JP2003529557A

JP2003529557A - コクリエート製剤、その調製方法および生物学的関連分子投与のための用途

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Publication number: JP2003529557A
Application number: JP2001552865A
Authority: JP
Inventors: レイラザリフ; ツオジン; イグナシオセガッラ; ラファエルジェイ．マンニーノ
Original assignee: バイオデリバリーサイエンスインコーポレーテッド; ユニバーシティオブメディシンアンドデンティストリオブニュージャージー
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2003-10-07
Also published as: WO2001052817A3; EP1259224A2; CA2397792A1; AU3111401A; WO2001052817A2

Abstract

(57)【要約】【課題】小さなサイズの脂質主体コクリエートを製造する方法の提供。【解決手段】コクリエートは水溶性２相ポリマー溶液に懸濁されたリポソームから誘導され、相分離による極性分子主体構造の差動的分配を可能とする。Ｃａ ^２＋またはＺｎ^２＋などの正に帯電した分子で処理したリポソーム含有２相ポリマー溶液は、１ミクロン未満の小さな粒子サイズのコクリエート沈殿物を形成する。この方法は生物学的関連分子を含むコクリエートを製造するために使用してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は新規な脂質主体コクリエート（渦巻形）送達システムの調製方法、薬
剤、炭水化物、ビタミン、ミネラル、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質等
の脂質主体コクリエート送達システムから得られる製剤、およびこれらの製剤の
使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】

経口経路にて投与される生物学的関連分子の性能は、いくつかの要因に依存す
る。生物学的関連分子は、該生物学的関連分子が活性輸送機構のための生物学的
膜を通って移送されるためには、消化液中に溶解しなければならないか、あるい
は小腸のパイエル板を通り、かつ、リンパ系を通って吸収され得る適当に小さな
粒子サイズでなければならない。粒子サイズは経口投与が達成されるべき場合に
は重要なパラメーターである（Couvreur P. et al, Adv. Drug Delivery Review
s 10:141-162, 1993) 。

【０００３】薬剤を経口にて投与する性能における第１の問題は、タンパク分解酵素から薬
剤を保護することである。理想的な手法とは、薬剤を疎水性物質中に組み入れて
、水溶性液体がこのシステムを通過できないようにすることである。脂質主体
コクリエートは、この目的を達成できる理想的なシステムである。

【０００４】コクリエートの利点は数多い。コクリエートは非水溶性構造を有し、したがっ
て、それらは：ａ）脂質が酸化されないから、より安定である；ｂ）凍結乾燥して貯蔵され得る；それは室温で長期間、貯蔵される潜在性をもた
らし、全世界への輸送や投与までの貯蔵において長所となるであろう；ｃ）凍結乾燥後ですら、その構造を維持する；一方、リポソーム構造は凍結乾燥
によって破壊される；ｄ）コクリエート構造の脂質２相中への生物学的関連分子の有効な組み入れを示
す；ｅ）コクリエートが解離するにつれて、インビボにて生物学的関連分子を低放出
する潜在性を有する；ｆ）担体として作用する脂質２相を有し、かつ動物および植物細胞膜に見られる
単純脂質から構成される；そのため脂質は非毒性である；ｇ）容易に、かつ安全に製造される；ｈ）所定量および割合の薬剤または抗原から構成される一定の製剤として製造さ
れ得る。

【０００５】コクリエート構造は大単層状小胞の調製における中間物質として、D. Papahad
jopoulosによって最初に調製されている（米国特許第4,078,052 号参照）。ワ
クチンとしてタンパクまたはペプチド分子を送達するコクリエートの使用は、米
国特許第5,840,707 号と5,643,574号に記載されている。また、薬剤、栄養剤、
調味料を送達するコンクエートの使用は、米国特許5,994,318号に記載されてい
る。しかし、小さなサイズでのコクリエートの使用上の利点は最近ようやく調査
されるようになったにすぎない。効果的なヒドロゲル単離コクリエートを媒介し
た薬剤経口送達は米国特許出願09/235,400に記載されている。しかしながら、効
果的なヒドロゲル単離コクリエートの送達の他生物学的関連分子である薬剤、ポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、サッカ
ロイド、調味料オイルなどについては言及していない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の目的は１ミクロン未満の粒子サイズを有するヒドロゲル単離コクリエ
ートを得る方法を提供することにある。さらに、該方法は有効な量のヒドロゲル
単離コクリエート中で少なくとも１つの生物学的関連分子を渦巻形（encochleat
e）とすることを必要とする工程を含む。

【０００７】「生物学的関連分子」とは、生物の生命過程において役割を果たすものである
。この分子は有機物または無機物、モノマーまたはポリマー、宿主生物にとって
内因性またはそうでないもの、天然に産生またはインビトロ合成のものなどであ
ってもよい。すなわち、その例としては、ビタミン、ミネラル、調味料、アミノ
酸、毒素、殺菌剤、静菌剤、補因子、酵素、ポリペプチド、ポリペプチド凝集体
、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、澱粉、顔料、脂肪酸、ホ
ルモン、サイトカイン、ウイルス、オルガネラ、ステロイドおよび他の多環状構
造物、糖類、金属、代謝毒物、薬剤などが挙げられる。

【０００８】これらおよび他の目的は、渦巻形の生物学的関連分子を提供することによって
達成される。その際、生物学的関連分子-コクリエートは下記成分を含む; ａ）生物学的関連分子ｂ）負に帯電した脂質、およびｃ）カチオン成分その際、渦巻形の生物学的関連分子の粒子サイズは、１ミクロン未満である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】

本発明は新規な方法を使用して1ミクロン未満の小さなサイズのコクリエート
を生産して、薬剤と他生体関連物質の有効な経口投与を達成する方法を提供する
。この新規な方法は、ともに水溶性である２種のポリマー溶液間の非相溶性に基
づく。ポリマーの水溶性２相系は、有機溶媒の必要性がないこと、マイルドな表
面張力、および水溶性ポリマーの生体適合性などの多くの利点を有することから
、タンパク精製においてよく使用されている（P.A. Albertsson in "Partition
of cell particles and macromolecules", 3^rd edition, Wiley NY 1986;および
"Separation using aqueous Phase System" D. Fischer Eds, Plenum, NY, 1989
参照）。例えば、タンパクなどの大きな極性分子は、ＰＥＧのそれに似た物理的
特性をもつポリマー相中よりも、デキストランのそれに似た物理的特性をもつポ
リマー相中でより高い濃度に分配することが公知である（Forciniti, et al.,
Biotechnol. Bioeng. 38, 986, 1991参照）。

【００１０】本発明では、小型脂質主体コクリエート粒子およびこれらから誘導した該粒子
中に組み込まれた生物学的関連分子を含む製剤の調製方法を提供する。コクリエ
ート粒子は脂質２相／カチオンの交互配列から形成されている。生物学的関連分
子は脂質２相または脂質２相間の空間のいずれかに組み込まれている。小サイズ
コクリエートの調製方法の１つは、１）小単層状リポソームまたは生物学的関連
分子負荷リポソームの懸濁液を調製し、２）該リポソーム懸濁液をポリマーＡと
混合し、３）ポリマーＡが非相溶性であって、ポリマーの水溶性２相系となる他
のポリマーＢ中へ、好ましくは注入によってリポソーム／ポリマーＡ懸濁液を添
加し、４）工程３の２相系へカチオン塩溶液を添加して、カチオンがポリマーＢ
中へ、次いで、リポソーム／ポリマーＡからなる粒子中へ拡散し、小型コクリエ
ートを形成し、５）ポリマーを洗い出し、生理的緩衝液または適当な薬学的ビヒ
クル中へ空、薬剤または他生体関連物質負荷コクリエートを再懸濁することを含
む。

【００１１】小サイズコクリエートを調製する第２の方法は、界面活性剤と生物学的関連分
子とカチオンを含む。界面活性剤はリポソームの粉砕のために加えた。この方法
は下記工程を含む。１）界面活性剤-脂質混合物を含む水溶性懸濁液を準備し、２）該界面活性剤-脂質懸濁液をポリマーＡと混合し、３）ポリマーＢを含む溶液中に該界面活性剤-脂質／ポリマーＡ懸濁液を添加
し、その際、ポリマーＡとポリマーＢは非相溶性であり、それによって２相ポリ
マー系を形成し、４）該２相ポリマー系へカチオン成分の溶液を添加し、かつ、５）該２相ポリマー系を洗浄して、ポリマーを除去する。

【００１２】凍結乾燥手法が適用されて、凍結乾燥した生物学的関連分子-コクリエート複
合体は、全身、皮膚または粘膜からの投与のために、柔らかいかあるいは固いゼ
ラチンカプセル、タブレットまたは他の用量形態中に充填され得る。

