JPH04506518A - 標的化リポソーム及びリポソーム―蛋白質カップリング方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 １ボソーム　１ボソームー　カッツ ユ２４友迭 且里二立互 本発明は、例えばＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチリルコホスファ チジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＰＥ）及び関連組成物を含む実質的に純粋な 反応性脂質を合成する方法に関するものである。本発明の組成物は、カップリン グ剤として有用であり、リポソーム内に取り込み、次いで蛋白質、補因子及び多 数の他の分子と結合することができる。

更に、本発明は、ＳＭＰＢ及び関連架橋剤で改質された脂質、並びにＭＰＢ−Ｐ Ｅを始めとする実質的に純粋な反応性脂質及び関連カップリング組成物を脂質内 に取り込むことにより得られたリポソームに関するものである。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、リポソームを治療及び診断の標的化（ｔ ａｒｇｅｔｉｎｇ）に用いることができる。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、それらの膜をはさんで膜内外電位差を有 していてもよく、脱水されてもよい。更に、複合体は、イオン化しつる生物活性 剤、例えば抗腫瘍剤を含んでもよく、診断検査に用いてもよい。

本発明は、高血液循環時間を示す、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を 製造する一般的な方法に関するものである。また、本発明は、本発明方法によっ て作られた、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体組成物に関するものであ る。本発明の複合体は、サイズが３０ｎｍから１５０ｎｍまでの範囲内にあるこ とが好ましく、良好な血液循環時間を示す。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、生体内又は診断での活性剤の搬送を標的 化するのに用いてもよい。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、それらの膜をはさんで膜内外電位差を有 していてもよく、脱水されてもよい。更に、複合体は、イオン化しつる生物活性 剤、例えば抗腫瘍剤を含んでもよく、診断検査に用いてもよい。

且豆五皇見 リポソームは、取り込まれた水性容積を含む脂質二分子膜からなる完全に閉鎖さ れた構造体である。リポソームは、水性相により分−された、多くの同心脂質二 分子膜を含んでもよく（多重ラメ゛う小胞、ＭＬＶ）、あるいは１個の膜状二分 子膜を含んでもよい（単ラメラ小胞）。脂質二分子膜は、疎水性“尾”領域と親 水性“頭”領域とを有する２つの脂質単分子膜で構成されている。

膜状二分子膜においては、脂質単分子膜の疎水性（非極性）“尾”が二分子膜の 中心に向かって配向し、一方、親水性（極性）“頭”は水性相に向かって配向し ている。リポソームの基本的な構造は、種々の公知技術により作ることができる 。

代表的には、リポソームは、Ｂａｎｇｈａｍ等の方法［Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 。

１３、２３８−２５２　（１９６５）　］を用いて調製されており、有機溶剤中 に懸濁した脂質を減圧下に蒸発させて、反応容器中で乾燥膜とする。

次いで、適当量の水相を容器に加え、混合物を撹拌する。その後、多重ラメラ小 胞が形成するのに十分な時間、実質的にかき乱さずに、混合物を放置する。リポ ソーム内に取り込まれる水性相は、とりわけ、薬剤、ホルモン、蛋白質、染料、 ビタミン、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などの生物活性剤を含んでも よい。

現在利用できる多数の技術を用いて、リポソームを再現可能に調製することがで きる。多数のこれらの技術を用いて生成することのできるリポソームの種類とし ては、小車ラメラ小胞（ｓｕＶ）［Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ及びＭｉｌ ｌｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ、ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　１３５゜６２４ −６３８　（＋９６７）参照］、逆相蒸発小胞（ＲＥＶ）［米国特許第４．２３ ５，５８７号、１９８０年１１月２５日発行、参照］、安定複ラメラ小胞（ＳＰ ＬＶ）［米国特許第４，５２２，８０３号、１９８５年６月１１日発行、参照］ 、及び同時係属中の米国特許出願番号第６２２６９０号、１９８４年６月２０日 出願、Ｇｕｌｌｉｓ等、名称“単ラメラ小胞製造のための押し出し手法”に記載 されている押し出し手法で作られる大挙ラメラ小胞を挙げることができ、それら の関連部分をここに参照のために記載した。

リポソームは、種々の特質、とりわけ、例えば薬剤、化粧品、診断試薬、生物活 性化合物の担体として、用いることができる。

蛋白質を複合するリポソーム組成物は、診断用及び生体内用の両用に設計される ことができる。例えば、特定の受容体又はその他の細胞表面部分に向かわせるよ うな、抗体指向小胞を生成する能力は、同様の非指向系に優る明白な利点であろ う［Ｇ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓ ｃｉ、　４．３０４−３０７　（１９８３）］　、これらの］蛋白質−リポソー ム複合は、小胞内に取り込まれた細胞毒性化合物の循環腫瘍細胞に対する選択的 標的化に有効に適用されるであろうし［Ｗｏｌｆｆ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　８０２．２５９−２７３　（＋９８４）コ、あるいは これらのイムノグロブリン結合小胞が、診断検査の発展に適用されるであろう。

更に、患者の特定部位に活性剤を搬送するための特定の蛋白質−リポソーム相互 作用の標的化によって更に、適用が行われることができるものであろう。事実、 蛋白質が結合する患者の系内の部位へ任意の活性剤の搬送を標的化するために、 蛋白質が複合したリポソームを理論的に用いることができよう。イムノリポソー ム［Ｌｅｓｅｒｎ＋ａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　２８８．６０２（１９８０）、Ｈｅ ａｔｈ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０．１ ３７７　（１９８３）及びＨｕａｎｇ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５８ ．１４０３４　（１９８３）参照］、診断プロトコル［Ｉｓｈｉｍｏｒｉ等、Ｊ 、　Ｉ＋＋ｕａｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７５．３５１（１９８４）及びＲ ｏｄｎｅｙ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４．４０３５　（１９８５）参照 ］並びにリポソームワクチン［Ａ１１ｉｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　２５２．２５ ２　（１９７４）参照］を介して薬剤を目的の部位に向かわせることを始めとす る種々の目的のために、リポソームに蛋白質を複合させる多数の技術がすでに開 発されている。

リポソームは、蛋白質、抗体及びイムノグロブリンに共有結合で結合することが できる。Ｈｅａｔｈ等　［Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

６４０、６６−８１　（１９８１）コは、グリコスフィンゴリピドを含むリポソ ームとイムノグロブリンとの共有結合について述べている。　Ｌｅｓｅｒｍａｎ 等　［リポソーム技術ｍ、２９〜４０頁、１９８４年、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉ ｎｃ、、　ＣＡ、；　Ｎａｔｕｒｅ　２８８．６０２−６０４　（１９８０）］ 及びＭａｒｔｉｎ等　［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５７２８６−２８８ 　（１９８２）］は、チオール化ＩｇＧ又はプロティンＡを脂質小胞に共有結合 させ、チオール化抗体とＦａｂ’　断片をそれぞれリポソームに結合させる方法 について述べている。これらのプロトコル及び変更した種々のもの［Ｍａｒｔｉ ｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０．４２２９−４２３８　（１９８１）； 及びＧｏｕｎｄａｌｋｅｒ等、Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　３ ６．４６５−４６６　（１９８４）］は、カップリングに対する最も有用なアプ ローチを示している。アクチノマイシンＤを含有するアビジン結合、及びアビジ ン、ビオチニン結合リン脂質リポソームは、ガングリオ−Ｎ−トリオシルセラミ ドを発現する腫瘍細胞へと向けられることに成功している［Ｕｒｄａｌ等、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２５５．　１０５０９−１０５１６　（１９８０）コ　。

Ｈｕａｎｇ　等　［Ｂｉｏ（ｈｉｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７１６． １４０−１５０　（１９８２）］は、主要組織適合抗原Ｈ−２（Ｋ）に対するマ ウスモノクローナル抗体の結合、あるいはモロニー白血病ウィルスの主要糖蛋白 、パルミチン酸に対する山羊抗体の結合について示している。これらの脂肪酸変 性ＩｇＧをリポソームに取り込み、適当な抗原を発現する細胞に対するこれらの リポソームの結合が確認された。特定のイムノグロブリンで被覆されたリポソー ムの特定の結合について、生体外における他の検討が行われている［５ｈａｒｋ ｅｙ等、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、３８．１０８９（１９７９）］　、更に他のカップ リングの研究において、Ｒａｈｍａｎ等は、リポソームの組織取り込みを、リポ ソームへの糖脂質の結合により変更できることを見いだした［Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌ、８３．２６８ａ　（１９７９）］。

リポソームの第一の用途によれば、抗腫瘍剤をリポソーム二分子膜内に取り込む ことにより、薬剤の直接投与に比べて、より有効な治療が行えるようになってい る［Ｆｏｒｓｓｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４３、５４６　（１９８３）：及びＧａｂｉｚｏｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、 ４２．４７３４　（＋９８２）］。抗腫瘍剤及び他の薬剤のカプセル化に伴う大 きな問題は、これらの薬剤の多くが、カプセル化後、リポソームから急速に放出 されることが分かっているということである。直接投与に比較して、リポソーム カプセル化により、多くの抗腫瘍剤の毒性を著しく低減することができるという 事実を考えると、このことは、望ましくない効果である。例えば、Ｆｏｒｓｓｅ ｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３゜５４６　（１９８３）及びＲａｈｍａｎ 等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４２．１８１７　（１９８２）参照。更に、徐放 形式で好ましく搬送されるある種の医薬は、ａ！準リポソーム搬送系に適合しな い。多くのリポソーム組成物は、薬剤をあまりにも急速に放出してしまうので、 徐放搬送を行うことができない。

上記問題に対する一つの解答は、リポソーム系の安定性及び徐放特性を維持する 予め形成された安定なリポソームを用いることである。米国特許出願番号筒８１ １，０３７号、１９８５年１２月１８日出願、名称“リポソームの標的化、貯蔵 及び装填用の新規な組成物”に記載されているように、蛋白質結合リポソームを 含むリポソーム組成物により、いつまでも安定に貯蔵できる貯蔵安定性リポソー ムが製造されている。これらのリポソームは、リポソームに結合したストレプト アビジン及びイムノグロブリンを含み、′必要に応じて”リポソームに装填して 、脱水状態で貯蔵されてもよい。これらの蛋白質結合リポソームには、イオン化 しうる抗腫瘍剤が装填されており、リポソームの壁をはさんで膜内外電位差が生 じ、この膜内外電位差により、リポソーム内に抗腫瘍剤が装填される０例えば、 米国特許出願番号筒７４９，１６１号、Ｂａｄｌｙ等、１９８５年６月２６日出 願、名称“リポソーム内への抗腫瘍剤のカプセル化″（この関連部分をここに参 照のために記載した）参照。

上で説明したように、蛋白質−リポソーム複合体は、診断系から生体内の病気の 部分への標的化に至るまでの多くの適用可能性を有している。他の所［Ｌｏｕｇ ｈｅｒｙ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

９０１、１５７　（＋９８７）コで示したように、ストレプトアビジンをリポソ ームに結合させると、後で種々の蛋白質を簡単に複合させる適応性のある基本的 な系となる。しかし、リポソーム−蛋白質複合体は、複合工程中、特に脂質に対 する蛋白質の割合が高い場合に、凝集する傾向がある。例えば、リポソームに複 合される蛋白質［Ｆ　（ａｂ）断片コの量が多くなると、小胞個体群の多分散性 が増加する結果となることが見いだされている［Ｒ，Ｂｒｅｄｅｈｏｒｓｔ等、 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ　２５．５６９３（＋９８６）参照コ。カップリン グインキュベーション工程において、脂質濃度及び脂質に対する蛋白質の割合を 高めるといったような、リポソームに対する蛋白質のカップリング効率を高める 条件では、ネガティブ染色で観察した場合の小胞凝集の程度が増大することが認 められている［Ｈｅａｔｈ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ 、　５９９．４２　（１９８０）参照ｊ６蛋白質カップリング中の蛋白質−リポ ソーム複合体の凝集は、残念ながら、この系の一般的な適用性を阻害する特性で ある。この凝集現象は、リポソームのサイズが大きくなることと関連している。

（血液）循環からのリポソームの排出速度は、製剤のサイズに依存すること、即 ち、リポソームが大きければ大きいほど、循環から速く取り除かれることが認め られている［Ａ、　Ｃ，Ｈｕｎｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ ｔａ、７１９．４５０　（１９８２）及び５ｏｔａ等、Ｃｈｅｍ。

Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、　３４．４２４４　（１９８６）参照］。蛋白質リポソ ーム複合体が凝集する傾向があるために、このような製剤のサイズは大きくなり 易く、従って、循環時間が多少不利である。蛋白質−リポソーム複合体の血液か らの浄化は、同じサイズの非複合リポソームよりも速くなる傾向がある。更に、 凝集した蛋白質−リボン−・ム複合体は、エンドサイト−シス法での細胞による 吸収が悪くなる傾向があり、細胞に入る薬剤の量が減少するかもしれない。診断 においては、凝集した複合体が溶液から析出し易く、診断が不正確になる可能性 がある。

従って、当該技術においては、一般的なターゲツティング用途に利用することの できる一定のサイズ分布の蛋白質−リポソーム複合体を製造する一般的な方法が 、要求されている。このようなサイズを揃えた蛋白質−リポソーム複合体は、凝 集蛋白質−リポソーム複合体の実買的な析出を示さず、高細胞吸収を始めとする 、活性剤搬送を標的化するための又は診断で使用するための蛋白質−リポソーム 製剤の好ましい特性を示すと期待されるであろう。

本発明の目的は、良好な特性の、サイズの揃った、一般標的化用の蛋白質−リポ ソーム複合体系を達成するために、リポソームへ蛋白質分子を結合させる一般的 な方法を提供することである。

本発明の他の目的は、リポソームが複合している蛋白質の結合活性に影響を与え ることなく、リポソームへの蛋白質の複合を容易にする、サイズの揃った蛋白質 −リポソーム複合体を生成する技術を提供することである。

また、本発明の目的は、種々の量の蛋白質を適合させることのできる一定のサイ ズ分布の蛋白質−リポソーム複合体を生成する一般的な方法を提供することであ る。

更に、本発明の目的は、本発明の方法で製造された安定な蛋白質−リポソーム複 合体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、蛋白質の結合活性に影響を与えることなく、蛋白質結 合リポソームのサイズを物理的に揃える操作を容易に行える一般的な方法を提供 することである。

本発明の更にもう一つ別の目的は、複合体の生体内性能及び安定性を高めて、カ プセル化された物質をより効率的に細胞へ搬送するために、安定な架橋と組み合 わせて有効なカップリング技術を提供することにより、サイズの揃った蛋白質リ ポソーム複合体の製造効率を高めることである。

更に、本発明の目的は、長期間安定に貯蔵できるサイズの揃った蛋白質−リポソ ーム複合体を提供することである。

本発明の更にもう一つ別の目的は、膜内外イオン電位差を用いて、活性剤を装填 できるサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を提供することである。

形質転換された細胞と結合しているもののような細胞表面抗原に向けられている 抗体に対するリポソーム、の共有結合は、治療に用いられる可能性がかなりある 。しかし、現在では、このような標的に向けられるリポソーム系は、診断検査の ような生体外用途に主として用いられている［Ｍａｒｔｉｎ及びＫｕｎｇ、　Ａ ｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｐｐ、　４４３−４４９　（＋９８５）］　、例えば、］リポソーム ー蛋白質力ツブリング及びリポソーム−補因子カップリングなどの他の系のほか に、抗体に向けられた担体系の可能性を全部利用するために、改良された有用で 信頼できるカップリングのための方法論を開発すべきである。

現在まで、蛋白質、抗体、その他の分子をリポソームに結合する一般的な方法は 、まだ得られていない。Ｌｅｓｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　 ２８８．６０２−６０４　（１９８０）及びＢａｒｂｅｔ等、Ｊ、Ｓｕｐｒａｍ ｏｌ。

５ｔｒｕｃｔ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６．２４３−２５８　（１９ ８１）は、チオール化ＩｇＧを、ジスルフィド結合を介して、Ｎ−［３−（２− ピリジルジチオ）−プロピオニル］ホスファチジルエタノールアミン（ＰＤＰ− ＰＥ）を含むリポソームに共有結合する方法について記載している。この方法の より一般的なバージョンは、プロティンＡを小胞にカップリングさせることによ り開発され［例えば、Ｌｅｓｅｒｍａｎ　（＋９８０）、前出、参照］、これは 、あるクラスのＩｇＧのＦＣ部分を結合するプロティンＡの能力を利用している 。この方法の一つの大きな制限は、多くのモノクローナル抗体が、この適当なり ラスではないということである。

カップリングに対する上記アプローチとは別のものに、Ｍａｒｔ　ｉｎ及びＰａ ｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５７．２８ ６−２８８　（１９８２）のアプローチがあり、彼らは、マレイミド基とのチオ エーテル結合、Ｌｅｓｅｒｍａｎ法のジスルフィド結合よりも血清中に見られる 還元条件をかなり受けにくい結合、の形成により、Ｎ−［４，−、（ｐ−マレイ ミドフェニル）−ブチリルコホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＰＥ） を含むリポソームに抗体及びＦａｂ’断片を共有結合する技術を開発した。Ｍａ ｒｔｉｎ／Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓのアプローチ及びこのアプローチの 種々の変形［例えば、Ｗｏｌｆｆ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ％Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　８０２．２５９　（１９８４）；　Ｍａｒｔｉ ｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０．４２２９　（１９８１）；及びＧｏｕ ｎｄａｌｋａｒ等、Ｊ、Ｐｈａｒｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３６．４６５　（ １９８４）コは、現在得られるカップリングに対する最も有用なアプローチを示 している。

リポソームを蛋白質、抗体、補因子、その他の分子に架橋するこの方法において 、マレイミド基を含む架橋剤、とりわけ、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）が、脂質を含むホスファチジ ルエタノールアミン及び他のアミンを複合分子、例えば反応性チオールを含む蛋 白質、抗体、補因子及び他の分子に架橋させるのに用いられる。

文献処方に従って、ホスファチジルエタノールアミン及び他の脂質と反応させる 従来の架橋剤、例えばＳＭＰＢは、スクシンイミジル基の置換中にマレイミド環 が開環し、開環ＭＰＢ−脂質誘導体が反応生成物に混入することになる。蛋白質 、抗体、補因子、その他の分子に対する架橋は、従来の文献処方を用いる理想的 なものよりも少ない。本発明の方法は、実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥ、即ち従来 法を用いて作られる開環ＭＰＢ−脂質が存在していないことを示すＳＭＰＢ誘導 ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームを提供することにより、問題 を解迅するのに役立つ。実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥを含むリポソームを、種々 の蛋白質、とりわけ、例えばストレプトアビジン、抗体、補因子及びその他の分 子と更に反応させて、本発明の複合リポソームを製造することができる。

本発明の第一の態様、即ち、治療部位への生物活性剤の搬送によれば、リポソー ム二分子膜内へ抗腫瘍剤を取り込むことにより、薬剤の直接投与に比較して、治 療がより有効になる［Ｆｏｒｓｓｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３．５４ ６　（１９８３）；及びＧａｂｉｚｏｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４２、４７ ３４　（１９８２）］。抗腫瘍剤及び他の薬剤のカプセル化に伴う大きな問題は 、これらの薬剤の多くが、カプセル化後、リポソームから急速に放出されること が分かつているということである。直接投与に比較して、リポソームカプセル化 により、多くの抗腫瘍剤の毒性を著しく低減することができるという事実を考え ると、このことは、望ましくない効果である。例えば、Ｆｏｒｓｓｅｎ等、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４３．５４６　（１９８３）及びＲａｈｍａｎ等、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、４２．１８１７　（１９８２）参照。更に、徐放形式で好ましく 搬送されるある種の医薬は、標準リポソーム搬送系に適合しない。多くのリポソ ーム組成物は、薬剤をあまりにも急速に放出してしまうので、徐放搬送を行うこ とができない。

本発明によれば、蛋白質、抗体、補因子又はその他の分子を、有効量の実質的に 純粋なＭＰＢ−ＰＥと関連マレイミド含有誘導体とからなるリポソームに複合化 することにより作られた複合リポソームは、′必要なように”リポソームに装填 して、脱水状態でいつまでも安定に貯蔵されることができる。

本発明の目的は、実質的に純粋なＭＰＢ−脂質、特に実質的に純粋なＭＰＢ−Ｐ Ｅ、関連マレイミド含有誘導体及び関連化合物を合成する一般的な方法を提供す ることである。

本発明の他の目的は、実質的に純粋なＭＰＢ−ＰＥと関連マレイミド含有誘導体 を含むリポソームを提供することである。このようなリポソームを、更に蛋白質 、抗体、補因子及びその他の分子と反応させて、複合リポソームを生成すること ができる。

