JP2002535267A - 新規ヒドロゲル単離コクリエート製剤、その調製方法および生物学的関連分子投与のための用途 - Google Patents
新規ヒドロゲル単離コクリエート製剤、その調製方法および生物学的関連分子投与のための用途Info
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Abstract
Description
質主体コクリエート送達システムから誘導される薬学的製剤、および生物学的関
連分子の有効な全身および粘膜投与を達成するためのこれらの薬学的製剤の使用
に関する。
る。生物学的関連分子は、該生物学的関連分子が活性輸送機構のための生物学的
膜を通って移送されるためには、消化液中に溶解しなければならないか、あるい
は小腸のパイエル板を通り、かつ、リンパ系を通って吸収され得る適当に小さな
粒子サイズでなければならない。粒子サイズは経口投与が達成されるべき場合に
は重要なパラメーターである(Couvreur P. et al, Adv. Drug Delivery Review
s 10:141-162, 1993) 。
剤を保護することである。理想的な手法とは、薬剤を疎水性物質中に組み入れて
、水溶性液体がこのシステムを通過できないようにすることである。脂質主体
コクリエートは、この目的を達成できる理想的なシステムである。
て、それらは: a)脂質が酸化されないから、より安定である; b)凍結乾燥して貯蔵され得る;それは室温で長期間、貯蔵される潜在性をもた
らし、全世界への輸送や投与に先立つ貯蔵において長所となるであろう; c)凍結乾燥後ですら、その構造を維持する;一方、リポソーム構造は凍結乾燥
によって破壊される; d)コクリエート構造の脂質2相中への生物学的関連分子の有効な組み入れを示
す; e)コクリエートが解離するにつれて、インビボにて生物学的関連分子を低放出
する潜在性を有する; f)担体として作用する脂質2相を有し、かつ動物および植物細胞膜に見られる
単純脂質から構成される;それため脂質は非毒性である; g)容易に、かつ安全に製造される; h)所定量および割合の薬剤または抗原から構成される一定の製剤として製造さ
れ得る。
jopoulosによって最初に調製されている(米国特許第4,078,052 号参照) 。ワク
チンとしてタンパクまたはペプチド分子を送達するコクリエートの使用は、米国
特許第5,840,707 号に記載されている。しかし、これらの特許のいずれにも粒子
の大きさの重要性または小さなサイズのコクリエートによって仲介される生物学
的関連分子の有効な経口投与については言及していない。
ゲル単離コクリエートを得る方法を提供することにある。さらに、該方法は治療
に有効な量のヒドロゲル単離コクリエート中で少なくとも1つの生物学的関連分
子を渦巻形とすることを必要とする工程を含む。
。この分子は有機物または無機物、モノマーまたはポリマー、宿主生物にとって
内因性またはそうでないもの、天然に産生またはインビトロ合成のものなどであ
ってもよい。すなわち、その例としては、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、毒素
、殺菌剤、静菌剤、補因子、酵素、ポリペプチド、ポリペプチド凝集体、ポリヌ
クレオチド、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、澱粉、顔料、脂肪酸、ホルモン、
サイトカイン、ウイルス、オルガネラ、ステロイドおよび他の多環状構造物、糖
類、金属、代謝毒物、薬剤などが挙げられる。
達成される。その際、生物学的関連分子・コクリエートは下記成分を含む。 a)生物学的関連分子 b)負に荷電した脂質、および c)カチオン成分 その際、渦巻形の生物学的関連分子の粒子サイズは、1ミクロンより小さく、さ
らに生物学的関連分子は、好ましくは薬剤である。
投与する方法を提供する。 好ましい態様では、生物学的関連分子・コクリエートは経口から投与される。
口投与を達成する方法を提供する。この新規な方法は、ともに水溶性である2種
のポリマー溶液間の非相溶性に基づく。ポリマーの水溶性2相系は、有機溶媒の
必要性がないこと、マイルドな表面張力、および水溶性ポリマーの生体適合性な
どの多くの利点を有することから、タンパク精製においてよく使用されている(
P.A. Albertsson in "Partition of cell particles and macromolecules", 3rd
edition, Wiley NY 1986;および"Separation using aqueous Phase System" D.
Fischer Eds, Plenum, NY, 1989参照)。例えば、タンパクなどの大きな極性分
子は、PEGのそれに似た物理的特性をもつポリマー相中よりも、デキストラン
のそれに似た物理的特性をもつポリマー相中でより高い濃度に分配することが公
知である(D. Forciniti, C. K. Hall, M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng. 38,
986, 1991 )。
中に組み込まれた生物学的関連分子を含む製剤の調製方法を提供する。コクリエ
ート粒子は脂質2相/カチオンの交互配列から形成されている。生物学的関連分
子は脂質2相または脂質2相間の空間のいずれかに組み込まれている。小型コク
リエートの調製方法の1つは、1)小型単層リポソームまたは生物学的関連分子
負荷リポソームの懸濁液を調製し、2)該リポソーム懸濁液をポリマーAと混合
し、3)ポリマーAが非相溶性であって、ポリマーの水溶性2相系となる他のポ
リマーB中へ、好ましくは注入によってリポソーム/ポリマーA懸濁液を添加し
、4)工程3の2相系へカチオン塩溶液を添加して、カチオンがポリマーB中へ
、次いで、リポソーム/ポリマーAからなる粒子中へ拡散し、小型コクリエート
を形成し、5)ポリマーを洗い出し、生理的緩衝液または適当な薬学的ビヒクル
中へ空または薬剤負荷コクリエートを再懸濁することを含む。
カチオンを含む。この方法は下記工程を含む。 a)界面活性剤・脂質混合物を含む水溶性懸濁液を準備し、 b)該界面活性剤・脂質懸濁液をポリマーAと混合し、 c)ポリマーBを含む溶液中に該界面活性剤・脂質/ポリマーA懸濁液を添加
し、その際、ポリマーAとポリマーBは非相溶性であり、それによって2相ポリ
マー系を形成し、 d)該2相ポリマー系へカチオン成分の溶液を添加し、かつ、 e)該2相ポリマー系を洗浄して、ポリマーを除去する。
合体は、全身、皮膚または粘膜からの投与のために、柔らかいあるいは固いゼラ
チンカプセル、タブレットまたは他の用量形態中に充填され得る。
をもつ小型粒子となる。生物学的関連分子は脂質2相およびその中間のいずれか
、あるいは双方へ分配し、生物学的関連分子はインビボで粒子の解離によってコ
クリエート粒子から放出される。投与の別な経路は、筋肉内、皮下または静脈内
などの全身性、または鼻内、眼内、膣内、肛門内、非経口または肺内などの粘膜
からであってもよい。適当な用量は、例えば、実験室動物または臨床試験での用
量反応実験から、および患者の体重、吸収率、半減期、疾患の重症度などを考慮
して決定され得る。用量回数、日々の用量および治療過程は個々人により異なる
であろう。他の投与経路は皮膚、経皮膚、また皮膚内である。
たは微細流動化、または他の関連方法(例えば、Liposome Technology, Liposom
e Preparation and Related Techniques, Edited by Gregory Gregoriadis,Vol.
