DE69211691T2

DE69211691T2 - Pharmazeutische formulierung und pharmazeutisches verfahren

Info

Publication number: DE69211691T2
Application number: DE69211691T
Authority: DE
Inventors: Jill P. Altadena Ca 91001 Adler-Moore; William A. San Dimas Ca 91773 Ernst
Original assignee: Nexstar Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Nexstar Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-20
Publication date: 1997-01-16
Anticipated expiration: 2012-04-21
Also published as: JP2721041B2; US5688525A; AU1797792A; CA2108288C; DK0580817T3; JPH06510024A; ATE139439T1; ES2088160T3; CA2108288A1; US5670166A; US5660856A; WO1992018104A1; EP0580817A1; DE69211691D1; GR3020396T3; AU657961B2; EP0580817B1

Description

Diese Erfindung betrifft die Gebiete von Biochemie und Medizin und insbesondere eine neue Liposomenformulierung und ein neues Liposomenverfahren. Mehr spezifisch bezieht sie sich auf eine Liposomenformulierung, welche das immunosuppressive Mittel Cyclosporin enthält, und das Verfahren zu ihrer Herstellung. Diese Erfindung bezieht sich auf eine liposomale Cyclosporinformulierung mit reduzierter Toxizität.
Die Cyclosporine wurden 1970 von Forschern bei Versuchen zur Identifizierung neuer antimikrobieller Mittel entdeckt. Cyclosporin (ebenfalls bekannt als Cyclosporin A), ein potents immunosuppressives Mittel, wurde aus zwei Stämmen von unvollendeten Pilzen (Fungi imperfecti), Cylindrocapon lucidum Booth und Tolypocladium inflatum Gams, isoliert.
Cyclosporine sind hydrophobe, neutrale, cyclische Peptide, welche im wesentlichen vergleichbare chemische und physikalische Merkmale besitzen. Cyclosporin ist ein repräsentatives Beispiel und besteht aus elf Aminosäuren mit einem Gesamtmolekulargewicht von 1201. Cyclosporin ist löslich in Methanol, Chloroform und Ether und praktisch unlöslich in Wasser. Es wird fur therapeutische Zwecke entweder als eine intravenöse Präparation, die in einem medizinischen Rizinusöl und Alkohol aufgelöst ist, oder als eine orale Formulierung, die in Labrophil und Olivenöl aufgelöst ist, geliefert.
Cyclosporin wird hauptsächlich zur Behandlung von Transplantationspatienten benutzt, und es wurde bei experimentellen Versuchen für Autoimmunkrankheiten eingesetzt. Die Verwendung dieses Arzneimittels hat die Uberlebensrate von Transplantationspatienten seit seinem Erscheinen 1978 stark erhöht.
Obwohl Cyclosporin ein sehr brauchbares immunosuppressives Mittel ist, kann es ebenfalls hochtoxisch sein, wenn es für längere Zeitspannen und/oder mit hohen Dosen angewandt wird, die beide zur Sicherstellung des Annehmens des Transplantates erforderlich sind. Der mit Cyclosporin verbundene schwerwiegenste Nebeneffekt ist die durch das Arzneimittel induzierte Nephrotoxizität. Vaskuläre interstitielle Toxizität ist die häufigste Form der Cyclosporin-Nephrotoxizität und kann sich selbst als drei unterschiedliche morphologische Läsionen manifestieren, welche entweder alleine oder in Kombination auftreten. Obwohl nicht alle diese morphologischen Veränderungen, welche mit Cyclosporin-Nephrotoxizität verbunden sind, für Cyclosporintoxizität einzigartig sind, falls sie in Kombination miteinander beobachtet werden und es ebenfalls einen entsprechenden hohen Pegel an Serumcyclosporin gibt, ist die Schädigung wahrscheinlich ein Ergebnis von Cyclosporintoxizität. Einige Individuen können einige dieser schädlichen Reaktionen bei therapeutischen Dosen (5 bis 10 mg/kg/Tag), welche Analysenwerte von 200-500 ng/ml im Gesamtblut und 20-60 ng/ml im Serum ergeben, aufweisen. Renale Toxizitäten können serologisch durch Verfolgung des Anstiegs der Creatininwerte überwacht werden. Der Einstieg in Creatininwert ist wahrscheinlich ein direktes Ergebnis von Arteriolenkonstriktion und -blockade, welche eine geringere glomerulare Filtrationsrate und daher einen Anstieg im Serumcreatinin ergeben könnten.
Es gibt andere schädliche Nebenreaktionen, welche mit einer Cyclosporinbehandlung verbunden sind. Diese treten mit unterschiedlichen Häufigkeiten in Abhängigkeit von dem Typ des Transplantates auf. Sie schließen Symptome wie kardiovaskuläre Hypertension und Krämpfe, Hauthirsutismus, Zahnfleischhyperplasie, Diarrhoe, Übelkeit, Erbrechen, Hepatoxizität, Blutbildungsveränderungen einschließlich Leukopenie und Lymphom, Atmungsbeschwerden und Sinusitis ein.
Andere mit der intravenösen Zufuhr von Cyclosporin verbundene Nebeneffekte sind Folge der intravenösen Trägersubstanz, Cremophor-El (CreL). CreL ist ein polyoxyethyliertes Rizinusöl, das eines der besten ionischen grenzflächenaktiven Stoffe ist, welche zur Auflösung von lipophilen Arzneiwirkstoffen benutzt wird. Die häufigste der negativen Reaktionen, welche mit der CreL-Applikation verbunden sind, war Anaphylaxe, welche von einer raschen Freisetzung von Histamin herrührt und erhöhte Hypertension bewirkt. Es wird ebenfalls angenommen, daß ein Teil der mit einer Cyclosporinbehandlung verbundenen Nephrotoxizität durch CreL-Ablagerung und Kristallbildung innerhalb der Nierentubuli erhöht werden kann. Andere Untersuchungen haben ebenfalls eine Abnahme sowohl der renalen Blutströmung und der Creatininfreisetzung in mit CreL behandelten Tieren gezeigt. Es wurde gezeigt, daß Riconsäure, eine Komponente von CreL, Vasokonstriktion hervorruft, welche ebenfalls mit Hypertension und vermindertem Nierenblutfluß verbunden sein könnte.
Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Toxizität von Cyclosporin zu eliminieren, indem der Wirkstoff in Liposome für Zwecke der Applikation eingebaut wurde, so daß der toxische Rizinusölträger ausgeschaltet wurde. Liposome sind mikroskopische Anlieferungsvesikel, welche teilweise aus Phospholipiden bestehen, die geschlossene, mit Fluid gefüllte Kugelnbilden, wenn sie mit Wasser gemischt sind. Phospholipidmoleküle sind polar, besitzen einen hydrophilen ionisierbaren Kopf und einen hydrophoben Schwanz, bestehend aus langen Fettsäureketten. Wenn daher ausreichend Phospholipidmoleküle mit Wasser vorliegen, assoziieren die Schwänze spontan unter Ausschluß von Wasser, während die hydrophilen Phosphatköpfe mit Wasser in Wechselwirkung treten. Das Ergebnis ist eine Zweischichtmembran, in der die Fettsäureschwänze in dem Inneren der neu gebildeten Membran zusammenlaufen und die polaren Köpfe in entgegengesetzten Richtungen zu einem wässrigen Medium zeigen. Die polaren Köpfe an einer Oberfläche der Membran zeigen zu dem wässrigen Inneren des Liposoms. An der gegenüberliegenden Oberfläche treten die polaren Köpfe mit dem umgebenden wässrigen Medium in Wechselwirkung. Wenn sich die Liposome bilden, werden wasserlösliche Moleküle in das wässrige Innere eingebaut und lipophile Moleküle besitzen die Neigung, in die Lipiddoppelschicht eingebaut zu werden. Liposome können entweder multilamellar wie eine Zwiebel mit zahlreiche Lipiddoppelschichten trennender Flüssigkeit sein, oder sie können unilamellar mit einer einzigen Doppelschicht, welche ein vollständiges Flüssigkeitszentrum umgibt, sein.
Es gibt zahlreiche Typen von Arbeitsweisen zur Liposomenherstellung, welche angewandt werden können und welche verschiedene Typen von Liposomen erzeugen. Diese können in Abhängigkeit von der Verwendung, der beabsichtigten einzuschließenden Chemikalie und dem Typ von zur Bildung der Doppelschichtmembran verwendeten Lipiden ausgewählt werden.
Die Parameter, welche bei der Herstellung einer optimalen Liposomenpräparation berücksichtigt werden müssen, sind denen von anderen Mechanismen zur kontrollierten Freisetzung vergleichbar. Es sind folgende: (1) hoher Prozentsatz an eingeschlossener Chemikalie; (2) erhöhte chemische Stabilität; (3) niedrige chemische Toxizität; (4) schnelles Herstellungsverfahren und (5) reproduzierbare Größenverteilung.
Das erste beschriebene Verfahren zum Einkapseln von Chemikalien in Liposomen umfaßte die Herstellung von multilamellaren Vesikeln (MLVs). Das MLV-Verfahren umfaßt das Auflösen der flüssigen Komponenten in einem geeigneten Lösungsmittel, das Verdampfen des Lösungsmittels zur Bildung eines trockenen Lipidfilms und die Hydratation des Lipidfilms mit einem wässrigen Medium. Die multilamellaren Vesikeln, welche sich bilden, sind Strukturen mit im allgemeinen mehr als drei konzentrischen Doppelschichten. Lipohile Wirkstoffe werden in die MLVs durch Mitauflösung der Wirkstoffe in der Lösungsmittelphase eingebaut, während hydrophile Wirkstoffe zwischen den Doppelschichten mit dem Hydratationspuffer eingefangen werden. Durch Erhöhung der Zeitdauer der Hydratation und vorsichtiges Schütteln des sich resuspendierenden Lipidfilms kann man einen höheren Anteil der wässrigen Phase pro Mol Lipid erreichen und auf diese Weise die Einkapselung von hydrophilem Wirkstoff fördern. Der erhöhte Einschluß von wässrigem Puffer kann ebenfalls unter Verwendung von geladenen Lipiden erreicht werden.
Liposome können ebenfalls als unilamellare Vesikel (UVs) gebildet werden, welche Durchmesser bis zu 2 µm, jedoch im allgemeinen weniger als 1 µm besitzen.
Es gibt verschiedene Arbeitsweisen, welche zur Herstellung von unilamellaren Liposomen angewandt werden. Große unilamellare Vesikel können unter Verwendung der Methode der Umkehrphasenverdampfung gebildet werden. Dies wird durch Entfernen der organischen Phase aus einer mit Ultraschall beaufschlagten Emulsion von Phospholipid, Puffer und überschüssigem organischem Lösungsmittel unter Druck erreicht. Diese Arbeitsweise ist besonders brauchbar zum Einkapseln von großen Volumina von wässriger Phase, welche hydrophile Moleküle wie Ferritin, 25S RNA oder SV-40 DNA enthält. Eine maximale Einkapselung der LUV wässrigen Phase (65%) kann erreicht werden, falls die Ionenstärke des wässrigen Puffers niedrig ist (0,01 M NaCl), die Einkapselung nimmt auf 20% ab, wenn die Ionenstärke auf 0,5 M NaCl erhöht wird. Die Größe der LUVs variiert mit dem Lipid und Cholesteringehalt. Aus Cholesterin und Phospholipid bei einem Molverhältnis von 1:1 gebildete Vesikel ergeben eine heterogene Größenverteilung von Vesikeln mit einem mittleren Durchmesser, bezogen auf eingeschlossenes Volumen, von 0,47 µm und einen Größenbereich von 0,17-0,8 µm. Aus ähnlichen Phospholipidmischungen ohne einen Gehalt an Cholesterin hergestellte Vesikel besitzen eine mittlere Größe von 0,18 µm und einen Größenbereich von 0,1-0,26 µm.
Die Methode der Lösungsmittelinfusionsverdampfung kann sowohl große als auch kleinere UVs in Abhängigkeit von den Variationen in der Arbeitsweise bilden. Zur Bildung von größeren-UVs werden Phospholipide in Diethylether aufgelöst und in einen auf 55-65ºC gehaltenen Puffer, welche das einzuschließende oder zu injizierende Material enthält, injiziert. Die Mischung wird unter Vakuum auf 30ºC gehalten. Wenn das Lösungsmittel verdampft ist, werden Vesikel gebildet. Der Bereich des Durchmessers dieser Vesikel beträgt von 0,25-1 µm. Diese Arbeitsweise ist für das Einschließen von großen Molekülen gut geeignet.
Kleinere unilamellare Vesikel können ebenfalls unter Anwendung einer Vielzahl von Arbeitsweisen gebildet werden. Durch Auflösen von Phospholipiden in Ethanol und Injizieren hiervon in einen Puffer ordnen sich die Lipide spontan neu in unilamellare Vesikel. Dies ergibt ein einfaches Verfahren zur Herstellung von UVs mit ähnlichen inneren Volumina zu denjenigen, welche durch Ultraschallbehandlung gebildet wurden (0,2-0,5 L/Mol/Lipid). Ultraschallbehandlung oder Extrusion (durch Filter) von MLVs ergibt ebenfalls die Dispersion zu UVs mit Durchmessern bis zu 0,2 µm, welche als klare oder durchscheinende Suspensionen in Erscheinung treten.
Eine andere übliche Methode zur Herstellung von kleinen UVs ist die Technik der Detergensentfernung. Phospholipide werden in entweder ionischen oder nichtionischen Detergentien wie Cholaten, Triton X oder n-Alkylglucosiden solubilisiert. Der Wirkstoff wird dann mit den solubilisierten Lipid-Detergensmicellen gemischt. Das Detergens wird dann nach einer von mehreren Technik entfernt: Dialyse, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Zentrifugieren, Ultrafiltration. Die Größenverteilung und die Einschlußeffizienz der auf diese Weise gebildeten UVs variiert in Abhängigkeit von den Einzelheiten der angewandten Technik. Auch wenn Proteine eingeschlossen werden, gibt es keine Sicherheit, daß das Protein, wenn das Detergens einmal entfernt worden ist, sich in seine native bioaktive Konformation renaturiert.
