was ein Anzeichen dafür war, daß Insulin bei einer Konzentration von 5 mg/ml für wenigstens 21 Tage bei Raumtemperatur eingeschlossen blieb. Der Insulineinschluß trat schneller auf bei 37º C.

7.3. In Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs eingeschlossenes Tylosin

Tylosin ist ein Antibiotikum, das in Wasser bei 25 ºC mit 5 mg/ml löslich ist, und es ist auch in niederen Alkoholen, Estern und Ketonen, chlorierten Kohlenwasserstoffen, Benzen und Ether löslich.
Es wurden kleine unilamellare Vesikel wie folgt hergestellt. 100 mg Tyloson-Base (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) und 200 mg Tris-Salz CHS wurden wirbelnd in 4 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) vermischt. Die erhaltene milchige Suspension von CHS-MLVs wurde mit einem Sondenspitzenbeschallungsgerät für 15 Minuten beschallt. (Als Vorsichtsmaßnahme wurde ein Eisbad um das Teströhrchen herum angeordnet, um die Temperatur des Gemisches niedrig zu halten). Das Gemisch wurde anschließend in ein Badbeschallungsgerät für eine Stunde und 45 Minuten eingebracht.
Nach einer zweistündigen Beschallungsperiode wurde das in die CHS-SUV eingeschlossene Tylosin aus der Suspension durch Zentrifugierung der Suspension bei 10000 x g nach 10 Minuten abgetrennt, wobei sich ein kleines Pellet bildete und ein opaleszierendes Überstehendes. Die beschallten CHS-SUVs in dem überstehenden wurden visuell mit einer Suspension von 100 mg Tylosin-Base (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) verglichen, die zu dem gleichen Volumen Wasser gegeben wurde. In der Suspension von Tylosin-Base bildete sich ein Niederschlag, wohingegen sich in der CHS-SUV-Tylosinpräparation kein Niederschlag bildete. Somit blieb das Tylosin für wenigstens 48 Stunden eingeschlossen.

8. Beispiel: Verwendung von Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen zum Einschluß von Lipid-löslichen Verbindungen

Der Einschluß von Lipid-löslichen bioaktiven Mitteln wurde für Indomethacin und Diazepam dargelegt.

8.1. In Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs eingeschlossenes Indomethacin

Indomethacin, ein Prostaglandininhibitor, ist in Wasser praktisch unlöslich. Die freie Säure von Indomethacin ist löslich in Ethanol, Ether, Aceton und in Rizinusöl.
CHS-MLVs, die verschiedene Mengen von Indomethacin als bioaktives Mittel enthielten, wurden wie folgt hergestellt: In einem Rundkolben wurden 27 mg Tris-Salz CHS, 1 bis 5 mg Indomethacin und 10 ul ¹&sup4;C-Indomethacin (8,1 x 10&sup8; Bq/mMol = 22,0 mCi/mMol, New England Nuclear, Boston, NA) vereinigt. Es wurde ausreichend Methanol hinzugegeben, um alle Komponenten zu lösen. Das Gemisch wurde anschließend rotationsverdampft, um einen dünnen Film auf dem Behälter zu bilden und im Vakuum über Nacht getrocknet, um das gesamte Methanol zu entfernen. Die CHS-MLVs wurden gebildet durch Zugabe von 1,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer zu jedem Kolben. Die Suspensionen wurden wirbelnd mit Glasperlen vermischt, und man ließ sie für zwei Stunden ungestört stehen.
Nach zwei Stunden wurde die relative Menge in den CHS-MLVs eingeschlossenen Indomethacin wie folgt bestimmt: 9,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer wurde zu jeder Probe hinzugegeben und das Gemisch wurde für 10 bis 20 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde dreimal gewaschen in 10 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer und anschließend in einem Endvolumen von 1,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer suspendieit. Es wurde ein "Standard" in gleicher Weise wie die Proben hergestellt, mit Ausnahme dessen, daß nur Isotopen-markiertes Indomethacin zu dem Anfangsgemisch gegeben wurde (d. h. die 1 bis 5 mg Indomethacin wurden in der CHS-MLV-Standardpräparation weggelassen). Es wurde die Radioaktivität, die in abfiltrierten 20 ul Aliquoten von jeder Probe vorhanden war, in 10 ml Szintillationsflüssigkeit gezählt. Der Vergleich des "Standards" mit den Proben, ale verschiedene Konzentrationen von Indomethacin enthielten, gestattete die Bestimmung des Prozentsatzes an eingeschlossenem Indomethacin. Die Ergebnisse sind In Tabelle III aufgeführt. Tabelle III Einschluß von Indomethacin in CHS-MLVs Konzentration Indomethacin (mg/ml) % ¹&sup4;C-Indomethacin, eingeschlossen in CHS-MLVs
Die Ergebnisse zeigen, daß bis zu 78 % des Indomethacins in CHS-MLVs eingeschlossen werden kann.

