JP3032004B2 - 標的化リポソーム及びリポソーム―蛋白質カップリング方法 - Google Patents

標的化リポソーム及びリポソーム―蛋白質カップリング方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、例えばＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）−ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン（MP
B−PE）及び関連組成物を含む実質的に純粋な反応性脂
質を合成する方法に関するものである。本発明の組成物
は、カップリング剤として有用であり、リポソーム内に
取り込み、次いで蛋白質、補因子及び多数の他の分子と
結合することができる。
更に、本発明は、SMPB及び関連架橋剤で改質された脂
質、並びにMPB−PEを始めとする実質的に純粋な反応性
脂質及び関連カップリング組成物を脂質内に取り込むこ
とにより得られたリポソームに関するものである。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、リポソームを
治療及び診断の標的化（targeting）に用いることがで
きる。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、それらの膜を
はさんで膜内外電位差を有していてもよく、脱水されて
もよい。更に、複合体は、イオン化しうる生物活性剤、
例えば抗腫瘍剤を含んでもよく、診断検査に用いてもよ
い。
本発明は、高血液循環時間を示す、サイズの揃った蛋
白質−リポソーム複合体を製造する一般的な方法に関す
るものである。また、本発明は、本発明方法によって作
られた、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体組成
物に関するものである。本発明の複合体は、サイズが30
nmから150nmまでの範囲内にあることが好ましく、良好
な血液循環時間を示す。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、生体内又は診
断での活性剤の搬送を標的化するのに用いてもよい。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、それらの膜を
はさんで膜内外電位差を有していてもよく、脱水されて
もよい。更に、複合体は、イオン化しうる生物活性剤、
例えば抗腫瘍剤を含んでもよく、診断検査に用いてもよ
い。
発明の背景 リポソームは、取り込まれた水性容積を含む脂質二分
子膜からなる完全に閉鎖された構造体である。リポソー
ムは、水性相により分離された、多くの同心脂質二分子
膜を含んでもよく（多重ラメラ小胞、MLV）、あるいは
１個の膜状二分子膜を含んでもよい（単ラメラ小胞）。
脂質二分子膜は、疎水性“尾”領域と親水性“頭”領域
とを有する２つの脂質単分子膜で構成されている。膜状
二分子膜においては、脂質単分子膜の疎水性（非極性）
“尾”が二分子膜の中心に向かって配向し、一方、親水
性（極性）“頭”は水性相に向かって配向している。リ
ポソームの基本的な構造は、種々の公知技術により作る
ことができる。
代表的には、リポソームは、Bangham等の方法［J.Mo
l.Biol.13,238−252（1965）］を用いて調製されてお
り、有機溶剤中に懸濁した脂質を減圧下に蒸発させて、
反応容器中で乾燥膜とする。次いで、適当量の水相を容
器に加え、混合物を撹拌する。その後、多重ラメラ小胞
が形成するのに十分な時間、実質的にかき乱さずに、混
合物を放置する。リポソーム内に取り込まれる水性相
は、とりわけ、薬剤、ホルモン、蛋白質、染料、ビタミ
ン、造影剤（imaging agent）などの生物活性剤を含ん
でもよい。
現在利用できる多数の技術を用いて、リポソームを再
現可能に調製することができる。多数のこれらの技術を
用いて生成することのできるリポソームの種類として
は、小単ラメラ小胞（SUV）［Papahadjopoulos及びMill
er、Biochem.Biophys.Acta.135,624−638（1967）参
照］、逆相蒸発小胞（REV）［米国特許第4,235,587号、
1980年11月25日発行、参照］、安定複ラメラ小胞（SPL
V）［米国特許第4,522,803号、1985年６月11日発行、参
照］、及び同時係属中の米国特許出願番号第622690号、
1984年６月20日出願、Gullis等、名称“単ラメラ小胞製
造のための押し出し手法”に記載されている押し出し手
法で作られる大単ラメラ小胞を挙げることができ、それ
らの関連部分をここに参照のために記載した。
リポソームは、種々の物質、とりわけ、例えば薬剤、
化粧品、診断試薬、生物活性化合物の担体として、用い
ることができる。蛋白質を複合するリポソーム組成物
は、診断用及び生体内用の両用に設計されることができ
る。例えば、特定の受容体又はその他の細胞表面部分に
向かわせるような、抗体指向小胞を生成する能力は、同
様の非指向系に優る明白な利点であろう［G.Gregoriadi
s,Trends Pharmacol Sci.4,304−307（1983）］。これ
らの蛋白質−リポソーム複合体は、小胞内に取り込まれ
た細胞毒性化合物の循環腫瘍細胞に対する選択的標的化
に有効に適用されるであろうし［Wolff等、Biochim.Bio
phys.Acta 802,259−273（1984）］、あるいはこれらの
イムノグロブリン結合小胞が、診断検査の発展に適用さ
れるであろう。更に、患者の特定部位に活性剤を搬送す
るための特定の蛋白質−リポソーム相互作用の標的化に
よって更に、適用が行われることができるものであろ
う。事実、蛋白質が結合する患者の系内の部位へ任意の
活性剤の搬送を標的化するために、蛋白質が複合したリ
ポソームを理論的に用いることができよう。イムノリポ
ソーム［Leserman等、Nature 288,602（1980）、Heath
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,1377（1983）及びHuan
g等、J.Biol.Chem.258,14034（1983）参照］、診断プロ
トコル［Ishimori等、J.Immunol.Methods 75,351（198
4）及びRodney等、J.Immunol.134,4035（1985）参照］
並びにリポソームワクチン［Allison等、Nature 252,25
2（1974）参照］を介して薬剤を目的の部位に向かわせ
ることを始めとする種々の目的のために、リポソームに
蛋白質を複合させる多数の技術がすでに開発されてい
る。
リポソームは、蛋白質、抗体及びイムノグロブリンに
共有結合で結合することができる。Heath等［Biochim.B
iophys.Acta.640,66−81（1981）］は、グリコスフィン
ゴリピドを含むリポソームとイムノグロブリンとの共有
結合について述べている。Leserman等［リポソーム技術
III、29〜40頁、1984年、CRC Press,Inc.,CA.;Nature 2
88,602−604（1980）］及びMartin等［J.Biol.Chem.257
286−288（1982）］は、チオール化IgG又はプロテイン
Ａを脂質小胞に共有結合させ、チオール化抗体とFab′
断片をそれぞれリポソームに結合させる方法について述
べている。これらのプロトコル及び変更した種々のもの
［Martin等、Biochemistry 20,4229−4238（1981）；及
びGoundalker等、J.Pharm.Pharmacol.36,465−466（198
4）］は、カップリングに対する最も有用なアプローチ
を示している。アクチノマイシンＤを含有するアビジン
結合、及びアビジン、ビオチニン結合リン脂質リポソー
ムは、ガングリオ−Ｎ−トリオシルセラミドを発現する
腫瘍細胞へと向けられることに成功している［Urdal
等、J.Biol.Chem.255,10509−10516（1980）］。Huang
等［Biochim.Biophys.Acta.716,140−150（1982）］
は、腫瘍組織適合抗原Ｈ−２（Ｋ）に対するマウスモノ
クローナル抗体の結合、あるいはモロニー白血病ウイル
スの主要糖蛋白、パルミチン酸に対する山羊抗体の結合
について示している。これらの脂肪酸変性IgGをリポソ
ームに取り込み、適当な抗原を発現する細胞に対するこ
れらのリポソームの結合が確認された。特定のイムノグ
ロブリンで被覆されたリポソームの特定の結合につい
て、生体外における他の検討が行われている［Sharkey
等、Fed.Proc.38,1089（1979）］。更に他のカップリン
グの研究において、Rahman等は、リポソームの組織取り
込みを、リポソームへの糖脂質の結合により変更できる
ことを見いだした［J.Cell Biol.83,268a（1979）］。
リポソームの第一の用途によれば、抗腫瘍剤をリポソ
ーム二分子膜内に取り込むことにより、薬剤の直接投与
に比べて、より有効な治療が行えるようになっている
［Forssen等、Cancer Res.43,546（1983）；及びGabizo
n等、Cancer Res.42,4734（1982）］。抗腫瘍剤及び他
の薬剤のカプセル化に伴う大きな問題は、これらの薬剤
の多くが、カプセル化後、リポソームから急速に放出さ
れることが分かっているということである。直接投与に
比較して、リポソームカプセル化により、多くの抗腫瘍
剤の毒性を著しく低減することができるという事実を考
えると、このことは、望ましくない効果である。例え
ば、Forssen等、Cancer Res.43,546（1983）及びRahman
等、Cencer Res.42,1817（1982）参照。更に、徐放形式
で好ましく搬送されるある種の医薬は、標準リポソーム
搬送系に適合しない。多くのリポソーム組成物は、薬剤
をあまりにも急速に放出してしまうので、徐放搬送を行
うことができない。
上記問題に対する一つの解答は、リポソーム系の安定
性及び徐放特性を維持する予め形成された安定なリポソ
ームを用いることである。米国特許出願番号第811,037
号、1985年12月18日出願、名称“リポソームの標的化、
貯蔵及び装填用の新規な組成物”に記載されているよう
に、蛋白質結合リポソームを含むリポソーム組成物によ
り、いつまでも安定に貯蔵できる貯蔵安定性リポソーム
が製造されている。これらのリポソームは、リポソーム
に結合したストレプトアビジン及びイムノグロブリンを
含み、“必要に応じて”リポソームに装填して、脱水状
態で貯蔵されてもよい。これらの蛋白質結合リポソーム
には、イオン化しうる抗腫瘍剤が装填されており、リポ
ソームの壁をはさんで膜内外電位差が生じ、この膜内外
電位差により、リポソーム内に抗腫瘍剤が装填される。
例えば、米国特許出願番号第749,161号、Bally等、1985
年６月26日出願、名称“リポソーム内への抗腫瘍剤のカ
プセル化”（この関連部分をここに参照のために記載し
た）参照。
上で説明したように、蛋白質−リポソーム複合体は、
診断系から生体内の病気の部分への標的化に至るまでの
多くの適用可能性を有している。他の所［Loughery等、
Biochim.Biophys.Acta.901,157（1987）］で示したよう
に、ストレプトアビジンをリポソームに結合させると、
後で種々の蛋白質を簡単に複合させる適応性のある基本
的な系となる。しかし、リポソーム−蛋白質複合体は、
複合工程中、特に脂質に対する蛋白質の割合が高い場合
に、凝集する傾向がある。例えば、リポソームに複合さ
れる蛋白質［Ｆ（ab）断片］の量が多くなると、小胞個
体群の多分散性が増加する結果となることが見いだされ
ている［R.Bredehorst等、Biochemistry 25,5693（198
6）参照］。カップリングインキュベーション工程にお
いて、脂質濃度及び脂質に対する蛋白質の割合を高める
といったような、リポソームに対する蛋白質のカップリ
ング効率を高める条件では、ネガティブ染色で観察した
場合の小胞凝集の程度が増大することが認められている
［Heath等、Biochim.Biophys.Acta.599,42（1980）参
照］。
蛋白質カップリング中の蛋白質−リポソーム複合体の
凝集は、残念ながら、この系の一般的な適用性を阻害す
る特性である。この凝集現象は、リポソームのサイズが
大きくなることと関連している。（血液）循環からのリ
ポソームの排出速度は、製剤のサイズに依存すること、
即ち、リポソームが大きければ大きいほど、循環から速
く取り除かれることが認められている［A.C.Hunt、Bioc
him.Biophys.Acta.719,450（1982）及びSota等、Chem.P
harm.Bull.34,4244（1986）参照］。蛋白質リポソーム
複合体が凝集する傾向があるために、このような製剤の
サイズは大きくなり易く、従って、循環時間が多少不利
である。蛋白質−リポソーム複合体の血液からの浄化
は、同じサイズの非複合リポソームよりも速くなる傾向
がある。更に、凝集した蛋白質−リポソーム複合体は、
エンドサイトーシス法での細胞による吸収が悪くなる傾
向があり、細胞に入る薬剤の量が減少するかもしれな
い。診断においては、凝集した複合体が溶液から析出し
易く、診断が不正確になる可能性がある。
従って、当該技術においては、一般的なターデッティ
ング用途に利用することのできる一定のサイズ分布の蛋
白質−リポソーム複合体を製造する一般的な方法が、要
求されている。このようなサイズを揃えた蛋白質−リポ
ソーム複合体は、凝集蛋白質−リポソーム複合体の実質
的な析出を示さず、高細胞吸収を始めとする、活性剤搬
送を標的化するための又は診断で使用するための蛋白質
−リポソーム製剤の好ましい特性を示すと期待されるで
あろう。
本発明の目的は、良好な特性の、サイズの揃った、一
般標的化用の蛋白質−リポソーム複合体系を達成するた
めに、リポソームへ蛋白質分子を結合させる一般的な方
法を提供することである。
本発明の他の目的は、リポソームが複合している蛋白
質の結合活性に影響を与えることなく、リポソームへの
蛋白質の複合を容易にする、サイズの揃った蛋白質−リ
ポソーム複合体を生成する技術を提供することである。
また、本発明の目的は、種々の量の蛋白質を適合させ
ることのできる一定のサイズ分布の蛋白質−リポソーム
複合体を生成する一般的な方法を提供することである。
更に、本発明の目的は、本発明の方法で製造された安
定な蛋白質−リポソーム複合体を提供することである。
本発明の更に他の目的は、蛋白質の結合活性に影響を
与えることなく、蛋白質結合リポソームのサイズを物理
的に揃える操作を容易に行える一般的な方法を提供する
ことである。
本発明の更にもう一つ別の目的は、複合体の生体内性
能及び安定性を高めて、カプセル化された物質をより効
率的に細胞へ搬送するために、安定な架橋と組み合わせ
て有効なカップリング技術を提供することにより、サイ
ズの揃った蛋白質リポソーム複合体の製造効率を高める
ことである。
更に、本発明の目的は、長期間安定に貯蔵できるサイ
ズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を提供することで
ある。
本発明の更にもう一つ別の目的は、膜内外イオン電位
差を用いて、活性剤を装填できるサイズの揃った蛋白質
−リポソーム複合体を提供することである。
形質転換された細胞と結合しているもののような細胞
表面抗原に向けられている抗体に対するリポソームの共
有結合は、治療に用いられる可能性がかなりある。しか
し、現在では、このような標的に向けられるリポソーム
系は、診断検査のような生体外用途に主として用いられ
ている［Martin及びKung、Ann.N.Y.Acad.Sci.pp.443−4
49（1985）］。例えば、リポソーム−蛋白質カップリン
グ及びリポソーム−補因子カップリングなどの他の系の
ほかに、抗体に向けられた担体系の可能性を全部利用す
るために、改良された有用で信頼できるカップリングの
ための方法論を開発すべきである。
現在まで、蛋白質、抗体、その他の分子をリポソーム
に結合する一般的な方法は、まだ得られていない。Lese
rman等、Nature（London）288,602−604（1980）及びBa
rbet等、J.Supramol.Struct.Cell.Biochem.16,243−258
（1981）は、チオール化IgGを、ジスルフィド結合を介
して、Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニ
ル］ホスファチジルエタノールアミン（PDP−PE）を含
むリポソームに共有結合する方法について記載してい
る。この方法のより一般的なバージョンは、プロテイン
Ａを小胞にカップリングさせることにより開発され［例
えば、Leserman（1980）、前出、参照］、これは、ある
クラスのIgGのFc部分を結合するプロテインＡの能力を
利用している。この方法の一つの大きな制限は、多くの
モノクローナル抗体が、この適当なクラスではないとい
うことである。
カップリングに対する上記アプローチとは別のもの
に、Martin及びPapahadjopoulos、J.Biol.Chem.257,286
−288（1982）のアプローチがあり、彼らは、マレイミ
ド基とのチオエーテル結合、Leserman法のジスルフィド
結合よりも血清中に見られる還元条件をかなり受けにく
い結合、の形成により、Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）−ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン
（MPB−PE）を含むリポソームに抗体及びFab′断片を共
有結合する技術を開発した。Martin/Papahadjopoulosの
アプローチ及びこのアプローチの種々の変形［例えば、
Wolff及びGregoriadis、Biochem.Biophys.Acta.802,259
（1984）;Martin等、Biochemistry 20,4229（1981）；
及びGoundalkar等、J.Pharm.Pharmacol.36,465（198
4）］は、現在得られるカップリングに対する最も有用
なアプローチを示している。
リポソームを蛋白質、抗体、補因子、その他の分子に
架橋するこの方法において、マレイミド基を含む架橋
剤、とりわけ、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ
−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）が、脂質を
含むホスファチジルエタノールアミン及び他のアミンを
複合分子、例えば反応性チオールを含む蛋白質、抗体、
補因子及び他の分子に架橋させるのに用いられる。文献
処方に従って、ホスファチジルエタノールアミン及び他
の脂質と反応させる従来の架橋剤、例えばSMPBは、スク
シンイミジル基の置換中にマレイミド環が開環し、開環
MPB−脂質誘導体が反応生成物に混入することになる。
蛋白質、抗体、補因子、その他の分子に対する架橋は、
従来の文献処方を用いる理想的なものよりも少ない。本
発明の方法は、実質的に純粋なMPB−PE、即ち従来法を
用いて作られる開環MPB−脂質が存在していないことを
示すSMPB誘導ホスファチジルエタノールアミンを含むリ
ポソームを提供することにより、問題を解迅するのに役
立つ。実質的に純粋なMPB−PEを含むリポソームを、種
々の蛋白質、とりわけ、例えばストレプトアビジン、抗
体、補因子及びその他の分子と更に反応させて、本発明
の複合リポソームを製造することができる。
本発明の第一の態様、即ち、治療部位への生物活性剤
の搬送によれば、リポソーム二分子膜内へ抗腫瘍剤を取
り込むことにより、薬剤の直接投与に比較して、治療が
より有効になる［Forssen等、Cancer Res.43,546（198
3）；及びGabizon等、Cancer Res.42,4734（1982）］。
抗腫瘍剤及び他の薬剤のカプセル化に伴う大きな問題
は、これらの薬剤の多くが、カプセル化後、リポソーム
から急速に放出されることが分かっているということで
ある。直接投与に比較して、リポソームカプセル化によ
り、多くの抗腫瘍剤の毒性を著しく低減することができ
るという事実を考えると、このことは、望ましくない効
果である。例えば、Forssen等、Cancer Res.43,546（19
83）及びRahman等、Cencer Res.42,1817（1982）参照。
更に、徐放形式で好ましく搬送されるある種の医薬は、
標準リポソーム搬送系に適合しない。多くのリポソーム
組成物は、薬剤をあまりにも急速に放出してしまうの
で、徐放搬送を行うことができない。
本発明によれば、蛋白質、抗体、補因子又はその他の
分子を、有効量の実質的に純粋なMPB−PEと関連マレイ
ミド含有誘導体とからなるリポソームに複合化すること
により作られた複合リポソームは、“必要なように”リ
ポソームに装填して、脱水状態でいつまでも安定に貯蔵
されることができる。
本発明の目的は、実質的に純粋なMPB−脂質、特に実
質的に純粋なMPB−PE、関連マレイミド含有誘導体及び
関連化合物を合成する一般的な方法を提供することであ
る。
本発明の他の目的は、実質的に純粋なMPB−PEと関連
マレイミド含有誘導体を含むリポソームを提供すること
である。このようなリポソームを、更に蛋白質、抗体、
補因子及びその他の分子と反応させて、複合リポソーム
を生成することができる。
更に、本発明の目的は、薬剤のような少なくとも一つ
の生物活性剤を取り込んだ本発明の複合リポソームを提
供することである。
本発明の更にもう一つ別の目的は、カプセル化された
物質をより効率的に細胞へ搬送するリポソーム複合体を
製造するために、安定な架橋と組み合わせて有効なカッ
プリング技術を提供することである。
本発明のまた別の目的は、従来法よりもより有効にリ
ポソームに結合した蛋白質を有し、長期間にわたって安
定に貯蔵できる安定な複合リポソームを提供することで
ある。
発明の要旨 本発明は 1.求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミ
ド部分を含む架橋剤との反応生成物を含む実質的に純粋
な反応性脂質であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋
剤を含まないことを特徴とする実質的に純粋な反応性脂
質、 2.該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである
上記１の反応性脂質、 3.該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールア
ミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記２の
