JP2004515453A - 癌を化学療法および放射線療法に付する間に細胞を保護するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
癌治療または骨髄移植過程の間に、癌の化学療法剤または放射線療法によって引き起こされる損傷から非新生物細胞を保護するための組成物、医薬調製物および方法が開示される。これらは、標的細胞集団において細胞性解毒酵素の生産を誘導または増加させる化学保護誘導剤の使用に基づく。組成物および方法は、一般に癌治療を受けている患者において起こる毛髪喪失、胃腸の不快感ならびに皮膚および口腔粘膜の障害の軽減または予防に有用である。また、新規な化学保護誘導剤を同定するための新規なアッセイ系も開示される。
Description
【０００１】
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）にしたがって、合衆国政府は、一部、国立衛生研究所からの基金（交付番号ＣＡ２２４８４）によってなされた本明細書に記載の発明において、ある特定の権利を有することが認められる。
本出願は、２０００年５月５日に出願された米国出願第０９／５６５７１４号を優先権主張し、その全てが出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は癌治療の分野に関する。特に、本発明は、放射線療法および癌の化学療法剤の毒性作用から非新生物細胞を保護するための新規な組成物および方法を提供する。
【０００３】
（背景技術）
本発明が属する分野の現状をより詳しく説明するために、いくつかの出版物が本出願において引用される。これらの出版物の各々における開示は、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００４】
過去数十年にわたり、外科手術と組み合わせた化学療法および放射線療法が癌死亡率の著しい減少に寄与してきた。しかしながら、癌の治療における化学療法薬の潜在的な有用性は、これらの薬剤の非特異的細胞毒性に関連した不都合な効果のために十分に活用されていない。単独または他の化学療法剤と組み合わせて使用されるアルキル化剤は、全ての化学療法処理のうち約半分において使用される。アルキル化剤は、ＤＮＡ複製を阻害することによって癌性細胞の増殖を妨害する。アルキル化剤以外の癌化学療法薬もまた、哺乳動物細胞に対して毒性である。それらは、２つだけ挙げるとすれば、（１）ＤＮＡ複製に必要なヌクレオチドの合成および（２）有糸分裂に必要な微小管機能などの複製中の細胞内の複数の部位を阻害することができる。細胞内で酸素ラジカルを生じることによってその細胞致死特性のほとんどを達成する放射線療法もまた、哺乳動物細胞を効率よく殺すことができる。これら３つの一般に使用される薬剤の毒性作用は、一般的に、癌細胞に特異的ではないので、それらは正常細胞、特に有糸分裂が活発な正常細胞の増殖にも影響を及ぼす。結果として、これらの癌治療の１以上で治療されている患者は一般に、非常に多くの臨床上の合併症を発現する。
【０００５】
上皮細胞の多くの集団は、早い代謝回転速度を有する。上皮細胞に対する癌治療の毒性は、化学療法または放射線療法を受けている患者が一般に被る副作用の多くの原因である。これらは、胃腸の不快感（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）、悪心、嘔吐、下痢、食欲喪失、毛髪喪失、骨髄抑制および照射部位の皮膚発疹または潰瘍化を包含する。これらの合併症に耐えることは非常に困難であり、患者が該問題を避けるために癌治療処理を見合わせたり、または中止することは稀なことではない。胃腸の障害は、患者の闘病能力を最も効果的にするために必要な食物を得ることを困難にするので、患者の回復のチャンスを傷つけるかもしれない。
【０００６】
典型的には、化学療法の過程の間中、毒性を最小限にし、正常な薬物感受性細胞を保護するために、化学療法剤は最適量より少ない投与量で投与される。正常細胞の化学療法剤に対する感受性を減らすことは、より多くの薬物投与量の投与を可能にし、化学療法をより効果的にすることができる。
放射能療法または化学療法剤の存在下で正常細胞の通常の成長および増殖を促進する保護療法の好結果の手段は、より高投与量の攻撃的な化学療法の使用を可能にするであろう。かかる療法の発展のための２つの重要な標的は、（１）口腔粘膜を包含する胃腸（ＧＩ）管全体の内面を覆う上皮細胞、および（２）毛包および表皮を包含する皮膚の上皮である。
【０００７】
ＧＩ管腔細胞の化学療法および放射線療法に関連する死および脱落は、ＧＩ損傷関連分子の脈管構造中への放出をもたらすようである。これらの血液に運搬される分子は、脳内の部位によって検出される場合、化学療法を受けている患者において非常に一般的である悪心応答を引き起こす。オンダンセトロン（Ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）のような薬物での現在の治療は、これらの脳中枢を抑制し、それにより悪心応答を減少させるように働く。しかしながら、ＧＩ内面の最初の崩壊が今だ、化学療法の最も有効な使用を制限している。これらの患者において悪心を減少させるためのより良好な機構は、ＧＩ表面の最初の崩壊を排除することであり、それにより、脳において損傷に関連した悪心誘導性分子の効果を抑制するというよりもむしろ、これらの分子の放出を防ぐことである。
【０００８】
正常細胞に対し何らかの保護を提供し、これらの細胞により作られる組織の無欠性および機能を維持する新規な胃腸療法が開発されている。正常細胞を保護し、正常細胞の増殖を刺激するための現行のアプローチは、栄養分刺激および増殖因子の摂取を最大化することを含む。かかる方法は、毒性の重篤度を減少し、および／または薬物処理の過程を短縮した。しかしながら、これらの改善点にもかかわらず、深刻な副作用が今だ存続し、より有効な療法が所望される。
【０００９】
化学療法に誘導される脱毛症の治療も研究されている。脱毛症または毛髪喪失は、ヒトにおける最も一般的な毛髪成長障害であり、しばしば、冒された個体において大きな心配事である。癌の化学療法また放射線療法に付随した後天的脱毛症に罹患した患者において、毛髪の喪失は重要な心配事として嘔吐の上位にくる。該状態は一般的に可逆性であり、毛髪成長の再生は治療の中止後１−２ヶ月以内に起こるが、毛髪喪失は、身体イメージにおける負の変化、社会的活動の減少および対人関係の変化を引き起こす可能性のある、さらなる化学療法の拒絶を導きかねない心理学的苦悩を与えるような影響を示す。
【００１０】
化学療法誘導性脱毛の現象は、毛包に対する細胞毒性およびアポトーシスに関連する損傷に起因すると考えられる。いくつかの研究は、化学療法誘導性毛包損傷の根底にある病理生物学的機構が皮膚乳頭の隆起、毛包管のよじれおよび膨大、およびメラニン生成装置の崩壊によって特徴付けられるという証拠を示した。
【００１１】
化学療法誘導性脱毛症から患者を保護する試みにおいて、種々のアプローチが行われた。これらは、頭皮の血流および毛包との薬物接触時間を一時的に減少させる物理的モジュールを包含したが、患者の耐性は非常に乏しかった。これらの不十分な結果は、毛包の幹細胞の代謝速度と毛包マトリックスへの血流の両方を減少させる頭皮冷却法の開発を導いたが、該戦略は失敗であることがわかった。フリーラジカルスカベンジャーであるα−トコフェロールの食事での使用は、ウサギにおいて保護効果を有することを示したが、ヒトでは示さなかった。ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）２％溶液もまた、化学療法誘導性脱毛症の治療において効果的ではないことが見出された。増殖因子およびサイトカインでのげっ歯動物の前処理は、ＡＲＡ−Ｃ（シトシンアラビノシド）によって誘導された脱毛症に対してある程度の保護を提供したが、一般に使用される癌治療薬シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）では提供しなかった。
【００１２】
非経口投与されたか、またはリポソーム中において局所的に塗布されたＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはＮＡＣ／Ｉｍｍｕ Ｖｅｒｔによるシクロホスファミドまたはシクロホスファミド／シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）誘導性脱毛症の逆転は、ラットモデル系において報告された（Ｊｉｍｅｎｅｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １０： ２７１−２７６， １９９２）。ＮＡＣはグルタチオンの前駆体であり、それ自体、細胞内ＧＳＨレベルを増加させることによって解毒剤として機能すると考えられる。この種の治療は、外来性ＮＡＣを添加することによって細胞内ＧＳＨレベルが細胞中およそ２倍にだけなることができることが示されたので、効力が制限される（Ｈｏ ＆ Ｆａｈｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９， １１２３１−１１２３５， １９８４； Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ５： １４３−１４８， １９８４参照）。
【００１３】
米国特許第５７５３２６３号（Ｌｉｓｈｋｏら）は、ある種の化学療法剤によって誘導される脱毛症を治療するための方法および組成物を開示し、それは、リポソーム担体中における有効量のｐ−糖蛋白、またはかかる蛋白をコードしているＭＤＲ遺伝子の局所的適用を特徴とする。該療法は、ｐ−糖蛋白ポンプを介して細胞から運び出されることのできる特定の化学療法剤に限定される。該リストから著しく外れるものは、アルキル化化学療法剤である。
【００１４】
したがって、上記に概説した型の治療は、化学療法誘導性毛髪喪失から何らかの軽減を提供するが、それらの有用性は制限され、さらなる効果的な療法が要望される。
【００１５】
（発明の開示）
本発明によると、癌を治療するための放射線療法または化学療法の過程の間、迅速に分裂している正常細胞を損傷から保護するための新規で有効な戦略が見出された。該戦略は、放射線または化学療法を適用したとき、細胞中に存在する天然の解毒系が活性化されるようにそれらを刺激することを基礎とし、それにより、細胞を損傷から保護することができる。
【００１６】
本発明の一の態様によると、癌の化学療法または放射線療法の間、非新生物細胞を損傷から保護するための組成物が提供される。該組成物は、下記に定義されるような１以上の化学保護誘導剤および該薬剤を非新生物細胞の標的集団に送達するためのデリバリービヒクルを含む。一の好ましい具体例において、標的細胞集団は、毛包内面を覆うかまたは皮膚表皮を含む上皮細胞よりなる。もう一つ別の好ましい具体例において、標的細胞集団は口腔粘膜および胃腸管腔の上皮細胞よりなる。
【００１７】
本発明のもう一つ別の態様によると、癌の化学療法または放射線療法の間、非新生物細胞を損傷から保護するための方法が提供される。該方法は、上皮細胞の集団に上記の組成物を、癌の化学療法または放射線療法の間、非新生物細胞を損傷から保護するのに十分な時間および量で投与することを特徴とする。好ましい具体例において、該方法は、頭皮に該組成物を塗布することによって、癌治療の間の禿頭を予防するために使用される。もう一つ別の好ましい具体例において、該方法は、該組成物を経口投与することによって、癌治療に起因する胃腸の不快感を予防するために使用される。またもう一つ別の好ましい具体例において、該方法は、該組成物を皮膚に塗布することによって、照射部位での皮膚発疹および潰瘍化を予防するために使用される。
【００１８】
本発明の上記態様の好ましい具体例において、化学療法剤は、アルカリ化剤、ＤＮＡ合成の代謝拮抗物質阻害剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂紡錘体毒およびビンカアルカロイドよりなる群から選択される一つまたは組み合わせである。限定するものではないが、例えば、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、アウパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シクロホスファミド（シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ））、シタラビン、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドクソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、フロックスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）ホスフェート、フルオロウラシル、ヒドロキシウリア、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ナイトロジェン・マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、プリアマイシン（ｐｌｉａｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、チオグアニン、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、ビンブラスチンおよびビンクリスチンが挙げられる。放射線療法は、Ｘ線、γ線、電子ビーム、光子、α−粒子および中性子よりなる群から選択される。
【００１９】
好ましい具体例において、化学保護誘導剤は、第Ｉ相およびＩＩ相薬物代謝酵素を誘導するものである。かかる薬剤は、当該分野で既知であり（例えば、Ｈａｙｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ． ６４， １４１−１６８， ２０００）、クマリン、ラクトン、ジテルペン、ジチオレチオンフラボン、インドール、イソチオシアネート、オルガノスルフィドおよびフェノールのようなクラスの化合物を包含する。特定の例は、限定するものではないが、３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール、２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，４−ジメトキシベンゼン、２−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、４−ヒドロキシアニソール、エトキシクイン（ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ）、α−アンジェリカラクトン、β−ナフトフラボン（ｎａｐｔｈｏｆｌａｖｏｎｅ）（β−ＮＦ）、ｐ−メトキシフェノール、オルチプラズ、インドール−３−カルビノール、オメプラゾール、クマリン、カフェストール、カーウェオール（ｋａｈｗｅｏｌ）、ケルセチン、インドール−３−アセトニトリル、アリルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、オイゲノール、フェネチルイソチオシアネート、スルフォラフェン（ｓｕｌｐｈｏｒａｐｈａｎｅ）、アリルメチルジスルフィド、ジアリルスルフィド、ブチルヒドロキシトルエン、エラグ酸およびフェルラ酸を包含する。
【００２０】
もう一つ別の具体例において、化学保護誘導剤は、抗−増殖機能のような第二の機能を有していてもよい。該性質の化合物は、限定するものではないが、３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））および（Ｒ）−（＋）−リモネンを包含する。
【００２１】
本発明のもう一つ別の態様によると、下記に定義されるように、化学保護誘導剤を同定するためのアッセイが提供される。該アッセイは、（ａ）プロモーターおよび１以上のＥｐＲＥ調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物で形質転換された細胞を提供し、（ｂ）化学保護誘導剤としての可能な有用性についてスクリーンされるべき試験化合物に該細胞を曝露し、次いで（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、ここに、試験化合物の不在下での発現と比較した試験化合物の存在下での発現の増加は、該試験化合物が化学保護誘導剤であることを示す工程を含む。また、本発明の該態様にしたがって、該アッセイの実行を容易にするためのキットも提供される。
【００２２】
本発明のもう一つ別の態様によると、環境性発癌物質への細胞の曝露によって引き起こされる癌の予防方法が提供される。該方法は、通常の食事摂生の一部として、１以上の化学保護誘導剤を細胞解毒酵素の発現を刺激するのに十分な量で提供し、それにより、環境性発癌物質への曝露時に環境性発癌物質の影響から細胞を保護することを特徴とする。
【００２３】
本発明の他の特徴および利益は、下記の図面、詳細な記載および実施例から理解されるであろう。
【００２４】
発明の詳細な記載
本発明は、患者に施された化学療法剤または放射線療法の毒性作用から患者の体内の非癌性の迅速に分裂している細胞を保護するための組成物および方法を提供する。特に、本発明の組成物および方法は、上皮細胞を保護するために設計される。最も詳細には、標的は毛包内面を覆う上皮細胞および胃腸管の上皮細胞である。
【００２５】
また、患者が化学療法または放射線療法を受ける場合に影響を及ぼされる他の細胞部位での本発明のさらなる応用も予測される。例えば、いくつかの皮膚病変が、化学療法および／または放射線療法の激しい療法を受ける患者において観察された。これらは、典型的に、基礎的な器官における腫瘍を標的とする放射線療法の分野内で皮膚に起こる。一例として、胸部皮膚病変がしばしば、肺癌のために照射された患者において起こる。別例は、頭部および首部の放射線治療を受けている患者における粘膜炎症の発症、すなわち、口腔ただれの発現である。さらに、以前に問題なく放射線治療を受けた患者において、患者がその後にシトキサンで処理されるときに皮膚病変が起こるという「放射線リコール」と呼ばれる現象がときどき現れる。
【００２６】
皮膚病変は一般に、皮膚炎の変形であり；それらは皮膚破壊および腫瘍化（上記の口腔ただれを包含する）、全身に広がった皮膚発疹、または繰り返して照射した皮膚領域における散乱した赤い病変よりなることができる。これらの癌治療によって誘導される病変の形成は、正常な皮膚の表皮層内で常に起きている高レベルの細胞分裂と一致する。本発明の組成物は、可能な同時的全身性化学療法はもちろん、繰り返しの放射線によって危険にさらされているこれらの皮膚領域を治療するのに非常に有用であると考えられる。
【００２７】
図３に示されるように、いくつかの化学保護誘導剤のいずれかへの皮膚の曝露後に、非常に多数のストレス応答遺伝子の発現が活性化される。活性化された遺伝子の群は、薬物の第ＩＩ相解毒および反応性酸素種に直接関与する蛋白質、例えば、２、３挙げるならば、いくつかのＧＳＴイソ型、カタラーゼおよびキノンレダクターゼ、ならびにｍｄｒ−２、ＭＲＰなどのような細胞からの薬物分子の輸送に関与する蛋白質をコードする。また、ＤＮＡ修復酵素も包含される。この幅広いアップレギュレートされた応答のため、発明者らは、アルカリ化剤分子を包含するが、多くの他の癌化学療法剤群、例えば、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、有糸分裂紡錘体毒、抗腫瘍抗生物質およびビンカアルカロイドにまで及ぶ幅広く種々の薬物に対する耐性表現型を予測する。薬物はストレス応答遺伝子産物の一つによって直接代謝されなくても、まだ、１以上のアップレギュレートされた膜薬物輸送ポンプによって細胞からより迅速に輸送されるようである。正常細胞においてその耐性を誘導しうる化学療法剤の例は、限定するものではないが、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クラドリビン、シクロホスファミド（シトキサン）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、エトポシド、フロックスウリジン、フルダラビンホスフェート、フルオロウラシル、ヒドロキシウリア、イダルビシン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、ナイトロジェン・マスタード、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プリアマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチンおよびビンクリスチンを包含する。シトキサン、シタラビン、ドクソルビシンおよび放射能の毒性作用に対して保護するための化学保護誘導剤の使用は、実施例においてより詳細に記載される。
【００２８】
したがって、本発明は、細胞のために解毒剤として作用する生物学的分子を生産することのできる細胞の能力を利用する。本明細書で用いる場合、「解毒剤」なる語は、直接または間接的に、１以上の化学療法剤または放射線療法の毒性作用を軽減または排除できる薬剤をいう。解毒剤のいくつかのカテゴリーが細胞において生産される。薬剤の１のカテゴリーは、毒性化合物を修飾することによって、その毒性を減少させるか、または影響を受けやすくして、その後に細胞から排除するように作用する。例えば、化学療法において使用されるアルキル化剤のほとんどは、主要な疎水性領域を有する脂肪親和性親電子物質である。これらの薬剤を細胞から除去するための直接的な輸送機構の不在は、これらの疎水性親電子物質の漸次的な細胞内蓄積をもたらす。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、種々の抗新生物アルキル化薬を不活性化することのできるその能力についてよく知られている。ＧＳＴは、親電子化合物によって引き起こされる損傷から細胞を保護することにおいて重要な役割を有する酵素の一群である。化学療法剤をより毒性の低い形態または細胞からより容易に除去される形態に変換することによって作用する別の薬剤は、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。該分子は、カルボプラチンおよびオキサザホスホリンを包含するアルキル化剤、例えば、シクロホスファミドおよび４−ヒドロペルオキシシクロホスファミドの影響に対する細胞の増加した耐性と関連することが示されている（Ｔａｎｎｅｒら、Ｇｙｎ． Ｏｎｃｏｌ． ６５： ５４−６２， １９９７； Ｂｕｎｔｉｎｇ ＆ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １１８８４−１１８９０， １９９６）。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、オキサザホスホリンの活性化経路の重要な中間体であるアルドホスファミドの酸化を触媒し、それにより、これらの薬剤を解毒する（Ｓｒｅｅｒａｍａ ＆ Ｓｌａｄｅｋ， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ２３： １０８０−１０８４， １９９５）。
【００２９】
解毒剤のもう一つ別のカテゴリーは、（上記のように輸送用に修飾されたか、または修飾されていない）毒性薬剤の細胞の外への輸送を容易にすることによって作用する。例えば、ある特定のＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターは、哺乳動物を包含する幅広く種々の生物において同定されており、このように作用するようである。各々、ｍｄｒおよびｍｒｐ遺伝子によってコードされたＡＢＣトランスポーターの２つのよく研究された群は、哺乳動物の腫瘍細胞において観察された多剤耐性現象と関連する。ｍｄｒ遺伝子は、細胞からのある特定の脂肪親和性薬剤（例えば、アドリアマイシン、ビンブラスチン、タキソール）のエネルギー依存性流出の媒介となるＰ−糖蛋白のファミリーをコードする。ｍｒｐ遺伝子は、その特異性がｍｄｒ遺伝子産物のそれと重複するが、また、グルタチオンとの結合後に種々の有機化合物の排出の媒介となるトランスポーターのファミリーをコードする。
【００３０】
上皮細胞における１以上これらの解毒剤の増加が、上記に列挙した化学療法剤のうち１つまたはそれ以上の毒性作用に対して細胞を保護し、同様に、放射線療法の過程の間、損傷から細胞を保護するように働くことが、本発明によって見出された。したがって、本発明はその最も基本的な態様において、化学療法および／または放射線療法の前またはその初期の過程の間に、上皮細胞においてかかる薬剤を送達して、またはかかる薬剤の生産を増加して、癌治療に付随する損傷から細胞を保護することに向けられる。
【００３１】
しかしながら、上記に列挙した解毒剤のほとんどが酵素であることに注目されたい。有効量の解毒酵素が細胞中に存在するようにポリペプチドまたはポリペプチドをコードしている遺伝子を選択された細胞集団へ送達することは困難であり、予測不可能である。したがって、本発明は、１以上の細胞性解毒剤の生産の増加を誘導するために、既知または見出された小型分子の投与によって標的細胞におけるその酵素の生産の増加を誘導することに依存する。これらの分子は、本明細書において、「化学保護誘導剤」または分子と称される。したがって、本明細書で定義される「化学保護誘導剤」は、上記のように、細胞への送達時に、細胞の内在性解毒剤の生産を誘導または増加する薬剤である。
【００３２】
本発明によると、化学保護誘導剤が標的細胞集団へ効率よく送達され、細胞に侵入し、種々の手段により、例えば、酵素をコードしている遺伝子の発現増加を誘導することにより、１以上の解毒酵素の生産を誘導または増加させることができることが見出された。得られた利益は、下記により詳細に論じられるように、化学療法または放射線療法に関連する症状、最も顕著には、毛髪喪失および胃腸の不快感の緩和である。
【００３３】
本発明の組成物は、内在性解毒分子の生産を誘導することによって上記の１以上の化学療法剤に対する解毒効果を示す１以上の化学保護誘導剤、および化学保護誘導剤を保護の標的とされる細胞および組織に送達するためのデリバリービヒクルを含む。
【００３４】
化学保護誘導剤