8.1.2. Ultrastruktur von Cholesterol-Hemisuccinatvesikeln die Indomethacin enthalten

Um zu bestimmen, ob das eingeschlossene Indomethacin die Membranvesikel verändert, wurden die in Gegenwart von Indomethacin hergestellten CHS-MLVs (siehe Abschnitt 8.1.1.) wie vorher beschrieben der Gefrier-Ätz-Elektronenmikroskopie unterzogen. Bei der Gefrier-Ätz-Elektronenmikroskopie waren unter geringer Vergrößerung die "leeren" CHS-MLVs schwer von denen unterscheidbar, in denen Indomethacin eingeschlossen war. Das liegt daran, daß es kein offensichtliches Merkmal gibt, mit dem man das eine vom anderen eindeutig unterscheiden kann. Bei größeren Vergrößerungen ist allerdings die "Bilayer" der Indomethacin enthaltenden CHS-MLVs unterscheidbar. Da Indomethacin ein wasserunlösliches Arzneimittel ist und in Ethanol, Ether, Aceton und anderen nicht polaren Lösungsmitteln löslich ist, kann erwartet werden, daß Indomethacin in Anwesenheit von Lipiden sich so anordnen würde, daß es von dem Wasser abgesondert wird. Die durch Elektronenmikroskopie erfolgte Untersuchung der Bilayer zeigte, daß die Dicke der Bilayer beim Querbruch variiert. Dies läßt darauf schließen, daß Indomethacin tatsächlich in dem Lipidteil der Bilayer verteilt war, so daß es erscheint, als gäbe es eine zusätzliche Dicke und eine sehr ungleichmäßige Konfiguration; das heißt, die Dicke variiert wenn man einer Bilayer entlang einer Bruchlinie folgt. Dieser Effekt ist vermutlich ein besonderer für solche Arzneimittel, deren Löslichkeiten so sind, daß sie sich in dem Lipidteil der Bilayer absondern.

8.2. In Cholesterol-Hemisuccinat-SIVs eingeschlossenes Diazepam

Diazepam, ein Sedativum oder Tranquillizer (d.i. Valium), ist in Chlorform, Dimethylformamid, Benzen, Aceton und Alkohol löslich; es ist nur schwach löslich in Wasser.
Diazepam enthaltende CHS-SUVs wurden wie folgt hergestellt: 2, 3, 4 oder 5 mg Diazepam wurden in ein Teströhrchen gegeben, enthaltend 5 ul H-Diazepam (2,8 x 10¹² Bq/mMol = 76,7 Ci/mMol, New England Nuclear, Boston, MA). Es wurde ausreichend Methanol zu jedem Röhrchen hinzugegeben, um das Arzneimittel zu lösen (Maximum 2 ml Methanol). Das Gemisch wurde anschließend zu einem dünnen Film rotationsverdampft, und es wurde über Nacht unter Vakuum getrocknet, um die Entfernung des gesamten Methanols zu gewährleisten. Der getrocknete Film wurde resuspendiert in 1 ml einer Suspension von beschalltem CMS-SUVs (hergestellt wie unten beschrieben unter Verwendung von 50, 100 oder 200 mg/ml CHS), wirbelnd unter Verwendung von Glasperlen vermischt und filtriert unter Einsatz eines 0,22 um Millipore-Filters (Millipore Corp., New York, NY).
Die CHS-SUVs wurden nach dem folgenden Ablauf hergestellt: 50, 100 oder 200 mg Tris-Salz CHS wurde wirbelnd vermischt mit 1,0 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer. Unter Einsatz eines Sondenbeschallungsgerätes wurde das Gemisch bis zu einer optischen Dichte von etwa 0,40 beschallt, gemessen bei einer Wellenlänge von 550 nm (d.i. eine "klare" Lösung, und anschließend bei 1000 x g zentrifugiert, um irgendwelches Titanium zu entfernen, das von der Spitze der Beschallungssonde gegebenenfalls abgegeben wurde. Die Suspension von CHS-SUVs wurde dann aus dem Röhrchen abdekantiert.
Die relative Menge an Diazepam, die durch die beschallten CHS- SUVs eingeschlossen werden konnten, wurde durch Vergleich der Proben mit einer "Standard"-Präparation bestimmt. Die "Standard"-Präparation wurde in gleicher Weise wie die Proben hergestellt, mit Ausnahme dessen, daß nur strahlenmarkiertes Diazepam hinzugegeben wurde (d. h. die 2 bis 5 mg Diazepam wurde aus der CHS-SUV-Standardpräparation weggelassen). In beiden Fällen wurde die in 10 ul Aliquoten der filtrierten Suspensionen enthaltene Radioaktivität in 10 ml Szintillationsflüssigkeit gezählt. Die Ergebnisse sind In Tabelle IV aufgeführt. Tabelle IV Einschuß von Diazepam in beschallten CHS-Vesikeln Konzentration Diazepam (mg/ml) % eingeschlossenes ³H-Diazepam Konzentration CHS (mg/ml)
Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl 100 als auch 200 mg/ml CHS 100 % der höchsten Konzentration von eingesetztem Diazepam (5 mg/ml) einschlossen. Da sowohl 100 als auch 200 mg/ml CHS ausreichend das Diazepam einschlossen, sind die 100 mg/ml eine idealere Konzentration von CHS für den Einschluß von Diazepam.

