ES2290019T3

ES2290019T3 - Nuevas formulaciones de cocleatos aislados en hidrogel, procedimiento de preparacion y su uso para la administracion de moleculas biologicamente relevantes.

Info

Publication number: ES2290019T3
Application number: ES00909961T
Authority: ES
Inventors: Leila Biodelivery Sciences Inc. ZARIF; Tuo Biodelivery Sciences Inc. JIN; Ignacio Biodelivery Sciences Inc. SEGARRA; Raphael Univ.of Med.& Dent.of New Jersey MANNINO
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey; Biodelivery Sciences Inc
Current assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey; Biodelivery Sciences Inc
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2020-01-24
Also published as: CA2358505C; US20030228355A1; US20050186265A1; EP1143933B1; DE60035669T2; DE60035669D1; JP2002535267A; CA2358505A1; US6153217A; US20140220109A1; AU3213300A; CY1106916T1; US20120294901A1; ATE367800T1; EP1143933A2; PT1143933E; WO2000042989A2; US20090028904A1; DK1143933T3; WO2000042989A3

Abstract

Un procedimiento para producir cocleatos basados en lípidos que comprende las etapas de: a) proporcionar una suspensión acuosa de liposomas; b) mezclar la suspensión de liposomas con polímero A; c) añadir la suspensión de liposomas/polímero A, a una disolución que comprende polímero B, en la que el polímero A y el polímero B son inmiscibles, creando así un sistema polimérico bifásico; d) añadir una disolución de una fracción catiónica al sistema polimérico bifásico; y e) lavar el sistema polimérico bifásico para eliminar los polímeros.

Description

Nuevas formulaciones de cocleatos aislados en hidrogel, procedimiento de preparación y su uso para la administración de moléculas biológicamente relevantes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para preparar un nuevo sistema de administración de cocleatos basado en lípidos, a las preparaciones farmacéuticas derivadas del sistema de administración de cocleatos basado en lípidos y al uso de estas preparaciones farmacéuticas para conseguir una eficaz administración sistémica y a las mucosas de moléculas biológicamente relevantes.

Antecedentes de la invención

La capacidad de las moléculas biológicamente relevantes para ser administradas a través de la vía oral depende de varios factores. La molécula biológicamente relevante debe ser soluble en los fluidos gastrointestinales, con objeto de que la molécula biológicamente relevante sea transportada a través de las membranas biológicas por un mecanismo de transporte activo, o tener un tamaño de partícula pequeño adecuado que pueda ser absorbido a través de las placas de Peyer del intestino delgado y a través del sistema linfático. El tamaño de partícula es un parámetro importante cuando se va a conseguir la administración por vía oral (véase Couvreur P. y col., Adv. Drug Delivery Reviews 10; 141-162, 1993).

La cuestión principal en la capacidad de administrar fármacos por vía oral es la protección del fármaco frente a las enzimas proteolíticas. Una metodología ideal es incorporar el fármaco en un material hidrófobo, de forma que los fluidos acuosos no puedan penetrar en el sistema. Los cocleatos basados en lípidos son un sistema ideal que puede conseguir este propósito.

Las ventajas de los cocleatos son numerosas. Los cocleatos tienen una estructura no acuosa, y por lo tanto:

a): son más estables debido a una menor oxidación de los lípidos;

b): pueden almacenarse liofilizados, lo que proporciona el potencial de ser almacenados durante largos períodos de tiempo a temperatura ambiente, lo que sería ventajoso para envíos a todo el mundo y para su almacenamiento antes de su administración;

c): mantienen su estructura incluso después de la liofilización, mientras que las estructuras en liposoma son destruidas por la liofilización;

d): muestran una eficaz incorporación de moléculas biológicamente relevantes en la bicapa lipídica de la estructura del cocleato;

e): tienen el potencial de una liberación lenta de una molécula biológicamente relevante in vivo al disociarse el cocleato;

f): tiene una bicapa lipídica que sirve como vehículo y está formada por lípidos simples que se encuentran en las membranas celulares animales y vegetales, por lo que los lípidos no son tóxicos;

g): se producen de forma fácil y segura;

h): pueden producirse como formulaciones definidas formadas por cantidades y proporciones predeterminadas de fármacos o de antígenos.

Las estructuras de los cocleatos fueron preparadas inicialmente por D. Papahadjopoulos como un intermedio en la preparación de grandes vesículas unilamelares (véase el documento US 4.078.052). El uso de cocleatos para administrar proteínas o moléculas peptídicas para vacunas se ha descrito en el documento US 5.840.707. Sin embargo, ninguna de estas patentes aborda la importancia del tamaño de partícula o la administración eficaz por vía oral de moléculas biológicamente relevantes mediada por cocleatos de pequeño tamaño.

Resumen de la invención

De acuerdo con lo anterior, es un objeto de esta invención proporcionar un procedimiento para obtener un cocleato aislado en hidrogel con un tamaño de partícula menor de un micrómetro. El procedimiento comprende adicionalmente las etapas necesarias para coclear al menos una molécula biológicamente relevante en los cocleatos aislados en hidrogel en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Una "molécula biológicamente relevante" es aquella que tiene un papel en los procedimientos biológicos de un organismo vivo. La molécula puede ser orgánica o inorgánica, un monómero o un polímero, endógena a un organismo hospedador o no, que aparece de forma natural o sintetizada in vitro, y similares. Por lo tanto, algunos ejemplos incluyen vitaminas, minerales, aminoácidos, toxinas, microbicidas, microbiostáticos, cofactores, enzimas, polipéptidos, agregados de polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, nucleótidos, almidones, pigmentos, ácidos grasos, hormonas, citocinas, virus, orgánulos, esteroides y otras estructuras multianulares, sacáridos, metales, venenos metabólicos, fármacos y similares.

Estos y otros objetos se han obtenido proporcionando una molécula biológicamente relevante cocleada, en la que la molécula biológicamente relevante comprende los siguientes componentes:

a): una molécula biológicamente relevante,

b): un lípido cargado negativamente, y

c): un componente catiónico,

en la que el tamaño de partícula de la molécula biológicamente relevante cocleada es menor de un micrómetro, y adicionalmente en la que la molécula biológicamente relevante es preferiblemente un fármaco.

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para administrar por vía oral a un hospedador una cantidad biológicamente eficaz del cocleato descrito anteriormente.

En una forma de realización preferida, el cocleato-molécula biológicamente relevante se administra por vía oral.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 Esquema del procedimiento mediante el cual se obtienen los cocleatos aislados en hidrogel, con o sin fármaco.

Figuras 2a y 2b Distribución del tamaño de partícula (análisis ponderal) de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con anfotericina B (AmB) (fig. 2a) o vacíos (fig. 2b) medida mediante dispersión de luz láser.

Figuras 3a y 3b Imágenes microscópicas de una mezcla de liposomas en dextrano dispersados en una disolución de gel de PEG. Los pequeños puntos negros son partículas de dextrano formadas dispersando la fase de dextrano en la fase de PEG. Los grandes círculos blancos se forman mediante la fusión de pequeñas partículas de dextrano. El reparto de los liposomas favorece la fase de dextrano, según se indica por el color amarillo de la AmB. 3b. Imágenes microscópicas de la muestra mostrada en la Fig. 3a después del tratamiento con una disolución de CaCl_{2}. Los objetos negros de los círculos, indicados por una flecha, son cocleatos formados mediante la adición de iones Ca^{2+}.