本発明の目的の場合、「化学保護誘導剤」は、上皮細胞への送達時に、細胞内における解毒分子（上記に定義される）の生産を誘導または増加させるいずれの薬剤であってもよい。作用機構に関するいずれの説明によっても制限されるものではなく、本明細書において示される実験結果は、これらの化学保護誘導剤が一連のストレス応答分子を生産するように細胞を刺激する穏かな酸化ストレスを提供し、その結果、化学療法または放射線療法のより重篤なストレスが強要されるとき、該分子がすでに増加しているかまたは活性化されているので、これらの化学保護誘導剤が有効であることを示唆する。該機構は、ワクチン接種法に対するその機能的類似のため、ときどき、本明細書において「代謝ワクチン接種（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」と称される。
【００３５】
「化学保護誘導剤」として包含されるべき単独または上記の化合物と組み合わせる第２群の化合物は、アリール炭化水素（Ａｈ）受容体の機能的リガンドである化合物を包含する。いくつかの場合、活性化されたＡｈ受容体に起因するシトクロムＰ４５０ １Ａ１遺伝子の保証される誘導発現は、薬物の解毒における第Ｉ相代謝工程を提供することができ、次いで、ストレス応答遺伝子群の不可欠な部分である１以上の誘導されたＧＳＴによる代謝産物の抱合が起こる。次いで、本質において、これらの化合物は、細胞から毒性薬物を除去するために、細胞が代謝的「ワンツーパンチ」を発揮する機会を提供する。該能力において使用できるＡｈ受容体リガンドの例は、限定するものではないが、アブラナ科植物由来のインドール−３−カルビノール、およびオメルプラゾール（ｏｍｅｒｐｒａｚｏｌｅ）を包含する（Ｊｅｌｌｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４５： １１２９−１１３６， １９９３； Ｄｚｅｌｅｔｏｖｉｃら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １２７０５−１２７１３， １９９７）。他の適当なＡｈリガンドは当該分野で既知である。
【００３６】
当該分野で知られている多くの化学保護誘導剤は、本発明において使用に適する（例えば、ＤｅＬｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５： ５４６−５５１， １９８５； Ｉｏａｎｎｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２： １１９９−１２０４， １９８２； Ｃｈｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６： １６５−１６８， １９８６； Ｗａｔｔｅｒｎｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４０： ２８２０−２８２３， １９８０； およびＫｅｎｓｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６： ３９２４−３９３１， １９８６）。限定するものではないが、例えば、３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（３−ＢＨＡ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（２−ＢＨＡ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，４−ジメトキシベンゼン（メチル−ＢＨＡ）、２−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシキノン（ｔ−ＢＨＱ）、４−ヒドロキシアニソール、エトキシクイン、α−アンジェリカラクトン、β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）、ｐ−メトキシフェノールおよびオルチプラズが挙げられる。これらに加えて、本発明によると本明細書に開示される方法を用いて、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）の小型分子ライブラリーから同定された図１５に示される分子を包含する他の化学保護誘導剤が同定された。図１５に示されるように、これまでに同定された最も強力な化学保護誘導剤は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅライブラリー由来のＣＧ０９である（図１５の構造１）。
【００３７】
上記に列挙した分子のいくつか（例えばＢＨＡ）は、食物産業において化学的抗酸化剤として使用される。しかしながら、本発明において明らかにされるように、その効果は体内での代謝におけるオキシダントとしてである。例えば、ＢＨＡを哺乳動物に投与すると、代謝されて、１次代謝産物としてｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔ−ＢＨＱ）が生じる。細胞系における大抵のヒドロキノンと同様に、ｔ−ＢＨＱは自発的に、キノンとヒドロキノン形態間の環変換、すなわち、細胞中での酸化還元循環を起こす。酸化還元循環の副産物は、１以上の形態の酸素フリーラジカルの形成である。細胞は、これらの酸素フリーラジカルを環境ストレスとして感知し、ストレス応答遺伝子の発現を引き起こす。このように、ＢＨＡのような化学的抗酸化剤は、本明細書で定義されるような化学保護誘導剤として作用するように、細胞中で効果的なオキシダントになりうる。
【００３８】
実施例に記載されるように、いくつかの化学保護誘導剤を種々の動物モデル系、特に仔ラットにおける脱毛症モデルにおける効力について試験した。したがって、上記に列挙した化合物の確認において、または上記化合物に加えて、これらの化合物は本発明における使用に特に好ましい。それらは、化学療法または放射線誘導性脱毛症の治療における使用に特に好ましい。これらの化合物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリー由来の化合物ＣＧ０９、２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（２−ＢＨＡ）、β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）、オルチプラズ、ベンジルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン（レスベラトロール）および（Ｒ）−（＋）−リモネンを包含する。
【００３９】
これらの後者の２つの化合物（レスベラトロールおよび（Ｒ）−（＋）−リモネン）は、抗増殖剤として機能することも知られている。したがって、化学療法および放射線療法の間に迅速に分裂している細胞を保護することにおけるそれらの効力は、それらの化学保護誘導機能または抗増殖機能のいずれか、あるいはその両方の機能に帰することが可能かもしれない。これらの分子がその効果を示す機構にかかわらず、それらは、脱毛症モデルの仔ラットにおいて効果的であることが明らかになり、本発明の他の具体例において特に有用であることが予測される。
【００４０】
デリバリービヒクル
本発明の組成物は、また、デリバリービヒクルを含む。デリバリービヒクルの主要な機能は、化学保護誘導剤を化学療法剤からの保護の標的とされる細胞集団または組織に運搬することである。
【００４１】
非侵襲性担体系を用いる皮膚を介する有機および生物学的物質のデリバリーは、その手法の非侵襲性による患者許容性ならびに胃腸障害および送達された分子の初回通過代謝の回避を包含する多くの魅力を有する。しかしながら、皮膚デリバリーにおける主要な問題は、皮膚角質層の障壁に対するほとんどの物質の低い浸透率である。皮膚は真皮と表皮の二層からなる。真皮は、結合組織、神経、血管およびリンパ管、毛包、皮脂腺および汗腺よりなる。表皮は、分化のいくつかの段階の細胞よりなる；この分化の間、細胞は基底層から表面へ移動し、角化して角質層を形成する。角質層の脂質マトリックスは、コレステロール、遊離脂肪酸およびセラミドよりなる二重層になった脂質膜より形成される。角質層は経皮的吸収に対する主要な障壁であると考えられるが、それはまた、浸透の主要経路でもある。したがって、角質層の脂質マトリックスを緩めるまたは流動化する化合物は、皮膚に対する物質の浸透を増加させうる。これは通常、アルブミン結合体、レシチン、糖蛋白、多糖類およびリポソームのような担体分子を用いることによって達成される。
【００４２】
これらの選択肢のうち、リポソーム処方は、より慣用的な処方を超えるいくつかの利益を提供する。主要な利益は、（１）望ましくなく高い全身性吸収由来の深刻な副作用および配合禁忌の減少；（２）リポソームと角質層の高い融和性による、投与部位での送達された物質の有意に高い蓄積；（３）幅広く種々の疎水性および親水性分子の皮膚中への容易な取り込み；（４）捕獲した化合物の代謝分解からの保護；および（５）天然の膜構造に対する密接な類似およびそれに関連する生体適合性および生物分解性である。
【００４３】
リポソームは、リン脂質が水性媒体中に分散されるときに形成されるリン脂質分子の高度に精密な自己集合から作成される球形同心流動モザイクとして定義され得る。脂質が水性媒体中に置かれるとき、脂質頭部群と水との親水性相互作用が、球形外皮の形態の生物膜に似た多重層状および単層状の系または小胞の形成をもたらす。これらの基本的なリポソームは、ときどき、「従来のリポソーム」と称される。いくつかの他の型のリポソーム調製物が存在し、それは、（１）ポリエチレングリコールのような不活性親水性ポリマーで被覆された表面である、立体安定化されたリポソーム；（２）抗体またはそのフラグメント、レクチン、オリゴ糖またはペプチドのような標的リガンドが結合する、標的とされるリポソーム（下記に論じられるように、コレラ毒Ｂ（ＣＴＢ）を用いて、胃腸上皮にリポソームを向ける）；および（３）特定の相互作用に応答してその相および構造を変化する、反応性または「多形」リポソーム（該群は、刺激のなかでも特に、イオン（ｐＨ、カチオン）、熱および光に感受性のリポソームを包含する）を包含する。上記の異なる型のリポソームの概説については、Ｄ． Ｌａｓｉｃ， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９４の第６章を参照のこと。
【００４４】
化学保護分子の皮膚への効果的なデリバリーを達成するために、リポソームの種々の処方（リン脂質を基礎とする小胞、カチオン性リポソーム、非イオン性リポソーム、非イオン性／カチオン性リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ））、ＰＩＮＣポリマー、およびプロピレングリコールおよびエタノール混合物（ミノキシジルの投与用に一般に使用されるビヒクル）、および非イオン性リポソーム／プロピレングリコールおよびエタノール混合物が試験された（実施例参照）。非イオン性リポソームまたは非イオン性リポソームおよびプロピレングリコール／エタノールの混合物が特に効果的な経皮担体であることが決定された。
【００４５】
反応性リポソームは、本発明の他の具体例に好ましい。リポソームの微量成分としてのカチオン性両親媒性化合物の封入は、負に荷電した溶質との会合、リポソームの細胞表面への迅速な結合、およびリポソームの細胞取り込みを容易にする。ｐＨ感受性リポソームは、抗腫瘍薬剤、蛋白質および核酸の細胞質デリバリーの効率を改善するために開発されてきた。ほとんどのｐＨ感受性リポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を用いて調製された。ＰＥは単独でリポソームを形成せず、反転した六辺形相（ＨＩＩ）を形成する傾向がある。しかしながら、リポソームは、ＰＥに別の二重層安定性の両親媒性脂質成分を加えることによって調製することができる。カルボキシル基を有する滴定可能な両親媒性物質は、ｐＨ感受性リポソームの調製のための成分として使用されてきた。これらの滴定可能な両親媒性物質によって二重層膜を安定化することのできる能力は、酸性条件下で減少するので、不安定化がリポソームの融合をもたらす。ｐＨ感受性リポソームは、生理学的ｐＨにて安定であり、エンドサイトーシス経路を通じて細胞によって内在化され、それによりリポソームが酸性ｐＨに曝露される。エンドソーム内のリポソームは不安定化され、おそらく、エンドソーム膜と融合し、その結果、リソソーム酵素による分解を伴うことなく細胞質中にその内容物を放出する。
【００４６】
本発明の他の具体例において、立体的に安定化した不活性リポソームが特に適当である。また他の具体例において、標的とされるリポソームを用いて利益を得てもよい。
本発明の他の具体例において、特に化学保護誘導剤の表皮への投与のために、脂質を基礎とする「クリーム」が特によく適する。クリームは一般に、水、アルコール、プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよび白蝋を含むように処方される。別の処方において、それらは水、アルコール、グリセロール、ホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリンおよびトリグリセリドを含む。
【００４７】
局所投与に有効であると証明されたもう一つ別のデリバリービヒクルは、水性アルコール溶液である。エタノール、メタノール、プロピレングリコールまたはブタンジオールのようなアルコール類は、１０−１００％アルコールを含む水性溶液において調製され、活性薬剤を該溶液中に溶解させる。該型のデリバリービヒクルは、実施例７−９に記載のプロトコールにおいて用いられる。
他のデリバリービヒクルもまた、本発明における使用、特に、胃腸管腔への解毒剤の投与に適当である。限定するものではないが、（１）植物油または魚油などの油（標準的なゲルカプセル中に入れることができる）；および（２）ポリオキシエチレンエーテル、例えば、１０−ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ ７６）を水性バッファー中で分散させることによって調製されたエマルジョンが挙げられる。
【００４８】
ＧＩ管腔に適当なデリバリービヒクルの他の例は、ポリ乳酸ポリグリコール酸の生物分解性微粒子（直径０．１−１０μＭ）を包含し、それは、経口ドラッグデリバリーを介する胃腸内取り込みのイン・ビトロでのモデル系として、蛋白質をＣａｃｏ−２細胞へ送達するために使用された（Ｄｅｓａｉら、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １４： １５６８−１５７３， １９９７）。他に、ポリスチレン粒子によって運搬される蛋白質のラットの小腸内面細胞中への有意な取り込みが示された（Ｈｉｌｌｅｒｙら、Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２： １５１−１５６， １９９４）。実際、蛋白質含有微粒子のデリバリーは、ＧＩ管腔から粘膜下組織脈管構造までさまざまに報告された（Ａｐｈｒａｍａｉａｎら、Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ６１： ６９−７６， １９８７）。したがって、かかるポリマー微粒子は、ＧＩ管腔の表面に見出される胃腸上皮細胞への化学保護誘導剤の経口デリバリーに極めて適当である。
【００４９】
化学保護誘導剤を含む医薬調製物の投与
保護の標的とされる細胞集団または組織に依存して、下記の本発明の組成物の投与様式が考えられる：局所、経口、鼻腔、眼、直腸、膣、経皮、腹腔内および静脈内。標的とされるデリバリーが意図されるので、これらの投与様式のうち若干数が標的とされるデリバリービヒクル（例えば、ＣＴＢ−または抗体−散在リポソーム）に最も適当である。
【００５０】
本発明の組成物は、一般に、医薬調製物として患者に投与される。本明細書で使用される場合、「患者」なる語はヒトまたは動物対象をいう（動物は特に、特定の組成物の臨床上の効力に関するモデルとして有用である）。適当な医薬調製物の選択は、選択された投与法に依存し、医化学者によく知られたプロトコールにしたがって作成され得る。
【００５１】
本発明の組成物を含む医薬調製物は、従来、水、緩衝化セーライン、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁化剤またはその適当な混合物などの許容される媒体と共に投与するために処方される。選択された媒体中における特定の組成物の濃度は、デリバリービヒクルおよびその中に配置された活性薬剤の特異的性質と共に、媒体の疎水性または親水性の性質に依存するであろう。溶解性限界は当業者によって容易に決定されうる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「生物学的に許容される媒体」なる語は、上記の段落で例示されたような、医薬調製物の望ましい投与経路に適当でありうるあらゆる溶媒、分散媒体などを包含する。医薬上活性な物質のためのかかる媒体の使用は、当該分野で既知である。いずれかの慣用的な媒体または薬剤が投与されるべき組成物と配合禁忌である場合を除いて、医薬調製物中におけるその使用が意図される。
【００５３】
医薬調製物は、投与の簡便性および適用量の均一性のために、投与単位形態で処方される。本明細書中で使用される場合、投与単位形態なる語は、治療を受けている患者に適当な医薬調製物の物理的に分離した単位をいう。各適用量は、選択された医薬担体と関連して所望の保護効果を生じるように計算された量の化学保護誘導剤を含有する。適当な投与単位を決定するための手法は当業者によく知られている。
【００５４】
投与単位は、患者の体重に基づいて比例的に増減させてもよい。特定の化学療法剤の毒性作用からの標的細胞集団または組織の保護を達成するための適当な濃度は、当該分野で知られているように、用量濃度曲線計算によって決定され得る。
一例として、局所塗布の場合、化学保護誘導剤は、頭皮または他の皮膚部位に塗布される適当な担体（例えば、リポソームエマルジョン）中５−１００ｍＭの濃度範囲で使用されうる。該用量は、げっ歯動物モデルを用いる実験の結果から得られ（実施例１−３参照）、用量の範囲は、用量効果において変動したいくつかの異なる分子を用いる実験から得られた結果の相関的要素である。皮膚に塗布される材料の容量は、被覆されるべき表面積の大きさによって変化する；例えば、小さな子供の頭皮処理では３−５ｍｌを要し、成人においてその量は、１回の塗布につき１０−２０ｍｌまで増加する。
【００５５】
もう一つ別の例として、胃腸内投与の場合、適当な媒体（例えば、リポソームエマルジョン）中における化学保護誘導剤の経口投与は、胃および十二指腸の管腔表面積に対して標準化される。これは、患者が朝起きたときに空の胃において材料を消費すると仮定した。
【００５６】
また、本発明の医薬処方が１以上の化学誘導剤を含有しうることは当業者に明らかであろう。かかる薬剤の種々の組み合わせはある特定の適用に有用であり、かかる組み合わせの処方は上記の一般的なガイドラインによって調製されたであろう。さらに、１以上の化学保護誘導剤は、２つの異なる作用様式によって効果のある医薬処方を提供するために、抗増殖薬のような他の薬剤と組み合わせてもよい。かかる使用に適当な抗増殖剤は、２０００年１２月２８日にＷＯ００／７８２８９として公開されたＰＣＴ出願ＵＳ００／０５１８６において記載されたサイクリン依存性キナーゼＩＩ阻害剤である。さらに、本明細書に記載された化学保護誘導剤のうち若干数は抗増殖活性も有する。
【００５７】
医薬調製物の投与方針
本発明の組成物を含む医薬調製物は、化学療法および／または放射線療法と適当な間隔をおいて、化学療法および／または放射線療法の前、化学療法および／または放射線療法の間または化学療法および／または放射線療法の後に投与してもよい。特定の場合、適当な間隔は通常、化学療法または放射線療法および保護の標的とされる細胞集団の性質に依存するであろう。
【００５８】
例えば、化学療法に誘導される脱毛症の予防の場合、化学保護誘導剤を含有するリポソームまたは他のデリバリービヒクルは、例えば、局所クリームとして、化学療法の予定された適用前に患者の頭皮に送達させるように処方することができる。毛包の曝露面の内面を覆う上皮細胞を化学療法薬から保護することによって、一般に癌化学療法に付随する毛髪の喪失を予防することができる。実施例においてより詳細に記載されるように、化学療法の適用時に誘導された解毒遺伝子産物が毛包の上皮細胞中で完全に活性化されることを保証するために、局所処方は好ましくは化学療法の１−５日前に開始する。次いで、化学療法の過程の間、該処方を塗布しつづけてもよい。
【００５９】
胃腸上皮の保護の場合、化学保護誘導剤は、化学療法の予定された適用前に患者に経口的に送達させるように処方される。したがって、化学療法剤の注入の１−５日前での保護処方の投与は、影響されやすい上皮細胞に保護を与える。例えば、患者は、化学療法の１−５日前の朝の朝食前に、化学保護誘導剤／リポソームエマルジョンを含有する「シェイク」を消費するように指示されるであろう。結果として、ストレス応答遺伝子産物のレベルは、化学療法薬がＧＩ管腔上皮に浸透するとき、その誘導される最大値になるであろう。
【００６０】
新規な化学保護誘導剤の同定
上記のように、種々の分子が細胞においてストレス応答遺伝子を誘導することが知られており、それにより、本発明において利用される化学保護誘導効果を提供する。しかしながら、同等または上回る活性を有する新規な化学保護誘導剤を同定するための単純な方法を見出すことは、当該分野における前進であろう。したがって、本発明は、また、有害な化学療法剤または放射線療法の副産物の細胞解毒が可能な１以上のストレス応答分子の生産または活性を誘導または増加させることのできる能力について、候補分子をスクリーニングするための迅速かつ単純なアッセイ系を提供する。該方法は実施例４に詳細に記載される。アッセイは、親電子応答エレメント（ＥｐＲＥ）が、種々の環境因子からの細胞保護の重要な機構を構成する第ＩＩ相解毒酵素および酸化ストレス蛋白質の誘導発現の媒介となるという実例に基づいている（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ５３６１−５３６６， １９９７）。該アッセイは、プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子およびプロモーターに隣接して挿入された１以上のＥｐＲＥ調節エレメントを含むＤＮＡ構築物を利用する。細胞を該ＤＮＡ構築物で形質転換し、発現されたレポーター遺伝子産物の低い存在および活性を展示するクローン（負の対照）、第ＩＩ相解毒酵素の既知の誘導剤に細胞を曝露したとき、レポーター遺伝子産物の高い存在または活性を誘導可能なクローン（正の対照）を選択する。次いで、細胞を候補試験化合物に曝露し、レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。該アッセイは、多くの試験化合物の同時試験のためのマルチプルウェル系において組み立てることができる。
【００６１】
本発明の好ましい具体例において、レポーター遺伝子は、実施例４に記載のように、チミジンキナーゼプロモーターおよびＥｐＲＥ調節エレメントのコンカテマーの調節下で緑色蛍光蛋白質をコードする。
また、本発明によると、スクリーニングアッセイの実施を容易にするためのキットも提供される。該キットは、ＤＮＡ構築物およびアッセイを行うための説明書を含む。さらに、キットは、形質転換に適当な培養細胞、アッセイにおいて対照として使用するための試薬、レポーター遺伝子の発現量を検出するための試薬、および他の種々の培養培地または生物化学試薬を適宜含んでいてもよい。
【００６２】
癌を予防するための化学保護誘導剤の使用
癌の病因は完全には理解されていないが、ある種の化学的または環境的因子が突然変異原および発癌物質として作用することがよく知られている。この理由で、本発明は、癌予防としての化学保護誘導剤処方の使用も意図する。毎日の食事摂生の一部としてのこれらの薬剤の予防的消費は、正常な器官、例えば、胃および小腸、ならびに胸部のような非ＧＩ組織の宿主において化学保護遺伝子の慢性的な誘導発現をもたらすであろう。解毒細胞蛋白質の慢性的な増加は、それらの細胞がよりいっそう、一般に喫煙および食物副産物から生じる発癌物質のような毎日の生活において遭遇する化学発癌物質を解毒できるようにするであろう。
【００６３】
下記の実施例は、本発明を説明するために提供される。それらはいかなる方法においても本発明を制限しようとするものではない。
【００６４】
実施例１
化学保護遺伝子産物の発現を誘導する分子の局所塗布による化学療法誘導性脱毛症の予防
発明者らは、細胞毒に対して細胞を保護することが知られているＧＳＴ、ＭＲＰ、ＭＤＲ、ＡＬＤＨ３などの化学保護遺伝子産物を発現することによる毛包の選択的保護によって薬物誘導性脱毛症が大いに首尾よく予防できると仮定した。ＭＲＰおよびＧＳＴ Ｐ１の組み合わせた増加した発現は、抗癌剤の細胞毒性に対し高レベルの耐性を与えることが見出された（Ｍｏｒｒｏｗら、１９９８）。しかしながら、ＭＲＰおよびＧＳＴの遺伝子産物は抗癌剤の細胞からの除去においてその協同作用により細胞毒性に対して癌細胞を保護するように共同で働くので、ＭＲＰまたはＧＳＴのいずれか単独の発現はあまり好結果ではないことが見出された。
【００６５】
該実施例に示される実験は、上記の化学保護遺伝子の発現を誘導することが知られている分子を送達することによって、毛包細胞においてこれらの保護遺伝子を過剰発現させるという考えで設計された。脱毛症は、シトキサンを投与することにより、７日齢の仔ラットにおいて誘導された（図１）。シトキサン投与の前および投与の間に、非イオン性リポソームを毛包中に侵入させるためのビヒクルとして用いてラットを化学保護分子で処理し、脱毛症の予防における各化学保護剤の効力を決定した。
【００６６】
材料および方法
シトキサン（ＣＴＸ）による脱毛症の誘導
１匹の母親につき１２匹の仔を有する泌乳性スプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットをハーラン・スプレーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）から購入した。ＣＴＸ誘導性脱毛症を生ずるために、数種類の濃度（３５、４０、４５μｇ／ｇ体重）の水中におけるＣＴＸを７日齢の仔に腹腔内注射した。ＣＴＸ処理の７日後、仔を検査して体毛喪失の程度を決定した。仔の背に穏かにブラシをかけて、皮膚に刺さっている固定していない体毛を除去し、写真撮影した。次いで、仔の体毛密度を決定した。１００％の体毛密度は、非処理の対照の仔において見出された密度を示し、一方、０％は全体毛を喪失した仔を示す。４０μｇ／ｇのＣＴＸが７日齢の仔において１００％体毛喪失を誘導するのに十分であったことが観察され、該濃度を次の実験に使用した。
【００６７】
化学保護剤での処理；デリバリーのためのビヒクルとしての非イオン性リポソームの調製