【００１３】前述の両方の方法は、生物学的関連分子の有効な経口投与を可能とする狭いサ
イズ範囲をもつ小さいサイズの粒子となる。生物学的関連分子は脂質２相および
その中間のいずれか、あるいは双方へ分配し、生物学的関連分子はインビボで粒
子の解離によってコクリエート粒子から放出される。投与の別な経路は、筋肉内
、皮下または静脈内などの全身性、または鼻内、眼内、膣内、肛門内、非経口ま
たは肺内などの粘膜からであってもよい。適当な用量は、例えば、実験室動物ま
たは臨床試験での用量反応実験から、および患者の体重、吸収率、半減期、疾患
の重症度などを考慮して決定され得る。用量回数、日々の用量および治療過程は
個々人により異なるであろう。他の投与経路は皮膚、経皮膚、また皮膚内である
。

【００１４】本発明の何れかの方法の第１工程は、小さなリポソームの調製であり、超音波
または微細流動化、または他の関連方法（例えば、Liposome Technology, Lipos
ome Preparation and Related Techniques, Edited by Gregory Gregoriadis,Vo
l. I, 2^nd Edition, CRC Press, 1993）によって達成され得る。

【００１５】本発明の何れかの方法の第２工程は、好ましくは注入によるポリマーＢ中への
ポリマーＡ／リポソーム懸濁液の添加を、適当な制御速度、例えば、０．１ｍｌ
／分〜５０ｍｌ／分、好ましくは１〜１０ｍｌ／分の速度でシリンジポンプを使
用して機械的に行い得ることになる。

【００１６】ヒドロゲル単離コクリエートの生成（生物学的関連分子とともに、あるいは該
分子なしで）はリポソームを含む水溶性２相ポリマー溶液へ正に帯電した分子を
添加して達成される。正に帯電した分子は、多価カチオンであり、より具体的に
はコクリエート生成を誘導することができる２価カチオンである。好ましい態様
では、２価カチオンとしては、Ｃａ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、Ｂａ^＋＋およびＭｇ^＋＋あ
るいは２価イオンを生成可能な他の要素または負に帯電した脂質とキレートおよ
び架橋できる多数の正電荷を有する他の構造物が挙げられる。リポソーム含有溶
液への正に帯電した分子の添加もまた、水溶液からコクリエートを沈殿させるた
めに使用される。

【００１７】コクリエート構造物を単離し、ポリマー溶液を除去するために、コクリエート
沈殿物は正に帯電した分子、より具体的には２価カチオン、を含む緩衝液で繰返
して洗浄される。洗浄緩衝液への正に帯電した分子の添加は、コクリエート構造
が洗浄工程を通じて維持され、これらが沈殿物のままであることを確証する。

【００１８】最後に、コクリエートが懸濁される媒体は、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化コ
バルト、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、
硫酸マグネシウムおよび炭酸ナトリウムなどの塩を含むことができる。この媒体
はプルオレニックス（pluoronics）、ポリエチレングリコーゲンなどのポリマー
を含むことができる。生物学的関連分子-コクリエートは生物学的に許容される
適当なビヒクル（例、２価カチオン含有緩衝液）中に希釈して製造される。

【００１９】本発明の脂質は非毒性脂質であり、動物および植物細胞膜に見出される単純脂
質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、脂質は負に帯電した脂
質、より好ましくは、負に帯電したホスホリピド、およびさらに好ましくは、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびホ
スファチジルグリセロールの群からの脂質である。この脂質もまた、少量の両性
イオン性脂質、カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、またはＰＥＧ化した脂質
などの生物学的関連分子と水素結合を形成することが可能な中性脂質を含む。

【００２０】本発明のポリマーＡおよびＢは、水溶性２相系を形成することができる全ての
生物学的適合性ポリマーの群からなる。例えば、ポリマーＡはデキストラン２０
０，０００〜５００，０００、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３，４００〜
８，０００で挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーＢはポリビニルピ
ロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、フィコール３０，００
０〜５０，０００、ポリビニルメチルエーテル（ＰＶＭＢ）６０，０００〜１６
０，０００、ＰＥＧ３，４００〜８，０００が挙げられるが、これらに限定され
ない。ポリマーＡの濃度は、ポリマーの性質に依存して最終濃度２〜２０ｗ/ｗ
％の範囲である。ポリマーＢにおいても同じ濃度が適用され得る。適当な２相系
の例としては、４〜１０ｗ/ｗ％ＰＥＧ３，４００〜８，０００中、５〜２０ｗ/
ｗ％デキストラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／ＰＥ
Ｇ、１０〜２０ｗ/ｗ％ＰＶＰ１０，４００〜２０，０００中、１０〜２０ｗ/ｗ
％デキストラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／ＰＶＰ、
３〜１５ｗ/ｗ％ＰＶＡ１０，０００〜６０，０００中、３〜１５ｗ/ｗ％デキス
トラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／ＰＶＡ、１０〜２
０ｗ/ｗ％フィコール３０，４００〜５０，０００中、１０〜２０ｗ/ｗ％デキス
トラン２００，０００〜５００，０００であるデキストラン／フィコール、６〜
１５ｗ/ｗ％ＰＶＭＥ６０，０００〜１６０，０００中、２〜１０ｗ/ｗ％ＰＥＧ
３，５００〜３５，０００であるＰＥＧ／ＰＶＭＥがある。

【００２１】生物学的関連分子は、生物の生命過程において役割を果たす分子である。この
分子は有機物または無機物、モノマーまたはポリマー、正または負の電荷を帯び
ているもの、水溶液で、親水性、両親媒性または疎水性、宿主生物にとって内因
性またはそうでないもの、天然に産生またはインビトロ合成のものなどであって
もよい。

【００２２】この生物学的関連分子は薬剤であってもよく、薬剤は抗ウイルス剤、麻酔薬、
抗炎症剤、抗菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系炎症剤、非ステロイド系
抗炎症剤、精神安定剤、または血管拡張剤であってもよい。その例としては、ア
ンホテリシンＢ、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン、メルファラ
ン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン、テストステ
ロン、ステロイド、フェニトイン、エルゴタミン、カナビノイド、ラパマイシン
、プロパニジッド、プロポフォール、アルファジオン、エチノマイシン、硝酸ミ
コナゾール、テニポシド、タキソール、タキソテレ、ナイスタミン、リファピリ
ン、ビタミンＡ酸が挙げられる。

【００２３】生物学的関連分子はシクロスポリン、アンジオテンシンＩ、IIおよびIII 、エ
ンケファリンおよびその類似体、ＡＣＴＨ、抗炎症性ペプチドＩ、II、III 、ブ
ラジキニン、カルシトニン、ｂeta−エンドルフィン、ジノルフィン、ロイコキ
ニン、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インシュリン、ニューロキニ
ン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、チロイド分泌ホルモン（ＴＲＨ）および
バソプレシンなどのペプチドであってもよい。

【００２４】生物学的関連分子は抗原であってもよいが、該抗原はタンパク抗原に限定され
ない。抗原はまた炭水化物またはＤＮＡなどのポリヌクレオチドであってもよい
。抗原性タンパクの例としては、ウイルスからの外皮糖タンパク、動物細胞膜タ
ンパク、植物細胞膜タンパク、細菌性膜タンパクおよび寄生虫膜タンパクが挙げ
られる。ポリヌクレオチドの例としては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。ポ
リヌクレオチドはプラスミドＤＮＡの形であってもよい。ポリヌクレオチドは生
物活性ポリペプチド、例として酵素、構造または機能蛋白質を発現させる１つの
ものである。さらに、ポリヌクレオチドは発現される必要がないが、免疫源、リ
ボソーム、またはアンチセンス分子であってもよい。

【００２５】生物学的関連分子はビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸および糖等の栄養
素であってもよい。具体例としてビタミンＡ,Ｄ,ＥまたはＫ、カルシウム、マグ
ネシウム、バリウム、鉄または亜鉛のようなミネラル類、ポリ不飽脂肪酸または
必須油、アミノ酸、グルコースまたはスクロースのような糖が挙げられる。

【００２６】生物学的関連分子は調味料物質であってもよい。例として一般的に必須油と結
合して扱われるシナモン油、およびハーブ、シトラス、香味料または種などの植
物源由来の抽出物が挙げられる。油/抽出物は酸化による分解に過敏であり、油/
抽出物の製法は通常多段階の操作を必要とするため、一般的に費用が高いと考え
られている。油/抽出物コクリエートの利点は他の揮発性または高価な風味物質
の安定化処理である。また調味料コクリエートは風味強化剤として消費食品剤中
に組込むことができる。

