PT1143933E

PT1143933E - Novas formulações de cocleatos isolados em hidrogel, processo de preparação e sua utilização para a cedência de moléculas biologicamente relevantes.

Info

Publication number: PT1143933E
Application number: PT00909961T
Authority: PT
Inventors: Leila Zarif; Tuo Jin; Raphael Mannino
Original assignee: Univ New Jersey Med; Biodelivery Sciences Inc
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2007-09-03
Also published as: WO2000042989A3; WO2000042989A2; CA2358505A1; EP1143933A2; US6592894B1; CY1106916T1; ES2290019T3; US20120294901A1; EP1143933B1; AU3213300A; CA2358505C; US20030228355A1; ATE367800T1; US20050186265A1; US20140220109A1; DE60035669D1; DE60035669T2; US20090028904A1; JP2002535267A; US6153217A

Description

DESCRIÇÃO "NOVAS FORMULAÇÕES DE COCLEATOS ISOLADOS EM HIDROGEL, PROCESSO DE PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO PARA A CEDÊNCIA DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE RELEVANTES"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um novo processo para preparar um novo sistema de cedência de cocleatos à base de lipidos, às preparações farmacêuticas derivadas do sistema de cedência de cocleatos à base de lipidos e à utilização destas preparações farmacêuticas para se obter uma cedência sistémica e nas mucosas eficaz de moléculas biologicamente relevantes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A capacidade das moléculas biologicamente relevantes serem administradas por via oral depende de vários factores. A molécula biologicamente relevante deve ser solúvel nos fluidos gastrointestinais, de modo a que a molécula biologicamente relevante seja transportada através das membranas biológicas para um mecanismo de transporte activo, ou deve ter um tamanho de partícula pequeno adequado de modo a poder ser absorvida através das placas de Peyer no intestino delgado e através do sistema linfático. 0 tamanho de partícula é um parâmetro importante quando se pretende obter uma cedência oral (ver 1

Couvreur P. et al., Adv. Drug Delivery Reviews 10:141-162, 1993). O aspecto principal na capacidade de ceder fármacos oralmente é a protecção do fármaco contra as enzimas proteoliticas. Uma abordagem ideal é incorporar o fármaco num material hidrófobo, de modo a que os fluidos aquosos não possam penetrar o sistema. Os cocleatos à base de lipidos são um sistema ideal que pode alcançar este objectivo.

As vantagens dos cocleatos são numerosas. Os cocleatos têm uma estrutura não aquosa e, portanto, elas: a) são mais estáveis devido a uma menor oxidação dos lipidos; b) podem ser armazenadas liofilizadas, o que proporciona a capacidade de serem armazenadas durante períodos de tempo longos à TA, o que seria vantajoso para uma distribuição para todo o mundo e armazenamento antes da administração; c) mantêm a sua estrutura mesmo após liofilização, enquanto as estruturas lipossomais são destruídas por liofilização; d) exibem uma incorporação eficaz de moléculas biologicamente relevantes na bicamada lipídica dos cocleatos; e) têm o potential para libertar lentamente uma molécula biologicamente relevante in vivo, enquanto os cocleatos se dissociam; f) têm uma bicamada lipídica que serve como um transportador e é composta por lipidos simples que se podem encontram em membranas de células animais e de plantas, pelo que os lipidos são não tóxicos; g) são produzidas de forma fácil e segura; 2 h) podem ser produzidas como formulações definidas compostas por quantidades e razões predeterminadas de fármacos ou antigénios.

Os cocleatos foram preparados pela primeira vez pelo D. Papahadjopoulos como um intermediário na preparação de vesículas unilamelares grandes (ver documento US 4078052). A utilização de cocleatos para fornecer moléculas de proteína ou péptido para vacinas foi divulgada no documento US 5840707. No entanto, nenhuma destas patentes se refere à importância do tamanho de particula ou à cedência oral eficaz de moléculas biologicamente relevantes, mediado por cocleatos de tamanho reduzido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Deste modo, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um método para obter um cocleato isolado em hidrogel com um tamanho de particula inferior a um mícron. O método compreende também os passos necessários para inserir, pelo menos, uma molécula biologicamente relevante nas estruturas espiral isoladas em hidrogel, numa quantidade terapeuticamente eficaz.

Uma "molécula biologicamente relevante" é uma que tem um papel nos processos de vida de um organismo vivo. A molécula pode ser orgânica ou inorgânica, um monómero ou um polímero, endógena para um organismo hospedeiro ou não, pode ocorrer naturalmente ou ser sintetizada in vitro e semelhantes. Assim, exemplos incluem vitaminas, minerais, aminoácidos, toxinas, microbicidas, microbiostáticos, cofactores, enzimas, 3 polipéptidos, agregados de polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, nucleótidos, amidos, pigmentos, ácidos gordos, hormonas, citocinas, virus, organelos, esteróides e outras estruturas multi-anel, sacáridos, metais, venenos metabólicos, fármacos e semelhantes.

Estes e outros objectivos foram alcançados proporcionando uma molécula biologicamente relevante inserida num cocleato, em que o cocleato contendo uma molécula biologicamente relevante compreende os seguintes componentes: a) uma molécula biologicamente relevante, b) um lipido carregado negativamente e c) um componente catião, em que o tamanho de partícula da molécula biologicamente relevante inserida no cocleato é inferior a um mícron e, ainda, em que a molécula biologicamente relevante é, de um modo preferido, um fármaco. A presente invenção proporciona também um método para a administração oral, a um hospedeiro, de uma quantidade biologicamente eficaz do cocleato acima descrito.

Numa forma de realização preferida, 0 cocleato contendo uma molécula biologicamente relevante é administrada oralmente. 4

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Esquema do processo através do qual se obtêm os cocleatos isolados em hidrogel, com ou sem fármaco.

Figuras 2a e 2b. Distribuição do tamanho de partícula (análise em peso) de cocleatos isolados em hidrogel, carregados com anfotericina B (AmB) (Fig. 2a) ou vazias (Fig. 2b), tal como medido por dispersão de luz laser.

Figuras 3a e 3b. Imagens microscópicas de uma mistura de lipossomas em dextrano, dispersa em solução de gel PEG. Os pontos pretos pequenos são partículas de dextrano formadas por dispersão da fase de dextrano na fase PEG. Os círculos abertos grandes são formados por fusão de partículas de dextrano pequenas. A partição de lipossomas favorece a fase de dextrano, como indicado pela cor amarela de AmB. 3b. Imagens microscópicas da amostra apresentada na Fig. 3a após tratamento com solução de CaCl2. Os objectos pretos, em círculos indicados por uma seta, são cocleatos formados pela adição de iões Ca2+.

Figuras 4a-4f. Imagens microscópicas da amostra apresentada nas Figs. 3a e 3b após lavagem com um tampão contendo CaCl2 1 mM e NaCl 100 mM. Formam-se agregados pelas partículas de cocleatos. 4b. Suspensão apresentada na Fig. 4a após a adição de EDTA. As partículas de cocleatos abriram-se para lipossomas com um diâmetro de 1-2 mícrons, indicando que o tamanho intrínseco das partículas de cocleato está na gama sub-mícron. 4c. Cocleatos isolados em hidrogel com AmB precipitadas com zinco, de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 4.4d. Cocleatos apresentados na Fig. 4c após tratamento com EDTA. 4e. Cocleatos vários isolados em hidrogel precipitados com zinco, de acordo 5 com o procedimento descrito no Exemplo 3.4f. Cocleatos apresentados em 4f após tratamento com EDTA.