更に、本発明の目的は、薬剤のような少なくとも一つの生物活性剤を取り込んだ 本発明の複合リポソームを提供することである。

本発明の更にもう一つ別の目的は、カプセル化された物質をより効率的に細胞へ 搬送するリポソーム複合体を製造するために、安定な架橋と組み合わせて有効な カップリング技術を提供することである。

本発明のまた別の目的は、従来法よりもより有効にリポソームに結合した蛋白質 を有し、長期間にわたって安定に貯蔵できる安定な複合リポソームを提供するこ とである。

発明の要旨 本発明の方法においては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又は関連リ ポソーム形成求核脂質を、少なくとも一つのマレイミド基及びアミン反応性機能 を有する架橋剤、例えばＳＭＰＢと反応させ、実質的に純粋な反応性脂質、例え ばＭＰＢ−ＰＥを生成する。本発明の方法においては請求核脂質、例えばＰＥ、 の反応は、加水分解条件が存在しないときに起こり、従来技術の方法によって生 成される開環副生成物を回避する。純粋反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥの製造 後、チオール含有複合分子、例えば抗体又は補因子のような蛋白質又はその他の 分子を、この反応性脂質に共有結合させて、蛋白質、抗体、補因子又はその他の 分子と架橋したリポソームを製造する。ここで用いる場合、このような架橋リポ ソームを複合リポソームという。

驚くべきことに、従来法（メタノール、エタノール又はその他のアルコールを塩 基性条件下で用いる条件）を用いるＳＭＢＰと核リポソーム形成脂質、例えばＰ Ｅ、との反応により、反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、に加えて、アルコール によってマレイミド環が開かれたかなりの量の副生成物（″開環副生成物ｎ）が 作られることが発見された。アルコールを用いるグロマトグラフ及びその他の分 離技術によっても、かなりの量の開環副生成物が作られることが発見された。

本発明の実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を製造する本発明の 方法においては、次の工程が利用される。

１、非求核アミンを含有する溶剤中で請求核溶剤の不存在下に、求核脂質がＭＰ Ｂ−ＰＥのような反応性脂質へ完全に変換するのに十分な時間、ＳＭＰＢのよう な架橋剤を核脂質と反応させる。

２、反応性脂質を形成する反応が実質的に完了した後、溶液を溶剤で希釈し、少 なくとも１回、水、好ましくは食塩水で洗浄して、副生成物を除去する。

３、（２）からの溶液を真空中で濃縮し、固体残渣を粉末にして未反応ＳＭＰＢ とスクシンイミド副生成物を除去し、反応性脂質１例えばＭＰＢ−脂質、を製造 する。

実質的に純粋な反応性脂質は、工程２を用いず、工程ｌと３を続けて用いること によっても作れることが指摘されるべきである。

本発明の反応性脂質の多くは、上記３つの工程を全て用いて作られるが、ある種 の反応性脂質では、変換工程１後、溶液から粉末にして、実質的に純粋な反応性 脂質を作ってもよい。

本発明の方法態様の工程においては、更に純粋な反応性脂質を再結晶し、続いて リポソーム内に取り込み、反応性リポソームを形成してもよい。反応性リポソー ムを複合分子、例えば、チオール含有蛋白質、抗体、補因子又は関連分子と反応 させ、本発明の複合リポソームを作ってもよい。本発明の複合リポソームは、種 々の生物活性剤の搬送を標的化するのに、あるいは診断用途に用いることができ る２例えば、これらの複合されたものの標的化及び診断法への適用は、このよう な複合体が、標的である抗原の細胞分散を反映する態様で、規定されたビオチン 化モノクローナル抗体を介して、リンパ球に特異的に結合していることにより説 明されるであろうＣ例えば、５ｔａｓｈｅｎｋｏ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ ２５．　＋６７８　（＋９８０）及びＨｏｗａｒｄ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ ２６．２１１７　（１９８１）参照コ求核脂質の純粋なＳＭＰＢ誘導体を合成す る新しい処方をここに示す。リポソームに蛋白質を複合するためのカップリング 条件を、反応性脂質、例えばＭＰＢ−ジパルミトイルホスファチジルエタノール アミン（ＭＰＢ−ＤＰＰＥ）、のマレイミド機能を完全に維持するように最適化 した。本発明において詳述する最適条件下では、５０％を越えるカップリング効 率が容易に達成される。

リポソーム内のＭＰＢ　ＥＰＥの濃度が高いことと結び付いた場合にのみ、従来 法を用いて、同じような効率が達成されている［５モル％、例えば、Ｂｒａｇｍ ａｎ等、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、７３゜１２７０９８４） 参照コ、実質的に純粋な反応性脂質、例えば本発明のＭＰＢ　ＰＥ、の使用と関 連する効率的なカップリングは、リポソーム内の反応性脂質の濃度が約２．５モ ル％よりも高くなると、リポソームの安定性に劇的な影響を及ぼすので、特に重 要である〔例えば、Ｂｒａｄｅｈｏｒｓ　を等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ ５．５６Ｇ３　（１９８６）参照〕。

本発明は、少なくとも一つの実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＢＰ−ＰＥを 、少なくとも一つの別のリポソーム形成脂質と組み合わせて含む反応性リポソー ムに関するものでもある。本発明のリポソームは、一般に、少なくとも約０．０ ５モル％のＭＰＢ−ＰＥのような実質的に純粋な反応性脂質と、約９９．９５モ ル％以下の少なくとも一つのリポソーム生成脂質を含む０本発明の複合リポソー ムは、更に、リポソームに共有結合又は非共有結合している種々の蛋白質、抗体 、補因子又はその他の分子を含む。

本発明の一つの態様においては、本発明の複合リポソームを形成するのに、スト レプトアビジンが用いられる。これらのストレプトアビジン被覆リポソームは、 急速かつ効率的にビオチン化蛋白質を結合し、生体内で特異的な標的化性を示す 複合リポソームとなる。このようなリポソームは、治療及び診断の標的化用に利 用することができる。

本発明の別の方法においては、リポソームが、共有結合又は非共有結合を介して 、蛋白質、例えば他の蛋白質の中でも、ストレプトアビジン又はイムノグロブリ ン、と結合し、凝集蛋白質−リポソーム複合体を生成する０次いで、この凝集複 合リポソーム謂製物を、約３０ｎｍから約１１００ｎまでの範囲の細孔サイズを 有するフィルターから押し出し、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を生 成する。カップリング後、蛋白質−リポソーム複合体を押し出すことにより、蛋 白質がリポソームに結合したときに生ずる凝集が逆になり、容易に凝集しない一 定のサイズの安定、非凝集蛋白質−リポソーム複合体が作られる。凝集蛋白質− リポソーム複合体を濾別せずに、押出過程が生ずるということは、驚くべき結果 である。

本発明の方法は、蛋白質結合リポソームのサイズを物理的に揃える操作を容易に し、蛋白質の結合活性に影響を与えることを避けることができる。この技術によ り、一定のサイズ分布の安定な蛋白質−リポソーム複合体を、種々の量の蛋白質 をリポソームに結合した状態で、容易に調製することができる。行った実験にお いて、押し出された複合体の血液循環時間が長くなり、結合能力が維持されたこ とは、蛋白質−リポソーム複合体の押出製剤が、生体内で蛋白質結合部位に結合 できるあろうということを示している。

本発明は、蛋白質−リポソーム複合体に関するものでもある。

本発明のこの態様の種々の成分の重量パーセントは、大きく変わるかもしれない が、一般に、本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、次のものを含む。

１．８）少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質；及び ｂ）少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質；及び Ｃ）リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子に等しい量で該機能化さ れた脂質に結合した蛋白質を含むリポソーム小胞。

本発明のリポソームには、他の多くの医薬の中でも、例えば局所麻酔剤、気管支 拡張薬、β−アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、抗うつ薬、抗痙彎薬、抗ヒスタ ミン薬、抗マラリア薬及び鎮痛薬などの医薬に加えて、生物活性剤を装填しても よい。本発明のリポソーム内に活性剤を装填するためには、濃度勾配に対して、 それらのラメラをはさんで、膜内外電位差が生じるような方法でリポソームを調 製するのが好ましい。この濃度勾配は、Ｎ　ａ　＋　／　Ｋ＋電位かあるいはｐ Ｈ勾配（Ｈ＋）のいずれかにより作られる。

内部対外部の電位の差は、イオン化しつる生物活性剤をリポソームに装填させる 機構である。膜内外電位差に応じて、行われたリポソームの装填に遅延が生じる であろう。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、一つ又はそれ以上の保護糖類の存在下で 脱水し、その脱水状態で貯蔵し、次いで、イオン勾配及び関連性能を維持して再 水和し、生物活性剤を蓄積することができる。更に、本発明の蛋白質−リポソー ム複合体は、診断検査に用いることができる。

本発明のリポソーム複合体は、一つ又はそれ以上の保護糖類の存在下で脱水し、 その脱水状態で貯蔵し、次いで、イオン勾配及び関連性能を維持して再水和し、 生物活性剤を蓄積することができる。更に、本発明の蛋白質−リポソーム複合体 は、診断検査に用いることができる。

図面の簡単な説明 図１は、ＰＤＰ−ＥＰＥとＭＰＢ−ＥＰＥを含むリポソームに対するチオール化 ＩｇＧのカップリングの比較を、リポソームに含まれるコレステロールの濃度の 関数として示す。示されているように、２０モル％よりも多いコレステロールが リポソーム内に取り込まれるまでは、ＰＤＰ−ＥＰＥを含むリポソームに対する チオール化１ｇＧの顕著なカップリングは起こらなかった。始めの対比では、Ｍ ＰＢ　ＰＥを含むリポソームについては、コレステロールが存在しないときでも 、１２ｕｇ　ＩｇＧ／ｕｍｏｌｅ脂質の水準が得られた。

図２は、純ＭＰＢ−ＤＰＰＥのＮＭＲスペクトルを示し、これは本発明の方法に より合成される。

図３は、ＭＰＢ−ＰＥ合成の従来技術に記載されているものに対する条件下での 、２−メトキシエチルアミンとＳＭＰＢとの提案された反応機構（開環副生成物 、ＰＨの化学等量決定する目的で）の構造図を示す。この図は、反応によって、 一方は構造がＭＰＢ−ＰＥ　（構造Ｂ）と同様なものであり、他方の生成物は構 造がマレイミド基のケト基へのメタノール性攻撃により生じる開環副生成物と同 様なものである、２つの生成物が作られることを示している。

図４及び５は、純粋なＭＰＢ　ＤＰＰＥを含むリポソームに、チオール化ストレ プトアビジンをカップリングさせるための最適条件の研究を示す６図４に示すよ うに、リポソームに複合される蛋白質の量は、７よりも大きいｐＨ値において急 速に増大するが、それに対応して、反応性脂質のマレイミド基が急速に分解する 。

図５は、マレイミド脂質の反応性に対する、リポソームに結合しているストレプ トアビジンを反応させる時間経過を示す、この結果は、ｐＨ７，５、室温で８時 間のインキュベーション後に、マレイミドの分解が最小で、最適水準のリポソー ム複合ストレプトアビジン（約３７　ｕ　ｇ／ｕｍｏ　１　ｅ脂質）が得られた ことを示している。

図６Ａ％Ｂ及びＣは、ビオチン化抗体が存在しないとき（図６Ａ）と存在すると き（図６Ｂ及びＣ）の、リポソームストレプトアビジン複合体による標的細胞に 対するリポソームの標的化を、フローサイトメトリー技術で測定して比較する。

図７は、リポソームへストレプトアビジンをカップリングさせることの小胞サイ ズに及ぼす影響を示すグラフである。

実施例２０に記載されているように、リポソーム（５４％ＥＰＣ１４５％ＣＨＯ Ｌ、１％ＭＰＢ−ＰＥ、５ｍＭ最終脂質濃度、１０１００ｎを、ｐＨ７，５で時 間をかけて、ストレプトアビジン（１００ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌｅ脂質）とイン キュベートした。

グラフに示すように、種々の時間において、Ｎ−エチルマレイミド（蛋白質に対 して５００モル比）を加えて反応を冷却し、セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）　ＣＬ　−４Ｂでのゲル濾過により遊離のストレプトアビジンを除去した。結 合したストレプトアビジンの量を３Ｈビオチン結合によってめ（グラフＡ）、小 胞サイズをＱＥＬＳにより評価した（グラフＢ）。

図８は、ストレプトアビジン−脂質製剤のフリーズフラクチャーである。ストレ プトアビジン−脂質サンプルを、０．２　（Ａ）　。

２　（Ｂ）　、　４　（Ｃ）及び１８（Ｄ）時間口にＮ−エチルマレイミドで冷 却し、実施例２０及び上記図７で説明したように調製し、フリーズフラクチャー により調べた。

図９は、実施例２１に記載のストレプトアビジン−脂質複合体の押出を示すグラ フである。ストレプトアビジンを、最終脂質濃度２０ｍＭで、１％ＭＰＢ−ＰＥ を含むリポソーム（ｌｏｏｎｍ）と結合させた。種々の時間に、反応混合物の一 部をＮ−エチルマレイミドで冷却し、１１００ｎポリカーボネートフイルターか ら押し出す前に、５ｍＭ脂質濃度に希釈した。セファロースＣＬ−４Ｂで脂質サ ンプルからゲルを除去した後、ストレプトアビジン脂質への３Ｈビオチン結合に より、結合したストレプトアビジンの量（Ａ）を測定した。押出前後に、ＱＥＬ Ｓによりストレプトアビジン−脂質複合体のサイズを測定した（Ｂ）。

図１０は、実施例２１記載の抗体リポソーム複合体の押出を示すグラフである。

フルオレセイン標識抗体を、最終脂質濃度２０ｍＭで、１％ＭＰＢ−ＰＥを含む リポソーム（１００ｎｍ）と結合させた。種々の時間に、反応混合物の一部をＮ −エチルマレイミドで冷却し、１１００ｎポリカーボネートフィルターから押し 出す前に、５ｍＭ脂質濃度に希釈した。セファロースＣＬ−４Ｂでの脂質サンプ ルの交換後、リポソームに結合した蛍光の濃度を測ることにより、結合した抗体 の量（Ａ）をめた。押出前後に、ＱＥＬＳにより抗体リポソームのサイズを測定 した（ｂ）。

図１１は、実施例２１記載の押出前後のストレプトアビジンリポソームのフリー ズフラクチャーである。図７及び実施例２１に記載のように、最終脂質濃度２０ ｍＭで８時間、ストレプトアビジンをリポソームに結合させた。押出前に、サン プルを５ｕｍ。

ｌ　ｅ　／　ｍ　ｌに希釈した。実施例１３に記載のように、最終脂質濃度５ｍ Ｍで、ビオチン−ＰＥ（０，２５％）含有リポソームにストレプトアビジンを非 共有結合させた。押出前（Ａ）及び後（Ｂ）のＭＰＢ−ＰＥ含有ストレプトアビ ジン−リポソーム並びに押出前（Ｃ）及び後（Ｄ）のビオチン−ＰＥ含有ストレ プトアビジン−リポソームを図に示す。１１００ｎポリカーボネートフイルター からの押出前及び後に、フリーズフラクチャーによりサンプルを調べた。

図１２は、押し出されたストレプトアビジン−リポソーム複合体の安定性の試験 をＱＥＬＳにより示す。チオール化ストレプトアビジンを１％ＭＰＢ−ＰＥ含有 リポソームと、最終脂質濃度２０ｍＭで８時間インキュベートすることにより、 約５１ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌｅ脂質のストレプトアビジン−リポソームを調製し た。セファロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により未結合ストレプトアビジンを除 去した後、サンプルを５ｍＭ脂質に希釈し、２枚重ねの１１００ｎポリカーボネ ートフイルターから１０回押し出した。示された種々の時間に、押し出されたＭ ＭのサイズをＱＥＬＳにより測定した（０）。図７で調製したストレプトアビジ ン−リポソーム複合体のサイズを、比較のためにグラフで示す（０）図１３は、 実施例２３に記載のリポソーム製剤の生体内浄化速度を示す。最終脂質濃度３０ ｍＭ及びインキュベーション時間１５分で、ストレプトアビジンをリポソーム（ ５０及び１０１００ｎと結合させ、Ｎ−エチルマレイミドで２時間冷却し、次い で、Ｂ−メルカプトエタノールと一部インキユベートした。ＭＰＢ−ＰＥを含む 対照リポソームをｐＨ７，５に滴定し、ＨＢＳで平衡化したセファデックス（ｓ ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−５０で交換した。ＥＰＣ／ＣＨＯＬリポソームが、Ｈ ＢＳ内に調製された。マウス（１時点当り４〜８匹）に１００ｍｇ／ｋｇの投与 量で脂質を注射した。

特定時点におけるＥＤＴＡ全血から血漿を調製し、実施例１３の材料及び方法の 項に記載のシンチレーション計数により、一部を分析した。押し出されたサンプ ルのサイズをＱＥＬＳにより測定した。（Ａ）：ＥＰＣ／ＣＨＯＬ、１２５ｎｍ 　（黒丸）、ＥＰＣ／ＣＨＯＬ、１９７ｎｍ（黒四角）、ＭＰＢ−ＰＥリポソー ム、１７．０ｎｍ（冷却黒逆三角、未冷却（黒三角）；　（Ｂ）：凝集１１００ ｎストレプトアビジン−リポソーム、５３０ｎｍ（白四角）；１１００ｎフイル ターから押し出されたストレプトアビジン−リポソーム、１８７ｎｍ（白三角） ；５０ｎｍから押し出されたストレプトアビジン−リポソーム、１３９ｎｍ（白 丸）。

発明の詳細な説明 本発明は、リポソーム内に取り込み、次いで蛋白質、抗体、補因子又はその他の 分子と反応させて、複合リポソームを製造することができる実質的に純粋な反応 性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ。

を合成する改善された方法に関するものである。本発明の複合リポソームは、生 物活性剤搬送及び診断用標的化を始めとする多数の標的化用途に利用できる。

本発明の方法においては、リポソーム形成求核脂質、例えばホスファチジルエタ ノールアミン（ＰＥ）、を架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マ レイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）と反応させて、実質的に純粋な反応 性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を製造する。本発明の方法態様においては、架橋 剤とリポソーム形成求核脂質との反応を、非求核溶剤及び任意には第三級アミン のような非求核塩基の存在下で行う。非求核塩基の存在下でアルコール性溶剤を 利用する従来法によるＭＰＢ−ＰＥの合成では、かなりの量の開環副生成物が作 られることが発見されている。この開環副生成物は、マレイミド基よりもチオー ル基との反応性が著しく小さく、その結果、本発明のＭＰＢ−ＰＥよりも蛋白質 、抗体、補因子及びその他の分子をカップリングする効率が低い、従来技術の不 純反応性脂質ＭＰＢ　ＰＥとなる。

本発明で用いられる場合、複合分子を反応性脂質に結合させるのに用いる架橋剤 は、マレイミド含有架橋剤、例えば、ｐ−マレイミドフェニルブチレート基又は その他の基、特に、例えばＳＭＰＢである。このような剤は、反応性リポソーム と複合分子、特に蛋白質を架橋する好ましい試薬であることが分がっている。Ｓ ＭＰＢは本発明で使用するのに好ましい試薬であるが、マレイミド基を含む他の 架橋剤を使用してもよい。本発明で使用できるこれらの架橋剤の中には、他のマ レイミド含有架橋剤の中でも、Ｎ−スクシンイミジル　３−マレイミドベンゾエ ート（ＳＭＢ）、Ｎ−スクシンイミジル　３−マレイミジルチルート（ＧＭＢＳ ）、Ｎ−スクシンイミジル　６−マレイミドカプロエート（ＥＭＣ３）、Ｎ−ス クシンイミジル　３−マレイミドプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル　トラ ンス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート （ＳＭＣＣ）及びＮ−スクシンイミジルマレイミジルアセテート（ＡＭＡＳ）が 挙げられる。

ここで用いる場合、リポソーム形成求核脂質という用語は、ＳＭＰＢ又は同等の マレイミド含有架橋剤と反応して、マレイミド含有脂質又は同等の脂質を作り、 他のリポソーム形成脂質と共にリポソーム内に取り込まれることができる任意の 脂質を意味する。