I, 2nd Edition, CRC Press, 1993) によって達成され得る。
は、適当な制御速度、例えば、0.1ml/分〜50ml/分、好ましくは1〜
10ml/分の速度でシリンジポンプを使用して機械的に行い得る。
質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、脂質は負に荷電した脂
質、より好ましくは、負に荷電したホスホリピド、およびさらに好ましくは、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびホ
スファチジルグリセロールの群からの脂質である。この脂質もまた、少量の両性
イオン性脂質、カチオン性脂質、またはPEG化した脂質などの生物学的関連分
子と水素結合を形成することが可能な中性脂質を含む。
生物学的適合性ポリマーの群からなる。例えば、ポリマーAはデキストラン20
0,000〜500,000、ポリエチレングリコール(PEG)3,400〜
8,000で挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーBはポリビニルピ
ロリドン(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)、フィコール30,00
0〜50,000、ポリビニルメチルエーテル(PVMB)60,000〜16
0,000、PEG3,400〜8,000が挙げられるが、これらに限定され
ない。ポリマーAの濃度は、ポリマーの性質に依存して最終濃度2〜20w/w
%の範囲である。ポリマーBにおいても同じ濃度が適用され得る。適当な2相系
の例としては、4〜10w/w%PEG3,400〜8,000中、5〜20w
/w%デキストラン200,000〜500,000であるデキストラン/PE
G、10〜20w/w%PVP10,400〜20,000中、10〜20w/
w%デキストラン200,000〜500,000であるデキストラン/PVP
、3〜15w/w%PVA10,000〜60,000中、3〜15w/w%デ
キストラン200,000〜500,000であるデキストラン/PVA、10
〜20w/w%フィコール30,400〜50,000中、10〜20w/w%
デキストラン200,000〜500,000であるデキストラン/フィコール
、6〜15w/w%PVME60,000〜160,000中、2〜10w/w
%PEG3,500〜35,000であるPEG/PVMEがある。
。この生物学的関連分子は薬剤であってもよく、薬剤は抗ウイルス剤、麻酔薬、
抗炎症剤、抗菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系炎症剤、非ステロイド系
抗炎症剤、精神安定剤、または血管拡張剤であってもよい。その例としては、ア
ンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン、メルファラ
ン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン、テストステ
ロン、ステロイド、フェニトイン、エルゴタミン、カナビノイド、ラパマイシン
、プロパニジッド、プロポフォール、アルファジオン、エチノマイシン、硝酸ミ
コナゾール、テニポシド、タキソールおよびタキソテレが挙げられる。
ンケファリンおよびその類似体、ACTH、抗炎症性ペプチドI、II、III 、ブ
ラジキニン、カルシトニン、b−エンドルフィン、ジノルフィン、ロイコキニン
、黄体化ホルモン放出ホルモン(LHRH)、インシュリン、ニューロキニン、
ソマトスタチン、サブスタンスP、チロイド分泌ホルモン(TRH)およびバソ
プレシンなどのペプチドであってもよい。
ない。抗原はまた炭水化物またはDNAなどのポリヌクレオチドであってもよい
。抗原性タンパクの例としては、インフルエンザまたはセンダイウイルスからの
外皮糖タンパク、動物細胞膜タンパク、植物細胞膜タンパク、細菌性膜タンパク
および寄生虫膜タンパクが挙げられる。
から抽出される。生物学的関連分子の生物活性は維持される必要はない。しかし
、いくつかの例(例えば、タンパクが膜溶融またはリガンド結合活性または免疫
系によって認識される複合構成を有する場合)では、生物活性を維持することが
望ましい。これらの例では、膜タンパクの生物活性を破壊しない界面活性剤を含
む抽出緩衝液が使用される。適当な界面活性剤としては、コール酸塩、デオキシ
コール酸塩などのイオン性界面活性剤、またはツイーン(Tween) 、BRIGまた
はトリトン(Triton)などの異種ポリオキシエチレン界面活性剤が挙げられる。
リポソーム中への再構築、および終局的にはコクリエートとの有効な解離を可能
とする。これは、生物学的活性形において抗原の有効な再構成に悪影響を与える
有機溶媒、超音波、または極端なpH、温度、または圧力を避けることができる
。
含んでいてもよい。 小型コクリエートの生成(生物学的関連分子とともに、あるいは該分子なしで
)はリポソームを含む水溶性2相ポリマー溶液へ正に荷電した分子を添加して達
成される。コクリエートを製造する上記手法では、正に荷電した分子は、多価カ
チオンであり、より具体的にはコクリエート生成を誘導することができる2価カ
チオンである。好ましい態様では、2価カチオンとしては、Ca++、Zn++
、Ba++およびMg++あるいは2価イオンを生成可能な他の要素または負に
荷電した脂質とキレートおよび架橋できる多数の正電荷を有する他の構造物が挙
げられる。リポソーム含有溶液への正に荷電した分子の添加もまた、水溶液から
コクリエートを沈殿させるために使用される。
沈殿物は正に荷電した分子、より具体的には2価カチオンを含む緩衝液で繰返し
て洗浄される。洗浄緩衝液への正に荷電した分子の添加は、コクリエート構造が
洗浄工程を通じて維持され、これらが沈殿物のままであることを確証する。
、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マ
グネシウムおよび炭酸ナトリウムなどの塩を含むことができる。この媒体はツイ
ーン80またはBRIGまたはトリトンなどのポリマーを含むことができる。生
物学的関連分子・コクリエートは生物学的に許容される適当なビヒクル(例、2
価カチオン含有緩衝液)中に希釈して製造される。
配置することができ、このカプセルは腸溶性被覆され得る。
ける増大した吸収性能をもたらすために添加され得る。これらの物質は好ましく
は長鎖カルボン酸、長鎖カルボン酸エステル、長鎖カルボン酸アルコールおよび
これらの混合物からなる群から選択される。疎水性物質はリポソーム生成前に、
最初に、あるいは乳化液などの脂肪性ビヒクルの形態として、後の工程で脂質に
添加することができる。
決定することができる。多くの権威ある文書や参考文献の全て、例えば、"Goodm
an & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics", (6th Ed., Go
odman et al., eds., MacMillan Publ. Co., New York, 1980)を参照することが
できる。
に考慮されるべきものではない。実施例中、断りのないかぎり、全ての割合、パ
ーセントおよび量は重量によるものである。
ら空ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS, Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL, USA)のクロロホルム溶液(10mg/ml)を丸底フラスコに入れ、ブチ(B
uchi)回転式蒸発器を使用して、35℃で乾燥して薄膜とした。この回転式蒸発
器は0.2μmのフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。次工程は無
菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg脂質/mlの濃度にて脱イオン水で
水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封して、次いで冷却され、浴式超音波
発生装置(Laboratory Supplies Com., Inc.) 中で超音波処理した。超音波処置
は懸濁液が澄明になり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可
視できるリポソームが存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒から
数分間)続けた。レーザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)から平均直径
が35.7±49.7nmであることを示す。
ームの懸濁液中で、40w/w%デキストラン500,000(Sigma)と混合し
た。この混合物を次いで、15w/w%PEG−8,000(Sigma )〔PEG
8000/(懸濁液A)〕中へ磁性攪拌しつつ、シリンジで注入して懸濁液Bを
得た。攪拌速度は800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100
mM)を懸濁液に添加して、最終濃度1mMを達成した。
含む洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。この懸濁液に渦巻き
を作り(vortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清
を除去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条
件で遠心分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に
記載される。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築し
た。レーザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)から、コクリエートの平均
直径が407.2±85nmであることを示す(図2b)。
1,2−ジステアロイル−sn−グリセロール−3−ホスホエタノールアミン−
n−(ポリ(エチレングリコール)−5000、DSPE−PEG)の混合物か
らの空ヒドロゲル単離コクリエートの調製 工程1:小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)と1,2−ジステアロイル−s
n−グリセロール−3−ホスホエタノールアミン−n−(ポリ(エチレングリコ
ール)−5000)、(DSPE−PEG、Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL, USA)のクロロホルム溶液(重量比、DOPS:DSPS−PEG=100:
1)を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、35℃で乾
燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は0.2μmフィルターを通して窒素ガスを噴
射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg脂質/
mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き 、窒素で封して
、次いで冷却された浴式超音波発生装置(Laboratory Supplies Com., Inc.) 中
で超音波処理した。超音波処置は懸濁液が澄明になり(懸濁液A)、倍率100
0の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで(脂質
の量および性質により数秒から数分間)続けた。
ームの懸濁液中で40w/w%デキストラン500,000と混合した。この混
合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液A