Figura 5. Fotografias de microscópio de cocleatos isolados em hidrogel, após criofractura.

Figura 6. Inibição do crescimento de Candida albícans por cocleatos isolados em hidrogel carregadas com AmB a 0,625 yg AmB/mL. A comparação é feita com AmB em DMSO e AmBisomeR.

Figura 7. Efeito de cocleatos isolados em hidrogel na viabilidade de Candida albicans após 30 horas.

Figura 8. Eficácia de cocleatos contendo anfotericina B e culturas de macrófagos.

Figura 9. Níveis tecidulares de anfotericina B após administração de cocleatos contendo anfotericina B.

Figura 10. Perfil da concentração tecidular de AmB no tempo após administração de uma dose única de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com AmB.

Figura 11. Nível tecidular de AmB 24 horas após uma dose única e 24 horas após um regime de dose múltipla.

Figura 12. Correlação entre o nível tecidular de anfotericina B e o nível de Candida albicans após administração de cocleatos com anfotericina B. 6

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma solução para se obter A cedência oral eficaz de fármacos, produzindo cocleatos de tamanho reduzido utilizando um processo novo. A nova abordagem baseia-se na incompatibilidade entre duas soluções de polímero, que são ambas aquosas. Os sistemas de polímeros de duas fases aquosos são muito utilizados para a purificação de proteínas devido a várias vantagens, tais como a não necessidade de solventes orgânicos, tensão superficial baixa e biocompatibilidade dos polímeros aquosos (ver P.A. Albertsson em "Partition of cell particles and macromolecules", 3a edição, Wiley NY 1986; e "Separation using aqueous Phase System" D. Fisher Eds, Plenum NY, 1989) . É conhecido, por exemplo, que as moléculas polares grandes, tais como as proteínas, se particionam a uma concentração muito mais elevada numa fase de polímero com características físicas semelhantes às do dextrano, do que numa fase de polímero com características físicas semelhantes às de PEG (D. Forciniti, C. K. Hall, M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng. 38, 986 1991).

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se processos para preparar partículas de cocleatos à base de lípidos, de tamanho reduzido e preparações derivadas destas, compreendendo uma molécula biologicamente relevante incorporada nas partículas. As partículas de cocleatos são formadas por uma sequência alternada de bicamadas lipídicas/catião. A molécula biologicamente relevante é incorporada nas bicamadas lipídicas ou no interespaço entre as bicamadas lipídicas. Um dos processos para preparar os cocleatos de tamanho reduzido compreende: 1) preparar uma suspensão de lipossomas unilamelares pequenos ou lipossomas carregados com uma molécula biologicamente relevante, 7 2) misturar a suspensão de lipossomas com polímero A, 3) adicionar, de um modo preferido, por injecção, a suspensão de lipossoma/polímero A noutro polímero B no qual o polímero A não é miscível, originando um sistema de polímeros de duas fases aquoso, 4) adicionar uma solução de sal do catião ao sistema de duas fases do passo 3, de modo que o catião se difunde para o polímero B e em seguida para as partículas constituídas por lipossoma/polímero A, permitindo a formação de cocleatos de tamanho reduzido, 5) remover os polímeros por lavagem e ressuspender os cocleatos vazios ou carregados com fármaco num tampão fisiológico, ou qualquer veículo farmacêutico adequado.

Um segundo processo para preparar os cocleatos de tamanho reduzido compreende detergente e uma molécula biologicamente relevante e um catião. 0 processo compreende os seguintes passos: a) proporcionar uma suspensão aquosa contendo uma mistura detergente-lípido; b) misturar a suspensão detergente-lípido com polímero A; c) adicionar a suspensão detergente-lípido/polímero A a uma solução compreendendo polímero B, em que o polímero A e o polímero B são imiscíveis, criando desse modo um sistema de polímeros de duas fases ; d) adicionar uma solução de uma porção catiónica ao sistema de polímeros de duas fases; e e) lavar o sistema de polímeros de duas fases para remover o polímero.

Pode-se aplicar um procedimento de liofilização e o complexo molécula biologicamente relevante-cocleato liofilizado pode ser inserido em cápsulas de gelatina moles ou duras, comprimidos ou 8 outra forma de dosagem, para cedência sistémica, dérmica ou nas mucosas.

Este processo origina uma partícula de tamanho reduzido com uma gama de tamanhos estreita que permite uma cedência oral eficaz das moléculas biologicamente relevantes. A molécula biologicamente relevante particiona-se nas bicamadas lipidicas no interespaço ou em ambos e a molécula biologicamente relevante é libertada das partículas de cocleato por dissociação das partículas in vivo. As vias de administração alternativas podem ser sistémica, tais como intramuscular, subcutânea ou intravenosa, ou nas mucosas, tais como intranasal, intraocular, intravaginal, intra-anal, parentérica ou intrapulmonar. As dosagens adequadas são determinadas, por exemplo, por experiências de dose-resposta em animais de laboratório ou em ensaios clínicos e tendo em conta o peso corporal do doente, taxa de absorção, semi-vida, gravidade da doença e semelhantes. 0 número de doses, dosagem diária e esquema de tratamento podem variar de indivíduo para indivíduo. Outras vias de cedência podem ser a via dérmica, transdérmica ou intradérmica. 0 primeiro passo do novo processo da presente invenção, que é a preparação de lipossomas pequenos, pode ser realizado por métodos convencionais, tais como sonicação ou microfluidização, ou outros métodos relacionados (ver, por exemplo, Liposome Technology, Liposome Preparation and Related Techniques, Editado por Gregory Gregoriadis, Vol I, 2a Edição, CRC Press, 1993) . A adição, de um modo preferido por injecção, de uma suspensão de polímero A/lipossoma em polímero B pode ser conseguida mecanicamente utilizando uma bomba de seringa a uma taxa controlada adequada, por exemplo uma taxa de 0,1 mL/min a 9 50 mL/min e de um modo preferido, a uma taxa de de 1 a 10 mL/min.

Os lípidos da presente invenção são lipidos não tóxicos e incluem, mas não se limitam a lípidos simples que são encontrados em membranas celulares de animais e plantas. De um modo preferido o lípido é um lípido carregado negativamente, de um modo mais preferido, um fosfolípido carregado negativamente e de um modo ainda mais preferido, um lípido do grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, e fosfatidilglicerol. Os lípidos podem também incluir quantidades menores de lípidos zwiteriónicos, lípidos catiónicos ou lípidos neutros, capazes de formar ligações de hidrogénio com uma molécula biologicamente relevante, tal como um lípido tratado com PEG.