Figuras 4a-4f Imágenes microscópicas de la muestra mostrada en las Figs. 3a y 3b después del lavado con un tampón que contiene CaCl_{2} 1 mM y NaCl 100 mM. Los agregados están formados por las partículas de cocleatos. 4b. Suspensión mostrada en la Fig. 4a tras la adición de EDTA. Partículas de cocleato abiertas en liposomas con un diámetro de 1-2 micrómetros, lo que indica que el tamaño intrínseco de las partículas de cocleato está en un intervalo submicrométrico. 4c. Cocleatos aislados en hidrogel con AmB precipitados con cinc según el procedimiento descrito en el Ejemplo 4. 4d. Cocleatos mostrados en la fig. 4c tras un tratamiento con EDTA. 4e. Cocleatos aislados en hidrogel vacíos precipitados con cinc según el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. 4f) Cocleatos mostrados en 4f tras un tratamiento con EDTA.

Figura 5 Micrografías de cocleatos aislados en hidrogel tras la criofractura.

Figura 6 Inhibición del crecimiento de Candida albicans mediante cocleatos aislados en hidrogel cargados con AmB a 0,625 \mug de AmB/ml. Se realiza una comparación con AmB en DMSO y AmBisome^{R}.

Figura 7 Efecto de los cocleatos aislados en hidrogel sobre la viabilidad de Candida albicans después de 30 horas.

Figura 8 Eficacia de los cocleatos de anfotericina B y cultivos de macrófagos.

Figura 9 Niveles tisulares de anfotericina B tras la administración de cocleatos de anfotericina B.

Figura 10 Perfil temporal de la concentración tisular de AmB tras la administración de una única dosis de cocleatos aislados en hidrogel cargados con AmB.

Figura 11 Nivel tisular de AmB 24 h después de una única dosis y 24 h después de un régimen de dosis múlti-
ples.

Figura 12 Correlación entre el nivel tisular de anfotericina B y el nivel de Candida albicans tras la administración de cocleatos de anfotericina B.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una solución para conseguir la administración eficaz por vía oral de fármacos mediante la producción de cocleatos de pequeño tamaño usando un nuevo procedimiento. La nueva metodología se basa en la incompatibilidad entre dos disoluciones de polímero, siendo ambas acuosas. Los sistemas acuosos bifásicos de polímeros se usan ampliamente para la purificación de proteínas debido a diversas ventajas, tales como la libertad de no necesitar disolventes orgánicos, una leve tensión superficial y la biocompatibilidad de los polímeros acuosos (véase P. A. Albertsson en "Partition of ceil particles and macro-molecules", 3ª edición, Wiley NY 1986; y "Separation using aqueous Phase System" D. Fisher Eds., Plenum NY, 1989). Se sabe, por ejemplo, que grandes moléculas polares tales como las proteínas se reparten a una concentración mucho mayor en una fase de polímero con unas características físicas similares a las del dextrano que en una fase de polímero con unas características físicas similares a las del PEG (D. Forciniti, C. K. Hall, M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng. 38, 986 1991).

Según la presente invención se proporcionan procedimientos para preparar partículas de cocleatos de pequeño tamaño basadas en lípidos y preparaciones derivadas de las mismas, que comprenden una molécula biológicamente relevante incorporada en las partículas. Las partículas de cocleatos están formadas por una secuencia alternante de bicapas lipídicas/catión. La molécula biológicamente relevante está incorporada bien en las bicapas lipídicas o bien en el espacio entre las bicapas lipídicas. Uno de los procedimientos para preparar los cocleatos de pequeño tamaño comprende: 1) preparar una suspensión de pequeños liposomas unilamelares o de liposomas cargados con una molécula biológicamente relevante, 2) mezclar la suspensión de liposomas con polímero A, 3) añadir, preferiblemente mediante inyección, la suspensión de liposomas/polímero A, a otro polímero B en el que el polímero A no es miscible, dando lugar a un sistema acuoso bifásico de polímeros, 4) añadir una disolución de una sal catiónica al sistema bifásico de la etapa 3, de forma que el catión difunda en el polímero B y después en las partículas formadas por liposomas/polímero A, permitiendo la formación de cocleatos de pequeño tamaño, 5) eliminar los polímeros mediante lavado y resuspender los cocleatos vacíos o cargados con fármaco en un tampón fisiológico o en cualquier vehículo farmacéutico apropiado.

Un segundo procedimiento para preparar los cocleatos de pequeño tamaño comprende detergente y una molécula biológicamente relevante y un catión. El procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una suspensión acuosa que contiene una mezcla de detergente-lípido;

b) mezclar la suspensión de detergente-lípido con polímero A;

c) añadir la suspensión de detergente-lípido/polímero A, a una disolución que comprende polímero B, en la que el polímero A y el polímero B son inmiscibles, creando así un sistema polimérico bifásico;

d) añadir una disolución de una fracción catiónica al sistema polimérico bifásico; y

e) lavar el sistema polimérico bifásico para eliminar el polímero.

Puede aplicarse un procedimiento de liofilización, y el complejo molécula biológicamente relevante-cocleato liofilizado se puede introducir en cápsulas de gelatina dura o blanda, comprimidos u otra forma de dosificación, para su administración por vía sistémica, dérmica o a través de las mucosas.

Este procedimiento da lugar a una partícula de pequeño tamaño con un estrecho intervalo de tamaños que permite una eficaz administración por vía oral de moléculas biológicamente relevantes. La molécula biológicamente relevante se reparte en una o ambas bicapas lipídicas y espacio intermedio, y la molécula biológicamente relevante es liberada de las partículas de cocleato mediante la disociación de las partículas in vivo. Algunas vías de administración alternativas pueden ser sistémicas tales como intramuscular, subcutánea o intravenosa, o a través de mucosas tales como intranasal, intraocular, intravaginal, intraanal, parenteral o intrapulmonar. Las dosis apropiadas pueden determinarse mediante, por ejemplo, experimentos de dosis-respuesta en animales de laboratorio o en ensayos clínicos, y teniendo en cuenta el peso corporal del paciente, la tasa de absorción, la semivida, la gravedad de la enfermedad y similares. El número de dosis, la dosificación diaria y el curso del tratamiento pueden variar de un individuo a otro. Otras vías de administración pueden ser dérmica, transdérmica o intradérmica.

La primera etapa del nuevo procedimiento de la presente invención, que es la preparación de liposomas pequeños, puede conseguirse mediante procedimientos estándar tales como aplicación de ultrasonidos o microfluidificación u otros procedimientos relacionados (véase, por ejemplo, Liposome Technology, Liposome Preparation and Related Techniques, editado por Gregory Gregoriadis, Vol. 1, 2ª edición, CRC Press, 1993).

La adición, preferiblemente mediante inyección, de la suspensión de polímero A/liposoma en el polímero B puede conseguirse mecánicamente usando una bomba de jeringa a una tasa apropiada y controlada, por ejemplo, a una tasa desde 0,1 ml/min hasta 50 ml/min y preferiblemente a una tasa desde 1 hasta 10 ml/min.