非イオン性リポソーム調製物は、ジラウリン酸グリセリル（ＧＤＬ）、コレステロール、ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル（ＰＯＥ−１０）を５８：１５：２７の重量パーセント比で含有した。脂質混合物は、また、１％α−トコフェロールを含有した。適当な量の脂質を混合し（１００ｍｇ／ｍｌ全脂質）、滅菌ポリスチレンチューブ中７０℃で融解した。脂質混合物を滅菌シリンジ中に引入れた。滅菌ＰＢＳを含有する第２のシリンジを７０℃に予め加熱し、二路活栓を介して脂質相シリンジに連結した。次いで水相をゆっくりと脂質相シリンジ中に注入した。混合物が室温に達するまで、冷たい水道水の流水下で冷却しながら、混合物をすみやかに２つのシリンジ間を行ったり来たり移動させた。最終的な調製物を顕微鏡下で調べて、リポソームの無欠性および質を確認した。使用直前に、リポソームを室温で２分間超音波処理し、等量の適当な溶媒（典型的にはＤＭＳＯ）中における化学保護剤と混合し、室温で４５分間インキュベートした。
【００６８】
下記の化学保護剤を含有するいくつかの非イオン性リポソーム調製物を調製した。
５ｍＭ β−ＮＦ
１０ｍＭ β−ＮＦ
１５ｍＭ β−ＮＦ
５ｍＭ ＣＧ０９
１０ｍＭ ＣＧ０９
１５ｍＭ ＣＧ０９
２０ｍＭ ＣＧ０９
２５ｍＭ ＢＨＡ
５０ｍＭ ＢＨＡ
２５ｍＭ ｔＢＨＱ
５０ｍＭ ｔＢＨＱ
５ｍＭ スルフォラフェン
１０ｍＭ スルフォラフェン
１５ｍＭ オルチプラズ
２０ｍＭ オルチプラズ
【００６９】
実験の２日前から開始して、７日齢の仔ラットの背中の皮膚１平方センチメートルにリポソーム処方をミクロピペットによって塗布した。実験０日目に、動物に４０μｇ／ｇ ＣＴＸを注射した。リポソーム調製物の塗布は実験６日目まで続けた。対照動物は空のリポソームのみを与えられた。実験７日目に、動物にスコアをつけて脱毛の程度を決定した。仔の背中を穏かにこすって固定していない体毛を除去し、写真撮影した。図１は、体毛喪失の予防に対する化学保護分子の影響を示す。
【００７０】
結果：
既知の化学保護化合物のなかでも、β−ＮＦは８０％の保護効果を有し、次いで、ＢＨＡ（６０％）、オルチプラズ（５０％）、ｔＢＨＱ（１０％）およびスルフォラフェン（５％）であった。新たに見出された化合物ＣＧ０９は、〜９７％の最も高い保護レベルを示した（図１、挿入図）。また、体毛の手触りは、非処理の仔ラットのそれに匹敵することがわかった。ＤＭＳＯを担体として用いて化学保護分子を送達させた場合、仔はＣＴＸ処理後に体毛を保持したが、その皮膚はざらざらで鱗状であることが観察された。ミノキシジル担体であるプロピレングリコール：エタノール：水混合物は、これらの化学保護分子の効果的な担体として作用しなかった。ミノキシジルビヒクル中におけるβ−ＮＦまたはＣＧ０９で処理された仔における脱毛症は、非処理のＣＴＸ処理仔ラットと同様の重篤度であった（図２）。
【００７１】
実施例２
皮膚における化学保護遺伝子発現に対する化学保護遺伝子の小型分子誘導剤の影響
β−ＮＦおよびＣＧ０９の保護効果の基礎をなす基本的機構を解明するために、発明者らは、ＧＳＴｓ、ＭＤＲ、ＭＲＰおよびＡＬＤＨ３などの化学保護遺伝子の発現レベルを先の実施例に記載したのと同じ局所処理条件下で研究した。
【００７２】
簡単に言うと、仔ラットをＣＴＸまたはβ−ＮＦのいずれかで処理し、異なる時間間隔をおいて皮膚試料を収集し、全ＲＮＡをそこから抽出した。ＲＮＡを逆転写して、３２Ｐ ｄＡＴＰの存在下、ストレス関連遺伝子に特異的なプライマーを用いて各ｃＤＮＡを生成した。合成された放射能標識ｃＤＮＡを用いて、２０７個のストレス関連遺伝子よりなるラットストレス遺伝子ｃＤＮＡ発現アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコールにしたがってプローブした。ハイブリダイズした膜をホスファーイメージャースクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ｓｃｒｅｅｎ）に曝露し、得られた画像をオリエンテーショングリッドに並べて、発現される遺伝子を同定した。対照、ＣＴＸ処理およびβ−ＮＦ処理動物由来の画像を比較して、もしあれば、これらの実験条件下での化学保護遺伝子の発現パターンにおける変化を決定した。
【００７３】
図３は、β−ＮＦおよびシトキサンで処理した仔ラットにおけるストレス遺伝子の発現パターンを示す。１５ｍＭ β−ＮＦの仔ラットへの５日間の局所投与は、シトキサンで処理した仔ラットと比較した場合、ＧＳＴ−ＰＩ、ＧＳＴ−Ｍｕ２、ＧＳＴ−ＹａおよびＧＳＴ（ヒトのラット相同物）の発現レベルにおいて有意な増加をもたらした。
【００７４】
図６は、ラット皮膚細胞（その大部分は毛包細胞である）におけるその発現が、β−ＮＦ／非イオン性リポソームエマルジョンの仔ラット皮膚への毎日の塗布後１−６日で（β−ＮＦ１−β−ＮＦ６、５日目に安定期に達する）誘導される一連の遺伝子を示す。グラフの注目すべき点は：（１）β−ＮＦまたはＣＧ０９はシトキサン処理の前日に塗布されただけだが、にもかかわらず、実質的な保護効果が達成されたこと；（２）データが、０日目にシトキサンを投与する５日前に局所的頭皮処理を開始し、次いで、シトキサン処理後の数日間、局所処理を続けて、患者の体からシトキサンを一掃させることに関する強い主張を提供すること；（３）発現が誘導される遺伝子のリスト（すなわち、垂直バーの下の名前）が、なぜシトキサンの毒性が毛包細胞においてほとんど除去されるのかを明らかにすることである。これらの遺伝子、いくつかのＧＳＴおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼは、シトキサンおよび他のアルキル化剤を代謝および解毒することが知られている。ｍｄｒ−２遺伝子発現の増加は、動物をアドリアマイシン、シトシンアラビノシドおよび脱毛症を誘導することが知られており、かつ、ｍｄｒ−２膜流出ポンプの基質であることも知られているいる他の薬剤で処理したとき、毛包細胞における耐性または保護表現型が展示されるであろうことを強く示唆する。
【００７５】
図７は、β−ＮＦ処理（単独）の５日目またはシトキサン（単独）の全身投与後５日目に皮膚組織において誘導されるストレス応答遺伝子を示す。全身性シトキサン投与は、皮膚細胞におけるストレス応答遺伝子のサブセットを誘導する。不運にも、シトキサンは取り除かれてから久しく、シトキサン誘導性ストレス応答遺伝子が有意に発現される前にその損傷が起こる。したがって、本発明は、β−ＮＦのようなより穏かなストレス誘導剤を化学療法剤の投与の１−５日前に適用し、その結果、化学療法剤の送達時にこれらの酵素の発現および解毒活性がピークに達するようにする「分子ワクチン処理」技術を利用する。
【００７６】
実施例３
上皮細胞への化学保護遺伝子誘導剤のデリバリーのための担体の同定
皮膚中への化学保護分子の効果的なデリバリーを達成するために、種々の処方のリポソーム（リン脂質を基礎とする小胞、カチオン性リポソーム、非イオン性リポソーム、非イオン性／カチオン性リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム）、ＰＩＮＣポリマー、ならびにプロピレングリコールおよびエタノール混合物（ミノキシジルを投与するために一般に使用されるビヒクル））を用いて研究を行った。まず、これらの処方を用いて、マーカー蛋白質ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼをコードするようなレポーター遺伝子、または蛍光プローブ（ナイル・レッド（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ））を捕獲し、送達されたマーカー蛋白質の機能アッセイによって、またはナイル・レッドの場合、蛍光発光によって、標的組織においてそのデリバリーを追跡した。リポソームは下記のように調製した。
【００７７】
リン脂質を基礎とするビヒクル
調製物は、１：０．５：０．１モル比における下記の脂質混合物を含有した。
１．ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＯＴＡＰ
２．ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＣ
３．ＤＯＰＥ−２０００：コレステロール：ＤＳＰＣ
脂質をクロロホルム中に溶解し、回転蒸発器中５０℃で蒸発させた。乾燥した脂質薄膜を室温で３０分間、ＤＮＡ（β−ｇａｌまたはルシフェラーゼ）または１ｍｇのナイル・レッドを含有するＨＥＰＥＳバッファーで水和した。得られた懸濁液を冷凍および解凍の５サイクルに付した。最終的な懸濁液を０．２２μｍフィルターに７回通過させた。ビヒクルを４℃で保管した。
【００７８】
非イオン性リポソーム
非イオン性リポソーム調製物は、ジラウリル酸グリセリル（ＧＤＬ）、コレステロール、ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル（ＰＯＥ−１０）を５８：１５：２７の重量パーセント比で含有した。脂質混合物は１％α−トコフェロールも含有した。適当な量の脂質を混合し（１００ｍｇ全脂質）、滅菌ポリスチレンチューブ中７０℃で溶融した。脂質混合物を滅菌シリンジ中に引入れた。滅菌ＰＢＳを含有する第２のシリンジを７０℃に予め加熱し、二路活栓を介して脂質相シリンジに連結した。次いで、水相をゆっくりと脂質相シリンジ中に注入した。混合物が室温に達するまで、冷たい水道水の流水下で冷却しながら、混合物をすみやかに２つのシリンジ間を行ったり来たり移動させた。最終的な調製物を顕微鏡下で調べて、リポソームの無欠性および質を確認した。使用直前に、リポソーム調製物を室温で２分間超音波処理し、等量のレポーターＤＮＡ（２５０μｇ）を加え、室温で１時間インキュベートした。
【００７９】
非イオン性／カチオン性リポソーム
非イオン性／カチオン性調製物は、ＧＤＬ、ＰＯＥ−１０、コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，２ジオレイルオキシ−３（トリメチルアンモニオ）プロパン）を１００ｍｇ／ｍｌ調製物中５０：２３：１５：１２の重量パーセント比で含有した。適当な量の脂質を混合し、ポリスチレンチューブ中７０℃で溶融し、７０℃に予め加熱したシリンジ中に引入れた。滅菌ＰＢＳを含有する第２のシリンジを７０℃に予め加熱し、二路活栓を介して脂質相シリンジに連結した。水相をゆっくりと脂質相シリンジ中に注入した。混合物が室温に達するまで、冷たい水道水の流水下で冷却しながら、混合物をすみやかに２つのシリンジ間を行ったり来たり移動させた。使用直前に、リポソーム懸濁液を室温で２分間超音波処理し、等量のＤＮＡ（２５０μｇ）および非イオン性／カチオン性リポソームを混合し、室温で１時間インキュベートした。
【００８０】
ＰＩＮＣ（保護的、相互作用的、および不凝性（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｎｏｎ Ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ））ポリマー
７０％ＰＶＰ、３０％酢酸ビニルおよび２５０μｇプラスミドＤＮＡを０．９％ＮａＣｌ中で混合し、室温で１５分間インキュベートすることによって処方を作成した。
【００８１】
ＰＧ（プロピレングリコール）：エタノール−プラスミドＤＮＡ複合体（ミノキシジルビヒクル）
２５０μｇのプラスミドＤＮＡを６０％ＰＧ、２０％エタノールおよび２０％水と混合し、使用前に室温で１５分間インキュベートした。
レポーター遺伝子の捕獲の効率を決定するために、エチジウムブロマイドを用いるＤＮＡインターカレーション研究を行って、加えられたＤＮＡがリポソーム中に捕獲されたことを確認した。簡単に言うと、１ｍｌのエチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）をＤＮＡを含有するリポソーム調製物のアリコートに加え、ボルテックスミキサーで３秒間混合した。正および負の対照として、ＤＮＡおよびエチジウムブロマイドならびにエチジウムブロマイド単独を用いた。全試料のエチジウムブロマイドに基づく蛍光を蛍光計において発光波長５９５ｎｍでモニターした。
【００８２】
仔ラットにおけるイン・ビボ実験
動物実験は、６日齢のハーラン・スプレーグ・ドーリー仔ラットにおいて行った。ルシフェラーゼ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子または１ｍｇのナイル・レッド（蛍光プローブ）を含有する１００μｌのリポソーム処方を３０分間隔で、１平方センチメートルの背中の皮膚に塗布した。対照の仔は空のリポソームのみを与えられた。２４、４８および７２時間後、仔を殺し、処理した皮膚セクションを切開し、レポーター遺伝子の発現または蛍光プローブのレベルを分析するために用いた。
【００８３】
イン・サイトゥβ−ガラクトシダーゼアッセイ
皮膚セクションの部分をＯＣＴ中に埋め込み、切断し、５μｍ細片として超冷凍スライド上に、氷冷したＰＢＳ中における１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて固定した。固定した組織を室温で２時間、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．０２％ ＮＰ４０を含有するＰＢＳを３回交換して洗浄した。次いで、これらを暗所中３７℃で１６時間、ＰＢＳ中における２ｍｇ／ｍｌ ４−Ｃｌ−５−Ｂｒ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％ＮＰ４０および０．１％デオキシコール酸ナトリウム中で染色した。インキュベーション期間の最後に、スライドをＰＢＳで洗浄し、組織学的研究のためにヘモトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）およびエオシン中で対比染色した。
【００８４】
組織ホモジェネートの調製
切開した皮膚セクションを小片に切断し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを用いて２ｍｌのレポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でホモジナイズした。ホモジェネートを最大速度で１５分間遠心分離し、上清をさらなる分析に用いた。ホモジェネートの蛋白質含量をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）法を用いて測定した。
【００８５】
β−ガラクトシダーゼ活性の定量分析
β−ガラクトシダーゼ活性は、基質（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有する等量の２ｘアッセイバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組織ホモジェネートのアリコートを加えることによって測定した。試料を３７℃で３０分間インキュベートし、その間、β−ガラクトシダーゼ酵素は無色の基質を黄色のｏ−ニトロフェノールに加水分解する。１Ｍ炭酸ナトリウムの添加によって反応を停止し、分光光度計において４２０ｎｍで吸光度を測定した。活性は単位／ｍｇ蛋白質として表した。
【００８６】
ルシフェラーゼ活性の定量分析
ルシフェラーゼ活性を、デュアル・ルシフェラーゼアッセイキット（Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ））を用い、製造者の説明書にしたがって測定した。簡単に言うと、１００μｌの試料に基質を含有する１００μｌのルシフェラーゼアッセイバッファーを加え、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏバッファーの添加直後に、発光された光を照度計で測定した。活性はＲＬＵ／ｍｇ蛋白質として表した。
ナイル・レッド
ナイル・レッドの蛍光発光は、皮膚セクション上、蛍光顕微鏡下で観察された。
【００８７】
結果：
使用したデリバリー系の効率の比較
リポソームデリバリー系の効率を、処理した皮膚セクションにおける発現した生産物β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼに関して、抽出された蛋白質１ｍｇあたりの組織ホモジェネート中におけるこれら２つの酵素の活性を測定することによって比較した。図４は、リポソーム処方で処理されたラットにおける外来性ルシフェラーゼの発現を示す。２５０μｇのルシフェラーゼＤＮＡを入れている非イオン性（ＮＩ）リポソームで処理された仔ラットは、ＮＩ＋ＤＯＴＡＰおよびＰＬ処方に対し、処理の２４時間後に最大の発現（９５０００ＲＬＵ／ｍｇ蛋白質）を示した。興味深いことに、ＰＩＮＣポリマー、ＰＥＧおよびミノキシジル担体系は、上記の系において効率が悪いことが見出された。同様の傾向が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子および蛍光ナイル・レッドのデリバリーにおいて観察された。非イオン性リポソーム処方は、他のデリバリー系と比べたとき、最も効率のよいデリバリー系であることが見出された（図５）。ＰＥＧを基礎とするミノキシジル担体系は単独で、効率の悪い担体系であることが見出されたが、その後の実験は、非イオン性リポソーム処方およびミノキシジル担体の１：１混合物が、ナイル・レッド染料の毛包および表皮細胞へのデリバリーにおいて、非イオン性リポソーム処方単独と同等かまたはそれ以上に効率がよいことを明らかにした。
これらの観察は、Ｎｉｅｍｉｃら（１９９７）によて報告された知見に類似する。彼らは、リポソーム−プラスミドＤＮＡ処方の局所適用後のヒトインターロイキン−１レポーターアンタゴニスト蛋白質の毛包周囲での発現がリン脂質を基礎とするリポソームより非イオン性リポソームで有意に高かったことを報告した。
【００８８】
化学保護分子を毛包中に送達するための好ましい担体物質の組成
非イオン性リポソームが経皮デリバリーに有効なビヒクルとして同定されたので、担体分子として非イオン性リポソームを用いて種々の化学保護分子を送達するための研究を行い、化学療法誘導性脱毛症に対して保護を与えることにおける各化学保護分子の効率をシトキサンで処理した仔ラットにおいて測定した。
非イオン性リポソーム調製物は上記と同様に調製された。使用直前に、適当な溶媒中における等量の化学保護誘導分子（β−ＮＦ、ＢＨＡ、ＣＧ０９、オルチプラズ、スルフォラフェン、およびＢＨＱ）をリポソームと混合し、使用する前に室温で４５分間放置した。
【００８９】
実施例４
化学保護誘導剤の迅速なスクリーニングのためのミクロプレートアッセイ
親電子物質応答エレメント（ＥｐＲＥ）は、癌の化学予防の重要な機構を構成する第ＩＩ相解毒酵素および酸化ストレス蛋白質の誘導発現の媒介となることが明らかにされた。該実施例は、化学保護誘導活性を有する天然または合成化学物質をスクリーンおよび同定するための迅速な細胞に基づく機能的アッセイの開発を記載する。
【００９０】
材料および方法
化学物質および試薬
ＢＨＡおよびｔＢＨＱは、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。ＤＭＳＯ、ｂ−ＮＦ、３−ＭＣおよびＰＤＴＣは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。オルチプラズはＭｃＫｅｓｓｏｎ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手した。スルフォラフェンはＬＫＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）から購入した。合成ＥｐＲＥオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）へ注文した。緑色蛍光蛋白質発現ベクターｐＥＧＦＰは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から購入した。１１００個の小型の手動合成分子を含有するＤＩＶＥＲＳｅｔａ化学ライブラリーの一部は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。
【００９１】
細胞培養
ヒトＨｅｐＧ２肝癌細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手し、０．１％ゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を補足した１０％胎仔ウシ血清を含有する高含量グルコースのＤＭＥＭ中で維持した。細胞を加湿した５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気中３７℃で増殖させた。
【００９２】
ＥｐＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰレポーター遺伝子の構築
４１ｂｐ ＥｐＲＥモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチドをアニールし、精製し、次いで、１２３ｂｐチミジン−キナーゼ（ＴＫ）プロモーターフラグメントを用いるかまたは用いずにｐＥＧＦＰのマルチプルクローニングサイト中に挿入し、各々、ＥｐＲＥ／ＴＫ／ｐＥＧＦＰおよびＴＫ／ｐＥＧＦＰ構築物を作成した。４１ｂｐ ＥｐＲＥをコンカテマー化することによって、複数のＥｐＲＥモチーフコピーをまた、ｐＥＧＦＰ中にサブクローン化した。構築されたプラスミドをＱｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）によって精製し、その配列を制限分析および配列決定によって確認し、それは、プラスミドがＥｐＲＥおよび／またはＴＫをセンス方向で含有したことを示した。
【００９３】
トランスフェクションアッセイ
ＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクションの２４時間前に１０５細胞／６０ｍｍプレート密度で播種した。リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｎｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用い、製造者の説明書にしたがって、細胞を２ｍｇのＥｐＲＥ／ＴＫ／ｐＥＧＦＰまたはＴＫ／ｐＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした。１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）に耐性のクローンを単離した。２−３週間後、顕微鏡を用いてコロニーを拾い、膨張のために２４−ウェルプレートのウェル中に移した。
【００９４】
ＧＦＰの測定およびスクリーニング方法
ＨｅｐＧ２細胞（５ｘ１０４）を黒色の透明底面の組織培養表面９６−ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）のウェル中に播種してバックグラウンド蛍光を最小限にし、次いで２４時間後、既知の化学物質または試験化合物でさらに２４時間処理した。ＤＩＶＥＲＳｅｔ化学ライブラリー化合物は、１００１／４ｇ／ウェルで９６ウェルプレート中の乾燥フィルムとして包装され；シュリンク包装カバーを除去後、それらを直接、ウェルあたり１００１／４ｌのＤＭＳＯ中に溶解し、次いで、化合物溶液の一部をさらに、細胞培養培地を用いて希釈プレート中で希釈した。ＨｅｐＧ２細胞ウェル中における試験化合物の最終濃度は、約５０１／４Ｍであった。試験化合物に使用される平均分子量は３００であった。正の対照としてｂ−ＮＦおよびｔＢＨＱを各々、１０１／４Ｍおよび９０１／４ＭでＨｅｐＧ２プレートのウェルに加えた。ＤＭＳＯを単独で対照培養物に加え、その濃度は決して正対照において０．１％および試験化合物ウェルにおいて１．６％を越えなかった。化合物への曝露の２４時間後、培地を除去し、２００ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌＥｔＢｒを含有するＰＢＳを加えてＨｅｐＧ２細胞を室温で２０分間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、２００ｍｌのＰＢＳをウェルに加えた後、蛍光を測定した。ＧＦＰまたはＥｔＢｒ蛍光の測定は、蛍光ミクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用い、各々、４８５ｎｍ／５３０ｎｍおよび４８５ｎｍ／６１２ｎｍの励起／発光を用いて行った。獲得したデータを直接、直接的データ分析のためにエクセルコンピューターファイルに移した。
【００９５】
結果：
レポーター遺伝子の構築およびトランスフェクション
該スクリーニング系のために構築されたレポーター遺伝子において、ＥｐＲＥ調節エレメントおよびＴＫプロモーターをＧＦＰレポーター遺伝子の前に挿入した。化学予防（ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）薬曝露に起因する刺激に対するレポーター遺伝子の感受性を高めるために、ＥｐＲＥエレメントの増加コピー数を含有する構築物も作成し、１Ｘ、２Ｘおよび４Ｘコピーの４１ｂｐ ＥｐＲＥインサートを含有した（図８）。該スクリーニング系における基本的仮定は、ＥｐＲＥを活性化する化学予防分子に細胞を曝露するとき、遺伝子発現の増加の程度を反映する細胞内ＧＦＰのレベルが試験化合物の誘導能力を反映するということである。該試験系の構築への最終工程において、基底のおよび誘導された安定なＧＦＰ発現を示すトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞クローンを単離し、その後のスクリーニング工程に用いた。
【００９６】
ＨｅｐＧ２細胞におけるＧＦＰの基底および誘導可能レベル
異なるコピー数のＥｐＲＥと共に安定にレポーター遺伝子を運搬したＨｅｐＧ２細胞クローンにおけるＧＦＰの基底および誘導可能な発現レベルを図２に示す。該実験において、発明者らは、ＥｐＲＥ−依存性遺伝子の発現の強力な誘導剤であることが以前に示されていたので（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＆ Ｆａｈｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９４： ５３６１−５３６６， １９９７）、ｔＢＨＱ、ＢＨＡの１次代謝産物の一つを誘導分子として使用した。ｔＢＨＱの代謝的形成は、一般に、ＢＨＡの抗発癌効果の原因となる工程であると考えられる。親のＨｅｐＧ２細胞とＧＦＰレポーター遺伝子を安定に発現した選択されたクローンのいずれかとの間の細胞増殖率において、識別可能な差異はなかった。４ｘＥｐＲＥレポーター遺伝子を有する２４個の独立したクローンにおいて基底のおよび誘導されたＧＦＰレベルを測定後、ＧＦＰの最も高い誘導可能な発現を有するコロニーおよび最も低い基底レベルをその後の化学ライブラリースクリーニングアッセイに用いた。