このような核脂質としては、とりわけ、ホスファチジルエタノールアミン、ジパ ルミトイルホスファチジルエタノールアミンＤＰＰＥ）、シミリストイルホスフ ァチジルエタノールアミン（ＤＭ　Ｐ　Ｅ）及び卵ホスファチジルエタノールア ミン（ＥＰＥ）のような天然、合成、半合成脂質が挙げられる。一般に、より好 ましい核脂質としては、アミン基、好ましくは第一級アミン基、を含むものが挙 げられるが、他の核基の中でも、オキシアニオンのようなアルコール性アニオン を含む合成脂質を特徴とする請求核脂買を、本発明で用いることを考えてもよい 。純粋な反応性脂質を生成するために請求核基の核脂質への反応性並びに核脂質 及びＳＭＰＢの量及び濃度を変えてもよいことは、当業者によりｔｇｍされるで あろう。一般に、１対１よりも大きいＳＭＰＢ対求核脂質モル比を用いると、マ レイミド開環副生成物ができることが認識されるであろう。反応性脂質を製造す る反応は、非求核溶剤中で進行する。ここで用いる場合、非求核溶剤という用語 は、反応性成分を溶解する好ましい特性を有する任意の溶剤を意味し、例えば非 求核アミンが挙げられるが、これ自身は開環副生成物を生成しない。本発明の方 法態様で用いることのできる溶剤の例としては、他の溶剤の中でも、クロロホル ム、塩化メチレン及びより高度に塩素化、ハロゲン化された溶剤、ジメチルスル ホキシド（ＤＭＳ○）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメヂルアセトアミ ド（ＤＭＡ）、１．４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）並びにその 他のエーテルが挙げられる。多数のその他の非求核溶剤も、本発明において用い ることができる。

本発明に使用する溶剤を選択する際の目的としては、反応性脂質を生成する反応 を最大にすること、及びＳＭＰＢのマレイミド基への溶剤の攻撃により生成する 副生成物を最小にすることが挙げられると理解されよう。反応性脂質を製造する 従来法の条件は避けるべきであり、他の反応性アルコールの中でも、メタノール 及びエタノールのような核性溶剤は、特に塩基の存在下では、避けるべきである ということが認識されるべきである。

反応性脂質を置換Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びその他の副生成物から分離 するに際し、アルコール性及びその他の核溶剤の使用を避けるべきであるという ことに注目するのは、重要である。従って、より極性の大きい副生成物から反応 性脂質を分離するためには、非求核溶剤を用いる粉末化又は抽出技術が好ましい 。ここで用いる場合、実質的に純粋な反応性脂質という用語は、マレイミド基が もともと完全である、即ち核剤と反応して開環副生成物を生成することのない反 応性脂質を意味する。実質的に純粋な反応性脂質という用語は、実質的に完全な マレイミド基を有しているが、少量の不純物及び開環側生成物以外の副生成物も 含有する反応性脂質を排除するものと解釈されるべきではない。

本発明の反応性リポソームは、本発明の反応性リポソームが実質的に純粋である 点、即ちそれらが実質的な量の開環反応性脂質、例えばＰＢ−脂質、を含んでい ないという点で、従来の反応性リポソームとは異なる。理論によって制限される ことはないが、このような開環反応性脂質は、複合リポソームを形成する反応性 リポソームの能力に影響を及ぼすと信じられており、相当量の開環反応性脂質を 含有する反応性リポソームは、蛋白質又はその他の分子に複合するリポソームの 効率を著しく低減させる。この効率の低減に加えて、反応性脂質は複合リポソー ムを不安定にする傾向があるという事実から、高安定性及び高結合特性を始めと する、従来の複合リポソームよりもはるかに好ましい特性を有する反応性脂質及 びそれから生成されるリポソームが得られることになる。

実質的に純粋な反応性脂質を単離した後、それをリポソーム内に取り込んで、反 応性リポソーム、即ち蛋白質、抗体、補因子、その他の分子のような複合分子と 更に反応して、複合リポソームを生成することのできるリポソーム、を生成する 。一般に、反応性リポソームは、少なくとも約０．０５モルパーセントの反応性 脂質と少なくとも約９０重量％のリポソーム形成脂質を含む。しかしながら、反 応性リポソームの安定性を促進するためには、反応性脂質の量が、反応性脂質の 全重量の約２．５モルパーセント以下であることが好ましい。反応性リポソーム は、リポソームを形成するのに当該技術において用いることのできる任意の方法 を実質的の使用して、蛋白質、抗体又は補因子に共有結合するように作用して複 合リポソームを生成する反応性部分、例えばＭＰＢ。

を破壊しないように注意しながら、形成されることができる。

一般に、反応性リポソームを形成後、反応性脂質上のマレイミド基を介して、反 応性リポソームに蛋白質又はその他の基を結合させる。分子が十分に核的で、好 ましくはチオール基を含んでいれば、任意の蛋白質、抗体、補因子又は関連分子 をマレイミド基に結合させることができる。本研究は、チオール基が、他の核基 、例えばアミン基又はアルコール基、よりも明らかに好ましく、カップリング反 応の好ましいｐＨ及び温度条件下で、他の基よりもはるかに反応性に富んでいる ことを証明した。

生物活性剤又はその他の分子を搬送する目的で、ある標的化機能を有する、即ち ある活性部位、受容対部位又はその他の結合部位に結合しつる複合分子を結合す ることが、明らかに好ましい。

本発明において有用な蛋白質としては、とりわけ、ストレプトアビジン、種々の 酵素、免疫調節剤、例えばインターロイキン−１、インターロイキン−２、腫瘍 壊死因子（ＴＮＦ）　、種々のペプチド及びペプチド断片、特にワクチン注射に 使用するためのもの、抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥのようなイムノグ ロブリン、モノクローナル抗体並びに関連蛋白質が挙げられる。本発明は、好ま しくは、リポソームに共有結合又は非共有結合し、反応性リポソームに結合後、 受容体部位、抗原決定基あるいはその他の標的結合部位のようなターゲットにも 蛋白質が結合するような自然の完全性（ｎａｃｕｒａｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ） を維持するこれらの蛋白質を用いることを意図している。本発明において有用な 補因子としては、ストレプトアビジン及びアビジンを始めとする多数の蛋白質を 非共有結合する能力があるため、特にビオチンを挙げることができる。

本発明において有用な蛋白質は、反応性リポソームの反応性脂質に共有結合する ことができるし、一方、補因子、例えばビオチンを介して、反応性脂質に非共有 結合することもできる。複合分子と反応性脂質との間の共有結合は、蛋白質内に 存在するチオール基又はその他の分子と反応性脂質のマレイミド基との反応によ り、形成されることができる。複合分子がチオール基を含まない場合は、分子が リポソームに共有結合するように、チオール基を合成により導入してもよい、複 合分子が蛋白質である例においては、その蛋白質を二官能性試薬、例えばＮ−ス クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、で変 性して、反応性脂質のマレイミド基と反応することのできる２つのチオール基を 含む蛋白質を作ってもよい。

反応性脂質への結合のために複合分子を変性するのに有用な二官能性試薬として は、複合分子と反応する少なくとも一つの基と、反応性脂質のマレイミド基と反 応する少なくとも一つの基を有するこれらの剤が挙げられる。上に示したように 、本発明においては、多数の二官能性試薬が有用であり、とりわけ、例えば５Ｐ ＤＰ１スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＳ）及びスクシンイミ ジルアセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）が有用である。

本発明の他の態様では、複合分子において、例えば、蛋白質が反応性脂質に共有 結合する前に、蛋白質が先ず補因子、例えばビオチン、に共有結合してもよい。

ビオチンを用いるこの発明の態様においては、ストレプトアビジンのような蛋白 質をＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン又はｐ−ニトロフェニルビオチンと 反応させて、蛋白質−リポソーム複合体を製造する際に用いる共有結合でビオチ ン化した蛋白質を生成することができる。

本発明の他の態様においては、ストレプトアビジン又はその他のビオチン結合蛋 白質を含む蛋白質−リポソーム複合体を、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド ビオチンでのビオチンへのカップリングによりビオチン化されたＩｇＧ又はモノ クローナル抗体のような蛋白質に、更に結合することができる。蛋白質をリポソ ームと標的部位の間の吸引カプラー（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ　ｃｏｕｐｌｅｒ） にする蛋白質−リポソーム複合体の安定性が認められたことは、全く驚くべきこ とである。

蛋白質が反応性リポソームに非共有結合している本発明の態様においては、最も 好ましくは、約００１モルパーセントと約１モルパーセントとの間の反応性脂質 、例えばホスファチジルエタノールアミン、を用いて、先ずリポソームを形成し 、補因子又は変性補因子と反応することのできるマレイミド含有架橋剤と共有結 合させる。ある種の蛋白質、例えばアビジン及びストレプトアビジンが、実際に 結合できる補因子の好ましい例は、ビオチンである。ビオチンを用いる本発明の ある態様においては、ＭＰＢ−ＰＥに共有結合して、ビオチン含有複合リポソー ムを生成するチオール基を含むように、ビオチンを変性することによって、ＭＰ Ｂ−ＰＥ上にビオチンを導入することができる。ストレプトアビジンのような蛋 白質を、複合リポソームのビオチンに非共有結合させてもよい６ 蛋白質をリポソームに共有結合又は非共有結合させて、蛋白質−リポソーム複合 体を製造する場合、リポソームが凝集して、サイズが大きくなるかもしれない。

このような場合、リポソームを押し出して、サイズの揃ったリポソーム複合体を 作るのが好ましいであろう。サイズの揃ったリポソームを作り、凝集を減少させ る方法は、当該技術において利用可能であり、従来、ここに参照のために記載し た米国特許出願番号第３７０，６５０号、名称パ一定のサイズ分布の標的化され たリポソーム系の調製”、１９８９年６月２３日出願、に記載されている。

本発明の方法態様においては、次の工程が用いられる。

１、非求核溶剤中で請求核脂質の反応性脂質への変換が完了するのに十分な時間 、ＳＭＰＢを核脂質と反応させる。

２、求核脂質が反応性脂質へ完全に変換した後、溶液を真空中で濃縮し、固体残 渣を溶剤で粉末化して未反応ＳＭＰＢ及び置換されたスクシンイミドを除去し、 実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ、を生成する。

工程１の後の反応で、抽出工程を用いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのよう な副生成物を除去するのが好ましい。その工程では、工程ｌからの反応混合物を 非求核溶剤で希釈し、次いで数回洗浄して副生成物を除去することができる。抽 出工程を実施した後、上記工程２、粉末化工程が一般に行われる。

本出願の発明から逸脱することなく、即ち実質的に純粋な反応性脂質を生成する ために、上記反応工程の種々の変形を実施することは、当業者の認識するところ であろう。例えば、粉末化工程（上記工程２）を実施する代わりに、非求核溶剤 及びマレイミド開環を回避する条件を用いるグロマトグラフ分離を実施できるこ とが１ｓｍされよう。

本発明は、本発明の実質的に純粋な反応性脂質を取り込んでいる反応性リポソー ムに関するものでもある。本発明の反応性リポソームは、複合分子を結合するの に十分な量の少なくとも一つの実質的に純粋な反応性脂質、例えばＭＰＢ−ＰＥ 、を他のリポソーム形成脂質と組み合わせて含むものである。一般に、本発明の 反応性リポソームは、少なくとも約０．０５モルパーセントのＭＰＢ−ＰＥのよ うな反応性脂質を、一般に反応性リポソームの約９９．９５モルパーセント以下 の量の少なくとも一つのリポソーム形成脂質と組み合わせて含むものである。本 発明の反応性リポソーム及び複合リポソームに用いることのできるリポソーム形 成脂質の検討については、以下に詳述する。

本発明は、反応性リポソームを含むＭＰＢ−脂質上に蛋白質を結合させる改善さ れた方法に関するものでもある。蛋白質を反応性リポソームに結合させる反応は 、ｐＨ７，５、約室温、即ち２３℃、の温度の条件を用いた場合に、最も効率的 であることが分かっている。ｐＨ又は温度を上げると、反応は高まるが、ＭＰＢ ＰＥの完全性は低下するであろう。同様に、温度又はｐＨを下げると、反応性リ ポソームに対する蛋白質の結合が減少するであろう。本発明の条件、即ち約２３ ℃の温度及び約７．５のｐＨのとき、蛋白質を反応性リポソームにカップリング させて蛋白質複合リポソームを生成する効率が、最も高くなる。更に、これらの 条件下では、反応性脂質の完全性が最高になる。本発明方法の最適条件下では、 ５０％を越えるカップリング効率が容易に達成される。同様の効率は、リポソー ム内に高濃度のＭＰＢ−ＰＥを取り込んだ場合に達成されているだけである［５ モル％、Ｂｒａｇｍａｎ等、　Ｊ、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、７３ ．　１２７　（１９８４）］　。

本発明は、蛋白質、抗体、補因子及びその他の分子のような複合分子へのリポソ ームのカップリングにより生ずるリポソーム複合体に関するものでもある。この ようなリポソームは、複合分子を結合するのに有効な量の反応性脂質、その反応 性脂質と組み合わせて安定なリポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形 成及び受容体、活性部位又は抗原決定基のような標的化部位にリポソームを標的 化するのに有効な量の、反応性リポソームに結合する少なくとも一つの複合分子 １例えば蛋白質、抗体、補因子及びその他の分子、を含む。

本発明のリポソーム複合体には、生物活性剤を装填することができる。複合分子 が蛋白質であるリポソーム複合体の場合、サイズの揃ったリポソームを形成し、 リポソームの凝集を避けるために、このようなリポソームを押し出してもよい。

本発明のリポソーム複合体を形成後、脱水及び再水和し、あるいは４℃で安定に 貯蔵することができる。一方、再水和工程又はそれに続く工程中、形成後の二分 子腹をはさむイオンの電位差により、選ばれた生物活性剤を装填する前に、リポ ソーム複合体を押し出して、サイズの揃ったリポソームを作ることができる。リ ポソーム内へ生物活性剤を装填する好ましい方法としては、Ｍａｄｄｅｎ等によ り、米国特許出願番号第３５２，４９７号、１９８９年５月１５日出願、名称“ プロトン勾配によるリポソーム内への薬剤の蓄積”に記載されている方法が挙げ られ、その関連部分をここに参照のために記載した。一方、脱水的に、リポソー ム複合体に生物活性剤を加えてもよい。

本発明のリポソーム複合体は、被験者、例えばヒトを始めとする哺乳動物、に投 与することができる。組成物は、薬理学的に許容できる担体又はリン酸緩衝生理 食塩水のような希釈剤でこのような被験者に非経口的に搬送することができる。

リポソームに結合された蛋白質は、リポソーム及びそれらの内容物を体の特定部 位に標的化する際に、助けとなる。抗腫瘍剤のような生物活性剤の場合のごとく 、非経口的に用いられる場合、使用量は医者によって定められ、治療方法は腫瘍 の大きさ及びその他の条件により決定される。

上述のごとく、本発明は、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造する 方法を示す。本発明の方法においては、少なくとも０．１パーセントの機能化さ れた脂質及び少なくとも９０モルパーセントのリポソーム生成脂質を含むリポソ ームを、最初に形成する。このようなリポソームを反応性リポソームと言う。反 応性リポソームは、蛋白質に共有結合又は非共有結合することのできる機能化さ れた脂質を含むリポソームである。反応性リポソームを形成した後、蛋白質がリ ポソームに結合して、蛋白質−リポソーム複合体を製造する。蛋白質−リポソー ム複合体を形成した後、約３０ｎｍから約１１００ｎまでの範囲の細孔を有する フィルターから押し出して、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造す る。蛋白質−リポソーム複合体を形成した後の押出工程の使用が、比較的サイズ の小さい非凝集蛋白質−リポソーム複合体をもたらし、その複合体は安定で、好 ましい血液循環時間を示すことが分かっている。驚くべきことに、押出工程中、 凝集蛋白質−リポソーム複合体が濾別されるようなことがない。

蛋白質を反応性リポソームに共有結合又は非共有結合して、本発明の蛋白質−リ ポソーム複合体形成するために、任意の数の従来法を用いることができる。しか し、一般に、反応性リポソームは、少なくとも約０．１モルパーセントの機能化 された脂質、好ましくは約１０モルパーセント以下、最も好ましくは約０．２５ 〜約１モルパーセントの機能化された脂質を含むように調製される。本出願の明 細書を通じて用いる場合、機能化された脂質は、他のリポソーム生成脂質と組み 合わせてリポソームを形成することができ、（共有又は非共有的に）蛋白質に結 合することのできる任意のリポソームである。本発明では、多数の機能化された 脂質が意図され、リポソームを形成するのに用いられる多数の標準脂質の内のど れか、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、を二官能性剤、とりわ け、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート （ＳＭＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ ート（ＳＰＤＰ）　、Ｎ−スクシンイミジル　トランス−４−（Ｎ−マレイミジ ルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及びＮ−スクシ ンイミジル　３−マレイミドベンゾエート（ＳＭＢ）　、と反応させて、例えば 機能化された脂質ＭＰＢ−ＰＥ及びＰＤＰ−ＰＥを作ることにより、一般に形成 される。

本発明において有用な機能化された脂質は、２つの方法で形成される。第一の方 法は、脂質を少なくとも二つの官能基を含む二官能性剤と反応させることによる ものであり、その官能基の内の一つは、脂質と共有結合し、他のものは蛋白質と 更に反応して、共有結合した蛋白質−リポソーム複合体を生成する。この明細書 を通じて用いられる場合の二官能性剤は、脂質を蛋白質又は補因子に架橋させる ように機能する少なくとも二つの明白な反応性の基を含む化学剤である。用いら れる機能化された脂質の化学的性質に応じて、二官能性試薬は、活性化されたエ ステルのような少なくとも二つの親電子基、アミン、ヒドロキシル、若しくはチ オールのような少なくとも二つの核基又は少なくとも一つの親電子基と一つの核 基を含むことができる。もちろん、当業者は、二官能性試薬と脂質又は蛋白質と の間の共有結合の生成が最大になるように、二官能性試薬を選択することができ るであろう。必要な場合は、当該技術において容易に利用できるブロッキング剤 を用いて、共有結合を最大にし、二つの異なる二官能性試薬間の反応を防止すべ きである。

一方、機能化された脂質は、アミン又はヒドロキシル基のような反応性の基を含 む脂質、例えばＰＥ、を中間体、例えばＮ−スクシンイミジルビオチン又はｐ− ニトロフェニルビオチン、と反応させて、ある蛋白質が容易に非共有結合する補 因子又はその他の基、例えばビオチン、をこの脂質上に導入して、ビオチン−Ｐ Ｅを形成することにより、形成されることもできる。補因子が結合している機能 化された脂質は、ストレプトアビジン又はアビジンのようなビオチンを必要とし ている蛋白質と非共有結合して、本発明の非共有結合蛋白質−リポソーム複合体 を製造することができる。

機能化された脂質は、他の従来のリポソーム生成脂質と混合されて、反応性リポ ソームを生成する。機能化された脂質は、一般に１反応性リポソームの全脂質含 有量の少なくとも約０．１モルパーセント、好ましくは約１０モルパーセント以 下、最も好ましくは約０．２５〜約１モルパーセントを含む。リポソーム内に導 入されることのできる機能化された脂質の量が１０モルパーセントよりも大きい と認識される限り、このような量は、本発明において何部有用な機能を果たさな い。

本発明の一般的な方法においては、機能化された脂質を含むリポソーム小胞が形 成された後、その機能化された脂質を介して、反応性リポソームに蛋白質が結合 する。リポソームには、任意の蛋白質を結合させることができる。しかし、本発 明では、リポソームに共有結合又は非共有結合し、反応性リポソームに結合後、 受容体部位、抗原決定基又はその他の結合部位のような標的にも結合できるよう にそれらの自然の完全性を維持するこれらの蛋白質が好ましく意図される。本発 明において有用な蛋白質としては、とりわけ、ストレプトアビジン、抗体、例え ば、ＩｇＧ、ＩｇＭ。

ＩｇＥのようなイムノグロブリン、モノクローナル抗体、酵素、免疫調節刑、例 えばインターロイキン−１１インターロイキン−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及 びワクチン注射に使用するためのペプチドが挙げられる。

本発明において有用な蛋白質は、リポソームの機能化された脂質に共有結合する ことができ、一方、例えばビオチンのような補因子を介して、機能化された脂質 に非共有結合することができる。

蛋白質と機能化された脂質との間の共有結合は、蛋白質内に天然に存在するシス テイニルチオール基と機能化された脂質との反応により形成されることができ、 一方、蛋白質は、二官能性試薬、例えば５ＰＤＰ、で変性されて、反応性の基、 例えば機能化された脂質と反応することのできるチオール、を有する変性蛋白質 を生ずることができる。機能化された脂質に共有結合されるべき蛋白質が、比較 的露出されている、即ち、標的部位への蛋白質の結合に影響を及ぼすことなく、 リポソームの機能化された脂質と反応するのに十分なだけ蛋白質の外面に露出さ れている場合は、二官能性試薬で蛋白質を変性する必要はないかもしれない。し かし、リポソームに共有結合されるべき蛋白質が、システイニル残基を含んでい ない場合、又はシステイニル残基が、標的との蛋白質の結合を阻害することによ ってのみ、露出されることができる場合は、蛋白質を二官能性試薬で機能化する 必要があるかもしれない。