Los lípidos de la presente invención son lípidos no tóxicos e incluyen, pero no se limitan a, lípidos simples que pueden encontrarse en las membranas celulares animales y vegetales. Preferiblemente, el lípido es un lípido cargado negativamente, más preferiblemente un fosfolípido cargado negativamente, e incluso más preferiblemente un lípido de grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico y fosfatidilglicerol. Los lípidos también pueden incluir cantidades menores de lípidos bipolares, lípidos catiónicos o lípidos neutros capaces de formar puentes de hidrógeno con una molécula biológicamente relevante tal como un lípido PEGilado.

Los polímeros A y B de la presente invención pueden ser de cualquier clase de polímeros biocompatibles que puedan producir un sistema acuoso bifásico. Por ejemplo, el polímero A puede ser, pero no se limita a, dextrano 200.000-500.000, polietilenglicol (PEG) 3.400-8.000; el polímero B puede ser, pero no se limita a, polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivinílico (PVA), ficoll 30.000-50.000, polivinilmetil éter (PVMB) 60.000-160.000, PEG 3.400-8.000. La concentración del polímero A puede variar entre el 2-20% p/p, ya que la concentración final depende de la naturaleza del polímero. Puede aplicarse el mismo intervalo de concentración para el polímero B. Algunos ejemplos de sistemas bifásicos adecuados son dextrano/PEG, 5-20% p/p de dextrano 200.000-500.000 en 4-10% p/p de PEG 3.400-8.000; dextrano/PVP, 10-20% p/p de dextrano 200.000-500.000 en 10-20% p/p de PVP 10.000-20.000; dextrano/PVA, 3-15% p/p de dextrano 200.000-500.000 en 3-15% p/p de PVA 10.000-60.000; dextrano/ficoll, 10-20% p/p de dextrano 200.000-500.000 en 10-20% p/p de Ficoll 30.000-50.000; PEG/PVME, 2-10% p/p de PEG 3.500-35.000 en 6-15% p/p de PVME 60.000-160.000.

La molécula biológicamente relevante puede ser una molécula orgánica que sea hidrófoba en medio acuoso. La molécula biológicamente relevante puede ser un fármaco, y el fármaco puede ser un antiviral, un anestésico, un antinfeccioso, un antifúngico, un anticanceroso, un inmunosupresor, un antiinflamatorio esteroideo, un antiinflamatorio no esteroideo, un tranquilizante o un agente vasodilatador. Algunos ejemplos incluyen anfotericina B, aciclovir, adriamicina, cabamacepina, melfalano, nifedipino, indometacina, naproxeno, estrógenos, testosteronas, esteroides, fenitoína, ergotaminas, cannabinoides rapamicina, propanidida, propofol, alfadiona, equinomicina, nitrato de miconazol, tenipósido, taxol y taxotero.

La molécula biológicamente relevante puede ser un polipéptido tal como ciclosporina, angiotensina I, II y III, encefalinas y sus análogos, ACTH, péptidos antiinflamatorios I, II, III, bradicinina, calcitonina, b-endorfina, dinorfina, leucocinina, luliberina (LHRH), insulina, neurocininas, somatostatina, sustancia P, tiroliberina (TRH) y vasopresina.

La molécula biológicamente relevante puede ser un antígeno, pero el antígeno no se limita a un antígeno proteico. El antígeno también puede ser un carbohidrato o un polinucleótido tal como ADN. Algunos ejemplos de antígenos proteicos incluyen glucoproteínas de la cubierta de los virus de la gripe o de Sendai, proteínas de la membrana celular animal, proteínas de la membrana celular vegetal, proteínas de la membrana bacteriana y proteínas de la membrana de parásitos.

La molécula biológicamente relevante se extrae de la partícula, célula, tejido u órgano de origen mediante procedimientos conocidos. La actividad biológica de las moléculas biológicamente relevantes no tiene por qué mantenerse. Sin embargo, en algunos casos (por ejemplo, cuando una proteína tiene fusión de membranas o actividad de unión de ligandos, o una conformación de complejo que es reconocida por el sistema inmune), es deseable mantener la actividad biológica. En estos casos, se usa un tampón de extracción que contiene un detergente que no destruye la actividad biológica de la proteína de membrana. Algunos detergentes adecuados incluyen detergentes fónicos tales como sales de cola-
to, sales de desoxicolato y similares, o detergentes polioxietilénicos heterogéneos tales como Tween, BRIG o Triton.

La utilización de este procedimiento permite la reconstitución de antígenos, más específicamente de proteínas, en los liposomas, conservando las actividades biológicas, y finalmente, una eficaz asociación con los cocleatos. Esto evita los disolventes orgánicos, la aplicación de ultrasonidos o el pH, la temperatura o la presión extremos, todos los cuales pueden tener un efecto adverso sobre la eficaz reconstrucción del antígeno en una forma biológicamente activa.

Los cocleatos aislados en hidrogel pueden contener una combinación de varias moléculas biológicamente relevantes según sea adecuado.

La formación de cocleatos de pequeño tamaño (con o sin una molécula biológicamente relevante) se consigue añadiendo una molécula cargada positivamente a la disolución bifásica de polímero acuoso que contiene liposomas. En el procedimiento anterior para elaborar cocleatos, la molécula cargada positivamente puede ser un catión polivalente, y más específicamente, cualquier catión divalente que pueda inducir la formación de un cocleato. En una forma de realización preferida, los cationes divalentes incluyen Ca^{++}, Zn^{++}, Ba^{++} y Mg^{++} u otros elementos capaces de formar iones divalentes u otras estructuras con múltiples cargas positivas capaces de quelatar y puentear lípidos cargados negativamente. La adición de moléculas cargadas positivamente a las disoluciones que contienen los liposomas también se usa para precipitar los cocleatos a partir de la disolución acuosa.

Para aislar las estructuras de los cocleatos y para eliminar la disolución de polímero, los precipitados de cocleatos se lavan repetidamente con un tampón que contiene una molécula cargada positivamente, y más preferiblemente, un catión divalente. La adición de una molécula cargada positivamente al tampón de lavado asegura que las estructuras de los cocleatos se mantienen a lo largo de la etapa de lavado; y que permanecen como precipitados.

El medio en el que se suspenden los cocleatos puede contener sales tales como cloruro cálcico, cloruro de cinc, cloruro de cobalto, cloruro sódico, sulfato sódico, sulfato potásico, sulfato amónico, sulfato magnésico y carbonato sódico. El medio puede contener polímeros tales como Tween 80, BRIG o Triton. La molécula-cocleato biológicamente relevante se elabora diluyéndola en un vehículo adecuado o biológicamente aceptable (por ejemplo, un tampón que contenga un catión divalente).

Las partículas del cocleato pueden ser entéricas. Las partículas del cocleato pueden colocarse dentro de cápsulas de gelatina, y la cápsula pueden ser recubierta entéricamente.

En las preparaciones de la presente invención pueden añadirse ciertos materiales hidrófobos para proporcionar un aumento de las propiedades de absorción para la administración por vía oral de moléculas biológicamente relevantes. Estos materiales se eligen preferiblemente del grupo constituido por ácidos carboxílicos de cadena larga, ésteres de ácidos carboxílicos de cadena larga, alcoholes de ácidos carboxílicos de cadena larga y mezclas de los mismos. Los materiales hidrófobos pueden añadirse inicialmente al lípido antes de la formación de los liposomas o en una etapa posterior en forma de un vehículo graso, tal como una emulsión.

El artesano experto puede determinar el medio más eficaz y terapéutico para efectuar el tratamiento llevando a la práctica la actual invención. También puede hacerse referencia a cualquiera de las numerosas autoridades y referencias, incluyendo, por ejemplo, "Goodman & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics", (6ª ed., Goodman y col., eds., MacMillan Publ. Co., Nueva York, 1980).