Die therapeutische Verwendung von Liposomen schließt die Anlieferung von Wirkstoffen ein, welche normalerweise sehr toxisch in der freien Form sind. In der liposomalen Form kann der toxische Wirkstoff von dem empfindlichen Gewebe entfernt gehalten werden und auf ausgewählte Bereiche als Ziel gerichtet werden. Liposome können ebenfalls therapeutisch zur langsamen Freisetzung von Wirkstoffen über eine verlängerte Zeitspanne eingesetzt werden, wodurch die Häufigkeit von Applikation herabgesetzt wird. Zusätzlich können Liposome eine Methode zur Bildung einer wässrigen Dispersion von hydrophoben Wirkstoffen für die intravenöse Anlieferung bilden.
Wenn Liposome eingesetzt werden, um eingekapselte Wirkstoffe an ausgewählte Wirtsgewebe und von empfindlichen Geweben weg zielgerichtet anzuliefern, können mehrere Techniken angewandt werden. Diese Arbeitsweisen schließen die Auswahl der Größe der Liposome, ihre Oberflächennettoladung wie auch den Weg der Applikation ein. Mehr spezifische Auswahlmethoden haben das Markieren der Liposome mit Rezeptoren oder Antikörpern für spezielle Plätze im Körper eingeschlossen.
Der Anlieferungsweg von Liposomen kann ebenfalls ihre Verteilung im Körper beeinflussen. Eine passive Anlieferung von Liposomen schließt die Verwendung von verschiedenen Applikationswegen, z.B. intravenös, subkutan oder topisch, ein. Jeder Weg ergibt Unterschiede in der Lokalisierung der Liposome. Zwei übliche angewandte Methoden für die aktive Führung der Liposome zu ausgewählten Zielflächen sind das Anbinden von entweder Antikörpern oder spezifischen Rezeptorliganden an die Oberfläche der Liposome. Antikörper haben bekanntermaßen eine hohe Spezifität für ihr entsprechendes Antigen, und es wurde gezeigt, daß sie zur Bindung an der Oberfläche von Liposomen in der Lage sind, wodurch die Targetspezifität des im Liposom eingekapselten Wirkstoffes erhöht wird.
Da die chemische Zusammensetzung von vielen Arzneimitteln ihre intravenöse Applikation ausschließt, können Liposome bei der Adaption dieser Arzneimittl für intravenöse Zufuhr sehr vorteilhaft sein. Zahlreiche hydrophobe Arzneimittel einschließlich Cyclosporin fallen in diese Kategorie, da sie nicht in einfacher Weise in einem Medium auf Wasserbasis aufgelöst werden können und in Alkoholen oder grenzflächenaktiven Mitteln aufgelöst werden müssen, von denen gezeigt wurde, daß sie toxische Reaktionen in vivo bewirken. Liposome, bestehend aus überwiegend Lipiden, mit oder ohne Cholesterin, sind nicht toxisch. Da Liposome aus amphipathischen Molekülen bestehen, können sie hydrophile Arzneimittel in ihrem Innenraum und hydrophobe Moleküle in ihrer Lipiddoppelschicht einschließen.
Aus einer Vielzahl von Gründen, welche hauptsächlich mit der Nichtfähigkeit von üblichen Fachleuten zum Einschluß ausreichender Cyclosporine in einem stabilen Liposomenträger zu tun haben, ist ein therapeutisch wirksames Liposomenprodukt mit eingelagertem Cyclosporin kommerziell nicht verfügbar gewesen. Die WO-90/00389 beschreibt gefriergetrocknete "potentielle Liposomen"-Mischungen, welche Cyclosporine enthalten, die im trockenen Zustand für ausgedehnte Zeitspannen lagerfähig sind. Jedoch sind die wässrigen Suspensionen solcher Liposome in vitro nicht stabil.
Die WO-91/04019 beschreibt die Verwendung von negativ und neutral geladenen Phospholipiden zur Verlängerung der in vivo Bioverfügbarkeit von hydrophilen Peptiden, die in unilamellaren (oder oligolamellaren) Liposomen eingekapselt sind, jedoch richtet sie sich nicht an die spezifischen Schwierigkeiten zur Stabilisierung von wässrigen Liposomensuspensionen von hydrophoben Arzneimitteln wie Cyclosporinen.
Es bestand daher ein Wunsch zur Entwicklung einer liposomalen Cyclosporin enthaltenden Formulierung, welche den Einbau eines hohen Anteils des aktiven Mittels hierin erlaubt und ausreichend stabil für kommerzielle Zwecke ist. Die vorliegende Erfindung liefert ein solches Produkt.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt liefert die Erfindung Liposome, welche in einer wässrigen Lösung suspendiert und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie umfassen: (i) ein neutrales Phospholipid, (ii) ein negativ geladenes Phospholipid, ausgewählt aus Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Dilaurylphosphatidylglycerin und Dimyristoylphosphatidsäure, und (iii) ein Cyclosporin.
Eine solche stabile immunosuppressive Formulierung kann hergestellt werden durch Hydratisieren einer festen Lipidphase, welche das negativ geladene Phospholipid und das Cyclosporin umfaßt, mit einem physiologisch verträglichen Puffer, bevorzugt einer wässrigen Lösung mit einem pH von 5,5 bis 9,5, vorteilhafterweise von 7,0 bis 9,5, bevorzugt von 7,5 bis 9,1. Die feste Lipidphase kann gebildet werden durch Auflösen des Phospholipids und Cyclosporins in einem organischen Lösungsmittel. Ein neutrales Phospholipid wie ein Phosphatidylcholin, bevorzugt ein solches mit hauptsächlich aus geraden Fettsäureketten mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen bestehenden Lipidabschnitten, kann ebenfalls in der festen Lipidphase eingeschlossen sein.
Mehr spezifisch wird gemäß der Erfindung eine liposomale therapeutische Cyclosporinformulierung, welche selbst bei Abwesenheit von Lyophilisierung stabil ist, nach einem Verfahren hergestellt, welches die Stufen umfaßt von:
(a) Auflösen (i) eines Phosphatidylcholins, (ii) des negativ geladenen Phospholipids (oder Mischungen hiervon) und (iii) eines Cyclosporins in einem organischen Lösungsmittel zur Bildung einer Lösung, worin das Molverhältnis von (i) zu (ii) zu (iii) von etwa 7:7:0,05 bis etwa 7:3:2 reicht,
(b) Trocknen der so gebildeten organischen Lösung unter Bildung einer festen Phase, z.B. eines Filmes oder Pulvers,
(c) Hydratisieren der festen Phase mit einer wässrigen Lösung, die einen pH von etwa 7,5 bis etwa 9,5 besitzt, um die stabile therapeutische liposomale Cyclosporinformulierung zu bilden.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung die therapeutische Lipidzusammensetzung, welche das negativ geladene Lipid und ein Cyclosporin, bevorzugt Cyclosporin, suspendiert in einer wässrigen Lösung mit einem pH im Bereich von etwa 7,5 bis etwa 9,1 umfaßt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Liposome unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von weniger als 0,2 µm. Weiterhin kann Cholesterin ebenfalls in das Liposom eingebaut werden, bevorzugt in Mengen bis zu 50 Mol-% des Phosphatidylcholins, um der Liposommembran Stabilität zu erteilen.
Die Erfindung liefert ein neues Verfahren und eine liposomale Formulierung mit als Zwischenschicht eingebautem Cyclosporin, welche bei der Lagerung stabil ist, eine therapeutisch effektive Menge des aktiven Inhaltsstoffes enthält und eine liposomale Cyclosporinformulierung mit reduzierter Toxizität bereitstellt. Das Verfahren der Erfindung liefert ein kommerziell leicht durchführbares Verfahren für die Herstellung von liposomalem Cyclosporin.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse von Tests wiedergibt, die zur Bestimmung einer Liposomenformulierung durchgeführt wurden.
Fig. 2 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse von Tests wiedergibt, die zur Bestimmung der Konzentration von verschiedenen Komponenten einer Liposomenformulierung durchgeführt wurden.
Fig. 3 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse von Tests wiedergibt, die zur Bestimmung der Molverhältnisse von DMPG in einer Liposomenformulierung durchgeführt wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wie hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck Liposom auf unilamellare Vesikel oder multilamellare Vesikel, wie sie in den US-Patenten 4 753 788 und 4 935 171 beschrieben sind, auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird. Der Ausdruck Einkapselung, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf den Einbau des Cyclosporins in die Liposomenmembran.
Das Verfahren zur beispielhaften Erläuterung der vorliegenden Erfindung beginnt mit der Herstellung einer Lösung, aus welcher Liposome gebildet werden. Kurz gesagt, eine Menge eines Phosphatidylcholins, eines Phosphatidylglycerins und von Cyclosporin wird in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform, unter Bildung einer Lösung aufgelöst. Die Lösung wird unter Bildung einer festen Lipidphase wie eines Films oder eines Pulvers verdampft, beispielsweise mit einem Rotationsverdampfer, einem Sprühtrockner oder mittels anderer Einrichtungen. Der Film wird dann mit einer wässrigen Lösung hydratisiert, die einen pH im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,5 besitzt, um eine Liposomendispersion zu bilden.
Multilamellare Liposome werden durch Inbewegunghalten der Dispersion, vorzugsweise unter Verwendung einer Dünnfilmverdampferapparatur, wie sie im US-Patent 4 935 171 beschrieben ist, hergestellt. Unilamellare Vesikel werden durch Anlegen einer Scherkraft auf eine wässrige Dispersion der Lipidfeststoffphase gebildet, z.B. durch Ultraschallbehandlung oder Anwendung einer Homogenisierapparatur wie eines Gaulin- Homogenisators oder einer französischen Presse (French press). Scherkraft kann ebenfalls unter Verwendung entweder von Injektion, Gefrieren und Auftauen, Wegdialysieren einer Detergenslösung von Lipiden oder nach anderen bekannten Methoden, welche zur Herstellung von Liposomen angewandt werden, angelegt werden. Die Größe der Liposome kann unter Anwendung einer Vielzahl von bekannten Techniken einschließlich Dauer der Scherkraft gesteuert werden. Bevorzugt wird die modifizierte Gaulin-Homogenisierapparatur, wie sie im US-Patent 4 753 788 beschrieben ist, zur Bildung von unilamellaren Vesikeln mit Durchmessern von weniger als 200 Nanometern bei einem Druck von 48 bis 90 MPa (7000 bis 13000 psi) und einer Temperatur von etwa der Aggregatumwandlung der Lipide angewandt. Methoden zum Inbewegunghalten bzw. Rühren oder zum Scheren von Lipiden zur Bildung multilamellarer oder unilamellarer Vesikeln sind auf dem Fachgebiet bekannt und per se kein Teil dieser Erfindung.
Distearoylphosphatidylcholin oder Ei-phosphatidylcholin (Ei-PC) sind bevorzugte Phosphatidylcholine zur Verwendung in der Erfindung. Geeignete Phosphatidylcholine schließen solche ein, welche aus Sojabohnen oder anderen pflanzlichen Quellen erhalten wurden, oder solche, welche teilweise oder vollständig synthetisch sind wie Diplamitoylphosphatidylcholin. Alle diese Stoffe sind im Handel erhältlich.
Das bevorzugte Phosphatidylglycerin zur Anwendung in der Erfindung ist Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG). Andere Phosphatidylglycerine, welche für die Verwendung geeignet sind, schließen Dilaurylphosphatidylglycerin (DLPG) ein. Diese beiden sind im Handel erhältlich.
Dimyristoylphosphatidinsäure kann anstelle von oder zusätzlich zu Phosphatidylglycerin verwendet werden. Die Inhaltsstoffe werden bevorzugt in Lösung in einem Molverhältnis von Phosphatidylcholin zu Phosphatidylglycerin oder Phosphatidinsäure zu Cyclosporin im Bereich von etwa 7:7:0,05 bis etwa 7:3:2, am meisten bevorzugt 7:5:2, eingegeben. Andere Molverhältnisse wie 7:5:1 bis 7:3:1 können ebenfalls mit im wesentlichen äquivalenten Ergebnissen verwendet werden.
Das bevorzugte organische Lösungsmittel ist Chloroform, jedoch können andere Lösungsmittel oder Kombinationen von Lösungsmitteln wie Ether, Methanol, Ethanol oder andere Alkohole ebenfalls verwendet werden.
Die bevorzugte wässrige Lösung für Zwecke der Hydratisierung ist eine gepufferte Lösung, z.B. 0,15 M Phosphatgepufferte Salzlösung (0,145 M NaCl, 0,003 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,0035 M Na&sub2;H&sub2;PO&sub4;) (PBS) mit einem pH von 7,8.
Die in Übereinstimmung mit dem zuvorgenannten Verfahren hergestellte Formulierung fängt einen hohen Prozentsatz von Cyclosporin, 60% oder darüber, ein, und sie ist bei der Lagerung stabil, was die therapeutische Verwendung der Formulierung kommerziell einfach macht. Die Formulierung kann ebenfalls lyophilisiert, aufbewahrt und rehydratisiert werden ohne Verlust an Wirksamkeit. Da Dosierungsanforderungen für freies Cyclosporin den medizinischen Anwendern wohlbekannt sind, ist die Menge des in der Liposomenformulierung der Erfindung eingeschlossenenen Cyclosporins, welche für die Unterdrückung von Immunansprechen in Säugetieren und insbesondere Menschen wirksam ist, dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Die Einkapselung von Cyclosporin in der beschriebenen Weise reduziert die Toxizität von vorhandenen therapeutischen Formulierungen und erhöht seine therapeutische Wirksamkeit.
Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verständlich, wobei diese der Erläuterung der Erfindung dienen, diese jedoch nicht beschränken sollen. Die Beispiele 1-6 geben Details der Bildung und sowohl die chemische als auch biologische Untersuchung des liposomalen Cyclosporins der Erfindung.