蛋白質二官能性試薬の機能は、蛋白質を機能化された脂質に共有結合させること である。

本発明のこの態様において有用な二官能性試薬としては、脂質に結合して機能化 された脂質を生成するのに用いられる同じ二官能性試薬が挙げられる６本発明の この態様においては、二官能性試薬は、蛋白質と反応する少なくとも一つの基と 、機能化された脂質と反応する少なくとも一つの基とを含む、上に示したように 、本発明においては、多数の二官能性試薬が有用である０本発明のこの態様にお いて有用な特に好ましい二官能性試薬は、５ＰＤＰである。

本発明の他の態様においては、蛋白質−リポソーム複合体を製造する前に、蛋白 質が先ず補因子、例えばビオチン、に共有結合してもよい。次いで、蛋白質−ビ オチン組成物が反応性リポソームの機能化された脂質に共有結合して、補因子が 共有結合している蛋白質−リポソーム複合体を製造することができる。用いられ る補因子がビオチンである発明のこの態様においては、ストレプトアビジンのよ うな蛋白質をＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン又はｐ−ニトロフェニルビ オチンと反応させて、蛋白質−リポソーム複合体を製造する際に使用するための 共有結合でビオチン化された蛋白質を作ることができる。

本発明の他の態様においては、ストレプトアビジン又はその他のビオチン結合蛋 白質を含む蛋白質−リポソーム複合体を、更にイムノグロブリンＧ１又は、例え ばＮ−ヒドロキシスクシンイミドでのビオチンへのカップリングによりビオチン 化されたモノクローナル抗体へ結合させることができる。蛋白質をリポソームと 標的部位との間の吸引カプラーにする蛋白質−リポソーム複合体の安定性が認め られたことは、全く驚くべきことである。

蛋白質が反応性リポソームに非共有結合している本発明の態様においては、最も 好ましくは、約０．１モルパーセントと約１モルパーセントとの間の機能化され た脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、を用いて、リポソームを先ず 形成し、蛋白質が非共有結合できる補因子、基質又はその他の分子と共有結合さ せる。ある種の蛋白質、例えばアビジン及びストレプトアビジンが容易に結合で きる補因子の好ましい例は、ビオチンである。ビオチンが用いられている本発明 のある態様においては、ビオチンがホスファチジルエタノールアミン上に導入さ れて、機能化された脂質ビオチン−ＰＥを生成する。機能化された脂質は、反応 性リポソーム内に導入され、蛋白質は、機能化された脂質の補因子に非共有結合 する。本発明のある態様においては、機能化された脂質をビオチンへ共有結合す るのに、蛋白質ストレプトアビジンが用いられる。

蛋白質がリポソームに共有結合又は非共有結合して蛋白質−リポソーム複合体を 製造する場合は、リポソームが凝集し、サイズが大きくなる傾向がある。理論に より束縛されることなく、蛋白質−リポソーム複合体により示される凝集現象は 、一つ以上のリポソーム上で機能化された脂質に結合する一つ以上の反応性の基 を含む蛋白質問、又は一つ以上のリポソーム」−で補因子を非共有結合する蛋白 質問に生ずる架橋の結果であるかもしれないと信じられている。ストレプトアビ ジンの非共有結合の場合、凝集は、ストレプトアビジンが個別のリポソーム上の ４つのビオチン単位に結合できることの結果であると信じられている。この架橋 の結果、リポソームは凝集又は固まり易く、蛋白質が結合した反応性リポソーム よりもサイズの大きいリポソームを生成する。行われた実験に基づくと、蛋白質 −リポソーム複合体に取り込まれた蛋白質の量は、凝集に影響を及ぼす。多くの 蛋白質が用いられるにつれて、架橋及び凝集の可能性は大きくなり、一般に、得 られた蛋白質−リポソーム複合体のサイズは大きくなるであろう。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体で利用される蛋白質の量は、用いられる蛋白 質のサイズ、蛋白質と標的部位との間の結合の強度及び用いられるリポソームの サイズに応じて変動する。一般に、リポソーム小胞当り約１０〜約１００個、最 も好ましくはリポソーム小胞当り約５５〜約８０個の蛋白質分子に等しい量の蛋 白質が、機能化された脂質に結合する。

本発明の方法においては、蛋白質をリポソームに結合させた後、凝集リポソーム を押し出すことにより、凝集リポソームのサイズが小さくなり、血液循環時間の 著しい増大を示す、より小さくて安定な非凝集蛋白質−リポソーム複合体を生成 することが発見されている。。′安定な”とは、蛋白質−リポソーム複合体が、 押出後少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、はぼ同一のサイズ及び 標的への蛋白質結合を維持することを意味する。蛋白質−リポソーム複合体が、 押出工程中濾別されないということは、驚くべき結果である。

本発明の押出態様においては、凝集蛋白質−リポソーム複合体を、一般に、約３ ０ｎｍから約１１００ｎの細孔を有するフィルターに通して、サイズが直径約７ ５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある蛋白質−リポソーム複合体を製造する。蛋 白質−リポソーム複合体が押し出されるフィルターの細孔サイズは、約５０ｎｍ から約１１００ｎの範囲にあることが好ましい。フィルターは、一般にポリカー ボネート製であるが、蛋白質−リポソーム複合体と相互に反応せず、十分な圧力 下で押出を行わせるのに十分強い耐久性のある物質で作られていてもよい。好ま しいフィルターとしては、本発明の好ましい押出方法の高圧力に一般に耐えるこ とができるために、′直路（ｓｔｒａｉｇｈｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ）　”フィルタ ーが挙げられる。好ましさでは劣るが、′屈曲路（ｔｏｒｔｕｏｕｓ　ｐａｔｈ ）　”も用いることができる。

当該技術において用いることのできる任意の押出方法を使用して、本発明のサイ ズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造することができ、本発明の蛋白質− リポソーム複合体の押出を、高圧下で逐次的又は″直路“で実施することができ る。本発明において使用するための特に好ましい押出方法としては、Ｃｕ１ｌｉ Ｓ等、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０１１６１、公開番号ＷＯ３６１００２ ３８、名称″リポソームを製造する押出技術”、１９８６年１月１６日公開に記 載されたものが挙げられ、その関連部分をここに参照のために記載した。本発明 は、蛋白質へのリポソームのカップリングに統く押出工程から生ずる蛋白質−リ ポソーム複合体に関するものでもある。本発明の蛋白質−リポソーム複合体を押 し出した後、脱水及び再水和し、あるいは４℃で安定に貯蔵することができる。

これらの組成物には、再水和工程又はそれに続く工程中、形成後の二分子膜をは さむイオンの電位差により、選ばれた生物活性剤を装填することができる。リポ ソーム内へ生物活性剤を装填する好ましい方法としては、Ｍａｄｄｅｎ等により 、米国特許出願番号筒３５２，４９７号、１９８９年５月１５８出願、名称′″ プロトン勾配よるリポソーム内への薬剤の蓄積”に記載されている方法が挙げら れ、その関連部分をここに参照のために記載した。一方、脱水前に、蛋白質−リ ポソーム複合体に生物活性剤を加えてもよい。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、被験者、例えばヒトを始めとする哺乳動 物、に投与することができる。組成物は、薬理学的に許容できる担体又はリン酸 緩衝生理食塩水のような希釈剤でこのような被験者に非経口的に搬送することが できる。リポソームに結合された蛋白質は、リポソーム及びそれらの内容物を体 の特定部位にターゲットする際に、助けとなる。抗腫瘍剤のような生物活性剤の 場合のごとく、非経口的に用いられる場合、使用量は医者によって定められ、治 療方法は腫瘍の大きさ及びその他の条件により決定される。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査にも用いることができる。この 場合、使用される蛋白質−リポソーム複合体の量は、サンプル中の標的化成分に 対するリポソーム結合抗体の感度に依存するであろう。

ある好ましい実施態様において、蛋白質−リポソーム複合体を形成するのに用い られる反応性リポソームは、同時係属中の米国特許出願、名称″単うメラ小胞を 製造する押出技術“、出願番号筒６．２２，６９０号、１９８４年６月２０［１ 出願（その関連部分をここに参照のために記載した）に記載されているＬＵＶＥ Ｔ装置を用いて、それ自体形成され、Ｌｅｓｅｒｍａｎ等の改良技術（リポソー ム技術ｍ、２９〜４０頁、１９８４年、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎ。

Ｙ、）を用いて、ストレプトアビジンに結合される。リポソームは、膜内外電位 差、即ち二分子膜をはさんでのＮ　ａ　＋　／　Ｋ十又はＨ＋勾配で形成される ことができる。同時係属中の米国特許出願番号第７４９，１６１号、Ｂａ１ｌｙ 等、名称“リポソーム内への抗腫瘍剤のカプセル化”　１９８５年６月２６日出 願（その関連部分をここに参照のために記載した）参照、この電位差は、リポソ ームの内部媒質対外部媒質のイオン濃度により達成される。リポソームに生物活 性剤を装填した後、トレハロースのような糖類の存在下又は不存在下に、リポソ ームを脱水し、この状態で、いつまでも貯蔵することができる。同時係属中の米 国特許出願番号第７５９゜４１９号、Ｊａｎｏｆｆ等、名称“脱水リポソーム” 、１９８５年７月２６日出願（その関連部分をここに参照のために記載した）参 照。

本発明で用いられる反応性リポソームは、各種の組成及び内部含有物を有するこ とができ、多重ラメラ、単ラメラ又はその他の種類のリポソーム、より一般的に は、現在知られているか又は今後開発される脂質含有粒子の形をとることができ る。例えば、脂質含有粒子は、普通に譲渡された米国特許出願番号第４７６，４ ９６．５２１，１７６．５９１，５７６及び５９９，６９１、それぞれ、１９８ ３年３月２４日、１９８３年８月８日、１９８４年３月２０日及び１９８４年４ 月１２日出願（それらの関連部分をここに参照のために記載した）に記載された 種類のステロイドリポソーム、安定複ラメラ小胞（ＳＰＬＶ）、単相小胞（ＭＰ Ｖ）又は脂質マトリックスキャリヤー（ＬＭＣ）の形をとることができる。しか し、ここで規定されているように、リポソームは、少なくとも約０．１モルパー セント、好ましくは約１０モルパーセント以下の機能化された脂質を含まなけれ ばならないことを認識すべきである。

本発明のリポソーム製剤に用いることのできるリポソームとしては、合成又は天 然のリン脂質が挙げられ、とりわけ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファ チジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチ ジルグリセロール（ＰＧ）　、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノ シトール、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）及びカルシオリビンを挙げることがで き、単独又は組み合わせて用いられる。本発明において有用なリン脂質としては 、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びシミリストイルホスフ ァチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を挙げることもできる。他の実施態様におい ては、ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＣＰ）　、ジパルミトイルホス ファチジルコリン（ＤＰＰＣ）又は水素化大豆ホスファチジルコリン（Ｈ２ＰＯ ）を用いることもできる。シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）と ジアラキドノイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）を同様に用いてもよい。こ れらのリポソームを作るためには、ＤＳＰＣ（約６５℃のＴｃ）　、ＤＰＰＣ（ 約４５℃のＴｃ）及びＤＡＰＣ（約８５℃のＴｃ）のように、脂質の転移温度（ Ｔｃ）が高いので、このような脂質をそれらのＴｃ前後、あるいはＴｃよりもわ ずかに高い、例えば約５℃まで高い温度に加熱するのが好ましい。好ましい実施 態様では、卵ホスファチジルコリンが用いられる。

本発明の多数の実施態様において、リポソームにステロイド成分を添加してもよ い。本発明の目的で、リポソームを作るために単独又はリン脂質と組み合わせて 用いることのできる上記脂質を含む任意の成分を、リポソーム生成脂質と言う。

本発明の好ましい実施態様においては、リポソーム生成脂質は、リポソームの脂 質の全重量の少なくとも９０モルパーセントを含む。上記リン脂質は、いずれも 、コレステロール、コレスタノール、コレスタノール、コレスタンからなる群よ り選ばれた少なくとも一つの他の成分と併用することができる。更に、コレステ ロールのポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧ−コレステロール）及びステロ ールの有機酸誘導体、例えばコレステロールヘミスクシネート（ＣＨ３）を、上 記リン脂質のどれかと併用することもできる。

アルファトコフェロールヘミスクシネート（ＴＨＳ）の有機酸誘導体を用いても よい。ＣＨ３，ＴＨ３含有リポソーム及びそれらのトリス塩形態は、得られたリ ン脂質−スチロール混合物が蛋白質と架橋できる安定なリポソームを生成する限 り、ステロールを含むリポソームを調製する任意の公知方法で調製することがで きる。特に、Ｊａｎｏｆｆ等、米国特許第４，７２１，６１２号、１９８８年１ 月２６日発行、名称“ステロイドのリポソーム”及びＪａｎｏｆｆ等、ＰＣＴ公 開番号８７１０２２１９．１９８７年４月２３日公開、名称“アルファトコフェ ロールを基体とした小胞”の方法参照。好ましい実施態様においては、コレステ ロールが、４５：５４のＥＰＣに対するコレステロールの重量比で、ＥＰＣと併 用される。

逆相蒸発、温浸法及び界面活性剤希釈等の大挙゛ラメラリポソーム（ＬＵＶ）を 作るのに用いられる技術を、反応性リポソームを製造するのに用いることができ る。リポソームを製造するこれら及びその他の方法の総説が、Ｍａｒｅ　Ｊ、　 ０ｓｔｒｏ編、リポソーム、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　（＋９８３）、第１章に見られ、その関連部分をここに参照のた めに記載した。

反応性リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体を製造するために、いくつかの 押出法を用いることができる。反応性リポソームを製造するためには、ＭＬＶは 、使用されるフィルターサイズに応じたサイズの大挙ラメラ小胞（ＬＵＶ）を形 成するフィルターを通して、押し出されるのが好ましい。一般に、本発明のサイ ズの揃った蛋白質−リポソーム複合体を製造するためには、３０．５０．６０又 は１１００ｎの細孔のポリカーボネートフィルターを用いることができる。この 方法では、Ｃｕ１ｌｉｓ等、ＰＣＴ公開番号Ｗ○８６１０００２３８．１９８６ 年１月１６日、Ｇ−記載すれ、その関連部分をここに参照のために記載したよう に、リポソーム懸濁液を繰り返して押出装置に通すことにより、均一なサイズ分 布のリポソーム個体群が生じる。例えば、濾過は、直路膜フイルタ−（Ｎｕｃｌ ｅｏｐｏｒｅポリカーボネートフィルター）若しくは屈曲路フィルターＣ例えば 、０．１ｕｍサイズのＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅフィルターメンブラフイルフィルタ ー（混合セルロースエステル）］を通して、又は均質化のような代わりの粉砕技 術により行われる。

反応性リポソームのサイズは、直径が約３０ｎｍから約２００ｎｍまで変わるか もしれないが、反応性リポソームは、サイズが約１１００ｎから約２００ｎｍで あることが好ましい。一般に、サイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体は、サ イズが約７５ｎｍと約２００ｎｍの間の範囲にある。

上述のごとく、室温よりも上の液晶Ｔｃに対してゲルを有する反応性脂質を形成 するために、多数の脂質を用いることができる。

このような場合、加熱バレル又は熱ジャケットを有する押出機を用いることがで きる。このような装置は、Ｌ　Ｕ　Ｖの押出を行わせるリポソーム懸濁温度を高 める働きをする。熱ジャケット付き押出機で用いられる脂質は、例えばＤＳＣＰ 、ＤＰＰＣ，ＤＭＰＣ及びＤＡＰＣであり、ある実施態様では、コレステロール が挙げられる。ＤＳＰＣを含むリポソームは、一般に約６５℃で、ＤＰｐｃは約 ４５℃で、ＤＡＰＣは約８５℃（脂質Ｔｃより約５℃高い）で押し出される。

押出後、反応性リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体は、生物活性剤を装填 してもよく、あるいは貯蔵のために脱水してもよい。しかし、蛋白質−リポソー ム複合体の場合は、押出工程中に、生物活性剤の多少の損失が生ずるかもしれな い。この起こりつる結果を避けるために、押出後に生物活性剤を装填するのが好 ましい。本発明のリポソーム膜び蛋白質−リポソーム複合体は、標準凍結乾燥装 置又は同等の装置を用いて脱水することができ、もし必要であれば、リポソーム 又は蛋白質−リポソーム複合体とそれらの周囲の媒質とを、脱水前に液体窒素中 で凍結させることができる。一方、リポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体は 、前もって凍結せず、単に減圧下に置くことにより、脱水することもできる。前 もっての凍結を伴う脱水には、試料中に一つ又はそれ以上の保護糖類が存在する ことが必要である。トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラク トース及びデキストランを始めとする各種の糖類を用いることができる。一般に 、二糖類の方が単糖類よりも良好に働くことが分かつており、二糖類については 、トレハロース及びスクロースが最も有効である。

リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体の内部又は外部媒質のいずれかの一部 として、一つ又はそれ以上の糖類が含まれる。

糖類が、リポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体の膜の内面と外面の両方と相 互に作用できるように、糖類が内部及び外部媒質の両方に含まれることが最も好 ましい。内部媒質への含有は、一つ又はそれ以上の糖類を、リポソームがカプセ ル化しようとする溶質に加えることにより達成される。はとんどの場合、この溶 質は、仕上げられたリポソームの外部媒質（ｂａｔ、ｈｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ） を形成するものでもあるので、この溶質に糖類を含ませることにより糖類が外部 媒質の一部となる。もちろん、例えば、膜内外電位差を生成するために、当初の 溶質以外の外部媒質を用いる場合は（下記参照）、その新しい外部媒質も、一つ 又はそれ以上の糖類を含まなくてはならない。

前もって凍結せずに脱水する場合、脱水されるリポソーム及び蛋白質−リポソー ム複合体が多脂質層を有し、膜の実質的な部分が、再水和に際してそれらの完全 性を維持するように、製剤中に水が十分残る終点まで、脱水が行われるならば、 一つ又はそれ以上の保護糖類の使用は省略してもよい。脱水工程の終わりに、製 剤が、脱水前に製剤中に存在する当初の水の少なくとも約２％、最も好ましくは 約２％〜約５％を含んでいれば、好ましいことが分かっている。

リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体が脱水されれば、それらを使用するま で、長期間にわたって貯蔵されることができる。

脱水されたリポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体を使用する場合は、単に、 リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体に水溶液、例えば蒸留水、を加え、そ れらを再水和することにより、再水和が行われる。

上で論じたように、本発明のリポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体製剤にイ オン化しつる薬理学的剤、例えば抗腫瘍剤、を装填するが、その際、リポソーム 又は蛋白質−リポソーム複合体の二分子膜をはさんで膜内外電位差を生成し、膜 内外電位差により抗腫瘍剤をリポソーム内に装填する。膜内外電位差は、リポソ ーム膜をはさんで、一つ又はそれ以上の帯電種（例えばＮａ＋、Ｋ十及び／又は Ｈ＋）について濃度勾配を作ることにより、生成される。濃度勾配は、異なる内 部及び外部媒質、即ち一つ又番まそれ以上の帯電種の濃度が異なる内部及び外部 媒質、を有するリポソーム及び蛋白質−リポソーム複合体を製造することにより 、作られる。

具体的には、一つ又はそれ以上の帯電種の第一の濃度を有する第一の媒質をカプ セル化する、本発明の蛋白質−リポソーム複合体を製造するために用いられる反 応性リポソームが調製される。

代表的なリポソーム調製技術（上記議論参照）につし１ては、リポソームが形成 されるとき、この第一の媒質がリポソームを取り囲み、従って、リポソームの当 初の外部媒質は、第一の媒質と同じ組成を有するであろう。濃度勾配を作るため に、当初の外部媒質を、一つ又はそれ以上の帯電種の異なる濃度を有する新しし ＼外部媒質と交換する。外部媒質の交換は、新い）媒質で平衡化されたゲル濾過 カラム、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）カラム、Ｇこリポソーム 試料を通すこと、又は遠心分離、透析あるし）は関連技術などの種々の技術によ り行うことができる。

この発明によれば、イオン化しうる抗腫瘍剤を、リポソームあるいはサイズを揃 えた蛋白質−リポソーム複合体内に装填するために、膜内外電位差が使用できる ことが分かつている。具体的（こは、濃度勾配を有するリポソーム、従って適当 な向きの電位差が作られると、リポソーム内に医薬を装填する方法が、その剤を 外部媒体に添加するという極めて簡単な工程に短縮される。添加すれば、膜内外 電位差が、自動的に剤をリポソーム内に装填することになる。