La invención se describirá ahora mediante ejemplos que no deben considerarse como limitantes de la invención. En los ejemplos, salvo que se indique de otro modo, todas las proporciones, porcentajes y cantidades son en peso.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel vacíos a partir de dioleoilfosfatidilserina precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una disolución de dioleoilfosfatidilserina (DOPS, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE.UU.) en cloroformo (10 mg/ml) en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 35°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío (Laboratory Supplies Com., Inc.). La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) indica que el diámetro medio es de 35,7 \pm 49,7 nm.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel

La suspensión de liposomas obtenida en la etapa 1 se mezcló entonces con dextrano 500.000 (Sigma) al 40% p/p en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces con una jeringa en PEG 8.000 (Sigma) al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de CaCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) indica que el diámetro medio del cocleato es de 407,2 \pm 85 nm (figura 2b).

Ejemplo 2 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel vacíos a partir de una mezcla de dioleoilfosfatidilserina y 1,2-diestearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina-n-(poli(etilenglicol)-5000, DSPE- PEG) precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares

Se dispuso una disolución de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) y 1,2-diestearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina-n-(poli(etilenglicol)-5000), (DSPE-PEG, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE.UU.), en cloroformo (proporción de DOPS:DSPS-PEG = 100:1, p:p) en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 35°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío (Laboratory Supplies Com., Inc.). La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel

La suspensión de liposomas obtenida en la etapa 1 se mezcló entonces con dextrano 500.000 al 40% p/p en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 (Sigma) al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de CaCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. El microscopio óptico de contraste de fases indica la formación de cocleatos uniformes, muy pequeños y fusiformes.

Ejemplo 3 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel vacíos a partir de una mezcla de dioleoilfosfatidilserina y n-octil-\beta-D-glucopiranósido precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares

Se dispuso una disolución de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 35°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con una disolución de n-octil-\beta-D-glucopiranósido (OCG) a 1 mg/ml, en una proporción de DOPS:OCG de 10:1, p:p. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron brevemente ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel

La suspensión obtenida en la etapa 1 se mezcló entonces con dextrano 500.000 al 40% p/p en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de CaCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

\newpage

Ejemplo 4 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con anfotericina B precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con AmB a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y AmB en metanol (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 40°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió amarillo claro (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2 Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con AmB

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) indica que el diámetro medio de los cocleatos de AmB era de 407,3 \pm 233,8 nm (figura 2a).

Ejemplo 5 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con doxorrubicina (DXR) precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con DXR a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y (DXR) en metanol (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 40°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió rosa claro (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con DXR

Entonces se mezclaron 5 ml de la suspensión de liposomas obtenida en la etapa 1 con dextrano 500.000 al 40% p/p (Sigma) en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 (Sigma) al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de CaCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 6.400 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) confirmó la formación de pequeños cocleatos de
DXR.

Ejemplo 6 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con ciclosporina A (CSPA) precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con CSPA a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y CSPA en metanol (0,5 mg/ml) a una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a temperatura ambiente. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con CSPA

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) confirmó la formación de pequeños cocleatos de CSPA.

Ejemplo 7 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con nelfinavir (NVIR) precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con NVIR a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y NVIR en metanol (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a TA. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con CSPA

La suspensión de liposomas obtenida en la etapa 1 se mezcló entonces con dextrano 500.000 al 40% p/p en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de CaCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

\newpage

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) confirmó la formación de pequeños cocleatos de NVIR.

Ejemplo 8 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con rifampicina (RIF) precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con RIF a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y RIF en metanol (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a TA. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con RIF

La suspensión de liposomas obtenida en la etapa 1 se mezcló entonces con dextrano 500.000 al 40% p/p (Sigma) en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 al 15% p/p (Sigma) [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de CaCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) confirmó la formación de pequeños cocleatos de RIF.

Ejemplo 9 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con vitamina A precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con vitamina A, a partir de dioleoilfosfatidilserina

La vitamina A (retinol) es sensible a la oxidación al aire y es inactivada por la luz UV. La vitamina A está protegida cuando está incluida en bicapas lipídicas. La incorporación se consigue como sigue:

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y vitamina A en metano) (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a TA. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

\newpage

\global\parskip0.930000\baselineskip

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con vitamina A

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada.

Ejemplo 10 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con ácido graso poliinsaturado (PFA) precipitados con calcio

Los PFA son moléculas biológicamente relevantes implicadas en el control del nivel de colesterol en sangre, y son los precursores de las prostaglandinas. Los PFA son sensibles a la oxidación, lo que limita su incorporación en los alimentos. Los PFA experimentan, en presencia de oxígeno, una serie de reacciones denominadas de autoxidación, produciendo aldehídos y después cetonas que tienen un desagradable olor y sabor a pescado. La inclusión de PFA en bicapas lipídicas rígidas y enrolladas ayuda a prevenir la cascada de autoxidación. Un procedimiento general para preparar cocleatos de PFA es como sigue:

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con PFA a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y PFA en metanol (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un evaporador rotatorio a TA. El evaporador rotatorio se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con PFA

Ejemplo 11 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con esencia de canela (CinO) precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con CinO a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y CinO en metanol (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 40°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con CinO

Ejemplo 12 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con ADN precipitados con calcio

Etapa 1

Preparación de pequeñas vesículas unilamelares cargadas con ADN a partir de dioleoilfosfatidilserina

Se dispuso una disolución de dioleoilfosfatidilserina en cloroformo (10 mg/ml) en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a TA. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con una disolución de pCMV-\beta-gal-ADN en tampón de TE (a 1 mg/ml) hasta alcanzar una concentración de DOPS:ADN de 10:1 y a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se mezcló en vórtex durante varios minutos.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con ADN

La mezcla de ADN/liposomas se mezcló entonces con dextrano 500.000 al 40% p/p en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de CaCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía CaCl_{2}1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 10:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada.

Ejemplo 13 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel vacíos precipitados con cinc

Etapa 1

Se dispuso una disolución de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 35°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió transparente (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel

La suspensión de liposomas obtenida en la etapa 1 se mezcló entonces con dextrano 500.000 al 40% p/p en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de ZnCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía ZnCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) confirmó la formación de pequeños cocleatos.

Ejemplo 14 Preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con anfotericina B precipitados con cinc

Etapa 1

Se dispuso una mezcla de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en cloroformo (10 mg/ml) y AmB en metano) (0,5 mg/ml) en una proporción molar de 10:1 en un matraz de fondo redondo, y se secó hasta formar una película usando un rotavapor Buchi a 40°C. El rotavapor se esterilizó mediante la vaporización instantánea de nitrógeno gaseoso a través de un filtro de 0,2 \mum. Las siguientes etapas se llevaron a cabo en una campana estéril. La película lipídica seca se hidrató con agua desionizada a una concentración de 10 mg de lípidos/ml. La suspensión hidratada se purgó y se precintó con nitrógeno, después se aplicaron ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de baño frío. La aplicación de ultrasonidos continuó (durante entre varios segundos y varios minutos, dependiendo de la cantidad y la naturaleza del lípido) hasta que la suspensión se volvió amarillo claro (suspensión A) y no hubo liposomas claramente visibles bajo un microscopio de contraste de fases con un aumento de 1000 X.