Beispiel 1

Eine Reihe von Cyclosporin enthaltenden Liposomenformulierungen wurde unter Anwendung der Rotationsverdampfertechnik hergestellt, bei welcher die Lipide und Cyclosporin in einem organischen Lösungsmittel (Chloroform) aufgelöst wurden und die so gebildet Lösung in einem Rotationsverdampfer getrocknet wurde. Der getrocknete Film wurde dann mit einer wässrigen Lösung, welche auf pH von 6,5 bis 9,1 gepuffert war, zur Bildung von multilamellaren Vesikeln hydratisiert.
Multilamellare Cyclosporinvesikel (Cyclosporin-MLVs) wurden aus Cyclosporinpulver (Mol.Gew. = 1201), Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG, Mol.Gew. = 684) und Ei-phosphatidylcholin (Mol.Gew. = 786) in einem Molverhältnis von 7:5:2 hergestellt. Ausgangslösungen (10 mg/ml) von Cyclosporin, DMPG und Ei-PC wurden in Chloroform hergestellt. Cyclosporin-MLVs wurden durch Kombination von 1,20 ml der Cyclosporinausgangslösung, 2,75 ml der Ei-PC-ausgangslösung und 1,70 ml der DMPG-ausgangslösung in einem 100 ml Rundkolben hergestellt. Das organische Lösungsmittel, Chloroform, wurde dann durch Anordnen des Rundkolbens an einem auf 95 Upm eingestellten Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 36ºC abgedampft. Die Cyclosporin-MLVs wurden gebildet, wenn 3,0 ml sterile 0,01M PBS, pH 7,8, erhitzt auf 52ºC, in den Rundkolben zugesetzt wurden, wobei der Rundkolben den Film aus Wirkstoff-Lipid enthielt und in einem erhitzten, auf 52ºC eingestellten Schüttler angeordnet war und mit 120 Upm für 20 Minuten rotieren gelassen wurde. Ein kleiner steriler Magnetrührstab wurde dann in den Rundkolben eingegeben, um die Entfernung des Films durch kräftiges Rühren (hohe Einstellung) bei niedriger Hitze (60ºC) für etwa 5-10 Minuten auf einem Heizplattenrührer zu unterstützen. Die Cyclosporin-MLVs wurden in ein steriles Reagenzglas überführt. Eine weitere Menge von 2,0 ml des sterilen PBS, pH 7,8, wurden in den Rundkolben gegeben, um den Kolben von irgendwelchen verbleibenden MLVs freizuspülen. Die zusammengegebenen MLVs wurden bei 2987 x g für 20 Minuten zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, und das MLV-Pellet wurde in 5,0 ml sterilem PBS, pH 7,8, resuspendiert. Die MLVs wurden bei 2987 x g für 20 Minuten erneut zentrifugiert. Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wurde das letztlich erhaltene MLV-Pellet in 5,0 ml sterilem PBS, pH 7,8 resuspendiert. Leer-MLVs (E-MLVs) wurden gleichzeitig mit den Cyclosporin-MLVs unter Anwendung derselben Arbeitsweisen, wie sie zuvor für die Cyclosporin-MLVs beschrieben wurden, mit der Ausnahme des Weglassens des Cyclosporins hergestellt. Bei dieser Arbeitsweise wurden Liposomen mit den folgenden Komponenten hergestellt:
#1. DMPG:Cyclosporin 10:1 Molverhältnis;
#2. Ei-PC:Cyclosporin 10:1 Molverhältnis; und
#3. Ei-PC:Cyclosporin 50:1 Molverhältnis
Jede der Liposomenproben wurde in Methanol auf 1:30 verdünnt, und es wurde die spektrophotometrische Analyse eingesetzt, um die Konzentration von Cyclosporin durch Bestimmung der optischen Dichte (O.D.) bei 214 nm unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 44.900 zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt, woraus ersichtlich ist, daß eine Liposomenformulierung, welche DMPG: Cyclosporin in einem Molverhältnis von 10:1 umfaßte, 0,57 mg/ml Cyclosporin einkapselt, was signifikant höher ist als solche der Formulierung mit Ei-PC.

Beispiel 2

Eine weitere Reihe von multilamellaren Vesikelproben, d.h. Liposomen, wurde in Übereinstimmung mit der in Beispiel 1 angegebenen Arbeitsweise hergestellt. Diese Proben waren wie folgt:
#1. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:5:1 Molverhältnis
#2. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 3:3:1 Molverhältnis
#3. Ei-PC:DMPG-Cyclosporin 5:3:1 Molverhältnis
Die MLV-Proben wurden in Methanol auf 1:30 verdünnt und es wurde die spektrophotometrische Analyse zur Bestimmung der Konzentration von Cyclosporin durch Bestimmung der O.D. bei 214 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 44.900 angewandt.
Die Ergebnisse der spektrophotometrischen Analyse sind in Fig. 2 gezeigt, woraus ersichtlich ist, daß MLVs, welche Ei-PC:DMPG:Cyclosporin in einem Verhältnis von 7:5:1 umfaßten, 0,63 mg/ml Cyclosporin einkapselten, was signifikant mehr ist als dieselben Zusammensetzungen bei anderen Molverhältnissen.

Beispiel 3

Eine weitere Reihe von multilamellaren Vesikeln wurde entsprechend der in Beispiel 1 angegebenen Arbeitsweise hergestellt, wobei die Konzentration von DMPG variiert wurde. Die Proben waren wie folgt:
#1. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:5:1 Molverhältnis
#2. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:7:1 Molverhältnis
#3. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:3:1 Molverhältnis
#4. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:1:1 Molverhältnis
Die Proben wurden auf 1:30 in Methanol verdünnt, und die Konzentration von Cyclosporin wurde wie in den vorangegangenen Beispielen bestimmt. Die Ergebnisse der spektrophotometrischen Analyse sind in Fig. 3 gezeigt, woraus ersichtlich ist, daß MLVs, die ein Molverhältnis von Ei-PC:DMPG:Cyclosporin von 7:5:1 haben, eine signifikant größere Menge von Cyclosporin (0,99 mg/ml) einkapseln, als dies MLVs,welche DMPG in niedrigeren oder höheren Mengen enthalten, tun.

Beispiel 4

Eine weitere Reihe von MLVs wurde entsprechend der in Beispiel 1 angegebenen Arbeitsweise hergestellt. In dieser Reihe wurde die Konzentration von Cyclosporin wie folgt variiert:
#1. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:5:1 Molverhältnis
#2. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:5:2 Molverhältnis
#3. Ei-PC:DMPG:Cyclosporin 7:5:0,5 Molverhältnis
Die vorangegangenen Proben wurden in Methanol auf 1:30 verdünnt, und die spektrophotometrische Analyse wurde zur Bestimmung der Konzentration von Cyclosporin durch Bestimmung der O.D. bei 214 nm unter Benutzung eines Extinktionskoeffizienten von 44.900 bestimmt.
Die Analyseergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie hieraus ersichtlich ist, war die Menge von eingekapseltem Cyclosporin im wesentlichen dieselbe bei allen drei Molwerten. Tabelle 1 Einkapselung bei variierenden Molverhältnissen von Cyclosporin

Beispiel 5

Eine weitere Reihe von Liposomen wurde entsprechend der in Beispiel 1 angegebenen Arbeitsweise hergestellt. Bei dieser Reihe wurde ein Molverhältnis von Ei-PC:DMPG:Cyclosporin von 7:5:2 für alle Liposome angewandt. Jedoch wurde der pH-Wert des Rehydratationspuffers zwischen Werten von 6,5 und 9,1 variiert.
Die Proben wurden dann in Methanol auf 1:30 verdünnt, und die Konzentration von Cyclosporin wurde wiederum durch spektrophotometrische Analyse bei 214 nm unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 44.900 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, woraus ersichtlich ist, daß der optimale Puffer-pH in Werten der % Wirkstoffgewinnung 7,8 beträgt, obwohl zufriedenstellende Ergebnisse bei pH-Werten im Bereich von 7,2 bis 9,1 erreicht wurden. Tabelle 2 Einfluß des pH auf die Einkapselungseffizienz
Aus den in den vorangegangenen Beispielen angegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß eine Liposomenformulierung, welche Ei-PC:DMPG:Cyclosporin in einem Molverhältnis von 7:5:0,5 bis 7:5:2 enthält, weit stärker effektiv bei der Einkapselung von Cyclosporin während des Verfahrens der Bildung ist als Formulierungen des Standes der Technik. Für optimale Ergebnisse ist es wesentlich, daß die Hydratation in einem Medium mit einem pH von etwa 7,0 bis etwa 9,5, vorzugsweise 7,8, unternommen wird.
Die Stabilität der Formulierungen dieser Erfindung wird durch das folgende Beispiel gezeigt.

