CH668554A5

CH668554A5 - Liposomen welche polypeptide mit interleukin-2-aktivitaet enthalten sowie verfahren zu ihrer herstellung.

Info

Publication number: CH668554A5
Application number: CH1415/85A
Authority: CH
Inventors: Thomas Dr Kissel; Juerg Dr Reinhardt; Henriette Dr Schrank
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1984-04-09
Filing date: 1985-04-02
Publication date: 1989-01-13
Also published as: IT8547939A0; FR2562421B1; NL8501010A; GB8508809D0; GB2157172A; DK155085A; IL74835A0; US4863740A; LU85839A1; FR2562421A1; JPH0665650B2; DE3512926A1; IT8547939A1; JPS60243022A; AU4094685A; SE8501709D0; IT1199967B; GB2157172B; SE8501709L; DK155085D0

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft Liposomen, welche Polypeptide mit Interleukin-2-Aktivität enthalten sowie Verfahren zur Herstellung derselben gemäss den Patentansprüchen 1 bis 12.

Interleukin-2 (hiernach IL-2 genannt) ist ein natürlich vorkommender Proteinfaktor, welcher erst 1976 entdeckt wurde. Das Produkt wird aus T-Zellen hergestellt, welche durch ein Antigen von Lectin aktiviert worden sind und ist ein essentieller Faktor für die Vermehrung von T-Zellen. Verschiedene IL-2-Strukturen wurden aus einer Anzahl Tierspezies isoliert, z.B. Maus, Primat, wie Affe oder Mensch. Menschliche und andere IL-2-Produkte wurden aus peripheren Blutlymphozyten, Mandellymphozyten, Milz-lymphozyten oder aus T-Zellen-Leukämie- und T-Zellen-Hybridomakulturen isoliert.

Wie oben angedeutet, ist IL-2 ein essentieller Faktor für die Vermehrung von T-Zellen, welche eng beteiligt ist an den Immunitätsreaktionen im Körper. Es wird erwartet, dass IL-2 ein enormes therapeutisches Potential hat, besonders in der Tumorentherapie, da es zu einer Vermehrung von antigen-spezifischen T-Zellen führt und diese T-Zellen das Tumorwachstum hemmen können. IL-2 induziert bekanntlich auch die Produktion von Gamma-Interferon und aktiviert natürliche Killerzellen. IL-2 wird vermutlich auch Einsatzmöglichkeiten aufweisen gegen immunologische Störungen, wie Geschwulstkrankheiten, bakterielle oder virale Infektionen, Krankheiten durch ungenügende Immunität oder gegen autoimmune Krankheiten (s. B. Papermaster et al., Adv. Im-munopharm. [1980] 507).

Wie mit anderen natürlichen Produkten, wie die Inter-feronen vor dem Aufkommen der Gentechnologie, war IL-2 nur in geringen Mengen verfügbar.

Jedoch ist die folgende Methode, bekannt für andere Proteine, z.B. für Gamma-Interferon, bereits auch für die strukturelle Bestimmung und Vermehrung eines klonten Gens für IL-2 eingesetzt worden (s. S. Taniguchi et al., Nature [1983] 302, Seiten 305—310 und Europäische Patentpublikation 91539). Der Inhalt dieser Publikationen wird durch ihre Nennung als Teil dieser Beschreibung betrachtet. Das nach dieser Methode hergestellte IL-2 wird als bekanntes IL-2 angedeutet.

Analog der Sequenzaufschlüsselung in den Nucleotiden wurde auch die Aminosäurensequenz des menschlichen IL-2-Polypeptids und namentlich die, welche den Aminosäuren 1 bis 153 in Fig. 3a der oben genannten Nature-Publikation betrifft, aufgeschlüsselt. Es wurde dabei vorausgesetzt, dass die ersten 20 Aminosäuren dieser Sequenz nach dem Transmembrantransport gespalten sein könnten. Das voll entwik-kelte menschliche IL-2 würde in diesem Fall aus 133 Aminosäureeinheiten bestehen, beginnend mit Ala auf Platz 21.

Diese Struktur des menschlichen IL-2-Produktes ist sowohl in unseren als auch in anderen Laboratorien bestätigt worden.

Es ist auch möglich, IL-2-Produkte von verschiedenen Strukturen herzustellen, indem Rekombinant-DNA-Tech-

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nologien angewendet werden. Z.B. können Modifikationen des menschlichen IL-2-Polypeptids, in denen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen oder durch andere Aminosäuren ersetzt sind, wie z.B. in der oben erwähnten Europäischen Patentpublikation beschrieben, besonders auf Seite 23 —25, durch entsprechendes Modifizieren des menschlichen IL-2-Gens hergestellt werden. Z.B. können gewünschtenfalls Cy-steinereste durch andere Aminosäurereste, z.B. aus Serin, ersetzt werden. Dies wird beschrieben in der Cetus Europäische Patentpublikation 109 748 und im Belgischen Patent 898016, z.B. IL-2-Serin-125. Weitere Beispiele solcher Inter-leukinen werden in der PCT Patentpublikation WO 85/ 00817 offenbart, wie IL-2-Gln-26, IL-2 Phe-121 und IL-2 Stop 121. Der Inhalt dieser Publikationen wird durch deren Nennung als Teil dieser Beschreibung betrachtet.

Weiters können IL-2-Produkte aus verschiedenen Quellen, wie der Affe, durch Rekombinant DNA-Techniken hergestellt werden. Modifizierung dieser Produkte kann in ähnlicher Weise erreicht werden. Weiters können IL-2-Produk-te, wie angedeutet, aus natürlichen Quellen (obwohl in relativ kleinen Mengen) isoliert werden. Diese Produkte können von den Produkten aus der Rekombinant-DNA-Technolo-gie verschieden sein, z.B. wo es die Glycosylierung betrifft. Ausserdem können Erbfaktor-Varianten hergestellt werden.

IL-2-Produkte können auch durch Kultivieren von menschlichen Zellen, z.B. in Anwesenheit eines Auslösers hergestellt werden. Beispiele sind IL-2 A-l, IL-2 A-2, IL-2 B-1, IL-2 B-2, wie in der Dänischen Patentanmeldung Nr. 3317/84 und der Europäischen Patentpublikation Nr.

132 359 angegeben. Auch wird der Inhalt dieser Publikationen durch deren blosse Nennung als Teil dieser Beschreibung betrachtet.

