DE60035669T2

DE60035669T2 - Neue in einem hydrogel isolierte cochleat-formulierungen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur verabreichung von biologisch aktiven molekülen

Info

Publication number: DE60035669T2
Application number: DE60035669T
Authority: DE
Inventors: Leila Newark ZARIF; Tuo Newark JIN; Ignacio Newark SEGARRA; Raphael Mannino
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey; Biodelivery Sciences Inc
Current assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey; Biodelivery Sciences Inc
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2020-01-25
Also published as: DK1143933T3; EP1143933B1; US20120294901A1; DE60035669D1; CY1106916T1; ATE367800T1; US20090028904A1; US20050186265A1; US20030228355A1; US6153217A; EP1143933A2; US20140220109A1; WO2000042989A2; PT1143933E; AU3213300A; ES2290019T3; CA2358505A1; US6592894B1; WO2000042989A3; JP2002535267A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Verfahren für die Herstellung eines neuartigen Verabreichungssystems mit auf Lipiden beruhenden Cochleaten, die von dem Verabreichungssystem mit auf Lipiden beruhenden Cochleaten abgeleiteten pharmazeutischen Zubereitungen, und die Verwendung dieser pharmazeutischen Zubereitungen, um eine effiziente systemische oder über die Schleimhäute erfolgende Verabreichung biologisch aktiver Moleküle zu erzielen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fähigkeit von biologisch aktiven Molekülen, oral verabreicht werden zu können, hängt von mehreren Faktoren ab. Das biologisch aktive Molekül muss in den Flüssigkeiten des Magen-Darm-Trakts löslich sein, damit das biologisch aktive Molekül für einen aktiven Transportmechanismus durch biologische Membranen transportiert werden kann, oder eine geeignete kleine Teilchengröße aufweisen, die durch die Peyer-Plaques im Dünndarm und durch das lymphatische System aufgenommen werden kann. Die Teilchengröße ist ein wichtiger Parameter, wenn orale Verabreichung erreicht werden soll (siehe Couvreur P. et al., Adv. Drug Delivery Reviews 10: 141–162, 1993).
Das Hauptproblem bei der Möglichkeit, Arzneimittel oral zu verabreichen, ist der Schutz des Arzneimittels vor proteolytischen Enzymen. Ein idealer Ansatz ist es, das Arzneimittel in ein hydrophobes Material einzubauen, so dass die wässrigen Flüssigkeiten nicht das System eindringen können. Auf Lipiden beruhende Cochleate sind ein ideales System, das diesen Zweck erreichen kann.
Die Vorteile von Cochleaten sind zahlreich. Die Cochleate haben eine nichtwässrige Struktur und folglich:

a) sind sie beständiger auf Grund geringerer Oxidation von Lipiden;
b) können sie in lyophilisierter Form gelagert werden, was die Möglichkeit bietet, sie für lange Zeiträume bei Raumtemperatur zu lagern, was vorteilhaft wäre für den weltweiten Transport und die Lagerung vor der Verabreichung;
c) behalten sie ihre Struktur sogar nach Lyophilisierung, während die Strukturen von Liposomen durch Lyophilisierung zerstört werden;
d) zeigen sie effizienten Einbau von biologisch aktiven Molekülen in die Lipid-Doppelschicht der Cochleatstruktur;
e) bieten sie die Möglichkeit, ein biologisch aktives Molekül in vivo langsam freizusetzen, in dem Maße, in dem die Cochleate sich auflösen;
f) weisen sie eine Lipid-Doppelschicht auf, die als Träger dient und aus einfachen Lipiden zusammengesetzt ist, die in Membranen von Tier- und Pflanzenzellen gefunden werden, so dass die Lipide nicht giftig sind;
g) können sie leicht und sicher produziert werden;
h) können sie als definierte Formulierungen hergestellt werden, die aus vorgegebenen Mengen und Verhältnissen von Wirkstoffen oder Antigenen zusammengesetzt sind.

Cochleat-Strukturen sind zuerst von D. Papahadjopoulos als ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von großen unilamellaren Vesikeln hergestellt worden (siehe US 4 078 052 ). Die Verwendung von Cochleaten für die Verabreichung von Protein- oder Peptidmolekülen für Impfstoffe ist in US 5 840 707 offenbart worden. Jedoch spricht keines dieser Patente die Bedeutung der Teilchengröße oder die wirkungsvolle orale Verabreichung von biologisch aktiven Molekülen an, die durch kleine Cochleate vermittelt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es ein Gegenstand dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines in einem Hydrogel isolierten Cochleats mit einer Teilchengröße von kleiner als ein Mikron zur Verfügung zu stellen. Das Verfahren enthält weiterhin die Schritte, die erforderlich sind, um mindestens ein biologisch aktives Molekül in einer therapeutisch wirksamen Menge in den in einem Hydrogel isolierten Cochleaten einzuschließen.
Ein „biologisch aktives Molekül" ist ein Molekül, das eine Rolle in den Lebensprozessen eines lebenden Organismus spielt. Das Molekül kann organisch oder anorganisch sein, ein Monomer oder ein Polymer sein, endogen in einem Wirtsorganismus vorkommen oder nicht, natürlich vorkommen oder in vitro synthetisiert sein, und dergleichen mehr. So schließen Beispiele Vitamine, Mineralien, Aminosäuren, Toxine, Mikrobizide, Mikroorganismenwachstum verhindernde Mittel, Cofaktoren, Enzyme, Polypeptide, Polypeptidaggregate, Polynukleotide, Lipide, Kohlenhydrate, Nukleotide, Stärken, Pigmente, Fettsäuren, Hormone, Cytokine, Viren, Organellen, Steroide und andere polyzyklische Strukturen, Zucker bzw. Saccharide, Metalle, Stoffwechselgifte, Wirkstoffe und dergleichen mit ein.
Diese und andere Gegenstände sind erhalten worden, indem man ein in einem Cochleat eingeschlossenes biologisch aktives Molekül zur Verfügung stellte, worin das Cochleat des biologisch aktiven Moleküls die folgenden Bestandteile enthält:

a) ein biologisch aktives Molekül,
b) ein negativ geladenes Lipid, und
c) eine kationische Komponente,

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur oralen Verabreichung einer biologisch wirksamen Menge des oben beschriebenen Cochleats an einen Wirt zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Cochleat des biologisch aktiven Moleküls oral verabreicht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1. Schema des Verfahrens, durch das die in einem Hydrogel isolierten Cochleate mit oder ohne Wirkstoff erhalten werden.
2a und 2b. Teilchengrößenverteilung (Gewichtsanalyse) von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, entweder mit Amphotericin B (AmB) beladen (2a) oder leer (2b), wie durch Laserlichtstreuung gemessen.
3a und 3b. Durch ein Mikroskop aufgenommene Bilder einer Mischung von Liposomen in Dextran, die in der Lösung eines PEG-Gels dispergiert wurden. Die kleinen schwarzen Punkte sind Dextranpartikel, die durch die Dispergierung der Dextranphase in der PEG-Phase gebildet wurden. Die großen offenen Kreise werden durch Verschmelzung kleiner Dextranpartikel gebildet. Die Verteilung der Liposomen bevorzugt die Dextranphase, wie durch die gelbe Farbe von AmB angezeigt wird. 3b. Durch ein Mikroskop aufgenommene Bilder der in 3a gezeigten Probe nach Behandlung mit einer Lösung von CaCl₂. Die schwarzen Objekte in den Kreisen, die durch einen Pfeil markiert sind, sind Cochleate, die durch die Zugabe von Ca²⁺-Ionen gebildet werden.