9. Beispiel: Verwendung von Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen zur Bestimmung von Aminoglycosid-Konzentration in Serum

Es wurde beobachtet, daß eine relativ geringe Konzentration an CHS-Vesikeln (weniger als 1 ug/ml CHS) in starkem Maße rote Blutzellen (RBC) aus einer Suspension in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) agglutinierten. Da die CHS-Vesikel durch Ca&spplus;&spplus; und andere Kationen wie Aminoglycosid-Antibiotika ausgefällt werden, können die CHS-Vesikel dazu eingesetzt werden, die Konzentration von Aminoglycosid-Antibiotika in Seren zu bestimmen durch:
(a) Bestimmung der Verdünnung von Antibiotikum enthaltendem Serum, bei dem eine feste Menge an CHS-Vesikeln ausgefällt wird;
(b) Bestimmung durch Hämagglutinations-Titration der verbleibenden freien Vesikel, die nach Zugabe des Antibiotikum-enthaltenden Serums nicht ausgefällt wurden.
In beiden Situationen konnte die genaue Menge von Antibiotikum festgestellt werden unter Einsatz eines Vergleichs mit einer Standardkurve, die aus bekannten Konzentrationen des Antibiotikums abgeleitet wurde. Die Grundexperimente sind unten beschrieben:
Es wurden entsprechend 24 ul Gentamycin-Sulfat in PBS (1 mg/- ml) seriell im Serum verdünnt (d. h. 25 ul Aliquote des Serums). Anschließend wurde ein 24 ul Aliquotes von CHS-unilamellaren Vesikeln, hergestellt durch Beschallung von Tris-Salz CHS bei einer Konzentration von 25 mg/ml in 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer bei pH 7,4, zu jeder Probe hinzu gegeben.
Nach etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Trübung eines jeden Gemisches aufgezeichnet. Nur Gemische, die 50 ug oder mehr Gentamycin enthielten, zeigten eine sichtbare Fällung, als Anzeichen dafür, daß die CHS-Vesikel mit dem Gentamycin zusammenwirken.
Als nächstes wurde das ausgefällte Material pelletisiert, und das Überstehende wurde dazu verwendet, die Konzentration der CHS-SUVs durch Hämagglutination von roten Blutzellen von Hühnern zu bestimmen. Die Hämagglutinations-Assay erfolgte in 96 U-förmigen Mikrovertiefungsplatten durch serielles Verdünnen der Vesikelsuspensionen auf 50 ul PBS und anschließendes Zugeben in jede Vertiefung von 40 ul 0,5 % RBC in PBS. Nach 60 Minuten bei 4 ºC wurde mit einem Umkehrspiegel Hämagglutination beobachtet. Die Kontrolle (RBC in Abwesenheit von CHS- Vesikeln) zeigte keine Hämagglutination. Alle CHS enthaltende Proben hämagglutinierten stark das RBC mit Ausnahme jener, die im vorherigen Experiment trübe waren. Dieses Ergebnis zeigt, daß CHS-Vesikel mit Gentamycin zusammenwirken, so daß relativ wenige Vesikel für die Hämagglutination zur Verfügung standen im Vergleich mit der Kontrollsuspension, die nur CHS enthielt.

10. Beispiel: in vivo-Verabreichung von Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen

Die folgenden Unterabschnitte beschreiben Verfahren und Zusammensetzungen für die in vivo-Verabreichung von bioaktiven Mitteln unter Verwendung von Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen der vorliegenden Erfindung. Die klinische Effektivität der eingeschlossenen bioaktiven Mittel wird bestimmt, und die Arzneimittelverteilung innerhalb ausgewählter Organe wird verfolgt, wo es geeignet ist.