【００２７】生物学的関連分子は公知方法によって起源である粒子、細胞、組織または生体
から抽出される。生物学的関連分子の生物活性は維持される必要はない。しかし
、いくつかの例（例えば、タンパクが膜溶融またはリガンド結合活性または免疫
系によって認識される複合構成を有する場合）では、生物活性を維持することが
望ましい。これらの例では、膜タンパクの生物活性を破壊しない界面活性剤を含
む抽出緩衝液が使用される。適当な界面活性剤としては、コール酸塩、デオキシ
コール酸塩などのイオン性界面活性剤、またはツイーン(Tween) 、ＢＲＩＧまた
はトリトン(Triton)などの異種ポリオキシエチレン界面活性剤が挙げられる。

【００２８】この方法を使用すると、生物活性を保持して抗原、より具体的にはタンパクの
リポソーム中への再構成、および終局的にはコクリエートとの有効な解離を可能
とする。これは、生物学的活性形において抗原の有効な再構成に悪影響を与える
有機溶媒、超音波、または極端なｐＨ、温度、または圧力を避けることができる
。

【００２９】ヒドロゲル単離コクリエートは種々の生物学的関連分子の組み合わせを適当に
含んでいてもよい。

【００３０】コクリエート粒子は腸溶性である。コクリエート粒子はゼラチンカプセル内に
配置することができ、このカプセルは腸溶性被覆され得る。

【００３１】本発明の調製法では、ある種の疎水性物質が生物学的関連分子の経口投与にお
ける増大した吸収性能をもたらすために添加され得る。これらの物質は好ましく
は長鎖カルボン酸、長鎖カルボン酸エステル、長鎖カルボン酸アルコールおよび
これらの混合物からなる群から選択される。疎水性物質はリポソーム生成前に、
最初に、あるいは乳化液などの脂肪性ビヒクルの形態として、後の工程で脂質に
添加することができる。

【００３２】当業者は、本発明を実施して治療をなし遂げるために、最も有効な治療手段を
決定することができる。多くの権威ある文書や参考文献の全て、例えば、"Goodm
an & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics", (6^th Ed., Go
odman et al., eds., MacMillan Publ. Co., New York, 1980)を参照することが
できる。

【００３３】ここに実施例により本発明を説明するが、これらは本発明を限定するべきもの
ではない。実施例中、断りのないかぎり、全ての割合、パーセントおよび量は重
量によるものである。

【００３４】

【実施例】

実施例１カルシウムにより沈殿したジオレオイルホスファチジルセリンから
空ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状小胞の調製ジオレオイルホスファジルセリン（DOPS, Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL, USA)のクロロホルム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を丸底フラスコに入れ、ブチ(B
uchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃で乾燥して薄膜とした。この回転式蒸発
器は０．２μｍのフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。次工程は無
菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で
水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封して、次いで冷却され、浴式超音波
発生装置（Laboratory Supplies Com., Inc.) 中で超音波処理した。超音波処置
は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可
視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から
数分間）続けた。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から平均直径
が３５．７±４９．７ｎｍであることを示す。

【００３５】工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソ
ームの懸濁液中で、４０ｗ/ｗ％デキストラン５００，０００（Sigma)と混合し
た。この混合物を、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００（Sigma ）〔ＰＥＧ８００
０／（懸濁液Ａ）〕中へ磁性攪拌しつつ、シリンジで注入して懸濁液Ｂを得た。
攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００３６】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２および１５０ｍＭＮａＣｌを
含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。この懸濁液を攪拌し
（vortex）、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除
去した後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で
遠心分離した。コクリエートを得るこの新規な方法の概念は、図１に詳細に記載
される。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構成した。
レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から、コクリエートの平均直径
が４０７．２±８５ｎｍであることを示す（図２Ｂ）。

【００３７】実施例２カルシウムにより沈殿したジオレオイルホスファチジルセリンと１
，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−ｎ
−〔ポリ（エチレングリコール）−５０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ〕の混合物から
の空ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１：小単層状小胞の調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）と１，２−ジステアロイル−ｓ
ｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−ｎ−〔ポリ（エチレングリコ
ール）−５０００〕、（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL, USA)のクロロホルム溶液（重量比、ＤＯＰＳ：ＤＳＰＳ−ＰＥＧ＝１００：
１）を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃で乾
燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴
射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／
ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封して
、次いで冷却された浴式超音波発生装置（Laboratory Supplies Com., Inc.) 中
で超音波処理した。超音波処置は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１００
０の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質
の量および性質により数秒から数分間）続けた。

【００３８】工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製次いで、工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソ
ームの懸濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン５００，０００と混合した。この混
合物は、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中
へシリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，０００ｒ
ｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１
ｍＭを達成した。

【００３９】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用
して再構成した。位相差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの
生成を示す。

【００４０】実施例３カルシウムにより沈殿したジオレオイルホスファチジルセリンとｎ
−オクチル−β−Ｄ−グルコ−ピラノシドの混合物からの空ヒドロゲル単離コク
リエートの調製工程１：小単層状小胞の調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液を丸底フラ
スコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃で乾燥して薄膜を得
た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌し
た。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜をｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コ−ピラノシド（ＯＣＧ）溶液１ｍｇ／ｍｌで、ＤＯＰＳ：ＯＣＧの重量比、１
０：１にて水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴
式超音波発生装置中で簡単に超音波処理した。

【００４１】工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得た懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸濁液中で４
０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物は、１５ｗ/ｗ
％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、
シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍ
であった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭ
を達成した。

【００４２】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。位相差光学顕微鏡は均一で非常に小さい針状のコクリエートの生成を示
す。

【００４３】実施例４カルシウムにより沈殿したアンホテリシンＢ負荷ヒドロゲル単離コ
クリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからのＡｍＢ負荷小単層状小胞の
調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＡｍＢメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）をモル比、１０：１にて
丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、４０℃で乾燥して
薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射し
て殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ／ｍｌの濃
度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却
された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸濁液が明るい黄
色になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポ
ソームが存在しなくなるまで続けた。

【００４４】工程２：ＡｍＢ−負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの
懸濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物
は次いで、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕
中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８
００〜１，０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添
加して、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００４５】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）からＡｍＢ-コクリエー
トの平均直径は４０７．３±２３３．８ｎｍであったことを示す（図２Ａ）。

【００４６】実施例５カルシウムにより沈殿したドキソルビシン（ＤＸＲ）負荷ヒドロゲ
ル単離コクリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＤＸＲ負荷小胞の
調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）と（ＤＸＲ）のメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比
、１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室
温で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を２５ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が明るいピンクになり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らか
に可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒
から数分間）続けた。

【００４７】工程２：ＤＸＲ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液５ｍｌは２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソー
ムの懸濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００（Sigma）と混合した
。この混合物は次いで、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（
懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。
攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）
を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００４８】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した（図１参照）。得られ
たペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構成した。レーザー光散乱
（重量分析、Coulter N4 Plus）から小サイズＤＸＲ・コクリエートの生成を確
認した。

【００４９】実施例６カルシムにより沈殿したシクロスポリンＡ（ＣＳＰＡ）負荷ヒドロ
ゲル単離コクリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＣＳＰＡ負荷小胞
の調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＣＳＰＡのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、
１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温
で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分
間）続けた。

【００５０】工程２：ＣＳＰＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの
懸濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物
は、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００（Sigma ）〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ
）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。攪拌速度
は８００〜１，０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液
に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００５１】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別な洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小サイズＣＳＰＡ
−コクリエートの生成を確認した。

【００５２】実施例７カルシウムにより沈殿したネルフィナビール（ＮＶＩＲ）負荷ヒド
ロゲル単離コクリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＮＶＩＲ負荷小胞
の調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＮＶＩＲのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、
１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温
で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分
間）続けた。

【００５３】工程２：ＮＶＩＲ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの懸
濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物は
、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気
攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，
０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最
終濃度１ｍＭを達成した。

【００５４】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別な洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小サイズＮＶＩＲ
−コクリエートの生成を確認した。

【００５５】実施例８カルシムにより沈殿したリファミピン（ＲＩＦ）負荷ヒドロゲル単
離コクリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＲＩＦ負荷小胞の
調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＲＩＦのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１
０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、室温で
乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガス
を噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂
質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分
間）続けた。

【００５６】工程２：ＲＩＦ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム（S
igma ）懸濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この
混合物は、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕
中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８
００〜１，０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添
加して、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００５７】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小サイズＲＩＶ−
コクリエートの生成を確認した。