)〕中へシリンジを経て注入して、懸濁液Bを得た。攪拌速度は800〜1,0
00rpmであった。CaCl2溶液(100mM)を懸濁液に添加して、最終
濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用して再構築し
た。位相差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの生成を示す。
−オクチル−β−D−グルコ−ピラノシドの混合物からの空ヒドロゲル単離コク
リエートの調製 工程1:小型単層小胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液を丸底フラ
スコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、35℃で乾燥して薄膜を得
た。回転式蒸発器 は0.2μmフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌し
た。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜をn−オクチル−β−D−グル
コ−ピラノシド(OCG)溶液1mg/mlで、DOPS:OCGの重量比、1
0:1にて水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴
式超音波発生装置中で簡単に超音波処理した。
液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合した。この混合物は次
いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液A)〕中へ
磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Bを得た。攪拌速度は800〜
1,000rpmであった。CaCl2溶液(100mM)を懸濁液に添加して
、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。位相
差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの生成を示す。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用して再構築し
た。位相差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの生成を示す。
クリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからのAmB負荷小型単層小胞の
調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とAmBメタノール溶液(0.5mg/ml)をモル比、10:1にて
丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、40℃で乾燥して
薄膜を得た。回転式蒸発器 は0.2μmフィルターを通して窒素ガスを噴射し
て殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg/mlの濃
度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却
された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸濁液が明るい黄
色になり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポ
ソームが存在しなくなるまで続けた。
ームの懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合した。この
混合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液
A)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Bを得た。攪拌速
度は800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100mM)を懸濁
液に添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。レー
ザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)からAmB・コクリエートの平均直
径は407.3±233.8nmであったことを示す(図2a)。
ル単離コクリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層DXR負荷小胞の
調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)と(DXR)のメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比
、10:1にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室
温で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は0.2μmフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を25mg
脂質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が明るいピンクになり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らか
に可視できるリポソームが存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒
から数分間)続けた。
リポソームの懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000(Sigma)
と混合した。この混合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8
000/(懸濁液A)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液
Bを得た。攪拌速度は800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(1
00mM)を懸濁液に添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。コクリエート
を得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載される。得られたペレットは
所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。レーザー光散乱(重量分析、
Coulter N4 Plus)から小型DXR・コクリエートの生成を確認した。
ゲル単離コクリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層CSPA負荷小胞
の調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とCSPAのメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比、
10:1にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温
で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器 は0.2μmフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg
脂質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒から数分
間)続けた。
ームの懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合した。この
混合物は次いで、15w/w%PEG−8,000(Sigma )〔PEG8000
/(懸濁液A)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Bを得
た。攪拌速度は800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100m
M)を懸濁液に添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別な洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。レー
ザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)から小型CSPA−コクリエートの
生成を確認した。
ロゲル単離コクリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層NVIR負荷小胞
の調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とNVIRのメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比、
10:1にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温
で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器 は0.2μmフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg
脂質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒から数分
間)続けた。
ームの懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合した。この
混合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液
A)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Bを得た。攪拌速度
は800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100mM)を懸濁液
に添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別な洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。レー
ザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)から小型NVIR−コクリエートの
生成を確認した。
離コクリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層RIF負荷小胞の
調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とRIFのメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比、1
0:1にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温で
乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器 は0.2μmフィルターを通して窒素ガス
を噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg脂