膜内外電位差装填法は、抗腫瘍剤を始めとする、適当な水性媒質（例えば、プロ トン化されることのできるアミン基を含む有機化合物）に溶解した際に帯電状態 で存在することのできる事実上任意の薬理学的剤について用いることができる。

好ましくは、この剤は、リポソーム膜内に分配するように、比較的親油性でなけ ればならない。この方法によりリポソーム内に装填することのできる薬理学的剤 のいくつかの例としては、多くの他の医薬の中でもとりわけ、抗腫瘍剤、例えば ドキソルビシン、ミドマイシン、プレオマイシン、ダウノルビシン、ストレブト ゾシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、塩酸メクロレタミン、メルフアラン 、シグロホスファミド、トリエチレンチオホスファ−アミド、カルムスチン、ロ ムスチン、セムスチン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、チオグアニン、シ タラビン、フロゲスウリジン、デカルバジン、シスプラチン及びプロカルバジン ；局所麻酔剤、例えばりドカイン、ジブカイン及びグロルプロマジン；気管支拡 張薬、例えばメタプロテレノール、テルブタリン及びイソプロテレノール；ベー ターアドレナリン遮断薬、例えばプロパノロール、チモロール及びラベトロール ；抗高血圧薬、例えばクロニジン及びヒドララジン；抗うつ薬、例えばイミブラ ミン、アミトリブチリン及びドキセピン；抗けいれん薬、例えばフェニトイン： 抗嘔吐薬、例えばプロカインアミド及びプロクロルペラジン：抗ヒスタミン薬１ 例えばジフェンヒドラミン、グロロフエニラミン及びプロメタシン；抗不整脈薬 、例えばキニジン及びシソビラミド：抗マラリア薬、例えばクロロキン、キナク リン及びキニン；並びに鎮痛薬が挙げられる。

一つの薬理学的剤を装填することに加えて、複数の薬理学的剤を同時又は逐次的 に装填する方法を用いることができる。また、イオン化しうる抗腫瘍剤が装填さ れる蛋白質−リポソーム複合体それ自体に、通常のカプセル化技術を用いて（例 えば、リポソームが作られる緩衝液に薬剤を取り込むことにより）、他の抗腫瘍 剤又は薬剤を前装填することができる。

薬理学的剤を複合体内に維持するように向けられる蛋白質−リポソーム複合体膜 をはさんでの膜内外電位差を作ることにより、薬理学的剤の放出速度を著しく低 下させることができることが知られている。即ち、イオン化された際に正に帯電 する剤については、外部電位に対して負である内部電位を有する膜内外電位差が 、蛋白質−リポソーム複合体膜をはさんで作られ、一方、負に帯電する剤につい ては、反対の向きが用いられる。

この発明の膜内外装填態様に関しては、Ｎａ＋、Ｋ十及び／又はＨ＋のような帯 電種のリポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体の内側及び外側の濃度を調整す ることにより、薬剤放出速度を低下させるために用いられる膜内外電位差が作ら れる。事実、このような濃度勾配によって生成された膜内外電位差により、リポ ソーム又は蛋白質−リポソーム複合体が装填されたとすれば、当初の濃度勾配を 維持する外部媒質中にリポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体を単に保持する だけで、所望の放出速度低下が得られるであろう。一方、膜内外電位差が、リポ ソーム又は蛋白質−リポソーム複合体膜をはさんで、まだ作られていなかったと すれば、例えば、リポソーム又は蛋白質−リポソーム複合体が、通常の方法を用 いて装填されていたとすれば、上記交換技術を用いて、外部媒質の組成を変える ことにより、所望の膜内外電位差を容易に作ることができる。

蛋白質−リポソーム複合体の脱水に関するこの発明の方法態様においては、二つ の基本的なアプローチが提供される。第一のアプローチでは、複合体に生物活性 剤を装填しく例えば、通常の方法又は上述の膜内外電位差装填技術を用いて）、 貯蔵、輸送等の目的で脱水し、次いで、使用時に再水和することができる。一方 、前もって形成されたリポソーム複合体を、貯蔵等のために脱水し、使用時又は その近くで再水和し、上述の膜内外電位差装填技術を用いて、イオン化しつる生 物活性剤を装填することができる。

脱水された蛋白質−リポソーム複合体を使用する場合は、水性溶液、例えば蒸留 水又は適当な緩衝液、を蛋白質−リポソーム複合体に単に加えて、再水和させる ことにより、再水和を行う。溶液を静かに渦巻かせることにより、水溶液中に複 合体を懸濁させてもよい。再水和は、室温、又はリポソームの組成及びそれらの 内部含有物に適当な他の温度で行うことができる。

投与しようとする生物活性剤が、脱水前に蛋白質−リポソーム複合体内に取り込 まれており、それ以上の変更が要求されないのであれば、再水和された複合体を 、リポソームカプセル化薬剤を投与する公知の方法を伴う治療に直接使用するこ とができる。

一方、上に述べた膜内外電位差法を用いて、投与直前に、イオン化しつる生物活 性剤を再水和された蛋白質−リポソーム複合体内に取り込むことができる。この アプローチに関連して、膜内外電位差を生成するのに用いられる濃度勾配は、上 述の外部媒質交換技術を使用して、脱水前か再水和の後かのいずれかに作ること ができる。

同一の内部及び外部媒質を有する、即ち膜内外電位差のなし）蛋白質−リポソー ム複合体は、調製、脱水、貯蔵、再水和され、その後、外部媒体を、膜内外電位 差を生成することのできる組成を有する新しい媒質と交換し、この膜内外電位差 を、リポソーム内にイオン化しうる抗腫瘍剤を装填するのに用いることができる 。

一方、膜内外電位差を生成することのできる内部及び外部媒質を有する蛋白質− リポソーム複合体は、調製、脱水、貯蔵、再水和され、その後、膜内外電位差を 用いて装填することができる。

本発明の蛋白質−リポソーム及びリポソーム複合体は、ヒトを始めとする哺乳動 物のような被験者に投与することができる。病気の治療におけるヒトへの投与に ついては、処方する医者が、特定のヒト被験者への適当な投与量を最終的に決め るであろう。そして、これは、患者の症状の性質及び重さと共に、個人の年齢、 体重及び反応によって変わるものと予測することができる。

投与の形態によって、化合物が搬送される生体内の部位が決まるであろう。例え ば、感染の特定部位への搬送は、局所塗布（もし、感染が外部的、例えば、目、 皮膚、耳内のような領域、又は創傷や火傷のような病気、であれば）又は上皮若 しくは皮膚粘膜ライニングによる吸収（例えば、鼻腔内、経口、腟内、直腸内、 胃腸内、粘膜等）により、最も容易に行うことができる。このような局所塗布は 、クリーム又は軟膏の形で行うことができる。生物活性剤を含む蛋白質−リポソ ーム複合体は、単独で投与されてもよいが、一般には、目的とする投与経路及び 標準製薬プラグテイスに関連して選択された製薬担体と混合して投与されるであ ろう。本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、非経口で、例えば静脈内、筋肉内 又は皮下に注射してもよい。非経口投与については、それらを、例えば、溶液を 等強性にするのに十分な塩、グルコース又はぶどう糖のような他の溶質をを含ん でもよい無菌水溶液の形で用いるのが最良である。

経口投与形態については、本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、錠剤、カプセ ル、ロゼンジ、トローチ、粉末薬、シロップ、エリキシル剤、水溶液、懸濁液等 の形で使用することができる。

錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム及びリ ン酸の塩が挙げられる。デンプンのような種々の崩壊剤及び潤滑剤、例えばデン プン、を用いることができる。カプセル形態での経口投与については、有用な希 釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。経口用に水性 懸濁液が必要な場合は、ある種の甘味及び／又は着香剤を加えることができる。

本発明の蛋白質−リポソーム複合体は、診断検査にも用いることができる。この 場合、使用される組成物の量は、試料中の標的成分に対するリポソーム結合抗体 の感度に依存するであろう。

次の実施例は、説明の目的でのみ与えられるものであり、この発明の範囲を限定 するものと考えるべきではない。

１上■ 材料及び方法 卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵ホスファチジルエタノールアミン（Ｅ　 Ｐ　Ｅ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｅ ）は、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ　（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ。

＾１ａ、　ＵＳＡ）から入手した。Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジル ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）　、Ｎ−スゲシンイミジル　４−（ｐ−マ レイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＨ）は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂ ｅｓ、　Ｏｒｅｇｏｎ、　ＵＳＡから入手し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビ オチン（ＮＨ３−ビオチン）は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手し た。ジチオスレイトル（ＤＴＴ）　、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンーＮ ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−　（Ｎ−モルホリノ）−エタン スルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′　−２−エ タンスルホン酸（）（ＥＰＥＳ）、ＦｉＴＣ−セライト、エチレンジアミン西酢 酸塩（ＥＤＴＡ）、ジチオビヌー２−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）　、Ｎ−エチ ルマレイミド（ＮＥＭ）、生血清アルブミン（ＢＳＡ）、カルボキシフルオレセ イン、ストレプトアビジン、ビオチン化プロティンＡ、ビオチン化アルカリホス ファターゼ、ビオチン化スグシニル化コンカナバリンＡ及びセファデックス（Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　５０は、Ｓｉｇｍａ、　ＵＳＡから入手した。抗ヒト赤 血球１ｇＧは、Ｃａｐｐｅｌ、　Ｉｎｃ、　ＵＳＡから購入し、ビオチン化抗Ｂ ］、（ＰＡＮ−Ｂ、Ｉ　ｇＧ　２ａ）及びビオチン化抗Ｔｌ１（Ｅ−ロゼツト、 ＩｇＧ　１）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　ＵＳＡから入手 した。セファロースＣＬ−４Ｂ及びフィコールバーク（ｆｉｃｏｌｌｐａｑｕｅ 　）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　ＵＳＡから入手した 。３Ｈビオチンは、Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　ＵＳＡから 入手し、１４Ｇコレステロールは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、 　ＵＳＡから入手した。

実施例１及び２ Ｎ−３−２−ピリジルジチオ　プロピオニル−ホスファチジルエタノールアミン 　ＰＤＰ−ＰＥ　Ｎ−４−−マレイミドフェニル）ブチリル］ホスファチジルエ タノールアミン（ＭＢＰ−ＰＥ）の合成 Ｌｅｓｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２８８．６０２　（１ ９８４）により記載されているように、ＦＤＰ−ＥＰＥを合成した。簡単に言う と、５０ｕｍｏｌのＥＰＥをクロロホルム／メタノール（９：１）３゜５ｍｌに 溶解し、６０１Ｊ、　ｍ、　ｏ　ｉの５ＰＤＰと１００１０００ｕのトリエチル アミンを含むメタ７ノール１５　ｍ　ｌに加えた。室温での４時間のインキュベ ーションの後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ，ランニング溶剤：クロロホル ム／メタノール／水、６５：２５：４）で分析すると、ＥＰＥの９９％がより速 いランニング生成物に変換していた。反応混合物を、１０ｍ１のリン酸緩衝生理 食塩水で洗浄した。減圧下で有機相を除去する前に、この洗浄を３回繰り返した 。２デイメンジヨンＴＬＣ及びプロトンＮＭＲで分析すると、９８％よりも純度 の高い単一の生成物が得られていた。ＦＤＰ−Ｅを、窒素下、クロロホルム中、 ２０℃で数カ月貯蔵した。

少し変更を加えたＭａｒｔｉｎ等（＋９８２）の方法により、最初にＭＢ　Ｐ　 −Ｐ　Ｅを合成した。ＥＰＥ　（１００ｕｍｏ　ｌ）を、１００１００ｕの新し く蒸留したトリエチルアミンと５０ｍｇのＳＭＰＢとを含む無水メタノール５ｍ ｌに溶解した。窒素下、常温で反応を行い、その進行をＴＬＣ（流出溶剤：クロ ロホルム／メタノール／水、６５：２５：４）でモニターした。１８時間のイン キュベーションの結果、ＰＥＰの９５％が、より速い流出生成物に変換された。

減圧下でメタノールを除去し、サンプルをクロロホルムに溶解し、１％ＮａＣ１ で広範に（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）洗浄して、未反応ＳＭＰＢ及び残留トリエ チルアミンを除去した。Ｍａｒｔｉｎ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５ ７．２８６　（１９８２）により用いられた溶剤系を用いたＴＬＣ分析により、 脂質生成物が、ニンヒドリンに敏感でなく　（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ−ｉｎｓｅｎ ｓｉｔｉｖｅ）リン酸塩に陽性である（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｏｓｉｔｉｖｅ） 単一成分として流出されたことが分かった。更に、２デイメンジヨンＴＬＣ（第 １デイメンジヨン、塩基：クロロホルム／メタノール／Ｎｈ３／Ｈ２０，９０１ ５４１５，７１５，３；第２デイメンジヨン、酸：クロロホルム／メタノール／ 酢酸／Ｈ２ｏ、６０／３０／ｌ　８／２．８５）により反応生成物を確認したと ころ、ニンヒドリンに陰性で、リン酸塩に陽性である２つの脂質成分が存在する ことが分かった（酸ディメンジョンでのＲｆ値二０．９３及び０．７８３）、こ れらの観察は、Ｉ　ＨＮＭＲ分析により確認され、全脂質画分の約６０％を含む より遅い流出生成物が、純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥとして同定された。

上で合成された２つのチオール反応性脂質、ＰＤＰ−ＥＰＥとＭＰ　Ｂ　−Ｅ　 Ｐ　Ｅを、従来技術によるチオール化ＩｇＧとのカップリング反応に供し、２つ の架橋基のどちらがより効率的であるかをめた。図１に示すように、２０モル％ よりも多くのコレステロールがリポソーム内に取り込まれるまでは、ＰＤＰ−Ｅ ＰＥを含むリポソームに対するチオール化ＩｇＧの顕著なカップリングは起こら なかった。これに対して、ＭＰＢ−ＥＰＥを含むリポソームについては、コレス テロールが存在していなくても、１２ｕｇ１ｇＧ／ｕｍｏｌ脂質の水準が得られ た。リポソームに複合した蛋白質の水草は、小胞内に取り込まれたコレステロー ルの量に関して、直線的に増加した。ＥＰＥのマレイミド誘導体については、試 験した全ての条件下で、著しく高いカップリング率が得られた。

実施例３ なＭＰＢ−ＰＥのム トリエチルアミン（１０ｍｇ）を含むクロロホルム（５ｍｌ）中、４０℃で、Ｄ ＰＰＥ　（６９ｍｇ）をＳＭＰＢ（６５ｍｇ）と反応させることにより、純粋な ＭＰＢ−ＰＥを合成した。２時間後、シリカでのＴＬＣにより、ＤＰＰＥがより 速い流出生成物へ変換したことがわかった（溶剤系：クロロホルム／メタノール ／アセトニドロール／水、７５：’１６＋５：４、Ｒｆ　：　０．６）、溶液を クロロホルム（ｌｏｍｌ）で希釈し、ＮａＣ１（０，９％）で数回洗浄して反応 の副生成物を除去した。この溶液を、真空中で更に濃縮し、固体残渣を粉末化し 、ジエチルエーテルから再結晶して未反応ＳＭＰＢを除去した。更にジエチルエ ーテル／アセトニトリルから再結晶することにより、ＩＨＮＭＲ分析（Ｂｒｕｋ ｅｒ　Ｗ２Ｏ，４００ＭＨｚ）で示されるように、純粋な生成物が生じた。

ブリティッシュコロンビア大学、ブリティッシュコロンビア地方質量分光学セン ターにおいて、ＡＥＩ　ＭＳ９で、高速作用衝撃（Ｆａｓｔ　Ａｃｔｉｎｇ　Ｂ ｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）　（Ｆ　Ａ　Ｂ　）質量スペクトルを得た。

実施例４ ＭＰＢ−ＰＥ　／　る　・の 実施例２に従ってＤＰＰＥをＳＭＰＢと反応させることにより得られた脂質の” ＨＮＭＲ分析から、’ＨＮＭＲスペクトルの低フィールド領域に、予測される生 成物に特有なものではない新しいビーブが出現し、ＳＭＰＢのＮ−ヒドロキシス クシンイミド基によるシグナルが喪失したことがわかる（デルタ：　７．５８， ７．１５及び６．４５．６．２２）、ＳＭＰＢでＤＰＰＥを誘導するための条件 をもっと良く理解するために、ＳＭＰＢと反応するモデルアミンとして、２−メ トキシエチルアミン（ＣＨ，○−ＣＨ，ＣＨ，−ＮＨ，；図３、構造Ａ）を選択 した。

ＳＭＰＢのＩＨＮＭＲスペクトルは、フェニル基の芳香族プロトンによる低フィ ールド共鳴（化学シフト（デルタ）ニア、３及びビニルプロトン（デルタ：６． ８６）並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基のメチレンに関する高フィール ド共鳴（ＮＨ３、デルタ：２．８６）を示す。ＭＰＢ−ＰＥの従来の合成につい て述べた同様な条件下で、２−メトキシエチルアミンをＳＭＰＢとインキュベー トしたとき、ＳＭＰＢよりも極性の大きい２つの主要生成物が、ＴＬＣにより検 出された（図３及び以下の表１参照）、ＳＭＰＢのＮＨ３基の４つのメチレンプ ロトンについてのデルタ２．８６においてピークが喪失し、デルタ３．３５　（ ＯＣＨ，による）及びデルタ３．４５（〇−ＣＨ，ＣＨ置図３、構造Ｂによる） において新しいピークが出現したため、ＳＭＰＢからＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド（ＮＨ３）の置換により形成されたアミドとして、より極性の低い生成物が ゛ＨＮＭＲ分析により同定された。極性の大きい方の生成物を“ＨＮＭＲで分析 することにより、環構造（図３、構造Ｃ）のメタツリシスによるマレイミド基の 開環と一致するパターンがわかった。例えば、表１に示すように、４つの芳香族 プロトンについてのシグナルが、デルタ７．５８における２つの明確な二重線（ ｄ、Ｊ＝８Ｈ，２つのプロトン）として出現し、一方、２つのビニルプロトンに ついての共鳴が、上のフィールドに移動し、デルタ６．２２及びデルタ６．４５ における２つの二重線（Ｊ＝１３Ｈｚ）として出現した。

３つのプロトンについて統合されたデルタ３．８６におけるシャープなピークの 出現は、マレイミド基にメタノールを添加したために生じたものと解釈され、そ の結果、環部分が開くことになった。これらの結果は、質量スペクトル分析（構 造Ｂ：分子式Ｃ、、Ｈ，、Ｎ、Ｏ，，３１６において分子イオン；構造Ｃ：分子 式Ｃ１゜Ｈ，、Ｎ、Ｃ１，３４８において分子イオン）により更に支持された。

Ｍａｒｔｉｎ等の従来法により合成されたＭＰＢ−ＤＰＰＥ脂質のＩＨＮＭＲ分 析によっても、サンプル中に純粋及び開環ＭＰＢ−ＤＰＰＥ誘導体の混合物が存 在することがわかった。

塩基性条件下におけるメタノール性環開裂に対するマレイミド基の感受性は、Ｓ ＭＰＢのメタノール溶液をトリエチルアミンで処理した場合、より極性の高い生 成物が形成されることにより確認された（下記表１）。クロロホルム中において 、ＳＭＰＢがはるかに安定であることがわかったので、１当量のトリエチルアミ ンを含むこの溶剤中で、ＳＭＰＢでのＤＰＰＥの誘導を行った。

Ｅであることがわかった（図２）、質量分光分析（ＦＡＢ）により、ＭＰＢ−Ｄ ＰＰＥのナトリウム塩に対応するＣ５１Ｈ８４０ＩＩＰＮａの分子式に相当する ９５５における分子イオンが存在することから、脂質誘導体の純度が確認された 。