【００５８】実施例９カルシムにより沈殿したビタミンＡ酸負荷ヒドロゲル単離コクリエ
ートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ビタミンＡ負荷小
胞の調製ビタミンＡ酸（レチノール酸）は空気酸化に対して感受性を有し、紫外線によ
って不活性化される。ビタミンＡは脂質２相内に包埋されると保護される。この
組み込みは下記のようにして達成される。ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とビタミンＡのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比
、１０：１（脂質：ビタミンＡ）にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式
蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィ
ルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾
燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度の脱イオン水で水和した。水和懸濁液を
取り除き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理し
た。超音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微
鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質
により数秒から数分間）続けた。

【００５９】工程２：ビタミンＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液５ｍｌは２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソ
ーム懸濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混
合物は、1/2Ｖ/Ｖの懸濁Ａ/ＰＥＧの割合１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥ
Ｇ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁
液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（
１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００６０】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から、小サイズＲＩＶ
−コクリエートの生成を確認した。コクリエートに包入したビタミンＡの量はＵ
Ｖ吸収（３４６nm ）によって決定し、９０％より多い初期ビタミンＡがコクリ
エートに会合していることを確認した。

【００６１】実施例１０カルシムにより沈殿した多価不飽和脂肪酸（ＰＦＡ）負荷ヒドロ
ゲル単離コクリエートの調製ＰＦＡは血中のコレステロール濃度制御に関与する生物学的関連分子であり、
プログラスタンジンの前駆体である。ＰＦＡは酸化に対して感受性を有し、食品
への導入が制限される。ＰＦＡは酸素存在下に自動酸化と呼ばれる一連の反応を
受け、アルデヒドとなり、次いで魚のような不愉快な臭味や風味を有するケトン
となる。固く包まれた脂質２相にＰＦＡを包埋すると、自動酸化のカスケードを
阻止することを助ける。ＰＦＡ-コクリエートを調製する一般的な方法は下記の
通りである。

【００６２】工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＰＦＡ負荷小胞の
調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＰＦＡのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１
０：１にて丸底フラスコに入れ、回転式蒸発器を使用して、室温で乾燥して薄膜
を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して殺菌
した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度
の脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封し、次いで冷却され
た浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸濁液が澄明になり（
懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存
在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。

【００６３】工程２：ＰＦＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム懸
濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物は
、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気
攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，
０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最
終濃度１ｍＭを達成した。

【００６４】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。

【００６５】実施例１１カルシムにより沈殿したバニリン負荷ヒドロゲル単離コクリエー
トの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状バニリン負荷小胞の
調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とバニリンのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、
１０：１（脂質/バニリン）にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器
を使用して、室温で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルター
を通して窒素ガスを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質
薄膜を１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度の脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除
き、窒素で封し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超
音波処理は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明
らかに可視できるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により
数秒から数分間）続けた。

【００６６】工程２：バニリン負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム懸
濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物は
、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気
攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，
０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最
終濃度１ｍＭを達成した。

【００６７】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。コクリエートに包入したバニリンの量はＵＶ吸収（２３９nm ）によっ
て決定した。

【００６８】実施例１２カルシムにより沈殿したシナモンオイル（ＣｉｎＯ）負荷ヒドロ
ゲル単離コクリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＣｉｎＯ−負荷小
胞の調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＣｉｎＯのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、
１０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、４０
℃で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
し、次いで冷却された浴式超音波発生装置中で超音波処理した。超音波処理は懸
濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視で
きるリポソームが存在しなくなるまで（脂質の量および性質により数秒から数分
間）続けた。

【００６９】工程２：ＣｉｎＯ−負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム懸濁
液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物は次
いで、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ
磁気攪拌しつつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜
１，０００ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して
、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００７０】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構
成した。

【００７１】実施例１３カルシムにより沈殿したＤＮＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエート
の調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＤＮＡ負荷小胞の
調製ジオレオイルホスファジルセリンのクロロホルム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を丸
底フラスコに入れ、ブチ(Buchi) 回転式蒸発器を使用して、４０℃で乾燥して薄
膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガスを噴射して
殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜をｐＣＭＶ−β−ｇａｌ
−ＤＮＡのＴＥ緩衝液の溶液（１ｍｇ／ｍｌ）で水和して、ＤＯＰＳ：ＤＮＡが
１０：１であり、１０ｍｇ脂質／ｍｌの濃度に達した。水和懸濁液を取り除き、
窒素で封し、次いで数分間、攪拌した(vortex)。

【００７２】工程２：ＤＮＡ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製ＤＮＡ／リポソーム混合物は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソーム懸濁液中
で４０ｗ/ｗ％デキストラン−５００，０００と混合した。この混合物は、１５
ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁気攪拌し
つつ、シリンジを経て注入して懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，０００
ｒｐｍであった。ＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度
１ｍＭを達成した。

【００７３】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＣａＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離した（
図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で再構成し
た。

【００７４】実施例１４亜鉛により沈殿した空ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状小胞の調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）を丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、３５℃
で乾燥して薄膜とした。この回転式蒸発器は０．２μｍのフィルターを通して窒
素ガスを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０
ｍｇ脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒
素で封して、次いで冷却された浴式超音波発生装置（Laboratory Supplies Com.
, Inc.) 中で超音波処理した。超音波処置は懸濁液が澄明になり（懸濁液Ａ）、
倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなる
まで（脂質の量および性質により数秒から数分間）続けた。

【００７５】工程２：ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソームは２／１ｖ／ｖデキシトラン／リポソームの懸濁液
中で、４０ｗ/ｗ％デキストラン５００，０００と混合した。この混合物を、１
５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁性攪拌
しつつ、シリンジで注入して懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００〜１，０００ｒ
ｐｍであった。ＺｎＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加して、最終濃度１
ｍＭを達成した。

【００７６】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＺｎＣｌ_２および１５０ｍＭＮａＣｌを
含む洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vor
tex)、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した
後、別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分
離した（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液で
再構成した。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）から小サイズコク
リエートの生成を確認した。

【００７７】実施例１５亜鉛により沈殿したアンホテオリシンＢ負荷ヒドロゲル単離コク
リエートの調製工程１：ジオレオイルホスファチジルセリンからの小単層状ＡｍＢ負荷小胞の
調製ジオレオイルホスファジルセリン（ＤＯＰＳ）のクロロホルム溶液（１０ｍｇ
／ｍｌ）とＡｍＢのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物をモル比、１
０：１にて丸底フラスコに入れ、ブチ(Buchi)回転式蒸発器を使用して、４０℃
で乾燥して薄膜を得た。回転式蒸発器は０．２μｍフィルターを通して窒素ガ
スを噴射して殺菌した。次工程は無菌箱内で実施した。乾燥脂質薄膜を１０ｍｇ
脂質／ｍｌの濃度にて脱イオン水で水和した。水和懸濁液を取り除き、窒素で封
して、次いで冷却された浴式超音波発生装置（Laboratory Supplies Com., Inc.
) 中で超音波処理した。超音波処理は懸濁液が澄んだ黄色となり（懸濁液Ａ）、
倍率１０００の位相差顕微鏡で明らかに可視できるリポソームが存在しなくなる
まで（脂質の量および性質により数秒から数分間）、続けた。

【００７８】工程２：ＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの調製工程１で得たリポソーム懸濁液は２／１ｖ／ｖデキストラン／リポソームの
懸濁液中で４０ｗ/ｗ％デキストラン５００，０００と混合した。この混合物は
、１５ｗ/ｗ％ＰＥＧ−８，０００〔ＰＥＧ８０００／（懸濁液Ａ）〕中へ磁性
攪拌しつつ、中へシリンジを経て注入して、懸濁液Ｂを得た。攪拌速度は８００
〜１，０００ｒｐｍであった。ＺｎＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）を懸濁液に添加し
て、最終濃度１ｍＭを達成した。

【００７９】攪拌を１時間続け、次いで１ｍＭＺｎＣｌ_２と１５０ｍＭＮａＣｌを含む
洗浄緩衝液を容量比、１：１にて懸濁液Ｂに添加した。懸濁液を攪拌し(vortex)
、３０分間、２〜４℃で３０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を除去した後、
別の洗浄緩衝液を容量比、０．５：１にて添加し、続いて同じ条件で遠心分離し
た（図１参照）。得られたペレットは所望の濃度になるように同じ緩衝液を使用
して再構成した。レーザー光散乱（重量分析、Coulter N4 Plus）からＡｍＢ−
Ｚｎ−コクリエートの生成を確認した。