Os polímeros A e B da presente invenção podem ser de qualquer classe de polímero biocompatível que possa produzir um sistema de duas fases aquoso. Por exemplo, o polímero A pode ser, mas não se limita a dextrano 200.000-500.000, Polietilenoglicol (PEG) 3.400-8.000; o polímero B pode ser, mas não se limita a polivinilpirrolidona (PVP), álcool polivinílico (PVA), Ficoll 30.000-50.000, éter polivinilmetílico (PVMB) 60.000-160.000, PEG 3.400-8.000. A concentração de polímero A pode variar entre 2-20% p/p, sendo a concentração final dependente da natureza do polímero. Pode-se aplicar a mesma gama de concentrações para o polímero B. Exemplos de sistemas de duas fases adequados são Dextrano/PEG, 5-20% p/p de Dextrano 200.000-500.000 em 4-10% p/p de PEG 3.400-8.000; Dextrano/PVP, 10-20% p/p de Dextrano 200.000-500.000 em 10-20% p/p de PVP 10.000-20.000; Dextrano/PVA, 3-15% p/p de Dextrano 200.000-500.000 em 3-15% p/p PVA 10.000-60.000; Dextrano/Ficoll, 10-20% p/p de 10

Dextrano 200.000-500.000 em 10-20% p/p de Ficoll 30.000-50.000; PEG/PVME, 2-10% p/p de PEG 3.500-35.000 em 6-15% p/p de PVME 60.000-160.000. A molécula biologicamente relevante pode ser uma molécula orgânica que é hidrófoba em meio aquoso. A molécula biologicamente relevante pode ser um fármaco e o fármaco pode ser um agente antiviral, anestésico, anti-infeccioso, antifúngico, anticanceroso, imunossupressor, anti-inflamatório esteróide, anti-inflamatório não esteróide, tranquilizante ou vasodilatador. Exemplos incluem anfotericina B, aciclovir, adriamicina, cabamazepina, melfalan, nifedipina, indometacina, naproxeno, estrogénios, testosteronas, esteróides, fenitoína, ergotaminas, canabinóides rapamicina, propanidida, propofol, alfadiona, equinomicina, nitrato de miconazole, teniposido, taxol e taxotere. A molécula biologicamente relevante pode ser um polipéptido, tais como ciclosporina, angiotensina I, II e III, encefalinas e seus análogos, ACTH, péptidos anti-inflamatórios I, II, III, bradicinina, calcitonina, b-endorfina, dinorfina, leucocinina, hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH), insulina, neurocininas, somatostatina, substância P, hormona libertadora da tiróide (TRH) e vasopressina. A molécula biologicamente relevante pode ser um antigénio, mas o antigénio não se limita a um antigénio proteico. O antigénio pode ser também um hidrato de carbono ou um polinucleótido, tal como ADN. Exemplos de proteínas antigénicas incluem glicoproteínas de envelope de vírus influenza ou Sendai, proteínas de membrana de células animais, proteínas de membrana 11 de células de plantas, proteínas de membrana de bactérias e proteínas de membrana de parasitas. A molécula biologicamente relevante é extraída da partícula, célula, tecido ou organismo fonte por métodos conhecidos. Não é necessário que a actividade biológica de moléculas biologicamente relevantes seja mantida. No entanto, nalguns casos (e. g., quando uma proteína tem actividade de fusão membranar, ou de ligação ao ligando, ou uma conformação complexa que é reconhecida pelo sistema imunitário), é desejável manter a actividade biológica. Nestes casos, utiliza-se um tampão de extracção contendo um detergente que não destrói a actividade biológica da proteína de membrana. Detergentes adequados incluem detergentes iónicos, tais como sais de colato, sais de desoxicolato e semelhantes, ou detergentes de polioxietileno heterogéneos, tais como Tween, BRIG ou Triton. A utilização deste método permite a reconstituição de antigénios, mais especificamente proteínas, nos lipossomas com retenção das actividades biológicas e, eventualmente, associação eficiente com os cocleatos. Isto evita os solventes orgânicos, sonicação ou pH extremo, temperatura ou pressão, podendo todos estes ter um efeito adverso na reconstituição eficiente do antigénio numa forma biologicamente activa.

Os cocleatos isolados em hidrogel podem conter uma combinação de várias moléculas biologicamente relevantes, conforme adequado. A formação de cocleatos de tamanho reduzido (com ou sem uma molécula biologicamente relevante) é conseguida adicionando uma molécula carregada positivamente à solução de polímero de duas 12 fases, aquosa, contendo lipossomas. No procedimento acima para produzir cocleatos, a molécula carregada positivamente pode ser um catião polivalente e, mais especificamente, qualquer catião divalente que possa induzir a formação de um cocleato. Numa forma de realização preferida, os catiões divalentes incluem Ca++, Zn++, Ba++ e Mg++, ou outros elementos capazes de formar iões divalentes ou outras estruturas com múltiplas cargas positivas capazes de quelatar e formar ponte com lipidos carregados negativamente. A adição de moléculas carregadas positivamente a soluções contendo lipossomas também é utilizada para precipitar cocleatos a partir da solução aquosa.

Para isolar os cocleatos e remover a solução de polímero, os precipitados dos cocleatos são repetidamente lavados com um tampão contendo uma molécula carregada positivamente e, de um modo mais preferido, um catião divalente. A adição de uma molécula carregada positivamente ao tampão de lavagem assegura que os cocleatos são mantidas ao longo do passo de lavagem e que permanecem como precipitados. 0 meio em que os cocleatos são suspensas pode conter sais, tais como cloreto de cálcio, cloreto de zinco, cloreto de cobalto, cloreto de sódio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de amónio, sulfato de magnésio e carbonato de sódio. 0 meio pode conter polímeros, tais como Tween 80 ou BRIG ou Triton. A cocleato contendo a molécula biologicamente relevante é produzida por diluição num transportador biologicamente aceitável adequado (e. g., um tampão contendo um catião divalente). 13

As partículas de cocleatos podem ser entéricas. As partículas de cocleatos podem ser colocadas dentro de cápsulas de gelatina e a cápsula pode ter um revestimento entérico.

Nas preparações da presente invenção, podem-se adicionar alguns materiais hidrófobos para se obterem propriedades de absorção melhoradas para cedência oral de moléculas biologicamente relevantes. Estes materiais são, de um modo preferido, seleccionados do grupo constituído por ácidos carboxílicos de cadeia longa, ésteres de ácidos carboxílicos de cadeia longa, álcoois de ácidos carboxílicos de cadeia longa e suas misturas. Os materiais hidrófobos podem ser adicionados ou inicialmente ao lípido, antes da formação dos lipossomas, ou num passo posterior, na forma de um veículo gordo, tal como uma emulsão. 0 especialista na técnica pode determinar os meios mais eficazes e terapêuticos para realizar o tratamento praticando a presente invenção. Também se pode fazer referência a qualquer uma das numerosas autoridades e referências, incluindo, por exemplo, "Goodman & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics", (6a Ed., Goodman et al., eds., MacMillan Publ. Co., Nova Iorque, 1980). A invenção será agora descrita por exemplos que não devem ser considerados como limitativos da invenção. Nos exemplos, salvo indicação em contrário, todas as razões, percentagens e quantidades são em peso. 14

EXEMPLOS

Exemplo 1. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, vazias, a partir de dioleoilfosfatidilserina precipitada com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas a partir de dioleoilfosfatidilserina.