Beispiel 6

Dieser Versuch wurde durchgeführt, um den Effekt von unterschiedlichen Temperaturen (4ºC, 25ºC und 37ºC) für variierende Zeitspannen (2 h, 24 h, 48 h) auf die Cyclosporin- MLV-Assoziation zu zeigen, wenn die Cyclosporin-MLVs frisch hergestellt oder im Anschluß an eine Lyophilisierung rehydratisiert worden waren. Es wurden MLVs mit eingebautem Cyclosporin mit einem Molverhältnis von 7:5:2 von Ei-PC:DMPG:Cyclosporin unter Anwendung der zuvor beschriebenen Arbeitsweise der Rotationsverdampfung hergestellt. Der Hydratisierungspuffer war PBS, pH 7,8. Im Anschluß an die Hydratation wurden die MLVs auf eine G50-80 Sephadexsäule in einer 5 ml Spritze aufgeschichtet und bei 2500 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Dies wurde zur Abtrennung von nichteingekapseltem Cyclosporin aus den MLVs mit eingebautem Cyclosporin durchgeführt.
Im Anschluß an das Zentrifugieren wurden Cyclosporin- MLV-pellets in PBS, pH 7,8, erneut suspendiert und gepoolt, um ein Gesamtvolumen von etwa 9 ml zu erhalten. Die gepoolten Proben wurden auf Cyclosporinkonzentration durch UV-Absorptionsspektrophotometrie untersucht. Das Gesamtprobenvolumen wurde dann in zwei Fraktionen von jeweils 4,5 ml aufgeteilt. Eine Fraktion wurde weiter in drei weitere Teilmengen (1,5 ml pro Teilmenge) unterteilt. Die andere Fraktion wurde auf -70ºC für wenigstens 2 Stunden eingefroren und dann lyophilisiert.
Die nichteingefrorenen Teilmengen (jeweils 1,5 ml), welche die frischen Cyclosporin-MLVs enthielten, wurden bei entweder 4ºC, 25ºC (Zimmertemperatur) oder 37ºC inkubiert und Proben (0,5 ml) wurden bei jedem Temperaturzustand nach 2 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden entnommen. Nach der Entnahme wurde jede Probe durch eine Sephadex-G50-80-Säule in einer 5 ml Spritze zentrifugiert, das Cyclosporin-MLV-pellet wurde wieder suspendiert und auf Cyclosporinkonzentration analysiert.
Die lyophilisierten Cyclosporin-MLVs wurden mit ausreichend sterilem entionisiertem Wasser rehydratisiert, um die Präparation auf das ursprüngliche Volumen zu bringen. Das rehydratisierte Material wurde auf Cyclosporinkonzentration analysiert und dann in drei Teilmengen von 1,5 ml unterteilt, diese wurden bei 4ºC, 25ºC (Zimmertemperatur) oder 37ºC aufbewahrt. Proben (0,5 ml) wurden von jedem Aufbewahrungszustand nach 2 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden entnommen und durch eine Sephadex-G50-80-Säule in einer 5 ml Spritze zentrifugiert, und jedes Cyclosporin-MLV-pellet wurde erneut suspendiert und auf Cyclosporinkonzentration analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefaßt. Tabelle 3 Frische Cyclosporin-MLVs Tabelle 4 Lyophilisierte und rehydratisierte Cyclosporin-MLVs
Die Werte zeigen vergleichbare Ergebnisse für sowohl frisch hergestellte als auch lyophilisierte, rehydratisierte Cyclosporin-MLVs, was anzeigt, daß das Verfahren der Lyophilisierung und Rehydratation die Assoziation des Cyclosporins mit den MLVs nicht signifikant veränderte. Beide Typen von Präparationen zeigten einen geringen Wirkstoffverlust nach 2 h Inkubation bei allen getesteten Temperaturen. Wenn die Präparationen jedoch bei 4ºC für 2 h aufbewahrt wurden, war die Assoziation von Cyclosporin mit den MLVs (15%-20% Wirkstoffverlust) besser als bei der Lagerung bei entweder 25ºC oder 37ºC (25%-35% Wirkstoffverlust).
Bei der Herstellung einer Cyclosporin-MLV-formulierung, welche stabil war und optimale Wirkstoffeinkapselung zeigte, wurden mehrere Faktoren untersucht, einschließlich verschiedenen Lipiden, deren Molverhältnissen und des pH des Hydratationspuffers. Da Cyclosporin ein hydrophobes Molekül ist und in die Lipidmembran eher als in den wässrigen Raum innerhalb des Liposoms eingebaut wird, wurde ein multilamellares Vesikel für die anfänglichen Experimente zum Maximieren des Lipidvolumens pro Vesikel ausgewählt.
Die ersten Untersuchungen wurden unter Verwendung eines Lipids mit Cyclosporin durchgeführt. DMPG:Cyclosporin-MLVs zeigten beträchtlich höhere Einkapselung als Ei-PC: Cyclosporin-MLVs. Dies kann Folge der Flexibilität von DMPG bei seiner Ubergangstemperatur, annähernd 23ºC (Zimmertemperatur) sein, was es ihm ermöglicht, ein großes Molekül wie Cyclosporin in der Liposomendoppelschicht unterzubringen. Nicht-hydrogeniertes Ei-PC wurde verwendet, da Ei-PC, verschieden von synthetischen Lipiden, mehr als ein Lipid enthält, jedes mit unterschiedlichen Kettenlängen, welche ebenfalls die Unterbringung des großen Cyclosporinmoleküls innerhalb der Liposomendoppelschicht unterstützen können.
Wenn unterschiedliche Kombinationen von Lipiden, Ei-PC und DMPG zur Optimierung des Cyclosporineinbaues in Liposome und zur Minimierung seines Austretens aus den MLVs angewandt wurden, zeigte ein Molverhältnis von 7:5:1 für Ei-PC:DMPG:- Cyclosporin die höchste Menge an Wirkstoffeinkapselung. Dies legt es nahe, daß bei dem geeigneten Verhältnis die Eigenschaften von beiden Lipiden zu einer erhöhten Einkapselungseffizienz beitragen.
Zur weiteren Untersuchung der Assoziation von Cyclosporin mit dem negativ geladenen DMPG in der Liposomenmembran wurden Untersuchungen durchgeführt, um den Effekt der Variation des pH des hydratisierenden Puffers auf den Cyclosporinliposomeneinbau zu untersuchen. Die maximale Einkapselung wird beobachtet mit 0,15 M PBS, pH 7,8, wobei eine Modifizierung des pH über oder unter diesen Wert die Einkapselungseffizienz weiter verändert. Unter Verwendung eines Hydratisierungspuffers mit einem pH zwischen 6,5 und 9,5 ergeben sich Wirkstoffgewinnungen im Bereich von 25 bis fast 88%.
Die Untersuchungen der fertigen Formulierungen wurden unter Verwendung von erhöhten Mengen von Cyclosporin in der Liposomenformulierung zur Erniedrigung des Verhältnisses von Lipid zu Wirkstoff durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten, daß eine 2-fache Erhöhung im Molverhältnis von Cyclosporin (7:5:2 Molverhältnis, Ei-PC:DMPG:Cyclosporin) den Prozentsatz von anfänglich in den Liposomen aufgenommenen Wirkstoff nicht veränderte. Dies ist wichtig, da stärkere Cyclosporin-MLVs mit weniger Lipid hergestellt werden können, was die zur Herstellung einer vorgegebenen Menge von eingekapseltern Wirkstoff erforderlichen Kosten und die erforderliche Zeit herabsetzen.
Es wurden Tests unternommen, um die therapeutische Wirksamkeit der liposomalen Cyclosporinformulierungen der Erfindung zu bestimmen. Die Materialien und Methoden sind in den folgenden Abschnitten beschrieben, und die Tests sind im einzelnen in den Beispielen 7-12 angegeben.

Herstellung von Wirkstofformulierungen zur Behandlung von Mäusen

Freies Cyclosporin (Cyclosporin-CreL) wurden durch Auflösen von 12 mg Cyclosporinpulver in 1,0 ml Cremophor-eL mit 0,1 ml 95%igem Ethanol und dann Erhitzen auf 50ºC hergestellt. Nachdem sich das Cyclosporin aufgelöst hatte, wurden 1,9 ml steriles 0,15 M PBS, pH 7,8, erhitzt auf 55ºC, zu der Lösung zugesetzt, was eine Cyclosporinkonzentration von 4 mg/ml ergab. Das verwendete PBS hatte folgende Zusammensetzung: 0,0028 M Mononatriumphosphat, 0,0072 M Dinatriumphosphat und 0,145 M Natriumchlorid. Die Lösung wurde weiter mit PBS verdünnt, um eine abschließende Cyclosporinkonzentration von 2,0 mg/ml zu erhalten. Zu 110 ml der 2,0 mg/ml Cyclosporinlösung wurden 9,0 ml steriles 0,15 M PBS, pH 7,8, zugesetzt, was eine Cyclosporinkonzentration von 0,2 mg/ml ergab. Drei unterschiedliche Konzentrationen von Cyclosporinlösung wurden dann hergestellt, weil die von den Mäusen erforderlichen Dosiswerte variierten, und es erforderlich war, das Volumen von injiziertem Material für alle Behandlungen vergleichbar zu halten (zwischen 0,1 bis 0,2 ml).
Cyclosporin-MLVs und E-MLVs wurden hergestellt, wie im zweiten Abschnitt von Beispiel 1 beschrieben. Die Konzentration von Cyclosporin in der Cyclosporin-MLV-suspension wurde in den Beispielen 7-12 unter Anwendung dere Beers-Lambertgleichung und des Extinktionskoeffizienten für Cyclosporin bei 238 nrn bestimmt, wenn der Wirkstoff in Methanol und Tetrahydrofuran (THF), Vol/Vol = 1:1, aufgelöst war. Das Cyclosporin wurde aus den Cyclosporin-MLVs durch Eingabe von 0,1 ml Cyclosporin-MLV-probe in ein Reagenzglas, das 1,4 ml absolutes Methanol enthielt, extrahiert. Das Reagenzglas wurde für etwa 10 Sekunden aufgewirbelt, es wurden 1,5 ml THF zugesetzt und die Lösung wurde erneut aufgewirbelt. Die E-MLV-probe wurde in ähnlicher Weise verarbeitet. Dieser Extraktionsvorgang ergab eine 1:30 Verdünnung der Cyclosporin-MLV-probe, diese wurde spektrophotometrisch bei 238 nm untersucht, verglichen gegen eine 1:30 Verdünnung der E-MLV-probe. Nachdem die Cyclosporinkonzentration bestimmt war, wurden 1 bis 2 ml Teilmengen von Cyclosporin-MLVs langsam auf -70ºC in einer Einfriereinrichtung Revco eingefroren. Nachdem die Proben vollständig durchgefroren waren, wurden sie lyophilisiert und bei -20ºC aufbewahrt. Vor der Verwendung wurden sie in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert, auf 37ºC für 10 Minuten erwärmt und dann erneut auf Cyclosporinkonzentration untersucht. Erforderlichenfalls wurde die Probe mit sterilem PBS, pH 7,8, verdünnt, um die geeignete Konzentration für die Injektion zu erreichen.