【００８０】実施例１６ヒドロゲル単離コクリエートの顕微鏡による観察光学的顕微鏡の研究を、ヒドロゲル単離コクリエート生成の構造的作用の詳細
を得るために、調製手法を使用して段階的に実施した。図３Ａ、Ｂおよび４Ａ〜Ｆに見られる顕微鏡による像は、Ｃａ^２＋イオンによ
り沈殿したＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの各調製段階における形態上
の変化を示す。ＡｍＢ／リポソーム−デキストラン混合物がＰＥＧ溶液に分散さ
れると、相分離が図３Ａによって示されるように生じた。リポソームの分配はＡ
ｍＢの黄色によって示されるように、分散デキストラン相を好んだ。この分配は
各デキストラン粒子にリポソームが単離されることを確証する。連続相（ＰＥＧ
）中へのカルシウムイオンの添加は、分散相の沈殿生成となった。最終産物とし
て、小さな針状コクリエートが形成され、顕微鏡下に観察され、これらのコクリ
エートはＥＤＴＡの添加およびカルシウムのキレートによって単層小胞中へ開い
た（図４Ａ、Ｂ）。針状形態は、凍結破砕後、走査電子顕微鏡によって確認され
た（図５）。空およびＡｍＢ−Ｚｎ−沈殿ヒドロゲル単離コクリエート（図４Ｃ
、Ｄ）および空Ｚｎ−沈殿ヒドロゲル単離コクリエート（図４Ｅ、Ｆ）において
同様な顕微鏡像を得た。

【００８１】実施例１７アンホテリシンＢを負荷したヒドロゲル単離コクリエートのイン
ビトロ抗菌活性カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の成長阻害酵母のインビトロ感受性分析を行い、ＡｍＢ−コクリエート、ＡｍＢisomes（
ＡｍＢのリポソーム生成）およびＡｍＢ／ＤＭＳＯの阻害および致死効果を比較
した。新しく成長するカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の５つのコロ
ニーをＹＰＤ寒天プレートから（４８時間培養物から）選択し、２ｍｌの２ｘＹ
ＰＤブロス、ｐＨ５．７へ添加した。この保存溶液のＯＤ_５９０を測定し、酵母
密度をＯＤ_５９０＝０．１に調節し、この懸濁液０．１ｍｌを９６ウェルプレー
トのそれぞれのウェルへ添加した。

【００８２】ＡｍＢ／コクリエート、ＡｍＢ／ＤＭＳＯおよびＡｍＢisomesを９６ウェルプ
レートへ添加して、ＡｍＢ最終濃度を０．０７８、０．１５６、０．３１２５、
０．６２５、１．２５および２．５μｇ／ｍｌとした。９６ウェルプレートを緩
やかに攪拌しながら、３７℃に加熱し、細胞密度を０、２、４、６、２４および
３０時間に、９６ウェルプレートリーダー（Molecular Devices Spectramax 340
）上で測定した。図６はＡｍＢ-コクリエートがＡｍＢisomes（ＡｍＢのリポソ
ーム生成）よりも大きな成長阻害効果を有することを示す。

【００８３】アンホテリシンＢを負荷したヒドロゲル単離コクリエートの抗菌効果酵母細胞の部分標本（５０μｌ）を９６ウェルプレートから取り出し、連続的
に希釈し（寒天培地上に置くために１：１００００まで）、かつ、血算機(hemoc
ytometer) を使用して計数した。希釈酵母細胞５０μｌをＹＰＤ寒天プレート上
に置き、３７℃で２４時間、加熱した。黄色のコロニーをQuanitity One TMソフ
トウェアを装備したBioRad Fluor-S A Multi-Imager を使用して計数した。

【００８４】ＡｍＢisomes、ＡｍＢ／ＤＭＳＯおよびＡｍＢ／コクリエート（０．６２５μ
ｇＡｍＢ／ｍｌ）で処理した酵母細胞について、加熱３０時間後に全細胞数に対
するコロニー形成単位の割合をテストした。その結果はＡｍＢ／コクリエートが
テストした他の抗菌剤に比べて、酵母細胞に対して最も大きな致死効果を有する
ことを示す。ＡｍＢ-コクリエートによる処理後、酵母生存率はほぼ０％であり
、ＡｍＢ／ＤＭＳＯによる処理後、酵母生存率は１２％であった。ＡｍＢisome
は効果的ではなく、酵母生存率５２％であった（図７）。

【００８５】ＡｍＢコクリエートによるマクロファージ保護マクロファージなどの粒子補足細胞は、多くの微生物感染に対する防御の第１
線である。しかしながら、重度のヒトへの臨床的感染を誘導する多くの微生物は
マクロファージに感染し、破壊を避けることが示されている。

【００８６】インビボにてマクロファージは細胞内取り込み機構によって、コクリエートの
摂取において重要な役割を果たすことが可能である。マクロファージはまた宿主
防御および真菌類および寄生虫のクリアランスにおいて重要な役割を果たすこと
から、マクロファージとコクリエート間の相互作用を検討することが重要である
。

【００８７】下記実施例はコクリエートがマクロファージによって摂取されることを示す。
マクロファージへ送達された大量のＡｍＢは非毒性であると判断され、生物学的
活性形態にてマクロファージ内に残された。ＡｍＢコクリエートは真菌感染前ま
たは後に投与された場合、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)による感
染に対してマクロファージに保護をもたらした。

【００８８】予防的用量摂取：Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ（Ｍ）を９６ウェルプレート
にて、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、１×１０^５細胞／ｍｌの濃度で継代培養した
。ＡｍＢコクリエート１００μｌ（ＡｍＢｃ０．２、０．６、１．２５、および
２．５μｇＡｍＢ／ｍｌ）、フンギゾーン（Fungizone ）、または空コクリエー
ト（２、６、１２．５、および２５μｇ脂質／ｍｌのＥＣ）を特定濃度で添加し
た。プレートを３７℃で一夜、５％ＣＯ_２中でインキュベートした。２４時間後
、培地を取り換えた。この工程を２回行なった。カンジダ・アルビカンス（ＣＡ
）を濃度２．５×１０^３細胞／ｍｌ、マクロファージに比べて１：２００の割合
でプレートに添加した。プレートを上記した条件下に一夜インキュベートした。

【００８９】２４時間インキュベートした後、プレートを取り出し、観察した。培地を勢い
よくピペットで取り出し、細胞を破砕し、この懸濁的２５μｌをサブロー・デキ
ストロース寒天プレート上に置き、次いで、３７℃で一夜、ドライインキュベー
ター中に置いた。Candida albicansのＣＦＵを翌日、計数した。図８Ａのデータ
はマクロファージを負荷したＡｍＢコクリエートが真菌細胞の殺傷に非常に効果
的であることを示唆した。

【００９０】感染後用量摂取：Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ（Ｍ）を９６ウェルプレート
で継代培養し、次いで一夜、インキュベートした。インキュベート後、マクロフ
ァージにＣＡを２００：１の割合で感染させ、次いで、ＡｍＢｃ、フンギゾン（
Fungizone）またはＥＣを続いて特定濃度で添加した。２４時間後、細胞培養物
を上記したように観察し、ＣＦＵを測定した。

【００９１】ＭにＣＡを感染させ、続いてＡｍＢコクリエートを投与したとき、ＣＦＵ数は
再びほぼ零であった。これらの結果は、ＡｍＢコクリエートが洗い出された後、
マクロファージがCandida albicans感染に対して保護されたので、マクロファー
ジがＡｍＢコクリエートを巻き込み、かつ濃縮していることを示す（図８Ｂ）。

【００９２】反対に、フンギゾーン（デオキシコール酸中のＡｍＢ）、ＡｍＢの最も一般的
な臨床形状は、インビトロでマクロファージに対して極めて毒性および致死性を
示した。投与後、５時間以内にペトリ皿に大量の細胞性残骸が見られ、生きたマ
クロファージの徴候は見られなかった。

【００９３】顕微鏡観察では、ＡｍＢコクリエートは検討した最高用量でもマクロファージ
に対して毒性を有しないことを明らかにする。ＡｍＢコクリエートは高濃度で集
積して、大きな膨張小胞となる。マクロファージを洗浄し、再び２４時間インキ
ュベートした後、大抵の小胞は正常な形態および大きさにもどり、なお、わずか
なものは著しく大きくなっていた。わずかなマクロファージですら、拡大した小
胞とともに「移動」していることが認められた。ＡｍＢコクリエートは小胞内に
濃縮し、おそらくＡｍＢは時間とともに徐々に放出される。