質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き 、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒から数分
間)続けた。
ーム(Sigma )懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合し
た。この混合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/
(懸濁液A)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Bを得た
。攪拌速度は800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100mM
)を懸濁液に添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。レー
ザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)から小型RIV−コクリエートの生
成を確認した。
トの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層ビタミンA負荷小
胞の調製 ビタミンA(レチノール)は空気酸化に対して感受性を有し、紫外線によって
不活性化される。ビタミンAは脂質2相内に包埋されると保護される。この組み
込みは下記のようにして達成される。 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とビタミンAのメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比
、10:1にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室
温で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は0.2μmフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg
脂質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒から数分
間)続けた。
リポソーム(Sigma )懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と
混合した。この混合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG80
00/(懸濁液A)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Bを
得た。攪拌速度は800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100
mM)を懸濁液に添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。レー
ザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)から、小型RIV−コクリエートの
生成を確認した。
ゲル単離コクリエートの調製 PFAは血中のコレステロール濃度制御に関与する生物学的関連分子であり、
プログラスタンジンの前駆体である。PFAは酸化に対して感受性を有し、食品
への導入が制限される。PFAは酸素存在下に自動酸化と呼ばれる一連の反応を
受け、アルデヒドとなり、次いで魚のような不愉快な臭味や風味を有するケトン
となる。固く包まれた脂質2相にPFAを包埋すると、自動酸化のカスケードを
阻止することを助ける。PFA・コクリエートを調製する一般的な方法は下記の
通りである。
調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とPFAのメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比、1
0:1にて丸底フラスコに入れ、回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜
を得た。回転式蒸発器は0.2μmフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌
した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg脂質/mlの濃度
にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却さ
れた浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸濁液が澄明になり
(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが
存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒から数分間)続けた。
ーム懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合した。この混
合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液A
)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Bを得た。攪拌速度は
800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100mM)を懸濁液に
添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。
ゲル単離コクリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層CinO−負荷小
胞の調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とCinOのメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比、
10:1にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、40
℃で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は0.2μmフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg
脂質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり(懸濁液A)、倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで(脂質の量および性質により数秒から数分
間)続けた。
ーム懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合した。この混
合物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液A
)〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Bを得た。攪拌速度は
800〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100mM)を懸濁液に
添加して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。
の調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層DNA−負荷小胞
の調製 ジオレオイルホスファジルセリンのクロロホルム溶液(10mg/ml)を丸
底フラスコに入れ、ブチ(Buchi) 回転式蒸発器を使用して、40℃で乾燥して薄
膜を得た。回転式蒸発器 は0.2μmフィルターを通して窒素ガスを噴射して
殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜をpCMV−β−gal
−DNAのTE緩衝液の溶液(1mg/ml)で水和して、DOPS:DNAが
10:1であり、10mg脂質/mlの濃度に達した。水和懸濁液を取り除き、
窒素で封し、次いで数分間、渦巻きを作った(vortex)。
懸濁液中で40w/w%デキストラン−500,000と混合した。この混合物
は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液A)〕
中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Bを得た。攪拌速度は80
0〜1,000rpmであった。CaCl2溶液(100mM)を懸濁液に添加
して、最終濃度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。
/ml)を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、35℃
で乾燥して薄膜とした。この回転式蒸発器は0.2μmのフィルターを通して窒
素ガスを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10
mg脂質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き 、窒
素で封して、次いで冷却された浴式超音波発生装置(Laboratory Supplies Com.
, Inc.) 中で超音波処理した。超音波処置は懸濁液が澄明になり(懸濁液A)、
倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなる
まで(脂質の量および性質により数秒から数分間)続けた。
懸濁液中で、40w/w%デキストラン500,000と混合した。この混合物
を次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液A)〕
中へ磁性攪拌しつつ、シリンジで注入して懸濁液Bを得た。攪拌速度は800〜
1,000rpmであった。ZnCl2溶液(100mM)を懸濁液に添加して
、最終濃度1mMを達成した。
含む洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作
り(vortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除
去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で
遠心分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載
される。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構築した。
レーザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)から小型コクリエートの生成を
確認した。
離コクリエートの調製 工程1:ジオレオイルホスファチジルセリンからの小型単層AmB負荷小胞の
調製 ジオレオイルホスファジルセリン(DOPS)のクロロホルム溶液(10mg
/ml)とAmBのメタノール溶液(0.5mg/ml)の混合物をモル比、1
0:1にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、40℃
で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器 は0.2μmフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を10mg
脂質/mlの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
して、次いで冷却された浴式超音波発生装置(Laboratory Supplies Com., Inc.