反応性脂質、 4.該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チリル］MPB基を含む上記１の脂質、 5.該架橋剤がＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート（SMPB）である上記４の脂
質、 6.a）少なくとも一つの非求核溶剤の存在下、かつ求核
溶剤の不存在下で、求核脂質を反応性脂質に完全に変換
するのに十分な時間、求核リポソーム形成脂質をマレイ
ミド含有架橋剤と反応させて、反応性脂質溶液を作り、 ｂ）真空中で該溶液を濃縮することにより該溶液から該
反応性脂質を分離して、固体残渣を生成し、該固体残渣
を溶剤で粉末化して、実質的に純粋な反応性脂質を製造
することからなる実質的に純粋な反応性脂質を合成する
方法、 7.工程（ａ）の反応溶液を、追加的な求核溶剤で希釈
し、次いで工程（ｂ）の分離に先立ち洗浄する上記６の
方法、 8.該非求核溶剤が、クロロホルム、塩化メチレン、DM
F、DMA、DMSO、THF及び１、４−ジオキサンからなる群
より選ばれる上記６の方法、 9.a）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分
子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質
と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形
成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、 ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該
反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させるこ
とからなり、該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と
少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応
生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含
まないものである、複合リポソームを形成する方法、 10.該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約
0.05モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約99.95
モルパーセント以下からなる上記９の方法、 11.反応性脂質が押出されるものである上記９の方法、 12.a.少なくとも約90モルパーセントのリポソーム生成
脂質、 b.少なくとも約0.1モルパーセントの機能化された脂
質、及び c.該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り約10〜約
100の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質 を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを
示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体、 13.機能化された脂質が約0.25ないし１モルパーセント
の間の複合体の脂質を含有する上記12の蛋白質−リポソ
ーム複合体、 14.該機能化された脂質が、MPB−ホスファチジルエタノ
ールアミン、PDP−ホスファチジルエタノールアミン及
びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる
群より選ばれる上記12の蛋白質−リポソーム複合体、 15.該蛋白質が、ストレプトアビジン、IgG、IgM、IgE、
モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる上
記12の蛋白質−リポソーム複合体、 16.蛋白質がストレプトアビジンであり、該ストレプト
アビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している上記
15の蛋白質−リポソーム複合体、 17.該蛋白質が、非共有結合で機能化された脂質に結合
し、該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエ
タノールアミンである上記12の蛋白質−リポソーム複合
体、 18.サイズが約75nmから約200nmの範囲にある上記12の蛋
白質−リポソーム複合体、 19.生物活性剤を含む上記12の蛋白質−リポソーム複合
体、及び 20.該複合体が脱水されている上記12の蛋白質−リポソ
ーム複合体、 に関するものである。
更に本発明の態様としては次のようなものが挙げられ
る。
1.求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミ
ド部分を含む架橋剤との反応生成物を含む実質的に純粋
な反応性脂質であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋
剤を含まないことを特徴とする実質的に純粋な反応性脂
質、 2.該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである
上記１の反応性脂質、 3.該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールア
ミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上記２の
反応性脂質、 4.該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チリル］MPB基を含む上記１の脂質、 5.該架橋剤がＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート（SMPB）である上記４の脂
質、 6.求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノ
ールアミンとＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート（SMPB）との反応生成物を含
む上記１の脂質、 7.該反応生成物が実質的に純粋なMPB−DPPE、MPB−DMPE
又はMPB−EPEである上記１の反応性脂質、 8.治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を
結合するのに有効な量の反応性脂質と、リポソームを形
成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを含む、複
合リポソームを形成するのに使用する反応性リポソー
ム、 9.該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも
一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であ
り、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まない上記
８の反応性リポソーム、 10.該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンであ
る上記９の反応性リポソーム、 11.該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノール
アミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである上
記10の反応性リポソーム、 12.該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチリル］MPB基を含む上記９の反応性リポソーム、 13.該架橋剤がＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（SMPB）である上記10の反
応性リポソーム、 14.該反応性脂質が求核リポソームの不存在下でのホス
ファチジルエタノールアミンとＮ−スクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）と
の反応生成物を含む上記10の反応性リポソーム、 15.該反応性脂質が実質的に純粋なMPB−DPPE、MPB−DMP
E又はMPB−EPEである上記14の反応性リポソーム、 16.該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約
0.05モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約99.95
モルパーセント以下からなる上記８の反応性リポソー
ム、 17.a）治療及び診断の標的化に有効な多数の複合分子を
結合する有効量の実質的に純粋な反応性脂質と、リポソ
ームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを
含む反応性リポソームと、 ｂ）治療及び診断の標的化に有効な量の、該反応性リポ
ソームに結合した複合分子 との反応生成物を含む複合リポソーム、 18.該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくと
も一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物で
あり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まない上
記17の含有リポソーム、 19.該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンであ
る上記18の複合リポソーム、 20.該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノール
アミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミ
ン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵
ホスファチジルエタノールアミンである上記19の複合リ
ポソーム、 21.該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチリル］MPB基を含む上記18の複合リポソーム、 22.該架橋剤がＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（SMPB）である上記21の複
合リポソーム、 23.該反応性脂質が求核アルコールの不存在下でのホス
ファチジルエタノールアミンとＮ−スクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）と
の反応生成物を含む上記17の複合リポソーム、 24.該反応性脂質が実質的に純粋なMPB−DPPE、MPB−DMP
E又はMPB−EPEである上記23の複合リポソーム、 25.該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約
0.05モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約99.95
モルパーセント以下からなる上記17の複合リポソーム、 26.該複合分子が蛋白質、抗体又は補因子から選ばれる
上記17の複合リポソーム、 27.該複合分子がストレプトアビジンである上記26の複
合リポソーム、 28.該抗体がIgG、IgE及びモノクローナル抗体から選ば
れる上記26の複合リポソーム、 29.該補因子がビオチンである上記26の複合リポソー
ム、 30.該補因子に非共有結合した蛋白質を更に含む上記26
の複合リポソーム、 31.該ビオチンに非共有結合したストレプトアビジンを
更に含む上記29の複合リポソーム、 32.該複合リポソームが生物活性剤を含む上記17の複合
リポソーム、 33.該複合リポソームが膜内外電位差を有する上記17の
複合リポソーム、 34.該複合リポソームが生物活性剤を含む上記33の複合
リポソーム、 35.脱水されている上記17の複合リポソーム、 36.脱水されている上記34の複合リポソーム、 37.生物活性剤を含む上記27の複合リポソーム、 38.生物活性剤を含む上記28の複合リポソーム、 39.該複合分子が蛋白質であり、該複合リポソームが凝
集の存在しないことを示す安定でサイズの揃ったリポソ
ームである上記26の複合リポソーム、 40.上記32の複合リポソーム及び薬理学的に許容できる
担体又は希釈剤を含む医薬組成物、 41.該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記40の組成物、 42.該抗腫瘍剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、
ビンブラスチン、ビンクリスチン、シスプラチニウム、
シクロホスファミド並びに薬理学的に許容できる塩、誘
導体及びそれらの混合物からなる群より選ばれる上記41
の組成物、 43.a）少なくとも一つの非求核溶剤の存在下、かつ求核
溶剤の不存在下で、求核脂質を反応性物質に完全に変換
するに十分な時間、求核リポソーム形成脂質をマレイミ
ド含有架橋剤と反応させて、反応性脂質溶液を作り、 ｂ）真空中で該溶液を濃縮することにより該溶液から該
反応性脂質を分離して、固体残渣を生成し、該固体残渣
を溶剤で粉末化して、実質的に純粋な反応性脂質を製造
することからなる実質的に純粋な反応性脂質を合成する
方法、 44.該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンであ
る上記43の方法、 45.該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノール
アミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミ
ン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵
ホスファチジルエタノールアミンである上記44の方法、 46.該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチリル］MPB基を含む上記43の方法、 47.該架橋剤がＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（SMPB）である上記46の方
法、 48.求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタ
ノールアミンとＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（SMPB）との反応生成物が
含む上記43の方法、 49.該反応性脂質が実質的に純粋なMPB−DPPM、MPB−DMP
E又はMPB−EPEである上記48の方法、 50.該反応工程（１）の後に、該反応溶液を該非求核溶
剤で希釈し、次いで少なくとも１回洗浄して、副生成物
を除去する抽出工程を更に含む上記43の方法、 51.該非求核溶剤が、クロロホルム、塩化メチレン、DM
F、DMA、DMSO、THF及び１、４−ジオキサンからなる群
より選ばれる上記43の方法、 52.a）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分
子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な反応性脂質
と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形
成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、 ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該
反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させるこ
とからなる複合リポソームを形成する方法、 53.該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくと
も一つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物で
あり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含まない上
記52の方法、 54.該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンであ
る上記53の方法、 55.該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノール
アミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミ
ン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵
ホスファチジルエタノールアミンである上記54の方法、 56.該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチリル］MPB基を含む上記53の方法、 57.該架橋剤がＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（SMPB）である上記56の方
法、 58.求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタ
ノールアミンとＮ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート（SMPB）との反応生成物を
含む上記52の方法、 59.該反応性脂質が実質的に純粋なMPB−DPPE、MPB−DMP
E又はMPB−EPEである上記58の方法、 60.該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約
0.05モルパーセント、該リポソーム形成脂質が約99.95
モルパーセント以下からなる上記52の方法、 61.該反応工程（２）をpH約75及び室温で行う上記52の
方法、 62.該複合分子が蛋白質、抗体及び補因子から選ばれる
上記53の方法、 63.該複合分子がストレプトアビジンである上記62の方
法、 64.該複合分子がIgG、IgM、IgE及びモノクローナル抗体
から選ばれる抗体である上記62の方法、 65.該補因子がビオチンである上記62の方法、 66.1.a.少なくとも約90モルパーセントのリポソーム生
成脂質、 b.少なくとも約0.1モルパーセントの機能化された脂
質、及び c.該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り約10〜約
100の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質 を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを
示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体、 67.該機能化された脂質が該複合体の約0.25と１モルパ
ーセントの間からなる上記66の蛋白質−リポソーム複合
体、 68.該蛋白質がリポソーム小胞当り約55〜約80の蛋白質
分子に等しい量で結合している上記66の蛋白質−リポソ
ーム複合体、 69.該機能化された脂質が、MPB−ホスファチジルエタノ
ールアミン、PDP−ホスファチジルエタノールアミン及
びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる
群より選ばれる上記66の蛋白質−リポソーム複合体、 70.該蛋白質が共有結合により該機能化された脂質に結
合されている上記66の蛋白質−リポソーム複合体、 71.該共有結合がジスルフィド結合である上記70の蛋白
質−リポソーム複合体、 72.該蛋白質が、ストレプトアビジン、IgG、IgM、IgE、
モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる上
記66の蛋白質−リポソーム複合体、 73.該蛋白質がストレプトアビジンである上記72の蛋白
質−リポソーム複合体、 74.ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結
合している上記73の蛋白質−リポソーム複合体、 75.該蛋白質が、非共有結合で該機能化された脂質に結
合している上記66の蛋白質−リポソーム複合体、 76.該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエ
タノールアミンである上記75の蛋白質−リポソーム複合
体、 77.サイズが約75nmから約200nmの範囲にある上記66の蛋
白質−リポソーム複合体、 78.該機能化された脂質がビオチンを含む上記77の蛋白
質−リポソーム複合体、 79.該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエ
タノールアミンである上記79の蛋白質−リポソーム複合
体、 80.生物活性剤を含む上記66の蛋白質−リポソーム複合
体、 81.該複合体が脱水されている上記66の蛋白質−リポソ
ーム複合体、 82.該複合体が膜内外電位差を有する上記66の蛋白質−
リポソーム複合体、 83.該複合体が生物活性剤を含み、膜内外電位差を有
し、脱水されている上記66の蛋白質−リポソーム複合
体、 84.該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記80の蛋白質−リ
ポソーム複合体、 85.該蛋白質がIgGである上記72の蛋白質−リポソーム複
合体、 86.該蛋白質がモノクローナル抗体である上記72の蛋白
質−リポソーム複合体、 87.上記66の蛋白質−リポソーム複合体及び薬理学的に
許容できる担体又は希釈剤を含む医薬組成物、 88.1）a.少なくとも約90モルパーセントのリポソーム生
成脂質、 b.少なくとも約0.1モルパーセントの機能化された
脂質、 を含むリポソーム小胞を形成し、 ２）リポソーム小胞当り約10〜約100の蛋白質分子に等
しい量で該蛋白質が結合している該機能化された脂質
に、蛋白質を結合して、凝集した蛋白質リポソーム複合
体をつくり、 ３）該凝集した蛋白質−リポソーム複合体を押し出すこ
と を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃
った蛋白質−リポソーム複合体を製造する方法、 89.該機能化された脂質が該複合体の約0.25と１モルパ