Als Interleukin ist hiernach jedes Polypeptid gemeint, ob es nun aus natürlichen Quellen isoliert oder durch eine synthetische oder biosynthetische Methode entwickelt wurde, wenn es nur IL-2-Aktivität hat. Die Erfindung betrifft jedoch vorzugsweise menschliches IL-2 oder dessen Modifikation, was vorzugsweise durch Rekombinant DNA-Metho-den hergestellt worden ist. Das Interleukin wurde bisher mittels Injektion, z.B. intravenös, appliziert und getestet und zeigte eine sehr kurze Halbwertzeit unter 5 Minuten. Ganz klar existiert ein Bedarf an parenteralen Interleukin-Formen, welche den Wirkstoff über genügend lange Perioden freisetzen können. Jedoch ist bisher nur wenig über spezifische ga-lenische Formen von Interleukinen publiziert worden.

Versuche in unseren Laboratorien haben gezeigt, dass Interleukin in Liposomen eingearbeitet werden kann, welche nach Applikation, z.B. intravenöse Applikation, noch immer IL-2-Aktivität zeigen. Die erfindungsgemässen Liposomen haben eine verlängerte Halbwertzeit und sind für Aufnahme in die Milz, den Lungen, das Knochenmark oder die Lymphknoten vorgesehen.

Die Erfindung betrifft Liposomen, welche Polypeptide mit Interleukin-2-Aktivität enthalten, gemäss den Patentansprüchen 1 bis 5.

Die erfindungsgemässen Liposomen können durch Ein-kapsulierung eines Interleukins in ein Liposom-bildendes Material hergestellt werden.

Liposomen sind vollständig geschlossene doppelschichtige Membranen, welche eine wässrige Phase mit Interleukin enthalten. Das Interleukin kann sich in der wässrigen Phase und/oder in der Membran befinden. Die Liposomen können als ein-lamelliges Bläschen oder als oligo- oder als multi-lamelliges Bläschen aus konzentrischen doppelschichtigen Membranen auftreten, die voneinander durch eine Wasserschicht getrennt sind.

Sie können nach einer grossen Verschiedenheit von Methoden hergestellt werden (s. F. Szoka und D. Paphadjopou-

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los, «Liposomes and their uses in biology and medicine», Ann. N.Y. Acad. Sei. 308,1 -462 [1978]; R.L. Juliano & D. Layton, «Liposomes as a drug delivery system» in Drug delivery systems, S. 189—236, Oxford University Press, Inc., New York, 1980), jedoch werden die Methoden der Erfindung gemäss den Patentansprüchen 6 bis 12 bevorzugt, da sie Liposomen liefern, welche besonders interessante Eigenschaften aufweisen, wie besonders gute Stabilität, so dass kein Interleukin austritt oder verlorengeht. Diese erfindungsgemässen Herstellungsmethoden sind für kommerzielle Anwendung geeignet.

Die Liposomen können aus verschiedenen bläschenbildenden Lipiden geformt werden, wie aus Phosphorlipiden, z.B. natürlichem Lecithin, das in Eiern oder in Soyabohnen vorkommt, synthetischen Lecithinen, Kaphalinen und Sphingomyelinen. Sie können aber auch aus Phosphatidyl-cholinen, Phosphatidinsäuren, Lysophosphatidylcholinen, Sphingolipiden, Phosphatidylglycerin, Cardiolipinen, Glyco-lipiden, Gangliosiden und Cerebrosiden gebildet werden.

Verwendbare Lecithine sind die EPIKURONE von Lucas Meyer, Hamburg 28, BRD. Ein Beispiel eines solchen Epikurons enthält die folgende Menge Phospholipid: Phos-phatidylcholin 44—47%, Phosphatidylethanolamin 22—25%, Phosphatidylinosit 0—2%, Fettsäuregehalt: gesättigt: Palmitinsäure 9—11%, Stearinsäure 2—4%, ungesättigt: Linolsäure 63—67%, Linolensäure 5—8%, Ölsäure 14—18%, und ist bekannt als EPIKURON 145 V. Ein anderes Beispiel enthält mehr als 95% Phosphatidylcholin, z.B. 95—98%, und als ungesättigte Säuren, z.B. Ölsäure 10—12%, Linolsäure 62—65%, Linolensäure 5—6%, sowohl als gesättigte Säuren, wie Palmitinsäure 15—17%, Stearinsäure 3—4% und ist das EPIKURON 200.

Es werden solche Lecithine mit hohem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren bevorzugt. Es sind aber auch Lecithine mit hohem Gehalt an gesättigten Fettsäuren, wie Stearinsäure, und hohem Gehalt an Phosphatidylcholin von 95% oder mehr, z.B. SOYA PHOSPHITID NC 95 oder gereinigte Äquivalente für pharmazeutische Verwendung verfügbar, z.B. bei NATTERMANN CHEMIE GmbH., Köln, BRD.

Synthetische Phospholipide können Verbindungen mit Hydroxylgruppen, verzweigten Kohlenstoffketten, oder auch Cycloderivate, aromatische Derivate, Äther, Amide, polyungesättigte Derivate, halogenierte Derivate oder Car-bohydrate, Glykol, Phosphate, Phosphonate, quaternäre Amine, Sulphate, Sulphonate oder Carboxyl-, Amino-, Sulf-hydryl- und Imidazol-Gruppen, enthalten, wie sie in Dimyri-stoyl-, Dipalmitoyl- oder Distearoyl-Phosphatocholinen vorkommen.

Gewünschtenfalls kann die Doppelschicht des Liposoms z.B. bis zu 50 Molprozent aus anderen Lipiden, z.B. Steroiden, wie Cholesterol, bestehen.

Vorzugsweise ist im Liposom ein Steroid, wie Cholesterol, vorhanden. Geeignete Gewichtsverhältnisse von Lipid zu Steroid liegen zwischen 6:1 und 1:1.

Gewünschtenfalls kann die Doppelschicht ein Lecithin, Kephalin oder Sphingomyelin mit bis zu 10 Molprozent eines Additivs enthalten, das die Aufnahme des Wirkstoffes erleichtert, z.B. anionische Verbindungen, wie Säuren, z.B. Dicetylphosphat, Phosphatidinsäure, Natriumtaurocholat, Phosphatidylserin (Merck) oder kationische Verbindungen, z.B. Amine, wie Stearylamin. Vorzugsweise wird Phosphatidylserin von Merck, BRD, verwendet.

Falls das Lipid extra Hilfsstoffe enthält, kann es von Vorteil sein, eine Lösung des Lipids und der Hilfsstoffe, z.B. in Methylenchlorid im Reaktionsgefäss zu verdampfen, bevor das Lipid mit dem Interleukin vermischt wird, damit ein Lipidfilm auf der Gefasswand gebildet wird.

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Die Liposomen können in bekannter Weise hergestellt werden, z.B. durch Bestrahlung, wie durch Ultraschall, allerdings unter milden Bedingungen, damit kein Interleukin zersetzt wird. Homogene Lipidgemische können gebildet werden, indem das Lipid, z.B. Lecithin mit Cholesterol, in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, gelöst wird. Die Lösung im Reaktionsgefäss wird dann verdampft und hinterlässt eine Lipidschicht.