4a–4f. Durch ein Mikroskop aufgenommene Bilder der in 3a und 3b gezeigten Probe nach dem Waschen mit einem Puffer, der 1 mM CaCl₂ und 100 mM NaCl enthält. Die Cochleat-Partikel bilden Aggregate. 4b. Die in 4a gezeigte Suspension nach der Zugabe von EDTA. Die Cochleat-Partikel öffneten sich zu Liposomen mit einem Durchmesser von 1–2 Mikrometer und zeigten dadurch an, dass die tatsächliche Größe der Cochleat-Partikel weniger als 1 Mikrometer beträgt. 4c. Mit Zink entsprechend dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren ausgefällte mit AmB beladene in einem Hydrogel isolierte Cochleate. 4d. Die in 4c dargestellten Cochleate nach Behandlung mit EDTA. 4e. Leere in einem Hydrogel isolierte Cochleate, ausgefällt mit Zink entsprechend dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. 4f) Die in 4f dargestellten Cochleate nach Behandlung mit EDTA.
5. Mikrographen von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten nach Gefrierbruch.
6. Hemmung des Wachstums von Candida albicans durch mit AmB beladene in einem Hydrogel isolierte Cochleate bei 0,625 μg AmB/ml. Es wird mit AmB in DMSO und in AmBisome^® verglichen.
7. Effekt von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten auf die Entwicklungsfähigkeit von Candida albicans nach 30 Stunden.
8. Wirksamkeit von Amphotericin B enthaltenden Cochleaten und von Makrophagenkulturen.
9. Konzentrationen von Amphotericin B im Gewebe nach Verabreichung von Amphotericin B enthaltenden Cochleaten.
10. Änderung der Konzentration von AmB über die Zeit im Gewebe nach einmaliger Verabreichung von mit AmB beladenen in einem Hydrogel isolierten Cochleaten.
11. Konzentration von AmB im Gewebe 24 Stunden nach Behandlung durch einmalige Gabe und 24 Stunden nach Behandlung durch mehrmalige Gabe.
12. Wechselbeziehung zwischen der Konzentration von Amphotericin B im Gewebe und der Konzentration von Candida albicans nach Verabreichung von Amphotericin B enthaltenden Cochleaten.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert eine Lösung dafür, eine wirkungsvolle orale Verabreichung von Arzneimitteln zu erreichen, indem man mit einem neuen Verfahren kleine Cochleate herstellt. Der neue Ansatz beruht auf der Unverträglichkeit zweier Polymerlösungen, die beide wässrige Polymerlösungen sind. Wässrige zweiphasige Systeme von Polymeren werden häufig für die Reinigung von Proteinen eingesetzt, auf Grund einer Anzahl von Vorteilen wie Freiheit von der Notwendigkeit des Einsatzes organischer Lösungsmittel, geringe Oberflächenspannung und der Biokompatibilität von wässrigen Polymeren (siehe P. A. Albertsson „Verteilung von Zellpartikeln und Makromolekülen" (Partition of cell particles and macromolecules), 3. Ausgabe, Wiley NY 1986; und „Trennung unter Einsatz eines Systems mit wässriger Phase" (Separation using aqueous Phase System) D. Fisher Eds, Plenum NY, 1989). Es zum Beispiel bekannt, dass große polare Moleküle wie beispielsweise Proteine sich in einer viel höheren Konzentration in einer Polymerphase mit physikalischen Eigenschaften, die denen von Dextran ähnlich sind, ansammeln als in einer Polymerphase mit physikalischen Eigenschaften, die denen von PEG ähnlich sind (D. Forciniti, C. K. Hall, M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng. 38, 986, 1991).
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Verfügung gestellt für die Herstellung kleiner, auf Lipiden beruhender Cochleat-Partikel und daraus hergestellter Zubereitungen, die ein in den Partikeln eingebautes biologisch aktives Molekül enthalten. Die Cochleat-Partikel sind aus einer alternierenden Reihenfolge von Lipid-Doppelschichten und Kationen aufgebaut. Das biologisch aktive Molekül ist entweder in den Lipid-Doppelschichten oder im Zwischenraum zwischen den Lipid-Doppelschichten enthalten. Eines der Verfahren zur Herstellung der kleinen Cochleate umfasst: 1) Herstellung einer Suspension von kleinen unilamellaren Liposomen oder mit biologisch aktiven Molekülen beladenen Liposomen, 2) Mischen der Suspension der Liposomen mit Polymer A, 3) Zugabe, vorzugsweise durch Einspritzen, der Suspension von Liposomen in Polymer A zu einem anderen Polymer B, mit dem Polymer A nicht mischbar ist, wodurch ein wässriges zweiphasiges System von Polymeren erhalten wird, 4) Zugabe einer Lösung eines Kationen enthaltenden Salzes zu dem zweiphasigen System aus Schritt 3, so dass das Kation in das Polymer B und dann in die Partikel diffundiert, die aus Liposom und Polymer A bestehen, was die Bildung kleiner Cochleate erlaubt, 5) Auswaschen der Polymeren und Resuspendieren der leeren oder mit Wirkstoff beladenen Cochleate in einem physiologischen Puffer oder in irgendeinem geeigneten pharmazeutischen Vehikel.
Ein zweites Verfahren zur Herstellung der kleinen Cochleate schließt ein Tensid und ein biologisch aktives Molekül und ein Kation ein. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer wässrigen Suspension, die eine Mischung von Tensid und Lipid enthält;
b) Mischen der Suspension von Tensid und Lipid mit Polymer A;
c) Zugabe der Suspension aus Tensid und Lipid und Polymer A zu einer Polymer B enthaltenden Lösung, wobei Polymer A und Polymer B nicht mischbar sind, wodurch ein zweiphasiges Polymersystem erzeugt wird;
d) Hinzufügen einer Lösung einer kationischen Spezies zu dem zweiphasigen Polymersystem; und
e) Waschen des zweiphasigen Polymersystems, um das Polymer zu entfernen.

Ein Verfahren zur Lyophilisierung kann angewendet werden und der Komplex aus lyophilisiertem biologisch aktiven Molekül und Cochleat kann in weiche oder harte Gelatinekapseln, Tabletten oder andere Dosierungsformen gefüllt werden, für eine systemische Verabreichung, eine Verabreichung über die Haut oder über die Schleimhäute.
Dieses Verfahren führt zu einen kleinen Partikel mit einer engen Größenverteilung, das eine effektive orale Verabreichung von biologisch aktiven Molekülen erlaubt. Das biologisch aktive Molekül verteilt sich in einer oder in beiden Lipid-Doppelschicht(en) und im Zwischenraum und das biologisch aktive Molekül wird aus den Cochleat-Partikeln durch Dissoziation der Partikel in vivo freigesetzt. Alternative Wege der Verabreichung können systemische Wege sein wie beispielsweise intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Verabreichung oder Wege über die Schleimhäute wie beispielsweise intranasale, intraokulare, intravaginale, intraanale, parenterale oder intrapulmonäre Verabreichung. Geeignete Dosierungen können z. B. durch Dosis-Wirkungs-Experimente an Labortieren oder in klinischen Versuchen ermittelt werden, wobei das Körpergewicht des Patienten, die Absorptionsrate, die Halbwertzeit, die Schwere der Krankheit und dergleichen mehr in Betracht zu ziehen sind. Die Anzahl der Dosen, die tägliche Dosis und der Behandlungsverlauf können von Individuum zu Individuum unterschiedlich sein. Andere Wege der Verabreichung können dermale, transdermale oder intradermale Verabreichung sein.
Der erste Schritt des neuen Verfahrens der vorliegenden Erfindung, die Herstellung von kleinen Liposomen, kann durch Standardmethoden wie Ultraschallbehandlung oder Mikrofluidisierung oder andere verwandte Verfahren erfolgen (siehe zum Beispiel „Liposomentechnologie, Liposomenherstellung und verwandte Techniken" (Liposome Technology, Liposome Preparation and Related Techniques), herausgegeben von Gregory Gregoriadis, Vol. I, 2. Ausgabe, CRC Press, 1993).