【００９４】実施例１８アンホテリシンＢヒドロゲル単離コクリエートの静脈投与後のＡ
ｍＢの組織透過評価アンホテリシンＢの組織透過性は静脈投与後に評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウ
ス（２０〜２３ｇ）群（ｎ＝５）にＡｍＢコクリエート（０．０５ｍｇ／２０ｍ
ｌ）を１８ｇ1/2針サイズを有する1/2ｃｃＵ１００インシュリンシリンジで静脈
から（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）与えた。予定された屠殺時間（２、５、１０、２
０および４０分、１、２、３、４、６、８、１２、２４、３６および４８時間）
に動物に麻酔薬を与え、心臓穿刺して採血し、次いで安楽死させ、解剖し、目的
の組織（脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、脂肪、胃、胃内容物、腸および腸内
容物）を取り出し、重量測定した。ＡｍＢ分析後、試料を抽出溶媒（１０％メタ
ノール、３５％水、５５％エタノール）と混合し、均質化し、超音波処理して、
遠心分離した。上清の部分標本９０μｌをマイクロバイアル中へ移送し、４０℃
に保持したＮｏｖａ−ＰａｋＣ−１８カラム（３．９×１５０ｍｍ、粒子サイ
ズ４μｍ）のＨＰＬＣシステム中へ注入した。アンホテリシンＢは２９％メタノ
ール、３０％アセトニトリルおよび４１％２．５ｍＭＥＤＴＡでもって流速０
．５ｍｌ／分にて溶出し、次に４０８ｎｍにて検出した。ＡｍＢ濃度は外部標準
曲線により計算した。

【００９５】図９に、ＡｍＢコクリエート１回静脈投与後の組織露出（exposure）を示す。
肝臓、脾臓および腎臓などの主要組織では大きな透過が見られた。

【００９６】実施例１９ＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートによって仲介されたＡｍ
Ｂの経口投与一回用量摂取ＡｍＢ負荷ヒドロゲル単離コクリエートの経口投与は、一夜絶食したＣ５７Ｂ
Ｌ６マウス（２０〜２３ｇ）へ実施例４の処方剤を胃内投与して試験した。９匹
のマウスへ用量１０ｍｇ／ｋｇにて処方剤１／１０ｍｌを投与した。各群から３
匹のマウスを投与後、１、６および２４時間後に屠殺し、続いて器官および組織
のＡｍＢ濃度を分析した。

【００９７】組織および血液試料を以下のように処理した。組織は抽出溶媒（Ｈ_２Ｏ３５％
、メタノール１０％、エタノール５５％、ｗ/ｗ／ｗｎｖ／ｖ／ｖ）を添加し
て１／２０または１／１０倍に希釈し、Ultra-TurrexR装置を使用して均質化し
た。部分標本０．５ｍｌを取り出し、１分間超音波処理し、４℃で、１２分間、
７２６０ｒｐｍにて遠心分離した。上清をＨＰＬＣマイクロバイアルへ移送し、
Ｃ−１８、３．９×１５０ｍｍ、４μｍ粒子サイズの分析カラム上に４０℃で流
速０．５ｍｌにて、３０μｌを注入した。４０８ｎｍで検出したＡｍＢ濃度は外
部標準曲線により計算した。

【００９８】図１０は組織でのＡｍＢの２４時間、経時プロファイルを示す。３時点がプロ
ットされるにすぎないが、主要組織（肝臓、肺、脾臓および腎臓）での集積が見
られる。

【００９９】多数回用量摂取マウスの他の２群は１０日間に、１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口から多数回用量摂
取を受け、１群は最後の用量後、２４時間で屠殺され、他の群は最後の用量を受
けた後２０日に屠殺された。予定された時点で、マウスに麻酔をかけ、致死させ
て、組織採取のために解剖した。組織を１回用量摂取のように処理して、ＡｍＢ
濃度をＨＰＬＣにて測定した。１０回目の用量後、２４時間で得た結果を図１１
に示し、ヒドロゲル単離コクリエートは治療濃度で胃腸管からＡｍＢの送達を可
能とすることを示す。

【０１００】実施例２０．健康および感染マウスの生物分布と経口投与後の組織でのカンジ
ダ・アルビカンス濃度の相関関係図１２はアンホテリシンＢの組織濃度（左スケールのμｇ／ｇ組織）とＡｍＢ
-コクリエートの経口投与後のカンジダ・アルビカンス感染の減少としての効果
（右スケールのＣＦＵ／ｇ）との関係を示す。

【０１０１】健康なマウスへ１０日間連続して、１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与した後、Ａ
ｍＢが腎臓、続いて肺、脾臓、肝臓および脳で高い濃度を示した。これは他の組
織よりもより低い濃度を示す。これは疾患状態が異なった濃度で薬剤の薬学動態
に影響することを示す。この現象はグラフから明らかに示される。組織中のＡｍ
Ｂは５回以上、１５日間、１０ｍｇ／ｋｇ／日（同じ用量）を経口投与した後の
Ｃ．アルビカンス感染マウスでは健康群よりも低濃度に達する。これは肺が最低
濃度を示す標的組織である場合の分布パターンにおける変化を示す。

【０１０２】ＡｍＢコクリエート処方剤の１５日間、１０ｍｇ／ｋｇ／日の経口投与は、高
い効果をもたらした。腎臓組織中のＣＦＵ／ｇの減少はコクリエート処方剤にお
いて約３．５logである。肺では、ＡｍＢコクリエート処方剤は完全にＣ．アル
ビカンスを皆無とし、真菌感染の肺をきれいにする。コクリエート送達システム
は感染動物に高濃度のＡｍＢをもたらし、これはコクリエート処方剤に見られた
高効率と関連し、ＡｍＢコクリエートは、全身性カンジダ症の経口治療の適切な
ビヒクルであることを示す。

【０１０３】さらに、経口投与したＡｍＢコクリエートは最も高用量である５０ｍｇ／ｋｇ
ですら（ＡｍＢコクリエート１０、２０および５０ｍｇ／ｋｇを与えられたマウ
スの腎臓、ＧＩ管および他の器官で損傷は見られなかった）、非毒性であった。
この高い濃度（５０ｍｇ／ｋｇ）はカンジダ感染マウスモデルにおいて生存率１
００％を示した最低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）の１００倍と均等である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明のヒドロゲル単離コクリエートを生物関連物質とともに
、あるいは生物関連物質なしで得る方法の概念図である。

【図２】図２Ａおよび２Ｂは、レーザー光散乱によって測定したアンホテリシ
ンＢ（ＡｍＢ）を負荷した（図２Ａ）、あるいは空の（図２Ｂ）ヒドロゲル単離
コクリエート粒子サイズ分布（重量分析）を示す。

【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＰＥＧゲル溶液中に分散させたデキストランの
リポソーム混合物の顕微鏡像である。小さな黒点は、ＰＥＧ相中にデキストラン
相を分散させて形成したデキストラン粒子である。大きなオープン円は小さなデ
キストラン粒子の溶融によって形成される。リポソーム分配は、ＡｍＢの黄色に
よって示されるようにデキストラン相を好む。図３ｂはＣａＣｌ_２溶液によって
処理した後の図３Ａに示される試料の顕微鏡像である。矢印で示される円中の黒
色物は、Ｃａ^２＋イオンの添加によって形成されたコクリエートである。

【図４】図４Ａ〜４Ｆは、１ｍＭＣａＣｌ_２および１００ｍＭＮａＣｌを
含む緩衝液で洗浄した後の図３Ａおよび３Ｂに示される試料の顕微鏡像である。
凝集体はコクリエート粒子によって形成される。図４ＢはＥＤＴＡの添加後の図
４Ａに示される懸濁液を示す。直径１〜２ミクロンのリポソームに対して開口し
、コクリエート粒子の固有サイズを示すコクリエート粒子は、ミクロン未満の範
囲内にある。図４Ｃは実施例４に記載される方法に従って亜鉛で沈殿させたＡｍ
Ｂヒドロゲル単離コクリエートを示す。図４ＤはＥＤＴＡで処理した後の図４Ｃ
に示すコクリエートを示す。図４Ｅは実施例３に記載される方法に従って亜鉛で
沈殿させた空ヒドロゲル単離コクリエートを示す。図４ＦはＥＤＴＡで処理した
後のコクリエートを示す。

【図５】図５は、凍結破壊後のヒドロゲル単離コクリエートの顕微鏡写真であ
る。

【図６】図６は、０．６２５μｇＡｍＢ／ｍｌのＡｍＢを負荷したヒドロゲル
単離コクリエートによるカンジタ・アルビカンス(Candida albicans)の成長阻害
を示す。ＤＭＳＯ中のＡｍＢおよびＡｍＢisome^{（登録商標）}と対比する。