Colocou-se uma solução de dioleoilfosfatidilserina (DOPS, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) em clorofórmio (10 mg/mL) num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi a 35 °C. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 ym. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lipido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida foi sonicada num sonicador com banho arrefecido (Laboratory Supplies Com., Inc.). A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visiveis num microscópio de contraste de fases com uma ampliação de 1000X. A dispersão de luz laser (análise de peso, Coulter N4 Plus) indica que o diâmetro médio é de 35,7 + 49,7 nm.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida, misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 (Sigma) numa suspensão 15 de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada com uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 (Sigma) [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, a uma razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após a remoção do sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em peso, Coulter N4 Plus) indica que o diâmetro médio para a cocleato é de 407,2 + 85 nm (Figura 2b).

Exemplo 2. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, vazias de uma mistura de dioleoilfosfatidilserina e 1.2- Distearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina-n- (poli(etilenoglicol)-5000, DSPE-PEG) precipitada com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas.

Colocou-se uma solução de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) e 1.2- distearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina-n- (poli(etilenoglicol)-5000) , (DSPE-PEG, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) em clorofórmio (razão de DOPS:DSPS-PEG = 16 100:1, p:p) num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi a 35 °C. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lipido seco foi hidratado com água desionizada até uma concentração de 10 mg de lipido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido (Laboratory Supplies Com., Inc.). A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio óptico de contraste de fase com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação 17 nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado detalhado um esquema deste novo processo para obter cocleatos. 0 sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A mixroscopia óptica de contraste de fase indica a formação de cocleatos do tipo agulhas, muito pequenas, uniformes.

Exemplo 3. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, vazias, de uma mistura de dioleoilfosfatidilserina e n-octil-beta-D-glucopiranósido precipitada com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas.

Colocou-se uma solução de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi a 35° C. 0 rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 ym. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lipido seco foi hidratado com uma solução de n-octil-beta-D-glucopiranósido (OCG) a 1 mg/mL a uma razão de DOPSrOCG de 10:1 p:p. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel

A suspensão obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano-500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi, então, injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/ (suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A 18 velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A microscopia óptica de contraste de fase indica a formação de cocleatos do tipo agulha, muito pequenas, uniformes.

Exemplo 4. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com anfotericina B, precipitadas com cálcio.

Passo 1: Preparação de vesículas unílamelares pequenas de

dioleoilfosfatidilserina carregadas com AmB

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e AmB em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi a 40 °C. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lípido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão 19 hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar amarelo claro (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visiveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com AmB A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% v/v de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4° C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em 20 peso, Coulter N4 Plus) indica que o diâmetro médio para os cocleatos com AmB é de 407,3 + 233,8 nm (Figura 2a).

Exemplo 5. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com doxorrubicina (DXR), precipitadas com cálcio

Passo 1. Preparação de vesículas unilamelares pequenas de

dioleoilfosfatidilserina carregadas com DXR

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e (DXR) em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi à TA. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. 0 filme de lipido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 25 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar rosa claro (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com DXR

Misturaram-se em seguida 5 mL da suspensão de lipossomas obtida no passo 1 com 40% p/p de dextrano-500.000 (Sigma) numa 21 suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/ (suspensão A) ] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 6400 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em peso, Coulter N4 Plus) confirmou a formação de cocleatos contendo DXR, pequenas.

Exemplo 6. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregados com ciclosporina A (CSPA), precipitadas com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unílamelares, pequenas carregadas com CSPA de dioleoilfosfatidilserina.

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e CSPA em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme utilizando um rotavapor Buchi à TA. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lipido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi 22 purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com CSPA A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em peso, Coulter N4 Plus) confirmou a formação de cocleatos contendo CSPA, pequenas. 23

Exemplo 7. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com Nelfinavir (NVIR), precipitadas com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas de dioleoilfosfatidilserina carregadas com NVIR

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e NVIR em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi à TA. 0 rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lipido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lipido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com NVIR A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/ (suspensão A) ] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. 24

Adicionou-se uma solução de CaCÍ2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em peso, Coulter N4 Plus) confirmou a formação de cocleatos contendo NVIR, pequenas.

Exemplo 8. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com rifampina (RIF), precipitadas com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas a partir de dioleoilfosfatidilserina carregadas com RIF.

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e RIF em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi à TA. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lípido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador 25 com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com RIF A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 (Sigma) numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 (Sigma)[PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em peso, Coulter N4 Plus) confirmou a formação de estruturas em espiral contendo RIF, pequenas. 26

Exemplo 9. Preparação de cócleatos isolados em hidrogel carregadas com vitamina A, precipitadas com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas de dioleoilfosfatidilserina carregadas com vitamina Ά A vitamina A (retinol) é sensível à oxidação pelo ar e é inactivada por luz UV. A vitamina A fica protegida quando embebida em bicamadas lipídicas. A incorporação é conseguida como se segue:

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e vitamina A em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi à TA. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 μπι. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lípido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lípido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X. 27

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com vitamina A A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante , adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada.

Exemplo 10. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com ácido gordo poliinsaturado (PFA), precipitadas com cálcio

Os PFA são moléculas biologicamente relevantes envolvidas no controlo do nível de colesterol no sangue e são precursores das prostaglandinas. Os PFA são sensíveis à oxidação, o que limita a sua incorporação nos alimentos. Os PFA sofrem, na presença de 28 oxigénio, uma série de reacções designadas por auto-oxidação, levando a aldeídos e em seguida a cetonas que têm um odor e sabor a peixe, desagradável. A incorporação de PFA em bicamadas lipídicas, enroladas, rígidas ajuda a prevenir a cascata de auto-oxidação. Um método geral para preparar cocleatos contendo PFA é como se segue:

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas a partir de dioleoilfosfatidilserina carregadas com PFA.

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina em clorofórmio (10 mg/mL) e PFA em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme utilizando um rotavapor Buchi à TA. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lípido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lípido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com PFA A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 29 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada.

Exemplo 11. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com óleo de canela (CinO), precipitadas com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas de dioleoilfosfatidilserina carregadas com CinO.

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e CinO em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi a 40° C. O rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lípido seco foi hidratado com água 30 desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com CinO A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi, em seguida, injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. 31

Exemplo 12. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com ADN, precipitadas com cálcio

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas de dioleoilfosfatidilserina carregadas com ADN.

Colocou-se uma solução de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi à TA. 0 rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. 0 filme de lipido seco foi hidratado com uma solução de pCMV-beta-gal-ADN em tampão TE (a 1 mg/mL) para se obter uma concentração de DOPS:ADN de 10:1 e uma concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida agitada num vórtex durante vários minutos.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com ADN A mistura de ADN/lipossomas foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de

Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de CaCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. 32 A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo CaCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada.

Exemplo 13. Preparação de estruturas s em espiral isoladas em hidrogel, vazias, precipitadas com zinco

Passo 1: Preparação de vesículas unilamelares pequenas de dioleoilfosfatidilserina

Colocou-se uma solução de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme, utilizando um rotavapor Buchi a 35 °C. 0 rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. 0 filme de lípido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lípido) até a suspensão se tornar clara (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X. 33

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. Adicionou-se uma solução de ZnCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo ZnCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em peso, Coulter N4 Plus) confirmou a formação de cocleatos pequenos. 34

Exemplo 14. Preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com anfotericina B, precipitadas com zinco

Passol: Preparação de vesículas unilamelares pequenas de dioleoilfosfatidilserina carregadas com AmB.