Die Liposome können in bekannter Weise isoliert und sterilisiert werden.

Ihre Interleukin-Konzentration ist vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 500, speziell 20 bis 200 Mikrogramm/ml wässrige Phase.

Die Lipid-Konzentration ist vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 200, speziell 10 bis 100 mg/ml wässrige Phase. Der durchschnittliche Liposomendurchmesser ist vorzugsweise von etwa 25 Nanometer bis 20 Mikrometer, speziell von 100 bis 500 Nanometer.

Die entstandenen Liposome werden vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, z.B. zwischen —20° und +5 °C, gelagert.

Damit deren Lagerfahigkeit verbessert wird, können die erfindungsgemässen Liposomen durch Gefriertrocknen in ein trockenes Pulver verwandelt werden, wobei Mannit, Su-krose, Polyvinylpyrrolidon oder Gelatin als Trägermaterial eingesetzt wird. Dies kann unter gleichen Bedingungen ausgeführt werden, wie nachfolgend in bezug auf Verfahrensschritt Ab) erwähnt. Vor Verwendung kann steriles Wasser oder eine Lösung, welche z.B. für intravenöse Injektion oder Infusion geeignet ist, zugefügt werden.

Die Reinheit der Liposomen kann durch konventionelle analytische Methoden bestimmt werden.

Gewünschtenfalls kann dem Liposomengemisch ein An-tioxidans, z.B. bis zu 1%, vorzugsweise bis zu 0,1%, bezogen auf Lipid, zugegeben werden. Bevorzugte Antioxidantia sind z.B. Vitamin E (Tocopherolacetat), Vitamin C Palimitat und BHT (butyliertes Hydroxytoluol).

Es können auch Stabilisatoren für das Interleukin vorhanden sein, z.B. Zucker, wie Mannit, Arabinose, Sorbit oder Sucrose oder auch Albumine, wie menschliches Serinal-bumin. Sie können in die Pufferlösung vor der Liposomen-bildung mitgegeben werden. Vorzugsweise ist bis zu 20 Mol-% bezogen auf das Lipid der Liposome vorhanden.

Ein bevorzugtes Liposomherstellungsverfahren ist das gemäss Patentanspruch 6.

Im Verfahrensschritt a) wird unter Lösung auch eine Pseudolösung, wie eine Emulsion verstanden. Bevorzugt wird jedoch eine uniforme, klare Lösung, wobei jedes Lösungsmittelsystem verwendet werden kann, dass das Interleukin und das Lipid löst oder solubilisiert. Das System darf ein einziges Lösungsmittel oder ein Gemisch aus Lösungsmitteln sein und kann bis zu z. B. 15% Wasser und eventuell noch ein Tensid enthalten. Jedes organische Lösungsmittel, wenn es nur vom Lipid durch Verdampfung getrennt werden kann, ist möglich, wobei eine grosse Verschiedenheit von Äthern, wie Diethyläther und Diisopropyläther, oder Estern, wie Äthylacetat, Alkoholen, wie Methanol und tert. Buta-nol, und halogenierten Kohlenwasserstoffen verwendet werden kann. Gewünschtenfalls kann Essigsäure mitvorhanden sein. Es kommen vorzugsweise Diethyläther, Methylenchlorid oder tert. Butanol in Betracht.

Wir fanden, dass tert.-Butanol bevorzugt wird, wenn man im Verfahrensschritt b) ein Hochvakuum und Methylenchlorid bevorzugt wird, wenn man ein niedriges Vakuum entstehen lässt.

Im Verfahrensschritt b) kann das Lösungsmittel durch jedes konventionelle Verfahren entfernt werden, wenn nur die Empfindlichkeit des Interleukins berücksichtigt wird. Bevorzugt findet Verdampfung in niedrigem Vakuum, z. B. bei 10 — 50 mm Hg und Gefriertrocknen unter 5 mm Hg, z. B. bei 0,1 mm Hg, statt.

Gefriertrocknen ist, so fanden wir, die bevorzugte Methode.

Der Verfahrensschritt wird vorzugsweise unter Zimmertemperatur ausgeführt, wobei Vakuum und Temperatur so eingestellt werden, dass das Gemisch 1 bis 3° unter Umgebungstemperatur bleibt. So kann man das Gefriertrocknen bei —60 °C beginnen, die Temperatur in 12 Stunden bis —15 °C ansteigen lassen, dann auf +10 °C bringen und noch 2 Stunden auf diesem Niveau konstant halten.

Im Verfahrensschritt c) wird bevorzugt ein Phosphatpuffer z. B. von pH 4—7, z. B. 5 — 6,5, eingesetzt. Vorzugsweise ist die wässrige Phase hypotonisch, z.B. weniger als 300 mos-mol/1, speziell weniger als 290 mosmol/1. Die Suspension enthält vorzugsweise etwa 0,001 bis etwa 0,2 g Lipid pro ml.

Im Verfahrensschritt d) kann durch Ultraschall homogenisiert werden, wobei 30 bis 80 kHz geeignete Frequenzen sind. Für das Homogenisieren oder Schütteln von etwa 10 ml Gemisch reicht ein Vermögen von 200 bis 400 Watt aus. Die Ultraschallbehandlung soll so stattfinden, dass das Gemisch nicht mit Titan oder einem anderen Metall in Kontakt ist, damit die Metallverunreinigung des Gemisches vermieden wird.

Die Temperatur liegt vorzugsweise zwischen etwa 10° und 70 °C, wobei Zimmertemperatur für ungesättigte und 60 — 70 °C für gesättigte Lipide von Vorteil ist. Während dieses Schrittes wird eine Liposomen-Emulsion gebildet, welche gelegentlich Agglomerate enthält.

Gewünschtenfalls kann nach dem Schütteln durch Ultraschall noch ein Schütteln durch einen Hochgeschwindig-keits-Rührer, z. B. bei 10 000 bis 27 000 Umwälzungen pro Minute stattfinden. Vorzugsweise wird jedoch diese Nachbehandlung weggelassen und auf Ultraschall begrenzt.

Im Verfahrensschritt e) können die erfindungsgemässen Liposomen gemäss konventionellen Techniken, z.B. durch Ultrafiltrieren, Zentrifugieren, Ionenaustausch, Gelchromatographie oder Dialyse isoliert werden. Die Liposome können durch einen Filter mit kleinen Öffnungen, z.B. von 0,1 bis 1 Mikrometer filtriert und sterilisiert werden. Gewünschtenfalls wird das Filtrieren über der Phasenübergangstemperatur des Lipids, z.B. von 30 bis 70 °C, ausgeführt.