10.1. Behandlung von Gelenkarthritis unter Verwendung von Indomethacin, eingeschlossen in Cholesterol-Hemisuccinat-Liposomen-MLVs

Männliche weiße Neuseelandkaninchen (2 bis 2,5 kg) wurden intradermal immunisiert, und zwar zweimal in zweiwöchigen Abständen, mit 1 ml 20 mg/ml Rinder-Serumalbumin (BSA) (Miles Laboratories, Elkhart, IN), emulgiert in komplettem Freund's Adjuvans. In der dritten Woche erhielten die Kaninchen eine einzelne intraartikuläre Injektion von 10 mg BSA in 1,0 ml Salzlösung in das rechte Kniegelenk, um Gelenkarthritis hervorzurufen. Die linken Kniegelenke dienten als Kontrolle. Der Durchmesser der Gelenke wurde unter Verwendung eines Fowler Skalentasters gemessen, der bis auf 0,01 mm empfindlich war. Die BSA- injizierten Gelenke schwollen an und zeigten sich bei der Messung normalerweise um 3 bis 5 mm größer als die Kontrollgelenke. In der vierten Woche erhielten die Kaninchen eine andere intraartikuläre Injektion von BSA in Salzlösung, um die Gelenksentzündung hervorzurufen.
CHS-MLVs wurden wie in Abschnitt 8.1. beschrieben hergestellt unter Verwendung von 270,0 mg CHS und 10 mg Indomethacin, was zu einer Endkonzentration von 1,0 mg/ml Indomethacin führte. Drei Tage nach Hervorrufen der Entzündung erhielten die BAS- injizierten Tiere eine einzelne intramuskuläre Injektion von 1 mg/ml Indomethacin, das in CHS-Vesikeln eingeschlossen war (Gesamtdosis 1 mg/Tier). Die Gelenksschwellung wurde für weitere 10 Tage gemessen.
Die Ergebnisse sind grafisch in Fig. 5 erläutert und zeigen, daß das in CHS-MLVs eingeschlossene Indomethacin wirksam bei der Reduzierung der Gelenksachwellung war, wenn es intramuskulär verabreicht wird.

10.2. In vivo-Verabreichung von Diazepam, eingeschlossen in Cholesterol-Hemisuccinat-SUVs

Mäuse wurden intravenös oder intramuskulär mit 500 ug/kg Körpergewicht Diazepam geimpft, das CHS-SUVs eingeschlossen war, die wie in Abschnitt 8.2. beschrieben hergestellt worden waren. Das Diazepam hatte einen sedativen Effekt auf die Mäuse (die Mäuse fielen nach dem Impfen in einen Schlaf), was ein Anzeichen der Retention der Aktivität des eingeschlossenen Arzneimittels ist.

10.2.1. Organverteilung nach intravenöser Impfung

CHS-SUVs, enthaltend eingeschlossenes Diazepam, wurden wie in Abschnitt 8.2. beschrieben hergestellt. Nach der Beschallung in einem Bad-Beschallungsgerät wurde die Absorption der Suspension bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Sie betrug 0,370. Anschließend wurde ein 44,2 ul Aliquotes der CHS-SUV- Suspension in ein Glas-Teströhrchen gegeben, auf dem 1,48 x 10&sup4; Bg (40 uCi) ¹&sup4;C-Diazepam (spezifische Aktivität gleich 6,7 x 10&sup6; Bq)mg = 181 uCi/mg, zugeführt als 3,7 x 10&sup6; Bq/ml = 100uCi/ml in Ethanol) unter Stickstoff herunter getrocknet worden war. Nach wirbelndem Vermischen für 5 Minuten wurden 1,282 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl-Puffer zu der Lösung hinzugegeben. Das führte zu einer 30fachen Verdünnung der Suspension, was wiederum eine therapeutische Dosis für die Maus von 0,167 mg/pl Diazepam ergab.
Ein 0,1 ml Aliquotes der CHS-SUV-¹&sup4;C-Diazepam-Suspension wurde in die Schwanzvene von Wachen, gefangenen 35 mg Swiss-Webster- Mäusen injiziert. Die Kontrollmäuse wurden in ähnlicher Weise mit einer äquivalenten Dosis von nicht-eingeschlossenem ¹&sup4;C- Diazepam geimpft. Nach 1, 2 oder 5 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch Nackenverrenkung getötet, und die inne ran Organe (Niere, Lunge, Milz, Leber, Darm, Gehirn, Herz, Magen und Fett) entfernt und Blutproben wurden genommen. Die Organe wurden gewogen und eine kleine Probe (20 bis 40 ug) von jedem wurde digeriert und entfärbt nach der Methode von Mahim und Kohberg (1966, Analytical Biochem. 16:500). Die Proben wurden anschließend Dunkelheits-angepaßt für 5 Tage, um die Chemilumineszens abnehmen zu lassen, bevor die Radioaktivität gemessen wurde.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 6 gezeigt. Bei den Mäusen, die mit dem in CHS-SUV eingeschlossenen Diazepam geimpft wurden, reicherte sich das Arzneimittel nicht in der Milz an, was ein Zeichen dafür ist, daß das in CHS-SUVs eingeschlossene Diazepam sich nicht wie Arzneimittel verhielt, die in Phospholipidliposomen eingeschlossen waren, wenn es intravenös in vivo verabreicht wurde.