Colocou-se uma mistura de dioleoilfosfatidilserina (DOPS) em clorofórmio (10 mg/mL) e AmB em metanol (0,5 mg/mL) a uma razão molar de 10:1 num frasco de fundo redondo e secou-se até se obter um filme utilizando um rotavapor Buchi a 40 °C. 0 rotavapor foi esterilizado injectando azoto gasoso através de um filtro de 0,2 pm. Os passos seguintes foram realizados numa hote estéril. O filme de lipido seco foi hidratado com água desionizada na concentração de 10 mg de lípido/mL. A suspensão hidratada foi purgada e selada com azoto, em seguida sonicada num sonicador com banho arrefecido. A sonicação foi continuada (durante vários segundos a vários minutos, dependendo da quantidade e natureza do lipido) até a suspensão se tornar amarelo claro (suspensão A) e não haver lipossomas aparentemente visíveis num microscópio de contraste de fase, com uma ampliação de 1000X.

Passo 2: Preparação de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com AmB A suspensão de lipossomas obtida no passo 1 foi em seguida misturada com 40% p/p de dextrano 500.000 numa suspensão de 2/1 v/v de Dextrano/lipossoma. Esta mistura foi em seguida injectada através de uma seringa em 15% p/p de PEG-8.000 [PEG 8000/(suspensão A)] sob agitação magnética, para se obter a suspensão B. A velocidade de agitação era de 800-1.000 rpm. 35

Adicionou-se uma solução de ZnCl2 (100 mM) à suspensão para se obter a concentração final de 1 mM. A agitação foi continuada durante uma hora, em seguida adicionou-se um tampão de lavagem contendo ZnCl2 1 mM e NaCl 150 mM à suspensão B, na razão volumétrica de 1:1. A suspensão foi agitada num vórtex e centrifugada a 3000 rpm, 2-4 °C, durante 30 min. Após se remover o sobrenadante, adicionou-se mais tampão de lavagem na razão volumétrica de 0,5:1, seguido de centrifugação nas mesmas condições. Na Figura 1 é apresentado um esquema detalhado deste novo processo para obter cocleatos. O sedimento resultante foi reconstituído com o mesmo tampão até à concentração desejada. A dispersão de luz laser (análise em peso, Coulter N4 Plus) confirmou a formação de cocleatos contendo-Zn-AmB pequenos.

Exemplo 15. Observação ao microscópio de cocleatos isolados em hidrogel O estudo de microscopia óptica foi realizado gradualmente, isolado, com o procedimento de preparação de modo a se obterem alguns detalhes mecanísticos sobre a formação dos cocleatos isolados em hidrogel.

As imagens de microscópio apresentadas nas Figures 3a, b e 4a-f mostram as alterações morfológicas em cada passo de preparação de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com AmB, precipitadas com iões Ca2+. Quando a mistura de AmB/lipossoma-dextrano foi dispersa na solução de PEG, ocorreu uma separação de fases, conforme mostrado na Fig. 3a. A partição dos lipossomas favoreceu a fase de dextrano dispersa, conforme 36 indicado por uma cor amarela do AmB. Esta partição assegura que os lipossomas estão isolados em cada partícula de dextrano. A adição de iões cálcio na fase contínua (PEG) resultou na formação de precipitados na fase dispersa. Como produto final, formaram-se cocleatos em forma de agulha, pequenos e por observação no microscópio, estes cocleatos abriram-se em vesículas unilamelares por adição de EDTA e quelatação do cálcio (Figuras 4a, b) . A morfologia em forma de agulha foi confirmada por microscopia de varrimento electrónico, após criofractura (Figura 5) . Obtiveram-se imagens microscópicas semelhantes para cocleatos vazias e com AmB, precipitadas com Zn (Figuras 4c, d) e cocleatos isolados em hidrogel precipitadas com Zn (Figuras 4e, f).

Exemplo 16. Actividade antifúngica de cocleatos isolados em hidrogel carregadas com anfotericina B, in vitro

Inibição do crescimento de Candida albicans

Fez-se um teste de susceptibilidade a leveduras, in vitro, comparando os efeitos inibidores e letais de cocleatos contendo AmB, AmBisome (formulação lipossomal de AmB) e AmB/DMSO. Seleccionaram-se cinco colónias de Candida albicans acabadas de crescer, a partir de uma placa de ágar YPD (de uma cultura de 48 horas) e adicionou-se a 2 mL de 2x caldo YPD, pH 5,7. A DO590 desta cultura mãe foi medida e a densidade de levedura foi ajustada para DO590 = 0,1 e adicionou-se 1 mL desta suspensão a cada poço de uma placa de 96 poços.

Adicionou-se AmB/cocleatos, AmB/DMSO e AmBisome a placas de 96 poços, a uma concentração final de 0,078, 0,156, 0,3125, 37 0,625, 1,25 e 2,5 pg/mL de AmB. As placas de 96 poços foram incubadas a 37 °C com agitação cuidadosa e a densidade celular foi medida num leitor de placas de 96 poços (Molecular Devices Spectramax 340) a 0, 2, 4, 6, 24 e 30 horas. A Figura 6 mostra que os cocleatos contendo AmB têm um efeito inibitório do crescimento maior do que os AmBisome (formulação lipossomal de AmB) .

Efeito fungicida de cocleatos isolados em hidrogel, carregadas com anfotericina B.

Removeram-se aliquotas de células de levedura (50 pL) das placas de 96 poços e diluiu-se em série (até 1:10000 para plaquear em placas de ágar) e contou-se utilizando um hemocitómetro. Plaquearam-se 50 pL das células de levedura diluidas em placas de ágar YPD e incubou-se durante 24 horas a 37 °c. Contaram-se as colónias de leveduras utilizando um Fluor-S Multi-Imager da BioRad equipado com o programa Quanitity One™.

Analisaram-se as células de levedura tratadas com AmBisome, AmB/DMSO e AmB/cocleatos (0,625 pg AmB/mL) quanto à razão entre unidades formadoras de colónias e número total de células, após 30 horas de incubação. Os resultados mostram que o AmB/cocleatos teve o efeito letal mais elevado nas células de levedura, em comparação com os outros agentes antifúngicos testados. Havia uma viabilidade de cerca de 0% das leveduras após tratamento com AmB-cocleatos e uma viabilidade de 12% de leveduras após tratamento com AmB/DMSO. O AmBisome não era tão eficaz, resultando numa viabilidade de 52% de leveduras (Figura 7) . 38

Protecção de macrófagos com cocleatos contendo AmB.

As células de limpeza de partículas, tais como os macrófagos, são a primeira linha de defesa contra muitas infecções microbianas. No entanto, verificou-se que muitos micróbios que induzem infecções clínicas graves em humanos infectam macrófagos e impedem a destruição. É possível que, in vivo, o macrófago desempenhe um papel importante na incorporação de cocleatos, através de um mecanismo endocítico. Uma vez que o macrófago também desempenha um papel importante na defesa do hospedeiro e eliminação de fungos e parasitas, é importante estudar a interacção entre macrófagos e cocleatos.