Tiermodell für Cyclosporinbehandlungen

Die in diesen Experimenten verwendeten Mäuse waren C57BL/GJ, weibliche Mäuse, mit einem Alter von 8 bis 16 Wochen. Die Mäuse wurden intravenös mit verschiedenen Dosen von Cyclosporin-MLVs und Cyclosporin-CreL zu unterschiedlichen Zeiten, abhängig von dem therapeutischen Schema geimpft. Am Tag der Tötung wurde Blut aseptisch entweder durch Herzpunktation oder durch retroorbitales Ausbluten entnommen. Das Serum wurde gesammelt und bei -20ºC für folgende Hämagglutinationsbestimmungen und Bestimmungen des Blutharnstoffstickstoffs (BUN) aufbewahrt. Einige Nieren wurden entfernt und in einer 10%igen Formalinlösung, pH 7,3, verdünnt mit 0,15 M PBS fixiert und bei 4ºC bis zur Sektion aufbewahrt. Die Milz wurde ebenfalls aseptisch entfernt und in sterilen Gewebehomogenisatoren homogenisiert. Die Milzhomogenate von jeder Behandlungsgruppe wurden gepoolt, auf 6,0 ml mit RPMI 1640 verdünnt und über 4,0 neutrophilem Isolationsmedium in einem 15 ml sterilen konischen Zentrifugenglas aufgeschichtet. Das Material wurde bei 225 x g für 30 Minuten bei 18-20ºC zentrifugiert. Das abgetrennte Lymphocytenband wurde aus dem NIM-Gradienten entfernt und mit 6,0 ml RPMI verdünnt. Die Zellen in diesem Band wurden bei 125 x g für 9 Minuten zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, das Pellet wurde in 6,0 ml RPMI resuspendiert und erneut bei 125 x g für 9 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde wiederum verworfen und das letztlich erhaltene Pellet wurde in 1,0 ml RPMI resuspendiert. Die Zellkonzentration und die Lebensfähigkeit dieses letztlich erhaltenen Pellets wurde durch Auszählen der Zellen, die mit 0,1% Trypanblau gefärbt waren, mit einer Hämacytometerzählkammer bestimmt. Die Konzentration wurde auf 5 x 10&sup6; Zellen/ml mit vollständigem RPMI (RPMI mit 10% Serum von neugeborenem Kalb, 2% Penicillin-Streptomycin und Glutamin) eingestellt. Diese Zellsuspension wurde dann für den modifizierten Jerne-Plaqueassay und den T-Lymphocytenblastogeneseassay verwendet.

Kennedyassay: modifizierter Jerne-Plaqueassay

Eine 1:5-Verdünnung von Meerschweinchenkomplement wurde durch Verdünnen des Komplements mit Magnesiumsalzlösung hergestellt; eine 5 x 10&sup5; Lymphocytensuspension wurde durch Verdünnen der 5 x 10&sup6; Zellsuspension 1:10 mit Magnesiumsalzlösung hergestellt. Eine 1%ige Suspension von roten Blutzellen vom Schaf (sRBC), welche 1:10 Verdünnung des Komplements enthielt, wurde durch Vermischen von 1,0 ml von 2% sRBC mit 1,0 ml einer 1:5 Verdünnung von Komplement hergestellt.
Der Kennedyassay (Kennedy, 1971) wurde in einer Gewebekulturschale mit flachem Boden und 96 Löchern angesetzt, und jede Lymphocytenprobe für eine vorgegebene Behandlungsgruppe wurde dreifach getestet. In jedes Loch wurden zugesetzt: 0,1 ml der Lymphocytensuspension in vollständigem RPMI-Gewebekulturmedium (5 x 10&sup5; Zellen/ml), 0,05 ml 1%iges sRBC mit 1:10 Komplement und 0,1 ml vollständiges RPMI. Einige der Kontrollöcher enthielten 0,1 ml der Lymphocytensuspension, 0,05 ml 1%iges sRBC ohne Komplement und 0,1 ml vollständiges RPMI. Zwei zusätzliche Kontrollöcher wurden präpariert, indem 0,05 ml 1%iges sRBC und 0,2 ml vollständiges RPMI in ein Loch gemischt wurden und 0,05 ml 1%iges sRBC mit 1:10 Komplement mit 0,2 ml RPMI in dem anderen Loch vermischt wurden. Die Kulturschale wurde dann in einer befeuchteten Umgebung (mit einem angefeuchteten Papiertuch ausgekleideter Trog) angeordnet und bei 4ºC für 1,25 Stunden inkubiert. Die Kulturschale wurde dann bei Zimmertemperatur für 20 Minuten gebracht und für 1,5 Stunden in einem 5% CO&sub2;/95% Luft-Inkubator bei 37ºC inkubiert. Im Anschluß an die letzte Inkubation wurde die Plaquebildung durch Auszählen der Plaques in jedem Loch mit einem Dunkelfeldmikroskop bei 400X und Durchschnittsbildung der Anzahl der Plaques in drei Löchern für jede Probe bestimmt. Die Ergebnisse sind als Plaquebildungs einheiten (PFU)/10&sup6; Zellen angegeben.

T-Lymphocyten-PHA-stimulation und Chemotaxisassay

Blastogenese der T-Lymphocyten wurde in einer Gewebekulturschale mit rundem Boden und 96 Löchern durchgeführt. In jedes Loch wurde 0,1 ml einer 5 x 10&sup6; Zellen/ml Lymphocytensuspension (isoliert für den Kennedyassay) eingegeben, welche von jeder Behandlungsgruppe präpariert worden war. Zellsuspensionsproben von jeder Behandlungsgruppe wurden im Duplikat durchgeführt. In jedes der Testlöcher wurden 0,1 ml einer 900 µg/ml Lösung von Phytohämagglutinin (PHA), verdünnt in RPMI 1640, und 0,05 ml vollständiges RMPI 1640 eingegeben. Die Kontrollöcher enthielten 0,1 ml der Lymphocytensuspension und 0,15 ml von vollständigem RPMI. Die Gewebekulturschale wurde dann für 60 Stunden in einem 5% CO&sub2;/95% Luft Inkubator bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubationsperiode bei 37ºC wurde das Material aus jedem Loch in ein Mikrozentrifugenglas pipettiert und bei 8320 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Jede überstehende Flüssigkeit aus dieser Zentrifugation wurde in ein anderes Mikrozentrifugenglas pipettiert und bei -20ºC gefroren gehalten, bis sie bei dem Chemotaxisassay eingesetzt wurde.
Mikroskopobjektträger wurden mit Säure in einem 1:1 Verhältnis von 3 M HCl und 95% Ethanol für 2 Stunden gewaschen, mit entionisiertem Wasser gespült und in 0,5% Gelatine für 5 Minuten zur Reduzierung irgendwelcher negativen Ladung eingeweicht. Die Objektträger wurden letztmalig mit destilliertem Wasser gespült und an Luft trocknen gelassen. Agarose für die Objektträger wurde durch Auflösen von 110 g Agarose und 0,25 g Gelatine in 50 ml destilliertem Wasser hergestellt. Diese Präparation wurde im Autoklaven behandelt, auf 47ºC abgekühlt, mit 50 ml angewärmtem RPMI 1640 gemischt und es wurden annähernd 3 ml dieser Lösung auf jeden Glasobjektträger pipettiert. Nachdem die Agarose sich verfestigt hatte, wurde eine Reihe von drei Löchern in der Agarose auf jedem Objektträger hergestellt.
Makrophagen wurden aus den Milzhomogenaten von nicht mit Wirkstoff behandelten C57BL/6J Mäusen unter Anwendung der NIM-Separationstechnik isoliert, da Makrophagen sich in dem Mischlymphocytenband dieses Gradienten lokalisieren. Die Lymphocyten/Monocytensuspension wurde dann auf 3 x 10&sup7; Zellen/ml in vollständigem RPMI 1640 eingestellt. Die drei Löcher in der Agarose auf jedem Objektträger wurden dann wie folgt gefüllt: 15 µl von 3 x 10&sup7; Zellen/ml in dem mittleren Loch, 15 µl RPMI in einem anderen äußeren Loch und 15 µl einer überstehenden Blastogeneseprobe in dem anderen äußeren Loch. Die Objektträger wurden in einer sterilen befeuchteten Kammer (sterile Petrischale, ausgekleidet mit befeuchtetem sterilem Filterpapier) angeordnet und in einem 5% CO&sub2;/95% Luft Inkubator bei 37ºC für 18 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Objektträger durch Eintauchen in absolutes Methanol und dann für 30 Minuten in 37%igen Formaldehyd, pH 7,3, fixiert; die Agarose wurde dann vorsichtig von den Objektträgern entfernt. Die Objektträger wurden mit Wright-Anfärbelösung gefärbt und auf Makrophagenwanderung durch Überprüfung hiervon mit einem Mikroprojektor und Ausmessen der Zellwanderung von dem Rand des Loches untersucht.

Hämagglutinationsassay von Serum aus sRBC-stimulierten Mäusen

Von jeder Maus erhaltene Serumproben wurden verwendet, um 2-fache serielle Verdünnungen (1:1 bis 1:1024) in 0,15 M PBS, pH 7,3, zu präparieren. Der Assay wurde in einer Gewebekulturplatte mit rundem Boden und 96 Löchern durchgeführt. In jedes Testloch wurden 0,05 ml von 0,5%igen sRBC (1 x 10&sup6; Zellen/ml) und 0,05 ml Serumprobe eingebracht; Kontrollöcher enthielten 0,05 ml von 0,5%igen sRBC und 0,05 ml von 0,15 M PBS, pH 7,3. Die Platte wurde auf einem Schüttler angeordnet und bei 100 Upm für 10 Minuten in Rotation versetzt, hieran schloß sich eine Inkubation von einer Stunde bei Zimmertemperatur an. Der Hämagglutinationstiter für jede Probe wurde durch Untersuchung der Löcher durch ein Dunkelfeldmikroskop bei 400X bestimmt.

Hämagglutinationsassay von Serum aus LPS-stimulierten Mäusen

Eine mit Lipopolysaccharid (LPS) gebundene sRBC-Suspension wurde hergestellt, wie von Andersson (1971) beschrieben. LPS aus Salmonella abortus equi wurde in sterilem 0,15 M PBS, pH 7,3, mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml aufgelöst. Das LPS (3,0 ml) wurde dann in einem Reagenzglas mit Schraubverschluß für zwei Stunden gekocht. Nach dem Erhitzen wurde das LPS auf 37ºC in einem Wasserbad abgekühlt, und es wurden 1,0 ml von gepackten sRBC zu dem LPS zugesetzt, gefolgt von einer weiteren Inkubation bei 37ºC für 45 Minuten. Die sRBC-LPS-Mischung wurde dann dreimal in 0,15 M PBS, pH 7,3, gewaschen und auf 1 x 10&sup7; Zellen/ml verdünnt. Die Serumproben für den Assay wurden dadurch hergestellt, daß zweifache Verdünnungen von jeder Probe mit 0,15 M PBS, pH 7,3, von 1:1 bis 1:2048 hergestellt wurden. Der Assay wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben, ausgenommen daß die sRBC- LPS-Suspension die 0,5% sRBC ersetzten.