Vorzugsweise werden die Liposome durch Ultrazentrifu-gieren, z.B. bei 10 000 bis 20 000 g isoliert.

Ein Beispiel des erfindungsgemässen Verfahrens ist das gemäss Patentanspruch 7.

Ein anderes Beispiel des erfindungsgemässen Verfahrens ist das gemäss Patentanspruch 8.

Diese Verfahren können in analoger Weise wie das Verfahren gemäss Patentanspruch 6 durchgeführt werden.

Ein anderes Liposomherstellungsverfahren ist das gemäss den Patentansprüchen 9 und 10.

Für diesen Verfahrensschritt a) gelten die gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben für a).

Das Interleukin kann in Wasser oder vorzugsweise in einem wässrigen Puffersystem mit pH 4—7,4, z.B. 5 bis 6,5, gelöst werden.

Vorzugsweise ist der wässrige Puffer hypotonisch, z.B. weniger als 300 mosMol/1, besonders weniger als 290 mos-Mol/1. Das resultierende Gemisch enthält vorzugsweise 0,001 bis etwa 0,2 g Lipid/ml.

In diesem Verfahrensschritt b) wird die Ultraschallbehandlung wie unter Verfahrensschritt d) oben beschrieben, ausgeführt.

Die Liposomen können in an sich bekannter Weise isoliert werden, eventuell unter Anwendung von Massnahmen zur Verbesserung von deren Ausbeute.

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Im Verfahrensschritt ci) wird das organische Lösungsmittel zweckmässig im Niedrigvakuum, z.B. von 10 bis 600 mm Hg entfernt, wobei die wässrige Phase grösstenteils zurückgehalten wird. Vorzugsweise werden niedrige Temperaturen angewendet, z.B. Zimmertemperatur oder leicht erhöhte Temperaturen, z.B. bis 45°C.

Im Verfahrensschritt cii) kann die gelartige intermediäre Phase mit Wasser, gegebenenfalls mit einer Pufferlösung, behandelt werden, damit die Liposome gebildet werden.

Ein anderes Liposomherstellungsverfahren ist das gemäss den Patentansprüchen 11 und 12.

Für diese Verfahrensschritte a), b) und ci) und cii) gelten die gleichen Bedingungen wie sie in der Beschreibung der Verfahren a) und c) gemäss den Patentansprüchen 6 bis 8 sowie ci) und cii) oben erwähnt sind.

Das Interleukin kann in Pulverform, z.B. mit Teilchen, welche zweckmässig einen Durchmesser unter 60 Mikron haben, verwendet werden.

Die erfindungsgemässen Liposomen können nach bekannten Methoden weiter isoliert werden, wie z.B. unter Verfahrensschritt e) oben beschrieben.

Die Reinheit der Liposome kann anhand von konventionellen Methoden überprüft werden.

Damit die Aufnahmemenge des Interleukins in den Liposomen geprüft werden kann, wird das noch ungereinigte Rohprodukt verdünnt und während 3 bis 24 Stunden zentri-fugiert, wonach die Interleukinmenge der überstehenden Flüssigkeit bestimmt wird. Vom restierenden Interleukin wird angenommen, in dem Liposomen-Sediment vorhanden zu sein.

Zusätzlich kann dann die Aufnahme des Interleukins in den gereinigten Liposomen noch durch Hochleistungsflüs-sigkeits-Chromatographie bestimmt werden, wie in den Beispielen beschrieben wird.

Die Liposomenverteilung nach Applikation kann bestimmt werden durch übliche pharmakokinetische Studien, z.B. in Tierversuchen. Radioaktives Interleukin kann erhalten werden durch Umsetzen von Interleukin mit radioaktivem Jod-125, oder durch Herstellung von Interleukin aus z.B. S-35 markierten Aminosäuren. Dieses Interleukin wird in Liposomen aus z.B. mit C-14 radioaktiv markierten Lipiden aufgenommen und in Mäusen injiziert. Nach 1 Stunde werden die Mäuse getötet und die Menge und der Typ der Radioaktivität in allen Organen, z. B. in der Milz, gemessen.

Die erfindungsgemässen Liposomen können bei den verschiedenen Einsatzmöglichkeiten für Interleukine appliziert werden. Einsatzmöglichkeiten sind z.B. die Wachstumsverbesserung in Kulturen tierischer Zellen und andere in vitro Applikationen, aber auch deren therapeutische Verwendung bei der Behandlung von verschiedenen Zuständen.

In einem Versuch, hiernach als Bioanalyseversuch genannt, wird eine Interleukin-Bioanalyse durchgeführt, welche auf der Interleukin-konzentrationsabhängigen Stimulierung der Vermehrung einer Maus-T-Lymphozytzellenserie (CTLL Zellen) basiert (s. S. Gillis et al., J. Immunol. [1978] 120, S. 2027-2032).

T-Zellen einer Interleukin-abhängigen Zellenkultur wurden bis zur Entfernung des IL-2 gewaschen, mit den erfindungsgemässen Liposomen behandelt und in einem IL-2-freien Medium inkubiert. Sodann wurden die Testzellen einer konventionellen Serie von Verdünnungsversuchen (Ver-dünnungsmedium RPMI-1640, ergänzt mit 10%-igem fötalen Kälberserums), unterworfen. Die Vermehrung der Zellen nach 24-stündiger Inkubierung wurde gegen die gestiegene Liposomenkonzentration ausgesetzt. Für jede Verdünnung wurden 2 x 105 Zellen gebraucht.

Die Vermehrung wird anhand der Aufnahme von [3H]-Thymidin oder im photometrischen MTT-Versuch gemessen

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(MTT = (3'(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazo-hnbromid). Das gelbe MTT der lebendigen Zellen wird in das entsprechende dunkelblaue Formazan umgesetzt, was nach Auflösung in saures Isopropanol photometrisch gemessen wird.

Dabei wird die Verdünnung einer Probe, die 50% der maximalen Vermehrungsgeschwindigkeit aufweist, gemessen. Die Aktivität der erfindungsgemässen Liposomen ist etwa 1,2 bis 20 mal weniger, als die vom reinen Interleukin. Vorzugsweise werden solche Liposomen verwendet, welche eine Aktivität von mehr als 1,3 ng/ml im oben beschriebenen Versuch aufweisen.