Die Zugabe, vorzugsweise durch Einspritzen, der Suspension von Polymer A/Liposom zu Polymer B kann mechanisch erreicht werden durch das Verwenden einer Spritzenpumpe mit einer geeigneten kontrollierten Dosierrate, z. B. einer Rate von 0,1 ml/min bis 50 ml/min und vorzugsweise mit einer Rate von 1 bis 10 ml/min.
Die Lipide der vorliegenden Erfindung sind ungiftige Lipide und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, einfache Lipide, die in Membranen von Tier- und Pflanzenzellen gefunden werden. Vorzugsweise ist das Lipid ein negativ geladenes Lipid, besonders bevorzugt ein negativ geladenes Phospholipid und ganz besonders bevorzugt ein Lipid aus der Gruppe von Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylsäure und Phosphatidylglycerin. Die Lipide können auch kleine Mengen zwitterionischer Lipide, kationischer Lipide oder neutraler Lipide enthalten, die zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zu einem biologisch aktiven Molekül wie beispielsweise einem pegyliertem Lipid fähig sind.
Die Polymere A und B der vorliegenden Erfindung können irgendeiner Klasse von biokompatiblen Polymeren angehören, die ein wässriges zweiphasiges System bilden können. Zum Beispiel kann Polymer A, ohne darauf beschränkt zu sein, Dextran 200.000–500.000, Polyethylenglykol (PEG) 3.400– 8.000 sein; Polymer B kann, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA), Ficoll 30.000–50.000, Polyvinylmethylether (PVMB) 60.000–160.000, PEG 3.400–8.000 sein. Die Konzentration von Polymer A kann von 2–20 Gew.-% als Endkonzentration betragen, abhängig von den Eigenschaften des Polymers. Der gleiche Konzentrationsbereich kann auf Polymer B angewendet werden. Beispiele geeigneter zweiphasiger Systeme sind Dextran/PEG, 5–20 Gew.-% Dextran 200.000–500.000 in 4–10 Gew.-% PEG 3.400–8.000; Dextran/PVP 10–20 Gew.-% Dextran 200.000–500.000 in 10–20 Gew.-% PVP 10.000–20.000; Dextran/PVA 3–15 Gew.-% Dextran 200.000–500.000 in 3–15 Gew.-% PVA 10.000–60.000; Dextran/Ficoll 10–20 Gew.-% Dextran 200.000–500.000 in 10–20 Gew.-% Ficoll 30.000–50.000; PEG/PVME 2–10 Gew.-% PEG 3,500–35.000 in 6–15 Gew.-% PVME 60.000–160.000.
Das biologisch aktive Molekül kann ein organisches Molekül sein, das in wässrigem Medium hydrophob ist. Das biologisch aktive Molekül kann ein Wirkstoff sein, und der Wirkstoff kann ein antiviraler Wirkstoff, ein Anästhetikum, ein antiinfektiver Wirkstoff, ein antimykotischer Wirkstoff, ein Krebs bekämpfender Wirkstoff, ein Immunosuppressivum, ein steroidaler entzündungshemmender Wirkstoff, ein nicht steroidaler entzündungshemmender Wirkstoff, ein Beruhigungsmittel oder ein gefäßerweiterndes Mittel sein. Beispiele schließen Amphotericin B, Acyclovir, Adriamycin, Cabamazepin, Melphalan, Nifedipin, Indomethacin, Naproxen, Östroge ne, Testosterone, Steroide, Phenytoin, Ergotamine, Cannabinoide, Rapamycin, Propanidid, Propofol, Alphadion, Echinomycin, Miconazolnitrat, Teniposid, Taxol und Taxoter ein.
Das biologisch aktive Molekül kann ein Polypeptid sein wie beispielsweise Cyclosporin, die Angiotensine I, II und III, die Enkephaline und ihre Analoga, ACTH, die entzündungshemmenden Peptide I, II, III, Bradykinin, Calcitonin, b-Endorphin, Dinorphin, Leukokinin, das Luteinisierungshormon freisetzende Hormon (LHRH), Insulin, die Neurokinine, Somatostatin, die Substanz P, das Thyreotropin-Releasinghormon (TRH) und Vasopressin.
Das biologisch aktive Molekül kann ein Antigen sein, aber das Antigen ist nicht auf Proteinantigene beschränkt. Das Antigen kann auch ein Kohlenhydrat oder ein Polynukleotid wie DNA sein. Beispiele für Antigenproteine schließen Glucoproteine der Hülle von Influenza- oder Sendaiviren, Membranproteine von Tierzellen, Membranproteine von Pflanzenzellen, Membranproteine von Bakterien und Membranproteine von Parasiten ein.
Das biologisch aktive Molekül wird aus den als Quelle dienenden Partikeln, Zellen, Geweben oder Organismen durch bekannte Methoden extrahiert. Die biologische Aktivität der biologisch aktiven Moleküle braucht nicht aufrechterhalten zu werden. Jedoch ist es in einigen Fällen (z. B. wenn ein Protein eine Membranen verschmelzende oder Liganden bindende Aktivität zeigt oder ein komplexe Konformation aufweist, die vom Immunsystem erkannt wird) wünschenswert, die biologische Aktivität aufrecht zu erhalten. In diesen Fällen wird ein Extraktionspuffer verwendet, der ein Tensid enthält, das die biologische Aktivität des Membranproteins nicht zerstört. Geeignete Tenside schließen ionische Tenside wie beispielsweise Cholatsalze, Desoxycholatsalze und dergleichen oder heterogene Polyoxyethylentenside wie Tween, BRIG oder Triton mit ein.
Die Anwendung dieses Verfahrens erlaubt die Rekonstitution von Antigenen, genauer gesagt Proteinen, in die Liposomen unter Erhalt der biologischen Aktivitäten und schließlich die effiziente Verbindung mit den Cochleaten. Dies vermeidet organische Lösungsmittel, Ultraschallbehandlungen oder extreme pH-Werte, Temperaturen oder Drücke, die alle eine schädliche Auswirkung auf eine effiziente Rekonstitution des Antigens in einer biologisch aktiven Form haben können.
In einem Hydrogel isolierte Cochleate können eine Kombination von verschiedenen biologisch aktiven Molekülen enthalten, soweit erforderlich.
Die Bildung von kleinen Cochleaten (mit einem biologisch aktiven Molekül oder ohne ein biologisch aktives Molekül) wird erreicht, indem man ein positiv geladenes Molekül der wässrigen zweiphasigen Polymerlösung hinzufügt, die Liposomen enthält. Im oben genannten Verfahren zur Herstellung von Cochleaten kann das positiv geladene Molekül ein mehrwertiges Kation und insbesondere jedes zweiwertige Kation sein, das die Bildung von Cochleaten verursachen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die zweiwertigen Kationen Ca⁺⁺+, Zn⁺⁺+, Ba⁺⁺ und Mg⁺⁺ oder andere Elemente, die fähig sind zur Bildung zweiwertiger Ionen oder anderer Strukturen, welche mehrere positive Ladungen aufweisen und dazu fähig sind, negativ geladene Lipide zu chelatisieren und zu überbrücken. Die Zugabe von positiv geladenen Molekülen zu Liposomen enthaltenen Lösungen wird auch benutzt, um Cochleate aus der wässrigen Lösung auszufällen.