Os exemplos seguintes indicam que os cocleatos são incorporados pelos macrófagos. Verificou-se que doses elevadas de AmB fornecida ao macrófago não são tóxicas e permanecem no macrófago numa forma biologicamente activa. Os cocleatos com AmB proporcionaram protecção para o macrófago contra a infecção por Candida albicans quando administradas antes de, ou após a infecção fúngica.

Regime de dose profiláctica. Fez-se a subcultura de macrófagos J774A.1 (M) numa placa de 96 poços a uma concentração de lxlO5 células/mL em DMEM + 10% de FBS. Adicionaram-se 100 pL de cocleatos contendo AmB (AmBc 0,2, 0,6, 1,25, e 2,5 pg

AmB/mL) , Fungizona, ou cocleatos vazias (EC a 2, 6, 12,5, e 25 pg lípido/mL) na concentração especificada. As placas foram incubadas durante a noite a 37 °C e 5% de C02. 24 horas mais tarde, o meio foi substituído. Este passo foi realizado duas vezes. Adicionou-se Candida albicans (CA) à placa a uma 39 concentração de 2,5 x 103 células/mL, a uma razão de 1:200 em relação ao macrófago. As placas foram incubadas durante a noite nas condições referidas acima.

Após a incubação de 24 horas, as placas foram removidas e observadas. O meio foi pipetado vigorosamente para remover e romper as células, colocaram-se 25 pL desta suspensão em placas de ágar com Dextrose Sabouraud e em seguida colocaram-se num incubador seco durante a noite, a 37 °C. Contaram-se as CFU de C. albicans no dia seguinte. Os dados na Figura 8 sugerem que os macrófagos carregados com cocleatos contendo AmB são muito eficazes a matar células de fungos.

Regime de dose pós-infecção: Fez-se a subcultura de macrófagos J774A.1 (M) numa placa de 96 poços e em seguida incubou-se durante a noite. Após a incubação, os macrófagos foram infectados com CA a uma razão de 200:1 e subsequentemente adicionou-se AmBc, Fungizona ou EC nas concentrações especificadas. Vinte e quatro horas mais tarde, as culturas de células foram observadas e as CFU foram determinadas como descrito acima.

Quando se desafiaram M com CA e se doseou subsequentemente com cocleatos contendo AmB, a contagem de CFU era novamente próximo de zero. Estes resultados indicam que o macrófago incorporou e concentrou a cocleato contendo AmB, uma vez que os macrófagos ficaram protegidos contra o desafio com C. albicans, após se remover por lavagem os cocleatos contendo AmB (Figura 8) .

Pelo contrário, a fungizona, (AmB em desoxicolato), a forma clinica mais popular de AmB, era extremamente tóxica e letal 40 para o macrófago in vitro. No espaço de 5 horas após a administração havia uma grande quantidade de restos celulares na placa de Petri e nenhum sinal de macrófagos viáveis. A observação ao microscópio revela que os cocleatos contendo AmB não são tóxicos para os macrófagos, mesmo nas doses mais elevadas estudadas. Os cocleatos contendo AmB são acumulados a niveis elevados, resultando em vacúolos distendidos, grandes. Após lavagem dos macrófagos e incubação novamente durante 24 horas, a maioria dos vacúolos retomou a forma e tamanho originais, havendo no entanto alguns visivelmente aumentados. Notou-se que alguns macrófagos estavam mesmo a "mover-se" com os vacúolos aumentados. Os cocleatos contendo AmB estão concentrados dentro dos vacúolos e é provável que o AmB seja libertado gradualmente ao longo do tempo.

Exemplo 17: Avaliação da penetração tecidular de AmB após administração iv de cocleatos isolados em hidrogel contendo anfotericina B A penetração de anfotericina B nos tecidos foi avaliada após administração iv. Grupos (n=5) de ratinhos C57BL/6 (20-23 g) receberam iv (0,625 mg/kg) cocleatos contendo AmB (0,05 mL/20 g) com uma seringa de insulina de 100 U de 1/2 cc com uma agulha de 18 g 1/2 de tamanho. A tempos de sacrifício pré-determinados (2, 5, 10, 20 e 40 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 36 e 48 horas), os animais receberam uma anestesia, recolheu-se sangue por punção cardíaca, em seguida foram eutanizados, dissecados e os tecidos de interesse foram removidos (cérebro, pulmão, fígado, baço, rins, coração, gordura, estômago, conteúdo do estômago, intestino e conteúdo do intestino) e pesados. Para análise de 41

AmB, as amostras foram misturadas com solvente de extracção (10% de metanol, 35% de água, 55% de etanol) , homogeneizados, sonicados e centrifugados. Transferiu-se uma aliquota de 90 pL de sobrenadante para um microfrasco, injectou-se no sistema de HPLC numa coluna C-18 Nova-Pak (3,9 x 150 mm, 4 pm de tamanho de partícula) mantida a 40 °C. A anfotericina B foi eluída a um fluxo de 0,5 mL/min com 29% de metanol, 30% de acetonitrilo e 41% de EDTA 2,5 mM e detectada a 408 nm. A concentração de AmB foi calculada com o auxílio de uma curva padrão externa.

Na Figura 9 é apresentada a exposição do tecido após uma única dose iv de cocleatos contendo AmB. Pode-se observar uma forte penetração em tecidos chave como o fígado, baço e rim.

Exemplo 18: Cedência oral de AmB mediado por cocleatos isolados em hidrogel carregadas com AmB.

Regime de dose única A disponibilidade oral dos cocleatos isolados em hidrogel, carregados com AmB foi analisada por administração intragástrica da formulação do exemplo 2 a ratinhos C57BL16 (20-23 g) que jejuaram durante a noite. Administrou-se um décimo mL da formulação na dose de 10 mg/kg a 9 ratinhos. Sacrificaram-se três ratinhos de cada grupo a 1, 6 e 24 horas após administração, seguido de análise do nível de AmB em órgãos e tecidos.

As amostras de tecido e sangue foram processadas como se segue: os tecidos foram diluídos 1/20 ou 1/10 por adição do solvente de extracção (H20 a 35%, metanol a 10%, etanol a 55% 42 ρ/ρ/ρ ην/ν/ν) e homogeneizados com um dispositivo Ultra-Turrex®. Retirou-se uma aliquota de 0,5 mL, sonicou-se durante 1 min e centrifugou-se a 7260 rpm durante 12 min a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para um microfrasco de HPLC e injectaram-se 30 pL numa coluna analítica C-18, 3,9 x 150 mm, de 4 pm de tamanho de partícula com um fluxo de 0,5 mL, a 40 °C. A concentração de AmB detectada a 408 nm foi calculada com o auxílio de uma curva de calibração externa. A Figura 10 mostra o perfil de AmB nos tecidos ao longo do tempo, num período de tempo f de 24 horas. Embora apenas estejam representados graficamente três pontos de tempo, pode ver-se a acumulação em tecidos chave (fígado, pulmões, baço e rins).