ーセントの間からなる上記88の方法、 90.該蛋白質がリポソーム小胞当り約55〜約80の蛋白質
分子に等しい量で結合している上記88の方法、 91.該機能化された脂質が、MPB−ホスファチジルエタノ
ールアミン、PDP−ホスファチジルエタノールアミン及
びビオチン−ホスファチジルエタノールアミンからなる
群より選ばれる上記88の方法、 92.該蛋白質が共有結合により該機能化された脂質に結
合されている上記88の方法、 93.該共有結合がジスルフィド結合である上記92の方
法、 94.該蛋白質が、ストレプトアビジン、IgG、IgM、IgE、
モノクローナル抗体及び酵素からなる群より選ばれる上
記88の方法、 95.該蛋白質がストレプトアビジンである上記94の方
法、 96.ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結
合している上記95の方法、 97.該蛋白質が、非共有結合で該機能化された脂質に結
合している上記88の方法、 98.該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエ
タノールアミンである上記97の方法、 99.サイズが約75nmから約200nmの範囲にある上記88の方
法、 100.該複合体が、該押出工程（工程３）後、脱水される
上記88の方法、 101.該蛋白質がIgGである上記94の方法、 102.該蛋白質がモノクローナル抗体である上記94の方
法、 103.該押出工程（工程３）が、細孔サイズが約30nmから
約11nmまでの範囲にあるポリカーボネートフィルターを
通して行われる上記88の方法、 104.該押出工程が、高圧下で行われる上記103の方法、 105.（ａ）生物活性剤を蛋白質−リポソーム複合体内に
装填することができる方向で、上記66による蛋白質−リ
ポソーム複合体内に膜内外電位差を生成する工程、及び （ｂ）外部水性媒質内で、生物活性剤を蛋白質−リポソ
ーム複合体と混合する工程、 を含む、外部水性媒質で囲まれた蛋白質−リポソーム複
合体に生物活性剤を装填する方法、 106.該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記105の方法、 107.該抗腫瘍剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、
ビンブラスチン並びに薬理学的に許容できる塩及びそれ
らの誘導体からなる群より選ばれる上記106の方法、 108.工程（ｂ）の得られた蛋白質−リポソーム複合体を
脱水して、脱水組成物を得る追加工程を含む上記105の
方法、 109.該蛋白質がストレプトアビジンである上記105の方
法、 110.該蛋白質がIgGである上記105の方法、 111.該蛋白質がモノクローナル抗体である上記105の方
法、 112.該蛋白質−リポソーム複合体が上記88の方法により
作られる上記105の方法、 113.（ａ）上記66の蛋白質−リポソーム複合体を脱水し
て、脱水組成物を得る工程、及び （ｂ）脱水組成物を再水和する工程、 を含む、蛋白質−リポソーム複合体を貯蔵する方法、 114.組成物が保護糖類の存在下で脱水される上記113の
方法、 115.保護糖類が二糖類である上記114の方法、 116.該二糖類が、トレハロース、マルトース、スクロー
ス、グルコース、ラクトース及びデキストランからなる
群より選ばれる上記115の方法、 117.該二糖類がトレハロースである上記115の方法、 118.該蛋白質−リポソーム複合体が膜内外電位差を有す
る上記113の方法、 119.該蛋白質−リポソーム複合体が生物活性剤を含む上
記113の方法、 120.該生物活性剤が抗腫瘍剤である上記119の方法、 121.上記80の蛋白質−リポソーム複合体を被験者に投与
することを含む、生物活性剤の搬送を標的化する方法、 122.該蛋白質がストレプトアビジンである上記121の方
法、 123.該蛋白質がIgGである上記121の方法、 124.該蛋白質がモノクローナル抗体である上記121の方
法、 125.該生物活性剤が抗腫瘍剤であり、該被験者がヒトの
患者である上記121の方法、 126.上記66の蛋白質−リポソーム複合体をサンプルと接
触させることを含む、抗体用サンプルを測定する方法、 127.該蛋白質がストレプトアビジンである上記126の方
法、 128.該蛋白質がIgGである上記126の方法、 129.該蛋白質がモノクローナル抗体である上記126の方
法、および 130.1.a.少なくとも約90モルパーセントのリポソーム生
成脂質、 b.少なくとも約0.1モルパーセントの機能化された脂
質、及び c.該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り約10〜
約100の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質 を含むリポソーム小胞を含む、凝集した蛋白質−リポソ
ーム複合体を形成し、 2.該凝集した蛋白質−リポソームを押し出すこと を含む方法により製造された、複合体凝集の存在しない
ことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複
合体。
本発明の方法においては、ホスファチジルエタノール
アミン（PE）又は関連リポソーム形成求核脂質を、少な
くとも一つのマレイミド基及びアミン反応性機能を有す
る架橋剤、例えばSMPBと反応させ、実質的に純粋な反応
性脂質、例えばMPB−PEを生成する。本発明の方法にお
いては、求核脂質、例えばPE、の反応は、加水分解条件
が存在しないときに起こり、従来技術の方法によって生
成される開環副生成物を回避する。純粋反応性脂質、例
えばMPB−PEの製造後、チオール含有複合分子、例えば
抗体又は補因子のような蛋白質又はその他の分子を、こ
の反応性脂質に共有結合させて、蛋白質、抗体、補因子
又はその他の分子と架橋したリポソームを製造する。こ
こで用いる場合、このような架橋リポソームを複合リポ
ソームという。
驚くべきことに、従来法（メタノール、エタノール又
はその他のアルコールを塩基性条件下で用いる条件）を
用いるSMBPと求核リポソーム形成脂質、例えばPE、との
反応により、反応性脂質、例えばMPB−PE、に加えて、
アルコールによってマレイミド環が開かれたかなりの量
の副生成物（“開環副生成物”）が作られることが発見
された。アルコールを用いるクロマトグラフ及びその他
の分離技術によっても、かなりの量の開環副生成物が作
られることが発見された。
本発明の実質的に純粋な反応性脂質、例えばMPB−P
E、を製造する本発明の方法においては、次の工程が利
用される。
1.非求核アミンを含有する溶剤中で、求核溶剤の不存在
下に、求核脂質がMPB−PEのような反応性脂質へ完全に
変換するのに十分な時間、SMPBのような架橋剤を求核脂
質と反応させる。
2.反応性脂質を形成する反応が実質的に完了した後、溶
液を溶剤で希釈し、少なくとも１回、水、好ましくは食
塩水で洗浄して、副生成物を除去する。
3.（２）からの溶液を真空中で濃縮し、固体残渣を粉末
にして未反応SMPBとスクシンイミド副生成物を除去し、
反応性脂質、例えばMPB−脂質、を製造する。
実質的に純粋な反応性脂質は、工程２を用いず、工程
１と３を続けて用いることによっても作れることが指摘
されるべきである。本発明の反応性脂質の多くは、上記
３つの工程を全て用いて作られるが、ある種の反応性脂
質では、変換工程１後、溶液から粉末にして、実質的に
純粋な反応性脂質を作ってもよい。
本発明の方法態様の工程においては、更に純粋な反応
性脂質を再結晶し、続いてリポソーム内に取り込み、反
応性リポソームを形成してもよい。反応性リポソームを
複合分子、例えば、チオール含有蛋白質、抗体、補因子
又は関連分子と反応させ、本発明の複合リポソームを作
ってもよい。本発明の複合リポソームは、種々の生物活
性剤の搬送を標的化するのに、あるいは診断用途に用い
ることができる。例えば、これらの複合されたものの標
的化及び診断法への適用は、このような複合体が、標的
である抗原の細胞分散を反映する態様で、規定されたビ
オチン化モノクローナル抗体を介して、リンパ求に特異
的に結合していることにより説明されるであろう［例え
ば、Stashenko等、J.Immunol.125,1678（1980）及びHow
ard等、J.Immunol.126,2117（1981）参照］。
求核脂質の純粋なSMPB誘導体を合成する新しい処方を
ここに示す。リポソームに蛋白質を複合するためのカッ
プリング条件を、反応性脂質、例えばMPB−ジパルミト
イルホスファチジルエタノールアミン（MPB−DPPE）、
のマレイミド機能を完全に維持するように最適化した。
本発明において詳述する最適条件下では、50％を越える
カップリング効率が容易に達成される。リポソーム内の
MPB EPEの濃度が高いことと結び付いた場合にのみ、従
来法を用いて、同じような効率が達成されている［５モ
ル％、例えば、Bragman等、J.Natl.Cancer Inst.73,127
（1984）参照］。実質的に純粋な反応性脂質、例えば本
発明のMPB PE、の使用と関連する効率的なカップリング
は、リポソーム内の反応性脂質の濃度が約2.5モル％よ
りも高くなると、リポソームの安定性に劇的な影響を及
ぼすので、特に重要である［例えば、Bradehorst等、Bi
ochemistry 25,5693（1986）参照］。
本発明は、少なくとも一つの実質的に純粋な反応性脂
質、例えばMBP−PEを、少なくとも一つの別のリポソー
ム形成脂質と組み合わせて含む反応性リポソームに関す
るものでもある。本発明のリポソームは、一般に、少な
くとも約0.05モル％のMPB−PEのような実質的に純粋な
反応性脂質と、約99.95モル％以下の少なくとも一つの
リポソーム生成脂質を含む。本発明の複合リポソーム
は、更に、リポソームに共有結合又は非共有結合してい
る種々の蛋白質、抗体、補因子又はその他の分子を含
む。本発明の一つの態様においては、本発明の複合リポ
ソームを形成するのに、ストレプトアビジンが用いられ
る。これらのストレプトアビジン被覆リポソームは、急
速かつ効率的にビオチン化蛋白質を結合し、生体内で特
異的な標的化法を示す複合リポソームとなる。このよう
なリポソームは、治療及び診断の標的化用に利用するこ
とができる。
本発明の別の方法においては、リポソームが、共有結
合又は非共有結合を介して、蛋白質、例えば他の蛋白質
の中でも、ストレプトアビジン又はイムノグロブリン、
と結合し、凝集蛋白質−リポソーム複合体を生成する。
次いで、この凝集複合リポソーム調製物を、約30nmから
約100nmまでの範囲の細孔サイズを有するフィルターか
ら押し出し、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体
を生成する。カップリング後、蛋白質−リポソーム複合
体を押し出すことにより、蛋白質がリポソームに結合し
たときに生ずる凝集が逆になり、容易に凝集しない一定
のサイズの安定、非凝集蛋白質−リポソーム複合体が作
られる。凝集蛋白質−リポソーム複合体を濾別せずに、
押出過程が生ずるということは、驚くべき結果である。
本発明の方法は、蛋白質結合リポソームのサイズを物
理的に揃える操作を容易にし、蛋白質の結合活性に影響
を与えることを避けることができる。この技術により、
一定のサイズ分布の安定な蛋白質−リポソーム複合体
を、種々の量の蛋白質をリポソームに結合した状態で、
容易に調製することができる。行った実験において、押
し出された複合体の血液循環時間が長くなり、結合能力
が維持されたことは、蛋白質−リポソーム複合体の押出
製剤が、生体内で蛋白質結合部位に結合できるあろうと
いうことを示している。
本発明は、蛋白質−リポソーム複合体に関するもので
もある。本発明のこの態様の種々の成分の重量パーセン
トは、大きく変わるかもしれないが、一般に、本発明の
蛋白質−リポソーム複合体は、次のものを含む。
1.a）少なくとも約90モルパーセントのリポソーム生成
脂質；及び ｂ）少なくとも約0.1モルパーセントの機能化された脂
質；及び ｃ）リポソーム小胞当り約10〜約100の蛋白質分子に等
しい量で該機能化された脂質に結合した蛋白質 を含むリポソーム小胞。
本発明のリポソームには、他の多くの医薬の中でも、
例えば局所麻酔剤、気管支拡張薬、β−アドレナリン遮
断薬、抗高血圧薬、抗うつ薬、抗痙攣剤、抗ヒスタミン
薬、抗マラリア薬及び鎮痛薬などの医薬に加えて、生物
活性剤を装填してもよい。本発明のリポソーム内に活性
剤を装填するためには、濃度勾配に対して、それらのラ
メラをはさんで、膜内外電位差が生じるような方法でリ
ポソームを調製するのが好ましい。この濃度勾配は、Na
＋/K＋電位かあるいはpH勾配（Ｈ＋）のいずれかにより
作られる。内部対外部の電位の差は、イオン化しうる生
物活性剤をリポソームに装填させる機構である。膜内外
電位差に応じて、行われたリポソームの装填に遅延が生
じるからであろう。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、一つ又はそれ
以上の保護糖類の存在下で脱水し、その脱水状態で貯蔵
し、次いで、イオン勾配及び関連性能を維持して再水和
し、生物活性剤を蓄積することができる。更に、本発明
の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査に用いること
ができる。
本発明のリポソーム複合体は、一つ又はそれ以上の保
護糖類の存在下で脱水し、その脱水状態で貯蔵し、次い
で、イオン勾配及び関連性能を維持して再水和し、生物
活性剤を蓄積することができる。更に、本発明の蛋白質
−リポソーム複合体は、診断検査に用いることができ
る。
図面の簡単な説明 図１は、PDP−EPEとMPB−EPEを含むリポソームに対す
るチオール化IgGのカップリングの比較を、リポソーム
に含まれるコレステロールの濃度の関数として示す。示
されているように、20モル％よりも多いコレステロール
がリポソーム内に取り込まれるまでは、PDP−EPEを含む
リポソームに対するチオール化IgGの顕著なカップリン
グは起こらなかった。始めの対比では、MPB PEを含むリ
ポソームについては、コレステロールが存在しないとき
でも、12ug IgG/umole脂質の水準が得られた。
図２は、純MPB−DPPEのNMRスペクトルを示し、これは
本発明の方法により合成される。
図３は、MPB−PE合成の従来技術に記載されているも
のに対する条件下での、２−メトキシエチルアミンとSM
PBとの提案された反応機構（開環副生成物、PEの化学等
量決定する目的で）の構造図を示す。この図は、反応に
よって、一方は構造がMPB−PE（構造Ｂ）と同様なもの
であり、他方の生成物は構造がマレイミド基のケト基へ
のメタノール性攻撃により生じる開環副生成物と同様な
ものである、２つの生成物が作られることを示してい
る。
図４及び５は、純粋なMPB DPPEを含むリポソームに、
チオール化ストレプトアビジンをカップリングさせるた
めの最適条件の研究を示す。図４に示すように、リポソ
ームに複合される蛋白質の量は、７よりも大きいpH値に
おいて急速に増大するが、それに対応して、反応性脂質
のマレイミド基が急速に分解する。図５は、マレイミド
脂質の反応性に対する、リポソームに結合しているスト
レプトアビジンを反応させる時間経過を示す。この結果
は、pH7.5、室温で８時間のインキュベーション後に、
マレイミドの分解が最小で、最適水準のリポソーム複合
ストレプトアビジン（約37ug/umole脂質）が得られたこ
とを示している。
図6A、Ｂ及びＣは、ビオチン化抗体が存在しないとき
（図6A）と存在するとき（図6B及びＣ）の、リポソーム
ストレプトアビジン複合体による標的細胞に対するリポ
ソームの標的化を、フローサイトメトリー技術で測定し
て比較する。
図７は、リポソームへストレプトアビジンをカップリ
ングさせることの小胞サイズに及ぼす影響を示すグラフ
である。
実施例20に記載されているように、リポソーム（54％
EPC、45％CHOL、１％MPB−PE、5mM最終脂質濃度、100n
m）を、pH7.5で時間をかけて、ストレプトアビジン（10
0ug蛋白質/umole脂質）とインキュベートした。グラフ
に示すように、種々の時間において、Ｎ−エチルマレイ
ミド（蛋白質に対して500モル比）を加えて反応を冷却
し、セファロース（sepharose）CL−4Bでのゲル濾過に
より遊離のストレプトアビジンを除去した。結合したス
トレプトアビジンの量を3Hビオチン結合によって求め
（グラフＡ）、小胞サイズをQELSにより評価した（グラ
フＢ）。
図８は、ストレプトアビジン−脂質製剤のフリーズフ
ラクチャーである。ストレプトアビジン−脂質サンプル
を、0.2（Ａ）、２（Ｂ）、４（Ｃ）及び18（Ｄ）時間
目にＮ−エチルマレイミドで冷却し、実施例20及び上記
図７で説明したように調製し、フリーズフラクチャーに
より調べた。
図９は、実施例21に記載のストレプトアビジン−脂質
複合体の押出を示すグラフである。ストレプトアビジン
を、最終脂質濃度20mMで、１％MPB−PEを含むリポソー
ム（100nm）と結合させた。種々の時間に、反応混合物
の一部をＮ−エチルマレイミドで冷却し、100nmポリカ
ーボネートフィルターから押し出す前に、5mM脂質濃度
に希釈した。セファロースCL−4Bで脂質サンプルからゲ
ルを除去した後、ストレプトアビジン脂質への3Hビオチ
ン結合により、結合したストレプトアビジンの量（Ａ）
を測定した。押出前後に、QELSによりストレプトアビジ
ン−脂質複合体のサイズを測定した（Ｂ）。
図10は、実施例21記載の抗体リポソーム複合体の押出
を示すグラフである。フルオレセイン標識抗体を、最終
脂質濃度20mMで、１％MPB−PEを含むリポソーム（100n
m）と結合させた。種々の時間に、反応混合物の一部を
Ｎ−エチルマレイミドで冷却し、100nmポリカーボネー
トフィルターから押し出す前に、5mM脂質濃度に希釈し
た。セファロースCL−4Bでの脂質サンプルの交換後、リ
ポソームに結合した蛍光の濃度を測ることにより、結合
した抗体の量（Ａ）を求めた。押出前後に、QELSにより
抗体リポソームのサイズを測定した（ｂ）。
図11は、実施例21記載の押出前後のストレプトアビジ
ンリポソームのフリーズフラクチャーである。図７及び
実施例21に記載のように、最終脂質濃度20mMで８時間、
ストレプトアビジンをリポソームに結合させた。押出前
に、サンプルを5umole/mlに希釈した。実施例13に記載
のように、最終脂質濃度5mMで、ビオチン−PE（0.25
％）含有リポソームにストレプトアビジンを非共有結合
させた。押出前（Ａ）及び後（Ｂ）のMPB−PE含有スト
レプトアビジン−リポソーム並びに押出前（Ｃ）及び後
（Ｄ）のビオチン−PE含有ストレプトアビジン−リポソ
ームを図に示す。100nmポリカーボネートフィルターか
らの押出前及び後に、フリーズフラクチャーによりサン
プルを調べた。
図12は、押し出されたストレプトアビジン−リポソー
ム複合体の安定性の試験をQELSにより示す。チオール化
ストレプトアビジンを１％MPB−PE含有リポソームと、
最終脂質濃度20mMで８時間インキュベートすることによ
り、約51ug蛋白質/umole脂質のストレプトアビジン−リ
ポソームを調製した。セファロースCL−4Bでのゲル濾過
により未結合ストレプトアビジンを除去した後、サンプ
ルを5mM脂質に希釈し、２枚重ねの100nmポリカーボネー
トフィルターから10回押し出した。示された種々の時間
に、押し出された製剤のサイズをQELSにより測定した
（○）。図７で調製したストレプトアビジン−リポソー
ム複合体のサイズを、比較のためにグラフで示す
（○）。
図13は、実施例23に記載のリポソーム製剤の生体内浄
化速度を示す。最終脂質濃度30mM及びインキュベーショ
ン時間15分で、ストレプトアビジンをリポソーム（50及
び100nm）と結合させ、Ｎ−エチルマレイミドで２時間
冷却し、次いで、Ｂ−メルカプトエタノールと一晩イン
キュベートした。MPB−PEを含む対照リポソームをpH7.5
に滴定し、HBSで平衡化したセファデックス（sephade
x）Ｇ−50で交換した。EPC/CHOLリポソームが、HBS内に
調製された。マウス（１時点当り４〜８匹）に100mg/kg
の投与量で脂質を注射した。特定時点におけるEDTA全血
から血漿を調製し、実施例13の材料及び方法の項に記載
のシンチレーション計数により、一部を分析した。押し
出されたサンプルのサイズをQELSにより測定した。
（Ａ）:EPC/CHOL、125nm（黒丸）;EPC/CHOL、197nm（黒
四角）;MPB−PEリポソーム、170nm（冷却黒逆三角、未
冷却（黒三角）；（Ｂ）：凝集100nmストレプトアビジ
ン−リポソーム、530nm（白四角）;100nmフィルターか
ら押し出されたストレプトアビジン−リポソーム、187n
m（白三角）;50nmから押し出されたストレプトアビジン
−リポソーム、139nm（白丸）。
発明の詳細な説明 本発明は、リポソーム内に取り込み、次いで蛋白質、
抗体、補因子又はその他の分子と反応させて、複合リポ
ソームを製造することができる実質的に純粋な反応性脂
質、例えばMPB−PE、を合成する改善された方法に関す
るものである。本発明の複合リポソームは、生物活性剤
搬送及び診断用標的化を始めとする多数の標的化用途に
利用できる。
本発明の方法においては、リポソーム形成求核脂質、
例えばホスファチジルエタノールアミン（PE）、を架橋
剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチレート（SMPB）と反応させて、実質的
に純粋な反応性脂質、例えばMPB−PE、を製造する。本
発明の方法態様においては、架橋剤とリポソーム形成求
核脂質との反応を、非求核溶剤及び任意には第三級アミ
ンのような非求核塩基の存在下で行う。非求核塩基の存
在下でアルコール性溶剤を利用する従来法によるMPB−P
Eの合成では、かなりの量の開環副生成物が作られるこ
とが発見されている。この開環副生成物は、マレイミド
基よりもチオール基との反応性が著しく小さく、その結
果、本発明のMPB−PEよりも蛋白質、抗体、補因子及び
その他の分子をカップリングする効率が低い、従来技術
の不純反応性脂質MPB PEとなる。
本発明で用いられる場合、複合分子を反応性脂質に結
合させるのに用いる架橋剤は、マレイミド含有架橋剤、
例えば、ｐ−マレイミドフェニルブチレート基又はその
他の基、特に、．例えばSMPBである。このような剤は、
反応性リポソームと複合分子、特に蛋白質を架橋する好
ましい試薬であることが分かっている。SMPBは本発明で
使用するのに好ましい試薬であるが、マレイミド基を含
む他の架橋剤を使用してもよい。本発明で使用できるこ
れらの架橋剤の中には、他のマレイミド含有架橋剤の中
でも、Ｎ−スクシンイミジル ３−マレイミドベンゾエ
ート（SMB）、Ｎ−スクシンイミジル ３−マレイミジ
ブチレート（GMBS）、Ｎ−スクシンイミジル ６−マレ
イミドカプロエート（EMCS）、Ｎ−スクシンイミジル