Um die Cochleat-Strukturen zu isolieren und die Polymerlösung zu entfernen, werden die Cochleat-Niederschläge wiederholt mit einem Puffer gewaschen, der ein positiv geladenes Molekül und besonders bevorzugt ein zweiwertiges Kation enthält. Die Zugabe eines positiv geladenen Moleküls zu dem Waschpuffer stellt sicher, dass die Cochleat-Strukturen während des Waschschrittes erhalten bleiben, und dass sie als Niederschläge erhalten bleiben.
Das Medium, in dem die Cochleate suspendiert werden, kann Salze wie beispielsweise Calciumchlorid, Zinkchlorid, Cobaltchlorid, Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat und Natriumcarbonat enthalten. Das Medium kann Polymere wie beispielsweise Tween 80 oder BRIG oder Triton enthalten. Das biologisch aktive Moleküle enthaltende Cochleat wird hergestellt, indem man in einen geeigneten biologisch annehmbaren Träger verdünnt (z. B. einen zweiwertige Kationen enthaltenden Puffer).
Die Cochleat-Partikel können darmgängig bzw. enterisch sein. Die Cochleat-Partikel können in Gelatinekapseln eingebracht werden und die Kapsel kann mit einem gegen Magensaft resistenten Überzug versehen werden.
In den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können bestimmte hydrophobe Materialien hinzugefügt werden, um verbesserte Absorptionseigenschaften für die orale Verabreichung von biologisch aktiven Molekülen zur Verfügung zu stellen. Diese Materialien werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus langkettigen Carbonsäuren, langkettigen Carbonsäureestern, langkettigen Carbonsäurealkoholen und Mischungen davon besteht. Die hydrophoben Materialien können entweder am Anfang dem Lipid vor der Bildung der Liposomen zugegeben werden oder in einem späteren Schritt in Form eines Fettvehikels wie beispielsweise einer Emulsion.
Der Fachmann kann die wirksamsten und therapeutisch sinnvollsten Mittel für die Durchführung einer Behandlung im Rahmen der Ausführung der vorliegenden Erfindung ermitteln. Es kann auch auf eine der zahlreichen Autoritäten und Nachschlagewerke verwiesen werden, einschließlich z. B. „Goodman & Gillman's, Die pharmazeutischen Grundlagen der Therapeutik" (The Pharmaceutical Basis for Therapeutics), (6. Ausgabe, Goodman et al. (Hrsg.), MacMillan Publ. Co., New York, 1980).
Die Erfindung wird nun durch Beispiele beschrieben werden, die nicht als die Erfindung beschränkend aufgefasst werden sollen. In den Beispielen beziehen sich, falls es nicht anders angegeben ist, alle Verhältnisse, Prozente und Mengen auf das Gewicht.
BEISPIELE
Beispiel 1. Herstellung von leeren, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten aus Dioleoylphosphatidylserin, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen unilamellaren Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Lösung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) in Chloroform (10 mg/ml) wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei 35 °C zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad (Laboratory Supplies Com., Inc.) mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) zeigt an, dass der mittlere Durchmesser 35,7 ± 49,7 nm beträgt.
Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) zeigt an, dass der mittlere Durchmesser des Cochleats 407,2 ± 85 nm beträgt (2b).
Beispiel 2. Herstellung von leeren in einem Hydrogel isolierten Cochleaten aus einer Mischung aus Dioleoylphosphatidylserin und 1,2-Distearoyl-sn-glycerin-3-phosphoethanolamin-n-(poly(ethylenglykol)-5000, DSPE-PEG), ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen unilamellaren Vesikeln.
Eine Lösung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) und 1,2-Distearoyl-sn-glycerin-3-phosphoethanolamin-n-(poly(ethylenglykol)-5000), (DSPE-PEG, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) in Chloroform (Gewichtsverhältnis von DOPS : DSPS-PEG = 100 : 1) wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei 35 °C zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad (Laboratory Supplies Com., Inc.) mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Phasenkontrast-Lichtmikroskopie zeigt die Bildung von einheitlichen, sehr kleinen, nadelartigen Cochleaten.
Beispiel 3. Herstellung von leeren, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten aus einer Mischung von Dioleoylphosphatidylserin und n-Octyl-beta-D-glucopyranosid, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren Vesikeln.
Eine Lösung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei 35 °C zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit einer Lösung von n-Octyl-beta-D-glucopyranosid (OCG) bei 1 mg/ml und bei einem Gewichtsverhältnis von DOPS : OCG von 10 : 1 hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann kurz in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt.
Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Phasenkontrast-Lichtmikroskopie zeigt die Bildung von einheitlichen, sehr kleinen, nadelartigen Cochleaten.
Beispiel 4. Herstellung von mit Amphotericin B beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit AmB beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und AmB in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei 40 °C zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar und gelb wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit AmB beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) zeigt an, dass der mittlere Durchmesser der mit AmB beladenen Cochleate 407,3 ± 233,8 nm betrug (2a).
Beispiel 5. Herstellung von mit Doxorubicin (DXR) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit DXR beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und (DXR) in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 25 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar und rosa wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit DXR beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
5 ml der in Schritt 1 erhaltenen Suspension von Liposomen wurden dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 6400 U/min zentrifugiert. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) bestätigte die Bildung von kleinen, mit DXR beladenen Cochleaten.
Beispiel 6. Herstellung von mit Cyclosporin A (CSPA) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit CSPA beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und CSPA in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit CSPA beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) bestätigte die Bildung von kleinen, mit CSPA beladenen Cochleaten.
Beispiel 7. Herstellung von mit Nelfinavir (NVIR) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit NVIR beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und NVIR in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ul traschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit NVIR beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) bestätigte die Bildung von kleinen, mit NVIR beladenen Cochleaten.
Beispiel B. Herstellung von mit Rifampin (RIF) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit RIF beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und RIF in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit RIF beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) bestätigte die Bildung von kleinen, mit RIF beladenen Cochleaten.
Beispiel 9. Herstellung von mit Vitamin A beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit Vitamin A beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Vitamin A (Retinol) ist empfindlich gegenüber Oxidation durch Luft und wird durch UV-Licht deaktiviert. Vitamin A ist geschützt, wenn es in Lipid-Doppelschichten eingebettet ist. Der Einbau wird wie folgt erreicht:
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und Vitamin A in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit Vitamin A beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert.
Beispiel 10. Herstellung von mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren (polyunsaturated fatty acid, PFA) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PFA) sind biologisch aktive Moleküle, die an der Steuerung des Cholesteringehalts im Blut beteiligt sind und die Vorstufen der Prostaglandine sind. PFA sind für Oxidation anfällig, weshalb sie nur in begrenztem Umfang in die Nahrung eingebracht werden können. PFA durchlaufen in Gegenwart von Sauerstoff eine Reihe von Reaktionen, die Autoxidation genannt werden und zu Aldehyden und dann zu Ketonen führen, die einen fischartigen unangenehmen Geruch und Geschmack haben. Die Einbettung von PFA in steife, eingerollte Lipid-Doppelschichten hilft, die Autoxidationskaskade zu verhindern. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von mit PFA beladenen Cochleaten ist das folgende:
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit PFA beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und PFA in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit PFA beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert.
Beispiel 11. Herstellung von mit Zimtöl (CinO) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit CinO beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und CinO in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei 40 °C zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit CinO beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert.
Beispiel 12. Herstellung von mit DNA beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit DNA beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Lösung von Dioleoylphosphatidylserin in Chloroform (10 mg/ml) wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit einer Lösung von pCMV-beta-gal-DNA in TE Puffer (in einer Konzentration von 1 mg/ml) hydratisiert, um eine Konzentration von DOPS : DNA von 10 : 1 und eine Konzentration von 10 mg Lipid/ml einzustellen. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt und dann einige Minuten lang gevortext.
Schritt 2: Herstellung von mit DNA beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die Mischung aus DNA und Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von CaCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert.