Regime de dose múltipla

Dois outros grupos de ratinhos receberam um regime de dose múltipla oral de 10 mg/kg/dia durante dez dias e um grupo foi sacrificado 24 horas após a última dose e o outro grupo 20 dias após a última dose recebida. Nos pontos de tempo pré-determinados os ratinhos foram anestesiados, sacrificados e dissecados para recolha de tecidos. Os tecidos foram processados como no regime de dose única e o nível de AmB foi determinado por HPLC. Os resultados de 24 h após a 10a dose são apresentados na Figura 11 e mostram que os cocleatos isoladas em hidrogel permitem fornecer AmB a partir do tracto gastrointestinal, a níveis terapêuticos. 43

Exemplo 19: Correlação entre biodistribuição em ratinhos saudáveis e infectados e o nivel de Candida albicans no tecido, após administração oral A Figura 12 mostra a relação entre os níveis tecidulares de anfotericina B (pg/g de tecido na escala da esquerda) e eficácia, como diminuição da infecção por Candida albicans (CFU/g na escala da direita) após administração oral de cocleatos contendo AmB (Figura 12).

Após administração oral de 10 mg/kg/dia durante 10 dias consecutivos a ratinhos saudáveis, a AmB apresentou níveis elevados nos rins, seguidos pelos pulmões, baço, fígado e cérebro, que apresentam níveis muito menores do que os outros tecidos. Verificou-se que o estado de doença afecta a farmacocinética dos fármacos a níveis diferentes. Este fenómeno pode ser observado claramente no gráfico: a AmB no tecido atinge níveis inferiores em ratinhos infectados com C. albicans após administração oral de 10 mg/kg/dia (mesma dose) durante 15 dias, mais 5 doses do que o grupo saudável. Também mostra uma alteração no padrão de distribuição, sendo os pulmões o tecido alvo com os níveis mais baixos. A administração oral de uma formulação de cocleatos contendo AmB a 10 mg/kg/dia durante 15 dias permite uma eficácia elevada. A diminuição em CFU/g no tecido do rim é de cerca de 3,5 logs para a formulação de cocleatos. Nos pulmões, as formulações de cocleatos contendo AmB erradicam por completo a C. albicans e limpam os pulmões da infecção por fungos. É óbvio que o sistema de cedência de cocleatos proporciona um nível elevado de AmB em animais infectados, o que se correlaciona com a maior eficácia observada na formulação de cocleatos, indicando que os cocleatos 44 contendo AmB são um veículo adequado para o tratamento oral de candidíase sistémica.

Adicionalmente, os cocleatos-AmB administrados oralmente não eram tóxicos, mesmo na dose mais elevada de 50 mg/kg (não se encontraram lesões nos rins, tracto GI e outros órgãos de ratinhos que receberam 10, 20 e 50 mg/kg de cocleatos com AmB) . Esta dose elevada (50 mg/kg) é equivalente a 100 vezes a dose menor (0,5 mg/kg) que apresentou 100% de sobrevivência no modelo de ratinho infectado com Candida.