３−マレイミドプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル
トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート（SMCC）及びＮ−スクシ
ンイミジルマレイミジルアセテート（AMAS）が挙げられ
る。
ここで用いる場合、リポソーム形成求核脂質という用
語は、SMPB又は同等のマレイミド含有架橋剤と反応し
て、マレイミド含有脂質又は同等の脂質を作り、他のリ
ポソーム形成脂質と共にリポソーム内に取り込まれるこ
とができる任意の脂質を意味する。このような求核脂質
としては、とりわけ、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
DPPE）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミ
ン（DMPE）及び卵ホスファチジルエタノールアミン（EP
E）のような天然、合成、半合成脂質が挙げられる。一
般に、より好ましい求核脂質としては、アミン基、好ま
しくは第一級アミン基、を含むものが挙げられるが、他
の求核基の中でも、オキシアニオンのようなアルコール
性アニオンを含む合成脂質を始めとする他の求核脂質
を、本発明で用いることを考えてもよい。純粋な反応性
脂質を生成するために、求核基の求核脂質への反応性並
びに求核脂質及びSMPBの量及び濃度を変えてもよいこと
は、当業者により認識されるであろう。一般に、１対１
よりも大きいSMPB対求核脂質モル比を用いると、マレイ
ミド開環副生成物ができることが認識されるであろう。
反応性脂質を製造する反応は、非求核溶剤中で進行す
る。ここで用いる場合、非求核溶剤という用語は、反応
性成分を溶解する好ましい特性を有する任意の溶剤を意
味し、例えば非求核アミンが挙げられるが、これ自身は
開環副生成物を生成しない。本発明の方法態様で用いる
ことのできる溶剤の例としては、他の溶剤の中でも、ク
ロロホルム、塩化メチレン及びより高度に塩素化、ハロ
ゲン化された溶剤、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジ
メチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド（D
MA）、1,4−ジオキサン、テトラヒドロフラン（THF）並
びにその他のエーテルが挙げられる。多数のその他の非
求核溶剤も、本発明において用いることができる。
本発明に使用する溶剤を選択する際の目的としては、
反応性脂質を生成する反応を最大にすること、及びSMPB
のマレイミド基への溶剤の攻撃により生成する副生成物
を最小にすることが挙げられると理解されよう。反応性
脂質を製造する従来法の条件は避けるべきであり、他の
反応性アルコールの中でも、メタノール及びエタノール
のような求核性溶剤は、特に塩基の存在下では、避ける
べきであるということが認識されるべきである。
反応性脂質を置換Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び
その他の副生成物から分離するに際し、アルコール性及
びその他の求核溶剤の使用を避けるべきであるというこ
とに注目するのは、重要である。従って、より極性の大
きい副生成物から反応性脂質を分離するためには、非求
核溶剤を用いる粉末化又は抽出技術が好ましい。ここで
用いる場合、実質的に純粋な反応性脂質という用語は、
マレイミド基がもともと完全である、即ち求核剤と反応
して開環副生成物を生成することのない反応性脂質を意
味する。実質的に純粋な反応性脂質という用語は、実質
的に完全なマレイミド基を有しているが、少量の不純物
及び開環副生成物以外の副生成物も含有する反応性脂質
を排除するものと解釈されるべきではない。本発明の反
応性リポソームは、本発明の反応性リポソームが実質的
に純粋である点、即ちそれらが実質的な量の開環反応性
脂質、例えばPB−脂質、を含んでいないという点で、従
来の反応性リポソームとは異なる。理論によって制限さ
れることはないが、このような開環反応性脂質は、複合
リポソームを形成する反応性リポソームの能力に影響を
及ぼすと信じられており、相当量の開環反応性脂質を含
有する反応性リポソームは、蛋白質又はその他の分子に
複合するリポソームの効率を著しく低減させる。この効
率の低減に加えて、反応性脂質は複合リポソームを不安
定にする傾向があるという事実から、高安定性及び高結
合特性を始めとする、従来の複合リポソームよりもはる
かに好ましい特性を有する反応性脂質及びそれから生成
されるリポソームが得られることになる。
実質的に純粋な反応性脂質を単離した後、それをリポ
ソーム内に取り込んで、反応性リポソーム、即ち蛋白
質、抗体、補因子、その他の分子のような複合分子と更
に反応して、複合リポソームを生成することのできるリ
ポソーム、を生成する。一般に、反応性リポソームは、
少なくとも約0.05モルパーセントの反応性脂質と少なく
とも約90重量％のリポソーム形成脂質を含む。しかしな
がら、反応性リポソームの安定性を促進するためには、
反応性脂質の量が、反応性脂質の全重量の約2.5モルパ
ーセント以下であることが好ましい。反応性リポソーム
は、リポソームを形成するのに当該技術において用いる
ことのできる任意の方法を実質的の使用して、蛋白質、
抗体又は補因子に共有結合するように作用して複合リポ
ソームを生成する反応性部分、例えばMPB、を破壊しな
いように注意しながら、形成されることができる。
一般に、反応性リポソームを形成後、反応性脂質上の
マレイミド基を介して、反応性リポソームに蛋白質又は
その他の基を結合させる。分子が十分に求核的で、好ま
しくはチオール基を含んでいれば、任意の蛋白質、抗
体、補因子又は関連分子をマレイミド基に結合させるこ
とができる。本研究は、チオール基が、他の求核基、例
えばアミン基又はアルコール基、よりも明らかに好まし
く、カップリング反応の好ましいpH及び温度条件下で、
他の基よりもはるかに反応性に富んでいることを証明し
た。
生物活性剤又はその他の分子を搬送する目的で、ある
標的化機能を有する、即ちある活性部位、受容対部位又
はその他の結合部位に結合しうる複合分子を結合するこ
とが、明らかに好ましい。本発明において有用な蛋白質
としては、とりわけ、ストレプトアビジン、種々の酵
素、免疫調節剤、例えばインターロイキン−１、インタ
ーロイキン−２、腫瘍壊死因子（TNF）、種々のペプチ
ド及びペプチド断片、特にワクチン注射に使用するため
のもの、抗体、例えば、IgG、IgM、IgEのようなイムノ
グロブリン、モノクローナル抗体並びに関連蛋白質が挙
げられる。本発明は、好ましくは、リポソームに共有結
合又は非共有結合し、反応性リポソームに結合後、受容
体部位、抗原決定基あるいはその他の標的結合部位のよ
うなターゲットにも蛋白質が結合するような自然の完全
性（natural integrity）を維持するこれらの蛋白質を
用いることを意図している。本発明において有用な補因
子としては、ストレプトアビジン及びアビジンを始めと
する多数の蛋白質を非共有結合する能力があるため、特
にビオチンを挙げることができる。
本発明において有用な蛋白質は、反応性リポソームの
反応性脂質に共有結合することができるし、一方、補因
子、例えばビオチンを介して、反応性脂質に非共有結合
することもできる。複合分子と反応性脂質との間の共有
結合は、蛋白質内に存在するチオール基又はその他の分
子と反応性脂質のマレイミド基との反応により、形成さ
れることができる。複合分子がチオール基を含まない場
合は、分子がリポソームに共有結合するように、チオー
ル基を合成により導入してもよい。複合分子が蛋白質で
ある例においては、その蛋白質を二官能性試薬、例えば
Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（SPDP）、で変性して、反応性脂質のマレ
イミド基と反応することのできる２つのチオール基を含
む蛋白質を作ってもよい。
反応性脂質への結合のために複合分子を変性するのに
有用な二官能性試薬としては、複合分子と反応する少な
くとも一つの基と、反応性脂質のマレイミド基と反応す
る少なくとも一つの基を有するこれらの剤が挙げられ
る。上に示したように、本発明においては、多数の二官
能性試薬が有用であり、とりわけ、例えばSPDP、スクシ
ンイミジルアセチルチオアセテート（SATS）及びスクシ
ンイミジルアセチルチオプロピオネート（SATP）が有用
である。
本発明の他の態様では、複合分子において、例えば、
蛋白質が反応性脂質に共有結合する前に、蛋白質が先ず
補因子、例えばビオチン、に共有結合してもよい。ビオ
チンを用いるこの発明の態様においては、ストレプトア
ビジンのような蛋白質をＮ−ヒドロキシスクシンイミド
ビオチン又はｐ−ニトロフェニルビオチンと反応させ
て、蛋白質−リポソーム複合体を製造する際に用いる共
有結合でビオチン化した蛋白質を生成することができ
る。
本発明の他の態様においては、ストレプトアビジン又
はその他のビオチン結合蛋白質を含む蛋白質−リポソー
ム複合体を、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオ
チンでのビオチンへのカップリングによりビオチン化さ
れたIgG又はモノクローナル抗体のような蛋白質に、更
に結合することができる。蛋白質をリポソームと標的部
位の間の吸引カプラー（attractive coupler）にする蛋
白質−リポソーム複合体の安定性が認められたことは、
全く驚くべきことである。
蛋白質が反応性リポソームに非共有結合している本発
明の態様においては、最も好ましくは、約0.1モルパー
セントと約１モルパーセントとの間の反応性脂質、例え
ばホスファチジルエタノールアミン、を用いて、先ずリ
ポソームを形成し、補因子又は変性補因子と反応するこ
とのできるマレイミド含有架橋剤と共有結合させる。あ
る種の蛋白質、例えばアビジン及びストレプトアビジン
が、実際に結合できる補因子の好ましい例は、ビオチン
である。ビオチンを用いる本発明のある態様において
は、MPB−PEに共有結合して、ビオチン含有複合リポソ
ームを生成するチオール基を含むように、ビオチンを変
性することによって、MPB−PE上にビオチンを導入する
ことができる。ストレプトアビジンのような蛋白質を、
複合リポソームのビオチンに非共有結合させてもよい。
蛋白質をリポソームに共有結合又は非共有結合させ
て、蛋白質−リポソーム複合体を製造する場合、リポソ
ームが凝集して、サイズが大きくなるかもしれない。こ
のような場合、リポソームを押し出して、サイズの揃っ
たリポソーム複合体を作るのが好ましいであろう。サイ
ズの揃ったリポソームを作り、凝集を減少させる方法
は、当該技術において利用可能であり、従来、ここに参
照のために記載した米国特許出願番号第370,650号、名
称“一定のサイズ分布の標的化されたリポソーム系の調
製”、1989年６月23日出願、に記載されている。
本発明の方法態様においては、次の工程が用いられ
る。
1.非求核溶剤中で、求核脂質の反応性脂質への変換が完
了するのに十分な時間、SMPBを求核脂質と反応させる。
2.求核脂質が反応性脂質へ完全に変換した後、溶液を真
空中で濃縮し、固体残渣を溶剤で粉末化して未反応SMPB
及び置換されたスクシンイミドを除去し、実質的に純粋
な反応性脂質、例えばMPB−PE、を生成する。
工程１の後の反応で、抽出工程を用いて、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドのような副生成物を除去するのが好
ましい。その工程では、工程１からの反応混合物を非求
核溶剤で希釈し、次いで数回洗浄して副生成物を除去す
ることができる。抽出工程を実施した後、上記工程２、
粉末化工程が一般に行われる。
本出願の発明から逸脱することなく、即ち実質的に純
粋な反応性脂質を生成するために、上記反応工程の種々
の変形を実施することは、当業者の認識するところであ
ろう。例えば、粉末化工程（上記工程２）を実施する代
わりに、非求核溶剤及びマレイミド開環を回避する条件
を用いるクロマトグラフ分離を実施できることが認識さ
れよう。
本発明は、本発明の実質的に純粋な反応性脂質を取り
込んでいる反応性リポソームに関するものでもある。本
発明の反応性リポソームは、複合分子を結合するのに十
分な量の少なくとも一つの実質的に純粋な反応性脂質、
例えばMPB−PE、を他のリポソーム形成脂質と組み合わ
せて含むものである。一般に、本発明の反応性リポソー
ムは、少なくとも約0.05モルパーセントのMPB−PEのよ
うな反応性脂質を、一般に反応性リポソームの約99.95
モルパーセント以下の量の少なくとも一つのリポソーム
形成脂質と組み合わせて含むものである。本発明の反応
性リポソーム及び複合リポソームに用いることのできる
リポソーム形成脂質の検討については、以下に詳述す
る。
本発明は、反応性リポソームを含むMPB−脂質上に蛋
白質を結合させる改善された方法に関するものでもあ
る。蛋白質を反応性リポソームに結合させる反応は、pH
7.5、約室温、即ち23℃、の温度の条件を用いた場合
に、最も効率的であることが分かっている。pH又は温度
を上げると、反応は高まるが、MPB PEの完全性は低下す
るであろう。同様に、温度又はpHを下げると、反応性リ
ポソームに対する蛋白質の結合が減少するのであろう。
本発明の条件、即ち約23℃の温度及び約7.5のpHのと
き、蛋白質を反応性リポソームにカップリングさせて蛋
白質複合リポソームを生成する効率が、最も高くなる。
更に、これらの条件下では、反応性脂質の完全性が最高
になる。本発明方法の最適条件下では、50％を越えるカ
ップリング効率が容易に達成される。同様の効率は、リ
ポソーム内に高濃度のMPB−PEを取り込んだ場合に達成
されているだけである［５モル％、Bragman等、J.Natl.
Cancer Inst.73,127（1984）］。
本発明は、蛋白質、抗体、補因子及びその他の分子の
ような複合分子へのリポソームのカップリングにより生
ずるリポソーム複合体に関するものでもある。このよう
なリポソームは、複合分子を結合するのに有効な量の反
応性脂質、その反応性脂質と組み合わせて安定なリポソ
ームを形成するのに有効な量のリポソーム形成及び受容
体、活性部位又は抗原決定基のような標的化部位にリポ
ソームを標的化するのに有効な量の、反応性リポソーム
に結合する少なくとも一つの複合分子、例えば蛋白質、
抗体、補因子及びその他の分子、を含む。
本発明のリポソーム複合体には、生物活性剤を装填す
ることができる。複合分子が蛋白質であるリポソーム複
合体の場合、サイズの揃ったリポソームを形成し、リポ
ソームの凝集を避けるために、このようなリポソームを
押し出してもよい。本発明のリポソーム複合体を形成
後、脱水及び再水和し、あるいは４℃で安定に貯蔵する
ことができる。一方、再水和工程又はそれに続く工程
中、形成後の二分子膜をはさむイオンの電位差により、
選ばれた生物活性剤を装填する前に、リポソーム複合体
を押し出して、サイズの揃ったリポソームを作ることが
できる。リポソーム内へ生物活性剤を装填する好ましい
方法としては、Madden等により、米国特許出願番号第35
2,497号、1989年５月15日出願、名称“プロトン勾配に
よるリポソーム内への薬剤の蓄積”に記載されている方
法が挙げられ、その関連部分をここに参照のために記載
した。一方、脱水前に、リポソーム複合体に生物活性剤
を加えてもよい。
本発明のリポソーム複合体は、被験者、例えばヒトを
始めとする哺乳動物、に投与することができる。組成物
は、薬理学的に許容できる担体又はリン酸緩衝生理食塩
水のような希釈剤でこのような被験者に非経口的に搬送
することができる。リポソームに結合された蛋白質は、
リポソーム及びそれらの内容物を体の特定部位に標的化
する際に、助けとなる。抗腫瘍剤のような生物活性剤の
場合のごとく、非経口的に用いられる場合、使用量は医
者によって定められ、治療方法は腫瘍の大きさ及びその
他の条件により決定される。
上述のごとく、本発明は、サイズの揃った蛋白質−リ
ポソーム複合体を製造する方法を示す。本発明の方法に
おいては、少なくとも0.1パーセントの機能化された脂
質及び少なくとも90モルパーセントのリポソーム生成脂
質を含むリポソームを、最初に形成する。このようなリ
ポソームを反応性リポソームと言う。反応性リポソーム
は、蛋白質に共有結合又は非共有結合することのできる
機能化された脂質を含むリポソームである。反応性リポ
ソームを形成した後、蛋白質がリポソームに結合して、
蛋白質−リポソーム複合体を製造する。蛋白質−リポソ
ーム複合体を形成した後、約30nmから約100nmまでの範
囲の細孔を有するフィルターから押し出して、サイズの
揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造する。蛋白質−
リポソーム複合体を形成した後の押出工程の使用が、比
較的サイズの小さい非凝集蛋白質−リポソーム複合体を
もたらし、その複合体は安定で、好ましい血液循環時間
を示すことが分かっている。驚くべきことに、押出工程
中、凝集蛋白質−リポソーム複合体が濾別されるような
ことがない。
蛋白質を反応性リポソームに共有結合又は非共有結合
して、本発明の蛋白質−リポソーム複合体形成するため
に、任意の数の従来法を用いることができる。しかし、
一般に、反応性リポソームは、少なくとも約0.1モルパ
ーセントの機能化された脂質、好ましくは約10モルパー
セント以下、最も好ましくは約0.25〜約１モルパーセン
トの機能化された脂質を含むように調製される。本出願
の明細書を通じて用いる場合、機能化された脂質は、他
のリポソーム生成脂質と組み合わせてリポソームを形成
することができ、（共有又は非共有的に）蛋白質に結合
することのできる任意のリポソームである。本発明で
は、多数の機能化された脂質が意図され、リポソームを
形成するのに用いられる多数の標準脂質の内のどれか、
例えばホスファチジルエタノールアミン（PE）、を二官
能性剤、とりわけ、例えばＮ−スクシンイミジル−４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−
スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル トランス−
４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート（SMCC）及びＮ−スクシンイミジル
３−マレイミドベンゾエート（SMB）、と反応させて、
例えば機能化された脂質MPB−PE及びPDP−PEを作ること
により、一般に形成される。
本発明において有用な機能化された脂質は、２つの方
法で形成される。第一の方法は、脂質を少なくとも二つ
の官能基を含む二官能性剤と反応させることによるもの
であり、その官能基の内の一つは、脂質と共有結合し、
他のものは蛋白質と更に反応して、共有結合した蛋白質
−リポソーム複合体を生成する。この明細書を通じて用
いられる場合の二官能性剤は、脂質を蛋白質又は補因子
に架橋させるように機能する少なくとも二つの明白な反
応性の基を含む化学剤である。用いられる機能化された
脂質の化学的性質に応じて、二官能性試薬は、活性化さ
れたエステルのような少なくとも二つの親電子基、アミ
ン、ヒドロキシル、若しくはチオールのような少なくと
も二つの求核基又は少なくとも一つの親電子基と一つの
求核基を含むことができる。もちろん、当業者は、二官
能性試薬と脂質又は蛋白質との間の共有結合の生成が最
大になるように、二官能性試薬を選択することができる
であろう。必要な場合は、当該技術において容易に利用
できるブロッキング剤を用いて、共有結合を最大にし、
二つの異なる二官能性試薬間の反応を防止すべきであ
る。
一方、機能化された脂質は、アミン又はヒドロキシル
基のような反応性の基を含む脂質、例えばPE、を中間
体、例えばＮ−スクシンイミジルビオチン又はｐ−ニト
ロフェニルビオチン、と反応させて、ある蛋白質が容易
に非共有結合する補因子又はその他の基、例えばビオチ
ン、をこの脂質上に導入して、ビオチン−PEを形成する
ことにより、形成されることもできる。補因子が結合し
ている機能化された脂質は、ストレプトアビジン又はア
ビジンのようなビオチンを必要としている蛋白質と非共
有結合して、本発明の非共有結合蛋白質−リポソーム複
合体を製造することができる。
機能化された脂質は、他の従来のリポソーム生成脂質
と混合されて、反応性リポソームを生成する。機能化さ
れた脂質は、一般に、反応性リポソームの全脂質含有量
の少なくとも約0.1モルパーセント、好ましくは約10モ
ルパーセント以下、最も好ましくは約0.25〜約１モルパ
ーセントを含む。リポソーム内に導入されることのでき
る機能化された脂質の量が10モルパーセントよりも大き
いと認識される限り、このような量は、本発明において
何等有用な機能を果たさない。
本発明の一般的な方法においては、機能化された脂質
を含むリポソーム小胞が形成された後、その機能化され
た脂質を介して、反応性リポソームに蛋白質が結合す
る。リポソームには、任意の蛋白質を結合させることが
できる。しかし、本発明では、リポソームに共有結合又
は非共有結合し、反応性リポソームに結合後、受容体部
位、抗原決定基又はその他の結合部位のような標的にも
結合できるようにそれらの自然の完全性を維持するこれ
らの蛋白質が好ましく意図される。本発明において有用
な蛋白質としては、とりわけ、ストレプトアビジン、抗
体、例えば、IgG、IgM、IgEのようなイムノグロブリ
ン、モノクローナル抗体、酵素、免疫調節剤、例えばイ
ンターロイキン−１、インターロイキン−２、腫瘍壊死
因子（TNF）及びワクチン注射に使用するためのペプチ
ドが挙げられる。
本発明において有用な蛋白質は、リポソームの機能化
された脂質に共有結合することができ、一方、例えばビ
オチンのような補因子を介して、機能化された脂質に非
共有結合することができる。蛋白質と機能化された脂質
との間の共有結合は、蛋白質内に天然に存在するシステ
イニルチオール基と機能化された脂質との反応により形
成されることができ、一方、蛋白質は、二官能性試薬、
例えばSPDP、で変性されて、反応性の基、例えば機能化
された脂質と反応することのできるチオール、を有する
変性蛋白質を生ずることができる。機能化された脂質に
共有結合されるべき蛋白質が、比較的露出されている、
即ち、標的部位への蛋白質の結合に影響を及ぼすことな
く、リポソームの機能化された脂質と反応するのに十分
なだけ蛋白質の外面に露出されている場合は、二官能性
試薬で蛋白質を変性する必要はないかもしれない。しか
し、リポソームに共有結合されるべき蛋白質が、システ
イニル残基を含んでいない場合、又はシステイニル残基
が、標的との蛋白質の結合を阻害することによっての
み、露出されることができる場合は、蛋白質を二官能性
試薬で機能化する必要があるかもしれない。蛋白質二官
能性試薬の機能は、蛋白質を機能化された脂質に共有結
合させることである。
本発明のこの態様において有用な二官能性試薬として
は、脂質に結合して機能化された脂質を生成するのに用