Beispiel 13. Herstellung von leeren, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Zink
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Lösung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei 35 °C zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchge führt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von ZnCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM ZnCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) bestätigte die Bildung von kleinen Cochleaten.
Beispiel 14. Herstellung von mit Amphotericin B beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Zink
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren, mit AmB beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) und AmB in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer bei 40 °C zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar und gelb wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
Schritt 2: Herstellung von mit AmB beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min. Eine Lösung von ZnCl₂ (100 mM) wurde der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer, der 1 mM ZnCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben. Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde zusätzlicher Waschpuffer in einem Volumenverhältnis von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4 Plus) bestätigte die Bildung von kleinen, mit AmB beladenen Zn-Cochleaten.
Beispiel 15. Mikroskopische Untersuchung von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Eine lichtmikroskopische Untersuchung wurde stufenweise allein mit dem Herstellverfahren durchgeführt, um einige mechanistische Details der Bildung der in einem Hydrogel isolierten Cochleate zu erhalten.
Die durch ein Mikroskop aufgenommenen Bilder, die man in 3a, b und 4a–f sehen kann, zeigen die morphologischen Veränderungen in jedem Herstellschritt der mit AmB beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleate, die mit Ca²⁺ Ionen ausgefällt werden. Als die Mischung aus AmB, Liposomen und Dextran in der PEG-Lösung dispergiert wurde, trat als Ergebnis eine Phasentrennung auf, wie in 3a gezeigt. Die Verteilung der Liposomen erfolgte bevorzugt in die dispergierte Dextranphase, was durch eine von AmB herrührende gelbe Farbe angezeigt wird. Diese Verteilung stellt sicher, dass Liposomen in jedem der Dextranpartikel isoliert sind. Die Zugabe von Calciumionen zu der kontinuierlichen Phase (PEG) führte zur Bildung von Niederschlägen in der dispersen Phase. Als Endprodukt wurden kleine, nadelförmige Cochleate gebildet und unter dem Mikroskop untersucht. Diese Cochleate öffneten sich bei Zugabe von EDTA und Chelatisierung durch das Calcium zu unilamellaren Vesikeln (4a, b). Die nadelförmige Morphologie wurde durch Rasterelektronenmikroskopie nach Gefrierbruch bestätigt (5). Ähnliche durch ein Mikroskop aufgenommene Bilder wurden erhalten für leere, in einem Hydrogel isolierte Cochleate und mit AmB beladene, in einem Hydrogel isolierte Cochleate, die durch Zn ausgefällt worden waren (4c, d) und für leere, in einem Hydrogel isolierte Cochleate, die durch Zn ausgefällt worden waren (4e, f).
Beispiel 16. Antimykotische Aktivität von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, die mit Amphotericin B beladen sind, in vitro
Hemmung des Wachstums von Candida albicans
Eine in vitro Untersuchung der Anfälligkeit von Hefen wurde durchgeführt, die die wachstumshemmenden und lethalen Effekte von mit AmB beladenen Cochleaten, AmBisomen (liposomale Formulierung von AmB) und AmB in DMSO vergleicht. Fünf Kolonien von frisch wachsenden Candida albicans wurden aus einer YPD Agarplatte (aus einer 48 Stunden Kultur) ausgewählt und zu 2 ml 2 × YPD Broth, pH 5,7 hinzugegeben. Die OD₅₉₀ dieser Vorratskultur wurde gemessen und die Dichte der Hefezellen wurde auf OD₅₉₀ = 0,1 eingestellt und 0,1 ml dieser Suspension wurde in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.
Mit AmB beladene Cochleate, AmB in DMSO und AmBisomen wurden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,078, 0,156, 0,3125, 0,625, 1,25 und 2,5 μg/ml AmB einzustellen. Die Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden unter vorsichtigem Schütteln bei 37 °C inkubiert und die Zelldichte wurde nach 0, 2, 4, 6, 24 und 30 Stunden mit einem Reader für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Molecular Devices Spectramax 340) gemessen. 6 zeigt, dass mit AmB beladene Cochleate einen stärkeren wachstumshemmenden Effekt als AmBisomen (liposomale Formulierung von AmB) haben.
Fungizider Effekt von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, die mit Amphotericin B beladen wurden.
Aliquoten von Hefezellen (50 μl) wurden aus den Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen entnommen und es wurde eine Verdünnungsreihe (bis 1 : 10.000 für das Auftragen auf Agarplatten) davon hergestellt und die Zellen wurden mit einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Fünfzig μl der verdünnten Hefezellen wurden auf YPD Agarplatten aufgetragen und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Hefekolonien wurden mit einem BioRad Fluor-S Multi-Imager gezählt, der mit Quanitity One^TM Software ausgerüstet war.
Mit AmBisome, AmB in DMSO und mit AmB beladenen Cochleaten (0,625 μg AmB/ml) behandelte Hefezellen wurden auf das Verhältnis der Kolonien bildenden Einheiten zur Gesamtzahl der Zellen nach 30 Stunden Inkubation untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die mit AmB beladenen Cochleate die größte lethale Wirkung auf die Hefezellen hatten, verglichen mit den anderen untersuchten antimykotischen Mitteln. Die Entwicklungsfähigkeit der Hefe nach Behandlung mit den mit AmB beladenen Cochleaten war annähernd 0 % und die Entwicklungsfähigkeit der Hefe nach Behandlung mit AmB in DMSO betrug 12 Das AmBisom war nicht so wirkungsvoll, mit einem Ergebnis von 52 Entwicklungsfähigkeit der Hefe (7).
Schutz von Makrophagen durch mit AmB beladene Cochleate.
Teilchen fressende Zellen wie beispielsweise Makrophagen, sind die erste Verteidigungslinie gegen viele Infektionen durch Mikroben. Jedoch ist gezeigt worden, dass viele Mikroben, die schwere klinische Infektionen beim Menschen verursachen, Makrophagen infizieren und die Zerstörung vermeiden.
Es ist möglich, dass in vivo die Makrophagen eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Cochleaten spielen, über einen Mechanismus in der Zelle. Da die Makrophagen auch eine wichtige Rolle bei der Verteidigung des Wirts und der Beseitigung von Pilzen und Parasiten spielen, ist es wichtig, die Wechselwirkung zwischen Makrophagen und Cochleaten zu untersuchen.
Die folgenden Beispiele zeigen, dass die Cochleate durch Makrophagen aufgenommen werden. Es wurde gefunden, dass den Makrophagen zugeführte hohe Dosen von AmB ungiftig waren und in einer biologisch aktiven Form in den Makrophagen verblieben. Mit AmB beladene Cochleate schützten die Makrophagen gegen eine Infektion durch Candida albicans, wenn sie vor oder nach der Pilzinfektion appliziert wurden.
Behandlung durch prophylaktische Gabe: J774A.1 Makrophagen (M) wurden auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Nebenkultur weitergezüchtet bei einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml in DMEM + 10 FBS. 100 μl mit AmB beladene Cochleate (AmBc 0,2, 0,6, 1,25 und 2,5 μg AmB/ml), Fungizon, oder leere Cochleate (EC in einer Konzentration von 2, 6, 12,5 und 25 μg Lipid/ml) wurden in der angegebenen Konzentration hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. 24 Stunden später wurde das Medium ersetzt. Dieser Schritt wurde zweimal durchgeführt. Candida albicans (CA) wurde der Platte in einer Konzentration von 2,5 × 10³ Zellen/ml hinzugefügt, ein Verhältnis von 1 : 200 in Bezug auf die Makrophagen. Die Platten wurden über Nacht unter den oben angegebenen Bedingungen inkubiert.