【図７】図７は、３０時間後のカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の
生存可能性へのヒドロゲル単離コクリエートの影響を示す。

【図８】図８ＡまたはＢは、アンホテリシンＢ-コクリエートとマクロファー
ジ培養物の効果を示す。

【図９】図９は、アンホテリシンＢ-コクリエート投与後の組織でのアンホテ
リシンＢ濃度を示す。

【図１０】図１０は、ＡｍＢを負荷したヒドロゲル単離コクリエートの１回投
与後の組織でのＡｍＢ濃度の時間的経過を示す。

【図１１】図１１は、１回用量摂取後、２４時間および多数回用量摂取後、２
４時間の組織でのＡｍＢ濃度を示す。

【図１２】図１２は、アンホテリシンＢコクリエート投与後のアンホテリシン
Ｂ濃度とカンジダ・アルビカンス濃度との間の相関関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/122 Ａ６１Ｋ 31/122 31/19 31/19 31/197 31/197 31/355 31/355 31/593 31/593 31/70 31/70 31/7004 31/7004 31/7016 31/7016 33/06 33/06 33/26 33/26 33/30 33/30 47/02 47/02 47/24 47/24 47/30 47/30 47/34 47/34 47/46 47/46 47/48 47/48 Ａ６１Ｐ 3/02 Ａ６１Ｐ 3/02 １０２１０２１０９１０９ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ザリフレイラアメリカ合衆国ニュージャージー州 08876 ブランチバーグヒューロントレイル９ (72)発明者ジンツオアメリカ合衆国ニュージャージー州 08904 ハイランドパークバレンチンストリート 445 (72)発明者セガッライグナシオアメリカ合衆国ニュージャージー州 07079 サウスオレンジモントローズアヴェニュー 170 (72)発明者マンニーノラファエルジェイ．アメリカ合衆国ニュージャージー州 08801 アンナダールビクトリアドライブ 22 Ｆターム(参考） 4B018 LB09 LE06 MD66 MF08 4C076 AA19 AA93 AA95 AA99 BB01 BB24 BB25 BB27 BB29 BB30 CC21 CC23 CC40 CC41 DD23 DD24 DD25 DD63 EE23 EE56 EE59 FF68 GG11 4C086 AA01 AA02 BA09 DA15 EA01 HA03 HA04 HA11 MA01 MA04 MA07 MA11 MA24 MA52 MA56 MA58 MA59 MA60 NA10 NA13 ZC21 ZC23 ZC29 ZC33 ZC35 4C206 AA01 AA02 CA10 DA01 FA53 MA01 MA02 MA04 MA05 MA11 MA44 MA72 MA76 MA78 MA79 MA80 NA10 NA13 ZC21 ZC23 ZC29 ZC33 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）リポソームの水溶性懸濁液と栄養素と調味料物質からなる
郡から選択される少なくとも１つの生物関連分子を準備し、ｂ）リポソーム/ポリマーＡ懸濁液を作り、該リポソーム懸濁液をポリマーＡ
と混合して、ｃ）ポリマーＢを含む溶液中に該リポソーム／ポリマーＡ懸濁液を添加し、そ
の際、ポリマーＡとポリマーＢは非相溶性であり、それによって２相ポリマー系
を形成し、ｄ）該２相ポリマー系へカチオン成分の溶液を添加し、かつ、ｅ）該２相ポリマー系を洗浄してポリマーを除去するを含む脂質主体コクリエートを製造する方法。
【請求項２】前記栄養素がビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸および糖
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１の記載の方法。
【請求項３】前記ビタミンがビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群から
選択される少なくとも１つである、請求項２の記載の方法。
【請求項４】前記ミネラルがカルシウム、マグネシウム、バリウム、鉄およ
び亜鉛からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２の記載の方法
。
【請求項５】前記糖がグルコースおよびスクロースからなる群から選択され
る少なくとも１つである、請求項２の記載の方法。
【請求項６】前記調味料物質が植物必須油および抽出物からなる群から選択
される少なくとも１つである、請求項１の記載の方法。
【請求項７】前記調味料物質がシナモンオイルである、請求項２の記載の方
法。
【請求項８】前記抽出物がハーブ、シトラス、香味料および種の抽出物から
なる群から選択される少なくとも１つである、請求項６の記載の方法。
【請求項９】前記リポソーム水溶性懸濁液が超音波または微細流動化により
作られる、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】前記リポソーム／ポリマーＡ懸濁液の添加が注入により行わ
れる、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】前記リポソーム／ポリマーＡ懸濁液の添加を約０．１ｍｌ/
分〜５０ｍｌ/分の制御速度により行う、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】前記リポソーム／ポリマーＡ懸濁液の添加を約１ｍｌ/分〜
１０ｍｌ/分の制御速度により行う、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】前記リポソームが負に帯電した脂質を含む脂質で形成される
、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】前記負に帯電した脂質が負に帯電したホスホリピドである
、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】前記負に帯電したホスホリピドがホスファチジルセリン、ホ
スファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびホスファチジルグリセロー
ルからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１３または１４記載
の方法。
【請求項１６】前記脂質が少量の他の脂質を含む、請求項１３、１４または
１５記載の方法。
【請求項１７】前記他の脂質が１つ以上の両性イオン性脂質の群から選択さ
れる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】前記他の脂質が１つ以上のカチオン性脂質の群から選択され
る、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】前記他の脂質が１つ以上の多価カチオン性脂質の群から選択
される、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】前記他の脂質が生物学的に活性な分子と水素結合を形成する
ことが可能である１つ以上の中性脂質の群から選択される、請求項１６記載の方
法。
【請求項２１】前記中性脂質が１つ以上のＰＥＧ化した脂質である、請求項
２０記載の方法。
【請求項２２】前記コクリエートが小さな単層リポソームを使用して形成さ
れる、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】前記リポソームの水溶性懸濁液が単層リポソームを使用して
形成する、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】前記リポソームの水溶性懸濁液が生物関連分子を負荷した単
層リポソームを使用して形成する、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】前記リポソームの水溶性懸濁液が生物学的関連分子を含み
、それによって、該コクリエートもまた生物学的関連分子を含む、先の請求項の
いずれかに記載の方法。
【請求項２６】前記生物学的関連分子と脂質の混合物を含む薄膜を形成し
、水溶性相と該薄膜を接触させて小さな単層リポソームの水溶性懸濁液を形成す
ることにより、リポソーム懸濁液を形成する前処理工程を含む、請求項２５記載
の方法。
【請求項２７】前記生物学的関連分子が水溶性相中に存在する、請求項２６
記載の方法。
【請求項２８】前記脂質の薄膜を生物学的関連分子を含む水溶性相と接触さ
せて、リポソームの水溶性懸濁液を形成するリポソーム形成前処理工程を含む、
請求項２７記載の方法。
【請求項２９】空リポソームの懸濁液を生物学的関連分子と混合して、前記
リポソーム懸濁液を形成する前処理工程を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】前記生物学的関連分子が電荷を有する、請求項２７記載の方
法。
【請求項３１】前記生物学的関連分子が正に帯電されている、請求項３０記
載の方法。
【請求項３２】前記生物学的関連分子が負に帯電されている、請求項３０記
載の方法。
【請求項３３】前記生物学的関連分子が生物学的活性である、先の請求項の
いずれかに記載の方法。
【請求項３４】ａ）界面活性剤-脂質混合物を含む水溶性懸濁液を準備し、ｂ）脂質/ポリマーＡ懸濁液作成し、該界面活性剤-脂質懸濁液をポリマーＡと
混合して、ｃ）該界面活性剤-脂質／ポリマーＡ懸濁液をポリマーＢを含む溶液中に添加
し、その際、ポリマーＡおよびポリマーＢは非相溶性であり、それによって、２
相ポリマー系を形成し、ｄ）該２相ポリマー系にカチオン成分を添加し、ｅ）該２相ポリマー系を洗浄してポリマーを除去し、かつ、ｆ）工程aにおいて、栄養素と調味料物質からなる郡から選択される少なくと
も１つの生物関連分子を準備し、工程を含む脂質主体コクリエートを製造する方法。
【請求項３５】前記界面活性剤がオクチルグルコシドである、請求項３４記
載の脂質主体コクリエートの製造方法。
【請求項３６】前記脂質主体コクリエートは生物関連分子が生物学的活性で
ある、請求項３４記載の脂質主体コクリエートの製造方法。
【請求項３７】前記栄養素はビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸および
糖からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３４の記載の方法。
【請求項３８】前記ビタミンがビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群か
ら選択される少なくとも１つである、請求項３４の記載の方法。
【請求項３９】前記ミネラルがカルシウム、マグネシウム、バリウム、鉄お
よび亜鉛からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３４の記載の