いられる同じ二官能性試薬が挙げられる。本発明のこの
態様においては、二官能性試薬は、蛋白質と反応する少
なくとも一つの基と、機能化された脂質と反応する少な
くとも一つの基とを含む。上に示したように、本発明に
おいては、多数の二官能性試薬が有用である。本発明の
この態様において有用な特に好ましい二官能性試薬は、
SPDPである。
本発明の他の態様においては、蛋白質−リポソーム複
合体を製造する前に、蛋白質が先ず補因子、例えばビオ
チン、に共有結合してもよい。次いで、蛋白質−ビオチ
ン組成物が反応性リポソームの機能化された脂質に共有
結合して、補因子が共有結合している蛋白質−リポソー
ム複合体を製造することができる。用いられる補因子が
ビオチンである発明のこの態様においては、ストレプト
アビジンのような蛋白質をＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドビオチン又はｐ−ニトロフェニルビオチンと反応させ
て、蛋白質−リポソーム複合体を製造する際に使用する
ための共有結合でビオチン化された蛋白質を作ることが
できる。
本発明の他の態様においては、ストレプトアビジン又
はその他のビオチン結合蛋白質を含む蛋白質−リポソー
ム複合体を、更にイムノグロブリンＧ、又は、例えばＮ
−ヒドロキシスクシンイミドでのビオチンへのカップリ
ングによりビオチン化されたモノクローナル抗体へ結合
させることができる。蛋白質をリポソームと標的部位と
の間の吸引カプラーにする蛋白質−リポソーム複合体の
安定性が認められたとこは、全く驚くべきことである。
蛋白質が反応性リポソームに非共有結合している本発
明の態様においては、最も好ましくは、約0.1モルパー
セントと約１モルパーセントとの間の機能化された脂
質、例えばホスファチジルエタノールアミン、を用い
て、リポソームを先ず形成し、蛋白質が非共有結合でき
る補因子、基質又はその他の分子と共有結合させる。あ
る種の蛋白質、例えばアビジン及びストレプトアビジン
が容易に結合できる補因子の好ましい例は、ビオチンで
ある。ビオチンが用いられている本発明のある態様にお
いては、ビオチンがホスファチジルエタノールアミン上
に導入されて、機能化された脂質ビオチン−PEを生成す
る。機能化された脂質は、反応性リポソーム内に導入さ
れ、蛋白質は、機能化された脂質の補因子に非共有結合
する。本発明のある態様においては、機能化された脂質
をビオチンへ共有結合するのに、蛋白質ストレプトアビ
ジンが用いられる。
蛋白質がリポソームに共有結合又は非共有結合して蛋
白質−リポソーム複合体を製造する場合は、リポソーム
が凝集し、サイズが大きくなる傾向がある。理論により
束縛されることなく、蛋白質−リポソーム複合体により
示される凝集現象は、一つ以上のリポソーム上で機能化
された脂質に結合する一つ以上の反応性の基を含む蛋白
質間、又は一つ以上のリポソーム上で補因子を非共有結
合する蛋白質間に生ずる架橋の結果であるかもしれない
と信じられている。ストレプトアビジンの非共有結合の
場合、凝集は、ストレプトアビジンが個別のリポソーム
上の４つのビオチン単位に結合できることの結果である
と信じられている。この架橋の結果、リポソームは凝集
又は固まり易く、蛋白質が結合した反応性リポソームよ
りもサイズの大きいリポソームを生成する。行われた実
験に基づくと、蛋白質−リポソーム複合体に取り込まれ
た蛋白質の量は、凝集に影響を及ぼす。多くの蛋白質が
用いられるにつれて、架橋及び凝集の可能性は大きくな
り、一般に、得られた蛋白質−リポソーム複合体のサイ
ズは大きくなるであろう。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体で利用される蛋白
質の量は、用いられる蛋白質のサイズ、蛋白質と標的部
位との間の結合の強度及び用いられるリポソームのサイ
ズに応じて変動する。一般に、リポソーム小胞当り約10
〜約100個、最も好ましくはリポソーム小胞当り約55〜
約80個の蛋白質分子に等しい量の蛋白質が、機能化され
た脂質に結合する。
本発明の方法においては、蛋白質をリポソームに結合
させた後、凝集リポソームを押し出すことにより、凝集
リポソームのサイズが小さくなり、血液循環時間の著し
い増大を示す、より小さくて安定な非凝集蛋白質−リポ
ソーム複合体を生成することが発見されている。。“安
定な”とは、蛋白質−リポソーム複合体が、押出後少な
くとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、ほぼ同一
のサイズ及び標的への蛋白質結合を維持することを意味
する。蛋白質−リポソーム複合体が、押出工程中濾別さ
れないということは、驚くべき結果である。
本発明の押出態様においては、凝集蛋白質−リポソー
ム複合体を、一般に、約30nmから約100nmの細孔を有す
るフィルターに通して、サイズが直径約75nmから約200n
mの範囲にある蛋白質−リポソーム複合体を製造する。
蛋白質−リポソーム複合体が押し出されるフィルターの
細孔サイズは、約50nmから約100nmの範囲にあることが
好ましい。フィルターは、一般にポリカーボネート製で
あるが、蛋白質−リポソーム複合体と相互に反応せず、
十分な圧力下で押出を行わせるのに十分強い耐久性であ
る物質で作られていてもよい。好ましいフィルターとし
ては、本発明の好ましい押出方法の高圧力に一般に耐え
ることができるために、“直路（straight through）”
フィルターが挙げられる。好ましさでは劣るが、“屈曲
路（tortuous path）”も用いることができる。
当該技術において用いることのできる任意の押出方法
を使用して、本発明のサイズの揃った蛋白質−リポソー
ム複合体を製造することができ、本発明の蛋白質−リポ
ソーム複合体の押出を、高圧下で逐次的又は“直路”で
実施することができる。本発明において使用するための
特に好ましい押出方法としては、Cullis等、PCT出願PCT
/US85/01161、公開番号WO86/00238、名称“リポソーム
を製造する押出技術”、1986年１月16日公開に記載され
たものが挙げられ、その関連部分をここに参照のために
記載した。本発明は、蛋白質へのリポソームのカップリ
ングに続く押出工程から生ずる蛋白質−リポソーム複合
体に関するものである。本発明の蛋白質−リポソーム複
合体を押し出した後、脱水及び再水和し、あるいは４℃
で安定に貯蔵することができる。これらの組成物には、
再水和工程又はそれに続く工程中、形成後の二分子膜を
はさむイオンの電位差により、選ばれた生物活性剤を装
填することができる。リポソーム内へ生物活性剤を装填
する好ましい方法としては、Madden等により、米国特許
出願番号第352,497号、1989年５月15日出願、名称“プ
ロトン勾配によるリポソーム内への薬剤の蓄積”に記載
されている方法が挙げられ、その関連部分をここに参照
のために記載した。一方、脱水前に、蛋白質−リポソー
ム複合体に生物活性剤を加えてもよい。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、被験者、例え
ばヒトを始めとする哺乳動物、に投与することができ
る。組成物は、薬理学的に許容できる担体又はリン酸緩
衝生理食塩水のような希釈剤でこのような被験者に非経
口的に搬送することができる。リポソームに結合された
蛋白質は、リポソーム及びそれらの内容物を体の特定部
位にターゲットする際に、助けとなる。抗腫瘍剤のよう
な生物活性剤の場合のごとく、非経口的に用いられる場
合、使用量は医者によって定められ、治療方法は腫瘍の
大きさ及びその他の条件により決定される。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査にも
用いることができる。この場合、使用される蛋白質−リ
ポソーム複合体の量は、サンプル中の標的化成分に対す
るリポソーム結合抗体の感度に依存するであろう。
ある好ましい実施態様において、蛋白質−リポソーム
複合体を形成するのに用いられる反応性リポソームは、
同時係属中の米国特許出願、名称“単ラメラ小胞を製造
する押出技術”、出願番号第622,690号、1984年６月20
日出願（その関連部分をここに参照のために記載した）
に記載されているLUVET装置を用いて、それ自体形成さ
れ、Leserman等の改良技術（リポソーム技術III、29〜4
0頁、1984年、CRC Press,Inc.,N.Y.）を用いて、ストレ
プトアビジンに結合される。リポソームは、膜内外電位
差、即ち二分子膜をはさんでのNa＋/K＋又はＨ＋勾配で
形成されることができる。同時係属中の米国特許出願番
号第749,161号、Bally等、名称“リポソーム内への抗腫
瘍剤のカプセル化"1985年６月26日出願（その関連部分
をここに参照のために記載した）参照。この電位差は、
リポソームの内部媒質対外部媒質のイオン濃度により達
成される。リポソームに生物活性剤を装填した後、トレ
ハロースのような糖類の存在下又は不存在下に、リポソ
ームを脱水し、この状態で、いつまでも貯蔵することが
できる。同時係属中の米国特許出願番号第759,419号、J
anoff等、名称“脱水リポソーム”、1985年７月26日出
願（その関連部分をここに参照のために記載した）参
照。
本発明で用いられる反応性リポソームは、各種の組成
及び内部含有物を有することができ、多重ラメラ、単ラ
メラ又はその他の種類のリポソーム、より一般的には、
現在知られているか又は今後開発される脂質含有粒子の
形をとることができる。例えば、脂質含有粒子は、普通
に譲渡された米国特許出願番号第476,496、521,176、59
1,576及び599,691、それぞれ、1983年３月24日、1983年
８月８日、1984年３月20日及び1984年４月12日出願（そ
れらの関連部分をここに参照のために記載した）に記載
された種類のステロイドリポソーム、安定複ラメラ小胞
（SPLV）、単相小胞（MPV）又は脂質マトリックスキャ
リヤー（LMC）の形をとることができる。しかし、ここ
で規定されているように、リポソームは、少なくとも約
0.1モルパーセント、好ましくは約10モルパーセント以
下の機能化された脂質を含まなければならないことを認
識すべきである。
本発明のリポソーム製剤に用いることのできるリポソ
ームとしては、合成又は天然のリン脂質が挙げられ、と
りわけ、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジル
エタノールアミン（PE）、ホスファチジルセリン（P
S）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチ
ジン酸（PA）、ホスファチジルイノシトール、スフィン
ゴミエリン（SPM）及びカルジオリピンを挙げることが
でき、単独又は組み合わせて用いられる。本発明におい
て有用なリン脂質としては、ジミリストイルホスファチ
ジルコリン（DMPC）及びジミリストイルホスファチジル
グリセロール（DMPG）を挙げることもできる。他の実施
態様においては、ジステアリルホスファチジルコリン
（DSCP）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPP
C）又は水素化大豆ホスファチジルコリン（HSPC）を用
いることもできる。ジミリストイルホスファチジルコリ
ン（DMPC）とジアラキドノイルホスファチジルコリン
（DAPC）を同様に用いてもよい。これらのリポソームを
作るためには、DSPC（約65℃のTc）、DPPC（約45℃のT
c）及びDAPC（約85℃のTc）のように、脂質の転移温度
（Tc）が高いので、このような脂質をそれらのTc前後、
あるいはTcよりもわずかに高い、例えば約５℃までの高
い温度に加熱するのが好ましい。好ましい実施態様で
は、卵ホスファチジルコリンが用いられる。
本発明の多数の実施態様において、リポソームにステ
ロイド成分を添加してもよい。本発明の目的で、リポソ
ームを作るために単独又はリン脂質と組み合わせて用い
ることのできる上記脂質を含む任意の成分を、リポソー
ム生成脂質と言う。本発明の好ましい実施態様において
は、リポソーム生成脂質は、リポソームの脂質の全重量
の少なくとも90モルパーセントを含む。上記リン脂質
は、いずれも、コレステロール、コレスタノール、コプ
ロスタノール、コレスタンからなる群より選ばれた少な
くとも一つの他の成分と併用することができる。更に、
コレステロールのポリエチレングリコール誘導体（PEG
−コレステロール）及びステロールの有機酸誘導体、例
えばコレステロールヘミスクシネート（CHS）を、上記
リン脂質のどれかと併用することもできる。アルファト
コフェロールヘミスクシネート（THS）の有機酸誘導体
を用いてもよい。CHS、THS含有リポソーム及びそれらの
トリス塩形態は、得られたリン脂質−ステロール混合物
が蛋白質と架橋できる安定なリポソームを生成する限
り、ステロールを含むリポソームを調製する任意の公知
方法で調製することができる。特に、Janoff等、米国特
許第4,721,612号、1988年１月26日発行、名称“ステロ
イドのリポソーム”及びJanoff等、PCT公開番号87/0221
9、1987年４月23日公開、名称“アルファトコフェロー
ルを基体とした小胞”の方法参照。好ましい実施態様に
おいては、コレステロールが、45:54のEPCに対するコレ
ステロールの重量比で、EPCと併用される。
逆相蒸発、温浸法及び界面活性剤希釈等の大単ラメラ
リポソーム（LUV）を作るのに用いられる技術を、反応
性リポソームを製造するのに用いることができる。リポ
ソームを製造するこれら及びその他の方法の総説が、Ma
rc J.Ostro編、リポソーム、Marcel Dekker,Inc.New Yo
rk（1983）、第１章に見られ、その関連部分をここに参
照のために記載した。
反応性リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体を製
造するために、いくつかの押出法を用いることができ
る。反応性リポソームを製造するためには、MLVは、使
用されるフィルターサイズに応じたサイズの大単ラメラ
小胞（LUV）を形成するフィルターを通して、押し出さ
れるのが好ましい。一般に、本発明のサイズの揃った蛋
白質−リポソーム複合体を製造するためには、30、50、
60又は100nmの細孔のポリカーボネートフィルターを用
いることができる。この方法では、Cullis等、PCT公開
番号WO86/000238、1986年１月16日、に記載され、その
関連部分をここに参照のために記載したように、リポソ
ーム懸濁液を繰り返して押出装置に通すことにより、均
一なサイズ分布のリポソーム個体群が生じる。例えば、
濾過は、直路膜フィルター（Nucleoporeポリカーボネー
トフィルター）若しくは屈曲路フィルター［例えば、0.
1umサイズのNucleoporeフィルターメンブラフィルフィ
ルター（混合セルロースエステル）］を通して、又は均
質化のような代わりの粉砕技術により行われる。反応性
リポソームのサイズは、直径が約30nmから約200nmまで
変わるかもしれないが、反応性リポソームは、サイズが
約100nmから約200nmであることが好ましい。一般に、サ
イズの揃った蛋白質−リポソーム複合体は、サイズが約
75nmと約200nmの間の範囲にある。
上述のごとく、室温よりも上の液晶Tcに対してゲルを
有する反応性脂質を形成するために、多数の脂質を用い
ることができる。このような場合、加熱バレル又は熱ジ
ャケットを有する押出機を用いることができる。このよ
うな装置は、LUVの押出を行わせるリポソーム懸濁温度
を高める働きをする。熱ジャケット付き押出機で用いら
れる脂質は、例えばDSCP、DPPC、DMPC及びDAPCであり、
ある実施態様では、コレステロールが挙げられる。DSPC
を含むリポソームは、一般に約65℃で、DPPCは約45℃
で、DAPCは約85℃（脂質Tcより約５℃高い）で押し出さ
れる。
押出後、反応性リポソーム又は蛋白質−リポソーム複
合体は、生物活性剤を装填してもよく、あるいは貯蔵の
ために脱水してもよい。しかし、蛋白質−リポソーム複
合体の場合は、押出工程中に、生物活性剤の多少の損失
が生ずるかもしれない。この起こりうる結果を避けるた
めに、押出後に生物活性剤を装填するのが好ましい。本
発明のリポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体は、標
準凍結乾燥装置又は同等の装置を用いて脱水することが
でき、もし必要であれば、リポソーム又は蛋白質−リポ
ソーム複合体とそれらの周囲の媒質とを、脱水前に液体
窒素中で凍結させることができる。一方、リポソーム及
び蛋白質−リポソーム複合体は、前もって凍結せず、単
に減圧下に置くことにより、脱水することもできる。前
もっての凍結を伴う脱水には、試料中に一つ又はそれ以
上の保護糖類が存在することが必要である。トレハロー
ス、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース
及びデキストランを始めとする各種の糖類を用いること
ができる。一般に、二糖類の方が単糖類よりも良好に働
くことが分かっており、二糖類については、トレハロー
ス及びスクロースが最も有効である。
リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体の内部又は
外部媒質のいずれかの一部として、一つ又はそれ以上の
糖類が含まれる。糖類が、リポソーム及び蛋白質−リポ
ソーム複合体の膜の内面と外面の両方と相互に作用でき
るように、糖類が内部及び外部媒質の両方に含まれるこ
とが最も好ましい。内部媒質への含有は、一つ又はそれ
以上の糖類を、リポソームがカプセル化しようとする溶
質に加えることにより達成される。ほとんどの場合、こ
の溶質は、仕上げられたリポソームの外部媒質（bathin
g medium）を形成するものでもあるので、この溶質に糖
類を含ませることにより糖類が外部媒質の一部となる。
もちろん、例えば、膜内外電位差を生成するために、当
初の溶質以外の外部媒質を用いる場合は（下記参照）、
その新しい外部媒質も、一つ又はそれ以上の糖類を含ま
なくてはならない。
前もって凍結せずに脱水する場合、脱水されるリポソ
ーム及び蛋白質−リポソーム複合体が多脂質層を有し、
膜の実質的な部分が、再水和に際してそれらの完全性を
維持するように、製剤中に水が十分残る終点まで、脱水
が行われるならば、一つ又はそれ以上の保護糖類の使用
は省略してもよい。脱水工程の終わりに、製剤が、脱水
前に製剤中に存在する当初の水の少なくとも約２％、最
も好ましくは約２％〜約５％を含んでいれば、好ましい
ことが分かっている。
リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体が脱水され
れば、それらを使用するまで、長期間にわたって貯蔵さ
れることができる。脱水されたリポソーム又は蛋白質−
リポソーム複合体を使用する場合は、単に、リポソーム
又は蛋白質−リポソーム複合体に水溶液、例えば蒸留
水、を加え、それらを再水和することにより、再水和が
行われる。
上で論じたように、本発明のリポソーム及び蛋白質−
リポソーム複合体製剤にイオン化しうる薬理学的剤、例
えば抗腫瘍剤、を装填するが、その際、リポソーム又は
蛋白質−リポソーム複合体の二分子膜をはさんで膜内外
電位差を生成し、膜内外電位差により抗腫瘍剤をリポソ
ーム内に装填する。膜内外電位差は、リポソーム膜をは
さんで、一つ又はそれ以上の帯電種（例えばNa＋、Ｋ＋
及び／又はＨ＋）について濃度勾配を作ることにより、
生成される。濃度勾配は、異なる内部及び外部媒質、即
ち一つ又はそれ以上の帯電種の濃度が異なる内部及び外
部媒質、を有するリポソーム及び蛋白質−リポソーム複
合体を製造することにより、作られる。
具体的には、一つ又はそれ以上の帯電種の第一の濃度
を有する第一の媒質をカプセル化する、本発明の蛋白質
−リポソーム複合体を製造するために用いられる反応性
リポソームが調製される。代表的なリポソーム調製技術
（上記議論参照）については、リポソームが形成される
とき、この第一の媒質がリポソームを取り囲み、従っ
て、リポソームの当初の外部媒質は、第一の媒質と同じ
組成を有するであろう。濃度勾配を作るために、当所の
外部媒質を、一つ又はそれ以上の帯電種の異なる濃度を
有する新しい外部媒質と交換する。外部媒質の交換は、
新しい媒質で平衡化されたゲル濾過カラム、例えばセフ
ァデックス（Sephadex）カラム、にリポソーム試料を通
すこと、又は遠心分離、透析あるいは関連技術などの種
々の技術により行うことができる。
この発明によれば、イオン化しるう抗腫瘍剤は、リポ
ソームあるいはサイズを揃えた蛋白質−リポソーム複合
体内に装填するために、膜内外電位差が使用できること
が分かっている。具体的には、濃度勾配を有するリポソ
ーム、従って適当な向きの電位差が作られると、リポソ
ーム内に医薬を装填する方法が、その剤を外部媒体に添
加するという極めて簡単な工程に短縮される。添加すれ
ば、膜内外電位差が、自動的に剤をリポソーム内に装填
することになる。
膜内外電位差装填法は、抗腫瘍剤を始めとする、適当
な水性媒質（例えば、プロトン化されることのできるア
ミノ基を含む有機化合物）に溶解した際に帯電状態で存
在することのできる事実上任意の薬理学的剤について用
いることができる。好ましくは、この剤は、リポソーム
膜内に分配するように、比較的親油性でなければならな
い。この方法によりリポソーム内に装填することのでき
る薬理学的剤のいくつかの例としては、多くの多の医薬
の中でもとりわけ、抗腫瘍剤、例えばドキソルビシン、
ミトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、スト
レプトゾシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、塩酸
メクロレタミン、メルファラン、シクロホスファミド、
トリエチレンチオホスファーアミド、カルムスチン、ロ
ムスチン、セムスチン、フルオロウラシル、ヒドロキシ
尿素、チオグアニン、シタラビン、フロクスウリジン、
デカルバジン、シスプラチン及びプロカルバジン；局所
麻酔剤、例えばリドカイン、ジブカイン及びクロルプロ
マジン；気管支拡張薬、例えばメタプロテレノール、テ
レブタリン及びイソプロテレノール；ベータ−アドレナ
リン遮断薬、例えばプロパノール、チモロール及びラベ
トロール；抗高血圧薬、例えばクロニジン及びヒドラシ
ン；抗うつ薬、例えばイミプラミン、アミトリプチリン
及びドキセピン；抗けいれん薬、例えばフェニトイン；
抗嘔吐薬、例えばプロカインアミド及びプロクロルペラ
ジン；抗ヒスタミン薬、例えばジフェンヒドラミン、ク
ロロフェニラミン及びプロメタジン；抗不整脈薬、例え
ばキニジン及びジソピラミド；抗マラリア薬、例えばク
ロロキン、キナクリン及びキニン；並びに鎮痛薬が挙げ
られる。
一つの薬理学的剤を装填することに加えて、複数の薬
理学的剤を同時又は逐次的に装填する方法を用いること
ができる。また、イオン化しうる抗腫瘍剤が装填される