Im Anschluss an die 24 Stunden dauernde Inkubation wurden die Platten entfernt und untersucht. Das Medium wurde energisch abpipettiert, um die Zellen zu entfernen und zu zerstören, 25 μl dieser Suspension wurden auf Sabouraud Dextrose Agarplatten aufgebracht und dann über Nacht bei 37 °C in einem trockenen Inkubator gelagert. Am folgenden Tag wurden die koloniebildenden Einheiten („Colony Forming Unit”, CFU) von C. albicans gezählt. Die Daten in 8 weisen darauf hin, dass Makrophagen, die mit mit AmB beladenen Cochleaten beladen wurden, sehr wirkungsvoll die Pilzzellen töten.
Behandlung durch Gabe nach einer Infektion: J774A.1 Makrophagen (M) wurden auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Nebenkultur weitergezüchtet und dann über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Makrophagen mit CA in einem Verhältnis von 200 : 1 infiziert, dann wurde anschließend AmBc, Fungizon oder EC in den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellkulturen untersucht und die CFUs wurden bestimmt wie oben beschrieben.
Wenn M mit CA belastet wurden und anschließend die mit AmB beladenen Cochleaten zugesetzt wurden, war die Anzahl der CFUs wieder annähernd null. Diese Ergebnisse zeigen, dass Makrophagen mit AmB beladene Cochleate verschlingen und konzentrieren, da die Makrophagen gegen die Belastung durch C. albicans geschützt waren, nachdem das mit AmB beladene Cochleat abgewaschen worden war (8).
Im Gegensatz dazu war Fungizon, (AmB in Desoxycholat), die am weitesten verbreitete klinische Form von AmB, in vitro extrem giftig und lethal für die Makrophagen. Innerhalb von 5 Stunden nach der Applikation wurde in der Petrischale ei ne große Menge zellularer Rückstande gefunden, und es gab keine Anzeichen von entwicklungsfähigen Makrophagen.
Die mikroskopische Untersuchung zeigt, dass die mit AmB beladenen Cochleate auch bei den höchsten untersuchten Dosierungen für die Makrophagen ungiftig sind. Die mit AmB beladenen Cochleate werden in großem Umfang akkumuliert, was große gedehnte Vakuolen zur Folge hat. Nach Waschen der Makrophagen und erneuter 24 Stunden langer Inkubation hatten die meisten Vakuolen wieder ihre normale Form und Größe, aber einige waren merklich vergrößert. Es wurde sogar beachtet, dass einige Makrophagen sich mit den vergrößerten Vakuolen „bewegten". Mit AmB beladene Cochleate werden innerhalb der Vakuolen konzentriert und es ist wahrscheinlich, dass AmB über die Zeit allmählich freigegeben wird.
Beispiel 17: Auswertung der Gewebepenetration von AmB nach iv Verabreichung von mit Amphotericin B beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
Die Gewebepenetration von Amphotericin B ist nach iv Verabreichung ausgewertet worden. Gruppen (n = 5) von C57BL/6 Mäusen (20–23 g) wurden iv (0,625 mg/kg) mit AmB beladene Cochleate (0,05 ml/20 g) gegeben, mit einer ½ cc U 100 Insulinspritze mit einer Nadel der Größe 18 g ½. Zu vorgegebenen Opferzeiten (2, 5, 10, 20 und 40 Minuten, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 36 und 48 Stunden), wurde den Tieren Anästhesie verabreicht, es wurde durch Punktion des Herzens Blut entnommen, dann wurden sie getötet, seziert und die interessierenden Gewebe wurden entfernt (Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Nieren, Herz, Fett, Magen, Mageninhalt, Darm und Darminhalt) und gewogen. Für die Analyse auf AmB wurden die Proben mit einem Extraktionslösungsmittel gemischt (10 % Methanol, 35 % Wasser, 55 Ethanol), homogenisiert, mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Ein 90 μl Aliquot des Überstands wurde in ein Microvial überführt und eingespritzt in das HPLC-System in eine bei 40 °C gehaltene Nova-Pak C-18 Säule (3,9 × 150 mm, 4 μm Teilchengröße). Am photericin B wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min mit 29 % Methanol, 30 % Acetonitril und 41 % 2,5 mM EDTA eluiert und bei 408 nm detektiert. Die Konzentration von AmB wurde mit Hilfe einer Eichkurve eines externen Standards errechnet.
In 9 ist die Gewebeexposition nach einer einzigen iv Gabe von mit AmB beladenen Cochleaten gezeigt. Es kann eine hohe Durchdringung von Schlüsselgeweben wie Leber, Milz und Nieren beobachtet werden.
Beispiel 18: Orale Verabreichung von AmB, vermittelt durch mit AmB beladene in einem Hydrogel isolierte Cochleate.
Behandlung durch einmalige Gabe
Die orale Verfügbarkeit der mit AmB beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleate ist untersucht worden durch Verabreichung der Formulierung des Beispiels 2 in den Magen von über Nacht fastenden C57BL16 Mäusen (20–23 g). Ein Zehntel ml der Formulierung in einer Dosis von 10 mg/kg wurde 9 Mäusen verabreicht. Drei Mäuse aus jeder Gruppe wurden 1, 6 und 24 Stunden nach der Verabreichung getötet, anschließend wurde die Konzentration von AmB in den Organen und Geweben analysiert.
Gewebe- und Blutproben wurden wie folgt verarbeitet: Gewebe wurden 1/20 oder 1/10 verdünnt durch Zugabe von Extraktionslösungsmittel (H₂O 35 %, Methanol 10 %, Ethanol 55 % w/w/w nv/v/v) und mit einem Ultra-Turrax^® Gerät homogenisiert. Ein 0,5 ml Aliquot wurde entnommen, 1 min lang mit Ultraschall behandelt und 12 min lang bei 4 °C bei 7260 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein HPLC Microvial überführt und 30 μl wurden eingespritzt in eine analytische Säule (C-18, 3,9 × 150 mm, 4 μm Teilchengröße) bei 40 °C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml. Die bei 408 nm detektierte Konzentration von AmB wurde mit Hilfe einer Eichkurve eines externen Standards errechnet.
10 zeigt die Änderung der Konzentration von AmB über die Zeit in den Geweben über eine Zeitdauer von 24 Stunden. Obwohl nur Werte für drei Zeitpunkte abgebildet sind, kann man die Akkumulation in den Schlüsselgeweben (Leber, Lunge, Milz und Nieren) erkennen.
Behandlung durch mehrmalige Gabe
Zwei andere Gruppen von Mäusen erhielten 10 Tage lang eine Behandlung mit mehrmaligen Gaben mit 10 mg/kg/Tag und eine Gruppe wurde 24 Stunden nach der letzten erhaltenen Gabe und die andere Gruppe 20 Tage nach der letzten erhaltenen Gabe getötet. Zu den vorgegebenen Zeitpunkten wurden die Mäuse betäubt, getötet und seziert, um die Gewebe zu erhalten. Die Gewebe wurden wie bei der Behandlung durch einmalige Gabe verarbeitet und die Konzentration von AmB wurde durch HPLC bestimmt. Die 24 h nach der zehnten Gabe erhaltenen Ergebnisse sind in 11 bildlich dargestellt und zeigen, dass in einem Hydrogel isolierte Cochleate die Zufuhr von AmB in therapeutischen Konzentrationen über den Magen-Darm-Trakt ermöglichen.
Beispiel 19: Korrelation zwischen Biodistribution in gesunden und infizierten Mäusen und der Konzentration von Candida albicans im Gewebe nach oraler Gabe
12 zeigt den Zusammenhang zwischen der Konzentration von Amphotericin B im Gewebe (μg/g Gewebe auf der linken Skala) und der Wirksamkeit als Abnahme der Infektion mit Candida albicans (CFU/g auf der rechten Skala) nach oraler Gabe von mit AmB beladenen Cochleaten (12).