10.3. in vivo-Verabreichung von Chromium, eingeschlossen in Cholesterol-Hemisuccinat-MLVs

Um zu bestimmen, ob CHS-Vesikel intakt bleiben, wenn sie in vivo verabreicht werden, wurde die Organverteilung eines freien wäßrigen Markierungsmittels bestimmt im Vergleich zu dem des in CHS-Vesikeln eingeschlossenen wäßrigen Markierungsmittels nach intravenöser Injektion bei Mäusen. Zu diesem Zweck wurde die Organverteilung von nicht eingeschlossenem &sup5;¹Chromium (&sup5;¹Cr), in CHS-MLVs eingeschlossenem &sup5;¹Chromium und in Phospholipidvesikeln eingeschlossenem &sup5;¹Chromium verglichen. Die folgenden Abläufe waren wie folgt:
(a) unverkapseltes &sup5;¹Cr &sup5;¹Cr. wurde als &sup5;¹CrO&sub2; = in steriler 0,9 % Salzlösung (New England Nuclear, Newton MA) angewandt. Das freie &sup5;¹Cr-Injektat wurde hergestellt durch Verdünnung von 100 ul &sup5;¹Cr in 0,9 % Salzlösung auf 1,5 ml Gesamtvolumen mit 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl, 5 % Dextrose. Sechzehn 40 g männliche Swiss-Webster-Mäuse erhielten jeweils 0,1 ml (etwa 700000 cpm) intravenöse Injektion über die Schwanzvene.
(b) &sup5;¹Cr in CHS-MLVs wurden hergestellt durch Lösen von trockenem Tris-Salz CHS-Pulver in 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl, 5 % Dextrose, enthaltend eine Spurenmenge von &sup5;¹Cr (CrO&sub2; = in steriler 0,9 % Salzlösung). Das Gemisch wurde wirbelnd vermischt und anschließend kurz für 30 Minuten beschallt. Nach dem Pelletisieren durch Zentrifugieren und dreimaligem Waschen, wie vorher beschrieben, wurde das End-Pellet resuspendiert auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml CHS und auf einen Durchmesser von 1 Mikrometer dimensioniert mittels Nicomp quasielastischer Lichtstreuungsanalyse. Zwölf 40 g männliche Swiss- Webster-Mäuse erhielten jeweils 0,1 ml (etwa 120000 cpm) intravenöse Injektion über die Schwanzvene.
(c) &sup5;¹Cr in EPC-SPLVs wurden hergestellt durch das im Detail in der gleichfalls anhängigen Anmeldung Serial Nr. 476496 beschriebenen Anmeldung, eingereicht am 24. März 1983 durch Lenk et al., betitelt mit "Stabile Mehrfach-lamellare Vesikel, ihre Herstellung und Verwendung", die durch Bezugnahme hier engeschlossen wird. Zu diesem Zweck wurden 5 ml Mengen hergestellt durch Lösen von 65 mg Ei-Phosphatidylcholin (EPC) in Chloroform und Heruntertrocknen des EPC bis zur Bildung eines Filmes. Der Film wurde resuspendiert in 10 ml Ether, und es wurden 0,3 ml &sup5;¹CrO&sub2;= in 0,9 % Salzlösung (pH 8) hinzu gegeben. Das Gemisch wurde anschließend durch Beschallung emulgiert, während gleichzeitig der Ether unter N&sub2;-Gas abgedampft wurde. Die erhaltenen stabilen plurilamellaren Vesikel (SPLVs) wurden resuspendiert in 5 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl, 5 % Dextrose, und durch Zentrifugieren pelletiert. Das Pellet wurde dreimal gewaschen, um das nicht eingeschlossene &sup5;¹Cromium zu entfernen, und das End-Pellet wurde resuspendiert in 5 ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,3), 0,14 M NaCl, 5 % Dextrose. Die Endkonzentration von EPC betrug 13 mg/ml. Zwölf 40 g männliche Swiss Webster Mäuse erhielten jeweils 0,1 ml (etwa 100000 cpm) intravenöse Injektion über die Schwanzvene.
Am Ende von 1, 2, 5 und 24 Stunden wurden drei Mäuse aus jeder Gruppe mit einer Liposompräparation behandelt, und vier Mäuse aus der mit nichteingeschlossenem &sup5;¹Cromium behandelten Gruppe wurden durch Nackenverrenkung getötet. Die Organe wurden entfernt, mit 0,9 % Salzlösung gespült, gewogen und wie vorher beschrieben Impuls-gezählt, um die %-Dosis und %-Dosis/Gramm, die in jedem getesteten Organ verblieb, zu bestimmen.
Die in Fig. 7 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, daß nichtverkapseltes Chromium (siehe Fig. 7 C) schnell ausgeschieden wird und sich nicht in einem der untersuchten Organe konzentriert. EPC- und CHS-verkapseltes Chromium verbleibt mit meßbaren Mengen 24 Stunden nach der Injektion darin, was als Anzeichen dafür anzusehen ist, daß CHS-Vesikel, ähnlich wie EPC-SPLVs, in vivo intakt bleiben. Darüberhinaus reichern sich EPC-SPLVs (13 mg/ml), die einen mittleren Durchmesser zwischen 0,5 und 1,0 Mikrometer haben, in der Leber, der Lunge und der Milz an (siehe Fig. 7 B); d. h. das typische Bild der Liposomenverteilung. Äquimolare CHS-Vesikel reichern sich primär in der Leber an, und zu einem wesentlich größeren Gehalt in der Lunge und in der Milz (siehe Fig. 7 A). Dies zeigt einen Unterschied im Verteilungsbild der beiden Liposomenpräparationen in vivo an.