Histologie von Mäusenieren im Anschluß an Cyclosporinbehandlung

Nach dem Einsetzen in gepuffertem Formalin für wenigstens 72 Stunden bei 4ºC wurden die Nieren weiter wie folgt fixiert: 2 Stunden in 70% Ethanol; 1,5 Stunden in 80% Ethanol; 1,5 Stunden in 90% Ethanol; drei Inkubationen für jeweils 1,5 Stunden in 100% Ethanol; zwei Inkubationen für jeweils 1,5 Stunden in dehydratisierendem Mittel und drei Inkubationen für jeweils 1,5 Stunden in Paraffin. Die Nieren wurden in Paraffin eingebettet und es wurden Schnitte von 6 µm erhalten. Die Schnitte wurden wie folgt gefärbt: zwei Eintauchungen in entwässerndes Mittel für eine Dauer von jeweils 2,5 Minuten, zweimal in 100% Ethanol für eine Dauer von jeweils 2 Minuten, 95% Ethanol für 2 Minuten, 70% Ethanol für 2 Minuten, Spülen in Wasser, Eintauchen in Hämatoxylin für 2,5 Minuten, Spülen in Wasser für 2 Minuten, Spülen in Säure-Alkohol, bis das Auslaugen von Hematoxylin aufhörte, erneutes Spülen in Wasser, zehnmaliges Eintauchen in Ammoniakwasser, Spülen in Wasser, Eosinfärbung für 1,5 Minuten, zehnmaliges Eintauchen in 95% Ethanol, zweimal in 100% Ethanol und zweimal in dehydratisierendem Mittel. Die Nierenschnitte wurden auf Nephrotoxizität durch mikroskopische Untersuchung der Schnitte bei 100X und 400X untersucht.

In Vitro antifungale Effekte von Cyclosporin

Drei Spezien von Aspergillus, A. fumigatus, A. flavus und A. niger, und die Hefe Cryptococcus neoformans wurden bei diesem Teil der Studie verwendet. Diese Kulturen stammten von der California State Polytechnic University, Pomona, mikrobiologische Kultursammlung und sind als Laborstämme #385, #359, #360 bzw. #608 bezeichnet. Das zum Wachsen dieser Organismen verwendete Kulturmedium war Sabouraud (SAB)-Dextrosebrühe und SAB-Dextroseagar (1,5%). Die in diesen Studien eingesetzten vier Spezies der Pilze wurden auf SAB-Agarschrägplatten gehalten. Die Aspergilluskulturen wurden alle 48 Stunden während einer Zeitdauer von 6 Tagen übertragen, bevor Sporen für den Test gesammelt wurden. Die Sporen wurden durch Waschen der Schrägplatten mit 1,5 ml steriler 0,85% Salzlösung gesammelt. Die Sporen wurden unter Verwendung einer Hämacytometerzählkammer ausgezählt, und die Anzahl der Sporen wurden auf 1 x 10³ Sporen/ml in 0,85% Salzlösung eingestellt. Die Hefezellen von C. neoformans wurden ebenfalls alle 48 Stunden während einer Zeitdauer von 6 Tagen vor dem Sammeln übertragen; jedoch wurden die Zellen unter Verwendung von SAB-Brühe gesammelt. Die Hefezellen wurden ebenfalls unter Verwendung einer Hämacytometerzählkammer ausgezählt, und die Anzahl der Zellen wurden auf 1 x 10³ Zellen/ml in SAB-Brühe eingestellt.
Zur Bestimmung der antifungalen Aktivität von Cyclosporin-CreL und Cyclosporin-MLVs wurden SAB-Platten mit den mit Wirkstoff behandelten Sporen (oder Hefezellen) wie folgt geimpft: 0,15 ml der Suspension mit 1 x 10³ Sporen/ml wurde in einem Reagenzglas mit der geeigneten Konzentration von Cyclosporin-MLVs oder Cyclosporin-CreL (1 µg, 5 µg, 10 µg oder 200 µg) vermischt, und es wurde ausreichend SAB-Brühe in jedes Reagenzglas, das unterschiedliche Wirkstoffkonzentrationen enthielt, zugesetzt, um ein Endvolumen von 0,5 ml in jedem Reagenzglas zu erreichen; jedes Glas wurde dann aufgequirlt und auf eine getrennte SAB-Platte gegossen, wobei mit einem sterilen gebogenen Glasstab eine gleichmäßige Verteilung herbeigeführt wurde; nach 36 Stunden der Inkubation bei 37ºC wurden die Kolonien ausgezählt und ihre Durchmesser gemessen.

Beispiel 7

Zur Bestimmung, ob die Einkapselung von Cyclosporin innerhalb MLVs ihre antifungale Aktivität in vitro veränderte, wurden Studien durchgeführt, um die antifungalen Effekte in vitro von Cyclosporin-MLVs und Cyclosporin-CreL auf der Hefe, Cryptococcus neoformans, und den Schimmeln, Aspergillus flavus, fumigatus und niger zu vergleichen. Sowohl die eingekapselte (Cyclosporin-MLV) als auch nicht-eingekapselte (Cyclosporin-CreL) hemmten die Anzahl der Kolonien von C. neoformans in vitro nach 36 Stunden Inkubation. Eine Konzentration von 1 µg Cyclosporin-MLV hemmte die Hefe um 50%, und 1 µg Cyclosporin-CreL reduzierte die Anzahl um 65%, relativ zu nichtbehandelten Kontrollproben. Mit erhöhten Konzentrationen von Cyclosporin-MLV oder Cyclosporin- CreL (5 µg, 10 µg und 200 µg) ergab sich eine weitere Abnahme der Koloniezählwerte von 38, 10 und 2 für Cyclosporin- MLVs und 3, 3 und 0 für Cyclosporin-CreL, verglichen zu einer Kolonieauszählung von 106 für nichtbehandelte Kontrollproben. Cyclosporin beeinflußte ebenfalls die Koloniegröße von C. neoformans. Wenn die Hefe Cyclosporin-CreL ausgesetzt wurde, ergab sich selbst bei so niedrigen Konzentrationen wie 1 µg eine Abnahme in der Größe von 87%, verglichen zu nichtbehandelten Kontrollproben. Ein vergleichbares Ausmaß der Hemmung der Koloniegröße von Hefe wurde beobachtet, wenn 5 µg oder 10 µg Cyclosporin-CreL eingesetzt wurden; es wurde keine nachweisbare Hefe beobachtet, wenn die Hefe mit 200 µg des Wirkstoffes behandelt wurde. Im Gegensatz dazu zeigte die Hemmung der Koloniegröße von Hefe bei Anwesenheit von variierenden Mengen von Cyclosporin-MLVs ein Dosisansprechen; bei 1 µg, 5 µg, 10 µg und 200 µg betrug die Abnahme der Koloniegrößen 33%, 67%, 80% bzw. 93%, verglichen mit der Kontrolle.
Obwohl Cyclosporin in beliebiger Form die Anzahl von Aspergillus spp. Kolonien nicht reduzierte, hemmte es dennoch die Koloniegröße von A. flavus, A. fumigatus und A. niger. Die Cyclosporin-MLVs reduzierten die Koloniegröße von A. flavus bei Konzentrationen von 1 µg, 5 µg, 10 µg und 200 µg um 50%, 78%, 92% bzw. 96%, relativ zu der nichtbehandelten Kontrollkultur. Das Cyclosporin-CreL zeigte jedoch eine stärker ausgeprägte Hemmung von A. flavus als die Cyclosporin-MLVs, da es die Koloniegröße relativ zu den Kontrollen um 60% für 1 µg, 85% für 5 µg, 96% für 10 µg und 98% für 200 µg reduzierte.
Die Cyclosporin-MLVs hemmten nicht die Koloniegröße von A. fumigatus bei Konzentrationen von 1 µg und 5 µg, jedoch bei 10 µg und 200 µg hemmte der Wirkstoff die Koloniegröße um 40% bzw. 96% relativ zu den Kontrollen. Im Gegensatz dazu hemmte Cyclosporin-CreL die Koloniegröße von A. fumiga us bei 5 µg wie auch bei den höheren Dosiswerten von 10 µg und 200 µg mit Reduktionen von 30%, 80% bzw. 96%, verglichen mit der nichtbehandelten Kontrolle.
Die Koloniegröße von A. niger wurde sowohl durch Cyclosporin-MLVs als auch durch Cyclosporin-CreL reduziert. Cyclosporin-MLVs reduzierten die Koloniegröße um 37%, 75%, 75% und 97,5%, relativ zu Kontrollen, bei Konzentrationen von 1 µg, 5 µg, 10 µg bzw. 200 µg. Das Cyclosporin-CreL zeigte größere Hemmung, da 1 µg, 5 µg und 10 µg die Koloniegröße um 87,5%, 87,5% bzw. 92,5% hemmten, verglichen mit den nichtbehandelten Kontrollen. Bei 200 µg war die Hemmung des Pilzwachstums vergleichbar für beide Formen des Wirkstoffes.
Diese Werte zeigen, daß die Einkapselung von Cyclosporin in MLVs die in vitro antifungale Wirksamkeit des freien Wirkstoffes für bestimmte Pilze reduziert, wenn er bei Dosiswerten von 10 µg oder darunter appliziert wird. Höhere Wirkstoffwerte (d.h. 200 µg für beide Formen des Wirkstoffes) haben eine vergleichbare antifungale Aktivität in vitro.

Beispiel 8

Zur Bestimmung, ob Cyclosporin-MLVs und Cyclosporin- CreL vergleichbare immunosuppressive Aktivität in vivo hatten, wurden C57BL/6J Mäuse mit beiden Formen des Wirkstoffes in Verbindung mit einer T-abhängigen Antigenentest von sRBC behandelt. Die B-Zellaktivität dieser Mäuse gegenüber diesem Antigen wurde dann durch Jerne-Plaqueassays und hämagglutinierende Antikörperserumtiter überwacht. Bei der ersten Reihe von Experimenten wurden Mäuse 5 mal mit variierenden Dosiswerten des Wirkstoffes behandelt. Die Ergebnisse des Jerne-Plaqueassays zeigten, daß Mäuse, welche mit sRBC beaufschlagt, jedoch nicht mit Cyclosporin behandelt worden waren, einen Plaque-bildenden Einheitswert (PFU) von 560/10&sup6; Zellen hatten. Wenn Mäuse, denen sRBC gegeben worden war, mit Empty-L behandelt wurden, ergab sich jedoch eine 1,5- fache Erhöhung des PFU-Wertes, verglichen mit nichtbehandelten, mit Antigen beaufschlagten Mäusen. Die mit 5 Dosen von 5, 15 oder 25 mg/kg von Cyclosporin-CreL behandelten Mäuse zeigten eine Reduzierung der Plaques von 25%, 57% bzw. 84%, verglichen mit sRBC beaufschlagten, nichtbehandelten Kontrollen. Mäuse, welche mit 1, 5, 15 oder 25 mg/kg von Cyclosporin-MLVs behandelt wurden, zeigten eine Reduzierung der Plaques um 45%, 54%, 68% bzw. 89% zu denjenigen der mit sRBC beaufschlagten, nichtbehandelten Kontrollen. Die Plaquewerte von Mäusen, welche mit fünf Dosen von 5 mg/kg (gesamt = 0,55 mg pro Maus) Cyclosporin-MLVs behandelt wurden, waren vergleichbar zu denjenigen von Mäusen, welche mit fünf Dosen von 15 mg/kg (gesamt = 1,65 mg pro Maus) Cyclosporin-CreL behandelt wurden.
Mausserum aus dem zuvorgenannten Experiment wurde auf hämagglutinierende Antikörpertiter untersucht. Ohne Beaufschlagung mit Antigen hatten nichtbehandelte Mäuse einen hämagglutinierenden Titer von 0. Die Mäuse, denen nur sRBC, sRBC und CreL oder sRBC und Empty-L gegeben worden war, hatten Titer von 1:853. Die Mäuse, denen sRBC und entweder 5 oder 25 mg/kg Cyclosporin-CreL gegeben worden war, zeigten eine Reduzierung des Antikörpertiters von 80% bzw. 99,5%, verglichen mit Mäusen, denen nur sRBC gegeben worden war. Die Mäuse, welche mit 1, 5, 15 oder 25 mg/kg Cyclosporin- MLVs behandelt waren, zeigten eine Abnahme von 97,5%, 99,5%, 99,5% bzw. 99,8% im Antikörpertiter, relativ zu den Mäusen, denen nur sRBC gegeben worden war, Daher hatten mit Cyclosporin-MLVs behandelte Mäuse niedrigere Antikörpertiter im Vergleich zu Mäusen, denen vergleichbare Dosiswerte von Cyclosporin-CreL gegeben worden war. Die Ergebnisse zeigten ebenfalls, daß weder eine CreL-Behandlung noch eine Behandlung mit Empty-L das Antikörperansprechen dieser Müuse auf sRBC veränderte.
Die T-Zellen aus den Mäusen, welche mit 5 Dosen von entweder Cyclosporin-CreL oder Cyclosporin-MLVs behandelt worden waren, wurden mit PHA im Anschluß an ihre Isolierung stimuliert. Ihre Fähigkeit zur Produktion des Lymphokins, Chemotaxin, wurde durch ein Chemotaxinassay gemessen und als chemotaktischer Index angegeben. Die nicht mit Cyclosporin behandelten Mäuse hatten einen chemotaktischen Index von 1,43. Mäuse, welche mit 5, 15 oder 25 mg/kg Cyclosporin-CreL behandelt worden waren, zeigten eine reduzierte Chemotaxinbildung, was durch eine Reduzierung des chemotaktischen Index um 3%, 37% und 50%, verglichen mit nichtbehandelten Kontrollmäusen, angezeigt wird. Mäuse, welche mit 5, 15 oder 25 mg/kg Cyclosporin-MLVs behandelt worden waren, hatten chemotaktische Indizes, welche um 36%, 44% bzw. 38,5% im Vergleich zu nichtbehandelten Mäusen reduziert waren. Daher zeigten Mäuse, denen nur 5 mg/kg Cyclosporin-MLVs gegeben worden war, eine Unterdrückung der Chemotaxinbildung vergleichbar zu derjenigen von Mäusen, welche mit 15 mg/kg Cyclosporin-CreL behandelt worden waren.