表１ サンプル　フェニルプロトン　ビニルプロトン　ＮＨ３基のそのまま　開裂　そ のまま　開裂　メチレンｄ７．３　ｄ７．５８．　ｄ６．８６　ｄ６．４５．　 ｄ２，８６ＳＭＰＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ＳＭＰＢ＋　Ｘ　Ｘ メタノール ＭＰＢ−ＭＥＡ　Ｘ　Ｘ ＭＰＢ−ＭＥＡ＋　Ｘ　Ｘ ＤＰＰＥ　（純） ＭＰＢ−ＤＰＰＥ　Ｘ　Ｘ 実施例５ 互！］鷺≦募以１ｋ Ｈｏｐｅ等（＋９８５）により記載されたようにして、大半ラメラノ」）胞（Ｌ ＵＶ）を調製した。簡単に説明すると、クロロホルム中の脂質混合物の適当な一 定量をチューブに入れ、窒素気流下で乾燥して脂質フィルムとし、次いで、２時 間高真空にした。常法により、１５０ｍＭＮａＣ１，２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ ５ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ６，５中で、脂質サンプル（５０〜５４％ＥＰＣ１４５％ コレステロール、実施例１〜３により調製した１〜５％反応性脂質）を水和し、 ２枚重ねの１１００ｎフイルターから１０回押し出した。カップリング実験の直 前に、サンプルを、ＮａＯＨで適当なｐＨに滴定した。カップリング工程のチオ ール依存性を研究するために１％（カップリングにつし）て）、及びマレイミド 活性については５％の純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥを含む・響ノボソームを、上述の ようにしてｐＨ６，５で調製し、ＮａＯＨでｐＨ７，５に滴定し、一部を、マレ イミド脂質１モル当りｂ−メルカプトエタノール１０モルのモル比で、５分間、 ｂ−メルカプトエタノールとインキュベートした。２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２５ ｍＭ　ＭＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１％ｐＨ７，５で平衡化したセファデックス Ｇ−５０で、遊離のｂ−メルカプトエタノールからリポソームを分離した。クエ ンチされたリポソームのカップリング効率ポテンシャル及びマレイミド基の反応 性を、クエンチされていないリポソームのそれと比較した。Ｆｉｓｋｅ及びＳｕ ｂｂａｒｏｗ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　６６、３２５　（１９２５）の比 色測定法又は脂質混合物内に存在する微量の゛４Ｃコレステロールのどちらかに より、脂質を測定した。

これは、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｔｒｉ　Ｃａｒｂ液体シンチレーションアナライザー でのシンチレーション計数により行われた。

実施例６ マレ　ミ′　・　の ＭＰＢ−ＰＥのマレイミド基の反応性は、５ｅｄｌａｃｋ等、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、２５．１９２　（１９６８）により記載されているようにして 、脂質誘導体へのｂ−メルカプトエタノールのチオール結合、及びエルマン試薬 （Ｅｌ１ｍａｎ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）　、ジチオビス＝（２−ニトロ安息香酸 ）（ＤＴＮＢ）、での未結合ｂ−メルカプトエタノールの逆滴定により測定した 。リポソーム（５％ＭＰＢ−ＤＰＰＥ、５０％ＥＰＣ１４５％コレステロール、 ２００ｕ　ｌ中１　ｕｍｏ　ｌ）を、ｐ）１ｇ、２　（０，２ＭトリスＣ１，２ ０ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００、ｐＨ８，２， １，６ｍ１）、室温で３０分間、ｂ−メルカプトエタノール（１ｍＭの１００ｕ 　１）とインキュベートした。ＤＴＮＢ　（１００ｕ　ｌ、メタノール中２０ｎ Ｍ）を添加し、３０分後、４１２ｎｍにおいて吸光度を測定した。カップリング 工程において蛋白質結合チオ・−ル基が必要であることを、下記表２に示す。Ｍ ＰＢ−ＤＰＰＥＰＥリポソームってｂ−メルカプＩ・エタノールにさらすと、ク エンチされたサンプルを対照ＭＰＢ−ＤＰＰＥと比較した場合、リポソーム複合 ストレプトアビジンの量が低下することになる。これに平行して、脂質誘導体の マレイミド基の検出可能な反応性が低下した。更に、未処理ストレプトアビジン は、マレイミド脂質を含むリポソームと結合しなかった。

表２ ８時間　０時間　８時間 ＭＰＢ−ＤＰＰＥ　３６．０　１００　７３リポソーム ｂ−メルカプト　２．５　１１　０ エタノール処理 ＭＰＢ−ＤＰＰＥ リポソーム ＭＰＢ−ＤＰＰＥ　Ｏ１００７７ リポソーム＋ 未チオール化スト 結果：リポソーム（１又は５％ＭＰＢ−ＤＰＰＥ、５４〜５０％ＥＰＣ１４５％ コレステロール）を、ｐ　Ｈ７，５で５分間、ｂ−メルカプトエタノール（ＭＰ Ｂ−ＤＰＰＨに対して１０モル過剰）でクエンチし、ＨＢＳ、ｐＨ７，５で平衡 化したセファデックスＧ−５０にて交換して、ストレプトアビジンとあるいは単 独でインキュベートした（ｐＨ７，５、室温で８時間）。８時間のインキュベー ション後、対照（クエンチされていないＭ　Ｐ　Ｂ　−Ｄ　Ｐ　ＰＥリポソーム 又は未チオール化ストレプトアビジン）及びクエンチされたサンプルについて、 リボソー・ムに複合したストレプトアビジンの量及びマレイミド基の反応性を測 定した。示したように、ストシブｌ−アビジンのようなある場合は、他の蛋白質 と同様に、反応性チオールの存在が、反応性リポソームへの蛋白質のカップリン グを著しく促進する。事実、ストレブ［・アビジンの場合、チオール基の存在が 必要であるように思われる。

別に、Ｍａｒｔｉｎ等、前出、の従来法により合成されたＭＰＢ−ＰＥ脂質及び 本発明の方法により合成されたＭ　Ｐ　Ｂ　−Ｐ　Ｅを、ｐＨ７，５におけるｂ −メルカプトエタノールでの滴定に供した。

リポソーム（１又は５％Ｍ　））　Ｂ　−Ｐ　Ｅ、５４〜５０％ＥＰＣ１４５％ コレステロール）を、ｐＨ７，５で５分間、ｂ−メルカプトエタノール（ＭＰＢ Ｖ−ＰＥに対して１０モル過剰）でクエンチし、ＨＢＳ、ｐＨ７，５で平衡化し たセファデックスＧ−５０にて交換して、ストレプトアビジンと、あるいは単独 でインキュベートした。８時間のインキュベーション後、対照（クエンチされて いない）及びクエンチされたサンプルについて、リポソームに複合したストレプ トアビジンの量及びマレイミド基の反応性を測定した（上記参照）。純粋なＭＰ Ｂ−ＰＥは、従来法により作られたＭＰＢ−ＰＥよりもｂ−メルカプトエタノー ルでのクエンチングが大きくなった。結合したストレプトアビジンの量に大きな 差がないのは、恐らく、ストレプトアビジンのチオール基がマレイミドと反応す るのを妨げる立体相互作用の結果であろう。この実験の結果は、以下の表３に見 られる。

表３ ＭＰＢ−ＰＥのメルカプトエタノール　Ｈ２Ｓ　との　、サンプル　処理　ｕｇ ストレプトアビ　％マレイミドのＭＰＢ 実施例７ カップリング　ストレブ　ビジン　Ｌ　Ｇの上述のごとく、ある場合には、スト レプトアビジン蛋白質をＭＰＢ−ＰＥ含有反応性リポソームに結合させるために 、その蛋白質を変性して、反応性チオール基を導入することが必要である。

ストレプトアビジン（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７， ５；ＨＢＳ、ｐＨ７，５、中５　ｍ　ｇ　／　ｒｎ　１　）を、Ｃａｒｌｓｓｏ ｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７３．７２３　（１９７８）の公表された方 法にしたがって、アミン反応性試薬、５ＰＤＰ、で変性した。簡単（こ述べると 、５ＰＤＰ　（メタノール中２５ｍＭ）を、室温で３０分間、ストレプトアビジ ンに対して１０モル比でインキュベートした。未反応５ＰＤＰを、ＨＢ　３％ｐ Ｈ７，５で平衡化したセファデックスＧ−５０でのゲル濾過により除去した。Ｐ ＤＰ変性ストレプトアビジンをＤＴＴで還元した（２５ｍＭ、１０分）。チオー ル化生成物を、適切な緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、ゲル排 除により単離し、直ちにカップリング実験に使用した。ジチオスレイトル（ＤＴ Ｔ）添加前に、２８０ｎｍ（吸光率、Ｅ、、、：２７７０）における蛋白質の濃 度を、そしてＤＴＴの添加１ｏ分後に、３４３ｎｍ　（Ｅ、、、：　７５５０） における２−チオピリドンの濃度を測定することにより、ストレプトアビジンの 変性の程度をめた。、ＩｇＧの場合は、ストレプトアビジンについて述べたよう にして５ＰＤＰで変性後、蛋白質をＦＩＴＣ−セライトで蛍光標識した（Ｉｇｏ 　５０％重量、２０分）。

蛋白質をＤＴＴで処理する前に、酢酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣ１，１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０）で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、未反 応試薬からサンプルを分離し、その分子の固有のジスルフィドの還元から保護し た。両蛋白質資料は、５ＰＤＰで同程度に変性された（蛋白質当り約５〜６ＳＰ ＤＰ分子）。

実施例８ リポソームへの　白　のカップ１ング 還元されたＦＤＰ変性蛋白質を、種々のｐＨ値で１００ｕｇ蛋白質／ｕｍｏｌ脂 質（１ｍＭ最終濃度）の割合でＰＤＰ−ＰＥ、ＭＰＢ−ＥＰＥ又は純粋なＭＰＢ −ＤＰＰＥを含むリポソームとインキュベートすることにより、リポソームへの 蛋白質の力・ツブリングを実施した。ＨＢＳ、ｐＨ７，５で平衡化したセファロ ースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により、未結合蛋白質を除去した。リポソームへの ストレプトアビジンのカップリング量は、ストレプトアビジンへの３Ｈビオチン の結合をモニターすることにより測定された。簡単に述べると、ストレプトアビ ジン−リポソーム（０，５ｍｌ中０．２５ｕｍｏｌ脂質）を、°Ｈビオチン（２ ５ｕｌ中３．８５ｎｍｏ　ｌ、１５，４ｕｍｏ　ｌ／ｕＣｉ）で１０分間インキ ュベートし、ＨＢＳ、ｐＨ７，５で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂでのゲル 排除により、未結合ビオチンを除去した。セファデックスＧ−５０でのゲル排除 後のストレプトアビジンサンプル（１００ｕｇ）への″Ｈ結合の量を、カップリ ング率を計算するための参考として用いた。リポソームに結合した抗体の量を測 定するために、サンプル（２００ｕｌ）をエタノール（１，８ｍ１）に溶解し、 リポソーム結合蛍光を既知量のフルオレセイン標識抗体と関連づけた。４９５の 励起波長を有するＳＬＭ−ａｍｉｎｃｏ　５ＰＦ−５０ＱＣ蛍光分光光度計を用 いて、５２０ｎｍにおいて蛍光をモニターした。

実施例９ ｒ−ＭＰＢ−ＤＰＰＥ　’Ｉボソームこチオールイス　レプビジン　ムさせ　た めの 純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥを含むリポソームに、チオール化ストレプトアビジンを 結合させるための最適条件を調べた。結果を図４及び５に示す、ＭＰＢ−ＤＰＰ Ｅリポソームに対するチオール化ストレプトアビジン結合のｐＨ依存性及びマレ イミド機能を、始めに決定した。図４に示すように、リポソーム複合蛋白質の量 は、７．０よりも大きいｐＨ値において、急速に増大した。しかし、純粋なＭＰ Ｂ−ＤＰＰＥを含むリポソームを、７．０以上のｐＨ値においてインキュベート すると、誘導された脂質のマレイミド基が、対応して急速に分解した。１８時間 のインキュベーション後、ｐＨ７，５において、顕著な水準のストレプトアビジ ンがリポソームに結合しく４５％）、マレイミド反応性の喪失も許容できるもの であった（６５％残存）。このため、カップリング条件を更に最適化するために 、７．５のｐＨを選択した。

図５には、リポソームに対するストレプトアビジン結合及びマレイミド脂質の反 応性に関連する時間経過を示す。この結果から、ｐＨ７，５及び室温で８時間イ ンキュベーション後に、リポソームに複合したストレプトアビジンの最適水準（ 脂質１　ｕｍｏ　ｌ当り約３７ｕｇ）が得られ、マレイミド基の分解も最小にな ることがわかる。

実施例１゜ 々のビオチンヒ　への　・・ブ１ングの櫂々のタイプのターゲツティング分子を リポソームに結合する際における、本発明の一般的な方法論の適用性を示すため に、ストレプトアビジン−リポソームに対する種々のビオチン化蛋白質の結合を 調べた。下記表４に示すように、種々のビオチン化蛋白質をストレプトアビジン 複合リポソームとインキュベートした場合、ストレプトアビジン３分子毎に、お よそ２つの蛋白質分子が結合する。ストレプトアビジン結合小胞に対するビオチ ン化蛋白質の結合量は、ビオチン化蛋白質のサイズには依存しない（分子量＋４ ２，０００〜１５０，０ＯＯＤ）　。簡単に言うと、脂質１ｕｍｏｌ当り４５． ２ｕｇの蛋白質結合を有するストレプトアビジンリポソームを、実施例８に記載 したようにして調製した。フルオレセイン標識ビオチン化蛋白質を、ストレプト アビジンに対して２倍モル過剰で、ｐｌ（７，５にて１０分間、複合リポソーム とインキュベートした。サンプルをセファロースＣＬ−４Ｂでゲル排除した後、 蛋白質についてはリポソームに結合した蛍光の水準を測定し、脂質についてはシ ンチレーション計数することにより、ストレプトアビジンリポソームに対するビ オチン化蛋白質のカップリング量をめた。

表４ ス　レブ　ビジン冨ボソームへのビオ　ン　白　の７ム蛋白質　ｕｇ／ｍｏｌ　 ｎｍｏｌ／ｕｍｏｌ　モル比脂質　脂質　蛋白質−ストレブ （ｍｗ：１５０　ｋＤ） アルカリホス　７７．７　０．５５５　１：１，２５フアターゼ （ｍｗ：１４０　ｋＤ） プロティンＡ　２０．３　０．４８２　１：１．４６（ｍｗ：４３　ｋＤ） スクシニル化　０．４８０　１：１．４６実施例１１ ストレプトアビジンリポソームへのビオチン　の　ムＢａｙｅｒ等、ＦＥＢＳ　 Ｌｅｔｔ、　６８．２４０　（１９７６）の方法により、抗赤血球ＩｇＧをビオ チン化した。全てのビオチン化蛋白質を、ＩｇＧについて上述したように、ＦＩ ＴＣ−セライトで蛍光標識した。

リポソームに結合したストレプトアビジンに対して２倍モル比で、１３分間、蛋 白質をインキュベートした。ＨＢＳ、ｐＨ７，５で前もって平衡化したセファロ ースＣＬ−４Ｂでのゲル排除により、未結合蛋白質を除去した。蛍光標識１ｇＧ について上に述べたようにして、リポソーム結合蛋白質の量をめた。全てのビオ チン化蛋白質のバックグラウンド結合は、無視できるものであることがわかった 。

実施例１２ ストレブ　ビジンリポソーム　八　〇　内ター　ツーイングｐＨ７，５、最終脂 質濃度２．５　ｍＭで、上述のようにして、カルボキシフルオレスセイン（１５ ｍＭ）を取り込んだリポソームをチオール化ストレプトアビジンに結合させた。

Ｎ−エチルマレイミド（ストレプトアビジンに対して５００モル比）でカップリ ング反応をクエンチした。４時間後、セファロースＣＬ−４Ｂでのゲル排除によ り、ストレプトアビジンリポソーム複合体を単離し、上述のようにして、リポソ ーム結合ストレプトアビジンのレベルをめた。

ターゲツティング実験のために、ヒトの血液をＥＤＴＡ　（ＰＢＳ中２５ｍＭ） 中に集めた。フィコールバーク（Ｆｉｃｏｌｌ　ｐａｑｕｅ）を用いる標準プロ トコルにより、ヒト末梢血白血球を単離しくＢ。

ｙｕｍ、５ｃａｎｄ、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　２１．５ｕ ｐｐ、　９７．９　（１９６８）参照）、結合の検討を行う前に、２％ＢＳＡ及 び０．０１％アジ化Ｎａを含むＰＢＳ中に４℃で懸濁させた。細胞（１０６）を 丸底マイグロタイターウエルに分注し、洗浄して、ＰＢＳ中にて、４℃で１時間 、抗体（Ｔ１１及びＢ１、それぞれ１００ｕｌＰＢＳ中５及び１０ｕｇ）と共に あるいは単独でインキュベートした。

ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をストレプトアビジンリポソーム複合体（２００ ｕｌＰＢＳ中Ｑ、２ｕｍｏｌ）と共に、４℃で更に１時間インキュベートした。

次いで、この細胞をＰＢＳで３回洗浄し、以下に述べる方法に従って、フローサ イトメトリーにより分析した。

簡単に説明すると、細胞結合蛍光を、ＥＰＩＣＳプロファイルアナライザーで測 定した。アルゴンイオンレーザ−の４８８ｎｍ線で細胞を照射した。５１５〜５ ３０ｎｍ帯域通過フィルターの後で、蛍光を測定した。直角対前方光散乱細胞所 見（ｒｉｇｈｔ　ａｎｇｌｅ　ｖｅｒｓｕｓ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｌｉｇｈｔ　５ ｃａｔｔｅｒ　ｃｙｔｏｇｒａｍ）に基づいて、蛍光信号をゲート制御し、分析 を単一細胞から信号へ限定した。増幅器をログエリアモード（ｌｏｇ　ａｒｅａ 　ｍｏｄｅ）にセットした。ヒストグラムの統計的解析のために、対照サンプル のヒストグラムの右肩の基部において、より低いチャンネルで、領域ｌを任意に セットした（最小２，０７５、最大１０２３）。

図６に示すように、リポソームストレプトアビジン複合体（カプセル化されたカ ルボキシフルオレスセインを含む）を、末梢Ｂ細胞（Ｂ１）に特異的なビオチン 化モノクローナル抗体で前もって標識した細胞とインキュベートすることにより 、全リンパ球個体群の約２０％が、フルオレスセインで標識された（図６Ｂ）。

比較のために、ビオチン化抗Ｔ細胞抗体（Ｔｌｌ）で同様な検討を行うと、リン パ球の約９０％が標識された（図６Ｃ）。これらの結果は、Ｔ　ｌ　１　［Ｈｏ ｗａｒｄ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２６．２１１７　（１９８１）参照］ 及びＢ　ｌ　［５ｔａｓｈｅｎｋｏ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２５．１６７ ８　（１９８０）参照］により規定される抗原の予測される細胞分布と一致する 。

これらの複合体の特異性は、ビオチン化抗体が存在しないとき、リンパ球に対す るストレプトアビジンリポソーム複合体のバックグラウンド結合が無視できるこ とにより示される（図６Ａ）。

実施例１３ 卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノー ルアミン（ＤＰＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ　（Ｂｉｒ ｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ、　ＵＳＡ）から入手した。ビオチン−ホスファチジル エタノールアミン（ビオチン−ＰＥ）、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２〜ピリ ジルジチオ）プロピオネ−１−（ＳＰＩ）Ｐ）、Ｎ−スクシンイミジル　４−（ ｐ−マレ、イミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）は、）ｉｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｏｒｅｇｏｎ、　ＵＳＡから入手した。ストレプトアビジン 、ＦＩＴＣ−セライト、Ｎ〜エチルマレイミド、ジチオスレイトル、コレステロ ール、Ｂ−メルカプトエタノール、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン− Ｎ’　−３−プロパンスルホ〉′酸（ＥＰＰＳ）、２−　（Ｎ−モルホリノ）− ・エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−とドロキジエチルピペラジン−Ｎ′− ２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及びセファデックスＧ５０は、Ｓｉｇｍａ 、　ＵＳＡから入手した。抗ヒト赤血球１ｇＧは、Ｃａｐｐｅｌ、　Ｉｎｃ、　 ＵＳＡから購入し、セファロースＣＬ−４Ｂは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｃａｎ ａｄａから入手した。　１４Ｃコレステロール及び３王４コレステロール−ヘキ サデシル−エーテルｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ，　ＵＳＡから入手した。３Ｈ 及び１４Ｃビオチンは、Ａｍｅｒｓｈａｍ，　Ｃａｎａｄａから入手した。体重 が平均２１ｇのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｃａ ｌｉｆｏｒｎｉａ，　ＵＳＡから入手した。

Ｎ−　（４−　（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル）ジパルミトイルホスファ チジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＤＰＰＥ）の合成ＭＰＢ−ＤＰＰＥを、Ｍａ ｒｔｉｎ等、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，　２５７，　２８６−２８８　（＋９ ８２）の方法を改変したもので合成した。簡単に説明すると、完全なＭＰＢ−Ｄ ＰＰＥの合成は、クロロホルム中１当量のトリエチルアミンの存在下で、１．５ 　ＳＭＰＢ：ＤＰＰＥのモル比にて行われた。３時間後、反応混合物を窒素下で 蒸発乾固した。予備薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、アセトンの５０％クロロ ホルム溶液で展開されたシリカゲル）により、過剰の未反応ＳＭＰＢ及び主な副 生成物を除去した。メタノールの約２０〜３０％クロロホルム溶液（Ｖ：Ｖ）で 、脂質バンドの上部をシリカから抽出し、その結果、ＩＨＮＭＲで確認されたよ うに、純粋な完全ＭＰＢ−ＤＰＰＥが単離された。