Die Aktivität kann ebenfalls in Standard-invitro-Versu-chen zur Bestimmung der IL-2-Aktivität bestätigt werden, z.B. in Mäusen, welche eine herabgesetzte Menge an T-Lymphozytzellen aufweisen, z.B. in nackten Mäusen. In einem solchen Versuch werden Mäuse in diesen Zustand gebracht durch tägliche Einnahme von 90 mg/kg Cyclosporin A, wonach, wenn die Mäuse mit Schaferythrocyten immunisiert worden sind, die Anzahl der spezifischen Antikörperzellen in der Milz, bestimmt nach der Jerne-Analyse von Pla-que-bildenden Zellen, mit 80 bis 97% verringert ist. Nach intravenöser Antigen-Injektion werden die Mäuse in Gruppen von 6 bis 7 Mäusen verteilt und durch subkutane oder vorzugsweise durch intravenöse Injektion mit IL-2-Präparaten behandelt, welche etwa 2 bis 5 Mikrogramm IL-2 enthalten. Das Wiederaufleben der Immunität der Tiere wurde durch Bestimmung der spezifischen Antikörperzellen in der Milz nach dem Jerne-Versuch gemessen. Die Aktivität der erfindungsgemässen Liposomen ist etwa vergleichbar mit nicht-verkapseltem Interleukin.

Die erfindungsgemässen Liposomen werden vorzugsweise besonders wegen der immunitätsregulierenden Eigenschaften der Interleukine, die sie enthalten, bei besonders wichtigen therapeutischen Behandlungen verwendet, z.B. wie auf Seite 1 dieser Beschreibung erwähnt. Sie werden speziell bei Zuständen angesetzt, die durch Immunitätsmängel verursacht werden, wie das ernsthafte kombinierte Immuni-tätsmangelsyndrom (SCIDS) oder AIDS oder angeborene oder durch ein fortgeschrittenes Alter bedingte Immunitätsmängel. Das Interleukin kann jedoch auch als antimyoti-sches Mittel zur Behandlung von verschiedenen Viruskrankheiten, wie Infektionen durch das Cytomegalovirus und das Herpes-Virus oder durch Bakterien, wie bei Tuberkulose und Leprakrankheit, eingesetzt werden. Die Dosierungen für diese therapeutischen Liposomen-Verwendungen werden durch bekannte Faktoren bestimmt, wie die Krankheitsart, die Ernsthaftigkeit der Krankheit und die Aktivität und die Menge des aufgenommenen Interleukins.

Im allgemeinen können befriedigende Resultate, z.B. bei Säugetieren und besonders bei Menschen erreicht werden mit täglichen Interleukin-Dosierungen von 0,1 bis 30 Mikrogramm pro kg Körpergewicht, wobei intravenöse Injektion in einem geeigneten sterilen Trägermaterial bevorzugt wird.

Die Anwendungsmöglichkeiten, basierend auf der Eignung der Liposomen, das T-Zellenwachstum in Kulturen zu stimulieren, erstrecken sich auch auf Diagnostika und auf Massnahmen, welche therapeutische Behandlungen unterstützen. Die Verwendung in Diagnostika basiert auf der bekannten Möglichkeit, verschiedene Krankheiten festzustellen, indem das Ausmass des T-Lymphozytenwachstums in vitro nach Zufügen von Interleukin bestimmt wird, wobei die Aufnahme von radioaktivem Thymidin in der Zelle als Mass genommen wird. Bei therapeutischen Unterstützungs-massnahmen, wie gegen Tumore, kann das Interleukin verwendet werden, um das Wachstum von T-Lymphozyten in vitro zu stimulieren, welche vom Patienten oder vergleichbaren Donoren stammen. Die Lymphozyten, welche durch

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Vermehrung erhalten worden sind, können nun den Patienten erneut eingespritzt werden, um ihre Kondition zu verbessern. Allgemein wird die Interleukin-Menge, welche in Kulturen und in anderen in vitro-Versuchen eingesetzt wird, um T-Zellenwachstum in solchen Systemen zu stimulieren, anhand von Aktivitätsberechnungen und Vergleichen mit menschlichem Interleukin in der Literatin: bestimmt und kann für besondere Zwecke durch Routineversuche optimiert werden.

Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung:

«Lecithin» bezieht sich auf Sojabohnen-Lecithin.

Der Ultraschall, wo eingesetzt, wird durch 50 kHz und 350 W charakterisiert, wenn nichts anderes erwähnt wird.

Verfahren A Beispiel AI: Herstellung von Liposomen

2 mg menschliches IL-2 wird in 1 ml Essigsäure und 1 g gereinigtes Lecithin wird separat in 5 ml tertiäres Butanol gelöst. Die beiden Lösungen werden vermischt und bei —30 °C gefriergetrocknet, wodurch ein Lyophilisat entsteht. Das Lyophilisat wird in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 5) aufgenommen, bis 10 ml Suspension entstanden ist.

Die Suspension wird während 5 Minuten einer Ultraschall-Behandlung unterworfen, wonach sie 15 Minuten mit einem hochgeschwindigen Rührer mit etwa 15 000 Umwälzungen pro Minute (Typ Polytron Typ 10—30) unter Stickstoffhomogenisiert wird. Die Liposomlösung wird bei einer Temperatur über dem Phasenübergangspunkt von Lecithin, z.B. 20 °C, durch ein steriles Filter (0,2 Mikrometer) ge-presst. Die entstandene Liposomen-Lösung wird dann lyophilisiert. Falls erwünscht, kann auf das hochgeschwindige Rühren verzichtet und die Ultraschall-Behandlung 15 Minuten weiterverfolgt und/oder die Liposomen durch Zentrifu-gieren isoliert werden.

Analyse der Liposomen

Die erfindungsgemässen Liposomen können durch konventionelle Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie der umgekehrten Phase analysiert werden.

Vorzugsweise wird grossporiges (300 Angströmeinheiten) kugelförmiges C-8 Kohlenwasserstoff-haltiges Material von 10 Mikrometer Durchmesser (z.B. Säule RP 300 Aquapore 20 x 4,6 mm, erhältlich bei Browlee Laboratories Inc., USA) verwendet.

Ein bevorzugtes Eluiersystem ist hierbei aus einem Was-ser/Acetonitril-Gradientsystem mit 0,1% Trifluoressigsäure, wobei zwei Eluierflüssigkeiten verwendet werden:

System A: 50% Acetonitril in Wasser (+ 0,1 % Trifluoressigsäure)

System B: 70% Acetonitril in Wasser (+ 0,1% Trifluoressigsäure).

Die Eluierung kann mit einer Fliessgeschwindigkeit von 3 ml/Min. und mit einem Gradientsystem aus 100% A und 100% B in 10 Minuten ausgeführt werden. Unter solchen bevorzugten Bedingungen wird das menschliche IL-2 mit einer Retentionszeit von etwa 7,5 Minuten eluiert. Die Menge des Interleukins kann in konventioneller Weise durch Peakinte-gration festgestellt werden.