方法。
【請求項４０】前記糖がグルコースおよびスクロースからなる群から選択さ
れる少なくとも１つである、請求項３４の記載の方法。
【請求項４１】前記調味料物質が植物必須油および抽出物からなる群から選
択される少なくとも１つである、請求項３４の記載の方法。
【請求項４２】前記調味料物質がシナモンオイルである、請求項４１の記載
の方法。
【請求項４３】前記抽出物がハーブ、シトラス、香味料および種の抽出物か
らなる群から選択される少なくとも１つである、請求項４１の記載の方法。
【請求項４４】前記ポリマーＡがデキストランおよびポリエチレングリコー
ルからなる群から選択される少なくとも１つである、先の請求項のいずれかに記
載の方法。
【請求項４５】前記２相ポリマー系中のポリマーＡの濃度が、２〜２０ｗ/
ｗ％の濃度範囲である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】前記ポリマーＢがポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、フィコール、ポリビニルメチルエーテルおよびポリエチレングリコールか
らなる群から選択される少なくとも１つである、先の請求項のいずれかに記載の
方法。
【請求項４７】前記２相ポリマー系中のポリマーＢの濃度が、２〜２０ｗ/
ｗ％の範囲である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】前記２相ポリマー溶液はデキストラン／ポリエチレングリコ
ール、デキストラン／ポリビニルピロリドン、デキストラン／ポリビニルアルコ
ール、デキストラン／フィコールおよびポリエチレングリコール／ポリビニルメ
チルエーテルからなる群から選択される少なくとも１つのである、先の請求項の
いずれかに記載の方法。
【請求項４９】前記カチオン成分が、２価イオン形成可能に不可欠な要素で
ある、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】前記カチオン成分が、負帯電脂質をキレートあるいは架橋で
きる構造である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】前記カチオン成分が、多価カチオン脂質である、先の請求項
のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】前記カチオン成分が、２価以上の多価イオンを含む、先の請
求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】前記カチオン成分が、２価以上の多価金属イオンを含む、先
の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】前記金属イオンが、無機酸の塩として添加され、好ましくは
、その際、該塩は塩化カルシウム、塩化亜鉛または塩化コバルトである、請求項
５３記載の方法。
【請求項５５】前記金属イオンが、Ｃａ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、Ｂａ^＋＋およびＭ
ｇ^＋＋からなる群から選択される、請求項５３または５４記載の方法。
【請求項５６】前記コクリエートが、小サイズのコクリエートである、先の
請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】前記コクリエートのサイズが、１ミクロン未満である、先の
請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】前記洗浄工程が、２相ポリマー系を遠心分離してコクリエー
ト沈殿物を分離し、ポリマーを含む上清を除去し、洗浄用緩衝液中に沈殿物を再
懸濁し、洗浄沈殿物を遠心分離し、かつ、所望により再懸濁と遠心分離工程を１
回以上に繰り返すことを含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】前記洗浄用緩衝液が溶解したカチオン成分を含む、請求項５
８記載の方法。
【請求項６０】前記カチオン成分が２価以上の多価イオンを含む、請求項５
９記載の方法。
【請求項６１】前記２価以上の多価イオンが金属イオンである、請求項６０
記載の方法。
【請求項６２】前記金属イオンがカルシウムおよび亜鉛から選択される、請
求項６１記載の方法。
【請求項６３】前記カチオン成分が洗浄用緩衝液中に少なくとも１ｍＭの濃
度で存在する、請求項５９から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】請求項１から６３に記載の何れかの方法により調製された、
生物学的関連分子を含むコクリエート。
【請求項６５】１ミクロン未満の平均粒子サイズを有する、請求項６４記載
の生物学的関連分子を含むコクリエート。
【請求項６６】前記コクリエートが、塩を含む媒体に懸濁される、先の請求
項のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】前記媒体が、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化コバルト、塩
化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムまたは炭酸ナトリウムからなる群
の塩から選択されるものを含む、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】前記コクリエートが、ポリマーを含む媒体に懸濁される、先
の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】前記媒体が、プルオロニックスまたはポリエチレングリコー
ゲンからなる群のポリマーから選択されるものを含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】前記生物関連分子が有機体である、先の請求項のいずれかに
記載の方法。
【請求項７１】前記生物関連分子が無機体である、先の請求項のいずれかに
記載の方法。
【請求項７２】前記生物関連分子がモノマーである、先の請求項のいずれか
に記載の方法。
【請求項７３】前記生物関連分子がポリマーである、先の請求項のいずれか
に記載の方法。
【請求項７４】前記生物関連分子が親水性である、先の請求項のいずれかに
記載の方法。
【請求項７５】前記生物関連分子が両親媒性である、先の請求項のいずれか
に記載の方法。
【請求項７６】前記生物関連分子が疎水性である、先の請求項のいずれかに
記載の方法。
【請求項７７】前記生物関連分子が宿主生物にとって内因性である、先の請
求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】前記生物関連分子が天然に産出である、先の請求項のいずれ
かに記載の方法。
【請求項７９】前記生物関連分子がインビトロ合成である、先の請求項のい
ずれかに記載の方法。
【請求項８０】コクリエートの粒径サイズが１ミクロン未満である、ａ）生物関連分子、ｂ）負に荷電した第一脂質、かつｃ）２価以上の多価カチオン、を含むコクリエート組成。
【請求項８１】前記生物学的関連分子が電荷を有する、請求項８０記載のコ
クリエート組成。
【請求項８２】前記生物学的関連分子が正に帯電されている、請求項８１記
載のコクリエート組成。
【請求項８３】前記生物学的関連分子が負に帯電されている、請求項８１記
載のコクリエート組成。
【請求項８４】前記生物学的関連分子が栄養素と調味料物質からなる郡から
選択される少なくとも１つである、請求項８０記載のコクリエート組成。
【請求項８５】前記栄養素がビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸および
糖からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８４の記載のコクリ
エート組成。
【請求項８６】前記ビタミンはビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫからなる群か
ら選択される少なくとも１つである、請求項８５の記載のコクリエート組成。
【請求項８７】前記ミネラルがカルシウム、マグネシウム、バリウム、鉄お
よび亜鉛からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８５の記載の
コクリエート組成。
【請求項８８】前記脂肪酸がポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸からなる群
から選択される少なくとも１つである、請求項８５の記載のコクリエート組成。
【請求項８９】前記調味料物質が植物必須油および抽出物からなる群から選
択される少なくとも１つである、請求項８４の記載のコクリエート構成。
【請求項９０】前記抽出物がハーブ、シトラス、香味料および種の抽出物か
らなる群から選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項８９の記載の
コクリエート組成。
【請求項９１】前記負に帯電した脂質がホスファチジルセリンを含む、請
求項８０記載のコクリエート組成。
【請求項９２】前記コクリエート構成がさらに少量の第二の脂質を含む、請
求項８０記載のコクリエート組成。
【請求項９３】前記第二の脂質が両極性脂質である、請求項９２記載のコク
リエート組成。
【請求項９４】前記第二の脂質がカチオン性脂質である、請求項９２記載の
コクリエート組成。
【請求項９５】前記第二の脂質が生物学的に活性な分子と水素結合を形成す
ることが可能である脂質である、請求項９２記載のコクリエート構成。
【請求項９６】前記第二の脂質がＰＥＧ化した脂質である、請求項９２記載
のコクリエート組成。
【請求項９７】前記２価以上の多価イオンが金属イオンである、請求項８０
記載のコクリエート組成。
【請求項９８】前記２価金属イオンがカルシウム、亜鉛、バリウムおよびマ
グネシウムから選択される、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】請求項８０から９８のいずれかに記載のコクリエート組成物
の効果的な量、および薬学的に許容される担体を含む栄養素または調味料物質。
【請求項１００】生物学関連分子が栄養素である人或いは動物宿主にコクリ
エートの投与することを含む請求項８０から９８の何れかに記載の栄養素欠乏に
対する処理方法。
【請求項１０１】前記投与が粘膜または全身性経路である、請求項１００記
載の処理方法。
【請求項１０２】前記投与が、経口、経鼻、眼内、肛門内、膣内、非経口ま
たは肺内から選ばれる粘膜経路である、請求項１０１記載の処理方法。
【請求項１０３】前記投与が、静脈内、筋肉内、皮下、経皮または皮内から
選択される経路である、請求項１０２記載の処理方法。
【請求項１０４】コクリエート化調味料を含む調味料物質を包装する方法
。
【請求項１０５】生物学的関連分子が調味料物質である請求項８０から９８
に記載の何れかの被覆または供給する組成の使用