10.4. in vivo-Verabreichung von menschlichem Wachstumshormon, eingeschlossen in Cholesterol-Hemisucclnat-MLVs

CHS-multilamellare Vesikel, die ¹²&sup5;I-menschliches Wachstumshormon (HGH, New England Nuclear, Boston, MA) einschlossen, wurden wie folgt hergestellt: Tris-Salz CHS wurde zu 0,01 M Tris-HCl 0,14 M NaCl-Puffer (pH 7,4) gegeben, enthaltend 3,7 x 10&sup4; Bq/ml (1 uCi/ml) ¹²&sup5;I-HGH (New England Nuclear, Boston, MA), um eine Endkonzentration von 25 mg/ml Tris-Salz CMS zu erhalten. Die Suspension wurde wirbelnd mit Glasperlen vermischt. Die erhaltenen CHS-MLVs schlossen 10 % des ¹²&sup5;I-HGH ein, wie durch Vergleich mit den anfänglichen radioaktiven Zählimpulsen bestimmt.
Eine Gruppe von zwölf weiblichen Swiss-Webster-Mäusen wurde intramuskulär in die hintere Extremität mit 0,5 ml CHS-MLV, die ¹²&sup5;I-HGH-Suspension eingeschlossen enthielten, injiziert. Eine Kontrollgruppe von 12 Mäusen wurde mit 0,5 ml freiem ¹²&sup5;I-HGH in 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl-Puffer injiziert. Jedes Tier in beiden Gruppen erhielt etwa 35000 cpm/Tier. In periodischen Intervallen nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, die hintere Extremität dissektiert und der Prozentsatz der verbliebenen Gesamtradioaktivität bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle V zeigen einen wesentlichen Anstieg bei der Retention von ¹²&sup5;I-HGH, wenn es in CHS-NLVs eingeschlossen ist. Somit werden bei intramuskulärer Injektion das in CHS- Liposomen eingeschlossene Arzneimittel in verzögerter Weise freigesetzt. Tabelle V Retention von verabreichtem MLV-eingeschlossenem ¹²&sup5;I-Human-Wachstumshormon % verbliebene Radioaktivität in Hinterpfote Inoculum Zeit (Stunden) (N = 12 Tiere) Kontrollea ¹²&sup5;I-HGH ¹²&sup5;-I-HGH in CHS-Vesikelnb a Tiere erhielten 0,5 ml ¹²&sup5;I-Human-Wachstumshormon in 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl. b Tiere erhielten 0,5 ml ¹²&sup5;I-Human-Wachstumshormon in CHS-Vesikeln (25 mg/ml CHS) in 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl.

Claims

1. Steroid-Liposome, die vollständig geschlossene Doppelschichten umfassen, im wesentlichen umfassend eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins.

2. Steroid-Liposome nach Anspruch 1, worin die Doppelschichten eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins umfassen.