Etapa 2

Preparación de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con AmB

La suspensión de liposomas obtenida en la etapa 1 se mezcló entonces con dextrano 500.000 al 40% p/p en una suspensión de 2/1 v/v de dextrano/liposomas. Esta mezcla se inyectó entonces mediante una jeringa en PEG 8.000 (Sigma) al 15% p/p [PEG 8000/(suspensión A)] con agitación magnética para dar como resultado la suspensión B. La velocidad de agitación era de 800-1.000 rpm. Se añadió una disolución de ZnCl_{2} (100 mM) a la suspensión hasta alcanzar la concentración final de 1 mM.

La agitación continuó durante una hora, después se añadió a la suspensión B un tampón de lavado que contenía ZnCl_{2} 1 mM y NaCl 150 mM en una proporción volumétrica de 1:1. La suspensión se mezcló en vórtex y se centrifugó a 3.000 rpm, a 2-4°C, durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante se añadió tampón de lavado adicional en una proporción volumétrica de 0,5:1, seguido de una centrifugación en las mismas condiciones. Un esquema de este nuevo procedimiento de obtención de cocleatos se detalla en la Figura 1. El sedimento resultante se reconstituyó con el mismo tampón hasta la concentración deseada. La dispersión de luz láser (análisis ponderal, Coulter N4 Plus) confirmó la formación de pequeños cocleatos de AmB-Zn.

Ejemplo 15 Observación microscópica de cocleatos aislados en hidrogel

El estudio microscópico se realizó paso a paso aisladamente del procedimiento de preparación, con objeto de obtener algunos detalles mecanicistas sobre la formación de cocleatos aislados en hidrogel.

\newpage

Las imágenes microscópicas observadas en las Figuras 3a,b y 4a-f muestran los cambios morfológicos en cada etapa de preparación de cocleatos aislados en hidrogel cargados con AmB precipitados con iones Ca^{+2}. Cuando la mezcla AmB/liposomas-dextrano se dispersaba en la disolución de PEG, aparecía una separación de fases, según se muestra en la Fig. 3a. El reparto de los liposomas favorece la fase dispersa de dextrano, según se indica por el color amarillo de la AmB. Este reparto asegura que los liposomas estén aislados en cada partícula de dextrano. La adición de iones calcio a la fase continua (PEG) dio como resultado la formación de precipitados en la fase dispersa. Como producto final se formaron pequeños cocleatos fusiformes y se observaron al microscopio, estos cocleatos se abrieron en vesículas unilamelares tras la adición de EDTA y la quelatación del calcio (Figuras 4a,b). La morfología fusiforme fue confirmada mediante microscopía electrónica de barrido tras la criofractura (Figura 5). Se obtuvieron unas imágenes microscópicas similares para los cocleatos aislados en hidrogel vacíos y cargados con AmB precipitados con Zn (Figuras 4c,d) y para los cocleatos aislados en hidrogel vacíos precipitados con Zn (Figuras 4e,f).

Ejemplo 16 Actividad antifúngica de cocleatos aislados en hidrogel cargados con anfotericina B, in vitro Inhibición del crecimiento de Candida albicans

Se realizó un ensayo de susceptibilidad de levaduras in vitro comparando los efectos inhibidores y letales de los cocleatos de AmB, los AmBisomas (formulación liposómica de AmB) y AmB/DMSO. Se seleccionaron cinco colonias de Candida albicans recién crecidas a partir de una placa de agar YPD (procedente de un cultivo de 48 horas) y se añadieron a 2 ml de caldo 2x YPD, pH 5,7. Se midió la DO_{590} de este cultivo madre y se ajustó la densidad de levadura a una DO_{590} = 0,1, y se añadieron 0,1 ml de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

Los cocleatos de AmB, la AmB/DMSO y los AmBisomas se añadieron a placas de 96 pocillos hasta una concentración final de 0,078, 0,156, 0,3125, 0,625, 1,25 y 2,5 \mug/ml de AmB. Las placas de 96 pocillos se incubaron a 37°C con una agitación suave, y se midió la densidad celular en un lector de placas de 96 pocillos (Molecular Devices Spectramax 340) a las 0, 2, 4, 6, 24 y 30 horas. La Figura 6 muestra que los cocleatos de AmB tienen un mayor efecto inhibidor del crecimiento que los AmBisomas (formulación liposómica de AmB).

Efecto fungicida de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con anfotericina B

Se retiraron alícuotas de las células de levadura (50 \mul) de las placas de 96 pocillos y se diluyeron sucesivamente (hasta 1:10.000 para colocarlas en placas de agar) y se contaron usando un hemocitómetro. Se colocaron cincuenta \mul de las células de levadura diluidas en placas de YPD agar y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las colonias de levadura se contaron usando un BioRad Fluor-S Multi-Imager equipado con el programa informático Quantity One^{TM}.

Las células de levadura tratadas con AmBisomas, AmB/DMSO y cocleatos de AmB (0,625 ug de AmB/ml) se examinaron para comprobar la proporción de unidades formadoras de colonias con respecto al número total de células después de 30 horas de incubación. Los resultados muestran que los cocleatos de AmB tienen el mayor efecto letal sobre las células de levadura en comparación con los otros agentes antifúngicos probados. Hubo una viabilidad de la levadura de prácticamente el 0% después del tratamiento con los cocleatos de AmB, y una viabilidad de la levadura del 12% tras un tratamiento con AmB/DMSO. Los AmBisomas no fueron eficaces, dando como resultado una viabilidad de la levadura del 52% (Figura 7).

Protección de los macrófagos con los cocleatos de AmB

Las células fagocitadoras de partículas, tales como los macrófagos, son la primera línea de defensa frente a cualquier infección microbiana. Sin embargo, se ha demostrado que muchos microbios, que inducen graves infecciones clínicas humanas, infectan a los macrófagos y evitan su destrucción.

Es posible que, in vivo, los macrófagos jueguen un importante papel en la captación de cocleatos a través de un mecanismo de endocitosis. Dado que los macrófagos también juegan un papel importante en la defensa del hospedador y en la eliminación de hongos y parásitos, es importante estudiar la interacción entre los macrófagos y los cocleatos.

Los siguientes ejemplos indican que los cocleatos son captados por los macrófagos. Se encontró que grandes dosis de AmB administradas a los macrófagos no resultaban tóxicas y permanecían dentro del macrófago en una forma biológicamente activa. Los cocleatos de AmB proporcionaron protección para el macrófago frente a la infección por Candida albicans cuando se administran antes o después de la infección fúngica.

Régimen de dosis profiláctica: se subcultivaron macrófagos J774A.1 (M) en una placa de 96 pocillos a una concentración de 1 x 10^{5} células/ml en DMEM + un 10% de FBS. Se añadieron 100 \mul de cocleatos de AmB (AmBc 0,2, 0,6, 1,25, y 2 \mug de AmB/ml), Fungizone o cocleatos vacíos (EC a 2, 6, 12,5 y 25 \mug de lípido/ml), a la concentración especificada. Las placas se incubaron hasta el día siguiente a 37°C y un 5% de CO_{2}. 24 horas después se sustituyó el medio. Esta etapa se realizó dos veces. Se añadió Candida albicans a la placa a una concentración de 2,5 x 10^{3} células/ml, una proporción de 1:200 con respecto a los macrófagos. Las placas se incubaron hasta el día siguiente en las condiciones establecidas anteriormente.