実施例１４ 一去嵐ツニ１８先１に １（ｏｐｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ，　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．　８１２．　５ ５　（１９８５）により記載されたようにして、大挙ラメラ小胞（ＬＵＶ）を調 製した。簡単に説明すると、クロロホルム中の脂質混合物の一定量をチューブに 入れ、窒素気流下で乾燥して脂質フィルムとし、次いで、２時間高真空にした。

次いで、２５ｍＭＭＥＳ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１　５０ｍＭＮａＣ　１．ｐＨ ６．５中で、脂質を水和し、２枚重ねのｌｏｏｎｍ又は５０ｎｍフィルターから １０回押し出した。カップリング実験の前に、サンプルを、ＮａＯＨでｐＨ７。

５に滴定した。Ｃ．Ｆｉｓｋｅ及びＹ，　Ｓｕｂｂａｒｏｔｕ，　Ｊ．　Ｂｉｏ ｌ，　Ｃｈｅｍ．　６６。

３７５　（１９２５）の比色測定法又は脂質混合物内に微量の１４Ｃコレステロ ール若しくは３Ｆ（コレステロール−ヘキサデシルエーテルを取り込むことのど ちらかにより、脂質を測定した。サンプルは、ＰａｃｋａｒｄＴｒｉ　Ｃａｒｂ 液体又はＢｅｃｋｍａｎ　Ｌ　Ｓ　３　８　０　１型シンチレーシヨンアナライ ザーでのシンチレーション計数により測定された。

実施例１５ カップリング　の　ｆ ストレプトアビジン（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣ１、ｐＨ７．５ 、ＨＢＳ、中１０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｃａｒｌｓｓｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ ．　１７３，　７２３　（１９７８）の方法にしたがって、アミン反応性試薬、 ＳＰＤＰ、で変性した。簡単に述べると、ＳＰＤＰ　（メタノール中２５ｍＭ） を、室温で３０分間、ストレプトアビジンに対して１０モル比でインキュベート した。変性の程度を測定するために、反応混合物の一部を、ＨＢＳで平衡化した セファデックスＧ−５０に通して、未反応ＳＰＤＰを除去した。ジチオスレイト ル（ＤＴＴ）添加前に、２８０ｎｍ［２８０ｎｍにおける吸光率（Ｅ２８０　： 　２７７０）］における蛋白質の濃度を、そしてＤＴＴ（２５ｍＭ）の添加１０ 分後に、３４３ｎｍ　（Ｅ３４３　ニア５５０）における２−チオピリドンの濃 度を測定することにより、ストレプトアビジンの変性の程度をめた。反応混合物 の残部をＤＴＴで還元しく２５ｍＭ、１０分）、チオール化生成物を、２　５ｍ Ｍ　ＭＥＳ，２　５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，］、５５０ｍＭＮａＣ　ｌ、ｐＨ７．５ 、で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、ゲル排除により単離した。生成物 は、直ちにカップリング実験に使用した。

ＩｇＧ（ＨＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌ）の場合は、蛋白質をＳ　Ｐ　Ｉ）Ｐで変性後 、その蛋白質をＦＩＴＣ−セライトで蛍光ｍｍした（１　５０ｍＭ　ＮａＣｌ， 　０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８、中ＩｇＧ５０％重量、２０分）。蛋白 質をＤＴＴで処理する前に、酢酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣ１、１００ｍＭ酢酸 ナトリウム、ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−５０にて、未反応試 薬からサンプルを分離し、その分子の固有のジスルフィドの還元から保護した。

カップリング実験の前に、アクアサイド（ａｑｕａｃｉｄｅ）で脱水することに より、サンプルを５　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌに濃縮した。ストレプトアビジンの変 性の程度は、蛋白質当り約５〜６ＳＰＤＰ分子であり、一方、抗体試料の変性は 、蛋白質当り５ＰＤＰ２〜３分子となった。

実施例１６ １ボソームへの　の　Ａ 還元されたＰＤＰ変性蛋白質を、ｐＨ７，５，１００回ｇ蛋白質／　ｕ　ｍ　ｏ 　１脂質（５ｍＭ−３０ｍＭ最終濃度）の割合で、リポソーム（５４％ＥＰＣ， ４５％コレステロール、１％ＭＰＢ−ＰＥ、５０又は１１００ｎの細孔のフィル ターを通してサイズを揃えた）とインキュベートすることにより、リポソームへ の蛋白質のカップリングを実施した。Ｎ−エチルマレイミド（蛋白質に対して５ ００モル比、メタノール中）の添加により、種々の時間において反応をクエンチ した。生体内実験のために、反応混合物をＮ−エチルマレイミドと２時間インキ ュベートした後、Ｂ−メルカプトエタノール（Ｎ−エチルマレイミドに関して１ ０モル比）で更にサンプルをクエンチした。ＨＢＳで平衡化したセファロースＣ Ｌ−４Ｂでのゲル濾過により、未結合蛋白質を除去した。リポソームへのストレ プトアビジンのカップリング量は、ストレプトアビジンへの３Ｈ又は１４Ｃビオ チンの結合により測定された。

簡単に述べると、ストレプトアビジン−リポソーム（０，５ｍｌ中０．２５ｕｍ ｏｌ脂質）を、３Ｈ又は１４Ｃビオチン（２５ｕ１中３．８５ｎｍｏｌ、１５． ４ｕｍｏ　ｌ／ｕＣｉ）で１０分間インキュベートし、ＨＢＳで平衡化したセフ ァロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により、未結合ビオチンを除去した。セファデ ックスＧ−５０でのゲル排除後のストレプトアビジン標準（１００ｕｇ）へのビ オチンの結合の量を、カップリング率を計算するための参考として用いた。リポ ソームに結合した抗体（ＩｇＧ）の量を測定するために、サンプル（２００ｕｌ ）をエタノール（１，８ｍ１）に溶解し、リポソーム結合蛍光を既知量のフルオ レセイン標識抗体と関連づけた。４９５ｎｍの励起波長を有する５ＬＣ−５００ Ｃ蛍光分光光度計を用いて、５２０ｎｍにおいて蛍光をモニターした。

実施例１７ ム　たス　レプ　ビジンの リポソームへのストレプトアビジンの非共有結合の前に、ＩｇＧについて上に述 べたように、ストレプトアビジンをＦ　Ｉ　ＴＣ−セライトで蛍光標識した。ス トレプトアビジン（４，１ｍｇ）を、１０分間、２０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝生理食 塩水（ｐＨ８）中のビオチン−ＰＨに対して１０モル過剰で、約３０分間、リポ ソーム（５４，７５％ＥＰＣ，４５％コレステロール、０．２５％ビオチン−Ｐ Ｅ）とインキュベートした。　Ｌｏｕｇｈｅｒｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、Ａｃｔａ、　９０１．１５７　（１９８７）参照０種々の時間に、一部 をセファロースＣＬ−４Ｂカラム（５ｍ　ｌ　）で分別して、リポソームに結合 したストレプトアビジンを遊離のストレプトアビジンから分離した。ＩｇＧにつ いて述べたように（上記実施例１６）、セファロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過後 、結合ストレプトアビジンの量をめた。

実施例１８ された　−リポソームサンプルの　と 蛋白質−リポソーム複合体（５ｍＭ又は２０ｍＭ最終脂質濃度）を、２枚重ねの ミリポアフィルタ−（１００ｎｍ又は５０ｎｍ）から１０回押し出した。押し出 されたサンプルの一部のシンチレーション計数により、脂質回収率を測定した。

押出前後の蛋白質結合小胞のサイズを、フリーズフラクチャー技術並びに６３２ ゜８ｎｍ及び５ｍＷで働＜　Ｎｉｃｏｍｐ　Ｍｏｄｅｌ　２７０サブミクロパ゛ −ティクルサイズ（ｓｕｂｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　５ｉｚｅ）　を用いる 準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）により測定した。

実施例１９ １ボソーム　の　の　・ 生体内の検討のために、実施例１３〜１８に記載のようにして、最終脂質濃度３ ０ｍＭ、インキュベーション時間１５分で、ストレプトアビジン−リポソーム複 合体を調製した。　Ｌ、Ｈｕａｎｇ、′リポソーム”、　Ｍａｒｋ　Ｊ、　０ｓ ｔｒｏ編、８７〜１２４頁、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ発行、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、１９８３年、及び５ｔｅｉｎ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、ＩＩ。

１０４　（＋９８０）、比活性：０．２３ｕＣｉ／ｍｇ脂質、に記載の方法によ り、非代謝性、非交換性脂質マーカー、３Ｈコレステロール−ヘキサデシル−エ ーテルを用いて、リポソームの脂質の量を測定した。シンチレーション計数のた めに、５ｍｌのＰｉｃｏＯＦ１ｕｏｒ４０　（Ｐａｃｋａｒｄ、　Ｃａｎａｄａ ）シンチレーションカクテルに５０〜１００ｕｌの血漿を加え、Ｂｅｃｋｍａｎ 　Ｌ　Ｓ　３８０１型シンチレーシヨンカウンターでサンプルを計数した。未結 合ストレプトアビジンを、セファロースＣＬ−４Ｂでのゲル排除により除去した 。注射直前に、サンプルの一部を、２枚重ねの１１００ｎ又は５０ｎｍフィルタ ーから１ｏ回押し出した。対照として、ＭＰｌＢ−ＰＥ　（５４％ＥＰＣ１４５ ％コレステロール、１％ＭＰＢ−ＰＥ）を含むリポソームを、ｐＨ６，５で、上 述のようにして調製した。脂質サンプルの一部を、ＮａＯＨでｐＨ７，５に滴定 し、Ｂ−メルカプトエタノール（Ｍ　Ｐ　Ｂ　−Ｐ　Ｅに対して１０モル過剰） でクエンチし、ＨＢＳで平衡化したセファデックスＧ−５０にてゲル濾過により 、遊離のＢ−メルカプトエタノールを除去した。生体内実験の前に、ＨＢＳで平 衡化したセファデックスＧ−５０にて、クエンチされていないＭＰＢ−ＰＥリポ ソームを交換した。ＨＢＳ中で、５５％ＥＰＣ及び４５％コレステロールを含む リポソームを調製した。

生体内血漿脂質水準を測定するために、マウス（１時点当り４〜８匹）に、尾静 脈から、全脂質１００ｍｇ／ｋｇの投与量でサンプルを注射した。血液をＥＤＴ Ａ処理ミクロコンテナー（ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｉｎｅｒ）　（Ｂｅｃｔｉｎ　 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ ｙ）内に集め、全血液を臨床遠心分離器で１０分間遠心分離する（２００Ｘｇ） ことにより、血漿を調製した。動物１匹当りの全血漿容積を、平均体重の４．５ ５％とした。既知量のリポソームを含む対照血液サンプルから、リポソームの脂 質のわずかな両分がペレット化血液細胞と結合するだけであることがわかった。

全血液又は血漿からめると、リポソームの回収率は同様であった。生体内でリポ ソームと結合したストレプトアビジンの水準を、注射後１時間及び４時間目に単 離された血漿サンプルに対する１４Ｃビオチンの結合により測定した。

実施例２０ 小　サ　ズ・の　ムの リポソーム（５４％ＥＰＣ，４５％ＣＨＯＬ、１％ＭＰＢ−ＰＥ、５ｍＭ最終脂 質濃度、１０１００ｎを、ｐＨ７，５で時間をかけて、上述のようにしてストレ プトアビジン（１００ｕｇ蛋白質／　ｕ　ｍ　ｏ　ｌ脂質）とインキュベートし た。図１に示すように、５分から１２時間までの範囲の種々の時間において、Ｎ −エチルマレイミド（蛋白質に対して５００モル比）を加えて反応をクエンチし 、セファロースＣＬ−４Ｂでのゲル濾過により遊離のストレプトアビジンを除去 した。結合したストレプトアビジンの量を３　Ｈビオチン結合によりめ（図１の グラフＡに示す）、小胞サイズをＱ　Ｅ　Ｌ　Ｓにより測定した（図１のグラフ Ｂに示す）。図１に示すように、リボノ・−ムに結合した蛋白質の量が増えると 、ＱＥ　Ｌ　Ｓにより記録された場合の小胞サイズが著しく大きくなる。

小胞に対するストレプトアビジンの最初の急速なカップリングは、試料のサイズ 分布が急速に大きくなることと関連する。この結果を確認するために５より大き いシステムの形態を調べるフリーズフラグチャー技術を用いて、同一カッブリン グ系の一部を測定した。図２に示した結果から、ＱＥＬＳにより測定された場合 のサイズの増加が小胞の凝集と関係していることが、明らかにわかる。

しかし、長時間のインキュベーション後は、著しい数の、サイズの大きい小胞（ ＞２００ｎｍ）が認められ、凝集に続き融合が起こったことによるものと思われ る。

実施例２１ 山、ｔ？　ｓ、辷二１辷鷹ム　の　に　ぼ　丑冒グ１１１小さくて、均一なサイ ズの蛋白質−リポソーム複合体を達成しようとする試みにおいて、凝集した複合 小胞を１１００ｎの細孔サイズを有するフィルターから押し出すことの影響を、 上で調製したストレプトアビジン（図３）又は抗体（図４）の結合したリポソー ムについて調べた。カップリング反応混合物を、種々の時間においてＮ−エチル マレイミドでクエンチし、押出の前及び後の複合サンプルのサイズをＱＥＬＳに より測定した（［１１３Ｂ及び４Ｂ）。複合サンプルの押出後、結合蛋白質の量 を測定した（図３Ａ及び４Ａ）。リポソームに結合した蛋白質の量にかかわりな く、ストレプトアビジン又は抗体と結合した小胞は、容易に押し出され、得られ た試料は、狭いサイズ範囲内に入る。例えば、ストレプトアビジンの結合したリ ポソーム（２５〜６０　ｕ　ｇ　／　ｕ　ｍｏ１脂質）を押し出すと、１５０か ら５００ｎｍを越えるまでの元のサイズ分布に比較して、直径がｉ２０〜１４０ ｎｍの小胞サイズとなった。

同様に、抗体リポソーム複合体（１５〜３５ｕｇ蛋白賀／　ｕ　ｍ０１脂質）を 押し出すと、押出前の１３０〜２３０ｎｍのサイズ範囲と比較して、狭いサイズ 分布（９０〜１１０ｎｍ）のより小さい小胞となった。両種の蛋白質結合小胞に ついて、押出工程中の脂質の損失が最小であったということ（８５〜９０％の回 収率）に注目するのは、重要である。これらの結果から、高濃度の複合蛋白質を 有する小胞の高度に凝集した試料を有効に押し出すことができ、得られた試料が 同様のサイズであることがわかる。

更に、蛋白質−リポソーム凝集体の押出は、サイズの揃った蛋白質複合小胞を調 製する穏やかな方法を意味する。このことは。

押出後、ビオチンを結合するストレプトアビジン−リポソーム複合体が維持され ていることにより説明された（結果は示さず）。

リポソームへの蛋白質カップリング中に、リポソーム複合体が凝集することが認 められることは、リポソームへの蛋白質の共有結合に特異的なものではない。小 胞凝集は、ビオチン−ＰＥ含有リポソームへのストレプトアビジンの非共有結合 中にも起こる［Ｌｏｕｇｈｅｒｙ等、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　 Ａｃｔａ、　９０１．１５７　（１９８７）参照〕。蛋白質−リポソーム複合体 のサイズの揃った個体群を生成する手段として、押出法の一般的適用を示すため に、ＭＰＢ−ＰＥを含むリポソームに共有結合した、又はビオチン−ＰＥを含む ２ノボソームに非共有結合したストレプトアビジンの押出の影響を、フリーズフ ラクチャーにより調べた（図５）。両種のストレプトアビジンリポソーム複合体 は、押出前は、高度に凝集していることが認められた。押出後、結合小胞は、最 大凝集体が４つの小胞の集塊であると認められる状態で、ダイマーのモノマーと して存在した。非共有結合法の場合（図５０及び５Ｄ）は、結合小胞の押出中に 、脂質の著しい損失が生じた（５０％）。

実施例２２ し　されたリポソームの サイズに関する、共有結合したストレプトアビジンを含む押し出されたサンプル の安定性を図６に示す。ＱＥＬＳ測定から、押出後、試料のサイズが、最初の小 さい（３０ｎ’ｍ）急激な上昇を示すことがわかる。これは、フリーズフラクチ ャーにより示されるように（結果は示さず）、押し出された小胞の凝集が増大し たことによりもたらされた。下記表５に示すように、種々のストレプトアビジン −リポソーム複合体の押出８時間後に認められる再凝集の水準が、押出前のサン プルの凝集状態と比較したとき、最小であった。前のインキュベーションにより Ｂ−メルカプトエタノールでクエンチされたチオール化ストレプトアビジンと共 に、Ｍ　Ｐ　Ｂ　−Ｉ）　Ｅを押し出したとき、リポソームの再凝集は認められ なかった（下記表５）。このことは、再凝集がリポソームとの蛋白質の非特異的 結合によるものではなかったことを示している。

負に帯電した脂質、例えばホスファチジルセリン、の取り込み、又は低若しくは 高イオン強度緩衝液の存在は、再凝集を防ぐものではないことがわかった（デー タは示さず）、小胞に結合したストレプトアビジンの量が減少すると（下記表５ ）、押出８時間後の再凝集の量が対応して減少する。押し出されたサンプルの脂 質　。

濃度を変更しても、再凝集に著しい影響はなっかった。押出直後に凍結されたリ ポソームに結合したストレプトアビジンは、解凍に際しても、それらの元のサイ ズ分布を維持した。最後に、押し出されたサンプルを４℃で貯蔵すると、リポソ ームサイズの安定性が高くなった。

表５ 押し出されたストレプトアビジン−リポソームの凝集に影響を及ｕｇストレプ　 脂質 トアビジン／　濃度　押出後 ３１．６ａ　２．５　２３２　１１９　１４０４５．３ａ　２．５　２８６　１ ２３　１５４４５、ｌｂ　５，０　４０３　１７４　１９７４５、ｌｂ　１５， ０　４０３　１７４　１９７ａカップリング混合物（最終濃度２０ｍＭ）を種々 の時間においてＮ−エチルマレイミドでクエンチすることにより、結合ストレプ トアビジンの水準が興なるリポソームサンプル（５４％ＥＰＣ１４５％ＣＨＯＬ 、１％ＭＰＨ−ＤＰＰＥ）を調製した。

ｂ３０ｍＭの最終脂質濃度及び１５分のインキュベーション時間で、ストレプト アビジン−リポソームを調製した。

ｃＮ−エチルマレイミドでクエンチされたストレプトアビジン（５０ｕ　ｇ）を 、１％ＭＰＢ−ＤＰＰＥを含むリポソーム（ｌｕｍｏｌ、２．５ｍＭ最終脂質濃 度）と押し出した。

ｄ　ＱＥＬ測定前に、押し出されたサンプルを氷上に３時間保持した。

ｅ押し出されたサンプルを、押出直後に凍結し、ＱＥＬ測定直前に解凍した。

実施例２３ −ｉボソーム　Ａ　の血　Ｘゞの これまでの研究から、小さいリポソームに比較して、大きいリポソームは、急速 に血液循環から除去されることがわかっている［Ａ、　Ｃ，Ｈｕｎｔ、　Ｂｉｏ ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、７１９．４５０　（１９８２）及び５ ｏｔａ等、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、　３４．４２４４　（１９８６ ）参照］。生体内の標的化系について認められた急速な排出［Ｗｏｌｆｆ等、Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　８０２．２５９　（１９８４） 及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等、“Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ”Ｒ，Ｌ、Ｊｕｌｉａ ｎＯ編、５０７．４０３５　（１９８８）参照］は、一部はリポソームの凝集に よるものとすることができるかもしれない。従って、この仮説をテストするため に、マウス中のある対照リポソーム製剤（ｅ７Ａ）及び凝集し、押し出されたス トレプトアビジン−リポソーム複合体（図７Ｂ）の血液からの排出に要する時間 をを調べた。凝集したストレプトアビジン−リポソーム（Ｑ　Ｅ　Ｌ　Ｓで示さ れた直径が５３０ｎｍ）は、循環から急速に排出され、注射がも４時間後には、 最初の脂質投与量のわずか３％が循環内に残っただけであったにれらの蛋白質− 小胞複合体を５０又は１１００ｎポリカーボネートフイルターから押し出すと、 それぞれ１３９及び１８７ｎｍのサイズ分布を有する製剤となった。これら２つ の製剤は、生体内血液循環時間が長くなり、４時間後に、最初の投与量の４８及 び３２％が循環内に残っていた。１２５ｎｍサイズのＥＰＣ／ＣＨＯＬ小胞と比 較して、同様のサイズ（１３９ｎｍ）のリポソームに共有結合した蛋白質が存在 することにより、循環からのリポソームの排出が促進された（８０及び４８％の Ｅ　Ｐ　Ｃ／ＣＨＯＬ小胞が４時間後衛環内に残ったのに対し、４８及び３２％ の蛋白質−リポソーム複合体が残った）。直径Ｌ９７ｎｍのＥＰＣ／ＣＨＯＬ製 剤と比較して、ＭＰＢ−ＰＥリポソーム（正常のもの、又はＢ−メルカプトエタ ノールでクエンチ、直径１７０ｎｍ）の循環には、顕著な差は認められなかった 。