) 中で超音波処理した。超音波処理は懸濁液が澄んだ黄色となり(懸濁液A)、
倍率1000の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなる
まで(脂質の量および性質により数秒から数分間)、続けた。
ムの懸濁液中で40w/w%デキストラン500,000と混合した。この混合
物は次いで、15w/w%PEG−8,000〔PEG8000/(懸濁液A)
〕中へシリンジを経て注入して、懸濁液Bを得た。攪拌速度は800〜1,00
0rpmであった。ZnCl2溶液(100mM)を懸濁液に添加して、最終濃
度1mMを達成した。
洗浄緩衝液を容量比、1:1にて懸濁液Bに添加した。懸濁液に渦巻きを作り(v
ortex)、30分間、2〜4℃で3000rpmにて遠心分離した。上清を除去し
た後、別の洗浄緩衝液を容量比、0.5:1にて添加し、続いて同じ条件で遠心
分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図1に詳細に記載され
る。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用して再構築し
た。レーザー光散乱(重量分析、Coulter N4 Plus)からAmB−Zn−コクリ
エートの生成を確認した。
を得るために、調製手法を使用して段階的に実施した。 図3a、bおよび4a〜fに見られる顕微鏡による像は、Ca2+イオンによ
り沈殿したAmB負荷ヒドロゲル単離コクリエートの各調製段階における形態上
の変化を示す。AmB/リポソーム−デキストラン混合物がPEG溶液に分散さ
れると、相分離が図3aによって示されるように生じた。リポソームの分配はA
mBの黄色によって示されるように、分散デキストラン相を好んだ。この分配は
各デキストラン粒子にリポソームが単離されることを確証する。連続相(PEG
)中へのカルシウムイオンの添加は、分散相の沈殿生成となった。最終産物とし
て、小さな針状コクリエートが形成され、顕微鏡下に観察され、これらのコクリ
エートはEDTAの添加およびカルシウムのキレートによって単層小胞中へ開い
た(図4a、b)。針状形態は、凍結破砕後、走査電子顕微鏡によって確認され
さた(図5)。空およびAmB−Zn−沈殿ヒドロゲル単離コクリエート(図4
c、d)および空Zn−沈殿ヒドロゲル単離コクリエート(図4e、f)におい
て同様な顕微鏡像を得た。
ビトロ抗菌活性 カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の成長阻害 酵母のインビトロ感受性分析を行なったて、AmB−コクリエート、AmBア
イソマー(AmBのリポソーム生成)およびAmB/DMSOの阻害および致死
効果を比較した。新しく成長するカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の
5つのコロニーをYPD寒天プレートから(48時間培養物から)選択し、2m
lの2xYPDブロス、pH5.7へ添加した。この保存溶液のOD590を測
定し、酵母密度をOD590=0.1に調節し、この懸濁液0.1mlを96ウ
ェルプレートのそれぞれのウェルへ添加した。
ルプレートへ添加して、AmB最終濃度を0.078、0.156、0.312
5、0.625、1.25および2.5μg/mlとした。96ウェルプレート
を緩やかに攪拌しながら、37℃に加熱し、細胞密度を0、2、4、6、24お
よび30時間に、96ウェルプレートリーダー(Molecular Devices Spectramax
340)上で測定した。図6はAmB・コクリエートがAmBアイソマー(AmB
のリポソーム生成)よりも大きな成長阻害効果を有することを示す。
に希釈し(寒天培地上に置くために1:10000まで)、かつ、血算機(hemoc
ytometer) を使用して計数した。希釈酵母細胞50μlをYPD寒天プレート上
に置き、37℃で24時間、加熱した。黄色のコロニーはQuanitity One TMソフ
トウェアを装備したBioRad Fluor-S A Multi-Imager を使用して計数した。
5μgAmB/ml)で処理した酵母細胞について、加熱30時間後に全細胞数
に対するコロニー形成単位の割合をテストした。その結果はAmB/コクリエー
トがテストした他の抗菌剤に比べて、酵母細胞に対して最も大きな致死効果を有
することを示す。AmB・コクリエートによる処理後、酵母生存率はほぼ0%で
あり、AmB/DMSOによる処理後、酵母生存率は12%であった。AmBア
イソマーは効果的ではなく、酵母生存率52%であった(図7)。
線である。しかしながら、重度のヒトへの臨床的感染を誘導する多くの微生物は
マクロファージに感染し、破壊を避けることが示されている。
摂取において重要な役割を果たすことが可能である。マクロファージはまた宿主
防御および真菌類および寄生虫のクリアランスにおいて重要な役割を果たすから
、マクロファージとコクリエート間の相互作用を検討することが重要である。
マクロファージへ送達された大量のAmBは非毒性であると判断され、生物学的
活性形態にてマクロファージ内に残された。AmBコクリエートは真菌感染前ま
たは後に投与された場合、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)による感
染に対してマクロファージに保護をもたらした。
にて、DMEM+10%FBS中、1×105細胞/mlの濃度で継代培養した
。AmBコクリエート100μl(AmBc0.2、0.6、1.25、および
2.5μgAmB/ml)、フンギゾーン(Fungizone )、または空コクリエー
ト(2、6、12.5、および25μg脂質/mlのEC)を特定濃度で添加し
た。プレートを37℃で一夜、5%CO2中でインキュベートした。24時間後
、培地を取り換えた。この工程を2回行なった。カンジダ・アルビカンス(CA
)を濃度2.5×103細胞/ml、マクロファージに比べて1:200の割合
でプレートに添加した。プレートを上記した条件下に一夜インキュベートした。
よくピペットで取り出し、細胞を破砕し、この懸濁的25μlをサブロー・デキ
ストロース寒天プレート上に置き、次いで、37℃で一夜、ドライインキュベー
ター中に置いた。C.アルビカンスCFUを翌日、計数した。図8のデータはマ
クロファージを負荷したAmBコクリエートが真菌細胞の殺傷に非常に効果的で
あることを示唆した。
で継代培養し、次いで一夜、インキュベートした。インキュベート後、マクロフ
ァージにCAを200:1の割合で感染させ、次いで、AmBc、フンギゾン(
Fungizone)またはECを続いて特定濃度で添加した。24時間後、細胞培養物