3. Steroid-Liposome nach Anspruch 2, worin die Doppelschichten eine 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-, 2-Aminoethanol-, eine Bis-tris- propan- oder eine Triethanolamin-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins umfassen.

4. Steroid-Liposome nach Anspruch 1, worin sich das Salz von einem ionisierbaren bioaktiven Mittel ableitet.

5. Steroid-Liposome nach Anspruch 4, worin das ionisierbare bioaktive Mittel eine Antifungus-Verbindung umfaßt.

6. Steroid-Liposome nach Anspruch 5, worin das Antifungus-Mittel Miconazol umfaßt.

7. Steroid-Liposome nach Anspruch 1, worin die Doppelschichten eine Salzform eines organischen Säurederivats von Cholesterin umfassen.

8. Steroid-Liposome nach Anspruch 1, worin die Doppelschichten eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzform eines Hemisuccinat- Derivats von Cholesterin umfassen.

9. Steroid-Liposome, umfassend eine Verbindung, eingeschlossen in ein Liposom, dessen Doppelschichten eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins umfassen.

10. Steroid-Liposome nach Anspruch 9, worin die Doppelschichten eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins umfassen.

11. Steroid-Liposome nach Anspruch 9, worin die Doppelschichten eine Salzform eines Carbonsäurederivats eines Sterins, eine Salzform eines Dicarbonsäurederivats eines Sterins, eine Salzform eines Polycarbonsäurederivats eines Sterins, eine Salzform eines Hydroxycarbonsäurederivats eines Sterins, eine Salzform eines Aminosäurederivats eines Sterins oder eine Salzform eines Poly- (aminosäure)-derivats eines Sterins umfassen.

12. Steroid-Liposome nach Anspruch 11, worin die Dicarbonsäure eine aliphatische Dicarbonsäure mit bis zu sieben Kohlenstoffatomen umfaßt.

13. Steroid-Liposome nach Anspruch 12, worin die aliphatische Dicarbonsäure Bernsteinsäure ist.

14. Steroid-Liposome nach Anspruch 9, worin die Doppelschichten eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Cholesterins, eines Vitamin D, eines Phytosterins oder eines Steroid-Hormons umfassen.

15. Steroid-Liposome nach Anspruch 9, worin die Verbindung ein bioaktives Mittel umfaßt.

16. Steroid-Liposome nach Anspruch 9, worin die Doppelschichten die Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzform eines Hemisuccinat-Derivats von Cholesterin umfaßt.

17. Steroid-Liposome nach Anspruch 16, worin die Liposome multilamellare Vesikel umfassen.

18. Steroid-Liposome nach Anspruch 16, worin die Liposome unilamellare Vesikel umfassen.

19. Steroid-Liposome nach Anspruch 16, worin die Verbindung ein bioaktives Mittel umfaßt.

20. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel eine antibakterielle Verbindung umfaßt.

21. Steroid-Liposome nach Anspruch 20, worin die antibakterielle Verbindung Tylosin umfaßt.

22. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel eine Antifungus-Verbindung umfaßt.

23. Steroid-Liposome nach Anspruch 22, worin die Antifungus-Verbindung Miconazol umfaßt.

24. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel ein Wachstumshormon umfaßt.

25. Steroid-Liposome nach Anspruch 24, worin das Wachstumshormon ein Rinder-Wachstumshormon umfaßt.

26. Steroid-Liposome nach Anspruch 24, worin das Wachstumshormon menschliches Wachstumshormon umfaßt.

27. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel Insulin umfaßt.

28. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel Immunglobulin umfaßt.

29. Steroid-Liposome nach Anspruch 9, worin die Verbindung einen Farbstoff umfaßt.

30. Steroid-Liposome nach Anspruch 29, worin der Farbstoff Arsenazo III umfaßt.

31. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel eine anti-inflammatorische Verbindung umfaßt.

32. Steroid-Liposome nach Anspruch 31, worin das bioaktive Mittel Indomethacin umfaßt.

33. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel ein psychoaktives oder anxiolytisches Mittel umfaßt.

34. Steroid-Liposome nach Anspruch 33, worin das bioaktive Mittel Diazepam umfaßt.

35. Steroid-Liposome nach Anspruch 19, worin das bioaktive Mittel ein Vitamin umfaßt.

36. Steroid-Liposome nach Anspruch 35, worin das Vitamin α-Tocopherol umfaßt.

37. Verfahren zur Herstellung von Sterin-Liposomen, umfassend den Zusatz einer Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins, das geeignet ist, geschlossene Doppelschichten in einer ausreichenden Menge zur BiLdung von vollständig geschlossenen Vesikeln zu bilden, zu einer wäßrigen Phase, und Schütteln des Gemischs, bis eine Suspension multilamellarer Vesikel gebildet ist.