【００９７】
内部標準としてのＤＮＡ含量
既知の化学予防分子およびライブラリー試験化合物はある濃度で毒性になり、かくして、薬物曝露が２日を超えると、試験プレートの所定のウェル中の細胞増殖を抑制するので、観察されたＧＦＰレベルを各ミクロタイターウェル中の細胞数の何らかのインジケーターに標準化することが望まれた。各ウェルのＤＮＡ含量を測定することが内部細胞標準として採用された。スクリーニングの単純性を維持することを最初の目標として、発明者らは、ＧＦＰ発光波長の重複および細胞ＤＮＡ含量を検出するために用いられる他の利用可能な方法を考慮したとき、ＤＮＡ含量の迅速な定量測定のための挿入分子ＥｔＢｒのＤＮＡ染色能を用いることに決定した。蛍光ミクロプレートリーダーにおいて励起／発光波長を切り換えることによってＥｔＢｒシグナルのみを測定することは、非常に容易であった。相関分析は、ＥｔＢｒ強度と細胞数との間に優秀な相関があることを示した（図１０、ｒ＝０．９）。したがって、各標準および試験化合物のＧＦＰ発現レベルは、各ウェルにおいて見出されたＥｔＢｒ蛍光レベルに標準化されて、細胞あたりの最終ＧＦＰ値を与えた。
【００９８】
ＧＦＰの発現レベルは既知の化学予防分子によって有意に増加する
新規な化学予防分子を同定するために該細胞を基礎とするアッセイを用いることができることを明らかにするために、発明者らは、現在研究されている化学予防分子のうちいくつかを試験して、その検出において該スクリーニング系がどの程度感受性であるかを測定した。第一の工程として、ｔＢＨＱ処理後のＧＦＰ応答の用量および時間依存を決定した（図１１）。９０ｍＭ ｔＢＨＱまたは１０ｍＭ ｂ−ＮＦで２４時間処理したＨｅｐＧ２レポーター細胞に見られる緑色蛍光のレベルを蛍光画像において示す（図５）。８個の異なる分子についてのレポーター遺伝子発現の用量依存誘導を示すプロフィールを図１２に示す。ｂ−ＮＦは二官能性誘導剤であり、それは、第Ｉ相およびＩＩ相薬物代謝遺伝子の調節の研究において幅広く使用されてきた。ＢＨＡ、合成フェノール性抗酸化剤は、食物保存料として幅広く使用されている。ＢＨＡのより多くの用量の食事投与もまた、種々の化学発癌物質に対する保護を与えることが見出され、該効果は、げっ歯動物において多くの第ＩＩ相解毒酵素、例えば、ＧＳＴ、エポキシドヒドロラーゼ、およびＮＱＯ１の誘導に起因した（Ｂｅｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３８（１２）： ４４８６−９５， １９７８； Ｂｅｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ５２１６−２０， １９８０）。ブロッコリーから単離されたスルフォラフェンは、第ＩＩ相解毒酵素の既知の誘導剤であり、ラットにおいて発癌物質に誘導される乳癌を阻害することが見出された（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ，． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： ３１４７−５０， １９９４； Ｆａｈｅｙ ＆ Ｔａｌａｌａｙ， Ｆｏｏｄ ＆ Ｃｈｅｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ３７： ９７３−９， １９９９）。オルチプラズ、置換１，２−ジチオール−３−チオンである抗−住血虫薬分子は、多くのげっ歯動物組織において発癌性物質の有効な阻害剤であり、ヒトおよびげっ歯動物の両方において第ＩＩ相酵素のイン・ビボでの有効な誘導剤である（Ｃｌａｐｐｅｒ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ７８： １７−２７， １９９８）。
【００９９】
化学ライブラリーのスクリーニング
化学予防誘導化合物を同定するためのレポーターアッセイの能力の直接的試験において、発明者らは、記載のラピッドスクリーニングアッセイを用いて化学ライブラリーをスクリーンした。図７は、コンピューター分析によって処理された典型的な３Ｄグラフを示し、典型的なスクリーニングプレート上での試験化合物ならびに正および負の対照各々の誘導能力を示す。ｂ−ＮＦ正対照について見られたよりも１．６倍大きい誘導されたＧＦＰ発現を示すスクリーニングアッセイにおけるヒット（化合物＃０９Ｇ０６）が同定され、図１４に示される。
【０１００】
実施例５
アルキル化化学療法剤の毒性作用から哺乳動物上皮細胞を保護するためにリポソーム中に入れられたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの使用
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、細胞中で二量体として存在し、サブユニット分子量が約２２−３０ｋＤａの範囲であり、細胞膜を横切ることができない。したがって、ＧＳＴの標的細胞への細胞内デリバリーのための機構は、アルキル化剤処理の過程の間中、その保護効果を増強する必要がある。
【０１０１】
リポソームは、薬物、免疫原性蛋白質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび酵素のイン・ビボおよび培養細胞中へのデリバリーに適当な無毒性ビヒクルであることが知られている。該実施例において、発明者らは、大量のＧＳＴを哺乳動物細胞中へ導入するための有効なデリバリー機構としてのリポソームの有用性、および該処理によって与えられるアルキル化化学療法剤の有害な影響からの保護を明らかにする。
【０１０２】
哺乳動物細胞の細胞質中へのＧＳＴの有効なデリバリーの媒介となるカチオン性ｐＨ感受性リポソームの使用を下記する。該研究は、培養哺乳動物上皮細胞、薬物毒性からの保護を細胞に与えることにおけるリポソーム中に入れられた解毒蛋白質の有効性を試験するための適当なモデル系を用いて行われた。
【０１０３】
材料および方法
リポソームの調製
ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオキシルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール（ＤＯＳＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール（ＤＰＳＧ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ）から入手した。ラット肝臓グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入した。
【０１０４】
脂質薄層は、アルゴンガス下、クロロホルム溶液中において脂質を回転蒸発させることによって作成された。大きな多重層小胞は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２−５ｍｇの精製ラット肝臓ＧＳＴまたはＦＩＴＣ−結合型ラット肝臓ＧＳＴ（２００ｎｇ）を含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中において乾燥脂質薄層を水和（ボルテックス混合）することによって調製された。バッファー温度は、リン脂質のゲルから液体−結晶相への移行温度を約１０℃上回った温度で維持された。５０ｍｇ／ｍｌバッファーの脂質濃度が一般に使用された。冷凍および解凍された多重層小胞は、大きな多重層小胞を液体窒素中で上方から冷凍し、水和に使用するのと同じ温度で水浴中で試料を解凍することによって得られた。
【０１０５】
冷凍および解凍された大きな多重層小胞は、高温での押出を可能にする循環性水浴に取りつけられた１０ｍｌ水−ジャケット化バレルを装備したステンレススチール押し出し装置を用いて押し出された（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， ＢＣ）。小胞は、押出前に適温で少なくとも１５分間平衡化された。押出は、８００ｐｓｉまでの窒素圧にて直径１００−４００ｎｍ範囲の孔サイズの２つのポリカーボネートフィルターを通過させて行った。調製物は使用前に押出機により１０回繰り返しサイクルに付された。
得られたリポソームは、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ−１５ｍゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， ＣＡ）カラム（２０ｃｍ長さｘ２ｃｍ直径）上でのゲルろ過によって被包されていないＧＳＴから分離された。リポソームを含有するフラクションをｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５００濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， ＭＡ）上で３０分間スピンすることによって濃縮した。
【０１０６】
リポソームの細胞取り込み
ＣＯＳ−７およびＡＧＳ細胞の単層を、５０ｍｍ培養皿中における高グルコースのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）胎仔ウシ血清中、３７℃で増殖させた。リポソーム曝露前に、細胞単層をＤＭＥＭで２回洗浄した。次いで、細胞をリポソームを含有する培地中において３７℃で種々の時間（０．５−５時間）インキュベートした。細胞単層をＰＢＳ（リン酸緩衝化セーライン）で４回洗浄した。リポソーム中のＦＩＴＣ標識したＧＳＴの細胞による取り込みを定量的に測定するために、細胞単層をＰＢＳで徹底的に洗浄し、培養皿をこすり落とし、１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）中で溶解した。エッペンドルフ遠心機中で１０分間遠心分離後、細胞抽出物の透明になった上清を保持した。次いで、該サイトソル抽出物に関連する蛍光を蛍光分光光度計を用いて測定し、既知量のＦＩＴＣ標識ラット肝臓ＧＳＴで得られた標準曲線に基づいて内在化された単位ＦＩＴＣ−ＧＳＴに換算した。
【０１０７】
ＧＳＴ含有細胞の抗新生物薬への暴露
ＣＯＳ−７またはＡＧＳ細胞を９６ウェルプレート中に播種し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補足した高グルコースのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＨＧ）中で一晩増殖させた。次の日、細胞を血清不含ＤＭＥＭ−ＨＧで洗浄した。ＤＭＥＭ−ＨＧ中のリポソームを細胞単層に加え、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ−ＨＧで単層を洗浄して、遊離のリポソームを除去した。抗新生物薬メルファランを１０％ＦＢＳを所望の濃度で含有するフェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＨＧ中で希釈し、細胞単層に加えた。次いで、マルチウェルプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション期間の完了時、薬物含有培地を除去し、細胞をフェノールレッド不含およびＦＢＳ不含のＤＭＥＭ−ＨＧで洗浄して残留している血清を除去した。細胞増殖は、生存細胞による可溶性黄色染料ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃｌａｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ））の不溶性紫色沈殿物への変換を測定することにとって評価された。ＭＴＴをＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌで溶解し、２０μｍフィルターを通過させて不純物を除去した。ＭＴＴストック溶液をフェノールレッド不含ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ−ＨＧ中に１：４希釈し、２００μｌの該希釈液をプレートの各ウェルに加えた。プレートは暗所中３７℃で４時間インキュベートし、次いで、吸い取ってＭＴＴ溶液を除去した。変換した染料を２００μｌの酸性イソプロパノール（５００ｍｌイソプロパノール中における１．６ｍｌ濃ＨＣｌ）のプレートの各ウェルへの添加によって可溶化した。変換した染料の吸光度を、６９０ｎｍでバックグラウンドを引き算して５７０ｎｍ波長で測定した。
【０１０８】
結果
リポソーム中に入れられた解毒蛋白質の細胞へのデリバリー
解毒蛋白質の細胞へのデリバリーの効率をサイトソル中に見出された標識蛋白質の蛍光を定量することによって評価した。細胞は、ＰＣリポソームを用いた場合、リポソームを用いなかった場合よりも約６０−１７５％多くの蛍光標識した蛋白質を受け取った。カチオン性リポソーム（ＰＣ＋ＤＯＴＡＰ）によるデリバリーは、ＰＣリポソームによるデリバリーと比較して約６から８倍の蛍光増加をもたらした。
【０１０９】
リポソーム中に入れられた解毒蛋白質への曝露による細胞の保護
ＣＳＯ細胞のリポソーム中に入れられたＧＳＴとのインキュベーションおよびその後のメルファラン、アルキル化抗新生物剤での処理は、細胞に保護を与えた。高ＭＴＴ吸光度は細胞死の低い割合に相関する。リポソーム中に入れられたＧＳＴで処理されなかった細胞は、リポソーム中に入れられたＧＳＴで前処理された細胞の約２から２５倍低いＭＴＴ吸光度を有した。
【０１１０】
これらの結果は、抗新生物剤への曝露前のＧＳＴ含有リポソームでの上皮細胞の前処理が、これらの薬剤の細胞毒性作用に対して細胞を保護することを明らかにする。ＧＳＴを単独で用いる細胞の保護における成功を考慮して、さらに、ＧＳＴの活性率を増加させるために基質の付加的な供給を提供することによって、ＧＳＴおよびグルタチオンの両方を含むリポソームが、アルキル化化学療法剤の毒性作用から細胞を保護することにおいてよりいっそう有効であることが予測される。
【０１１１】
実施例６
胃腸上皮を標的とするためのリポソームの修飾
消化管の設定において、上皮細胞表面へのリポソームの付着を可能にするための付加的な手段の組み込みは、リポソーム内容物のこれらの細胞へのデリバリーを容易にしたであろう。胃および小腸上部の内面を覆う管腔上皮細胞に関するリポソームの特異性を増加するために、コレラ毒Ｂ（ＣＴＢ）サブユニットをリポソームの表面に共有結合させてもよい。リポソーム表面に結合したＣＴＢサブユニットを有するリポソームは、Ｍ１ガングリオシド受容体分子をその表面に発現する細胞に特異的に結合する。通常、該細胞表面分子を発現する細胞は、胃および小腸上部の内面を覆う管腔上皮細胞を包含する。これは、コレラ細菌細胞が自然感染においてこれらの細胞に結合するという手段である。コレラ毒のＢサブユニットは、Ｍ１ガングリオシド受容体結合を与えるが、Ａサブユニットの不在下では毒性を与えない。
【０１１２】
材料および方法
コレラ毒Ｂサブユニットへの抱合のためのリポソーム調製物
精製ラット肝臓ＧＳＴおよび微量ＦＩＴＣ結合型ラット肝臓ＧＳＴを含有するリポソームを、脂質：ホスファチジルコリン（ＰＣ）：ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［４］−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（Ｎ−ＭＢＰ−ＰＥ）、７０：２０：１０モル％の混合物を用いて、実施例１に記載の標準的な押出プロトコールによって調製および精製した。
【０１１３】
リポソームへの架橋のためのコレラ毒Ｂサブユニット（ＣＴＢ）の化学修飾
第一アミン反応試薬を用いてチオール基をＣＴＢのリジン残基に付加した。チオール基は、Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ含有リポソーム上のマレイミド基との反応に必要であった。これを達成するために、ＣＴＢ（１００μｇ）をＨＥＰＥＳ−セーラインバッファー中に溶解し、暗所中、室温にて１時間、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＦ）と一緒に１：１００モル比でインキュベートした。１０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中における２０ｍＭ Ｌ−リジンを加えることによって反応をクエンチし、次いで、反応産物を５μｌの水中における７．７ｍｇ／ｍｌジチオトレイトールを加えることによって還元した。反応混合物をサイズ排除Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを通過させることにより、反応しなかった基質を除去した。排除したフラクション中における活性化ＣＴＢの濃度をクーマシー蛋白質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）によって測定した。
【０１１４】
活性化ＣＴＢのリポソームへの架橋
ＧＳＴおよび微量ＦＩＴＣ結合型ＧＳＴを含有するリポソームへの活性化ＣＴＢの抱合は、還元したＣＴＢ（５０μｇ）を１ｍＬ Ｎ−ＭＢＰ−ＰＥ含有リポソームの懸濁液と一緒に５℃で一晩インキュベートすることによって行った。１０μｌのＬ−システインバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．２中における２０ｍＭ Ｌ−システイン）を加えることによってカップリング反応を止めた。ＣＴＢ抱合型リポソームをＨＥＰＥＳ−セーラインバッファーで予め平衡化したサイズ排除ゲルろ過カラム（Ｂｉｏｇｅｌ−Ａ−１５ｍゲル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＣＡ； １５ｃｍ長さｘ２ｃｍ直径）上で非抱合型ＣＴＢから精製した。リポソームを０．５ｍｌフラクション中において溶出し、各フラクションのリポソーム含量を蛍光およびＧＳＴ活性によって測定した。リポソーム含有フラクションをプールし（フラクション番号５−９）、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ５００濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて１０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって１ｍｌに濃縮した。
【０１１５】
ＣＴＢリポソームの細胞取り込み
細胞（６ｘ１０６ＨｕＴｕまたはＣＯＳ細胞）を６０ｍｍ皿に播種し、１０％ＣＯ２の加湿雰囲気中、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）を補足した高グルコースのＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ ｗ／ＨＧ）中において一晩、増殖させた。次いで、単層を５ｍｌのＤＭＥＭ ｗ／ＨＧ＋ＨＥＰＥＳセーライン（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。ＣＴＢ抱合型リポソームのＧＭ１ガングリオシド受容体を有する細胞へ特異的に結合できる能力を試験するために、いくつかの皿をＧＭ１ガングリオシド受容体の市販の試料（２０μｇ）で１０分間前処理した。ＣＴＢ抱合型リポソームの１００μｌ試料（ＦＩＴＣ結合型ＧＳＴの５０００蛍光単位を含有する）を５ｍｌ ＤＭＥＭ ｗ／ＨＧ＋ＨＥＰＥＳセーラインバッファーと一緒に各単層に加え、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、細胞単層を５ｍｌ ＰＢＳで４回洗浄して、結合しなかったＣＴＢ抱合型リポソームを除去した。細胞に結合した／内在化したＣＴＢ抱合型リポソームの量は、まず、細胞を培養皿からこすり落とし、０．３ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、３０秒間超音波処理することによって定量した。各細胞溶解物の２０μｌアリコートを２ｍｌのＰＢＳに加え、細胞に関連する蛍光の量を蛍光計において測定した（励起／発光最大４９４／５２０ｎｍ）。細胞溶解物中における蛋白質の濃度は、クーマシー蛋白質推定キットを用いて決定された。
【０１１６】
結果：
リポソーム表面に結合したＣＴＢサブユニットを有するリポソームの使用は、腎臓細管上皮細胞（ＣＯＳ細胞）へではなく、胃腸癌細胞（ＨｕＴｕ細胞）への標識蛋白質のデリバリーの増加をもたらした。ＣＴＢサブユニットによって与えられた効率の増加は、過剰の遊離Ｍ１ガングリオシド受容体の存在下でクエンチされた。これらの結果は、リポソームがＣＴＢサブユニットのその表面への組み込みによって、胃腸上皮の細胞を標的とするように有効に修飾されることを明らかにする。
【０１１７】
実施例７
化学療法誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおける化学保護誘導剤のさらなる試験
該実施例に示される実験は、化学療法誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおいて種々の化学保護誘導剤の効力を試験するために設計された。
【０１１８】
材料および方法
仔ラットを有する泌乳性スプレーグ・ドーリー母ラットをＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）から購入した。全ての化学保護誘導化合物はＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。それらを、もともとＨｕｓｓｅｉｎ Ａ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ： ２４９， １５６４ （１９９０）によって記載された、実施例１に記載の化学療法誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおいて試験した。シトキサン（ＣＴＸ）によって誘導される脱毛症を生ずるために、７ないし１０日齢の仔ラットにリン酸緩衝化セーライン中で調製された３５ｍｇ／ｍｌのＣＴＸを腹腔内注射した。化学保護誘導剤は、１００％エタノールよりなるデリバリービヒクル中で調製した。エタノール中における化学保護剤の５０−１５０μｌを仔の背中に１日１回、ＣＴＸ攻撃の前後に局所投与した。特に、仔は、ＣＴＸ攻撃前の５日間、ＣＴＸ攻撃日の数時間前、およびその後５日間、毎日１回処理された。デリバリービヒクル対照の仔は、エタノールのみを与えられた。ＣＴＸ処理の約７ないし１０日後、仔を脱毛症の存在について評価した。体毛喪失は、Ｃｈｅｎ Ｇ．ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ： ７５， ３０３ （１９９８）によって記載された修飾脱毛症スコアリング指標を用いて評価された。スコア０＝体毛喪失なし；スコア１＝１０−３０％体毛喪失；スコア２＝４０−６０％体毛喪失；スコア３＝７０−９０％体毛喪失；およびスコア４＝１００％体毛喪失。
【０１１９】
結果
第ＩおよびＩＩ相解毒分子のいくつかの誘導剤は、仔ラットにおけるＣＴＸ誘導性脱毛症モデルにおいて体毛喪失の予防に有効であることが見出された。化学療法誘導性仔ラットモデルにおいて異なる誘導化学保護剤を用いる結果を下記の表に示す。表１は、１０ｍＭの単一濃度で投与された化学保護誘導剤の結果を示す。わかるように、該濃度にて、いくつかの化合物は他よりも大きな効力を示した。しかしながら、投与量または担体ビヒクルの改変の効果は、これらの実験において試験されなかった。これらのパラメーターのいずれかにおける変化は、エタノール中１０ｍＭにて送達されたあまり有効ではない薬剤の効力に影響を及ぼすことができた。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
表２における結果は、レスベラトロールおよびリモネンのような、細胞増殖の阻害のような他の生物学的効果を誘導することができるある特定の第ＩＩ相誘導剤もまた、脱毛症モデルにおける体毛喪失の保護において非常に有効であったことを示す。表３の結果は、異なる濃度のレスベラトロールを用いるときの動物モデルにおける用量応答を明らかにする。５０ｍＭの局所的レスベラトロール用量は、ＣＴＸ攻撃後の仔ラットにおける脱毛症の予防に非常に有効であった。投与量が低ければ低いほど、脱毛症の予防に対する効力が減少することが見出された。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
実施例８
第Ｉ−ＩＩ相化学保護誘導剤での処理は化学療法誘導性脱毛症モデルにおいて異なる化学療法剤に対して有効である
β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）は、異なる化学療法剤を用いる脱毛症仔ラットモデルにおける体毛喪失の予防に有効であることが見出された。結果を表４に示す。仔は、シトキサン（３５ｍｇ／ｋｇ）またはシタラビン（１５ｍｇ／ｋｇ）またはドクソルビシン（２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの単一投与量を６日間、１日１回投与で与えられた。仔は１日１回局所的に、実施例１に記載のように調製された非イオン性リポソームビヒクル中における１０ｍＭのβ−ＮＦで処理された。非処理の仔を対照とした。シタラビンおよびドクソルビシン処理の仔の場合、β−ＮＦ処理を化学療法処理期間の間中、行った。シトキサン処理の仔の場合、β−ＮＦをシトキサン処理前の２日間および処理後の６日間投与した。β−ＮＦ処理の終了後の２日間、Ｃｈｅｎらによって記載されたスケールを用いて脱毛症の程度をスコア付した。β−ＮＦは、３つ（シトキサン、シタラビンおよびドクソルビシン）の化学療法の全てに対して仔ラットにおける体毛喪失を有効に予防することが見出された。非処理の仔は全て、重篤な体毛喪失を生じ、全て、脱毛症スコアは４であった（１００％体毛喪失）。全体的に、結果は、β−ＮＦのような単一の化学保護剤が異なる作用様式を有する複数の化学療法剤に対して有効でありうることを示す。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
実施例９
放射線誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおける化学保護誘導剤処理