蛋白質−リポソーム複合体それ自体に、通常のカプセル
化技術を用いて（例えば、リポソームが作られる緩衝液
に薬剤を取り込むことにより）、他の抗腫瘍剤又は薬剤
を前装填することができる。
薬理学的剤を複合体に維持するように向けられる蛋白
質−リポソーム複合体膜をはさんでの膜内外電位差を作
ることにより、薬理学的剤の放出速度を著しく低下させ
ることができることが知られている。即ち、イオン化さ
れた際に正に帯電する剤については、外部電位に対して
負である内部電位を有する膜内外電位差が、蛋白質−リ
ポソーム複合体膜をはさんで作られ、一方、負に帯電す
る剤については、反対の向きが用いられる。
この発明の膜内外装填態様に関しては、Na＋、Ｋ＋及
び／又はＨ＋のような帯電種のリポソームは蛋白質−リ
ポソーム複合体の内側及び外側の濃度を調整することに
より、薬剤放出速度を低下させるために用いられる膜内
外電位差が作られる。事実、このような濃度勾配によっ
て生成された膜内外電位差により、リポソーム又は蛋白
質−リポソーム複合体が装填されたとすれば、当初の濃
度勾配を維持する外部媒質中にリポソーム又は蛋白質−
リポソーム複合体を単に保持するだけで、所望の放出速
度低下が得られるであろう。一方、膜内外電位差が、リ
ポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体膜をはさんで、
まだ作られていなかったとすれば、例えば、リポソーム
又は蛋白質−リポソーム複合体が、通常の方法を用いて
装填されていたとすれば、上記交換技術を用いて、外部
媒質の組成を変えることにより、所望の膜内外電位差を
容易に作ることができる。
蛋白質−リポソーム複合体の脱水に関するこの発明の
方法態様においては、二つの基本的なアプローチが提供
される。第一のアプローチでは、複合体に生物活性剤を
装填し（例えば、通常の方法又は上述の膜内外電位差装
填技術を用いて）、貯蔵、輸送等の目的で脱水し、次い
で、使用時に再水和することができる。一方、前もって
形成されたリポソーム複合体を、貯蔵等のために脱水
し、使用時又はその近くで再水和し、上述の膜内外電位
差装填技術を用いて、イオン化しうる生物活性剤を装填
することができる。
脱水された蛋白質−リポソーム複合体を使用する場合
は、水性溶液、例えば蒸留水又は適当な緩衝液、を蛋白
質−リポソーム複合体に単に加えて、再水和させること
により、再水和を行。溶液を静かに渦巻かせることによ
り、水溶液中に複合体を懸濁させてもよい。再水和は、
室温、又はリポソームの組成及びそれらの内部含有物に
適当な他の温度で行うことができる。
投与しようとする生物活性剤が、脱水前に蛋白質−リ
ポソーム複合体内に取り込まれており、それ以上の変更
が要求されないのであれば、再水和された複合体を、リ
ポソームカプセル化薬剤を投与する公知の方法を伴う治
療に直接使用することができる。
一方、上に述べた膜内外電位差法を用いて、投与直前
に、イオン化しうる生物活性剤を再水和された蛋白質−
リポソーム複合体内に取り込むことができる。このアプ
ローチに関連して、膜内外電位差を生成するのに用いら
れる濃度勾配は、上述の外部媒質交換技術を使用して、
脱水前か再水和の後かのいずれかに作ることができる。
同一の内部及び外部媒質を有する、即ち膜内外電位差
のない蛋白質−リポソーム複合体は、調製、脱水、貯
蔵、再水和され、その後、外部媒体を、膜内外電位差を
生成することのできる組成を有する新しい媒質と交換
し、この膜内外電位差を、リポソーム内にイオン化しう
る抗腫瘍剤を装填するのに用いることができる。一方、
膜内外電位差を生成することのできる内部及び外部媒質
を有する蛋白質−リポソーム複合体は、調製、脱水、貯
蔵、再水和され、その後、膜内外電位差を用いて装填す
ることができる。
本発明の蛋白質−リポソーム及びリポソーム複合体
は、ヒトを始めとする哺乳動物のような被験者に投与す
ることができる。病気の治療におけるヒトへの投与につ
いては、処方する医者が、特定のヒト被験者への適当な
投与量を最終的に決めるであろう。そして、これは、患
者の症状の性質及び重さと共に、個人の年齢、体重及び
反応によって変わるものと予測することができる。
投与の形態によって、化合物が搬送される生体内の部
位が決まるであろう。例えば、感染の特定部位への搬送
は、局所塗布（もし、感染が外部的、例えば、目、皮
膚、耳内のような領域、又は創傷や火傷のような病気、
であれば）又は上皮若しくは皮膚粘膜ライニングによる
吸収（例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、胃腸内、
粘膜等）により、最も容易に行うことができる。このよ
うな局所塗布は、クリーム又は軟膏の形で行うことがで
きる。生物活性剤を含む蛋白質−リポソーム複合体は、
単独で投与されてもよいが、一般には、目的とする投与
経路及び標準製薬プラクティスに関連して選択された製
薬担体と混合して投与されるであろう。本発明の蛋白質
−リポソーム複合体は、非経口で、例えば静脈内、筋肉
内又は皮下に注射してもよい。非経口投与については、
それらを、例えば、溶液を等張性にするのに十分な塩、
グルコース又はぶどう糖のような他の溶質をを含んでも
よい無菌水溶液の形で用いるのが最良である。
経口投与形態については、本発明の蛋白質−リポソー
ム複合体は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、粉
末薬、シロップ、エリキシル剤、水溶液、懸濁液等の形
で使用することができる。錠剤の場合、使用できる担体
としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム及びリン酸
の塩が挙げられる。デンプンのような種々の崩壊剤及び
潤滑剤、例えばデンプン、を用いることができる。カプ
セル形態での経口投与については、有用な希釈剤は、ラ
クトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。
経口用に水性懸濁液が必要な場合は、ある種の甘味及び
／又は着香剤を加えることができる。
本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査にも
用いることができる。この場合、使用される組成物の量
は、試料中の標的成分に対するリポソーム結合抗体の感
度に依存するであろう。
次の実施例は、説明の目的でのみ与えられるものであ
り、この発明の範囲を限定するものと考えるべきではな
い。
実施例 材料及び方法 卵ホスファチジルコリン（EPC）、卵ホスファチジル
エタノールアミン（EPE）及びジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミン（DPPE）は、Avanti Polar Lip
ids（Birmingham,Ala.USA）から入手した。Ｎ−スクシ
ンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート（SMPB）は、Molecular Prob
es,Oregon,USAから入手し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドビオチン（NHS−ビオチン）は、Pierce Chemicals
から入手した。ジチオスレイトル（DTT）、Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルホ
ン酸（EPPS）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホ
ン酸（MES）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸（HEPES）、FITC−セライ
ト、エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、ジチオビス−
２−ニトロ安息香酸（DTNB）、Ｎ−エチルマレイミド
（NEM）、牛血清アルブミン（BSA）、カルボキシフルオ
レセイン、ストレプトアビジン、ビオチン化プロテイン
Ａ、ビオチン化アルカリホスファターゼ、ビオチン化ス
クシニル化コンカナバリンＡ及びセファデックス（Seph
adex）G50は、Sigma,USAから入手した。抗ヒト赤血球Ig
Gは、Cappel,Inc.USAから購入し、ビオチン化抗B1（PAN
−Ｂ、IgG 2a）及びビオチン化抗T11（Ｅ−ロゼット、
IgG １）は、Coulter Electronics,USAから入手した。
セファロースCL−4B及びフィコールパーク（ficoll paq
ue）は、Pharmacia,New Jersey,USAから入手した。3Hビ
オチンは、Amersham,New Jersey,USAから入手し、14Cコ
レステロールは、New England Nuclear,USAから入手し
た。
実施例１及び２ Ｎ−３［−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル−］ホ
スファチジルエタノールアミン（PDP−PE）及びＮ−
［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ホスファ
チジルエタノールアミン（MBP−PE）の合成 Leserman等、Nature（London）288,602（1984）によ
り記載されているように、PDP−EPEを合成した。簡単に
言うと、50umolのEPEをクロロホルム／メタノール（9:
1）3.5mlに溶解し、60umolのSPDPと1000umolのトリエチ
ルアミンを含むメタノール15mlに加えた。室温での４時
間のインキュベーションの後、薄層クロマトグラフィー
（TLC、ランニング溶剤：クロロホルム／メタノール／
水、65:25:4）で分析すると、EPEの99％がより速いラン
ニング生成物に変換していた。反応混合物を、10mlのリ
ン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。減圧下で有機相を除去
する前に、この洗浄を３回繰り返した。２ディメンジョ
ンTLC及びプロトンNMRで分析すると、98％よりも純度の
高い単一の生成物が得られていた。PDP−Ｅを、窒素
下、クロロホルム中、20℃で数カ月貯蔵した。
少し変更を加えたMartin等（1982）の方法により、最
初にMBP−PEを合成した。EPE（100umol）を、100umolの
新しく蒸留したトリエチルアミンと50mgのSMPBとを含む
無水メタノール5mlに溶解した。窒素下、常温で反応を
行い、その進行をTLC（流出溶剤：クロロホルム／メタ
ノール／水、65:25:4）でモニターした。18時間のイン
キュベーションの結果、PEPの95％が、より速い流出生
成物に変換された。減圧下でメタノールを除去し、サン
プルをクロロホルムに溶解し、１％NaClで広範に（exte
nsively）洗浄して、未反応SMPB及び残留トリエチルア
ミンを除去した。Martin等、J.Biol.Chem.257,286（198
2）により用いられた溶剤系を用いたTLC分析により、脂
質生成物が、ニンヒドリンに敏感でなく（ninhydrin−i
nsensitive）リン酸塩に陽性である（phosphate positi
ve）単一成分として流出されたことが分かった。更に、
２ディメンジョンTLC（第１ディメンジョン、塩基：ク
ロロホルム／メタノール/Nh3/H2O、90/54/5.7/5.3;第２
ディメンジョン、酸：クロロホルム／メタノール／酢酸
/H2O、60/30/18/2.85）により反応生成物を確認したと
ころ、ニンヒドリンに陰性で、リン酸塩に陽性である２
つの脂質成分が存在することが分かった（酸ディメンジ
ョンでのRf値:0.93及び0.783）。これらの観察は、1HNM
R分析により確認され、全脂質画分の約60％を含むより
遅い流出生成物が、純粋なMPB−DPPEとして同定され
た。
上で合成された２つのチオール反応性脂質、PDP−EPE
とMPB−EPEを、従来技術によるチオール化IgGとのカッ
プリング反応に供し、２つの架橋基のどちらがより効率
的であるかを求めた。図１に示すように、20モル％より
も多くのコレステロールがリポソーム内に取り込まれる
までは、PDP−EPEを含むリポソームに対するチオール化
IgGの顕著なカップリングは起こらなかった。これに対
して、MPB−EPEを含むリポソームについては、コレステ
ロールが存在していなくても、12ugIgG/umol脂質の水準
が得られた。リポソームに複合した蛋白質の水準は、小
胞内に取り込まれたコレステロールの量に関して、直線
的に増加した。EPEのマレイミド誘導体については、試
験した全ての条件下で、著しく高いカップリング率が得
られた。
実施例３ 純粋なMPB−PEの合成 トリエチルアミン（10mg）を含むクロロホルム（5m
l）中、40℃で、DPPE（69mg）をSMPB（65mg）と反応さ
せることにより、純粋なMPB−PEを合成した。２時間
後、シリカでのTLCにより、DPPEがより速い流出生成物
へ変換したことがわかった（溶剤系：クロロホルム／メ
タノール／アセトニトロール／水、75:16:5:4、Rf:0.
6）。溶液をクロロホルム（10ml）で希釈し、NaCl（0.9
％）で数回洗浄して反応の副生成物を除去した。この溶
液を、真空中で更に濃縮し、固体残渣を粉末化し、ジエ
チルエーテルから再結晶して未反応SMPBを除去した。更
にジエチルエーテル／アセトニトリルから再結晶するこ
とにより、1HNMR分析（Bruker W40、400MHz）で示され
るように、純粋な生成物が生じた。ブリティッシュコロ
ンビア大学、ブリティッシュコロンビア地方質量分光学
センターにおいて、AEI MS9で、高速作用衝撃（Fast A
cting Bombardment）（FAB）質量スペクトルを得た。
実施例４ MPB−PEを形成する反応の分析 実施例２に従ってDPPEをSMPBと反応させることにより
得られた脂質の1HNMR分析から、1HNMRスペクトルの低フ
ィールド領域に、予測される生成物に特有なものではな
い新しいピークが出現し、SMPBのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド基によるシグナルが喪失したことがわかる（デ
ルタ:7.58、7.15及び6.45、6.22）。SMPBでDPPEを誘導
するための条件をもっと良く理解するために、SMPBと反
応するモデルアミンとして、２−メトキシエチルアミン
（CH3O−CH2CH2−NH2;図３、構造Ａ）を選択した。
SMPBの1HNMRスペクトルは、フェニル基の芳香族プロ
トンによる低フィールド共鳴（化学シフト（デルタ）:
7.3及びビニルプロトン（デルタ:6.86）並びにＮ−ヒド
ロキシスクシンイミジル基のメチレンに関する高フィー
ルド共鳴（NHS、デルタ:2.86）を示す。MPB−PEの従来
の合成について述べた同様な条件下で、２−メトキシエ
チルアミンをSMPBとインキュベートしたとき、SMPBより
も極性の大きい２つの主要生成物が、TLCにより検出さ
れた（図３及び以下の表１参照）。SMPBのNHS基の４つ
のメチレンプロトンについてのデルタ2.86においてピー
クが喪失し、デルタ3.35（OCH3による）及びデルタ3.45
（Ｏ−CH2CH2;図３、構造Ｂによる）において新しいピ
ークが出現したため、SMPBからＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（NHS）の置換により形成されたアミドとして、
より極性の低い生成物が1NHMR分析により同定された。
極性の大きい方の生成物を1HNMRで分析することによ
り、環構造（図３、構造Ｃ）のメタノリシスによるマレ
イミド基の開環と一致するパターンがわかった。例え
ば、表１に示すように、４つの芳香族プロトンについて
のシグナルが、デルタ7.58における２つの明確な二重線
（d,J＝8H、２つのプロトン）として出現し、一方、２
つのビニルプロトンについての共鳴が、上のフィールド
に移動し、デルタ6.22及びデルタ6.45における２つの二
重線（Ｊ＝13Hz）として出現した。
３つのプロトンについて統合されたデルタ3.86におけ
るシャープなピークの出現は、マレイミド基にメタノー
ルを添加したために生じたものと解釈され、その結果、
環部分が開くことになった。これらの結果は、質量スペ
クトル分析（構造B:分子式C17H20N2O4、316において分
子イオン；構造C:分子式C18H24N2O5、348において分子
イオン）により更に支持された。Martin等の従来法によ
り合成されたMPB−DPPE脂質の1HNMR分析によっても、サ
ンプル中に純粋及び開環MPB−DPPE誘導体の混合物が存
在することがわかった。
塩基性存在下におけるメタノール性環開裂に対するマ
レイミド基の感受性は、SMPBのメタノール溶液をトリエ
チルアミンで処理した場合、より極性の高い生成物が形
成されることにより確認された（下記表１）。クロロホ
ルム中において、SMPBがはるかに安定であることがわか
ったので、１当量のトリエチルアミンを含むこの溶剤中
で、SMPBでのDPPEの誘導を行った。得られた脂質誘導体
は、1HNMRにより純粋なMPB−DPPEであることがわかった
（図２）。質量分光分析（FAB）により、MPB−DPPEのナ
トリウム塩に対応するC51H84O11PNaの分子式に相当する
955における分子イオンが存在することから、脂質誘導
体の純度が確認された。
実施例５ リポソームの調製 Hope等（1985）により記載されたようにして、大単ラ
メラ小胞（LUV）を調製した。簡単に説明すると、クロ
ロホルム中の脂質混合物の適当な一定量をチューブに入
れ、窒素気流下で乾燥して脂質フィルムとし、次いで、
２時間高真空にした。常法により、150mM NaCl、25mM H
EPES、25mM MES、pH6.5中で、脂質サンプル（50〜54％E
PC、45％コレステロール、実施例１〜３により調製した
１〜５％反応性脂質）を水和し、２枚重ねの100nmフィ
ルターから10回押し出した。カップリング実験の直前
に、サンプルを、NaOHで適当なpHに滴定した。カップリ
ング工程のチオール依存性を研究するために１％（カッ
プリングについて）、及びマレイミド活性については５
％の純粋なMPB−DPPEを含むリポソームを、上述のよう
にしてpH6.5で調製し、NaOHでpH7.5に滴定し、一部を、
マレイミド脂質１モル当りｂ−メルカプトエタノール10
モルのモル比で、５分間、ｂ−メルカプトエタノールと
インキュベートした。25mM HEPES、25mM MES、150mM Na
Cl、pH7.5で平衡化したセファデックスＧ−50で、遊離
のｂ−メルカプトエタノールからリポソームを分離し
た。クエンチされたリポソームのカップリング効率ポテ
ンシャル及びマレイミド基の反応性を、クエンチされて
いないリポソームのそれと比較した。Fiske及びSubbaro
w、J.Biol.Chem.66,325（1925）の比色測定法又は脂質
混合物内に存在する微量の14Cコレステロールのどちら
かにより、脂質を測定した。
これは、Packard Tri Carb液体シンチレーションアナ
ライザーでのシンチレーション計数により行われた。
実施例６ マレイミド反応性の測定 MPB−PEのマレイミド基の反応性は、Sedlack等、Ana
l.Biochem.25,192（1968）により記載されているように
して、脂質誘導体へのｂ−メルカプトエタノールのチオ
ール結合、及びエルマン試薬（Ellman's reagent）、ジ
チオビス−（２−ニトロ安息香酸）（DTNB）、での未結
合ｂ−メルカプトエタノールの逆滴定により測定した。
リポソーム（５％MPB−DPPE、50％EPC、45％コレステロ
ール、200ul中1umol）を、pH8.2（0.2MトリスCl、20mM
EDTA、１％トリトン（Triton）Ｘ−100、pH8.2、1.6m
l）、室温で30分間、ｂ−メルカプトエタノール（1mMの
100ul）とインキュベートした。DTNB（100ul、メタノー
ル中20nM）を添加し、30分後、412nmにおいて吸光度を
測定した。カップリング工程において蛋白質結合チオー
ル基が必要であることを、下記表２に示す。MPB−DPPE
リポソームを前もってｂ−メルカプトエタノールにさら
すと、クエンチされたサンプルを対照MPB−DPPEと比較
した場合、リポソーム複合ストレプトアビジンの量が低
下することになる。これに平行して、脂質誘導体のマレ
イミド基の検出可能な反応性が低下した。更に、未処理
ストレプトアビジンは、マレイミド脂質を含むリポソー
ムと結合しなかった。
結果：リポソーム（１又は５％MPB−DPPE、54〜50％EP
C、45％コレステロール）を、pH7.5で５分間、ｂ−メル
カプトエタノール（MPB−DPPEに対して10モル過剰）で
クエンチし、HBS、pH7.5で平衡化したセファデックスＧ
−50にて交換して、ストレプトアビジンとあるいは単独
でインキュベートした（pH7.5、室温で８時間）。８時
間のインキュベーション後、対照（クエンチされていな
いMPB−DPPEリポソーム又は未チオール化ストレプトア
ビジン）及びクエンチされたサンプルについて、リポソ
ームに複合したストレプトアビジンの量及びマレイミド
基の反応性を測定した。示したように、ストレプトアビ
ジンのようなある場合は、他の蛋白質と同様に、反応性
チオールの存在が、反応性リポソームへの蛋白質のカッ
プリングを著しく促進する。事実、ストレプトアビジン
の場合、チオール基の存在が必要であるように思われ
る。
別に、Martin等、前出、の従来法により合成されたMP
B−PE脂質及び本発明の方法により合成されたMPB−PE
を、pH7.5におけるｂ−メルカプトエタノールでの滴定
に供した、リポソーム（１又は５％MPB−PE、54〜50％E
PC、45％コレステロール）を、pH7.5で５分間、ｂ−メ
ルカプトエタノール（MPBV−PEに対して10モル過剰）で
クエンチし、HBS、pH7.5で平衡化したセファデックスＧ
−50にて交換して、ストレプトアビジンと、あるいは単
独でインキュベートした。８時間のインキュベーション
後、対照（クエンチされていない）及びクエンチされた
サンプルについて、リポソームに複合したストレプトア
ビジンの量及びマレイミド基の反応性を測定した（上記
参照）。純粋なMPB−PEは、従来法により作られたMPB−
PEよりもｂ−メルカプトエタノールでのクエンチングが
大きくなった。結合したストレプトアビジンの量に大き
な差がないのは、恐らく、ストレプトアビジンのチオー
ル基がマレイミドと反応するのを妨げる立体相互作用の
結果であろう。この実験の結果は、以下の表３に見られ
る。
実施例７ カップリング用ストレプトアビジン及びIgGの調製 上述のごとく、ある場合には、ストレプトアビジン蛋
白質をMPB−PE含有反応性リポソームに結合させるため
に、その蛋白質を変性して、反応性チオール基を導入す
ることが必要である。
ストレプトアビジン（25mM HEPES、150mM NaCl、pH7.