Nach oraler Gabe von 10 mg/kg/Tag über einen Zeitraum von 10 aufeinanderfolgenden Tagen an gesunde Mäuse fanden sich hohe Konzentrationen von AmB in den Nieren, gefolgt von der Lunge, der Milz, der Leber und dem Gehirn, das viel niedrigere Konzentrationen als die anderen Gewebe aufweist. Es ist gezeigt worden, dass ein Krankheitszustand die Pharmakokinetik von Arzneimitteln auf unterschiedlichen Ebenen beeinflusst. Dieses Phänomen kann man in dem Diagramm deutlich erkennen: Die Konzentration von AmB im Gewebe ist niedriger bei mit C. albicans infizierten Mäusen nach oraler Gabe von 10 mg/kg/Tag (die gleiche Dosis) über 15 Tage, 5 Gaben mehr als bei der gesunden Gruppe. Es zeigt auch eine Veränderung in dem Verteilungsmuster, in dem die Lunge das Zielgewebe mit den niedrigsten Konzentrationen ist.
Orale Gabe einer Formulierung mit AmB beladener Cochleate mit 10 mg/kg/Tag über 15 Tage ergab eine hohe Wirksamkeit. Die Abnahme der CFU/g im Nierengewebe beträgt etwa 3,5 Zehnerpotenzen für die Cochleat-Formulierung. In den Lungen rotten AmB Cochleat-Formulierungen C. albicans vollständig aus und beseitigen die Pilzinfektion den Lungen. Es wird deutlich, dass das auf Cochleaten beruhende Verabreichungssystem eine hohe Konzentration von AmB in infizierten Tieren zur Verfügung stellt. Dies korreliert mit der höheren Wirksamkeit, die bei der Cochleat-Formulierung beobachtet wird und zeigt, dass mit AmB beladene Cochleate ein geeignetes Vehikel für die orale Behandlung von systemischer Candidiasis sind.
Außerdem waren oral verabreichte, mit AmB beladene Cochleate auch bei der höchsten Dosis von 50 mg/kg ungiftig (es wurden keine Läsionen in den Nieren, dem Magen-Darm-Trakt und den anderen Organen von Mäusen gefunden, denen 10, 20 und 50 mg/kg mit AmB beladene Cochleate verabreicht worden waren). Diese hohe Dosis (50 mg/kg) entspricht dem 100-fachen der niedrigsten Dosis (0,5 mg/kg), die in dem Modell der mit Candida infizierten Mäuse 100 % Überlebensrate zeigte.

Claims

Verfahren zur Herstellung von auf Lipiden basierenden Cochleaten, mit den folgenden Schritten: a) Bereitstellen einer wässrigen Suspension von Liposomen, b) Mischen der Suspension von Liposomen mit Polymer A, c) Hinzufügen der Suspension von Liposomen und Polymer A zu einer Polymer B enthaltenden Lösung, wobei Polymer A und Polymer B nicht mischbar sind, wodurch ein zweiphasiges Polymersystem erzeugt wird, d) Hinzufügen einer Lösung einer kationischen Spezies zu dem zweiphasigen Polymersystem und e) Waschen des zweiphasigen Polymersystems, um die Polymeren zu entfernen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Hinzufügen der Suspension von Liposomen und Polymer A durch Injektion erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Liposomen aus Lipid gebildet sind, das negativ geladenes Lipid enthalten.
Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem das negativ geladene Lipid Phosphatidylserin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, bei dem das Lipid eine geringe Menge anderer Lipide enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das andere Lipid aus der Gruppe der zwitterionischen Lipide ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das andere Lipid aus der Gruppe der kationischen Lipide ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem die anderen Lipide ausgewählt sind aus der Gruppe der Lipide, die in der Lage sind, Wasserstoffbrückenbindungen zu einem biologisch wirksamen Molekül auszubilden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem das neutrale Lipid ein pegyliertes (mit Polyethylenglykol verknüpftes) Lipid ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem Polymer A mindestens ein aus der aus Dextran und Polyethylenglykol bestehenden Gruppe ausgewähltes Mitglied ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Konzentration von Polymer A in dem zweiphasigen Polymersystem eine Konzentration im Bereich von 2 bis 20 Gewichtsprozent ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem Polymer B mindestens ein aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Ficoll, Polyvinylmethylether und Polyethylenglykol ausgewähltes Mitglied ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Konzentration von Polymer B in dem zweiphasigen Polymersystem eine Konzentration im Bereich von 2 bis 20 Gewichtsprozent ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die zweiphasige Polymerlösung mindestens ein aus der Gruppe bestehend aus Dextran/Polyethylenglykol, Dextran/Polyvinylpyrrolidon, Dextran/Polyvinylalkohol, Dextran/Ficoll und Polyethylenglykol/Polyvinylmethylether ausgewähltes Mitglied ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die kationische Spezies ein Ion mit einer Ladungszahl von zwei oder mehr enthält.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die kationische Spezies ein Metallion mit einer Ladungszahl von zwei oder mehr enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem das Metallion in Form des Salzes einer anorganischen Säure zugegeben wird, wobei das Salz bevorzugt Calciumchlorid, Zinkchlorid oder Kobaltchlorid ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Lipidcochleate kleine Cochleate sind.
Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem die Größe der Cochleate weniger als μm beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem die Cochleate unter Verwendung kleiner unilamellarer Liposomen gebildet werden.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die wässrige Suspension von Liposomen ein biologisch relevantes Molekül enthält, wodurch die Cochleate ebenfalls das biologisch relevante Molekül enthalten.
Verfahren gemäß Anspruch 21, mit dem vorbereitenden Schritt der Herstellung der Suspension von Liposomen durch Erzeugen eines Films, der eine Mischung des biologisch relevanten Moleküls und des Lipids enthält, und In-Kontaktbringen des Films mit einer wässrigen Phase, um die wässrige Suspension kleiner unilamellarer Liposomen zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 21, bei dem das biologisch relevante Molekül in der wässrigen Phase vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 23, mit dem vorbereitenden Schritt der Herstellung von Liposomen durch In-Kontaktbringen eines Lipidfilms mit einer wässrigen Phase, die das biologisch relevante Molekül enthält, um die wässrige Suspension von Liposomen zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 21, mit einem vorbereitenden Schritt, in dem eine Suspension leerer Liposomen mit dem biologisch relevanten Molekül gemischt wird, um die Suspension von Liposomen zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 23, bei dem das biologisch relevante Molekül eine Ladung trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem das biologisch relevante Molekül positiv geladen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem das biologisch relevante Molekül negativ geladen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 23, bei dem das negativ geladene Molekül ein Polynukleotid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 29, bei dem das Polynukleotid DNS ist.
Verfahren zur Herstellung von auf Lipiden basierenden Cochleaten, mit den folgenden Schritten: a) Bereitstellen einer wässrigen Suspension, die eine Mischung aus Detergens und Lipid enthält, b) Mischen der Suspension von Detergens und Lipid mit Polymer A, c) Hinzufügen der Suspension von Detergens, Lipid und Polymer A zu einer Polymer B enthaltenden Lösung, wobei Polymer A und Polymer B nicht mischbar sind, wodurch ein zweiphasiges Polymersystem erzeugt wird, d) Hinzufügen einer Lösung einer kationischen Spezies zu dem zweiphasigen Polymersystem und e) Waschen des zweiphasigen Polymersystems, um die Polymeren zu entfernen.
Verfahren zur Herstellung von auf Lipiden basierenden Cochleaten gemäß Anspruch 31, bei dem das Detergens Octylglucosid ist.