化学保護誘導剤処理が放射線誘導性脱毛症を有効に予防できたかどうかを決定するために、β−ＮＦで局所処理した仔ラットを次いで、脱毛症を誘導するレベルで全身放射線に曝露した。Ｍａｒｋ Ｉ、Ｍｏｄｅｌ ３０、Ｃｓ１３７イラジエーター（Ｊ．Ｌ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いてスプレーグ・ドーリー仔ラットを照射した。２、５および７．５Ｇｙ（１グレイ（Ｇｙ）＝１００ｍｒｅｍ）での最初の全身放射線線量応答研究は、７．５Ｇｙの線量が照射された仔の背中に脱毛症を有効に引き起こしたことを示した。仔は、７．５Ｇｙでの放射能攻撃の前に、非イオン性リポソームデリバリービヒクル中における１０ｍＭ β−ＮＦで６日間、１日１回局所的に処理された。非処理の仔を対照とした。照射の７日後に、仔における脱毛症の程度をＣｈｅｎらによって記載されたスコアリングスケールを用いて評価した。結果を表５に示す。β−ナフトフラボンは、仔ラットにおいて放射線誘導性脱毛症の予防に有効であることが見出された。７．５Ｇｙに曝露された非処理の子の背中は、７日後に完全に禿げた。対照的に、β−ＮＦでの処理は、仔における重篤な体毛喪失を予防した。これらの結果は、局所的化学保護剤が放射線誘導性脱毛症を有効に予防できることを示す。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】
本発明は、上記に記載および例示された具体例に限定されないが、付随の特許請求の範囲の範囲から逸脱することのない変更および修飾が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】シトキサンで処理した仔ラットにおける体毛喪失に対する化学保護誘導剤の効果。化学保護剤は、脂質小滴懸濁またはＤＭＳＯ中においてデリバリー用に調製された（実施例１）。上方挿入図：実験プロトコール（実施例１）；下方挿入図：異なる化学保護誘導剤で前処理したシトキサン処理仔ラットにおける体毛密度を示すヒストグラム；写真（左から右へ、上方から下方へ）：対照（シトキサンまたは化学保護誘導剤で処理されない）；シトキサン処理した；シトキサン処理し、かつ、（１）β−ＮＦで前処理した（３つのパネル）、（２）オルチプラズで前処理した（２つのパネル）、（３）ＢＨＡで前処理した（１つのパネル）、（４）ｔＢＨＱで前処理した（１つのパネル）、（５）スルフォラフェンで前処理した（１つのパネル）および（６）ＣＧ０９で前処理した（２つのパネル）。
【図２】シトキサンで処理した仔ラットにおける体毛喪失に対する化学保護誘導剤の効果。化学保護誘導剤は、ミノキシジルのデリバリーに用いられた型のプロピレングリコール：エタノール：水混合物中においてデリバリー用に調製された（実施例１）。結果は、ミノキシジル担体が化学保護誘導剤のデリバリーにおいて効果的でなかったことを示す。ミノキシジル担体中のＣＧ０９またはβ−ＮＦで処理した仔ラットは、化学保護誘導剤で前処理されなかったシトキサン処理動物において観察されたのと同等の体毛喪失を被った。
【図３】β−ＮＦおよびシトキサンで処理した仔ラットにおけるストレス遺伝子の遺伝子発現パターン。仔ラットは、担体のみ（対照）、シトキサン、またはβ−ＮＦのいずれかで処理された。異なる時間間隔にて、試料を収集し、ｃＤＮＡ試料を試料から抽出したｍＲＮＡから調製した。合成された放射能標識ｃＤＮＡを用いて、製造者のプロトコールにしたがい、２０７個のストレス関連遺伝子よりなるラットストレス遺伝子ｃＤＮＡ発現アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプローブした。
【図４】２つのリポソーム処方で処理したラットにおける外来性ルシフェラーゼの発現を示すヒストグラム。非イオン性（ＮＩ）リポソームまたはＮＩ＋ＤＯＴＡＰを２５０μｇルシフェラーゼＤＮＡおよび２５０μｇβ−ガラクトシダーゼＤＮＡを包むように処方した。ルシフェラーゼ活性をリポソーム処方の投与後０、４、８、１６および２４時間で測定した。
【図５】異なるリポソーム処方で処理したラットにおける外来性β−ガラクトシダーゼ活性の発現を示すヒストグラム（実施例２）。リポソームまたは他の担体を２５０μｇルシフェラーゼＤＮＡおよび２５０μｇβ−ガラクトシダーゼＤＮＡを包むように処方した。ルシフェラーゼ活性を該処方の投与後０、４、８、１６および２４時間で測定した。
【図６】ラットの皮膚細胞における発現が毎日のβ−ＮＦ／非イオン性リポソームエマルジョンの皮膚への塗布後１−６（β−ＮＦ１−β−ＮＦ６）日で誘導される、ラットにおける一連の遺伝子の発現を示すヒストグラム。バーは、左から右へ、対照およびβ−ＮＦ１−β−ＮＦ６を示す。
【図７】ラットの皮膚細胞における発現が毎日のβ−ＮＦ／非イオン性リポソームエマルジョンの皮膚への塗布後５日で誘導される、ラットにおける一連の遺伝子の発現を示すヒストグラム。１回のシトキサンの腹腔内注射後の遺伝子発現と比較する。左から右へ、対照、シトキサン、βＮＦ。
【図８】ＧＦＰレポータープラスミドの構築。単一またはコンカテマー化した４１ｂｐ ＥｐＲＥモチーフおよび／またはＴＫプロモーターフラグメントを含有するフラグメントをＧＦＰベクター中のマルチプルクローニングサイト中に挿入した。
【図９】示されるＧＦＰレポーター遺伝子を安定に有するＨｅｐＧ２細胞クローンにおけるＧＦＰ発現の基底および誘導レベル。細胞を９０ｍＭ ｔＢＨＱで２４時間、または対照としてＤＭＳＯ（０．１％最終濃度）で処理した。細胞は下記の発現遺伝子を有したた：ＴＫ−ＧＦＰ、１ｘＥｐＲＥ／ＴＫ−ＧＦＰ、２ｘＥｐＲＥ／ＴＫ−ＧＦＰ、４ｘＥｐＲＥ／ＴＫ−ＧＦＰ。ＧＦＰ発現レベルは、蛍光プレートリーダーを用いて測定された。値は平均±Ｓ．Ｄ．として示される。
【図１０】播種された細胞数とＥｔＢｒまたはＧＦＰ蛍光に基づくウェル中のＤＮＡ含量との間の相関。ウェルあたりの蛍光強度を実施例４に記載のように測定した。値は３つの測定値の平均±Ｓ．Ｄ．として示される。
【図１１】ｔＢＨＱ処理したＨｅｐＧ２細胞中でのＧＦＰ発現の時間および用量依存。組み込まれた４ｘＥｐＲＥ／ＴＫレポーター構築物を有する細胞を（Ａ）９０ｍＭ ｔＢＨＱで所定の時間、または（Ｂ）所定のｔＢＨＱ濃度で２４時間処理した。ＧＦＰ発現レベルは、蛍光プレートリーダーを用いて測定された。値は３つの測定値の平均±Ｓ．Ｄ．として示される。
【図１２】既知の化学予防誘導分子によるＧＦＰ発現の用量依存性誘導。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルミクロタイタープレート（５ｘ１０４細胞／ウェル）中に２４時間播種し、次いで、材料および方法に記載のように、所定の化学物質で処理した。データは３つの平行培養の平均±ＳＤとして示される。相対蛍光強度率を対照皿を１として算出した。
【図１３】試験プレートから得られ、正の対照（ｔＢＨＱ、レーン１およびｂ−ＮＦ、レーン１２）および各試験化合物の誘導レベルを示すためにコンピューターによって分析された蛍光データを示すスクリーニング試験由来の典型的な３Ｄグラフ。化合物ＣＧ０９をレーン６に示す。
【図１４】既知の誘導剤および化学ライブラリースクリーニング由来のヒット化合物（０９Ｇ０６）の両方から誘導されたＧＦＰ発現のレベル。データは３つの測定値の平均±ＳＤとして示される。
【図１５】化学保護誘導活性を展示するＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリー由来のある特定の分子の構造。化合物ＣＧ０９は構造１である。
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）にしたがって、合衆国政府は、一部、国立衛生研究所からの基金（交付番号ＣＡ２２４８４）によってなされた本明細書に記載の発明において、ある特定の権利を有することが認められる。
本出願は、２０００年５月５日に出願された米国出願第０９／５６５７１４号を優先権主張し、その全てが出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は癌治療の分野に関する。特に、本発明は、放射線療法および癌の化学療法剤の毒性作用から非新生物細胞を保護するための新規な組成物および方法を提供する。
【０００３】
（背景技術）
本発明が属する分野の現状をより詳しく説明するために、いくつかの出版物が本出願において引用される。これらの出版物の各々における開示は、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００４】
過去数十年にわたり、外科手術と組み合わせた化学療法および放射線療法が癌死亡率の著しい減少に寄与してきた。しかしながら、癌の治療における化学療法薬の潜在的な有用性は、これらの薬剤の非特異的細胞毒性に関連した不都合な効果のために十分に活用されていない。単独または他の化学療法剤と組み合わせて使用されるアルキル化剤は、全ての化学療法処理のうち約半分において使用される。アルキル化剤は、ＤＮＡ複製を阻害することによって癌性細胞の増殖を妨害する。アルキル化剤以外の癌化学療法薬もまた、哺乳動物細胞に対して毒性である。それらは、２つだけ挙げるとすれば、（１）ＤＮＡ複製に必要なヌクレオチドの合成および（２）有糸分裂に必要な微小管機能などの複製中の細胞内の複数の部位を阻害することができる。細胞内で酸素ラジカルを生じることによってその細胞致死特性のほとんどを達成する放射線療法もまた、哺乳動物細胞を効率よく殺すことができる。これら３つの一般に使用される薬剤の毒性作用は、一般的に、癌細胞に特異的ではないので、それらは正常細胞、特に有糸分裂が活発な正常細胞の増殖にも影響を及ぼす。結果として、これらの癌治療の１以上で治療されている患者は一般に、非常に多くの臨床上の合併症を発現する。
【０００５】
上皮細胞の多くの集団は、早い代謝回転速度を有する。上皮細胞に対する癌治療の毒性は、化学療法または放射線療法を受けている患者が一般に被る副作用の多くの原因である。これらは、胃腸の不快感（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）、悪心、嘔吐、下痢、食欲喪失、毛髪喪失、骨髄抑制および照射部位の皮膚発疹または潰瘍化を包含する。これらの合併症に耐えることは非常に困難であり、患者が該問題を避けるために癌治療処理を見合わせたり、または中止することは稀なことではない。胃腸の障害は、患者の闘病能力を最も効果的にするために必要な食物を得ることを困難にするので、患者の回復のチャンスを傷つけるかもしれない。
【０００６】
典型的には、化学療法の過程の間中、毒性を最小限にし、正常な薬物感受性細胞を保護するために、化学療法剤は最適量より少ない投与量で投与される。正常細胞の化学療法剤に対する感受性を減らすことは、より多くの薬物投与量の投与を可能にし、化学療法をより効果的にすることができる。
放射能療法または化学療法剤の存在下で正常細胞の通常の成長および増殖を促進する保護療法の好結果の手段は、より高投与量の攻撃的な化学療法の使用を可能にするであろう。かかる療法の発展のための２つの重要な標的は、（１）口腔粘膜を包含する胃腸（ＧＩ）管全体の内面を覆う上皮細胞、および（２）毛包および表皮を包含する皮膚の上皮である。
【０００７】
ＧＩ管腔細胞の化学療法および放射線療法に関連する死および脱落は、ＧＩ損傷関連分子の脈管構造中への放出をもたらすようである。これらの血液に運搬される分子は、脳内の部位によって検出される場合、化学療法を受けている患者において非常に一般的である悪心応答を引き起こす。オンダンセトロン（Ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）のような薬物での現在の治療は、これらの脳中枢を抑制し、それにより悪心応答を減少させるように働く。しかしながら、ＧＩ内面の最初の崩壊が今だ、化学療法の最も有効な使用を制限している。これらの患者において悪心を減少させるためのより良好な機構は、ＧＩ表面の最初の崩壊を排除することであり、それにより、脳において損傷に関連した悪心誘導性分子の効果を抑制するというよりもむしろ、これらの分子の放出を防ぐことである。
【０００８】
正常細胞に対し何らかの保護を提供し、これらの細胞により作られる組織の無欠性および機能を維持する新規な胃腸療法が開発されている。正常細胞を保護し、正常細胞の増殖を刺激するための現行のアプローチは、栄養分刺激および増殖因子の摂取を最大化することを含む。かかる方法は、毒性の重篤度を減少し、および／または薬物処理の過程を短縮した。しかしながら、これらの改善点にもかかわらず、深刻な副作用が今だ存続し、より有効な療法が所望される。
【０００９】
化学療法に誘導される脱毛症の治療も研究されている。脱毛症または毛髪喪失は、ヒトにおける最も一般的な毛髪成長障害であり、しばしば、冒された個体において大きな心配事である。癌の化学療法また放射線療法に付随した後天的脱毛症に罹患した患者において、毛髪の喪失は重要な心配事として嘔吐の上位にくる。該状態は一般的に可逆性であり、毛髪成長の再生は治療の中止後１−２ヶ月以内に起こるが、毛髪喪失は、身体イメージにおける負の変化、社会的活動の減少および対人関係の変化を引き起こす可能性のある、さらなる化学療法の拒絶を導きかねない心理学的苦悩を与えるような影響を示す。
【００１０】
化学療法誘導性脱毛の現象は、毛包に対する細胞毒性およびアポトーシスに関連する損傷に起因すると考えられる。いくつかの研究は、化学療法誘導性毛包損傷の根底にある病理生物学的機構が皮膚乳頭の隆起、毛包管のよじれおよび膨大、およびメラニン生成装置の崩壊によって特徴付けられるという証拠を示した。
【００１１】
化学療法誘導性脱毛症から患者を保護する試みにおいて、種々のアプローチが行われた。これらは、頭皮の血流および毛包との薬物接触時間を一時的に減少させる物理的モジュールを包含したが、患者の耐性は非常に乏しかった。これらの不十分な結果は、毛包の幹細胞の代謝速度と毛包マトリックスへの血流の両方を減少させる頭皮冷却法の開発を導いたが、該戦略は失敗であることがわかった。フリーラジカルスカベンジャーであるα−トコフェロールの食事での使用は、ウサギにおいて保護効果を有することを示したが、ヒトでは示さなかった。ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）２％溶液もまた、化学療法誘導性脱毛症の治療において効果的ではないことが見出された。増殖因子およびサイトカインでのげっ歯動物の前処理は、ＡＲＡ−Ｃ（シトシンアラビノシド）によって誘導された脱毛症に対してある程度の保護を提供したが、一般に使用される癌治療薬シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）では提供しなかった。
【００１２】
非経口投与されたか、またはリポソーム中において局所的に塗布されたＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはＮＡＣ／Ｉｍｍｕ Ｖｅｒｔによるシクロホスファミドまたはシクロホスファミド／シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）誘導性脱毛症の逆転は、ラットモデル系において報告された（Ｊｉｍｅｎｅｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １０： ２７１−２７６， １９９２）。ＮＡＣはグルタチオンの前駆体であり、それ自体、細胞内ＧＳＨレベルを増加させることによって解毒剤として機能すると考えられる。この種の治療は、外来性ＮＡＣを添加することによって細胞内ＧＳＨレベルが細胞中およそ２倍にだけなることができることが示されたので、効力が制限される（Ｈｏ ＆ Ｆａｈｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９， １１２３１−１１２３５， １９８４； Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ５： １４３−１４８， １９８４参照）。
【００１３】
米国特許第５７５３２６３号（Ｌｉｓｈｋｏら）は、ある種の化学療法剤によって誘導される脱毛症を治療するための方法および組成物を開示し、それは、リポソーム担体中における有効量のｐ−糖蛋白、またはかかる蛋白をコードしているＭＤＲ遺伝子の局所的適用を特徴とする。該療法は、ｐ−糖蛋白ポンプを介して細胞から運び出されることのできる特定の化学療法剤に限定される。該リストから著しく外れるものは、アルキル化化学療法剤である。
【００１４】
したがって、上記に概説した型の治療は、化学療法誘導性毛髪喪失から何らかの軽減を提供するが、それらの有用性は制限され、さらなる効果的な療法が要望される。
【００１５】
（発明の開示）
本発明によると、癌を治療するための放射線療法または化学療法の過程の間、迅速に分裂している正常細胞を損傷から保護するための新規で有効な戦略が見出された。該戦略は、放射線または化学療法を適用したとき、細胞中に存在する天然の解毒系が活性化されるようにそれらを刺激することを基礎とし、それにより、細胞を損傷から保護することができる。
【００１６】
本発明の一の態様によると、癌の化学療法または放射線療法の間、非新生物細胞を損傷から保護するための組成物が提供される。該組成物は、下記に定義されるような１以上の化学保護誘導剤および該薬剤を非新生物細胞の標的集団に送達するためのデリバリービヒクルを含む。一の好ましい具体例において、標的細胞集団は、毛包内面を覆うかまたは皮膚表皮を含む上皮細胞よりなる。もう一つ別の好ましい具体例において、標的細胞集団は口腔粘膜および胃腸管腔の上皮細胞よりなる。
【００１７】
本発明のもう一つ別の態様によると、癌の化学療法または放射線療法の間、非新生物細胞を損傷から保護するための方法が提供される。該方法は、上皮細胞の集団に上記の組成物を、癌の化学療法または放射線療法の間、非新生物細胞を損傷から保護するのに十分な時間および量で投与することを特徴とする。好ましい具体例において、該方法は、頭皮に該組成物を塗布することによって、癌治療の間の禿頭を予防するために使用される。もう一つ別の好ましい具体例において、該方法は、該組成物を経口投与することによって、癌治療に起因する胃腸の不快感を予防するために使用される。またもう一つ別の好ましい具体例において、該方法は、該組成物を皮膚に塗布することによって、照射部位での皮膚発疹および潰瘍化を予防するために使用される。
【００１８】
本発明の上記態様の好ましい具体例において、化学療法剤は、アルカリ化剤、ＤＮＡ合成の代謝拮抗物質阻害剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂紡錘体毒およびビンカアルカロイドよりなる群から選択される一つまたは組み合わせである。限定するものではないが、例えば、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、アウパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シクロホスファミド（シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ））、シタラビン、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドクソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、フロックスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）ホスフェート、フルオロウラシル、ヒドロキシウリア、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ナイトロジェン・マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、プリアマイシン（ｐｌｉａｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、チオグアニン、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、ビンブラスチンおよびビンクリスチンが挙げられる。放射線療法は、Ｘ線、γ線、電子ビーム、光子、α−粒子および中性子よりなる群から選択される。
【００１９】
好ましい具体例において、化学保護誘導剤は、第Ｉ相およびＩＩ相薬物代謝酵素を誘導するものである。かかる薬剤は、当該分野で既知であり（例えば、Ｈａｙｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ． ６４， １４１−１６８， ２０００）、クマリン、ラクトン、ジテルペン、ジチオレチオンフラボン、インドール、イソチオシアネート、オルガノスルフィドおよびフェノールのようなクラスの化合物を包含する。特定の例は、限定するものではないが、３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール、２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，４−ジメトキシベンゼン、２−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、４−ヒドロキシアニソール、エトキシクイン（ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ）、α−アンジェリカラクトン、β−ナフトフラボン（ｎａｐｔｈｏｆｌａｖｏｎｅ）（β−ＮＦ）、ｐ−メトキシフェノール、オルチプラズ、インドール−３−カルビノール、オメプラゾール、クマリン、カフェストール、カーウェオール（ｋａｈｗｅｏｌ）、ケルセチン、インドール−３−アセトニトリル、アリルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、オイゲノール、フェネチルイソチオシアネート、スルフォラフェン（ｓｕｌｐｈｏｒａｐｈａｎｅ）、アリルメチルジスルフィド、ジアリルスルフィド、ブチルヒドロキシトルエン、エラグ酸およびフェルラ酸を包含する。
【００２０】
もう一つ別の具体例において、化学保護誘導剤は、抗−増殖機能のような第二の機能を有していてもよい。該性質の化合物は、限定するものではないが、３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））および（Ｒ）−（＋）−リモネンを包含する。
【００２１】
本発明のもう一つ別の態様によると、下記に定義されるように、化学保護誘導剤を同定するためのアッセイが提供される。該アッセイは、（ａ）プロモーターおよび１以上のＥｐＲＥ調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物で形質転換された細胞を提供し、（ｂ）化学保護誘導剤としての可能な有用性についてスクリーンされるべき試験化合物に該細胞を曝露し、次いで（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、ここに、試験化合物の不在下での発現と比較した試験化合物の存在下での発現の増加は、該試験化合物が化学保護誘導剤であることを示す工程を含む。また、本発明の該態様にしたがって、該アッセイの実行を容易にするためのキットも提供される。
【００２２】
本発明のもう一つ別の態様によると、環境性発癌物質への細胞の曝露によって引き起こされる癌の予防方法が提供される。該方法は、通常の食事摂生の一部として、１以上の化学保護誘導剤を細胞解毒酵素の発現を刺激するのに十分な量で提供し、それにより、環境性発癌物質への曝露時に環境性発癌物質の影響から細胞を保護することを特徴とする。
【００２３】
本発明の他の特徴および利益は、下記の図面、詳細な記載および実施例から理解されるであろう。
【００２４】
発明の詳細な記載
本発明は、患者に施された化学療法剤または放射線療法の毒性作用から患者の体内の非癌性の迅速に分裂している細胞を保護するための組成物および方法を提供する。特に、本発明の組成物および方法は、上皮細胞を保護するために設計される。最も詳細には、標的は毛包内面を覆う上皮細胞および胃腸管の上皮細胞である。
【００２５】
また、患者が化学療法または放射線療法を受ける場合に影響を及ぼされる他の細胞部位での本発明のさらなる応用も予測される。例えば、いくつかの皮膚病変が、化学療法および／または放射線療法の激しい療法を受ける患者において観察された。これらは、典型的に、基礎的な器官における腫瘍を標的とする放射線療法の分野内で皮膚に起こる。一例として、胸部皮膚病変がしばしば、肺癌のために照射された患者において起こる。別例は、頭部および首部の放射線治療を受けている患者における粘膜炎症の発症、すなわち、口腔ただれの発現である。さらに、以前に問題なく放射線治療を受けた患者において、患者がその後にシトキサンで処理されるときに皮膚病変が起こるという「放射線リコール」と呼ばれる現象がときどき現れる。
【００２６】
皮膚病変は一般に、皮膚炎の変形であり；それらは皮膚破壊および腫瘍化（上記の口腔ただれを包含する）、全身に広がった皮膚発疹、または繰り返して照射した皮膚領域における散乱した赤い病変よりなることができる。これらの癌治療によって誘導される病変の形成は、正常な皮膚の表皮層内で常に起きている高レベルの細胞分裂と一致する。本発明の組成物は、可能な同時的全身性化学療法はもちろん、繰り返しの放射線によって危険にさらされているこれらの皮膚領域を治療するのに非常に有用であると考えられる。
【００２７】
図３に示されるように、いくつかの化学保護誘導剤のいずれかへの皮膚の曝露後に、非常に多数のストレス応答遺伝子の発現が活性化される。活性化された遺伝子の群は、薬物の第ＩＩ相解毒および反応性酸素種に直接関与する蛋白質、例えば、２、３挙げるならば、いくつかのＧＳＴイソ型、カタラーゼおよびキノンレダクターゼ、ならびにｍｄｒ−２、ＭＲＰなどのような細胞からの薬物分子の輸送に関与する蛋白質をコードする。また、ＤＮＡ修復酵素も包含される。この幅広いアップレギュレートされた応答のため、発明者らは、アルカリ化剤分子を包含するが、多くの他の癌化学療法剤群、例えば、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、有糸分裂紡錘体毒、抗腫瘍抗生物質およびビンカアルカロイドにまで及ぶ幅広く種々の薬物に対する耐性表現型を予測する。薬物はストレス応答遺伝子産物の一つによって直接代謝されなくても、まだ、１以上のアップレギュレートされた膜薬物輸送ポンプによって細胞からより迅速に輸送されるようである。正常細胞においてその耐性を誘導しうる化学療法剤の例は、限定するものではないが、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クラドリビン、シクロホスファミド（シトキサン）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、エトポシド、フロックスウリジン、フルダラビンホスフェート、フルオロウラシル、ヒドロキシウリア、イダルビシン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、ナイトロジェン・マスタード、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プリアマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチンおよびビンクリスチンを包含する。シトキサン、シタラビン、ドクソルビシンおよび放射能の毒性作用に対して保護するための化学保護誘導剤の使用は、実施例においてより詳細に記載される。