38. Verfahren nach Anspruch 37, das darüber hinaus die Schallbehandlung der Suspension unter Bildung einer Suspension von multilamellaren Vesikeln umfaßt.

39. Verfahren nach Anspruch 37, worin die Doppelschichten eine Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins umfassen.

40. Verfahren nach Anspruch 37, worin die Doppelschichten eine 2-Amino- 2-methyl-1,3-propandiol-, eine 2-Amino-ethanol-, eine Bis-tris- propan- oder eine Triethanolamin-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins umfassen.

41. Verfahren nach Anspruch 37, worin die Doppelschicht eine Salzform einer Antifungus-Verbindung eines organischen Säurederivats eines Sterins umfaßt.

42. Verfahren nach Anspruch 41, worin das organische Säurederivat Succinat umfaßt.

43. Verfahren nach Anspruch 42, worin das Sterin Cholesterin umfaßt.

44. Verfahren nach Anspruch 37, worin sich das Salz von einem ionisierbaren bioaktiven Mittel ableitet.

45. Verfahren nach Anspruch 37, worin die Doppelschichten eine Miconazol- Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterins umfassen.

46. Verfahren nach Anspruch 45, worin das organische Säurederivat Succinat umfaßt.

47. Verfahren nach Anspruch 46, worin das Sterin Cholesterin umfaßt.

48. Verfahren nach Anspruch 37, worin das organische Säurederivat Succinat umfaßt.

49. Verfahren nach Anspruch 37, worin die Doppelschichten eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Cholesterins umfassen.

50. Verfahren nach Anspruch 37, worin die Doppelschichten die Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan-Salzform eines Hemisuccinatderivats von Cholesterin umfassen.

51. Verfahren nach Anspruch 50, worin die wäßrige Phase im wesentlichen frei von zweiwertigen Kationen ist.

52. Verfahren nach Anspruch 51, worin das Cholesterin-hemisuccinat in einem Bereich von etwa 4,5 mg bis etwa 200 mg pro ml wäßriger Phase vorhanden ist.

53. Verfahren nach Anspruch 50, das darüber hinaus den Zusatz eines Tris-Salzes zu der wäßrigen Phase umfaßt.

54. Verfahren nach Anspruch 37, das darüber hinaus den Zusatz einer in die Sterin-Vesikel einzuschließenden Verbindung zur wäßrigen Phase umfaßt.

55. Verfahren zum Einschluß einer wasserunlöslichen Verbindung in Sterin- Vesikel nach einem der Ansprüche 1 bis 36, umfassend:

(a) das Auflösen der wasserunlöslichen Verbindung in einem organischen Lösungsmittel;

(b) die Entfernung des organischen Lösungsmittels, wobei ein Film zurückbleibt, der die wasserunlösliche Verbindung umfaßt; und

(c) den Zusatz einer Suspension von mulilamellaren Vesikeln oder unilamellaren Vesikeln.

56. Verfahren zum Einschluß einer wasserunlöslichen Verbindung in Sterin- Vesikel nach einem der Ansprüche 1 bis 36, umfassend:

(a) das gemeinsame Auflösen in einem organischen Lösungsmittel von der wasserunlöslichen Verbindung und einer Salzform eines organischen Säurederivats von Sterin, geeignet zur Bildung von Doppelschichen in einer wäßrigen Phase;

(b) das Verdampfen des organischen Lösungsmittels, wobei ein Film zurückbleibt, der die Verbindung und die Salzform des organischen Derivats eines Sterins umfaßt; und

(c) den Zusatz einer wäßrigen Phase zu dem Film und das Schütteln unter Bildung einer Suspension von vollständig multilamellaren Vesikeln.

57. Verfahren nach Anspruch 56, das darüber hinaus die Schallbehandlung der Suspension zur BiLdung unilamellarer Vesikel umfaßt.

58. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens die Steroid- Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 36.

59. Zusammensetzung, umfassend das Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salz von Cholesteryl-hemisuccinat und eine Antifungus-Verbindung, nach Anspruch 58.

60. Zusammensetzung nach Anspruch 59, worin die Antifungus-Verbindung Miconazol umfaßt.

61. Creme, umfassend eine Zusammensetzung nach den Ansprüchen 59 und 60.

62. Suppositorium, umfassend eine Zusammensetzung nach den Ansprüchen 59 oder 60.

63. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend das Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan-Salz von Cholesteryl-hemisuccinat und ein Peptid.

64. Zusammensetzung nach Anspruch 63, worin das Peptid hydrophob ist.