Verfahren zur Herstellung von auf Lipiden basierenden Cochleaten gemäß Anspruch 31, bei dem das Cochleat ein biologisch wirksames Molekül enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 33, bei dem das biologisch wirksame Molekül eine Ladung trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 33, bei dem das biologisch wirksame Molekül positiv geladen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 33, bei dem das biologisch wirksame Molekül negativ geladen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 36, bei dem das negativ geladene Molekül ein Polynukleotid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 37, bei dem das Polynukleotid DNS ist.
Verfahren gemäß Anspruch 31, bei dem das biologisch wirksame Molekül in Schritt a zugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 33, bei dem das biologisch wirksame Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wirkstoffen, Polynukleotiden, Polypeptiden und Antigenen.
Verfahren gemäß Anspruch 40, bei dem das biologisch wirksame Molekül ein Wirkstoff ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus antiviralen Wirkstoffen, Anästhetika, antiinfektiven Wirkstoffen, antibakteriellen Wirkstoffen, antimykotischen Wirkstoffen, Krebs bekämpfenden Wirkstoffen, Immunosuppressiva, steroidalen entzündungshemmenden Wirkstoffen, nicht steroidalen entzündungshemmenden Wirkstoffen, Beruhigungsmitteln und gefäßerweiternden Mitteln.
Verfahren gemäß Anspruch 41, bei dem der Wirkstoff mindestens ein aus der Gruppe bestehend aus Amphotericin B, Acyclovir, Adriamycin, Cabamazepin, Melphalan, Nelfinavir, Nifedipin, Indomethacin, Naproxen, Östrogenen, Testosteronen, Steroiden, Phenytoin, Ergotaminen, Cannabinoiden, Rapamycin, Propanidid, Propofol, Alphadion, Echinomycin, Miconazolnitrat, Teniposid, Taxol, Taxoter und Rifampin ausgewähltes Mitglied ist.
Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem der Waschschritt Zentrifugieren des zweiphasigen Polymersystems zur Abtrennung des Cochleatniederschlags, Entfernen des Überstands, der das Polymer enthält, Resuspendieren des Niederschlags in einem Waschpuffer, Zentrifugieren des gewaschenen Niederschlags und gegebenenfalls ein- oder mehrfaches Wiederholen der Resuspendierungs- und Zentrifugierungsschritte umfasste.
Verfahren gemäß Anspruch 43, bei dem der Waschpuffer gelöste kationische Spezies enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 44, bei dem die kationische Spezies Ionen mit einer Ladungszahl von zwei oder mehr enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 45, bei dem die Ionen mit einer Ladungszahl von zwei oder mehr Metallionen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 46, bei dem die Metallionen aus Calcium und Zink ausgewählt sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 43 bis 47, bei dem die kationische Spezies in einer Konzentration von mindestens 1 mM im Waschpuffer enthalten ist.
Cochleat-Zusammensetzung mit: a) einem negativ geladenen Lipid, b) einer kationischen Komponente und c) einem von a) und b) verschiedenen biologisch relevanten Molekül, wobei die Cochleate eine mittlere Teilchengröße von weniger als 1 μm haben, und wobei die kationische Komponente ein Metallion mit einer Ladungszahl von zwei oder mehr ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül ausgewählt ist aus Vitaminen, Mineralien, Aminosäuren, Toxinen, Mikrobiziden, Mikroorganismenwachstum verhindernden Mitteln, Co-Faktoren, Enzymen, Polypeptiden, Aggregaten von Polypeptiden, Polynukleotiden, Lipiden, Kohlenhydraten, Nukleotiden, Stärke, Pigmenten, Fettsäuren, Hormonen, Cytokinen, Viren, Organellen, Steroiden und anderen Strukturen mit Mehrfachringstrukturen, Sacchariden, Metallen, Stoffwechselgiften und Wirkstoffen.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 50, bei der das biologisch relevante Molekül ein Wirkstoff ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus antiviralen Wirkstoffen, Anästhetika, antiinfektiven Wirkstoffen, antibakteriellen Wirkstoffen, antimykotischen Wirkstoffen, Krebs bekämpfenden Wirkstoffen, Immunosuppressiva, steroidalen entzündungshemmenden Wirkstoffen, nicht steroidalen entzündungshemmenden Wirkstoffen, Beruhigungsmitteln und gefäßerweiternden Mitteln.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 51, bei der der Wirkstoff mindestens ein aus der Gruppe bestehend aus Amphotericin B, Acyclovir, Adriamycin, Cabamazepin, Melphalan, Nelfinavir, Nifedipin, Indomethacin, Naproxen, Östrogenen, Testosteronen, Steroiden, Phenytoin, Ergotaminen, Cannabinoiden, Rapamycin, Propanidid, Propofol, Alphadion, Echinomycin, Miconazolnitrat, Teniposid, Taxol, Taxoter und Rifampin ausgewähltes Mitglied ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül Amphotericin B ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül Naproxen ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül ein Polypeptid ist ausgewählt aus Cyclosporin, Angiotensin I, II und III, Enkephalinen und deren Analoga, ACTH, entzündungshemmenden Peptiden I, II, III, Bradykinin, Calcitonin, b-Endorphin, Dinorphin, Leukokinin, Luteinisierungshormon freisetzendem Hormon (LHRH), Insulin, Neurokininen, Somatostatin, Substanz P, Thyreotropin-Releasinghormon (TRH) und Vasopressin.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül ein Antigen ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 56, bei der das Antigen ein Kohlenhydrat, ein Polynukleotid oder ein Protein ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 57, bei der das Protein-Antigen ausgewählt ist aus Glycoproteinen der Hülle von Influenza- oder Sendaiviren, Membranproteinen von Tierzellen, Membranproteinen von Pflanzenzellen, Membranproteinen von Bakterien und Membranproteinen von Parasiten.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül Vitamin A ist
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül eine mehrfach ungesättigte Fettsäure ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das biologisch relevante Molekül ein Polynukleotid ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 61, bei der das Polynukleotid DNS ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, bei der das Metallion ausgewählt ist aus Calcium, Magnesium, Zink und Barium.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49 oder 50, bei der das negativ geladene Lipid Phosphatidylserin ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 49 oder 50, die zusätzlich eine geringe Menge eines weiteren Lipids enthält, das ausgewählt ist aus zwitterionischen Lipiden, kationischen Lipiden und neutralen Lipiden.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 65, bei der das weitere Lipid ein neutrales Lipid ist, das Wasserstoffbrückenbindungen zu dem biologisch relevanten Molekül ausbildet.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß Anspruch 66, bei der das weitere Lipid ein pegyliertes (mit Polyethylenglykol verknüpftes) Lipid ist.
Cochleat-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 49 bis 67 oder das Produkt eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 48 zur Verwendung in einem Verfahren zur Verabreichung eines biologisch relevanten Moleküls an einen Wirt.
Verwendung einer Cochleat-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 49 bis 67 oder des Produkts eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 48 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Be handlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder zur Verabreichung eines biologisch relevanten Moleküls an einen Wirt.
Verwendung gemäß Anspruch 69, bei der die Zusammensetzung über einen mukosalen oder systemischen Weg verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 70, bei der die Zusammensetzung über einen mukosalen Weg verabreicht wird, der ausgewählt ist aus oraler, intranasaler, intraokularer, intraanaler, intravaginaler, parenteraler oder intrapulmonärer Verabreichung.
Verwendung gemäß Anspruch 71, bei der die Verabreichung oral erfolgt.
Verwendung gemäß Anspruch 71, bei der die Zusammensetzung ein Aerosol ist.
Verwendung gemäß Anspruch 70, bei der die Zusammensetzung über einen systemischen Weg verabreicht wird, der ausgewählt ist aus intravenöser, intramuskulärer, subkutaner, transdermaler oder intradermaler Verabreichung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Cochleat-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 49 bis 67 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.