5;HBS、pH7.5、中5mg/ml）を、Carlsson等、Biochem.J.
173,723（1978）の公表された方法にしたがって、アミ
ン反応性試薬、SPDP、で変性した。簡単に述べると、SP
DP（メタノール中25mM）を、室温で30分間、ストレプト
アビジンに対して10モル比でインキュベートした。未反
応SPDPを、HBS、pH7.5で平衡化したセファデックスＧ−
50でのゲル濾過により除去した。PDP変性ストレプトア
ビジンをDTTで還元した（25mM、10分）。チオール化生
成物を、適切な緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−
50にて、ゲル排除により単離し、直ちにカップリング実
験に使用した。ジチオスレイトル（DTT）添加前に、280
nm（吸光率、E280:2770）における蛋白質の濃度を、そ
してDTTの添加10分後に、343nm（E343:7550）における
２−チオピリドンの濃度を測定することにより、ストレ
プトアビジンの変性の程度を求めた。IgGの場合は、ス
トレプトアビジンについて述べたようにしてSPDPで変性
後、蛋白質をFITC−セライトで蛍光標識した（IgG 50％
重量、20分）。蛋白質をDTTで処理する前に、酢酸緩衝
液（100mM NaCl、100mM酢酸ナトリウム、pH5.0）で平衡
化したセファデックスＧ−50にて、未反応試薬からサン
プルを分離し、その分子の固有のジスルフィドの還元か
ら保護した。両蛋白質資料は、SPDPで同程度に変性され
た（蛋白質当り約５〜6SPDP分子）。
実施例８ リポソームへの蛋白質のカップリング 還元されたPDP変性蛋白質を、種々のpH値で100ug蛋白
質/umol脂質（1mM最終濃度）の割合でPDP−PE、MPB−EP
E又は純粋なMPB−DPPEを含むリポソームとインキュベー
トすることにより、リポソームへの蛋白質のカップリン
グを実施した。HBS、pH7.5で平衡化したセファロースCL
−4Bでのゲル濾過により、未結合蛋白質を除去した、リ
ポソームへのストレプトアビジンのカップリング量は、
ストレプトアビジンへの3Hビオチンの結合をモニターす
ることにより測定された。簡単に述べると、ストレプト
アビジン−リポソーム（0.5ml中0.25umol脂質）を、3H
ビオチン（25ul中3.85nmol、15.4umol/uCi）で10分間イ
ンキュベートし、HBS、pH7.5で平衡化したセファロース
CL−4Bでのゲル排除により、未結合ビオチンを除去し
た。セファデックスＧ−50でのゲル排除後のストレプト
アビジンサンプル（10ug）への3H結合の量を、カップリ
ング率を計算するための参考として用いた。リポソーム
に結合した抗体の量を測定するために、サンプル（200u
l）をエタノール（1.8ml）に溶解し、リポソーム結合蛍
光を既知量のフルオレセイン標識抗体と関連づけた。49
5の励起波長を有するSLM−aminco SPF−500C蛍光分光光
度計を用いて、520nmにおいて蛍光をモニターした。
実施例９ 純粋なMPB−DPPEを含むリポソームにチオール化ストレ
プトアビジンを結合させるための最適条件 純粋なMPB−DPPEを含むリポソームに、チオール化ス
トレプトアビジンを結合させるための最適条件を調べ
た。結果を図４及び５に示す。MPB−DPPEリポソームに
対するチオール化ストレプトアビジン結合のpH依存性及
びマレイミド機能を、始めに決定した。図４に示すよう
に、リポソーム複合蛋白質の量は、7.0よりも大きいpH
値において、急速に増大した。しかし、純粋なMPB−DPP
Eを含むリポソームを、7.0以上のpH値においてインキュ
ベートすると、誘導された脂質のマレイミド基が、対応
して急速に分解した。18時間のインキュベーション後、
pH7.5において、顕著な水準のストレプトアビジンがリ
ポソームに結合し（45％）、マレイミド反応性の喪失も
許容できるものであった（65％残存）。このため、カッ
プリング条件を更に最適化するために、7.5のpHを選択
した。
図５には、リポソームに対するストレプトアビジン結
合及びマレイミド脂質の反応性に関連する時間経過を示
す。この結果から、pH7.5及び室温で８時間インキュベ
ーション後に、リポソームに複合したストレプトアビジ
ンの最適水準（脂質1umol当り約37ug）が得られ、マレ
イミド基の分解も最小になることがわかる。
実施例10 種々のビオチン化蛋白質へのカップリングの適用性 種々のタイプのターゲッティング分子をリポソームに
結合する際における、本発明の一般的な方法論の適用性
を示すために、ストレプトアビジン−リポソームに対す
る種々のビオチン化蛋白質の結合を調べた。下記表４に
示すように、種々のビオチン化蛋白質をストレプトアビ
ジン複合リポソームとインキュベートした場合、ストレ
プトアビジン３分子毎に、およそ２つの蛋白質分子が結
合する。ストレプトアビジン結合小胞に対するビオチン
化蛋白質の結合量は、ビオチン化蛋白質のサイズには依
存しない（分子量:42,000〜150,000D）。簡単に言う
と、脂質1umol当り45.2ugの蛋白質結合を有するストレ
プトアビジンリポソームを、実施例８に記載したように
して調製した。フルオレセイン標識ビオチン化蛋白質
を、ストレプトアビジンに対して２倍モル過剰で、pH7.
5にて10分間、複合リポソームとインキュベートした。
サンプルをセファロースCL−4Bでゲル排除した後、蛋白
質についてはリポソームに結合した蛍光の水準を測定
し、脂質についてはシンチレーション計数することによ
り、ストレプトアビジンリポソームに対するビオチン化
蛋白質のカップリング量を求めた。
実施例11 ストレプトアビジンリポソームへのビオチン化蛋白質の
結合 Bayer等、FEBS Lett.68,240（1976）の方法により、
抗赤血球IgGをビオチン化した。全てのビオチン化蛋白
質を、IgGについて上述したように、FITC−セライトで
蛍光標識した。リポソームに結合したストレプトアビジ
ンに対して２倍モル比で、10分間、蛋白質をインキュベ
ートした。HBS、pH7.5で前もって平衡化したセファロー
スCL−4Bでのゲル排除により、未結合蛋白質を除去し
た。蛍光標識IgGについて上に述べたようにして、リポ
ソーム結合蛋白質の量を求めた。全てのビオチン化蛋白
質のバックグラウンド結合は、無視できるものであるこ
とがわかった。
実施例12 ストレプトアビジンリポソーム複合体の生体内ターゲッ
ティング pH7.5、最終脂質濃度2.5mMで、上述のようにして、カ
ルボキシスルオレスセイン（15mM）を取り込んだリポソ
ームをチオール化ストレプトアビジンに結合させた。Ｎ
−エチルマレイミド（ストレプトアビジンに対して500
モル比）でカップリング反応をクエンチした。４時間
後、セファロースCL−4Bでのゲル排除により、ストレプ
トアビジンリポソーム複合体を単離し、上述のようにし
て、リポソーム結合ストレプトアビジンのレベルを求め
た。
ターゲッティング実験のために、ヒトの血液をEDTA
（PBS中25mM）中に集めた。フィコールパーク（Ficoll
paque）を用いる標準プロトコルにより、ヒト末梢血白
血球を単離し（Boyum、Scand.J.Clin.Lab.Invest.21,Su
pp.97,9（1968）参照）、結合の検討を行う前に、２％B
SA及び0.01％アジ化Naを含むPBS中に４℃で懸濁させ
た。細胞（106）を、丸底マイクロタイターウエルに分
注し、洗浄して、PBS中にて、４℃で１時間、抗体（T11
及びB1、それぞれ100ulPBS中５及び10ug）と共にあるい
は単独でインキュベートした。PBSで２回洗浄した後、
細胞をストレプトアビジンリポソーム複合体（200ulPBS
中0.2umol）と共に、４℃で更に１時間インキュベート
した。次いで、この細胞をPBSで３回洗浄し、以下に述
べる方法に従って、フローサイトメトリーにより分析し
た。
簡単に説明すると、細胞結合蛍光を、EPICSプロファ
イルアナライザーで測定した。アルゴンイオンレーザー
の488nm線で細胞を照射した。515〜530nm帯域通過フィ
ルターの後で、蛍光を測定した。直角対前方光散乱細胞
所見（right angle versus forward light scatter cyt
ogram）に基づいて、蛍光信号をゲート制御し、分析を
単一細胞から信号へ限定した。増幅器をログエリアモー
ド（log area mode）にセットした。ヒストグラムのと
統計的解析のために、対照サンプルのヒストグラムの右
肩の基部において、より低いチャンネルで、領域１を任
意にセットした（最小2.075、最大1023）。
図６に示すように、リポソームストレプトアビジン複
合体（カプセル化されたカルボキシフルオレスセインを
含む）を、末梢Ｂ細胞（B1）に特異的なビオチン化モノ
クローナル抗体で前もって標識した細胞とインキュベー
トすることにより、全リンパ球個体群の約20％が、フル
オレスセインで標識された（図6B）。比較のために、ビ
オチン化抗Ｔ細胞抗体（T11）で同様な検討を行うと、
リンパ球の約90％が標識された（図6C）。これらの結果
は、T11［Howard等、J.Immunol.126,2117（1981）参
照］及びB1［Stashenko等、J.Immunol.125,1678（198
0）参照］により規定される抗原の予測される細胞分布
と一致する。これらの複合体の特異性は、ビオチン化抗
体が存在しないとき、リンパ球に対するストレプトアビ
ジンリポソーム複合体のバックグラウンド結合が無視で
きることにより示される（図6A）。
実施例13 卵ホスファチジルコリン（EPC）及びジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン（DPPE）は、Avanti P
olar Lipids（Birmingham,Ala.USA）から入手した。ビ
オチン−ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン−
PE）、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）
は、Molecular Probes,Oregon,USAから入手した。スト
レプトアビジン、FITC−セライト、Ｎ−エチルマレイミ
ド、ジチオスレイトル、コレステロール、Ｂ−メルカプ
トエタノール、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジ
ン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸（EPPS）、２−（Ｎ
−モルホリノ）−エタンスルホン酸（MES）、Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸（HEPES）及びセファデックスG50は、Sigma,USAか
ら入手した。抗ヒト赤血球IgGは、Cappel,Inc.USAから
購入し、セファロースCL−4Bは、Pharmacia,Canadaから
入手した。14Cコレステロール及び3Hコレステロール−
ヘキサデシル−エーテルは、New England Nuclear,USA
から入手した。3H及び14Cビオチンは、Amersham,Canada
から入手した。体重が平均21gのマウスは、Jackson Lab
oratories,California,USAから入手した。
Ｎ−（４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル）ジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（MPB−D
PPE）の合成MPB−DPPEを、Martin等、J.Biol.Chem.257,
286−288（1982）の方法を改変したもので合成した。簡
単に説明すると、完全なMPB−DPPEの合成は、クロロホ
ルム中１当量のトリエチルアミンの存在下で、1.5 SMP
B:DPPEのモル比にて行われた。３時間後、反応混合物を
窒素下で蒸発乾固した。予備薄層クロマトグラフィー
（TLC、アセトンの50％クロロホルム溶液で展開された
シリカゲル）により、過剰の未反応SMPB及び主な副生成
物を除去した。メタノールの約20〜30％クロロホルム溶
液（V:V）で、脂質バンドの上部をシリカから抽出し、
その結果、1H NMRで確認されたように、純粋な完全MPB
−DPPEが単離された。
実施例14 リポソームの調製 Hope等、Biochim.Biophys.Acta.812,55（1985）によ
り記載されたようにして、大単ラメラ小胞（LUV）を調
製した。簡単に説明すると、クロロホルム中の脂質混合
物の一定量をチューブに入れ、窒素気流下で乾燥して脂
質フィルムとし、次いで、２時間高真空にした。次い
で、25mM MES、25mM HEPES、150mMNaCl、pH6.5中で、脂
質を水和し、２枚重ねの100nm又は50nmフィルターから1
0回押し出した。カップリング実験の前に、サンプル
を、NaOHでpH7.5に滴定した。C.Fiske及びY.Subbarow、
J.Biol.Chem.66,375（1925）の比色測定法又は脂質混合
物内に微量の14Cコレステロール若しくは3Hコレステロ
ール−ヘキサデシルエーテルを取り込むことのどちらか
により、脂質を測定した。サンプルは、PackardTri Car
b液体又はBackman LS3801型シンチレーションアナライ
ザーでのシンチレーション計数により測定された。
実施例15 カップリング用蛋白質の調製 ストレプトアビジン（25mM HEPES、150mM NaCl、pH7.
5、HBS、中10mg/ml）を、Carlsson等、Biochem.J.173,7
23（1978）の方法にしたがって、アミン反応性試薬、SP
DP、で変性した。簡単に述べると、SPDP（メタノール中
25mM）を、室温で30分間、ストレプトアビジンに対して
10モル比でインキュベートした。変性の程度を測定する
ために、反応混合物の一部を、HBSで平衡化したセファ
デックスＧ−50に通して、未反応SPDPを除去した。ジチ
オスレイトル（DTT）添加前に、280nm［280nmにおる吸
光率（E280:2770）］における蛋白質の濃度を、そしてD
TT（25mM）の添加10分後に、343nm（E343:7550）におけ
る２−チオピリドンの濃度を測定することにより、スト
レプトアビジンの変性の程度を求めた。反応混合物の残
部をDTTで還元し（25mM、10分）、チオール化生成物
を、25mM MES、25mM HEPES、150mM NaCl、pH7.5、で平
衡化したセファデックスＧ−50にて、ゲル排除により単
離した。生成物は、直ちにカップリング実験に使用し
た。
IgG（HBS中20mg/ml）の場合は、蛋白質をSPDPで変性
後、その蛋白質をFITC−セライトで蛍光標識した（150m
M NaCl、0.2M NaHCO3、pH8.8、中IgG50％重量、20
分）、蛋白質をDTTで処理する前に、酢酸緩衝液（100mM
NaCl、100mM酢酸ナトリウム、pH5.0）で平衡化したセ
ファデックスＧ−50にて、未反応試薬からサンプルを分
離し、その分子の固有のジスルフィドの還元から保護し
た。カップリング実験の前に、アクアサイド（aquacid
e）で脱水することにより、サンプルを5mg/mlに濃縮し
た。ストレプトアビジンの変性の程度は、蛋白質当り約
５〜6SPDP分子であり、一方、抗体試料の変性は、蛋白
質当りSPDP2〜３分子となった。
実施例16 リポソームへの蛋白質の共有結合 還元されたPDP変性蛋白質を、pH7.5、100ug蛋白質/um
ol脂質（5mM−30mM最終濃度）の割合で、リポソーム（5
4％EPC、45％コレステロール、１％MPB−PE、50又は100
nmの細孔のフィルターを通してサイズを揃えた）とイン
キュベートすることにより、リポソームへの蛋白質のカ
ップリングを実施した。Ｎ−エチルマレイミド（蛋白質
に対して500モル比、メタノール中）の添加により、種
々の時間において反応をクエンチした。生体内実験のた
めに、反応混合物をＮ−エチルマレイミドと２時間イン
キュベートした後、Ｂ−メルカプトエタノール（Ｎ−エ
チルマレイミドに関して10モル比）で更にサンプルをク
エンチした。HBSで平衡化したセファロースCL−4Bでの
ゲル濾過により、未結合蛋白質を除去した。リポソーム
へのストレプトアビジンのカップリング量は、ストレプ
トアビジンへの3H又は14Cビオチンの結合により測定さ
れた。簡単に述べると、ストレプトアビジン−リポソー
ム（0.5ml中0.25umol脂質）を、3H又は14Cビオチン（25
ul中3.85nmol、15.4umol/uCi）で10分間インキュベート
し、HBSで平衡化したセファロースCL−4Bでのゲル濾過
により、未結合ビオチンを除去した。セファデックスＧ
−50でのゲル排除後のストレプトアビジン標準（100u
g）へのビオチンの結合の量を、カップリング率を計算
するための参考として用いた。リポソームに結合した抗
体（IgG）の量を測定するために、サンプル（200ul）を
エタノール（1.8ml）に溶解し、リポソーム結合蛍光を
既知量のフルオレセイン標識抗体と関連づけた。495nm
の励起波長を有するSLC−500C蛍光分分光度計を用い
て、520nmにおいて蛍光をモニターした。
実施例17 非共有結合したストレプトアビジンの調製 リポソームへのストレプトアビジンの非共有結合の前
に、IgGについて上に述べたように、ストレプトアビジ
ンをFITC−セライトで蛍光標識した。ストレプトアビジ
ン（4.1mg）を、10分間、20mMHepes緩衝生理食塩水（pH
8）中のビオチン−PEに対して10モル過剰で、約30分
間、リポソーム（54.75％EPC、45％コレステロール、0.