を上記したように観察し、CFUを測定した。
再びほぼ零であった。これらの結果は、AmBコクリエートが洗い出された後、
マクロファージがC.アルビカンス感染に対して保護されたように、マクロファ
ージがAmBコクリエートを巻き込み、かつ集中化することを示す(図8)。
な臨床形状は、インビトロでマクロファージに対して極めて毒性および致死性を
示した。投与後、5時間以内にペトリ皿に大量の細胞性残骸が見られ、生きたマ
クロファージの徴候は見られなかった。
に対して毒性を有しないことを明らかにする。AmBコクリエートは高濃度で集
積して、大きな膨張小胞となる。マクロファージを洗浄し、再び24時間インキ
ュベートした後、大抵の小胞は正常な形態および大きさにもどり、なお、わずか
なものは著しく大きくなっていた。わずかなマクロファージですら、拡大した小
胞とともに「移動」していることが認められたた。AmBコクリエートは小胞内
に集中化し、おそらくAmBは時間とともに徐々に放出される。
mBの組織透過評価 アンホテリシンBの組織透過性は静脈投与後に評価した。C57BL/6マウ
ス(20〜23g)群(n=5)にAmBコクリエート(0.05mg/20m
l)を18g1/2針サイズを有する1/2ccU100インシュリンシリンジ
で静脈から(0.625mgq/kg)与えた。予定された屠殺時間(2、5、
10、20および40分、1、2、3、4、6、8、12、24、36および4
8時間)に動物に麻酔薬を与え、心臓穿刺して採血し、次いで安楽死させ、解剖
し、目的の組織(脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、脂肪、胃、胃内容物、腸お
よび腸内容物)を取り出し、重量測定した。AmB分析後、試料を抽出溶媒(1
0%メタノール、35%水、55%エタノール)と混合し、均質化し、超音波処
理して、遠心分離した。上清の部分標本90μlをマイクロバイアル中へ移送し
、40℃に保持したNova−Pak C−18カラム(3.9×150mm、
粒子サイズ4μm)のHPLCシステム中へ注入した。アンホテリシンBは29
%メタノール、30%アセトニトリルおよび41%2.5mM EDTAでもっ
て流速0.5ml/分にて溶出し、408nmにて検出した。AmB濃度は外部
標準曲線により計算した。
肝臓、脾臓および腎臓などの主要組織では大きな透過が見られた。
Bの経口投与 AmB負荷ヒドロゲル単離コクリエートの経口投与は、一夜絶食したC57B
L6マウス(20〜23g)へ実施例2の処方剤を胃内投与して試験した。9匹
のマウスへ用量10mg/kgにて処方剤1/10mlを投与した。各群から3
匹のマウスを投与後、1、6および24時間後に屠殺し、続いて器官および組織
のAmB濃度を分析した。
、メタノール10%、エタノール55%、w/w/w nv/v/v)を添加し
て1/20または1/10倍に希釈し、Ultra-TurrexR装置を使用して均質化し
た。部分標本0.5mlを取り出し、1分間超音波処理し、4℃で、12分間、
7260rpmにて遠心分離した。上清をHPLCマイクロバイアルへ移送し、
C−18、3.9×150mm、4μm粒子サイズの分析カラム上に40℃で流
速0.5mlにて、30μlを注入した。408nmで検出したAmB濃度は外
部標準曲線により計算した。
がプロットされるにすぎないが、主要組織(肝臓、肺、脾臓および腎臓)での集
積が見られる。
取を受け、1群は最後の用量後、24時間で屠殺され、他の群は最後の用量を受
けた後20日に屠殺された。予定された時点で、マウスに麻酔をかけ、致死させ
て、組織採取のために解剖した。組織を1回用量摂取のように処理して、AmB
濃度をHPLCにて測定した。10回目の用量後、24時間で得た結果を図11
に示し、ヒドロゲル単離コクリエートは治療濃度で胃腸管からAmBの送達を可
能とすることを示す。
ダ・アルビカンス濃度の相関関係 図12はアンホテリシンBの組織濃度(左スケールのμg/g組織)とAmB
・コクリエートの経口投与後のカンジダ・アルビカンス感染の減少としての効果
(右スケールのCFU/g)との関係を示す(図12)。
mBが腎臓、続いて肺、脾臓、肝臓および脳で高い濃度を示した。これは他の組
織よりもより低い濃度を示す。これは疾患状態が異なった濃度で薬剤の薬学動態
に影響することを示す。この現象はグラフから明らかに示される。組織中のAm
Bは5回以上、15日間、10mg/kg/日(同じ用量)を経口投与した後の
C.アルビカンス感染マウスでは健康群よりも低濃度に達する。これは肺が最低
濃度を示す標的組織である場合の分布パターンにおける変化を示す。
い効果をもたらした。腎臓組織中のCFU/gの減少はコクリエート処方剤にお
いて約3.5logである。肺では、AmBコクリエート処方剤は完全にC.アル
ビカンスを皆無とし、真菌感染の肺をきれいにする。コクリエート送達システム
は感染動物に高濃度のAmBをもたらし、これはコクリエート処方剤に見られた
高効率と関連し、AmBコクリエートは、全身性カンジダ症の経口治療の適切な
ビヒクルであることを示す。
ですら(AmBコクリエート10、20および50mg/kgを与えられたマウ
スの腎臓、GI管および他の器官で損傷は見られなかった)、非毒性であった。
この高い濃度(50mg/kg)はカンジダ感染マウスモデルにおいて生存率1
00%を示した最低用量(0.5mg/kg)の100倍と均等である。
しで得る方法の概念図である。
ンB(AmB)を負荷した(図2a)、あるいは空の(図2b)ヒドロゲル単離
コクリエート粒子サイズ分布(重量分析)を示す。
リポソーム混合物の顕微鏡像である。小さな黒点は、PEG相中にデキストラン
相を分散させて形成したデキストラン粒子である。大きなオープン円は小さなデ
キストラン粒子の溶融によって形成される。リポソーム分配は、AmBの黄色に
よって示されるようにデキストラン相を好む。3bはCaCl2溶液によって処
理した後の図3aに示される試料の顕微鏡像である。矢印で示される円中の黒色
物は、Ca2+イオンの添加によって形成されたコクリエートである。
含む緩衝液で洗浄した後の図3aおよび3bに示される試料の顕微鏡像である。
凝集体はコクリエート粒子によって形成される。4bはEDTAの添加後の図4
aに示される懸濁液を示す。直径1〜2ミクロンのリポソームに対して開口し、
コクリエート粒子の固有サイズを示すコクリエート粒子は、ミクロン以下の範囲
内にある。4cは実施例4に記載される方法に従って亜鉛で沈殿させたAmBヒ
ドロゲル単離コクリエートを示す。4dはEDTAで処理した後の図4cに示す
コクリエートを示す。4eは実施例3に記載される方法に従って亜鉛で沈殿させ