Después de la incubación de 24 horas, las placas se retiraron y se observaron. El medio se pipeteó vigorosamente para extraer y desorganizar las células, 25 \mul de esta suspensión se colocaron en placas de agar de Sabouraud con dextrosa, y después se colocaron en una estufa de incubación en seco hasta el día siguiente a 37°C. Al día siguiente se contaron las UFC de Candida albicans. Los datos de la Figura 8 sugieren que los macrófagos cargados con cocleatos de AmB son muy eficaces para destruir las células fúngicas.

Régimen de dosis tras la infección: se subcultivaron macrófagos J774A.1 (M) en una placa de 96 pocillos, y después se incubaron hasta el día siguiente. Tras la incubación, los macrófagos se infectaron con CA a una proporción de 200:1, a continuación se añadieron subsiguientemente AmBc, Fungizone o EC, a las concentraciones especificadas. Veinticuatro horas después se observaron los cultivos celulares y se determinaron las UFC según se describió anteriormente.

Cuando los M fueron expuestos a CA y subsiguientemente se les aplicó una dosis de cocleatos de AmB, el recuento de UFC fue de nuevo próximo a cero. Estos resultados indican que los macrófagos absorben y concentran los cocleatos de AmB, ya que los macrófagos estaban protegidos frente a la exposición a C. albicans después de haber eliminado mediante lavado los cocleatos de AmB (Figura 8).

Por el contrario, Fungizone, (AmB en desoxicolato), la forma clínica más popular de AmB, era extremadamente tóxico y letal para los macrófagos in vitro. A las 5 horas de su administración se hallaron en las placas de Petri una gran cantidad de desechos celulares, sin ningún signo de macrófagos viables.

La observación microscópica revela que los cocleatos de AmB no son tóxicos para los macrófagos, ni siquiera a las dosis más altas estudiadas. Los cocleatos de AmB se acumulan en grandes cantidades, dando como resultado grandes vacuolas dilatadas. Tras eliminar los macrófagos mediante lavado de incubar de nuevo durante 24 h, la mayoría de las vacuolas había retornado a su forma y tamaño normales, aunque todavía había algunas apreciablemente engrosadas. Incluso se apreció que unos pocos macrófagos se "movían" con las vacuolas engrosadas. Los cocleatos de AmB están concentrados dentro de las vacuolas, y es probable que la AmB sea liberada gradualmente con el tiempo.

Ejemplo 17 Evaluación de la penetración tisular de la AmB tras la administración iv de cocleatos aislados en hidrogel cargados con anfotericina B

Se ha evaluado la penetración tisular de la anfotericina B tras una administración iv. A grupos (n = 5) de ratones C57BU6 (20-23 g) se les administraron por vía iv (0,625 mg/kg) cocleatos de AmB (0,05 ml/20 g) con una jeringa de insulina de 100 U de ½ cc con una aguja de 1 mm. En los tiempos de sacrificio predetermimados (2, 5, 10, 20 y 40 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 36 y 48 horas), a los animales se les administró anestesia, se les extrajo sangre mediante una punción cardiaca y después se sacrificaron, se diseccionaron y se extrajeron los tejidos de interés (cerebro, pulmón, hígado, bazo, riñones, corazón, grasa, estómago, contenido del estómago, intestino y contenido del intestino) y se pesaron. Para el análisis de la AmB, las muestras se mezclaron con un disolvente de extracción (10% de metanol, 35% de agua, 55% de etanol), se homogeneizaron, se les aplicó ultrasonidos y se centrifugaron. Se transfirió una alícuota del sobrenadante de 90 \mul a un microvial, se inyectó en el sistema de HPLC en una columna NovaPak C-18 (3,9 x 150 mm, 4 \mum de tamaño de partícula) mantenida a 40°C. La anfotericina B eluyó a una tasa de flujo de 0,5 ml/min con un 29% de metanol, un 30% de acetonitrilo y un 41% de EDTA 2,5 mM, y se detectó a 408 nm. La concentración de AmB se calculó con la ayuda de una curva estándar externa.

En la Figura 9 se muestra la exposición tisular tras una única dosis iv de cocleatos de AmB. Puede observarse una gran penetración en tejidos clave como el hígado, el bazo y el riñón.

Ejemplo 18 Administración por vía oral de AmB mediada por cocleatos aislados en hidrogel cargados con AmB Régimen de dosis únicas

La disponibilidad oral de los cocleatos aislados en hidrogel cargados con AmB se ha examinado mediante la administración intrínseca de la formulación del ejemplo 2 a ratones C57BL16 (20-23 g) tras un ayuno nocturno. Se administró un décimo de ml de la formulación a una dosis de 10 mg/kg a 9 ratones. Se sacrificaron tres ratones de cada grupo a las 1, 6 y 24 horas tras la administración, seguido de un análisis del nivel de AmB en órganos y tejidos.

Las muestras tisulares y sanguíneas se procesaron como sigue: los tejidos se diluyeron a 1/20 ó 1/10 mediante la adición de disolvente de extracción (35% de LKD, 10% de metanol, 55% de etanol p/p/p nv/v/v) y se homogeneizaron con un dispositivo Ultra-Turrex®. Se tomó una alícuota de 0,5 ml, se le aplicó ultrasonidos durante 1 min y se centrifugó a 7260 rpm durante 12 min a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un microvial de HPLC y se inyectaron 30 \mul en una columna analítica de C18, de 3,9 x 150 mm, de 4 \mum de tamaño de partícula, con una tasa de flujo de 0,5 ml, a 40°C. La concentración de la AmB detectada a 408 nm se calculó con la ayuda de una curva de calibración exter-
na.

La Figura 10 muestra el perfil temporal de la AmB en los tejidos durante un periodo de tiempo de 24 horas. Aunque sólo están representados tres puntos temporales, puede observarse la acumulación en los tejidos clave (hígado, pulmones, bazo y riñones).

Régimen de dosis múltiples

Otros dos grupos de ratones recibieron un régimen de dosis múltiples por vía oral de 10 mg/kg/día durante diez días, y un grupo fue sacrificado 24 horas después de la última dosis, y el otro grupo 20 días después de la última dosis recibida. En los puntos temporales predeterminados los ratones fueron anestesiados, sacrificados y diseccionados para la recolección de tejidos. Los tejidos fueron procesados como en el régimen de dosis únicas, y el nivel de AmB se determinó mediante HPLC. Los resultados a las 24 h después de la 10ª dosis se describen en la Figura 11, y muestran que los cocleatos aislados en hidrogel permiten la administración de AmB desde el tracto gastrointestinal a niveles terapéuticos.

Ejemplo 19 Correlación entre la biodistribución en ratones sanos e infectados y el nivel de Candida albicans en los tejidos después de una administración por vía oral

La Figura 12 muestra la relación entre los niveles tisulares de anfotericina B (\mug/g de tejido en la escala izquierda) y la eficacia según disminuye la infección por Candida albicans (UFC/g en la escala derecha) tras la administración oral de cocleatos de AmB (Figura 12).