【００２８】
したがって、本発明は、細胞のために解毒剤として作用する生物学的分子を生産することのできる細胞の能力を利用する。本明細書で用いる場合、「解毒剤」なる語は、直接または間接的に、１以上の化学療法剤または放射線療法の毒性作用を軽減または排除できる薬剤をいう。解毒剤のいくつかのカテゴリーが細胞において生産される。薬剤の１のカテゴリーは、毒性化合物を修飾することによって、その毒性を減少させるか、または影響を受けやすくして、その後に細胞から排除するように作用する。例えば、化学療法において使用されるアルキル化剤のほとんどは、主要な疎水性領域を有する脂肪親和性親電子物質である。これらの薬剤を細胞から除去するための直接的な輸送機構の不在は、これらの疎水性親電子物質の漸次的な細胞内蓄積をもたらす。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、種々の抗新生物アルキル化薬を不活性化することのできるその能力についてよく知られている。ＧＳＴは、親電子化合物によって引き起こされる損傷から細胞を保護することにおいて重要な役割を有する酵素の一群である。化学療法剤をより毒性の低い形態または細胞からより容易に除去される形態に変換することによって作用する別の薬剤は、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。該分子は、カルボプラチンおよびオキサザホスホリンを包含するアルキル化剤、例えば、シクロホスファミドおよび４−ヒドロペルオキシシクロホスファミドの影響に対する細胞の増加した耐性と関連することが示されている（Ｔａｎｎｅｒら、Ｇｙｎ． Ｏｎｃｏｌ． ６５： ５４−６２， １９９７； Ｂｕｎｔｉｎｇ ＆ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １１８８４−１１８９０， １９９６）。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、オキサザホスホリンの活性化経路の重要な中間体であるアルドホスファミドの酸化を触媒し、それにより、これらの薬剤を解毒する（Ｓｒｅｅｒａｍａ ＆ Ｓｌａｄｅｋ， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ２３： １０８０−１０８４， １９９５）。
【００２９】
解毒剤のもう一つ別のカテゴリーは、（上記のように輸送用に修飾されたか、または修飾されていない）毒性薬剤の細胞の外への輸送を容易にすることによって作用する。例えば、ある特定のＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターは、哺乳動物を包含する幅広く種々の生物において同定されており、このように作用するようである。各々、ｍｄｒおよびｍｒｐ遺伝子によってコードされたＡＢＣトランスポーターの２つのよく研究された群は、哺乳動物の腫瘍細胞において観察された多剤耐性現象と関連する。ｍｄｒ遺伝子は、細胞からのある特定の脂肪親和性薬剤（例えば、アドリアマイシン、ビンブラスチン、タキソール）のエネルギー依存性流出の媒介となるＰ−糖蛋白のファミリーをコードする。ｍｒｐ遺伝子は、その特異性がｍｄｒ遺伝子産物のそれと重複するが、また、グルタチオンとの結合後に種々の有機化合物の排出の媒介となるトランスポーターのファミリーをコードする。
【００３０】
上皮細胞における１以上これらの解毒剤の増加が、上記に列挙した化学療法剤のうち１つまたはそれ以上の毒性作用に対して細胞を保護し、同様に、放射線療法の過程の間、損傷から細胞を保護するように働くことが、本発明によって見出された。したがって、本発明はその最も基本的な態様において、化学療法および／または放射線療法の前またはその初期の過程の間に、上皮細胞においてかかる薬剤を送達して、またはかかる薬剤の生産を増加して、癌治療に付随する損傷から細胞を保護することに向けられる。
【００３１】
しかしながら、上記に列挙した解毒剤のほとんどが酵素であることに注目されたい。有効量の解毒酵素が細胞中に存在するようにポリペプチドまたはポリペプチドをコードしている遺伝子を選択された細胞集団へ送達することは困難であり、予測不可能である。したがって、本発明は、１以上の細胞性解毒剤の生産の増加を誘導するために、既知または見出された小型分子の投与によって標的細胞におけるその酵素の生産の増加を誘導することに依存する。これらの分子は、本明細書において、「化学保護誘導剤」または分子と称される。したがって、本明細書で定義される「化学保護誘導剤」は、上記のように、細胞への送達時に、細胞の内在性解毒剤の生産を誘導または増加する薬剤である。
【００３２】
本発明によると、化学保護誘導剤が標的細胞集団へ効率よく送達され、細胞に侵入し、種々の手段により、例えば、酵素をコードしている遺伝子の発現増加を誘導することにより、１以上の解毒酵素の生産を誘導または増加させることができることが見出された。得られた利益は、下記により詳細に論じられるように、化学療法または放射線療法に関連する症状、最も顕著には、毛髪喪失および胃腸の不快感の緩和である。
【００３３】
本発明の組成物は、内在性解毒分子の生産を誘導することによって上記の１以上の化学療法剤に対する解毒効果を示す１以上の化学保護誘導剤、および化学保護誘導剤を保護の標的とされる細胞および組織に送達するためのデリバリービヒクルを含む。
【００３４】
化学保護誘導剤
本発明の目的の場合、「化学保護誘導剤」は、上皮細胞への送達時に、細胞内における解毒分子（上記に定義される）の生産を誘導または増加させるいずれの薬剤であってもよい。作用機構に関するいずれの説明によっても制限されるものではなく、本明細書において示される実験結果は、これらの化学保護誘導剤が一連のストレス応答分子を生産するように細胞を刺激する穏かな酸化ストレスを提供し、その結果、化学療法または放射線療法のより重篤なストレスが強要されるとき、該分子がすでに増加しているかまたは活性化されているので、これらの化学保護誘導剤が有効であることを示唆する。該機構は、ワクチン接種法に対するその機能的類似のため、ときどき、本明細書において「代謝ワクチン接種（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」と称される。
【００３５】
「化学保護誘導剤」として包含されるべき単独または上記の化合物と組み合わせる第２群の化合物は、アリール炭化水素（Ａｈ）受容体の機能的リガンドである化合物を包含する。いくつかの場合、活性化されたＡｈ受容体に起因するシトクロムＰ４５０ １Ａ１遺伝子の保証される誘導発現は、薬物の解毒における第Ｉ相代謝工程を提供することができ、次いで、ストレス応答遺伝子群の不可欠な部分である１以上の誘導されたＧＳＴによる代謝産物の抱合が起こる。次いで、本質において、これらの化合物は、細胞から毒性薬物を除去するために、細胞が代謝的「ワンツーパンチ」を発揮する機会を提供する。該能力において使用できるＡｈ受容体リガンドの例は、限定するものではないが、アブラナ科植物由来のインドール−３−カルビノール、およびオメルプラゾール（ｏｍｅｒｐｒａｚｏｌｅ）を包含する（Ｊｅｌｌｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４５： １１２９−１１３６， １９９３； Ｄｚｅｌｅｔｏｖｉｃら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １２７０５−１２７１３， １９９７）。他の適当なＡｈリガンドは当該分野で既知である。
【００３６】
当該分野で知られている多くの化学保護誘導剤は、本発明において使用に適する（例えば、ＤｅＬｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５： ５４６−５５１， １９８５； Ｉｏａｎｎｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２： １１９９−１２０４， １９８２； Ｃｈｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６： １６５−１６８， １９８６； Ｗａｔｔｅｒｎｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４０： ２８２０−２８２３， １９８０； およびＫｅｎｓｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６： ３９２４−３９３１， １９８６）。限定するものではないが、例えば、３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（３−ＢＨＡ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（２−ＢＨＡ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，４−ジメトキシベンゼン（メチル−ＢＨＡ）、２−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシキノン（ｔ−ＢＨＱ）、４−ヒドロキシアニソール、エトキシクイン、α−アンジェリカラクトン、β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）、ｐ−メトキシフェノールおよびオルチプラズが挙げられる。これらに加えて、本発明によると本明細書に開示される方法を用いて、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）の小型分子ライブラリーから同定された図１５に示される分子を包含する他の化学保護誘導剤が同定された。図１５に示されるように、これまでに同定された最も強力な化学保護誘導剤は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅライブラリー由来のＣＧ０９である（図１５の構造１）。
【００３７】
上記に列挙した分子のいくつか（例えばＢＨＡ）は、食物産業において化学的抗酸化剤として使用される。しかしながら、本発明において明らかにされるように、その効果は体内での代謝におけるオキシダントとしてである。例えば、ＢＨＡを哺乳動物に投与すると、代謝されて、１次代謝産物としてｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔ−ＢＨＱ）が生じる。細胞系における大抵のヒドロキノンと同様に、ｔ−ＢＨＱは自発的に、キノンとヒドロキノン形態間の環変換、すなわち、細胞中での酸化還元循環を起こす。酸化還元循環の副産物は、１以上の形態の酸素フリーラジカルの形成である。細胞は、これらの酸素フリーラジカルを環境ストレスとして感知し、ストレス応答遺伝子の発現を引き起こす。このように、ＢＨＡのような化学的抗酸化剤は、本明細書で定義されるような化学保護誘導剤として作用するように、細胞中で効果的なオキシダントになりうる。
【００３８】
実施例に記載されるように、いくつかの化学保護誘導剤を種々の動物モデル系、特に仔ラットにおける脱毛症モデルにおける効力について試験した。したがって、上記に列挙した化合物の確認において、または上記化合物に加えて、これらの化合物は本発明における使用に特に好ましい。それらは、化学療法または放射線誘導性脱毛症の治療における使用に特に好ましい。これらの化合物は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリー由来の化合物ＣＧ０９、２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（２−ＢＨＡ）、β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）、オルチプラズ、ベンジルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン（レスベラトロール）および（Ｒ）−（＋）−リモネンを包含する。
【００３９】
これらの後者の２つの化合物（レスベラトロールおよび（Ｒ）−（＋）−リモネン）は、抗増殖剤として機能することも知られている。したがって、化学療法および放射線療法の間に迅速に分裂している細胞を保護することにおけるそれらの効力は、それらの化学保護誘導機能または抗増殖機能のいずれか、あるいはその両方の機能に帰することが可能かもしれない。これらの分子がその効果を示す機構にかかわらず、それらは、脱毛症モデルの仔ラットにおいて効果的であることが明らかになり、本発明の他の具体例において特に有用であることが予測される。
【００４０】
デリバリービヒクル
本発明の組成物は、また、デリバリービヒクルを含む。デリバリービヒクルの主要な機能は、化学保護誘導剤を化学療法剤からの保護の標的とされる細胞集団または組織に運搬することである。
【００４１】
非侵襲性担体系を用いる皮膚を介する有機および生物学的物質のデリバリーは、その手法の非侵襲性による患者許容性ならびに胃腸障害および送達された分子の初回通過代謝の回避を包含する多くの魅力を有する。しかしながら、皮膚デリバリーにおける主要な問題は、皮膚角質層の障壁に対するほとんどの物質の低い浸透率である。皮膚は真皮と表皮の二層からなる。真皮は、結合組織、神経、血管およびリンパ管、毛包、皮脂腺および汗腺よりなる。表皮は、分化のいくつかの段階の細胞よりなる；この分化の間、細胞は基底層から表面へ移動し、角化して角質層を形成する。角質層の脂質マトリックスは、コレステロール、遊離脂肪酸およびセラミドよりなる二重層になった脂質膜より形成される。角質層は経皮的吸収に対する主要な障壁であると考えられるが、それはまた、浸透の主要経路でもある。したがって、角質層の脂質マトリックスを緩めるまたは流動化する化合物は、皮膚に対する物質の浸透を増加させうる。これは通常、アルブミン結合体、レシチン、糖蛋白、多糖類およびリポソームのような担体分子を用いることによって達成される。
【００４２】
これらの選択肢のうち、リポソーム処方は、より慣用的な処方を超えるいくつかの利益を提供する。主要な利益は、（１）望ましくなく高い全身性吸収由来の深刻な副作用および配合禁忌の減少；（２）リポソームと角質層の高い融和性による、投与部位での送達された物質の有意に高い蓄積；（３）幅広く種々の疎水性および親水性分子の皮膚中への容易な取り込み；（４）捕獲した化合物の代謝分解からの保護；および（５）天然の膜構造に対する密接な類似およびそれに関連する生体適合性および生物分解性である。
【００４３】
リポソームは、リン脂質が水性媒体中に分散されるときに形成されるリン脂質分子の高度に精密な自己集合から作成される球形同心流動モザイクとして定義され得る。脂質が水性媒体中に置かれるとき、脂質頭部群と水との親水性相互作用が、球形外皮の形態の生物膜に似た多重層状および単層状の系または小胞の形成をもたらす。これらの基本的なリポソームは、ときどき、「従来のリポソーム」と称される。いくつかの他の型のリポソーム調製物が存在し、それは、（１）ポリエチレングリコールのような不活性親水性ポリマーで被覆された表面である、立体安定化されたリポソーム；（２）抗体またはそのフラグメント、レクチン、オリゴ糖またはペプチドのような標的リガンドが結合する、標的とされるリポソーム（下記に論じられるように、コレラ毒Ｂ（ＣＴＢ）を用いて、胃腸上皮にリポソームを向ける）；および（３）特定の相互作用に応答してその相および構造を変化する、反応性または「多形」リポソーム（該群は、刺激のなかでも特に、イオン（ｐＨ、カチオン）、熱および光に感受性のリポソームを包含する）を包含する。上記の異なる型のリポソームの概説については、Ｄ． Ｌａｓｉｃ， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９４の第６章を参照のこと。
【００４４】
化学保護分子の皮膚への効果的なデリバリーを達成するために、リポソームの種々の処方（リン脂質を基礎とする小胞、カチオン性リポソーム、非イオン性リポソーム、非イオン性／カチオン性リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ））、ＰＩＮＣポリマー、およびプロピレングリコールおよびエタノール混合物（ミノキシジルの投与用に一般に使用されるビヒクル）、および非イオン性リポソーム／プロピレングリコールおよびエタノール混合物が試験された（実施例参照）。非イオン性リポソームまたは非イオン性リポソームおよびプロピレングリコール／エタノールの混合物が特に効果的な経皮担体であることが決定された。
【００４５】
反応性リポソームは、本発明の他の具体例に好ましい。リポソームの微量成分としてのカチオン性両親媒性化合物の封入は、負に荷電した溶質との会合、リポソームの細胞表面への迅速な結合、およびリポソームの細胞取り込みを容易にする。ｐＨ感受性リポソームは、抗腫瘍薬剤、蛋白質および核酸の細胞質デリバリーの効率を改善するために開発されてきた。ほとんどのｐＨ感受性リポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を用いて調製された。ＰＥは単独でリポソームを形成せず、反転した六辺形相（ＨＩＩ）を形成する傾向がある。しかしながら、リポソームは、ＰＥに別の二重層安定性の両親媒性脂質成分を加えることによって調製することができる。カルボキシル基を有する滴定可能な両親媒性物質は、ｐＨ感受性リポソームの調製のための成分として使用されてきた。これらの滴定可能な両親媒性物質によって二重層膜を安定化することのできる能力は、酸性条件下で減少するので、不安定化がリポソームの融合をもたらす。ｐＨ感受性リポソームは、生理学的ｐＨにて安定であり、エンドサイトーシス経路を通じて細胞によって内在化され、それによりリポソームが酸性ｐＨに曝露される。エンドソーム内のリポソームは不安定化され、おそらく、エンドソーム膜と融合し、その結果、リソソーム酵素による分解を伴うことなく細胞質中にその内容物を放出する。
【００４６】
本発明の他の具体例において、立体的に安定化した不活性リポソームが特に適当である。また他の具体例において、標的とされるリポソームを用いて利益を得てもよい。
本発明の他の具体例において、特に化学保護誘導剤の表皮への投与のために、脂質を基礎とする「クリーム」が特によく適する。クリームは一般に、水、アルコール、プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよび白蝋を含むように処方される。別の処方において、それらは水、アルコール、グリセロール、ホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリンおよびトリグリセリドを含む。
【００４７】
局所投与に有効であると証明されたもう一つ別のデリバリービヒクルは、水性アルコール溶液である。エタノール、メタノール、プロピレングリコールまたはブタンジオールのようなアルコール類は、１０−１００％アルコールを含む水性溶液において調製され、活性薬剤を該溶液中に溶解させる。該型のデリバリービヒクルは、実施例７−９に記載のプロトコールにおいて用いられる。
他のデリバリービヒクルもまた、本発明における使用、特に、胃腸管腔への解毒剤の投与に適当である。限定するものではないが、（１）植物油または魚油などの油（標準的なゲルカプセル中に入れることができる）；および（２）ポリオキシエチレンエーテル、例えば、１０−ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ ７６）を水性バッファー中で分散させることによって調製されたエマルジョンが挙げられる。
【００４８】
ＧＩ管腔に適当なデリバリービヒクルの他の例は、ポリ乳酸ポリグリコール酸の生物分解性微粒子（直径０．１−１０μＭ）を包含し、それは、経口ドラッグデリバリーを介する胃腸内取り込みのイン・ビトロでのモデル系として、蛋白質をＣａｃｏ−２細胞へ送達するために使用された（Ｄｅｓａｉら、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １４： １５６８−１５７３， １９９７）。他に、ポリスチレン粒子によって運搬される蛋白質のラットの小腸内面細胞中への有意な取り込みが示された（Ｈｉｌｌｅｒｙら、Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２： １５１−１５６， １９９４）。実際、蛋白質含有微粒子のデリバリーは、ＧＩ管腔から粘膜下組織脈管構造までさまざまに報告された（Ａｐｈｒａｍａｉａｎら、Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ６１： ６９−７６， １９８７）。したがって、かかるポリマー微粒子は、ＧＩ管腔の表面に見出される胃腸上皮細胞への化学保護誘導剤の経口デリバリーに極めて適当である。
【００４９】
化学保護誘導剤を含む医薬調製物の投与
保護の標的とされる細胞集団または組織に依存して、下記の本発明の組成物の投与様式が考えられる：局所、経口、鼻腔、眼、直腸、膣、経皮、腹腔内および静脈内。標的とされるデリバリーが意図されるので、これらの投与様式のうち若干数が標的とされるデリバリービヒクル（例えば、ＣＴＢ−または抗体−散在リポソーム）に最も適当である。
【００５０】
本発明の組成物は、一般に、医薬調製物として患者に投与される。本明細書で使用される場合、「患者」なる語はヒトまたは動物対象をいう（動物は特に、特定の組成物の臨床上の効力に関するモデルとして有用である）。適当な医薬調製物の選択は、選択された投与法に依存し、医化学者によく知られたプロトコールにしたがって作成され得る。
【００５１】
本発明の組成物を含む医薬調製物は、従来、水、緩衝化セーライン、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁化剤またはその適当な混合物などの許容される媒体と共に投与するために処方される。選択された媒体中における特定の組成物の濃度は、デリバリービヒクルおよびその中に配置された活性薬剤の特異的性質と共に、媒体の疎水性または親水性の性質に依存するであろう。溶解性限界は当業者によって容易に決定されうる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「生物学的に許容される媒体」なる語は、上記の段落で例示されたような、医薬調製物の望ましい投与経路に適当でありうるあらゆる溶媒、分散媒体などを包含する。医薬上活性な物質のためのかかる媒体の使用は、当該分野で既知である。いずれかの慣用的な媒体または薬剤が投与されるべき組成物と配合禁忌である場合を除いて、医薬調製物中におけるその使用が意図される。
【００５３】
医薬調製物は、投与の簡便性および適用量の均一性のために、投与単位形態で処方される。本明細書中で使用される場合、投与単位形態なる語は、治療を受けている患者に適当な医薬調製物の物理的に分離した単位をいう。各適用量は、選択された医薬担体と関連して所望の保護効果を生じるように計算された量の化学保護誘導剤を含有する。適当な投与単位を決定するための手法は当業者によく知られている。
【００５４】
投与単位は、患者の体重に基づいて比例的に増減させてもよい。特定の化学療法剤の毒性作用からの標的細胞集団または組織の保護を達成するための適当な濃度は、当該分野で知られているように、用量濃度曲線計算によって決定され得る。
一例として、局所塗布の場合、化学保護誘導剤は、頭皮または他の皮膚部位に塗布される適当な担体（例えば、リポソームエマルジョン）中５−１００ｍＭの濃度範囲で使用されうる。該用量は、げっ歯動物モデルを用いる実験の結果から得られ（実施例１−３参照）、用量の範囲は、用量効果において変動したいくつかの異なる分子を用いる実験から得られた結果の相関的要素である。皮膚に塗布される材料の容量は、被覆されるべき表面積の大きさによって変化する；例えば、小さな子供の頭皮処理では３−５ｍｌを要し、成人においてその量は、１回の塗布につき１０−２０ｍｌまで増加する。
【００５５】
もう一つ別の例として、胃腸内投与の場合、適当な媒体（例えば、リポソームエマルジョン）中における化学保護誘導剤の経口投与は、胃および十二指腸の管腔表面積に対して標準化される。これは、患者が朝起きたときに空の胃において材料を消費すると仮定した。
【００５６】
また、本発明の医薬処方が１以上の化学誘導剤を含有しうることは当業者に明らかであろう。かかる薬剤の種々の組み合わせはある特定の適用に有用であり、かかる組み合わせの処方は上記の一般的なガイドラインによって調製されたであろう。さらに、１以上の化学保護誘導剤は、２つの異なる作用様式によって効果のある医薬処方を提供するために、抗増殖薬のような他の薬剤と組み合わせてもよい。かかる使用に適当な抗増殖剤は、２０００年１２月２８日にＷＯ００／７８２８９として公開されたＰＣＴ出願ＵＳ００／０５１８６において記載されたサイクリン依存性キナーゼＩＩ阻害剤である。さらに、本明細書に記載された化学保護誘導剤のうち若干数は抗増殖活性も有する。
【００５７】
医薬調製物の投与方針
本発明の組成物を含む医薬調製物は、化学療法および／または放射線療法と適当な間隔をおいて、化学療法および／または放射線療法の前、化学療法および／または放射線療法の間または化学療法および／または放射線療法の後に投与してもよい。特定の場合、適当な間隔は通常、化学療法または放射線療法および保護の標的とされる細胞集団の性質に依存するであろう。
【００５８】
例えば、化学療法に誘導される脱毛症の予防の場合、化学保護誘導剤を含有するリポソームまたは他のデリバリービヒクルは、例えば、局所クリームとして、化学療法の予定された適用前に患者の頭皮に送達させるように処方することができる。毛包の曝露面の内面を覆う上皮細胞を化学療法薬から保護することによって、一般に癌化学療法に付随する毛髪の喪失を予防することができる。実施例においてより詳細に記載されるように、化学療法の適用時に誘導された解毒遺伝子産物が毛包の上皮細胞中で完全に活性化されることを保証するために、局所処方は好ましくは化学療法の１−５日前に開始する。次いで、化学療法の過程の間、該処方を塗布しつづけてもよい。
【００５９】