た空ヒドロゲル単離コクリエートを示す。4fはEDTAで処理した後のコクリ
エートを示す。
る。
単離コクリエートによるカンジタ・アルビカンス(Candida albicans)の成長阻害
を示す。DMSO中のAmBおよびAmBアイソマーRと対比する。
生存可能性へのヒドロゲル単離コクリエートの影響を示す。
効果を示す。
リシンB濃度を示す。
与後の組織でのAmB濃度の時間的経過を示す。
4時間の組織でのAmB濃度を示す。
B濃度とカンジダ・アルビカンス濃度との間の相関関係を示す。
Claims (63)
- 【請求項1】 a)リポソームの水溶性懸濁液を準備し、 b)該リポソーム懸濁液をポリマーAと混合し、 c)ポリマーBを含む溶液中に該リポソーム/ポリマーA懸濁液を添加し、そ
の際、ポリマーAとポリマーBは非相溶性であり、それによって2相ポリマー系
を形成し、 d)該2相ポリマー系へカチオン成分の溶液を添加し、かつ、 e)該2相ポリマー系を洗浄してポリマーを除去する 工程を含む脂質主体コクリエートを製造する方法。 - 【請求項2】 前記リポソーム/ポリマーA懸濁液の添加を注入により行う、
請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 前記リポソームは負に荷電した脂質を含む脂質から形成される
、請求項1または請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 前記負に荷電した脂質はホスファチジルセリンである、請求項
3記載の方法。 - 【請求項5】 前記脂質は少量の他の脂質を含む、請求項3または請求項4記
載の方法。 - 【請求項6】 前記他の脂質は両性イオン性脂質の群から選択される、請求項
5記載の方法。 - 【請求項7】 前記他の脂質はカチオン性脂質の群から選択される、請求項5
記載の方法。 - 【請求項8】 前記他の脂質は生物学的に活性な分子と水素結合を形成するこ
とが可能である脂質の群から選択される、請求項5記載の方法。 - 【請求項9】 前記中性脂質はPEG化した脂質である、請求項8記載の方法
。 - 【請求項10】 前記ポリマーAはデキストランおよびポリエチレングリコー
ルからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーである、先の請求項のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項11】 前記2相ポリマー系中のポリマーAの濃度は、2〜20w/
v%の濃度範囲である、先の請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項12】 前記ポリマーBはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、フィコール、ポリビニルメチルエーテルおよびポリエチレングリコールか
らなる群から選択される少なくとも1つのメンバーである、先の請求項のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項13】 前記2相ポリマー系中のポリマーBの濃度は、2〜20w/
w%の範囲である、先の請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項14】 前記2相ポリマー溶液は、デキストラン/ポリエチレングリ
コール、デキストラン/ポリビニルピロリドン、デキストラン/ポリビニルアル
コール、デキストラン/フィコールおよびポリエチレングリコール/ポリビニル
メチルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーである、先
の請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項15】 前記カチオン成分は、2またはそれ以上の多価イオンを含む
、先の請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項16】 前記カチオン成分は、2またはそれ以上の多価金属イオンを
含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項17】 前記金属イオンは無機酸の塩として添加し、好ましくは、そ
の際、該塩は塩化カルシウム、塩化亜鉛または塩化コバルトである、請求項16
記載の方法。 - 【請求項18】 前記脂質コクリエートは、小型コクリエートである、先の請
求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項19】 前記コクリエートのサイズは1ミクロンより小さい、請求項
18記載の方法。 - 【請求項20】 前記コクリエートは小さな単層リポソームを使用して形成す
る、請求項18記載の方法。 - 【請求項21】 前記リポソームの水溶性懸濁液は生物学的関連分子を含み、
それによって、該コクリエートもまた生物学的関連分子を含む、先の請求項のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項22】 前記生物学的関連分子と脂質の混合物を含む薄膜を形成し、
小さな単層リポソームの水溶性懸濁液を形成する水溶性相と該薄膜を接触させる
ことによって、リポソーム懸濁液を形成する予備的工程を含む、請求項21記載
の方法。 - 【請求項23】 前記生物学的関連分子は水溶性相中に存在する、請求項21
記載の方法。 - 【請求項24】 前記脂質の薄膜を生物学的関連分子を含む水溶性相と接触さ
せて、リポソームの水溶性懸濁液を形成するリポソーム形成予備的工程を含む、
請求項23記載の方法。 - 【請求項25】 空リポソームの懸濁液を生物学的関連分子と混合して、前記
リポソーム懸濁液を形成する予備的工程を含む、請求項21記載の方法。 - 【請求項26】 前記生物学的関連分子は電荷を有する、請求項23記載の方
法。 - 【請求項27】 前記生物学的関連分子は正に荷電されている、請求項26記
載の方法。 - 【請求項28】 生物学的関連分子は負に荷電されている、請求項26記載の
方法。 - 【請求項29】 前記負に荷電されている分子はポリヌクレオチドである、請
求項28記載の方法。 - 【請求項30】 前記ポリヌクレオチドはDNAである、請求項29記載の方
法。 - 【請求項31】 a)界面活性剤・脂質混合物を含む水溶性懸濁液を準備し、 b)該界面活性剤・脂質懸濁液をポリマーAと混合し、 c)該界面活性剤・脂質/ポリマーA懸濁液をポリマーBを含む溶液中に添加
し、その際、ポリマーAおよびポリマーBは非相溶性であり、それによって、2