25％ビオチン−PE）とインキュベートした。Loughery
等、Biochem.Biophys.Acta.901,157（1987）参照。種々
の時間に、一部をセファロースCL−4Bカラム（5ml）で
分別して、リポソームに結合したストレプトアビジンを
遊離のストレプトアビジンから分離した。IgGについて
述べたように（上記実施例16）、セファロースCL−4Bで
のゲル濾過後、結合ストレプトアビジンの量を求めた。
実施例18 押し出された蛋白質−リポソームサンプルの調製と確認 蛋白質−リポソーム複合体（5mM又は20mM最終脂質濃
度）を、２枚重ねのミリポアフィルター（100nm又は50n
m）から10回押し出した。押し出されたサンプルの一部
のシンチレーション計数により、脂質回収率を測定し
た。押出前後の蛋白質結合小胞のサイズを、フリーズフ
ラクチャー技術並びに632.8nm及び5mWで働くNicomp Mod
el 270サブミクロパーティクルサイズ（submicropartic
le size）を用いる準弾性光散乱（QELS）により測定し
た。
実施例19 リポソーム試料の生体内の検討 生体内の検討のために、実施例13〜18に記載のように
して、最終脂質濃度30mM、インキュベーション時間15分
で、ストレプトアビジン−リポソーム複合体を調製し
た。L.Huang、“リポソーム”、Mark J.Ostro編、87〜1
24頁、Marcel Dekker発行、New York、1983年、及びSte
in等、FEBS Lett.11,104（1980）、比活性:0.23uCi/mg
脂質、に記載の方法により、非代謝性、非交換性脂質マ
ーカー、3Hコレステロール−ヘキサデシル−エーテルを
用いて、リポソームの脂質の量を測定した。シンチレー
ション計数のために、5mlのPicoOFluor 40（Packard,Ca
nada）シンチレーションカクテルに50〜100ulの血漿を
加え、Beckman LS3801型シンチレーションカウンターで
サンプルを計数した。未結合ストレプトアビジンを、セ
ファロースCL−4Bでのゲル排除により除去した。注射直
前に、サンプルの一部を、２枚重ねの100nm又は50nmフ
ィルターから10回押し出した。対照として、MPB−PE（5
4％EPC、45％コレステロール、１％MPB−PE）を含むリ
ポソームを、pH6.5で、上述のようにして調製した。脂
質サンプルの一部を、NaOHでpH7.5に滴定し、Ｂ−メル
カプトエタノール（MPB−PEに対して10モル過剰）でク
エンチし、HBSで平衡化したセファデックスＧ−50にて
ゲル濾過により、遊離のＢ−メルカプトエタノールを除
去した。生体内実験の前に、HBSで平衡化したセファデ
ックスＧ−50にて、クエンチされていないMPB−PEリポ
ソームを交換した。HBS中で、55％EPC及び45％コレステ
ロールを含むリポソームを調製した。
生体内血漿脂質水準を測定するために、マウス（１時
点当り４〜８匹）に、尾静脈から、全脂質100mg/kgの投
与量でサンプルを注射した。血液をEDTA処理ミクロコン
テナー（microcontainer）（Bectin Dickinson,Frankli
n Lakes,New Jersey）内に集め、全血液を臨床遠心分離
器で10分間遠心分離する（200Xg）ことにより、血漿を
調製した。動物１匹当りの全血漿容積を、平均体重の4.
55％とした。既知量のリポソームを含む対照血液サンプ
ルから、リポソームの脂質のわずかな画分がペレット化
血液細胞と結合するだけであることがわかった。全血液
又は血漿から求めると、リポソームの回収率は同様であ
った。生体内でリポソームと結合したストレプトアビジ
ンの水準を、注射後１時間及び４時間目に単離された血
漿サンプルに対する14Cビオチンの結合により測定し
た。
実施例20 小胞サイズでの蛋白質複合の確認 リポソーム（54％EPC、45％CHOL、１％MPB−PE、5mM
最終脂質濃度、100nm）を、pH7.5で時間をかけて、上述
のようにしてストレプトアビジン（100ug蛋白質/umol脂
質）とインキュベートした。図１に示すように、５分か
ら12時間までの範囲の種々の時間において、Ｎ−エチル
マレイミド（蛋白質に対して500モル比）を加えて反応
をクエンチし、セファロースCL−4Bでのゲル濾過により
遊離のストレプトアビジンを除去した。結合したストレ
プトアビジンの量を3Hビオチン結合により求め（図１の
グラフＡに示す）、小胞サイズをQELSにより測定した
（図１のグラフＢに示す）。図１に示すように、リポソ
ームに結合した蛋白質の量が増えると、QELSにより記録
された場合の小胞サイズが著しく大きくなる。小胞に対
するストレプトアビジンの最初の急速なカップリング
は、試料のサイズ分布が急速に大きくなることと関連す
る。この結果を確認するために、より大きいシステムの
形態を調べるフリーズフラクチャー技術を用いて、同一
カップリング系の一部を測定した。図２に示した結果か
ら、QELSにより測定された場合のサイズの増加が小胞の
凝集と関係していることが、明らかにわかる。しかし、
長時間のインキュベーション後は、著しい数の、サイズ
の大きい小胞（＞200nm）が認められ、凝集に続き融合
が起こったことによるものと思われる。
実施例21 リポソーム複合体の凝集に及ぼす押出の影響 小さくて、均一なサイズの蛋白質−リポソーム複合体
を達成しようとする試みにおいて、凝集した複合小胞を
100nmの細孔サイズを有するフィルターから押し出すこ
との影響を、上で調製したストレプトアビジン（図３）
又は抗体（図４）の結合したリポソームについて調べ
た。カップリング反応混合物を、種々の時間においてＮ
−エチルマレイミドでクエンチし、押出の前及び後の複
合サンプルのサイズをQELSにより測定した（図3B及び4
B）。複合サンプルの押出後、結合蛋白質の量を測定し
た（図3A及び4A）。リポソームに結合した蛋白質の量に
かかわりなく、ストレプトアビジン又は抗体と結合した
小胞は、容易に押し出され、得られた試料は、狭いサイ
ズ範囲内に入る。例えば、ストレプトアビジンの結合し
たリポソーム（25〜60ug/umol脂質）を押し出すと、150
から500nmを越えるまでの元のサイズ分布に比較して、
直径が120〜140nmの小胞サイズとなった。
同様に、抗体リポソーム複合体（15〜35ug蛋白質/umo
l脂質）を押し出すと、押出前の130〜230nmのサイズ範
囲と比較して、狭いサイズ分布（90〜110nm）のより小
さい小胞となった。両種の蛋白質結合小胞について、押
出工程中の脂質の損失が最小であったということ（85〜
90％の回収率）に注目するのは、重要である。これらの
結果から、高濃度の複合蛋白質を有する小胞の高度に凝
集した試料を有効に押し出すことができ、得られた試料
が同様のサイズであることがわかる。
更に、蛋白質−リポソーム凝集体の押出は、サイズの
揃った蛋白質複合小胞を調製する穏やかな方法を意味す
る。このことは、押出後、ビオチンを結合するストレプ
トアビジン−リポソーム複合体が維持されていることに
より説明された（結果は示さず）。
リポソームへの蛋白質カップリング中に、リポソーム
複合体が凝集することが認められることは、リポソーム
への蛋白質の共有結合に特異的なものではない。小胞凝
集は、ビオチン−PE含有リポソームへのストレプトアビ
ジンの非共有結合中にも起こる［Loughery等、Biochem.
Biophys.Acta.901,157（1987）参照］。蛋白質−リポソ
ーム複合体のサイズの揃った個体群を生成する手段とし
て、押出法の一般的適用を示すために、MPB−PEを含む
リポソームに共有結合した、又はビオチン−PEを含むリ
ポソームに非共有結合したストレプトアビジンの押出の
影響を、フリーズフラクチャーにより調べた（図５）。
両種のストレプトアビジンリポソーム複合体は、押出前
は、高度に凝集していることが認められた。押出後、結
合小胞は、最大凝集体が４つの小胞の集塊であると認め
られる状態で、ダイマーのモノマーとして存在した。非
共有結合法の場合（図5C及び5D）は、結合小胞の押出中
に、脂質の著しい損失が生じた（50％）。
実施例22 押し出されたリポソームの安定性 サイズに関する、共有結合したストレプトアビジンを
含む押し出されたサンプルの安定性を図６に示す。QELS
測定から、押出後、試料のサイズが、最初の小さい（30
nm）急激な上昇を示すことがわかる。これは、フリーズ
フラクチャーにより示されるように（結果は示さず）、
押し出された小胞の凝集が増大したことによりもたらさ
れた。下記表５に示すように、種々のストレプトアビジ
ン−リポソーム複合体の押出８時間後に認められる再凝
集の水準が、押出前のサンプルの凝集状態と比較したと
き、最小であった。前のインキュベーションによりＢ−
メルカプトエタノールでクエンチされたチオール化スト
レプトアビジンと共に、MPB−PEを押し出したとき、リ
ポソームの再凝集は認められなかった（下記表５）。こ
のことは、再凝集がリポソームとの蛋白質の非特異的結
合によるものではなかったことを示している。負に帯電
した脂質、例えばホスファチジルセリン、の取り込み、
又は低若しくは高イオン強度緩衝液の存在は、再凝集を
防ぐものではないことがわかった（データは示さず）。
小胞に結合したストレプトアビジンの量が減少すると
（下記表５）、押出８時間後の再凝集の量が対応して減
少する。押し出されたサンプルの脂質濃度を変更して
も、再凝集に著しい影響はなっかった。押出直後に凍結
されたリポソームに結合したストレプトアビジンは、解
凍に際しても、それらの元のサイズ分布を維持した。最
後に、押し出されたサンプルを４℃で貯蔵すると、リポ
ソームサイズの安定性が高くなった。
ａ カップリング混合物（最終濃度20mM）を種々の時間
においてＮ−エチルマレイミドでクエンチすることによ
り、結合ストレプトアビジンの水準が異なるリポソーム
サンプル（54％EPC、45％CHOL、１％MPE−DPPE）を調製
した。
ｂ 30mMの最終脂質濃度及び15分のインキュベーション
時間で、ストレプトアビジン−リポソームを調製した。
ｃ Ｎ−エチルマレイミドでクエンチされたストレプト
アビジン（50ug）を、１％MPB−DPPEを含むリポソーム
（1umol、2.5mM最終脂質濃度）と押し出した。
ｄ QEL測定前に、押し出されたサンプルを氷上に３時
間保持した。
ｅ 押し出されたサンプルを、押出直後に凍結し、QEL
測定直前に解凍した。
実施例23 蛋白質−リポソーム複合体の血液からの排出 これまでの研究から、小さいリポソームに比較して、
大きいリポソームは、急速に血液循環から除去されるこ
とがわかっている［A.C.Hunt、Biochim.Biophys.Acta.7
19,450（1982）及びSota等、Chem.Pharm.Bull.34,4244
（1986）参照］。生体内の標的化系について認められた
急速な排出［Wolff等、Biochim.Biophys.Acta.802,259
（1984）及びPapahadjopoulos等、“Annals of the New
York Academy of Sciences"R.L.Juliano編、507,4035
（1988）参照］は、一部はリポソームの凝集によるもの
とすることができるかもしれない。従って、この仮説を
テストするために、マウス中のある対照リポソーム製剤
（図7A）及び凝集し、押し出されたストレプトアビジン
−リポソーム複合体（図7B）の血液からの排出に要する
時間をを調べた。凝集したストレプトアビジン−リポソ
ーム（QELSで示された直径が530nm）は、循環から急速
に排出され、注射から４時間後には、最初の脂質投与量
のわずか３％が循環内に残っただけであった。これらの
蛋白質−小胞複合体を50又は100nmポリカーボネートフ
ィルターから押し出すと、それぞれ139及び187nmのサイ
ズ分布を有する製剤となった。これら２つの製剤は、生
体内血液循環時間が長くなり、４時間後に、最初の投与
量の48及び32％が循環内に残っていた。125nmサイズのE
PC/CHOL小胞と比較して、同様のサイズ（139nm）のリポ
ソームに共有結合した蛋白質が存在することにより、循
環からのリポソームの排出が促進された（80及び48％の
EPC/CHOL小胞が４時間後循環内に残ったのに対し、48及
び32％の蛋白質−リポソーム複合体が残った）。直径19
7nmのEPC/CHOL製剤と比較して、MPB−PEリポソーム（正
常のもの、又はＢ−メルカプトエタノールでクエンチ、
直径170nm）の循環には、顕著な差は認められなかっ
た。
ここに示すように、結合リポソームの凝集の量は、複
合製剤の血液排出挙動を著しく変える。示されているよ
うに、凝集したストレプトアビジン−リポソーム（直径
＞530nm）は、循環から急速に除去された（４時間後、
＜３％残存）。これに比べて、押し出された複合体につ
いては、循環時間が長くなった。即ち、直径187nm及び1
39nmのサンプルについて、注射後４時間で、それぞれ最
初の脂質投与量の32及び48％が循環内に残った。小さい
蛋白質−リポソーム複合体では、循環時間が長くなるこ
とから、製剤の凝集が、生体内の複合体の寿命を決定す
る大きな因子であることがわかる。しかし、蛋白質−リ
ポソーム複合体の血液からの排出は、同様のサイズの対
照サンプルについてよりも常に大きく、リポソームに蛋
白質が存在することが、循環からのリポソーム排出の促
進にある程度寄与することを示している点に注目すべき
である。EPC/CHOLリポソームと比較すると、リポソーム
にチオール反応性カップリング脂質MPB−PEが存在する
ことが、それらの生体内における排出挙動に著しい影響
を与えることはなく、チオール含有血清蛋白質の結合
が、リポソームの生体内性質に影響を及ぼさないことを
示唆している。
実施例24 生体内共有結合複合リポソームの安定性 生体内共有結合複合ストレプトアビジン−リポソーム
の安定性を、注射後１時間及び４時間して血漿から単離
されたリポソームサンプルへのビオチンの結合により示
した（下記表６）。血漿から単離されたサンプルについ
て、ストレプトアビジン結合リポソームのビオチン結合
能のわずかな低下が認められ、これは、血清成分の小胞
への吸収、蛋白質分解によるストレプトアビジンの不活
性化又は製剤への内因性ビオチンの結合から生じたのか
も知れない。
リポソームに結合したストレプトアビジンの量を、脂
質サンプル又は注射後１時間及び４時間して３匹のマウ
スからプールした血漿サンプルへの14Cビオチンの結合
により測定した。
前記説明及び実施例は、本発明を実施することを説明
するもので、決して限定するものでないことは、当業者
により理解されるであろう。ここに示した詳細は、本発
明の精神と範囲から逸脱せずに変更することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ Ｗ 33/544 33/544 Ａ 33/577 33/577 Ｂ (72)発明者 クリス，ピーター，アール カナダ国 ブリティッシュコロンビア州 ヴィ６ジェー ３アール２ ヴァンク ーバー ウォルナットストリート 1329 (72)発明者 バリー，マルセル，ビー カナダ国 ブリティッシュコロンビア州 ヴィ０エヌ アイ６オー ボーエンア イランド サイトピー，コンパート メ ント11，アール アール ＃１ (72)発明者 チョイ，ルイス，エス．，エル カナダ国 ブリティッシュコロンビア州 ヴィ５エー ２ジー１ ブルネービィ ケリーウッドクレスセント 76 72 (72)発明者 ウォング，キム，エフ カナダ国 ブリティッシュコロンビア州 ヴィ６アール ２ヴィ５ ヴァンクー バー ウエストサーティンスアベニュー 4595 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 39/395 A61K 47/24

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つ
    のマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物を含む実
    質的に純粋な反応性脂質であり、該反応性脂質が実質的
    に開環された架橋剤を含まないことを特徴とする実質的
    に純粋な反応性脂質。
  2. 【請求項２】該求核脂質がホスファチジルエタノールア
    ミンである請求の範囲１の反応性脂質。
  3. 【請求項３】該求核脂質がジパルミトイルホスファチジ
    ルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエ
    タノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノ
    ールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンであ
    る請求の範囲２の反応性脂質。
  4. 【請求項４】該架橋該がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフ
    ェニル）ブチリル］（MPB）基を含む請求の範囲１の反
    応性脂質。
  5. 【請求項５】該架橋剤がＮ−スクシンイミジル ４−
    （ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）である
    請求の範囲４の反応性脂質。
  6. 【請求項６】ａ）少なくとも一つの非求核溶剤の存在
    下、かつ求核溶剤の不存在下で、求核脂質を反応性脂質
    に完全に変換するのに十分な時間、求核リポソーム形成
    脂質をマレイミド含有架橋剤と反応させて、反応性脂質
    溶液を作り、 ｂ）真空中で該溶液を濃縮することにより該溶液から該
    反応性脂質を分離して、固体残渣を生成し、該固体残渣
    を溶剤で研和、分液（truiturate）して、実質的に純粋
    な反応性脂質を製造することからなる 実質的に純粋な反応性脂質を合成する方法。
  7. 【請求項７】工程（ａ）の反応溶液を、追加的な非求核
    溶剤で希釈し、次いで工程（ｂ）の分離に先立ち洗浄す
    る請求の範囲６の方法。
  8. 【請求項８】該非求核溶剤が、クロロホルム、塩化メチ
    レン、DMF、DMA、DMSO、THF及び１、４−ジオキサンか
    らなる群より選ばれる請求の範囲６の方法。
  9. 【請求項９】ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な
    数の複合分子を結合するのに有効な量の実質的に純粋な
    反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリ
    ポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、 ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該
    反応性脂質と結合させるのに十分な時間、反応させるこ
    とからなり、 該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一
    つのマレイミド部分を含む架橋剤との反応生成物であ
    り、該反応性脂質が実質的に開環された架橋剤を含まな
    いものである、 複合リポソームを形成する方法。
  10. 【請求項１０】該反応性脂質が該反応性リポソームの少
    なくとも約0.05モルパーセント、該リポソーム形成脂質
    が約99.95モルパーセント以下からなる請求の範囲９の
    方法。
  11. 【請求項１１】反応性リポソームが押出されるものであ
    る請求の範囲９の方法。
  12. 【請求項１２】a.少なくとも約90モルパーセントのリポ
    ソーム形成脂質、 b.少なくとも約0.1モルパーセントの機能化された脂
    質、及び c.該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り10〜100
    の蛋白質分子に等しい量で結合した蛋白質 を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないことを
    示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。
  13. 【請求項１３】機能化された脂質が約0.25ないし１モル
    パーセントの間の複合体の脂質を含有する請求の範囲12
    の蛋白質−リポソーム複合体。
  14. 【請求項１４】該機能化された脂質が、MPB−ホスファ
    チジルエタノールアミン、PDP−ホスファチジルエタノ
    ールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノールア
    ミンからなる群より選ばれる請求の範囲12の蛋白質−リ
    ポソーム複合体。
  15. 【請求項１５】該蛋白質が、ストレプトアビジン、Ig
    G、IgM、IgE、モノクローナル抗体及び酵素からなる群
    より選ばれる請求の範囲12の蛋白質−リポソーム複合
    体。
  16. 【請求項１６】蛋白質がストレプトアビジンであり、該
    ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合し
    ている請求の範囲15の蛋白質−リポソーム複合体。
  17. 【請求項１７】該蛋白質が、非共有結合で機能化された
    脂質に結合し、該機能化された脂質がビオチン−ホスフ
    ァチジルエタノールアミンである請求の範囲12の蛋白質
    −リポソーム複合体。
  18. 【請求項１８】サイズが約75nmから約200nmの範囲にあ
    る請求の範囲12の蛋白質−リポソーム複合体。
  19. 【請求項１９】生物活性剤を含む請求の範囲12の蛋白質
    −リポソーム複合体。
  20. 【請求項２０】該複合体が脱水されている請求の範囲12
    の蛋白質−リポソーム複合体。
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