Beispiel 9

Bei einer nächsten Reihe von Experimenten wurde der immunosuppressive Effekt von niedrigeren Gesamtdosen von Cyclosporin-CreL und Cyclosporin-MLVs untersucht. Bei diesen in vivo Experimenten wurden die Mäuse mit 3 Dosen von entweder Cyclosporin-MLVs oder Cyclosporin-CreL behandelt. Die Ergebnisse des Jerne-Plaqueassays zeigten, daß mit sRBC beaufschlagte Mäuse, denen kein Cyclosporin gegeben worden war, Plaquewerte von 680 PFU/10&sup6; Zellen hatten. Mäuse, denen sRBC und CreL gegeben worden war, zeigten ebenfalls hohe Werte von Plaques (700), jedoch hatten mit sRBC beaufschlagte Mäuse, welche mit 3 Dosen von 5 mg/kg (gesamt = 0,33 mg pro Maus) oder 15 mg/kg (gesamt = 0,99 mg pro Maus) Cyclosporin-CreL behandelt worden waren, um 50% (340) bzw. 68% (220) reduzierte Plaquewerte, verglichen mit den mit nicht mit Cyclosporin behandelten Mäusen. Mit sRBC und 3 Dosen von entweder 5 mg/kg (gesamt = 0,33 mg pro Maus) oder 15 mg/kg (gesamt = 0,99 mg pro Maus) Cyclosporin-MLVs behandelte Mäuse zeigten mehr Immunosuppression in ihrem sRBC-Ansprechen (70% (200) bzw. 79% (140) Reduzierung) als Mäuse, welche mit vergleichbaren Dosen von Cyclosporin-CreL behandelt worden waren.
Wenn die Mausseren aus dem zuvor beschriebenen Experiment auf hämagglutinierende Antikörpertiter untersucht wurden, wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten, wie sie aus dem Jerne-Plaqueassay gefunden wurden, wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist. Tabelle 5 Antikörpertiter (sRBC-Beaufschlagung) bei drei Dosiswerten
In dem in Beispiel 9 angegebenen Test wurden C57BL/6J Mäuse mit 0,2 ml von 10%igem sRBC IP an den Tagen 0 und 4 geimpft. Die Mäuse wurden ebenfalls mit 3 intravenösen Dosen (Tage 0, 4 und 8) von Cyclosporin-CreL oder Cyclosporin-MLVs behandelt. Kontrollmäuse G1 wurden nur mit sRBC geimpft. Alle Mäuse wurden am 9. Tag getötet, und ein Hämagglutinierungsassay erfolgte an-Seren, die von 5 Mäusen/Gruppe gepoolt worden waren. Die Ergebnisse sind von 3 Wiederholungen von 5 Mäusen/Gruppe und sind als mittlerer Titer angegeben.
Die Mäuse, denen nur sRBC gegeben worden war, hatten Titer von 1:853, während mit sRBC und entweder 5 oder 15 mg/kg Cyclosporin-CreL behandelte Mäuse eine 2,5-fache bzw. 6,7-f ache Abnahme im Titer hatten, verglichen zu den nicht mit Cyclosporin behandelten Mäusen; mit sRBC und entweder 5 oder 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs behandelte Mäuse zeigten eine 6,7-fache bzw. 19,8-fache Abnahme. Eine vergleichbare Immunosuppression des sRBC-Ansprechens wurde bei Mäusen gefunden, denen 5 mg/kg Cyclosporin-MLVs und 15 mg/kg Cyclosporin-CreL gegeben worden war.
Wenn die T-Zellen aus Mäusen, welche dreimal mit Cyclosporin behandelt worden waren, mit PHA stimuliert und auf Chemotaxinbildung getestet wurden, konnten chemotaktische Indizes zur Messung der Aktivität von T-Zellen berchnet werden, wie in Tabelle 6 ersichtlich ist. Tabelle 6 Chemotaxinbildung von PHA-stimulierten T-Zellen
Bei dem in Beispiel 9 aufgeführten Test wurden C57BL/6J Mäuse mit 3 Dosen (Tage, 0, 4 und 8) von entweder Cyclosporin-CreL oder Cyclosporin-MLVs behandelt. Kontrollmäuse G1 erhielten keine Behandlung und G2 wurden mit CreL behandelt. Die Mäuse wurden am 9. Tag getötet und die T-Zellen wurden als die gemischte Lymphocytenbande unter Verwendung von Neutrophil Isolation Media (NIM) und aus 5 Mäusen/Gruppe gepoolt isoliert. Die Ergebnisse wurden aus 4 Wiederholungen von 5 Mäusen/Gruppe erhalten und sind als mittlere chemotaktischer Index angegeben.
Beim Experiment 1 zeigten nicht mit Cyclosporin behandelte Mäuse einen Index von 1,76, während mit entweder 5 oder 15 mg/kg Cyclosporin-CreL behandelte Mäuse eine Reduktion von 15% bzw. 33% des chemotaktischen Index zeigten, verglichen mit den nicht behandelten Mäusen. Die Indizes von mit 5 oder 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs behandelten Mäuse waren um 39% bzw. 49% niedriger als die nichtbehandelten Mäuse. Die Wiederholung dieses Experimentes zeigte sehr vergleichbare Ergebnisse mit einer Abnahme der chemotaktischen Aktivität von 26% und 37% für 5 bzw. 15 mg/kg Cyclosporin-CreL sowie eine Reduktion von 37% und 51% für 5 bzw. 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs. Bei beiden Experimenten war die immunosuppressive Aktivität von 15 mg/kg Cyclosporin-CreL und 5 mg/kg Cyclosporin-MLVs vergleichbar. CreL alleine zeigte keine signifikante Reduktion der durch PHA-stimuliertren Aktivität von T-Zellen.

Beispiel 10

Zur Bestimmung, ob Cyclosporin-MLVs und Cyclosporin- CreL vergleichbare immunosuppressive Aktivität für B-Zellen auf das primäre und sekundäre Ansprechen auf Beaufschlagung mit sRBC hatten, wurden C57BL/6J Mäuse dreimal mit jeder Form des Wirkstoffes im Anschluß an entweder eine oder zwei Antigenbeaufschlagungen behandelt. Der Jerne-Plaqueassay und ein Hämagglutinationsassay wurden angewandt, um das Ansprechen der B-Zellen zu messen. Zum Erhalt von zusätzlicher Information über die Art des bei dem Ansprechen gebildeten Antikörpers wurde sowohl ein direkter als auch ein indirekter Jerne-Plaqueassay an jeder Probe zur Bestimmung der IgM- bzw. IgG-Titer durchgeführt. Bei dem zur Untersuchung des Effektes von Cyclosporin auf das Primäransprechen auf sRBC ausgelegten Experiment wurden die Mäuse mit sRBC am Tag geimpft und mit Cyclosporin an den Tagen 0, 4 und 7 behandelt. Der Jerne-Plaqueassay von mit sRBC beaufschlagten Kontrollmäusen bei diesem Experiment zeigte 560 PFU/10&sup6; Zellen bei dem direkten Assay (IgM-Ansprechen) und 1040 PFU bei dem indirekten Assay (kombiniertes IgM- und IgG-Ansprechen). Mit 5 mg/kg Cyclosporin-CreL behandelte Mäuse zeigten eine schwach erhöhte Anzahl von Plaques sowohl bei dem direkten als auch dem indirekten Assay, verglichen mit den Kontrollmäusen. Mit 5 mg/kg Cyclosporin-MLVs behandelte Mäuse zeigten jedoch eine 3,5-fache Abnahme der Plaqueanzahl bei dem direkten Assay, verglichen mit den Kontrollmäusen. Diese Werte zeigen, daß Cyclosporin-MLVs stärker immunosuppressiv für die IgM-Bildung beim primären Ansprechen sind als Cyclosporin-CreL bei niedrigen Dosen.
Wenn die Hämagglutinationstiter aus den zuvorgenannten Mäusen untersucht wurden, waren die Werte vergleichbar in gewisser Hinsicht zu den Plaqueassays. Die mit 5 mg/kg Cyclosporin-CreL oder Cyclosporin-MLVs behandelten Mäuse zeigten eine 1,7-fache bzw. 5-fache Abnahme des Titers, verglichen mit den mit sRBC beaufschlagten Kontrollmäusen.
Wenn das sekundäre Ansprechen der mit sRBC beaufschlagten und mit Cyclosporin behandelten Mäuse untersucht wurde, wurde den Mäusen sRBC an den Tagen 0 und 4 und Cyclosporin (5 mg/kg) an den Tagen 4, 6 und 8 gegeben. Das IgM-Ansprechen von Cyclosporin-CreL Mäusen war vergleichbar zu demjenigen der Kontrollmäuse, zeigte jedoch keine Veränderung der Plaqueanzahl beim indirekten Assay, was eine Unterdrückung des IgG-Ansprechens gegenüber sRBC in diesen Mäusen nahelegt. Mit Cyclosporin-MLV behandelte Mäuse zeigten jedoch eine Abnahme sowohl des IgM- als auch des IgG-Ansprechens auf sRBC, verglichen mit den Kontrollmäusen. Diese Werte demonstrieren wiederum die größere immunosuppressive Aktivität von Cyclosporin-MLV verglichen mit äquivalenten Dosen von Cyclosporin-CreL.