Tras la administración por vía oral de 10 mg/kg/día durante 10 días consecutivos a ratones sanos, la AmB presentaba altos niveles en los riñones, seguido de los pulmones, el bazo, el hígado y el cerebro, lo que muestra unos niveles mucho menores que los otros tejidos. Se ha demostrado que el estado patológico afecta a la farmacocinética de los fármacos a diferentes niveles. Este fenómeno puede observarse claramente en el gráfico: la AmB tisular alcanzó unos niveles menores en ratones infectados por C. albicans tras la administración oral de 10 mg/kg/día (misma dosis) durante 15 días, 5 dosis más que el grupo sano. También muestra un cambio en el patrón de distribución, en el que los pulmones son el tejido objetivo, con los menores niveles.

La administración por vía oral de una formulación de cocleatos de AmB a 10 mg/kg/día durante 15 días proporcionó una elevada eficacia. La disminución en las UFC/g en el tejido renal es de aproximadamente 3,5 logs para la formulación de cocleatos. En los pulmones, las formulaciones de cocleatos de AmB erradicaron completamente a C. albicans y liberaron a los pulmones de la infección fúngica. Está claro que el sistema de administración mediante cocleatos proporciona un alto nivel de AmB en los animales infectados, esto se correlaciona con la mayor eficacia observada en la formulación de cocleatos, lo que indica que los cocleatos de AmB son un vehículo adecuado para el tratamiento por vía oral de una candidiasis sistémica.

Además, los cocleatos de AmB no fueron tóxicos ni siquiera a la dosis mayor de 50 mg/kg (no se hallaron lesiones en los riñones, el tracto GI ni en otros órganos de los ratones a los que se les administraron 10, 20 y 50 mg/kg de los cocleatos de AmB). Esta elevada dosis (50 mg/kg) es equivalente a 100 veces la dosis menor (0,5 mg/kg) que mostró el 100% de supervivencia en el modelo de ratón infectado por Candida.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias mencionadas en la descripción

Esta lista de referencias mencionadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido especial cuidado al recopilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones, y la OEP renuncia a cualquier responsabilidad a este respecto.

Documentos patentes mencionados en la descripción

\bullet US 4078052 A [0005] \hskip2cm \bullet US 5840707 A [0005]

Bibliografía no patente mencionada en la descripción

\bulletCOUVREUR P. y col. Adv. Drug Delivery Reviews, 1993, vol. 10, 141-162 [0002]

\bullet P. A. ALBERTSSON. Partition of cell particles and macromolecules. Wiley, 1986 [0012]

\bullet Separation using aqueous Phase System. Plenum, 1989 [0012]

\bullet D. FORCINITI; C. K. HALL; M. R. KULA. Biotechnol. Bioeng., 1991, vol. 38, 986 [0012]

\bullet Liposome Technology, Liposome Preparation and Related Techniques. CRC Press, 1993, vol. [0017]

\bulletGoodman & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics. MacMillan Publ. Co, 1980 [0032]

Claims

1. Un procedimiento para producir cocleatos basados en lípidos que comprende las etapas de:

a): proporcionar una suspensión acuosa de liposomas;

b): mezclar la suspensión de liposomas con polímero A;

c): añadir la suspensión de liposomas/polímero A, a una disolución que comprende polímero B, en la que el polímero A y el polímero B son inmiscibles, creando así un sistema polimérico bifásico;

d): añadir una disolución de una fracción catiónica al sistema polimérico bifásico; y

e): lavar el sistema polimérico bifásico para eliminar los polímeros.

2. Un procedimiento de la reivindicación 1 en el que la adición de la suspensión de liposomas/polímero A se realiza mediante inyección.

3. Un procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2 en el que los liposomas están formados por lípido que comprende lípido cargado negativamente.

4. Un procedimiento de la reivindicación 3 en el que el lípido cargado negativamente es fosfatidilserina.

5. Un procedimiento de la reivindicación 3 o de la reivindicación 4 en el que el lípido comprende una cantidad menor de otros lípidos.

6. Un procedimiento de la reivindicación 5 en el que el otro lípido se elige del grupo de lípidos bipolares.

7. Un procedimiento de la reivindicación 5 en el que el otro lípido se elige del grupo de lípidos catiónicos.

8. Un procedimiento de la reivindicación 5 en el que los otros lípidos se eligen del grupo de lípidos capaces de formar puentes de hidrógeno con una molécula biológicamente activa.

9. Un procedimiento de la reivindicación 8 en el que el lípido neutro es un lípido PEGilado.

10. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polímero A es al menos un miembro elegido del grupo constituido por dextrano y polietilenglicol.

11. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la concentración de polímero A en el sistema polimérico bifásico varía en concentración del 2 al 20% p/p.

12. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polímero B es al menos un miembro elegido del grupo constituido por polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, ficoll, polivinilmetil éter y polietilenglicol.

13. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la concentración del polímero B en el sistema polimérico bifásico está en el intervalo del 2 al 20% p/p.

14. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la disolución polimérica bifásica es al menos un miembro elegido del grupo constituido por dextrano/polietilenglicol, dextrano/polivinilpirrolidona, dextrano/alcohol polivinílico, dextrano/ficoll y polietilenglicol/polivinilmetil éter.

15. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la fracción catiónica comprende un ión divalente o superior.

16. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la fracción catiónica comprende un ión metálico divalente o superior.

17. Un procedimiento de la reivindicación 16 en el que el ión metálico es añadido como una sal de un ácido inorgánico, preferiblemente en el que la sal es cloruro cálcico, cloruro de cinc o cloruro de cobalto.

18. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que los cocleatos de lípidos son cocleatos de pequeño tamaño.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que el tamaño de los cocleatos es menor de 1 micrómetro.

\newpage

20. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que los cocleatos se forman usando pequeños liposomas unilamelares.

21. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la suspensión acuosa de liposomas comprende una molécula biológicamente relevante, por lo que los cocleatos también comprenden la molécula biológicamente relevante.

22. Un procedimiento según la reivindicación 21 que comprende la etapa preliminar de formar la suspensión de liposomas formando una película que comprende una mezcla de la molécula biológicamente relevante y el lípido, y poner en contacto la película con una fase acuosa para formar la suspensión acuosa de pequeños liposomas unilamelares.

23. Un procedimiento según la reivindicación 21 en el que la molécula biológicamente relevante está presente en la fase acuosa.

24. Un procedimiento según la reivindicación 23 que comprende la etapa preliminar de formar liposomas, en la que se pone en contacto una película de lípidos con una fase acuosa que contiene la molécula biológicamente relevante para formar la suspensión acuosa de liposomas.

25. Un procedimiento según la reivindicación 21 que incluye una etapa preliminar en la que se mezcla una suspensión de liposomas vacíos con la molécula biológicamente relevante para formar dicha suspensión de liposomas.

26. Un procedimiento según la reivindicación 23 en el que la molécula biológicamente relevante porta una carga.

27. Un procedimiento según la reivindicación 26 en el que la molécula biológicamente relevante está cargada positivamente.

28. Un procedimiento según la reivindicación 26 en el que la molécula biológicamente relevante está cargada negativamente.

29. Un procedimiento según la reivindicación 23 en el que la molécula cargada negativamente es un polinucleótido.

30. Un procedimiento según la reivindicación 29 en el que el polinucleótido es ADN.

31. Un procedimiento para producir cocleatos basados en lípidos que comprende las etapas de:

a): proporcionar una suspensión acuosa que contiene una mezcla de detergente-lípido;

b): mezclar la suspensión de detergente-lípido con polímero A;

c): añadir la suspensión de detergente-lípido/polímero A, a una disolución que comprende polímero B, en la que el polímero A y el polímero B son inmiscibles, creando así un sistema polimérico bifásico;

e): lavar el sistema polimérico bifásico para eliminar el polímero.