Die erfindungsgemässen Liposomen werden vor der Anwendung der Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie-Methode i) mit Acetat-Puffer von pH 2,5 bis 4 verdünnt, wodurch das Liposomenmaterial in der Säule zusammenbricht und das Interleukin freigesetzt wird,

ii) kräftig vom Liposomhilfsstoff befreit, z.B. durch Behandlung mit Wasser und Methanol/Methylenchlorid, wodurch die Phosphoriipide entfernt und wonach die entstandene wässrige Interleukinlösung injiziert wird,

iii) auf eine Kationenwechselsäule gebracht, in der die Li-posomhilfsstoffe abgetrennt werden, wonach das freigemachte Interleukin auf dem Kationenwechsler eluiert und auf eine Säule mit umgekehrter Phase in üblicher Weise chromatographiert wird.

Eine geeignete Kationenwechselsäule hat eine Grösse von 30 x 4,6 mm und enthält Trägermaterial mit einem Durchschnitt von 10 |xm (z.B. SC x 10, erhältlich bei Browlee Laboratories Inc., USA).

Die Liposomen enthalten, so wurde festgestellt, etwa 50% des menschlichen IL-2.

Aktivität und Verwendbarkeit Die Liposomen weisen im oben erwähnten Bioaktivitäts-Analyseversuch etwa die gleiche Aktivität auf wie das menschliche IL-2 selbst.

Beispiel A2: Herstellung von Liposomen (V3) 0,5 mg menschliches IL-2 wird in 1 ml Essigsäure gelöst und 500 mg Lecithin (EPIKURON 145 V) werden separat in 50 ml tertiärem Butanol gelöst. Die beiden Lösungen werden vermischt und während etwa 16 Stunden bei -15° gefriergetrocknet, wobei ein Lyophilisat entsteht. Das Lyophilisat wird in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,5) aufgenommen, bis 10 ml Suspension entstanden ist.

Die Suspension wird bei Zimmertemperatur (etwa 20 °C) während 5 Minuten mit Ultraschall behandelt. Die Suspension wird während 10 Minuten mit einem hochgeschwindigen Rührer mit etwa 15 000 Umwälzungen/Minute bei Zimmertemperatur gerührt (Typ Polytron PT 15).

Die Liposomen werden bei 4 °C während 4 Stunden durch Zentrifugieren (150 000 g) isoliert.

Beispiel A3: Herstellung von Liposomen Die Ultraschallbehandlung und die Homogenisierung durch Rühren gemäss Beispiel A2 wird nun bei 70 °C statt bei Zimmertemperatur ausgeführt. Das verwendete Lecithin war Sojaphosphatid NC 95H. Die Zentrifugierzeit war 2 Stunden.

Beispiel A4: Herstellung von Liposomen 0,5 mg menschliches IL-2,450 mg Lecithin (Epikuron 145 V) und 50 ml Phosphatidylserin werden in 10 ml tertiärem Butanol vermischt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur mit Ultraschall behandelt, wodurch eine Lösung entsteht. Die Lösung wird bei -40 °C während 18 Stunden gefriergetrocknet, wodurch ein Lyophilisat gebildet wird.

Das Lyophilisat wird in 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,3 aufgenommen, bis sich 10 ml Suspension gebildet hat. Die Suspension wird 10 Minuten bei Zimmertemperatur (20 °C) mit Ultraschall behandelt und, wie im Beispiel B2 besprochen, 10 Minuten homogenisiert. Die Liposomen werden bei 4 °C während 4 Stunden zentrifugiert (150 000 g) und isoliert.

Beispiel A5: Herstellung von Liposomen Beispiel A4 wird wiederholt, wobei statt 450 mg Lecithin und 50 mg Phosphatidylserin nun 500 mg Lecithin verwendet wird.

Beispiel A6: Herstellung von Liposomen Beispiel A4 wird wiederholt, wobei statt 450 mg Lecithin und 50 mg Phosphatidylserin nun 425 mg Lecithin und 75 mg Cholesterin verwendet wird.

Beispiel A7: Herstellung von Liposomen Beispiel A2 wird ohne Rührphase mit hochgeschwindi-gem Rührer wiederholt. Die Ultraschallbehandlung dauert 15 Minuten.

6

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Beispiel A8: Herstellung von Liposomen Beispiele A 3—6 werden ohne Rührphase mit dem hoch-geschwindigen Rührer wiederholt.

Überstehende Flüssigkeit Nach Filtration wird die überstehende Flüssigkeit durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie mit umgekehrter Phase analysiert, wie oben beschrieben. Sie enthält weniger als 10% des ursprünglichen menschlichen IL-2.

Biologische Aktivität Die Liposomen werden im Verdünnungstestverfahren auf den Einbau von 3[H]-Thymidin in IL-2 abhängigen CTLL-(16) Zellen in oben erwähnter Weise untersucht (S. Gilles et al.). Die Konzentration der IL-2-Probe, die 50% des maximalen Wachstums von 10 000 Zellen nach 24 Stunden produziert, wird sofort nach Herstellung gemessen (Wert A in |ig/ml). In diesem Versuch hatte das menschliche IL-2, das als Ausgangsmaterial für die Liposomenbildung verwendet wurde, einen Wert von 0,2 jxg/ml.

Resultate

Beispiel

A° (ng/ml)

A2 (ng/ml)

A4 (ng/ml ):

A2

0,2

0,7

3,2

A3

9,5

8,4

nt

A4

0,7

nt nt

A5

2,6

nt nt

A6

1,6

nt nt

A7**

1,0

nt nt

* Nach 4 Wochen Lagerung bei 4 °C

** Ursprüngliche IL-2-Menge mit einer Aktivität von 0,8 ng/ml nt = nicht getestet

Im oben erwähnten in vivo Testverfahren wurden die folgenden Resultate mit einer gelagerten Liposomenmenge von Beispiel A2, welche im oben erwähnten Versuch eine in vitro Aktivität von 1,7 ng/ml aufwiesen, erhalten.

Menge in

Spezifische

Aktivität in

Mikro

Antikör

Bezug auf die grammen perzellen in

Aktivität des

der Milz

Kontrollver

suches

Immunisierte Maus

ohne unterdrückte

T-Lymphozy tzellen

(Kontrolle)

-

167,000

100%

Maus mit unter

drückten

T-Lymphozytzellen

-

28,000

17%

IL-2-Substanz

5

111,000

66%

Liposomen

5

96,700

58%

IL-2-Substanz

2

96,700

58%

Liposomen

2

87,100

52%

Beispiel A9: Herstellung von Liposomen 0,5 mg menschliches IL-2 wird in 1 ml Essigsäure gelöst und die Lösung wird an eine Lösung von 500 mg Lecithin (Epikuron 145 V) in 50 ml Methylenchlorid zugefügt.