胃腸上皮の保護の場合、化学保護誘導剤は、化学療法の予定された適用前に患者に経口的に送達させるように処方される。したがって、化学療法剤の注入の１−５日前での保護処方の投与は、影響されやすい上皮細胞に保護を与える。例えば、患者は、化学療法の１−５日前の朝の朝食前に、化学保護誘導剤／リポソームエマルジョンを含有する「シェイク」を消費するように指示されるであろう。結果として、ストレス応答遺伝子産物のレベルは、化学療法薬がＧＩ管腔上皮に浸透するとき、その誘導される最大値になるであろう。
【００６０】
新規な化学保護誘導剤の同定
上記のように、種々の分子が細胞においてストレス応答遺伝子を誘導することが知られており、それにより、本発明において利用される化学保護誘導効果を提供する。しかしながら、同等または上回る活性を有する新規な化学保護誘導剤を同定するための単純な方法を見出すことは、当該分野における前進であろう。したがって、本発明は、また、有害な化学療法剤または放射線療法の副産物の細胞解毒が可能な１以上のストレス応答分子の生産または活性を誘導または増加させることのできる能力について、候補分子をスクリーニングするための迅速かつ単純なアッセイ系を提供する。該方法は実施例４に詳細に記載される。アッセイは、親電子応答エレメント（ＥｐＲＥ）が、種々の環境因子からの細胞保護の重要な機構を構成する第ＩＩ相解毒酵素および酸化ストレス蛋白質の誘導発現の媒介となるという実例に基づいている（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ５３６１−５３６６， １９９７）。該アッセイは、プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子およびプロモーターに隣接して挿入された１以上のＥｐＲＥ調節エレメントを含むＤＮＡ構築物を利用する。細胞を該ＤＮＡ構築物で形質転換し、発現されたレポーター遺伝子産物の低い存在および活性を展示するクローン（負の対照）、第ＩＩ相解毒酵素の既知の誘導剤に細胞を曝露したとき、レポーター遺伝子産物の高い存在または活性を誘導可能なクローン（正の対照）を選択する。次いで、細胞を候補試験化合物に曝露し、レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。該アッセイは、多くの試験化合物の同時試験のためのマルチプルウェル系において組み立てることができる。
【００６１】
本発明の好ましい具体例において、レポーター遺伝子は、実施例４に記載のように、チミジンキナーゼプロモーターおよびＥｐＲＥ調節エレメントのコンカテマーの調節下で緑色蛍光蛋白質をコードする。
また、本発明によると、スクリーニングアッセイの実施を容易にするためのキットも提供される。該キットは、ＤＮＡ構築物およびアッセイを行うための説明書を含む。さらに、キットは、形質転換に適当な培養細胞、アッセイにおいて対照として使用するための試薬、レポーター遺伝子の発現量を検出するための試薬、および他の種々の培養培地または生物化学試薬を適宜含んでいてもよい。
【００６２】
癌を予防するための化学保護誘導剤の使用
癌の病因は完全には理解されていないが、ある種の化学的または環境的因子が突然変異原および発癌物質として作用することがよく知られている。この理由で、本発明は、癌予防としての化学保護誘導剤処方の使用も意図する。毎日の食事摂生の一部としてのこれらの薬剤の予防的消費は、正常な器官、例えば、胃および小腸、ならびに胸部のような非ＧＩ組織の宿主において化学保護遺伝子の慢性的な誘導発現をもたらすであろう。解毒細胞蛋白質の慢性的な増加は、それらの細胞がよりいっそう、一般に喫煙および食物副産物から生じる発癌物質のような毎日の生活において遭遇する化学発癌物質を解毒できるようにするであろう。
【００６３】
下記の実施例は、本発明を説明するために提供される。それらはいかなる方法においても本発明を制限しようとするものではない。
【００６４】
実施例１
化学保護遺伝子産物の発現を誘導する分子の局所塗布による化学療法誘導性脱毛症の予防
発明者らは、細胞毒に対して細胞を保護することが知られているＧＳＴ、ＭＲＰ、ＭＤＲ、ＡＬＤＨ３などの化学保護遺伝子産物を発現することによる毛包の選択的保護によって薬物誘導性脱毛症が大いに首尾よく予防できると仮定した。ＭＲＰおよびＧＳＴ Ｐ１の組み合わせた増加した発現は、抗癌剤の細胞毒性に対し高レベルの耐性を与えることが見出された（Ｍｏｒｒｏｗら、１９９８）。しかしながら、ＭＲＰおよびＧＳＴの遺伝子産物は抗癌剤の細胞からの除去においてその協同作用により細胞毒性に対して癌細胞を保護するように共同で働くので、ＭＲＰまたはＧＳＴのいずれか単独の発現はあまり好結果ではないことが見出された。
【００６５】
該実施例に示される実験は、上記の化学保護遺伝子の発現を誘導することが知られている分子を送達することによって、毛包細胞においてこれらの保護遺伝子を過剰発現させるという考えで設計された。脱毛症は、シトキサンを投与することにより、７日齢の仔ラットにおいて誘導された（図１）。シトキサン投与の前および投与の間に、非イオン性リポソームを毛包中に侵入させるためのビヒクルとして用いてラットを化学保護分子で処理し、脱毛症の予防における各化学保護剤の効力を決定した。
【００６６】
材料および方法
シトキサン（ＣＴＸ）による脱毛症の誘導
１匹の母親につき１２匹の仔を有する泌乳性スプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットをハーラン・スプレーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）から購入した。ＣＴＸ誘導性脱毛症を生ずるために、数種類の濃度（３５、４０、４５μｇ／ｇ体重）の水中におけるＣＴＸを７日齢の仔に腹腔内注射した。ＣＴＸ処理の７日後、仔を検査して体毛喪失の程度を決定した。仔の背に穏かにブラシをかけて、皮膚に刺さっている固定していない体毛を除去し、写真撮影した。次いで、仔の体毛密度を決定した。１００％の体毛密度は、非処理の対照の仔において見出された密度を示し、一方、０％は全体毛を喪失した仔を示す。４０μｇ／ｇのＣＴＸが７日齢の仔において１００％体毛喪失を誘導するのに十分であったことが観察され、該濃度を次の実験に使用した。
【００６７】
化学保護剤での処理；デリバリーのためのビヒクルとしての非イオン性リポソームの調製
非イオン性リポソーム調製物は、ジラウリン酸グリセリル（ＧＤＬ）、コレステロール、ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル（ＰＯＥ−１０）を５８：１５：２７の重量パーセント比で含有した。脂質混合物は、また、１％α−トコフェロールを含有した。適当な量の脂質を混合し（１００ｍｇ／ｍｌ全脂質）、滅菌ポリスチレンチューブ中７０℃で融解した。脂質混合物を滅菌シリンジ中に引入れた。滅菌ＰＢＳを含有する第２のシリンジを７０℃に予め加熱し、二路活栓を介して脂質相シリンジに連結した。次いで水相をゆっくりと脂質相シリンジ中に注入した。混合物が室温に達するまで、冷たい水道水の流水下で冷却しながら、混合物をすみやかに２つのシリンジ間を行ったり来たり移動させた。最終的な調製物を顕微鏡下で調べて、リポソームの無欠性および質を確認した。使用直前に、リポソームを室温で２分間超音波処理し、等量の適当な溶媒（典型的にはＤＭＳＯ）中における化学保護剤と混合し、室温で４５分間インキュベートした。
【００６８】
下記の化学保護剤を含有するいくつかの非イオン性リポソーム調製物を調製した。
５ｍＭ β−ＮＦ
１０ｍＭ β−ＮＦ
１５ｍＭ β−ＮＦ
５ｍＭ ＣＧ０９
１０ｍＭ ＣＧ０９
１５ｍＭ ＣＧ０９
２０ｍＭ ＣＧ０９
２５ｍＭ ＢＨＡ
５０ｍＭ ＢＨＡ
２５ｍＭ ｔＢＨＱ
５０ｍＭ ｔＢＨＱ
５ｍＭ スルフォラフェン
１０ｍＭ スルフォラフェン
１５ｍＭ オルチプラズ
２０ｍＭ オルチプラズ
【００６９】
実験の２日前から開始して、７日齢の仔ラットの背中の皮膚１平方センチメートルにリポソーム処方をミクロピペットによって塗布した。実験０日目に、動物に４０μｇ／ｇ ＣＴＸを注射した。リポソーム調製物の塗布は実験６日目まで続けた。対照動物は空のリポソームのみを与えられた。実験７日目に、動物にスコアをつけて脱毛の程度を決定した。仔の背中を穏かにこすって固定していない体毛を除去し、写真撮影した。図１は、体毛喪失の予防に対する化学保護分子の影響を示す。
【００７０】
結果：
既知の化学保護化合物のなかでも、β−ＮＦは８０％の保護効果を有し、次いで、ＢＨＡ（６０％）、オルチプラズ（５０％）、ｔＢＨＱ（１０％）およびスルフォラフェン（５％）であった。新たに見出された化合物ＣＧ０９は、〜９７％の最も高い保護レベルを示した（図１、挿入図）。また、体毛の手触りは、非処理の仔ラットのそれに匹敵することがわかった。ＤＭＳＯを担体として用いて化学保護分子を送達させた場合、仔はＣＴＸ処理後に体毛を保持したが、その皮膚はざらざらで鱗状であることが観察された。ミノキシジル担体であるプロピレングリコール：エタノール：水混合物は、これらの化学保護分子の効果的な担体として作用しなかった。ミノキシジルビヒクル中におけるβ−ＮＦまたはＣＧ０９で処理された仔における脱毛症は、非処理のＣＴＸ処理仔ラットと同様の重篤度であった（図２）。
【００７１】
実施例２
皮膚における化学保護遺伝子発現に対する化学保護遺伝子の小型分子誘導剤の影響
β−ＮＦおよびＣＧ０９の保護効果の基礎をなす基本的機構を解明するために、発明者らは、ＧＳＴｓ、ＭＤＲ、ＭＲＰおよびＡＬＤＨ３などの化学保護遺伝子の発現レベルを先の実施例に記載したのと同じ局所処理条件下で研究した。
【００７２】
簡単に言うと、仔ラットをＣＴＸまたはβ−ＮＦのいずれかで処理し、異なる時間間隔をおいて皮膚試料を収集し、全ＲＮＡをそこから抽出した。ＲＮＡを逆転写して、３２Ｐ ｄＡＴＰの存在下、ストレス関連遺伝子に特異的なプライマーを用いて各ｃＤＮＡを生成した。合成された放射能標識ｃＤＮＡを用いて、２０７個のストレス関連遺伝子よりなるラットストレス遺伝子ｃＤＮＡ発現アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコールにしたがってプローブした。ハイブリダイズした膜をホスファーイメージャースクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ｓｃｒｅｅｎ）に曝露し、得られた画像をオリエンテーショングリッドに並べて、発現される遺伝子を同定した。対照、ＣＴＸ処理およびβ−ＮＦ処理動物由来の画像を比較して、もしあれば、これらの実験条件下での化学保護遺伝子の発現パターンにおける変化を決定した。
【００７３】
図３は、β−ＮＦおよびシトキサンで処理した仔ラットにおけるストレス遺伝子の発現パターンを示す。１５ｍＭ β−ＮＦの仔ラットへの５日間の局所投与は、シトキサンで処理した仔ラットと比較した場合、ＧＳＴ−ＰＩ、ＧＳＴ−Ｍｕ２、ＧＳＴ−ＹａおよびＧＳＴ（ヒトのラット相同物）の発現レベルにおいて有意な増加をもたらした。
【００７４】
図６は、ラット皮膚細胞（その大部分は毛包細胞である）におけるその発現が、β−ＮＦ／非イオン性リポソームエマルジョンの仔ラット皮膚への毎日の塗布後１−６日で（β−ＮＦ１−β−ＮＦ６、５日目に安定期に達する）誘導される一連の遺伝子を示す。グラフの注目すべき点は：（１）β−ＮＦまたはＣＧ０９はシトキサン処理の前日に塗布されただけだが、にもかかわらず、実質的な保護効果が達成されたこと；（２）データが、０日目にシトキサンを投与する５日前に局所的頭皮処理を開始し、次いで、シトキサン処理後の数日間、局所処理を続けて、患者の体からシトキサンを一掃させることに関する強い主張を提供すること；（３）発現が誘導される遺伝子のリスト（すなわち、垂直バーの下の名前）が、なぜシトキサンの毒性が毛包細胞においてほとんど除去されるのかを明らかにすることである。これらの遺伝子、いくつかのＧＳＴおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼは、シトキサンおよび他のアルキル化剤を代謝および解毒することが知られている。ｍｄｒ−２遺伝子発現の増加は、動物をアドリアマイシン、シトシンアラビノシドおよび脱毛症を誘導することが知られており、かつ、ｍｄｒ−２膜流出ポンプの基質であることも知られているいる他の薬剤で処理したとき、毛包細胞における耐性または保護表現型が展示されるであろうことを強く示唆する。
【００７５】
図７は、β−ＮＦ処理（単独）の５日目またはシトキサン（単独）の全身投与後５日目に皮膚組織において誘導されるストレス応答遺伝子を示す。全身性シトキサン投与は、皮膚細胞におけるストレス応答遺伝子のサブセットを誘導する。不運にも、シトキサンは取り除かれてから久しく、シトキサン誘導性ストレス応答遺伝子が有意に発現される前にその損傷が起こる。したがって、本発明は、β−ＮＦのようなより穏かなストレス誘導剤を化学療法剤の投与の１−５日前に適用し、その結果、化学療法剤の送達時にこれらの酵素の発現および解毒活性がピークに達するようにする「分子ワクチン処理」技術を利用する。
【００７６】
実施例３
上皮細胞への化学保護遺伝子誘導剤のデリバリーのための担体の同定
皮膚中への化学保護分子の効果的なデリバリーを達成するために、種々の処方のリポソーム（リン脂質を基礎とする小胞、カチオン性リポソーム、非イオン性リポソーム、非イオン性／カチオン性リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム）、ＰＩＮＣポリマー、ならびにプロピレングリコールおよびエタノール混合物（ミノキシジルを投与するために一般に使用されるビヒクル））を用いて研究を行った。まず、これらの処方を用いて、マーカー蛋白質ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼをコードするようなレポーター遺伝子、または蛍光プローブ（ナイル・レッド（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ））を捕獲し、送達されたマーカー蛋白質の機能アッセイによって、またはナイル・レッドの場合、蛍光発光によって、標的組織においてそのデリバリーを追跡した。リポソームは下記のように調製した。
【００７７】
リン脂質を基礎とするビヒクル
調製物は、１：０．５：０．１モル比における下記の脂質混合物を含有した。
１．ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＯＴＡＰ
２．ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＣ
３．ＤＯＰＥ−２０００：コレステロール：ＤＳＰＣ
脂質をクロロホルム中に溶解し、回転蒸発器中５０℃で蒸発させた。乾燥した脂質薄膜を室温で３０分間、ＤＮＡ（β−ｇａｌまたはルシフェラーゼ）または１ｍｇのナイル・レッドを含有するＨＥＰＥＳバッファーで水和した。得られた懸濁液を冷凍および解凍の５サイクルに付した。最終的な懸濁液を０．２２μｍフィルターに７回通過させた。ビヒクルを４℃で保管した。
【００７８】
非イオン性リポソーム
非イオン性リポソーム調製物は、ジラウリル酸グリセリル（ＧＤＬ）、コレステロール、ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル（ＰＯＥ−１０）を５８：１５：２７の重量パーセント比で含有した。脂質混合物は１％α−トコフェロールも含有した。適当な量の脂質を混合し（１００ｍｇ全脂質）、滅菌ポリスチレンチューブ中７０℃で溶融した。脂質混合物を滅菌シリンジ中に引入れた。滅菌ＰＢＳを含有する第２のシリンジを７０℃に予め加熱し、二路活栓を介して脂質相シリンジに連結した。次いで、水相をゆっくりと脂質相シリンジ中に注入した。混合物が室温に達するまで、冷たい水道水の流水下で冷却しながら、混合物をすみやかに２つのシリンジ間を行ったり来たり移動させた。最終的な調製物を顕微鏡下で調べて、リポソームの無欠性および質を確認した。使用直前に、リポソーム調製物を室温で２分間超音波処理し、等量のレポーターＤＮＡ（２５０μｇ）を加え、室温で１時間インキュベートした。
【００７９】
非イオン性／カチオン性リポソーム
非イオン性／カチオン性調製物は、ＧＤＬ、ＰＯＥ−１０、コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，２ジオレイルオキシ−３（トリメチルアンモニオ）プロパン）を１００ｍｇ／ｍｌ調製物中５０：２３：１５：１２の重量パーセント比で含有した。適当な量の脂質を混合し、ポリスチレンチューブ中７０℃で溶融し、７０℃に予め加熱したシリンジ中に引入れた。滅菌ＰＢＳを含有する第２のシリンジを７０℃に予め加熱し、二路活栓を介して脂質相シリンジに連結した。水相をゆっくりと脂質相シリンジ中に注入した。混合物が室温に達するまで、冷たい水道水の流水下で冷却しながら、混合物をすみやかに２つのシリンジ間を行ったり来たり移動させた。使用直前に、リポソーム懸濁液を室温で２分間超音波処理し、等量のＤＮＡ（２５０μｇ）および非イオン性／カチオン性リポソームを混合し、室温で１時間インキュベートした。
【００８０】
ＰＩＮＣ（保護的、相互作用的、および不凝性（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｎｏｎ Ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ））ポリマー
７０％ＰＶＰ、３０％酢酸ビニルおよび２５０μｇプラスミドＤＮＡを０．９％ＮａＣｌ中で混合し、室温で１５分間インキュベートすることによって処方を作成した。
【００８１】
ＰＧ（プロピレングリコール）：エタノール−プラスミドＤＮＡ複合体（ミノキシジルビヒクル）
２５０μｇのプラスミドＤＮＡを６０％ＰＧ、２０％エタノールおよび２０％水と混合し、使用前に室温で１５分間インキュベートした。
レポーター遺伝子の捕獲の効率を決定するために、エチジウムブロマイドを用いるＤＮＡインターカレーション研究を行って、加えられたＤＮＡがリポソーム中に捕獲されたことを確認した。簡単に言うと、１ｍｌのエチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）をＤＮＡを含有するリポソーム調製物のアリコートに加え、ボルテックスミキサーで３秒間混合した。正および負の対照として、ＤＮＡおよびエチジウムブロマイドならびにエチジウムブロマイド単独を用いた。全試料のエチジウムブロマイドに基づく蛍光を蛍光計において発光波長５９５ｎｍでモニターした。
【００８２】
仔ラットにおけるイン・ビボ実験
動物実験は、６日齢のハーラン・スプレーグ・ドーリー仔ラットにおいて行った。ルシフェラーゼ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子または１ｍｇのナイル・レッド（蛍光プローブ）を含有する１００μｌのリポソーム処方を３０分間隔で、１平方センチメートルの背中の皮膚に塗布した。対照の仔は空のリポソームのみを与えられた。２４、４８および７２時間後、仔を殺し、処理した皮膚セクションを切開し、レポーター遺伝子の発現または蛍光プローブのレベルを分析するために用いた。
【００８３】
イン・サイトゥβ−ガラクトシダーゼアッセイ
皮膚セクションの部分をＯＣＴ中に埋め込み、切断し、５μｍ細片として超冷凍スライド上に、氷冷したＰＢＳ中における１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて固定した。固定した組織を室温で２時間、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．０２％ ＮＰ４０を含有するＰＢＳを３回交換して洗浄した。次いで、これらを暗所中３７℃で１６時間、ＰＢＳ中における２ｍｇ／ｍｌ ４−Ｃｌ−５−Ｂｒ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％ＮＰ４０および０．１％デオキシコール酸ナトリウム中で染色した。インキュベーション期間の最後に、スライドをＰＢＳで洗浄し、組織学的研究のためにヘモトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）およびエオシン中で対比染色した。
【００８４】
組織ホモジェネートの調製
切開した皮膚セクションを小片に切断し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを用いて２ｍｌのレポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でホモジナイズした。ホモジェネートを最大速度で１５分間遠心分離し、上清をさらなる分析に用いた。ホモジェネートの蛋白質含量をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）法を用いて測定した。
【００８５】
β−ガラクトシダーゼ活性の定量分析
β−ガラクトシダーゼ活性は、基質（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有する等量の２ｘアッセイバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組織ホモジェネートのアリコートを加えることによって測定した。試料を３７℃で３０分間インキュベートし、その間、β−ガラクトシダーゼ酵素は無色の基質を黄色のｏ−ニトロフェノールに加水分解する。１Ｍ炭酸ナトリウムの添加によって反応を停止し、分光光度計において４２０ｎｍで吸光度を測定した。活性は単位／ｍｇ蛋白質として表した。
【００８６】
ルシフェラーゼ活性の定量分析
ルシフェラーゼ活性を、デュアル・ルシフェラーゼアッセイキット（Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ））を用い、製造者の説明書にしたがって測定した。簡単に言うと、１００μｌの試料に基質を含有する１００μｌのルシフェラーゼアッセイバッファーを加え、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏバッファーの添加直後に、発光された光を照度計で測定した。活性はＲＬＵ／ｍｇ蛋白質として表した。
ナイル・レッド
ナイル・レッドの蛍光発光は、皮膚セクション上、蛍光顕微鏡下で観察された。
【００８７】
結果：
使用したデリバリー系の効率の比較
リポソームデリバリー系の効率を、処理した皮膚セクションにおける発現した生産物β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼに関して、抽出された蛋白質１ｍｇあたりの組織ホモジェネート中におけるこれら２つの酵素の活性を測定することによって比較した。図４は、リポソーム処方で処理されたラットにおける外来性ルシフェラーゼの発現を示す。２５０μｇのルシフェラーゼＤＮＡを入れている非イオン性（ＮＩ）リポソームで処理された仔ラットは、ＮＩ＋ＤＯＴＡＰおよびＰＬ処方に対し、処理の２４時間後に最大の発現（９５０００ＲＬＵ／ｍｇ蛋白質）を示した。興味深いことに、ＰＩＮＣポリマー、ＰＥＧおよびミノキシジル担体系は、上記の系において効率が悪いことが見出された。同様の傾向が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子および蛍光ナイル・レッドのデリバリーにおいて観察された。非イオン性リポソーム処方は、他のデリバリー系と比べたとき、最も効率のよいデリバリー系であることが見出された（図５）。ＰＥＧを基礎とするミノキシジル担体系は単独で、効率の悪い担体系であることが見出されたが、その後の実験は、非イオン性リポソーム処方およびミノキシジル担体の１：１混合物が、ナイル・レッド染料の毛包および表皮細胞へのデリバリーにおいて、非イオン性リポソーム処方単独と同等かまたはそれ以上に効率がよいことを明らかにした。
これらの観察は、Ｎｉｅｍｉｃら（１９９７）によて報告された知見に類似する。彼らは、リポソーム−プラスミドＤＮＡ処方の局所適用後のヒトインターロイキン−１レポーターアンタゴニスト蛋白質の毛包周囲での発現がリン脂質を基礎とするリポソームより非イオン性リポソームで有意に高かったことを報告した。
【００８８】
化学保護分子を毛包中に送達するための好ましい担体物質の組成
非イオン性リポソームが経皮デリバリーに有効なビヒクルとして同定されたので、担体分子として非イオン性リポソームを用いて種々の化学保護分子を送達するための研究を行い、化学療法誘導性脱毛症に対して保護を与えることにおける各化学保護分子の効率をシトキサンで処理した仔ラットにおいて測定した。
非イオン性リポソーム調製物は上記と同様に調製された。使用直前に、適当な溶媒中における等量の化学保護誘導分子（β−ＮＦ、ＢＨＡ、ＣＧ０９、オルチプラズ、スルフォラフェン、およびＢＨＱ）をリポソームと混合し、使用する前に室温で４５分間放置した。
【００８９】
実施例４
化学保護誘導剤の迅速なスクリーニングのためのミクロプレートアッセイ
親電子物質応答エレメント（ＥｐＲＥ）は、癌の化学予防の重要な機構を構成する第ＩＩ相解毒酵素および酸化ストレス蛋白質の誘導発現の媒介となることが明らかにされた。該実施例は、化学保護誘導活性を有する天然または合成化学物質をスクリーンおよび同定するための迅速な細胞に基づく機能的アッセイの開発を記載する。
【００９０】
材料および方法
化学物質および試薬
ＢＨＡおよびｔＢＨＱは、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。ＤＭＳＯ、ｂ−ＮＦ、３−ＭＣおよびＰＤＴＣは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。オルチプラズはＭｃＫｅｓｓｏｎ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手した。スルフォラフェンはＬＫＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）から購入した。合成ＥｐＲＥオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）へ注文した。緑色蛍光蛋白質発現ベクターｐＥＧＦＰは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から購入した。１１００個の小型の手動合成分子を含有するＤＩＶＥＲＳｅｔａ化学ライブラリーの一部は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。
【００９１】
細胞培養