ここに示すように、結合リポソームの凝集の量は、複合製剤の血液排出挙動を著 しく変える。示されているように、凝集したストレプトアビジン−リポソーム（ 直径＞５３０ｎｍ）は、循環から急速に除去された（４時間後、く３％残存）、 これに比べて、押し出された複合体については、循環時間が長くなった。即ち、 直径１８７ｎｍ及び１３９ｎｍのサンプルについて、注射後４時間で、それぞれ 最初の脂質投与量の３２及び４８％が循環内に残った。小さい蛋白質−リポソー ム複合体では、循環時間が長くなることから、製剤の凝集が、生体内の複合体の 寿命を決定する大きな因子であることがわかる。しかし、蛋白質−リポソーム複 合体の血液からの排出は、同様のサイズの対照サンプルについてよりも常に大き く、リポソームに蛋白質が存在することが、循環からのリポソーム排出の促進に ある程度寄与することを示している点に注目すべきである。ＥＰＣ／ＣＨＯＬリ ポソームと比較すると、リポソームにチオール反応性カップリング脂質ＭＰＢ− ＰＥが存在することが、それらの生体内における排出挙動に著しい影響を与える ことはなく、チオール含有血清蛋白質の結合が、リポソームの生体内性質に影響 を及ぼさないことを示唆している。

実施例２４ 生体内共有結合複合リポソームの安定性生体内共有結合複合ストレプトアビジン −リポソームの安定性を、注射後１時間及び４時間して血漿から単離されたリポ ソームサンプルへのビオチンの結合により示した（下記表６）。血漿から単離さ れたサンプルについて、ストレプトアビジン結合リポソームのビオチン結合能の わずかな低下が認められ、これは、血清成分の小胞への吸収、蛋白質分解による ストレプトアビジンの不活性化又は製剤への内因性ビオチンの結合から生じたの かも知れない。

表６ 生体内ストレプトアビジン−リポソーム複合体の安定性ｕｇストレプトアビジン ／ｕｍｏｌ脂質におけるストレプトアビ投与前　投与後 １時間　４時間 凝集 （＞５３０　ｎｍ）　４２．９　＋　０．１　４３．１　＋　０．８　２９．８ 　＋　０．８押出 （１８７ｎｍ）　、　４１．１　＋　２．８　３５．４　＋　Ｏ０２３２，９＋ 　０．３押出 （１３９ｎｍ）　４７．１　＋　０．５　４４．５　＋　１．４　３９．１　＋ 　０．６リポソームに結合したストレプトアビジンの量を、脂質サンプル又は注 射後１時間及び４時間して３匹のマウスがらプールした血漿サンプルへの１４Ｃ ビオチンの結合により測定した。

前記説明及び実施例は、本発明を実施することを説明するもので、決して限定す るものでないことは、当業客により理解されるであろう。ここに示した詳細は、 本発明の精神と範囲から逸脱せずに変更することができる。

ｒｇＪ２ マレイミド反応性％（０−０） ストレプトアビジンμｇ／ 脂質μモル （争−舎） ＦＬＩ 図７ 時間（ｈｒｓ、） ストレプトアビジンμｇ／脂質μモル（・−・）結合抗体μｇ／脂質μモル 時間（ｈｒｓ、） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分を含む架橋剤と の反応生成物を含む実質的に純粋な反応性脂質であり、該反応性脂質が実質的に 開環架橋剤を含まないことを特徴とする実質的に純粋な反応性脂質。 ２．請求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲１の反応性 脂質。 ３．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリスト イルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノー ルアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲２の反応性脂 質。 ４．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフエニル）プチリル］ＭＰＢ基を含 む請求の範囲１の脂質。 ５．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレー ト（ＳＭＰＢ）である請求の範囲４の脂質。 ６．求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−スク シンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレート（ＳＭＰＢ）との反応 生成物を含む請求の範囲１の脂質。 ７．該反応生成物が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又はＭ ＰＢ−ＥＰＥである請求の範囲１の反応性脂質。 ８．治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有効な量 の反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形成脂質とを 含む、複合リポソームを形成するのに使用する反応性リポソーム。 ９．該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部分 を台む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含ま ない請求の範囲８の反応性リボソーム。 １０．請求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲９の反応 性リポソーム。 １１．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリス トイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジルエタノールアミン である請求の範囲１０の反応性リポソーム。 １２．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチリル］ＭＰＢ基を 含む請求の範囲９の反応性リポソーム。 １３．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレ ート（ＳＭＰＢ）である請求の範囲１０の反応性リポソーム。 １４．請反応性脂質が求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノール アミンとＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレート（Ｓ ＭＰＢ）との反応生成物を含む請求の範囲１０の反応性リポソーム。 １５．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又は ＭＰＢ−ＥＰＥである請求の範囲１４の反応性リポソーム。 １６．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセン ト、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる請求の範 囲８の反応性リポソーム。 １７．ａ）治療及び診断の標的化に有効な多数の複合分子を結合する有効量の実 質的に純粋な反応性脂質と、リポソームを形成するのに有効な量のリポソーム形 成脂質とを含む反応性リボソームと、 ｂ）治療及び診断の標的化に有効な量の、該反応性リポソームに結合した複合分 子 との反応生成物を含む複合リポソーム。 １８．該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部 分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含 まない請求の範囲１７の複合リポソーム。 １９．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲１８の複 合リポソーム。 ２０．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリス トイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノ ールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジル エタノールアミンである請求の範囲１９の複合リポソーム。 ２１．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチリル］ＭＰＢ基を 含む請求の範囲１８の複合リポソーム。 ２２．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレ ート（ＳＭＰＢ）である請求の範囲２１の複合リポソーム。 ２３．該反応性脂質が求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノール アミンとＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレート（Ｓ ＭＰＢ）との反応生成物を含む請求の範囲１７の複合リポソーム。 ２４．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又は ＭＰＢ−ＥＰＥである請求の範囲２３の複合リポソーム。 ２５．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセン ト、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる請求の範 囲１７の複合リポソーム。 ２６．該複合分子が蛋白質、抗体又は補因子から選ばれる請求の範囲１７の複合 リポソーム。 ２７．該複合分子がストレプトアビジンである請求の範囲２６の複合リポソーム 。 ２８．該抗体がＩｇＧ、ＩｇＥ及びモノクローナル抗体から選ばれる請求の範囲 ２６の複合リポソーム。 ２９．該補因子がビオチンである請求の範囲２６の複合リボソーム。 ３０．該複因子に非共有結合した蛋白質を更に含む請求の範囲２６の複合リポソ ーム。 ３１．該ビオチンに非共有結合したストレプトアビジンを更に含む請求の範囲２ ９の複合リポソーム。 ３２．該複合リポソームが生物活性剤を含む請求の範囲１７の複合リポソーム。 ３３．該複合リポソームが膜内外電位差を有する請求の範囲１７の複合リポソー ム。 ３４．該複合リポソームが生物活性剤を含む請求の範囲３３の複合リポソーム。 ３５．脱水されている請求の範囲１７の複合リポソーム。 ３６．脱水されている請求の範囲３４の複合リポソーム。 ３７．生物活性剤を含む請求の範囲２７の複合リポソーム。 ３８．生物活性剤を含む請求の範囲２８の複合リポソーム。 ３９．該複合分子が蛋白質であり、該複合リポソームが凝集の存在しないことを 示す安定でサイズの揃ったリポソームである請求の範囲２６の複合リポソーム。 ４０．請求の範囲３２の複合リポソーム及び薬理学的に許容できる担体又は希釈 剤を含む医薬組成物。 ４１．該生物活性剤が抗腫瘍剤である請求の範囲４０の組成物。 ４２．該抗腫瘍剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンプラスチン、ビン クリスチン、シスプラチニウム、シクロホスフアミド並びに薬理学的に許容でき る塩、誘導体及びそれらの混合物カらなる群より選ばれる請求の範囲４１の組成 物。 ４３．ａ）少なくとも一つの非求核溶剤の存在下、かつ求核溶剤の不存在下で、 求核脂質を反応性脂質に完全に変換するのに十分な時間、求核リポソーム形成脂 質をマレイミド含有架橋剤と反応させて、反応性脂質溶液を作り、 ｂ）真空中で該溶液を濃縮することにより該溶液から該反応性脂質を分離して、 固体残渣を生成し、該固体残渣を溶剤で粉末化して、実質的に純粋な反応性脂質 を製造することからなる実質的に純粋な反応性脂質を合成する方法。 ４４．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲４３の方 法。 ４５．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリス トイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノ ールアミン、ジオレイルホスフアチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジル エタノールアミンである請求の範囲４４の方法。 ４６．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチリル］ＭＰＢ基を 含む請求の範囲４３の方法。 ４７．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレ ート（ＳＭＰＢ）である請求の範囲４６の方法。 ４８．求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−ス クシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレート（ＳＭＰＢ）との反 応生成物を含む請求の範囲４３の方法。 ４９．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又は ＭＰＢ−ＥＰＥである請求の範囲４８の方法。 ５０．該反応工程（１）の後に、該反応溶液を該非求核溶剤で希釈し、次いで少 なくとも１回洗浄して、副生成物を除去する抽出工程を更に含む請求の範囲４３ の方法。 ５１．該非求核溶剤が、クロロホルム、塩化メチレン、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＳ Ｏ、ＴＨＦ及び１、４−ジオキサンからなる群より選ばれる請求の範囲４３の方 法。 ５２．ａ）治療及び診断の標的化に有効な十分な数の複合分子を結合するのに有 効な量の実質的に純粋な反応性脂質と、リボソームを形成するのに有効な量のリ ポソーム形成脂質とを含む反応性リポソームを形成し、 ｂ）該反応性リポソームを複合分子と、該複合分子を該反応性脂質と結合させる のに十分な時間、反応させることからなる複合リポソームを形成する方法。 ５３．該反応性脂質が求核リポソーム形成脂質と少なくとも一つのマレイミド部 分を含む架橋剤との反応生成物であり、該反応性脂質が実質的に開環架橋剤を含 まない請求の範囲５２の方法。 ５４．該求核脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲５３の方 法。 ５５．該求核脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリス トイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノ ールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン又は卵ホスファチジル エタノールアミンである請求の範囲５４の方法。 ５６．該架橋剤がＮ−［４−（ｐ−マレイミドフエニル）プチリル］ＭＰＢ基を 含む請求の範囲５３の方法。 ５７．該架橋剤がＮ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレ ート（ＳＭＰＢ）である請求の範囲５６の方法。 ５８．求核アルコールの不存在下でのホスファチジルエタノールアミンとＮ−ス クシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレート（ＳＭＰＢ）との反 応生成物を含む請求の範囲５２の方法。 ５９．該反応性脂質が実質的に純粋なＭＰＢ−ＤＰＰＥ、ＭＰＢ−ＤＭＰＥ又は ＭＰＢ−ＥＰＥである請求の範囲５８の方法。 ６０．該反応性脂質が該反応性リポソームの少なくとも約０．０５モルパーセン ト、該リポソーム形成脂質が約９９．９５モルパーセント以下からなる請求の範 囲５２の方法。 ６１．該反応工程（２）をｐＨ約７５及び室温で行う請求の範囲５２の方法。 ６２．該複合分子が蛋白質、抗体及び補因子から選ばれる請求の範囲５３の方法 。 ６３．該複合分子がストレプトアビジンである請求の範囲６２の方法。 ６４．該複合分子がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びモノクローナル抗体から選ばれ る抗体である請求の範囲６２の方法。 ６５．該補因子がビオチンである請求の範囲６２の方法。 ６６．１．ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質、 ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、及び ｃ．該機能化された脂質に、リボン−ム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子 に等しい量で結合した蛋白質を含むリポソーム小胞を含む、凝集の存在しないこ とを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム複合体。 ６７．該機能化された脂質が該複合体の的０．２５と１モルパーセントの間から なる請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体。 ６８．該蛋白質がリポソーム小胞当リ約５５〜約８０の蛋白質分子に等しい量で 結合している請求の範囲６６の蛋白質−リボソーム複合体。 ６９．該機能化された脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＤ Ｐ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノール アミンからなる群より選ばれる請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体。 ７０．該蛋白質が共有結合により該機能化された脂質に結合されている請求の範 囲６６の蛋白質−リポソーム複合体。 ７１．該共有結合がジスルフィド結合である請求の範囲７０の蛋白質−リポソー ム複合体。 ７２．該蛋白質が、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクロー ナル抗体及び酸素からなる群より選ばれる請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム 複合体。 ７３．該蛋白質がストレプトアビジンである請求の範囲７２の蛋白質−リポソー ム複合体。 ７４．ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している請求の範囲 ７３の蛋白質−リポソーム複合体。 ７５．該蛋白質が、非共有結合で該機能化された脂質に結合している請求の範囲 ６６の蛋白質−リポソーム複合体。 ７６．該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエタノールアミンである 請求の範囲７５の蛋白質−リポソーム複合体。 ７７．サイズが約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある請求の範囲６６の蛋白 質−リポソーム複合体。 ７８．該機能化された脂質がビオチンを含む請求の範囲７７の蛋白質−リポソー ム複合体。 ７９．該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエタノールアミンである 請求の範囲７９の蛋白質−リポソーム複合体。 ８０．生物活性剤を含む請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体。 ８１．該複合体が脱水されている請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体。 ８２．該複合体が膜内外電位差を有する請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複 合体。 ８３．該複合体が生物活性剤を含み、膜内外電位差を有し、脱水されている請求 の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体。 ８４．該生物活性剤が抗腫瘍剤である請求の範囲８０の蛋白質−リポソーム複合 体。 ８５．該蛋白質がＩｇＧである請求の範囲７２の蛋白質−リボソーム複合体。 ８６．該蛋白質がモノクローナル抗体である請求の範囲７２の蛋白質−リポソー ム複合体。 ８７．請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体及び薬理学的に許容できる担 体又は希釈剤を含む医薬組成物。 ８８．１）ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリポソーム生成脂質、 ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、を含むリポソーム 小胞を形成し、 ２）リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子に等しい量で該蛋白質が 結合している該機能化された脂質に、蛋白質を結合して、凝集した蛋白質リポソ ーム複合体をつくり、３）該凝集した蛋白質−リポソーム複合体を押し出すこと を含む、凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム 複合体を製造する方法。 ８９．該機能化された脂質が該複合体の約０．２５と１モルパーセントの間から なる請求の範囲８８の方法。 ９０．該蛋白質がリポソーム小胞当り約５５〜約８０の蛋白質分子に等しい量で 結合している請求の範囲８８の方法。 ９１．該機能化された脂質が、ＭＰＢ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＤ Ｐ−ホスファチジルエタノールアミン及びビオチン−ホスファチジルエタノール アミンからなる群より選ばれる請求の範囲８８の方法。 ９２．該蛋白質が共有結合により該機能化された脂質に結合されている請求の範 囲８８の方法。 ９３．該共有結合がジスルフィド結合である請求の範囲９２の方法。 ９４．該蛋白質が、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクロー ナル抗体及び酸素からなる群より選ばれる請求の範囲８８の方法。 ９５．該蛋白質がストレプトアビジンである請求の範囲９４の方法。 ９６．ストレプトアビジンが、更にビオチン化蛋白質に結合している請求の範囲 ９５の方法。 ９７．該蛋白質が、非共有結合で該機能化された脂質に結合している請求の範囲 ８８の方法。 ９８．該機能化された脂質がビオチン−ホスファチジルエタノールアミンである 請求の範囲９７の方法。 ９９．サイズが約７５ｎｍから約２００ｎｍの範囲にある請求の範囲８８の方法 。 １００．該複合体が、該押出工程（工程３）後、脱水される請求の範囲８８の方 法。 １０１．該蛋白質がＩｇＧである請求の範囲９４の方法。 １０２．該蛋白質がモノクローナル抗体である請求の範囲９４の方法。 １０３．該押出工程（工程３）が、細孔サイズが約３０ｎｍから約１１ｎｍまで の範囲にあるポリカーボネートフィルターを通して行われる請求の範囲８８の方 法。 １０４．該押出工程が、高圧下で行われる請求の範囲１０３の方法。 １０５．（ａ）生物活性剤を蛋白質−リポソーム複合体内に装填することができ る方向で、請求の範囲６６による蛋白質−リボソーム複合体内に膜内外電位差を 生成する工程、及び（ｂ）外部水性媒質内で、生物活性剤を蛋白質−リポソーム 複合体と混合する工程、 を含む、外部水性媒質で囲まれた蛋白質−リポソーム複合体に生物活性剤を装填 する方法。 １０６．該生物活性剤が抗腫瘍剤である請求の範囲１０５の方法。 １０７．該抗腫瘍剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンプラスチン並び に薬理学的に許容できる塩及びそれらの誘導体からなる群より選ばれる請求の範 囲１０６の方法。 １０８．工程（ｂ）の得られた蛋白質−リポソーム複合体を脱水して、脱水組成 物を得る追加工程を含む請求の範囲１０５の方法。 １０９．該蛋白質がストレプトアビジンである請求の範囲１０５の方法。 １１０．該蛋白質がＩｇＧである請求の範囲１０５の方法。 １１１．該蛋白質がモノクローナル抗体である請求の範囲１０５の方法。 １１２．該蛋白質−リポソーム複合体が請求の範囲８８の方法により作られる請 求の範囲１０５の方法。 １１３．（ａ）請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体を脱水して、脱水組 成物を得る工程、及び（ｂ）脱水組成物を再水和する工程、 を含む、蛋白質−リポソーム複合体を貯蔵する方法。 １１４．組成物が保護糖類の存在下で脱水される請求の範囲１１３の方法。 １１５．保護糖類が二糖類である請求の範囲１１４の方法。 １１６．該二糖類が、トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラ クトース及びデキストランからなる群より選ばれる請求の範囲１１５の方法。 １１７．該二糖類がトレハロースである請求の範囲１１５の方法。 １１８．該蛋白質−リポソーム複合体が膜内外電位差を有する請求の範囲１１３ の方法。 １１９．該蛋白質−リポソーム複合体が生物活性剤を含む請求の範囲１１３の方 法。 １２０．該生物活性剤が抗腫瘍剤である請求の範囲１１９の方法。 １２１．請求の範囲８０の蛋白質−リポソーム複合体を被験者に投与することを 含む、生物活性剤の搬送を標的化する方法。 １２２．該蛋白質がストレプトアビジンである請求の範囲１２１の方法。 １２３．該蛋白質がＩｇＧである請求の範囲１２１の方法。 １２４．該蛋白質がモノクローナル抗体である請求の範囲１２１の方法。 １２５．該生物活性剤が抗腫瘍剤であり、該被験者がヒトの患者である請求の範 囲１２１の方法。 １２６．請求の範囲６６の蛋白質−リポソーム複合体をサンプルと接触させるこ とを含む、抗体用サンプルを測定する方法。 １２７．該蛋白質がストレプトアビジンである請求の範囲１２６の方法。 １２８．該蛋白質がＩｇＧである請求の範囲１２６の方法。 １２９．該蛋白質がモノクローナル抗体である請求の範囲１２６の方法。 １３０．１．ａ．少なくとも約９０モルパーセントのリボソーム生成脂質、 ｂ．少なくとも約０．１モルパーセントの機能化された脂質、及び ｃ．該機能化された脂質に、リポソーム小胞当り約１０〜約１００の蛋白質分子 に等しい量で結合した蛋白質を含むリポソーム小胞を含む、凝集した蛋白質−リ ポソーム複合体を形成し、 ２．該凝集した蛋白質−リポソームを押し出すことを含む方法により製造された 、複合体凝集の存在しないことを示す安定でサイズの揃った蛋白質−リポソーム 複合体。