Das Gemisch wird 1 Stunde bei 30 °C in einem Rotationsverdampfer bei einem Vakuum von 10 bis 50 mg Hg und dann 3 Stunden bei 50 °C behandelt, wonach ein Lipid-film vorliegt. Dieser Film wird in 10 ml (0,02 M) Phosphat668 554

puffer von pH 5 dispergiert. Die Dispersion wird dann während 30 Minuten bei Zimmertemperatur zur Bildung von Liposomen mit Ultraschall behandelt. Die Liposomen werden 4 Stunden bei 40 °C zentrifugiert (15 000 g) und isoliert.

Beispiel AIO: Herstellung von Liposomen Beispiel 9 wird wiederholt, wobei die Ultraschallbehandlung bei 70 °C statt bei Zimmertemperatur ausgeführt wird. Als Lecithin wurde Sojaphosphatin NC 95 H eingesetzt. Das Zentrifugieren dauerte 2 Stunden.

Analyse der Liposomen Analog wie im Beispiel A4.

Resultate

Beispiel A° (ng/ml) A2 (ng/ml)

A9 0,8 0,9

AIO 2,5 3,5

Verfahren B Beispiel Bl: Herstellung von Liposomen

An eine Lösung von 100 mg Lecithin in 5 ml Methylenchlorid in einem Rundkolben wird eine wässrige Lösung von 0,2 mg menschliches IL-2 und 20 mg L-Cystein in 1 noi 0,05 M Phosphatpuffer von pH 5 zugefügt. Das Gemisch wird während 5 Minuten bei 20 °C mit Ultraschall behandelt (80 kHz Frequenz).

Die Emulsion, welche einige bereits vorgeformte Liposomen und Agglomerate enthält, wird dann bei 20 °C in einem Vakuum von 20 bis 30 mm Hg konzentriert, bis ein Gel entstanden ist, wonach 2 ml der oben genannten Pufferlösung zugefügt werden.

Die gebildeten Liposomen werden von nichtaufgenom-menem Wirkstoff durch die folgenden Verfahrensschritte getrennt:

a) Zentrifugieren (5 Minuten, 20 °C, 5000 g). Der nicht-aufgenommene Wirkstoff bleibt in der überstehenden Flüssigkeit. Das Liposomen-Sediment wird resuspendiert.

b) Gelsäulenchromatographie (Biogel A 1,5 oder Sepha-dex G 50). Das liposomenenthaltende Eluat wird durch Ultrafiltration oder Dialyse gegen 0,9% NaCl-Lösung konzentriert.

Die erhaltene Liposomenlösung wird lyophilisiert.

Analyse

Von den Liposomen wurde festgestellt, dass sie 50 bis 90% des menschlichen IL-2 enthielten.

Aktivität und Verwendbarkeit

Von den Liposomen wurde festgestellt, dass sie etwa die gleiche Aktivität wie das menschliche IL-2 selbst im oben erwähnten Bioanalyseversuch hatten.

Beispiel B2: Herstellung von Liposomen

An eine Lösung von 500 mg Lecithin (Epikuron 145 V) in 200 ml Methylenchlorid in einem Rundkolben wurde eine wässrige Lösung von 0,5 mg menschliches IL-2 und 100 mg L-Cystein in 10 ml 0,05 M Phosphatpuffer von pH 5 zugefügt.

Das Gemisch wurde während 10 Minuten bei Zimmertemperatur (20 °C) mit Ultraschall behandelt. Die entstandene Emulsion, welche bereits einige vorgebildete Liposomen und Agglomerate enthielt, wurde während 10 Minuten bei 30 °C in einem Vakuum von 20 bis 30 mm Hg konzentriert, wonach ein Gel entstand. An das Gemisch wurden 10 mg

7

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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Pufferlösung zugegeben, wonach es 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt wurde.

Die Liposomen werden während 4 Stunden bei 4 °C durch Zentrifugieren bei 150 000 g isoliert.

Beispiel B3: Herstellung von Liposomen Die Liposomen wurden analog wie im Beispiel B2 beschrieben gebildet, jedoch wurde nur 5 Minuten bei 80 °C konzentriert statt 10 Minuten bei 35 °C. Das verwendete Lecithin war Soja Phosphat NB 95 H. Das Zentrifugieren dauerte 2 Stunden statt 4 Stunden.

Beispiele B4 und B5: Herstellung von Liposomen In analoger Weise wie in Beispielen 2 und 3, jedoch ohne L-Cystein.

Analyse der Liposomen Überstehende Flüssigkeit Die nach Zentrifugieren überstehende Flüssigkeit wurde durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie mit umgekehrter Phase, wie oben erwähnt, analysiert und enthielt weniger als 10% des ursprünglichen menschlichen IL-2.

Biologische Aktivität Die Liposomen werden gemäss dem Verdünnungsverfah-rens-Test auf die Aufnahme von 3[H]-Thyridin in IL-2 abhängigen CHL-(16)-Zellen gemäss dem oben erwähnten Versuch analysiert (S. Gilles et al.). Die Konzentration von IL-2, welche nach 24 Stunden 50% des maximalen Wachstums von 104-Zellen verursacht, wird sofort nach Herstellung (Wert A° in ng/ml) und nach 2 Wochen Lagerung bei 4 °C (Wert A2 in ng/ml) gemessen. In diesem Versuch hatte menschliches IL-2 selbst einen Wert von 0,2 ng/ml.

Resultate

Beispiel A° (ng/ml) A2 (ng/ml)

B2 0,8 2,4

B3 20,0 35,0

Verfahren C Beispiel Cl: Herstellung von Liposomen 50 p.Mol gereinigten Lecithins und 50 (iMol Cholesterol werden in 20 ml Chloroform unter Stickstoff in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der Rückstand wird in 5 ml Diethyläther aufgenommen. 600 ng menschliches IL-2 werden als Pulver z.B. mit Teilchengrösse 5 bis 50 |xm zugefügt, wonach 1,5 ml 0,05 M Phosphatpuffer zugegeben wird.

Das Gemisch wird während 5 Minuten bei 5 °C mit Ultraschall in ein Homogenisat übergeführt. Die entstandene Emulsion wird in 2 Stufen in einem Rotationsverdampfer konzentriert. In der ersten Stufe ist der Druck etwa 400 mm Hg und wird, bis ein viskoses Gel gebildet wird, beibehalten. Das Gel wird mit 1,5 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 5) behandelt und der Behälter wird leicht geschüttelt, bis eine wässrige Suspension gebildet wird. Die wässrige Suspension wird dann bei Raumtemperatur während 15 Minuten einer zweiten Verdampfungsstufe unterworfen, wobei eine nicht-transparente Liposomensuspension gebildet wird.