相ポリマー系を形成し、 d)該2相ポリマー系にカチオン成分を添加し、かつ、 e)該2相ポリマー系を洗浄してポリマーを除去する 工程を含む脂質主体コクリエートを製造する方法。 - 【請求項32】 前記界面活性剤はオクチルグルコシドである、請求項31記
載の脂質主体コクリエートの製造方法。 - 【請求項33】 前記コクリエートは生物学的に活性な分子を含む、請求項3
1記載の脂質主体コクリエートの製造方法。 - 【請求項34】 前記生物学的に活性な分子は電荷を有する、請求項33記載
の方法。 - 【請求項35】 前記生物学的に活性な分子は正に荷電されている、請求項3
3記載の方法。 - 【請求項36】 前記生物学的に活性な分子は負に荷電されている、請求項3
3記載の方法。 - 【請求項37】 前記負に荷電されている分子はポリヌクレオチドである、請
求項36記載の方法。 - 【請求項38】 前記ポリヌクレオチドはDNAである、請求項37記載の方
法。 - 【請求項39】 前記生物学的に活性な分子は工程aにて添加される、請求項
31記載の方法。 - 【請求項40】 前記生物学的関連分子は薬剤、ポリヌクレオチド、ポリペプ
チドおよび抗原からなる群から選択される、請求項21または請求項33記載の
方法。 - 【請求項41】 前記生物学的関連分子は、抗ウイスル剤、麻酔薬、抗菌剤、
抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症
剤、精神安定薬、および血管拡張薬からなる群から選択される薬剤である、請求
項40記載の方法。 - 【請求項42】 前記薬剤は、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマ
イシン、カバマゼピン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロ
キセン、エストロゲン、テストステロン、ステロイド、フェニトイン、エルゴタ
ミン、カナビノイド、ラパマイシン、プロパニジッド、プロポフォール、アルフ
ァジオン、エチノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキソールおよび
タキソテレからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項
41記載の方法。 - 【請求項43】 前記洗浄工程は、2相ポリマー系を遠心分離してコクリエー
ト沈殿物を分離し、ポリマーを含む上清を除去し、洗浄用緩衝液中に沈殿物を再
懸濁し、洗浄沈殿物を遠心分離し、かつ、所望により再懸濁と遠心分離工程を1
回またはそれ以上に繰り返すことを含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項44】 前記洗浄用緩衝液は溶解したカチオン成分を含む、請求項4
3記載の方法。 - 【請求項45】 前記カチオン成分は2またはそれ以上の多価イオンを含む、
請求項44記載の方法。 - 【請求項46】 前記2またはそれ以上の多価イオンは金属イオンである、請
求項45記載の方法。 - 【請求項47】 前記金属イオンはカルシウムおよび亜鉛から選択される、請
求項46記載の方法。 - 【請求項48】 前記カチオン成分は洗浄用緩衝液中に少なくとも1mMの濃
度で存在する、請求項43から47のいずれかに記載の方法。 - 【請求項49】 請求項1〜48により調製された、生物学的関連分子を含む
コクリエート。 - 【請求項50】 1ミクロン以下の平均粒子サイズを有する、請求項49記載
の生物学的関連分子を含むコクリエート。 - 【請求項51】 前記生物学的関連分子は薬剤、ポリヌクレオチド、ポリペプ
チドおよび抗原からなる群から選択される、請求項49記載のコクリエート。 - 【請求項52】 前記生物学的関連分子は、抗ウイスル剤、麻酔薬、抗菌剤、
抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症薬、非ステロイド系抗炎症
薬、精神安定薬、および血管拡張剤からなる群から選択される薬剤である、請求
項51記載のコクリエート。 - 【請求項53】 前記薬剤は、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマ
イシン、カバマゼピン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロ
キセン、エストロゲン、テストステロン、ステロイド、フェニトイン、エルゴタ
ミン、カナビノイド、ラパマイシン、プロパニジッド、プロポフォール、アルフ
ァジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキソールおよび
タキソテレからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項
52記載のコクリエート。 - 【請求項54】 前記生物学的関連分子を宿主へ送達する方法において使用す
る、請求項49〜53記載のコクリエートまたは請求項1〜48のいずれかに記
載の方法の生産物。 - 【請求項55】 ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するか、あるいは生物
学的関連分子を宿主へ送達する組成物の製造における請求項49〜54記載のコ
クリエートまたは請求項1〜48記載の方法の生産物の使用。 - 【請求項56】 請求項49〜54のいずれか記載のコクリエートまたは請求
項1〜48のいずれか記載の生産物のヒトまたは動物への投与を含む治療方法。 - 【請求項57】 前記投与は粘膜または全身性経路による請求項55記載の使
用または請求項56記載の方法。 - 【請求項58】 前記投与は、経口、経鼻、眼内、肛門内、膣内、非経口また
は肺内から選ばれる粘膜経路である、請求項57記載の使用または方法。 - 【請求項59】 前記経路は経口である、請求項57記載の使用または方法。
- 【請求項60】 前記投与はエアロゾルによって行なう、請求項58記載の使
用または方法。 - 【請求項61】 前記投与は全身性であり、静脈内、筋肉内、皮下、経皮また
は皮内から選択される経路による、請求項57記載の使用または方法。 - 【請求項62】 請求項49〜54のいずれかに記載のコクリエートまたは請
求項1〜48のいずれかに記載の方法の生産物、および担体を含む組成物。 - 【請求項63】 請求項49〜54のいずれかに記載のコクリエートまたは請
求項1〜48のいずれかに記載の方法の生産物、および薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物。
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