32. Un procedimiento para producir cocleatos basados en lípidos según la reivindicación 31 en el que el detergente es glucósido de octilo.

33. Un procedimiento para producir cocleatos basados en lípidos según la reivindicación 31 en el que el cocleato comprende una molécula biológicamente activa.

34. Un procedimiento según la reivindicación 33 en el que la molécula biológicamente activa porta una carga.

35. Un procedimiento según la reivindicación 33 en el que la molécula biológicamente activa está cargada positivamente.

36. Un procedimiento según la reivindicación 33 en el que la molécula biológicamente activa está cargada negativamente.

37. Un procedimiento según la reivindicación 36 en el que la molécula cargada negativamente es un polinucleótido.

38. Un procedimiento según la reivindicación 37 en el que el polinucleótido es ADN.

39. Un procedimiento según la reivindicación 31 en el que la molécula biológicamente activa se añade en la etapa a.

40. Un procedimiento según la reivindicación 21 o la reivindicación 33 en el que la molécula biológicamente relevante se elige del grupo constituido por fármacos, polinucleótidos, polipéptidos y antígenos.

41. Un procedimiento de la reivindicación 40 en el que la molécula biológicamente relevante es un fármaco elegido del grupo constituido por agentes antivirales, anestésicos, agentes antinfecciosos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes anticancerosos, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios esteroideos, agentes antiinflamatorios no esteroideos, tranquilizantes y vasodilatadores.

42. Un procedimiento de la reivindicación 41 en el que el fármaco es al menos un miembro elegido del grupo constituido por anfotericina B, aciclovir, adriamicina, cabamacepina, melfalano, nelfinavir, nifedipino, indometacina, naproxeno, estrógenos, testosteronas, esteroides, fenitoína, ergotaminas, cannabinoides rapamicina, propanidida, propofol, alfadiona, equinomicina, nitrato de miconazol, tenipósido, taxol, taxotero y rifampicina.

43. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la etapa de lavado implica centrifugar el sistema polimérico bifásico para separar el precipitado de cocleatos, eliminar el sobrenadante que contiene el polímero, resuspender el precipitado en un tampón de lavado, centrifugar el precipitado lavado y, opcionalmente, repetir las etapas de resuspensión y de centrifugación una o más veces.

44. Un procedimiento según la reivindicación 43 en el que el tampón de lavado contiene una fracción catiónica disuelta.

45. Un procedimiento según la reivindicación 44 en el que la fracción catiónica comprende iones divalentes o superiores.

46. Un procedimiento según la reivindicación 45 en el que los iones divalentes o superiores son iones metálicos.

47. Un procedimiento según la reivindicación 46 en el que los iones metálicos se eligen entre calcio y cinc.

48. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47 en el que la fracción catiónica está presente en el tampón de lavado a una concentración de al menos 1 mM.

49. Una composición de cocleato que comprende:

a): un lípido cargado negativamente;

b): un componente catiónico, y

c): una molécula biológicamente relevante distinta a a) y b), en la que los cocleatos tienen un tamaño medio de partícula menor de 1 \mum, y en la que dicho componente catiónico es un ión metálico divalente o superior.

50. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante se elige entre vitaminas, minerales, aminoácidos, toxinas microbicidas, microbiostáticos, cofactores, enzimas, polipéptidos, agregados de polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, nucleótidos, almidones, pigmentos, ácidos grasos, hormonas, citocinas, virus, orgánulos, esteroides y otras estructuras multianulares, sacáridos, metales, venenos metabólicos y fármacos.

51. Una composición de cocleato según la reivindicación 50 en la que la molécula biológicamente relevante es un fármaco elegido del grupo constituido por agentes antivirales, anestésicos, agentes antinfecciosos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes anticancerosos, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios esteroideos, agentes antiinflamatorios no esteroideos, tranquilizantes y vasodilatadores.

52. Una composición de cocleato según la reivindicación 51 en la que el fármaco que es al menos un miembro elegido del grupo constituido por anfotericina B, aciclovir, adriamicina, cabamacepina, melfalano, nelfinavir, nifedipino, indometacina, naproxeno, estrógenos, testosteronas, esteroides, fenitoína, ergotaminas, cannabinoides rapamicina, propanidida, propofol, alfadiona, equinomicina, nitrato de miconazol, tenipósido, taxol, taxotero y rifampicina.

53. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante es anfotericina B.

54. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante es naproxeno.

55. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante es un polipéptido elegido de entre ciclosporina, angiotensina I, II y III, encefalinas y sus análogos, ACTH, péptidos antiinflamatorios I, II, III, bradicinina, calcitonina, b-endorfina, dinorfina, leucocinina, luliberina (LHRH), insulina, neurocininas, somatostatina, sustancia P, tiroliberina (TRH) y vasopresina.

\newpage

56. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante es un antígeno.

57. Una composición de cocleato según la reivindicación 56 en la que el antígeno es un carbohidrato, un polinucleótido o una proteína.

58. Una composición de cocleato según la reivindicación 57 en la que el antígeno proteico se elige de entre glucoproteínas de la cubierta de los virus de la gripe o de Sendai, proteínas de la membrana celular animal, proteínas de la membrana celular vegetal, proteínas de la membrana bacteriana y proteínas de la membrana de parásitos.

59. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante es vitamina A.

60. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante es un ácido graso poliinsaturado.

61. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que la molécula biológicamente relevante es un polinucleótido.

62. Una composición de cocleato según la Reivindicación 61 en la que el polinucleótido es ADN.

63. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 en la que el ión metálico se elige entre calcio, magnesio, cinc y bario.

64. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 ó 50 en la que el lípido cargado negativamente es fosfatidilserina.

65. Una composición de cocleato según la reivindicación 49 ó 50 que comprende adicionalmente una cantidad menor de un lípido adicional elegido entre un lípido bipolar, un lípido catiónico y un lípido neutro.

66. Un cocleato según la reivindicación 65 en el que el lípido adicional es un lípido neutro que forma puentes de hidrógeno con la molécula biológicamente el relevante.

67. Una composición de cocleato según la reivindicación 66 en la que el lípido adicional es un lípido PEGilado.

68. Composición de cocleato según cualquiera de las reivindicaciones 49 a 67, o el producto de un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 48, para su uso en un procedimiento de administración de una molécula biológicamente relevante a un hospedador.

69. Uso de una composición de cocleato según cualquiera de las reivindicaciones 49 a 67, o del producto de un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 48, para la elaboración de una composición para su uso en un procedimiento de tratamiento de un cuerpo humano o animal, o para administrar una molécula biológicamente relevante a un hospedador.

70. Uso según la reivindicación 69 en el que la composición se administra a través de las mucosas o por vía sistémica.

71. Uso de la reivindicación 70 en el que la composición se administra a través de las mucosas por una vía elegida entre oral, intranasal, intraocular, intraanal, intravaginal, parenteral o intrapulmonar.

72. Uso según la reivindicación 71 en el que la vía es oral.

73. Uso según la reivindicación 71 en el que la composición es un aerosol.

74. Uso según la reivindicación 70 en el que la composición se administra a través de una vía sistémica elegida entre intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica o intradérmica.

75. Una composición farmacéutica que comprende una composición de cocleato según cualquiera de las reivindicaciones 49 a 67 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.