Lisboa, 22 de Agosto de 2007 45

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir cocleatos à base de lípidos compreendendo os passos de: a) proporcionar uma suspensão aquosa de lipossomas; b) misturar a suspensão de lipossomas com polimero A; c) adicionar a suspensão lipossomas/polimero A numa solução compreendendo polimero B, em que o polimero A e o polimero B são imiscíveis, criando desse modo um sistema de polímeros de duas fases; d) adicionar uma solução de uma porção catiónica ao sistema de polímeros de duas fases; e e) lavar o sistema de polímeros de duas fases para remover os polímeros.
2. Método da reivindicação 1, em que a adição da suspensão lipossomas/polimero A é realizada por injecção.
3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que os lipossomas são formados por lípido compreendendo lípido carregado negativamente.
4. Método da reivindicação 3, em que o lípido carregado negativamente é a fosfatidilserina. 1
5. Método da reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que o lipido compreende uma quantidade menor de outros lipidos.
6. Método da reivindicação 5, em que o outro lipido é seleccionado do grupo de lipidos zwiteriónicos.
7. Método da reivindicação 5, em que o outro lipido é seleccionado do grupo de lipidos catiónicos.
8. Método da reivindicação 5 em que os outros lipidos são seleccionados do grupo de lipidos capazes de formar ligações de hidrogénio com uma molécula biologicamente activa.
9. Método da reivindicação 8, em que o lipido neutro é um lipido PEGuilado.
10. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o polímero A é, pelo menos, um membro seleccionado do grupo consistindo de dextrano e polietilenoglicol.
11. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a concentração de polímero A no sistema de polímeros de duas fases está numa concentração na gama de 2 a 20% p/p.
12. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o polímero B é pelo menos um membro seleccionado do grupo consistindo de polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, Ficoll, éter polivinilmetílico e polietilenoglicol.
13. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a concentração de polímero B no sistema de polímeros de duas fases está na gama de 2 a 20% p/p. 2
14. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a solução de polímeros de duas fases é, pelo menos, um membro seleccionado do grupo consistindo de dextrano/polietilenoglicol, dextrano/polivinilpirrolidona, dextrano/álcool polivinílico, dextrano/Ficoll e polietilenoglicol/éter polivinilmetílico.
15. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a porção catiónica compreende um ião divalente ou de valência superior.
16. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a porção catiónica compreende um ião metálico divalente ou de valência superior.
17. Método da reivindicação 16, em que o ião metálico é adicionado como um sal de um ácido inorgânico, de um modo preferido em que o sal é cloreto de cálcio, cloreto de zinco ou cloreto de cobalto.
18. Método de qualquer reivindicação anterior, em que os cocleatos de lipídicos são cocleatos de tamanho reduzido.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o tamanho dos cocleatos é inferior a 1 mícron.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que os cocleatos são formados utilizando lipossomas unilamelares pequenos.
21. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a suspensão aquosa de lipossomas compreende uma molécula 3 biologicamente relevante, pelo que os cocleatos também compreendem a molécula biologicamente relevante.
22. Método de acordo com a reivindicação 21 que compreende o passo preliminar de formação de suspensão de lipossomas, formando um filme compreendendo uma mistura da molécula biologicamente relevante e lípido fazendo contactar o filme com uma fase aquosa, para formar a suspensão aquosa de lipossomas unilamelares pequenos.
23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a molécula biologicamente relevante está presente na fase aquosa.
24. Método de acordo com a reivindicação 23 compreendendo o passo preliminar de formação de lipossomas em que um filme de lipido é colocado em contacto com a fase aquosa contendo a molécula biologicamente relevante, para formar a suspensão aquosa de lipossomas.
25. Método de acordo com a reivindicação 21, incluindo um passo preliminar em que uma suspensão de lipossomas vazios é misturada com a molécula biologicamente relevante, para formar a referida suspensão de lipossomas.
26. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a molécula biologicamente relevante tem uma carga.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a molécula biologicamente relevante é carregada positivamente.
28. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a molécula biologicamente relevante é carregada negativamente. 4
29. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a molécula carregada negativamente é um polinucleótido.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o polinucleótido é ADN.
31. Método para produzir cocleatos à base de lipidos, compreendendo os passos de: a) proporcionar uma suspensão aquosa contendo uma mistura detergente-lípido; b) misturar a suspensão detergente-lipido com polímero A; c) adicionar a suspensão detergente-lípido/polímero A numa solução compreendendo polímero B, em que o polímero A e o polímero B são imiscíveis, criando desse modo um sistema de polímeros de duas fases ; d) adicionar uma solução de uma porção catiónica ao sistema de polímeros de duas fases; e e) lavar o sistema de polímeros de duas fases para remover o polímero.
32. Método para produzir cocleatos à base de lipidos de acordo com a reivindicação 31, em que o detergente é octilglucósido. 5
33. Método para produzir cocleatos à base de lípidos de acordo com a reivindicação 31, em que o cocleato compreende uma molécula biologicamente activa.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a molécula biologicamente activa tem uma carga.
35. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a molécula biologicamente activa está carregada positivamente.
36. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a molécula biologicamente activa está carregada negativamente.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que a molécula carregada negativamente é um polinucleótido.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o polinucleótido é ADN.
39. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a molécula biologicamente activa é adicionada no passo a.
40. Método de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 33, em que a molécula biologicamente relevante é seleccionada do grupo consistindo de fármacos, polinucleótidos, polipéptidos e antigénios.
41. Método da reivindicação 40, em que a molécula biologicamente relevante é um fármaco seleccionado do grupo consistindo de agentes antivirais, anestésicos, agentes anti-infecciosos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes anticancerosos, imunossupressores, agentes anti- 6 inflamatórios esteróides, agentes anti-inflamatórios não esteróides, tranquilizantes e vasodilatadores.
42. Método d a reivindicação 41, em que o fármaco é, pelo menos, um membro seleccionado do grupo constituído por anfotericina B, aciclovir, adriamicina, cabamazepina, melfalan, nelfinavir, nifedipina, indometacina, naproxeno, estrogénios, testosteronas, esteróides, fenitoína, ergotaminas, canabinóides rapamicina, propanidida, propofol, alfadiona, equinomicina, nitrato de miconazole, teniposido, taxol, taxotere e rifanipina.
43. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o passo de lavagem envolveu centrifugar o sistema de polímeros de duas fases para separar o precipitado dos cocleatos, remover o sobrenadante contendo o polímero, ressuspender o precipitado num tampão de lavagem, centrifugar o precipitado lavado e repetir, opcionalmente, os passos de ressuspensão e centrifugação, uma ou mais vezes.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o tampão de lavagem contém uma porção catiónica dissolvida.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que a porção catiónica compreende iões divalentes ou de valência superior.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que os iões divalentes ou de valência superior são iões metálicos. 7
47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que os iões metálicos são seleccionados de entre cálcio e zinco.
48. Método de acordo com qualquer das reivindicações 43 a 47, em que a porção catiónica está presente no tampão de lavagem a uma concentração de, pelo menos, 1 mM.
49. Composição de cocleatos compreendendo: a) um lipido carregado negativamente; b) um componente catiónico, e c) uma molécula biologicamente relevante diferente de a) e b), em que os cocleatos têm um tamanho de particula médio inferior a 1 pm e em que o referido componente catiónico é um ião metálico divalente ou de valência superior.
50. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que a molécula biologicamente relevante é seleccionada de vitaminas, minerais, aminoácidos, toxinas, microbicidas, microbiostáticos, cofactores, enzimas, polipéptidos, agregados de polipéptidos, polinucleótidos, lipidos, hidratos de carbono, nucleótidos, amidos, pigmentos, ácidos gordos, hormonas, citócinas, vírus, organelos, esteróides e outras estruturas multi-anel, sacáridos, metais, venenos metabólicos e fármacos.
51. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 50, em que a molécula biologicamente relevante é um fármaco seleccionado do grupo consistindo de agentes antivirais, 8 anestésicos, agentes anti-infecciosos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes anticancerosos, imunossupressores, agentes anti-inflamatórios esteróides, agentes anti-inflamatórios não esteróides, tranquilizantes e vasodilatadores.
52. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 51, em que o fármaco é, pelo menos, um membro seleccionado do grupo consistindo de anfotericina B, aciclovir, adriamicina, cabamazepina, melfalan, nelfinavir, nifedipina, indometacina, naproxeno, estrogénios, testosteronas, esteróides, fenitoina, ergotaminas, canabinóides rapamicina, propanidida, propofol, alfadiona, equinomicina, nitrato de miconazole, teniposido, taxol, taxotere e rifampina.
53. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 4 9, em que a molécula biologicamente relevante é anfotericina B.
54. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que a molécula biologicamente relevante é naproxeno.
55. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que a molécula biologicamente relevante é um polipéptido seleccionado de ciclosporina, angiotensina I, II e III, encefalinas e seus análogos, ACTH, péptidos anti-inflamatórios I, II, III, bradicinina, calcitonina, b-endorfina, dinorfina, leucocinina, hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH), insulina, neurocininas, somatostatina, substância P, hormona libertadora da tiróide (TRH) e vasopressina. 9
56. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que a molécula biologicamente relevante é um antigénio.
57. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 56, em que o antigénio é um hidrato de carbono, um polinucleótido, ou uma proteina.
58. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 57, em que o antigénio proteico é seleccionado de glicoproteinas de envelope de virus influenza ou Sendai, proteínas de membrana de células animais, proteínas de membrana de células de plantas, proteínas de membrana de bactérias e proteínas de membrana de parasitas.
59. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que a molécula biologicamente relevante é vitamina A.
60. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que a molécula biologicamente relevante é um ácido gordo poliinsaturado.
61. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que a molécula biologicamente relevante é um polinucleótido.
62. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 61, em que o polinucleótido é ADN.
63. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49, em que o ião metálico é seleccionado de cálcio, magnésio, zinco e bário. 10
64. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49 ou 50, em que o lipido carregado negativamente é a fosfatidilserina.
65. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 49 ou 50, que compreende, ainda, uma quantidade menor de outro lipido seleccionado de entre lipido zwiteriónico, lipido catiónico e lipido neutro.
66. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 65, em o outro lipido é um lipido neutro que forma ligações de hidrogénio com a molécula biologicamente relevante.
67. Composição de cocleatos de acordo com a reivindicação 66, em que o outro lipido é um lipido PEGuilado.
68. Composição de cocleatos de acordo com qualquer das reivindicações 49 a 67, ou o produto de um método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 48, para utilização num método de cedência de uma molécula biologicamente relevante a um hospedeiro.
69. Utilização da composição de cocleatos de acordo com qualquer das reivindicações 4 9 a 67, ou o produto de um método de acordo com as reivindicações 1 a 48, no fabrico de uma composição para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal, ou para ceder uma molécula biologicamente relevante a um hospedeiro.
70. Utilização de acordo com a reivindicação 69, em que a composição é administrada por uma via mucosa ou sistémica. 11
71. Utilização da reivindicação 70, em que a composição é administrada por uma via mucosa seleccionada de oral, intranasal, intraocular, intra-anal, intravaginal, parentérica ou intrapulmonar.
72. Utilização de acordo com a reivindicação 71, em que a via é a oral.
73. Utilização de acordo com a reivindicação 71, em que a composição é um aerossol.
74. Utilização de acordo com a reivindicação 70, em que a composição é administrada por uma via sistémica seleccionada de intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica ou intradérmica.
75. Composição farmacêutica compreendendo uma composição de cocleatos de acordo com qualquer das reivindicações 49 a 67 e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 22 de Agosto de 2007 12