Damit die letzten Spuren des organischen Lösungsmittels entfernt werden, kann eine Ultrafiltration in einer Ionen-wechselsäule (Sephadex 650) ausgeführt werden.

Analyse der Liposomen Von den Liposomen wird festgestellt, dass sie etwa 50—90% des menschlichen IL-2 enthalten.

Aktivität und Verwendbarkeit Im oben erwähnten Bioanalyseversuch weisen die Liposomen etwa die gleiche Aktivität auf wie das menschliche IL-2 selbst.

Beispiel C2: Herstellung von Liposomen 500 mg Lecithin (Epikuron 145 V) und 0,5 mg menschliches IL-2 werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst, wonach 10 ml 0,05 M Phosphatpuffer zugefügt wird.

Das Gemisch wird dann während 5 Minuten bei Zimmertemperatur (etwa 20 °C) mit Ultraschall behandelt. Die entstandene Emulsion wird während 10 Minuten bei 35 °C in einem Rotationsverdampfer konzentriert, bis ein viskoses Gel gebildet wird, wonach 10 ml 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 5) zugefügt und der Behälter während 30 Minuten bei Zimmertemperatur rotiert wird.

Beispiel C3: Herstellung von Liposomen Beispiel C2 wird wiederholt während 5 Minuten bei 80 °C statt 10 Minuten bei 35 °C. Das Lecithin ist Sojaphosphatin NC 95 H. Es wird während 2 Stunden zentrifugiert.

Analyse der Liposomen

Überstehende Flüssigkeit Die überstehende Flüssigkeit wird durch Anwendung von Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie mit umgekehrter Phase analysiert, wie oben beschrieben und enthält weniger als 10% des ursprünglichen menschlichen IL-2.

Biologische Aktivität Die Liposomen werden gemäss dem Verdünnungstestverfahren auf die Aufnahme von 3[H]-Thyridin in IL-2 abhängigen CHLL-(16)-Zellen im oben erwähnten Versuch untersucht (S. Gilles et al).

Die Konzentration von IL-2, welche nach 24 Stunden 50% des maximalen Wachstums von 104-Zellen verursacht, wird sofort nach der Herstellung gemessen (Wert A° in ng/ml) und nach 2 Wochen Lagerung bei 4 °C (Wert A2 in ng/ml). In diesem Test hatte das menschliche IL-2 selbst einen Wert von 0,2 ng/ml.

Resultate

Beispiel A° (ng/ml) A2 (ng/ml)

C2 1,2 2,9

C3 12,5 20,0

In jedem der obigen Beispiele für die Verfahren A, B oder C kann das menschliche IL-2 durch IL-2-Serin 125, IL-

2 A-l, IL-2 A-2, IL-2 B-l, IL-2 B-2, IL-2 Gln-26, IL-2 Phe-121 oder IL-2 Stop-121 ersetzt werden.

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S

Claims

668 554 PATENTANSPRÜCHE

1. Liposomen, welche Polypeptide mit Interleukin-2-Aktivität enthalten.

2. Liposomen gemäss Anspruch 1, welche menschliches IL-2 enthalten.

3. Liposomen gemäss Anspruch 1, welche IL-2-Serin 125 enthalten.

4. Liposomen gemäss Anspruch 1, welche IL-2 A-l, IL-2 A-2, IL-2 B-l oder IL-2 B-2 enthalten.

5. Liposomen gemäss Anspruch 1, welche IL-2 Gln-26, IL-2 Phe-121 oder IL-2 Stop-121 enthalten.

6. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die ein Polypeptid mit Interleukin-2-Aktivität enthalten, bestehend darin, dass man a) eine Lösung eines entsprechenden Polypeptides mit einem Lipid in einem organischen Lösungsmittel bildet,

b) das Lösungsmittel aus der Lösung entfernt, um einen Rückstand zu bilden,

c) den Rückstand in einer Pufferlösung suspendiert,

d) die Suspension schüttelt und homogenisiert bis sich Liposomen gebildet haben und e) die Liposomen isoliert.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, indem a) eine hydrophile Lösung eines Polypeptides mit Inter-leukin-2-Aktivität mit einem Lipid in einem organischen Lösungsmittel vermischt wird,

b) das Wasser und das organische Lösungsmittel durch Verdampfung entfernt werden,

c) der Rückstand in einer Pufferlösung von pH 4—7 aufgenommen und eine Suspension gebildet wird,

d) die Suspension bis zur Bildung von Liposomen einer Ultraschallbehandlung unterworfen, und e) die Liposomen isoliert werden.

8. Verfahren gemäss Anspruch 6, indem a) eine hydrophile Lösung eines Polypeptides mit Inter-leukin-2-Aktivität mit einem Lipid in einem organischen Lösungsmittel vermischt,

b) das Gemisch durch Gefriertrocknen in ein Lyophilisat übergeführt,

c) das gefriergetrocknete Gemisch in einer Pufferlösung von pH 4—7 suspendiert,

d) die Lösung geschüttelt wird bis die Liposomen und/ oder Agglomerate gebildet werden,

e) das Gemisch mechanisch homogenisiert und f) die Liposomen isoliert werden.

9. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die ein Polypeptid mit Interleukin-2-Aktivität enthalten, bestehend darin, dass man a) eine wässrige Lösung eines entsprechenden Polypeptides mit einer organischen Lösung eines Lipids vermischt,

b) das Gemisch bis zur Bildung von Liposomen und/oder Agglomeraten einer Ultraschallbehandlung unterwirft und c) die Liposomen aus dem Gemisch isoliert.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, gemäss welchem Schritt c) durchgeführt wird indem man i) das Lösungsmittel aus dem Gemisch verdampft, um eine intermediäre Phase mit Gelkonsistenz zu bilden und ii) die intermediäre Phase mit Gelkonsistenz in Liposomen überführt.

11. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die ein Polypeptid mit Interleukin-2-Aktivität enthalten, bestehend darin, dass man a) ein entsprechendes Polypeptid mit einem wässrigen Puffer bei pH 4—8 und mit einem Lipid in einem organischen Lösungsmittel vermischt,

b) die gebildete Suspension bis zur Bildung von Liposomen oder Agglomeraten einer Ultraschallbehandlung unterwirft, und c) die Liposomen aus dem Gemisch isoliert.

12. Verfahren gemäss Anspruch 11, gemäss welchem Schritt c) durchgeführt wird indem man i) das Lösungsmittel aus dem Gemisch verdampft, um eine intermediäre Phase mit Gelkonsistenz zu bilden und ii) die intermediäre Phase mit Gelkonsistenz in Liposomen überführt.