Beispiel 11

Zur Untersuchung des Effekts von prophylaktischer Behandlung von Mäusen mit Cyclosporin-MLVs oder Cyclosporin- CreL auf das Ansprechen von B-Zellen und T-Zellen von Mäusen wurden die Mäuse prophylaktisch mit einer Dosis von entweder Cyclosporin-MLVs oder Cyclosporin-CreL behandelt, während Kontrollmäuse keine Wirkstoffbehandlung erhielten, vor der Beaufschlagung mit sRBC. Aus dem Jerne-Plaqueassay ist ersichtlich, daß mit sRBC beaufschlagte Kontrollmäuse Plaquewerte von 560 PFU/10&sup6; Zellen zeigten, und daß Mäuse, welche mit 15 mg/kg Cyclosporin-CreL an entweder dem ersten oder zweiten Tag vor der Beaufschlagung mit Antigen behandelt wor den waren, vergleichbare, jedoch niedrigere (420 bzw. 520) Plaquewerte im Vergleich zu den Kontrollmäusen zeigten. Andererseits hatten Mäuse, welche mit 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs am entweder 1. oder 2. Tag vor der sRBC-Beaufschlagung behandelt worden waren, niedrigere Plaquezahlen von 54% (300) bzw. 50% (280) bei dem Assay, verglichen mit der Kontrolle. Die mit 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs am 1. oder 2. Tag behandelten Mäuse zeigten eine Reduzierung von 28,6% bzw. 46% der Plaques, verglichen mit Mäusen, denen äquivalente Dosen von Cyclosporin-CreL gegeben worden waren. Therapeutisch mit 3 Dosen von 5 mg/kg Cyclosporin-MLVs (an den Tagen 0, 4 und 8) behandelte Mäuse zeigten die beste Reduzierung der Plaques mit einer 3-fachen Abnahme der Plaqueanzahl (180), verglichen mit der Kontrolle.
Ergebnisse wurden ebenfalls aus einem Hämagglutinationsassay erhalten, der an Seren von Mäusen in der zuvorgenannten Untersuchung durchgeführt wurde, wie in Tabelle 7 gezeigt ist. Tabelle 7 Antikörpertiter (sRBC-Beaufschlagung) mit einer Dosis
Bei dem zuvorgenannten Experiment wurden C57BL/6J Mäuse mit 0,2 ml 10%igem sRBC IP an den Tagen 0 und 4 geimpft. Die Mäuse wurden ebenfalls mit einer intravenösen Dosis (entweder am Tag-2 oder -1 relativ zu der sRBC-Beaufschlagung) von 15 mg/kg Cyclosporin-CreL oder Cyclosporin- MLVs behandelt. Kontrollmäuse G1 wurden mit sRBC an den Tagen 0 und 4 geimpft, jedoch nicht mit Cyclosporin behandelt, und G6 Mäuse wurden mit sRBC geimpft und therapeutisch mit 3 Dosen (Tage 0, 4 und 8) von 5 mg/kg Cyclosporin-MLVs behandelt. Alle Mäuse wurden am 9. Tag getötet, und es wurde ein Hämagglutinationsassay an den Seren, welche von 5 Mäusen/Gruppe gepoolt worden waren, durchgeführt. Die Ergebnisse stammen von 3 Wiederholungen von 5 Mäusen/Gruppe, angegeben als mittlerer Titer.
Mit sRBC beaufschlagte Mäuse, denen keine Cyclosporinbehandlung gegeben wurde, zeigten Titer von 1:1365. Mit 15 mg/kg Cyclosporin-CreL am Tag-1 oder -2 behandelte Mäuse zeigten eine 2-fache Abnahme im Titer, verglichen mit den Kontrollen. Es gab eine 32-fach größere Abnahme des Antikörpertiters von Mäusen, welche mit 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs am Tag-2 behandelt worden waren, verglichen mit einer vergleichbaren Dosis von Cyclosporin-CreL. Weiterhin hatten mit 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs am Tag-2 behandelte Mäuse Antikörpertiter, welche mit denjenigen von Mäusen vergleichbar waren, welche therapeutisch mit 3 Dosen von 5 mg/kg Cyclosporin-MLVs behandelt worden waren. Diese Werte zeigen, daß eine Einzeldosis von Cyclosporin-MLVs, abweichend von einer vergleichbaren Dosis von Cyclosporin-CreL, prophylaktisch angewandt werden kann, um in effektiver Weise das Immunansprechen auf sRBC zu unterdrücken.
Wenn die T-Zellen von den zuvorgenannten Mäusen mit PHA behandelt und auf Chemotaxinbildung untersucht wurden, waren die chemotaktischen Indizes der mit Cyclosporin-CreL und mit Cyclosporin-MLVs behandelten Mäuse nicht dieselben. Nicht mit Cyclosporin behandelte Kontrollmäuse zeigten einen Durchschnittsindex von 1,46, und mit 15 mg/kg Cyclosporin-CreL am Tag-1 oder -2 behandelte Mäuse hatten beide vergleichbare Indizes zu denjenigen der Kontrollmäuse. Mit 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs am Tag-1 oder -2 behandelte Mäuse zeigten jedoch Indizes, welche 26% bzw. 32% niedriger als diejenigen der Kontrollmäuse waren. Die mit Cyclosporin-MLVs am Tag-1 oder -2 behandelten Mäuse zeigten einen 23% bzw. 29% niedrigeren Index als Mäuse, welche mit einer vergleichbaren Dosis von Cyclosporin-CreL behandelt worden waren. Die mit 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs am Tag-2 behandelten Mäuse zeigten eine Immunosuppression vergleichbar zu derjenigen von Mäusen, welche therapeutisch mit 3 Dosen von 5 mg/kg Cyclosporin- MLVs behandelt worden waren. Diese Werte legen es nahe, daß sowohl das Ansprechen der T-Zellen als auch das Ansprechen der B-Zellen effektiv durch prophylaktische Behandlung mit Cyclosporin-MLVs unterdrückt werden kann, nicht jedoch mit äquivalenten Dosen von Cyclosporin-CreL.

Beispiel 12

Bei diesem Experiment wurden Mäuse mit Lipopolysaccharid (LPS) einem T-unabhängigen Antigen, beaufschlagt und mit entweder Cyclosporin-MLVs oder Cyclosporin-CreL behandelt, um den Effekt von beiden Mitteln auf das Ansprechen von B-Zellen von Mäusen zu bestimmen. Die Kontrollmäuse erhielten nur LPS. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Antikörpertiter (LPS-Beaufschlagung) von mit drei Dosen behandelten Mäusen
In Beispiel 12 wurde das Ansprechen der B-Zellen von C57BL/6J Mäusen, welche mit 1,0 mg LPS, IV an den Tagen 0 und 4 geimpft worden waren, untersucht. Die Mäuse in G5, G6, G7 und G8 wurden ebenfalls mit 3 intravenösen Dosen (Tage 0, 4 und 8) von Cyclosporin-CreL oder Cyclosporin-MLVs behandelt. Kontrollmäuse (G1) wurden weder mit Cyclosporin noch mit LPS behandelt, G2 wurden mit LPS geimpft, jedoch nicht mit Cyclosporin behandelt, G3 wurden mit LPS geimpft und mit CreL behandelt und G4 wurden mit LPS geimpft und mit Leer- Liposomen (Empty-Liposomen) behandelt. Alle Mäuse wurden am 9. Tag getötet und es wurde ein Hämagglutinationsassay an den aus 5 Mäusen/Gruppe gepoolten Seren durchgeführt. Die Ergebnisse stammen von 3 Wiederholungen von 5 Mäusen/Gruppe, angegeben als mittlerer Titer.
Wenn Mäuseseren auf Antikörpertiter auf LPS analysiert wurden, zeigten nicht mit Cyclosporin behandelte Kontrollmäuse einen Durchschnittstiter von 1:85. Mit entweder CreL oder Empty-L (Leer-Liposomen) behandelte Mäuse hatten Titer von 1:85, was keinen Effekt dieser Substanzen auf das Ansprechen von B-Zellen auf LPS anzeigt. In ähnlicher Weise zeigten Mäuse, welche mit 5 oder 15 mg/kg Cyclosporin-CreL behandelt worden waren, ebenfalls keine Abnahme in Antikörpertiter, verglichen mit den Kontrollmäusen. Jedoch zeigten mit 5 oder 15 mg/kg Cyclosporin-MLVs behandelte Mäuse eine 7,7-fache bzw. 6,5-fache Abnahme im Titer, verglichen mit sowohl den Kontrollmäusen als auch den Mäusen, denen eine vergleichbare Dosis von Cyclosporin-CreL appliziert worden war. Diese Werte zeigen, daß Cyclosporin-MLVs, im Gegensatz zu äquivalenten Dosen von Cyclosporin-CreL, das Ansprechen der B-Zellen auf ein T-unabhängiges Antigen unterdrücken können. Die Ergebnisse legen es daher ebenfalls nahe, daß das Ziel der Immunosuppression für die Cyclosporin-MLVs der das Antigen präsentierende Makrophage sein könnte, welcher das Ansprechen der B-Zellen auf sowohl T-unabhängige als auch T-abhängige Antigene beeinflussen könnte.
Ein "one-tailed sign"-Test wurde durchgeführt, um die Wahrscheinlichkeit der Differenz zwischen der Anwendung der Cyclosporin-MLVs gegenüber einer vergleichbaren Dosis von Cyclosporin-CreL zu bestimmen. Wenn jeder der drei immunologischen Assays getestet wurde, wurde gefunden, daß es eine 95%ige Wahrscheinlichkeit gab, das Cyclosporin-MLVs signifikant stärker immunosuppressiv als vergleichbare Dosen von Cyclosporin-CreL waren.
Obwohl diese Beschreibung unter Bezugnahme auf spezielle Anwendungen gegeben und erläutert wurde, sind die beinhalteten Prinzipien auf zahlreiche andere Anwendungen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sind, anwendbar. Die Erfindung ist daher nur beschränkt, wie dies durch den Umfang der beigefügten Ansprüche angezeigt wird.

Claims

1. Liposome, welche in einer wässrigen Lösung suspendiert und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie umfassen: (i) ein neutrales Phospholipid, (ii) ein negativ geladenes Phospholipid, ausgewählt aus Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphophatidylglycerin, Dilaurylphosphatidylglycerin und Dimyristoylphosphatidsäure, und (iii) ein Cyclosporin.

2. Liposome nach Anspruch 1, in denen (i) Lipidabschnitte besitzt, welche aus Fettsäureketten mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen bestehen.

3. Liposome nach Anspruch 1 oder 2, in denen die wässrige Lösung eine Pufferlösung mit einem pH von 5,5 bis 9,5 ist.

4. Liposome nach Anspruch 3, in denen die wässrige Lösung eine Pufferlösung mit einem pH von 7,0 bis 9,5 ist.

5. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in denen die Liposome unilamellar sind und einen Durchmesser von weniger als 0,2 µm besitzen.

6. Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Formulierung von liposomalem Cyclosporin, welches gekennzeichnet ist durch:

a. Auflösen (i) eines neutralen Phospholipids, (ii) eines negativ geladenen Phospholipids, ausgewählt aus Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphophatidylglycerin, Dilaurylphosphatidylglycerin und Dimyristoylphosphatidsäure, und (iii) eines Cyclosporins in einem organischen Lösungsmittel zur Bildung einer Lösung;

b. Trocknen der Lösung unter Bildung einer festen Phase;

c. Hydratisieren der festen Phase mit einer wässrigen Lösung zur Bildung der therapeutischen Formulierung von liposomalem Cyclosporin.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem (i) Lipidabschnitte besitzt, welche aus Fettsäureketten mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen bestehen.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei welchem die wässrige Lösung die wässrige Lösung eine Pufferlösung mit einem pH von 5,5 bis 9,5 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem die wässrige Lösung eine Pufferlösung mit einem pH von 7,0 bis 9,5 ist.

10. Verfahren nach einem der Anspruche 6 bis 9, bei welchem die Liposome unilamellar sind und einen Durchmesser von weniger als 0,2 µm besitzen.

11. Lyophilisat der wässrigen Liposomensuspension von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5.