ヒトＨｅｐＧ２肝癌細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手し、０．１％ゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を補足した１０％胎仔ウシ血清を含有する高含量グルコースのＤＭＥＭ中で維持した。細胞を加湿した５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気中３７℃で増殖させた。
【００９２】
ＥｐＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰレポーター遺伝子の構築
４１ｂｐ ＥｐＲＥモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチドをアニールし、精製し、次いで、１２３ｂｐチミジン−キナーゼ（ＴＫ）プロモーターフラグメントを用いるかまたは用いずにｐＥＧＦＰのマルチプルクローニングサイト中に挿入し、各々、ＥｐＲＥ／ＴＫ／ｐＥＧＦＰおよびＴＫ／ｐＥＧＦＰ構築物を作成した。４１ｂｐ ＥｐＲＥをコンカテマー化することによって、複数のＥｐＲＥモチーフコピーをまた、ｐＥＧＦＰ中にサブクローン化した。構築されたプラスミドをＱｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）によって精製し、その配列を制限分析および配列決定によって確認し、それは、プラスミドがＥｐＲＥおよび／またはＴＫをセンス方向で含有したことを示した。
【００９３】
トランスフェクションアッセイ
ＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクションの２４時間前に１０５細胞／６０ｍｍプレート密度で播種した。リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｎｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用い、製造者の説明書にしたがって、細胞を２ｍｇのＥｐＲＥ／ＴＫ／ｐＥＧＦＰまたはＴＫ／ｐＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした。１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）に耐性のクローンを単離した。２−３週間後、顕微鏡を用いてコロニーを拾い、膨張のために２４−ウェルプレートのウェル中に移した。
【００９４】
ＧＦＰの測定およびスクリーニング方法
ＨｅｐＧ２細胞（５ｘ１０４）を黒色の透明底面の組織培養表面９６−ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）のウェル中に播種してバックグラウンド蛍光を最小限にし、次いで２４時間後、既知の化学物質または試験化合物でさらに２４時間処理した。ＤＩＶＥＲＳｅｔ化学ライブラリー化合物は、１００１／４ｇ／ウェルで９６ウェルプレート中の乾燥フィルムとして包装され；シュリンク包装カバーを除去後、それらを直接、ウェルあたり１００１／４ｌのＤＭＳＯ中に溶解し、次いで、化合物溶液の一部をさらに、細胞培養培地を用いて希釈プレート中で希釈した。ＨｅｐＧ２細胞ウェル中における試験化合物の最終濃度は、約５０１／４Ｍであった。試験化合物に使用される平均分子量は３００であった。正の対照としてｂ−ＮＦおよびｔＢＨＱを各々、１０１／４Ｍおよび９０１／４ＭでＨｅｐＧ２プレートのウェルに加えた。ＤＭＳＯを単独で対照培養物に加え、その濃度は決して正対照において０．１％および試験化合物ウェルにおいて１．６％を越えなかった。化合物への曝露の２４時間後、培地を除去し、２００ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌＥｔＢｒを含有するＰＢＳを加えてＨｅｐＧ２細胞を室温で２０分間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、２００ｍｌのＰＢＳをウェルに加えた後、蛍光を測定した。ＧＦＰまたはＥｔＢｒ蛍光の測定は、蛍光ミクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用い、各々、４８５ｎｍ／５３０ｎｍおよび４８５ｎｍ／６１２ｎｍの励起／発光を用いて行った。獲得したデータを直接、直接的データ分析のためにエクセルコンピューターファイルに移した。
【００９５】
結果：
レポーター遺伝子の構築およびトランスフェクション
該スクリーニング系のために構築されたレポーター遺伝子において、ＥｐＲＥ調節エレメントおよびＴＫプロモーターをＧＦＰレポーター遺伝子の前に挿入した。化学予防（ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）薬曝露に起因する刺激に対するレポーター遺伝子の感受性を高めるために、ＥｐＲＥエレメントの増加コピー数を含有する構築物も作成し、１Ｘ、２Ｘおよび４Ｘコピーの４１ｂｐ ＥｐＲＥインサートを含有した（図８）。該スクリーニング系における基本的仮定は、ＥｐＲＥを活性化する化学予防分子に細胞を曝露するとき、遺伝子発現の増加の程度を反映する細胞内ＧＦＰのレベルが試験化合物の誘導能力を反映するということである。該試験系の構築への最終工程において、基底のおよび誘導された安定なＧＦＰ発現を示すトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞クローンを単離し、その後のスクリーニング工程に用いた。
【００９６】
ＨｅｐＧ２細胞におけるＧＦＰの基底および誘導可能レベル
異なるコピー数のＥｐＲＥと共に安定にレポーター遺伝子を運搬したＨｅｐＧ２細胞クローンにおけるＧＦＰの基底および誘導可能な発現レベルを図２に示す。該実験において、発明者らは、ＥｐＲＥ−依存性遺伝子の発現の強力な誘導剤であることが以前に示されていたので（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＆ Ｆａｈｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９４： ５３６１−５３６６， １９９７）、ｔＢＨＱ、ＢＨＡの１次代謝産物の一つを誘導分子として使用した。ｔＢＨＱの代謝的形成は、一般に、ＢＨＡの抗発癌効果の原因となる工程であると考えられる。親のＨｅｐＧ２細胞とＧＦＰレポーター遺伝子を安定に発現した選択されたクローンのいずれかとの間の細胞増殖率において、識別可能な差異はなかった。４ｘＥｐＲＥレポーター遺伝子を有する２４個の独立したクローンにおいて基底のおよび誘導されたＧＦＰレベルを測定後、ＧＦＰの最も高い誘導可能な発現を有するコロニーおよび最も低い基底レベルをその後の化学ライブラリースクリーニングアッセイに用いた。
【００９７】
内部標準としてのＤＮＡ含量
既知の化学予防分子およびライブラリー試験化合物はある濃度で毒性になり、かくして、薬物曝露が２日を超えると、試験プレートの所定のウェル中の細胞増殖を抑制するので、観察されたＧＦＰレベルを各ミクロタイターウェル中の細胞数の何らかのインジケーターに標準化することが望まれた。各ウェルのＤＮＡ含量を測定することが内部細胞標準として採用された。スクリーニングの単純性を維持することを最初の目標として、発明者らは、ＧＦＰ発光波長の重複および細胞ＤＮＡ含量を検出するために用いられる他の利用可能な方法を考慮したとき、ＤＮＡ含量の迅速な定量測定のための挿入分子ＥｔＢｒのＤＮＡ染色能を用いることに決定した。蛍光ミクロプレートリーダーにおいて励起／発光波長を切り換えることによってＥｔＢｒシグナルのみを測定することは、非常に容易であった。相関分析は、ＥｔＢｒ強度と細胞数との間に優秀な相関があることを示した（図１０、ｒ＝０．９）。したがって、各標準および試験化合物のＧＦＰ発現レベルは、各ウェルにおいて見出されたＥｔＢｒ蛍光レベルに標準化されて、細胞あたりの最終ＧＦＰ値を与えた。
【００９８】
ＧＦＰの発現レベルは既知の化学予防分子によって有意に増加する
新規な化学予防分子を同定するために該細胞を基礎とするアッセイを用いることができることを明らかにするために、発明者らは、現在研究されている化学予防分子のうちいくつかを試験して、その検出において該スクリーニング系がどの程度感受性であるかを測定した。第一の工程として、ｔＢＨＱ処理後のＧＦＰ応答の用量および時間依存を決定した（図１１）。９０ｍＭ ｔＢＨＱまたは１０ｍＭ ｂ−ＮＦで２４時間処理したＨｅｐＧ２レポーター細胞に見られる緑色蛍光のレベルを蛍光画像において示す（図５）。８個の異なる分子についてのレポーター遺伝子発現の用量依存誘導を示すプロフィールを図１２に示す。ｂ−ＮＦは二官能性誘導剤であり、それは、第Ｉ相およびＩＩ相薬物代謝遺伝子の調節の研究において幅広く使用されてきた。ＢＨＡ、合成フェノール性抗酸化剤は、食物保存料として幅広く使用されている。ＢＨＡのより多くの用量の食事投与もまた、種々の化学発癌物質に対する保護を与えることが見出され、該効果は、げっ歯動物において多くの第ＩＩ相解毒酵素、例えば、ＧＳＴ、エポキシドヒドロラーゼ、およびＮＱＯ１の誘導に起因した（Ｂｅｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３８（１２）： ４４８６−９５， １９７８； Ｂｅｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ５２１６−２０， １９８０）。ブロッコリーから単離されたスルフォラフェンは、第ＩＩ相解毒酵素の既知の誘導剤であり、ラットにおいて発癌物質に誘導される乳癌を阻害することが見出された（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ，． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： ３１４７−５０， １９９４； Ｆａｈｅｙ ＆ Ｔａｌａｌａｙ， Ｆｏｏｄ ＆ Ｃｈｅｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ３７： ９７３−９， １９９９）。オルチプラズ、置換１，２−ジチオール−３−チオンである抗−住血虫薬分子は、多くのげっ歯動物組織において発癌性物質の有効な阻害剤であり、ヒトおよびげっ歯動物の両方において第ＩＩ相酵素のイン・ビボでの有効な誘導剤である（Ｃｌａｐｐｅｒ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ７８： １７−２７， １９９８）。
【００９９】
化学ライブラリーのスクリーニング
化学予防誘導化合物を同定するためのレポーターアッセイの能力の直接的試験において、発明者らは、記載のラピッドスクリーニングアッセイを用いて化学ライブラリーをスクリーンした。図７は、コンピューター分析によって処理された典型的な３Ｄグラフを示し、典型的なスクリーニングプレート上での試験化合物ならびに正および負の対照各々の誘導能力を示す。ｂ−ＮＦ正対照について見られたよりも１．６倍大きい誘導されたＧＦＰ発現を示すスクリーニングアッセイにおけるヒット（化合物＃０９Ｇ０６）が同定され、図１４に示される。
【０１００】
実施例５
アルキル化化学療法剤の毒性作用から哺乳動物上皮細胞を保護するためにリポソーム中に入れられたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの使用
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、細胞中で二量体として存在し、サブユニット分子量が約２２−３０ｋＤａの範囲であり、細胞膜を横切ることができない。したがって、ＧＳＴの標的細胞への細胞内デリバリーのための機構は、アルキル化剤処理の過程の間中、その保護効果を増強する必要がある。
【０１０１】
リポソームは、薬物、免疫原性蛋白質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび酵素のイン・ビボおよび培養細胞中へのデリバリーに適当な無毒性ビヒクルであることが知られている。該実施例において、発明者らは、大量のＧＳＴを哺乳動物細胞中へ導入するための有効なデリバリー機構としてのリポソームの有用性、および該処理によって与えられるアルキル化化学療法剤の有害な影響からの保護を明らかにする。
【０１０２】
哺乳動物細胞の細胞質中へのＧＳＴの有効なデリバリーの媒介となるカチオン性ｐＨ感受性リポソームの使用を下記する。該研究は、培養哺乳動物上皮細胞、薬物毒性からの保護を細胞に与えることにおけるリポソーム中に入れられた解毒蛋白質の有効性を試験するための適当なモデル系を用いて行われた。
【０１０３】
材料および方法
リポソームの調製
ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオキシルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール（ＤＯＳＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール（ＤＰＳＧ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ）から入手した。ラット肝臓グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入した。
【０１０４】
脂質薄層は、アルゴンガス下、クロロホルム溶液中において脂質を回転蒸発させることによって作成された。大きな多重層小胞は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２−５ｍｇの精製ラット肝臓ＧＳＴまたはＦＩＴＣ−結合型ラット肝臓ＧＳＴ（２００ｎｇ）を含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中において乾燥脂質薄層を水和（ボルテックス混合）することによって調製された。バッファー温度は、リン脂質のゲルから液体−結晶相への移行温度を約１０℃上回った温度で維持された。５０ｍｇ／ｍｌバッファーの脂質濃度が一般に使用された。冷凍および解凍された多重層小胞は、大きな多重層小胞を液体窒素中で上方から冷凍し、水和に使用するのと同じ温度で水浴中で試料を解凍することによって得られた。
【０１０５】
冷凍および解凍された大きな多重層小胞は、高温での押出を可能にする循環性水浴に取りつけられた１０ｍｌ水−ジャケット化バレルを装備したステンレススチール押し出し装置を用いて押し出された（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， ＢＣ）。小胞は、押出前に適温で少なくとも１５分間平衡化された。押出は、８００ｐｓｉまでの窒素圧にて直径１００−４００ｎｍ範囲の孔サイズの２つのポリカーボネートフィルターを通過させて行った。調製物は使用前に押出機により１０回繰り返しサイクルに付された。
得られたリポソームは、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ−１５ｍゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， ＣＡ）カラム（２０ｃｍ長さｘ２ｃｍ直径）上でのゲルろ過によって被包されていないＧＳＴから分離された。リポソームを含有するフラクションをｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５００濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， ＭＡ）上で３０分間スピンすることによって濃縮した。
【０１０６】
リポソームの細胞取り込み
ＣＯＳ−７およびＡＧＳ細胞の単層を、５０ｍｍ培養皿中における高グルコースのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）胎仔ウシ血清中、３７℃で増殖させた。リポソーム曝露前に、細胞単層をＤＭＥＭで２回洗浄した。次いで、細胞をリポソームを含有する培地中において３７℃で種々の時間（０．５−５時間）インキュベートした。細胞単層をＰＢＳ（リン酸緩衝化セーライン）で４回洗浄した。リポソーム中のＦＩＴＣ標識したＧＳＴの細胞による取り込みを定量的に測定するために、細胞単層をＰＢＳで徹底的に洗浄し、培養皿をこすり落とし、１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）中で溶解した。エッペンドルフ遠心機中で１０分間遠心分離後、細胞抽出物の透明になった上清を保持した。次いで、該サイトソル抽出物に関連する蛍光を蛍光分光光度計を用いて測定し、既知量のＦＩＴＣ標識ラット肝臓ＧＳＴで得られた標準曲線に基づいて内在化された単位ＦＩＴＣ−ＧＳＴに換算した。
【０１０７】
ＧＳＴ含有細胞の抗新生物薬への暴露
ＣＯＳ−７またはＡＧＳ細胞を９６ウェルプレート中に播種し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補足した高グルコースのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＨＧ）中で一晩増殖させた。次の日、細胞を血清不含ＤＭＥＭ−ＨＧで洗浄した。ＤＭＥＭ−ＨＧ中のリポソームを細胞単層に加え、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ−ＨＧで単層を洗浄して、遊離のリポソームを除去した。抗新生物薬メルファランを１０％ＦＢＳを所望の濃度で含有するフェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＨＧ中で希釈し、細胞単層に加えた。次いで、マルチウェルプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション期間の完了時、薬物含有培地を除去し、細胞をフェノールレッド不含およびＦＢＳ不含のＤＭＥＭ−ＨＧで洗浄して残留している血清を除去した。細胞増殖は、生存細胞による可溶性黄色染料ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃｌａｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ））の不溶性紫色沈殿物への変換を測定することにとって評価された。ＭＴＴをＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌで溶解し、２０μｍフィルターを通過させて不純物を除去した。ＭＴＴストック溶液をフェノールレッド不含ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ−ＨＧ中に１：４希釈し、２００μｌの該希釈液をプレートの各ウェルに加えた。プレートは暗所中３７℃で４時間インキュベートし、次いで、吸い取ってＭＴＴ溶液を除去した。変換した染料を２００μｌの酸性イソプロパノール（５００ｍｌイソプロパノール中における１．６ｍｌ濃ＨＣｌ）のプレートの各ウェルへの添加によって可溶化した。変換した染料の吸光度を、６９０ｎｍでバックグラウンドを引き算して５７０ｎｍ波長で測定した。
【０１０８】
結果
リポソーム中に入れられた解毒蛋白質の細胞へのデリバリー
解毒蛋白質の細胞へのデリバリーの効率をサイトソル中に見出された標識蛋白質の蛍光を定量することによって評価した。細胞は、ＰＣリポソームを用いた場合、リポソームを用いなかった場合よりも約６０−１７５％多くの蛍光標識した蛋白質を受け取った。カチオン性リポソーム（ＰＣ＋ＤＯＴＡＰ）によるデリバリーは、ＰＣリポソームによるデリバリーと比較して約６から８倍の蛍光増加をもたらした。
【０１０９】
リポソーム中に入れられた解毒蛋白質への曝露による細胞の保護
ＣＳＯ細胞のリポソーム中に入れられたＧＳＴとのインキュベーションおよびその後のメルファラン、アルキル化抗新生物剤での処理は、細胞に保護を与えた。高ＭＴＴ吸光度は細胞死の低い割合に相関する。リポソーム中に入れられたＧＳＴで処理されなかった細胞は、リポソーム中に入れられたＧＳＴで前処理された細胞の約２から２５倍低いＭＴＴ吸光度を有した。
【０１１０】
これらの結果は、抗新生物剤への曝露前のＧＳＴ含有リポソームでの上皮細胞の前処理が、これらの薬剤の細胞毒性作用に対して細胞を保護することを明らかにする。ＧＳＴを単独で用いる細胞の保護における成功を考慮して、さらに、ＧＳＴの活性率を増加させるために基質の付加的な供給を提供することによって、ＧＳＴおよびグルタチオンの両方を含むリポソームが、アルキル化化学療法剤の毒性作用から細胞を保護することにおいてよりいっそう有効であることが予測される。
【０１１１】
実施例６
胃腸上皮を標的とするためのリポソームの修飾
消化管の設定において、上皮細胞表面へのリポソームの付着を可能にするための付加的な手段の組み込みは、リポソーム内容物のこれらの細胞へのデリバリーを容易にしたであろう。胃および小腸上部の内面を覆う管腔上皮細胞に関するリポソームの特異性を増加するために、コレラ毒Ｂ（ＣＴＢ）サブユニットをリポソームの表面に共有結合させてもよい。リポソーム表面に結合したＣＴＢサブユニットを有するリポソームは、Ｍ１ガングリオシド受容体分子をその表面に発現する細胞に特異的に結合する。通常、該細胞表面分子を発現する細胞は、胃および小腸上部の内面を覆う管腔上皮細胞を包含する。これは、コレラ細菌細胞が自然感染においてこれらの細胞に結合するという手段である。コレラ毒のＢサブユニットは、Ｍ１ガングリオシド受容体結合を与えるが、Ａサブユニットの不在下では毒性を与えない。
【０１１２】
材料および方法
コレラ毒Ｂサブユニットへの抱合のためのリポソーム調製物
精製ラット肝臓ＧＳＴおよび微量ＦＩＴＣ結合型ラット肝臓ＧＳＴを含有するリポソームを、脂質：ホスファチジルコリン（ＰＣ）：ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［４］−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（Ｎ−ＭＢＰ−ＰＥ）、７０：２０：１０モル％の混合物を用いて、実施例１に記載の標準的な押出プロトコールによって調製および精製した。
【０１１３】
リポソームへの架橋のためのコレラ毒Ｂサブユニット（ＣＴＢ）の化学修飾
第一アミン反応試薬を用いてチオール基をＣＴＢのリジン残基に付加した。チオール基は、Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ含有リポソーム上のマレイミド基との反応に必要であった。これを達成するために、ＣＴＢ（１００μｇ）をＨＥＰＥＳ−セーラインバッファー中に溶解し、暗所中、室温にて１時間、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＦ）と一緒に１：１００モル比でインキュベートした。１０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中における２０ｍＭ Ｌ−リジンを加えることによって反応をクエンチし、次いで、反応産物を５μｌの水中における７．７ｍｇ／ｍｌジチオトレイトールを加えることによって還元した。反応混合物をサイズ排除Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを通過させることにより、反応しなかった基質を除去した。排除したフラクション中における活性化ＣＴＢの濃度をクーマシー蛋白質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）によって測定した。
【０１１４】
活性化ＣＴＢのリポソームへの架橋
ＧＳＴおよび微量ＦＩＴＣ結合型ＧＳＴを含有するリポソームへの活性化ＣＴＢの抱合は、還元したＣＴＢ（５０μｇ）を１ｍＬ Ｎ−ＭＢＰ−ＰＥ含有リポソームの懸濁液と一緒に５℃で一晩インキュベートすることによって行った。１０μｌのＬ−システインバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．２中における２０ｍＭ Ｌ−システイン）を加えることによってカップリング反応を止めた。ＣＴＢ抱合型リポソームをＨＥＰＥＳ−セーラインバッファーで予め平衡化したサイズ排除ゲルろ過カラム（Ｂｉｏｇｅｌ−Ａ−１５ｍゲル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＣＡ； １５ｃｍ長さｘ２ｃｍ直径）上で非抱合型ＣＴＢから精製した。リポソームを０．５ｍｌフラクション中において溶出し、各フラクションのリポソーム含量を蛍光およびＧＳＴ活性によって測定した。リポソーム含有フラクションをプールし（フラクション番号５−９）、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ５００濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて１０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって１ｍｌに濃縮した。
【０１１５】
ＣＴＢリポソームの細胞取り込み
細胞（６ｘ１０６ＨｕＴｕまたはＣＯＳ細胞）を６０ｍｍ皿に播種し、１０％ＣＯ２の加湿雰囲気中、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）を補足した高グルコースのＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ ｗ／ＨＧ）中において一晩、増殖させた。次いで、単層を５ｍｌのＤＭＥＭ ｗ／ＨＧ＋ＨＥＰＥＳセーライン（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。ＣＴＢ抱合型リポソームのＧＭ１ガングリオシド受容体を有する細胞へ特異的に結合できる能力を試験するために、いくつかの皿をＧＭ１ガングリオシド受容体の市販の試料（２０μｇ）で１０分間前処理した。ＣＴＢ抱合型リポソームの１００μｌ試料（ＦＩＴＣ結合型ＧＳＴの５０００蛍光単位を含有する）を５ｍｌ ＤＭＥＭ ｗ／ＨＧ＋ＨＥＰＥＳセーラインバッファーと一緒に各単層に加え、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、細胞単層を５ｍｌ ＰＢＳで４回洗浄して、結合しなかったＣＴＢ抱合型リポソームを除去した。細胞に結合した／内在化したＣＴＢ抱合型リポソームの量は、まず、細胞を培養皿からこすり落とし、０．３ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、３０秒間超音波処理することによって定量した。各細胞溶解物の２０μｌアリコートを２ｍｌのＰＢＳに加え、細胞に関連する蛍光の量を蛍光計において測定した（励起／発光最大４９４／５２０ｎｍ）。細胞溶解物中における蛋白質の濃度は、クーマシー蛋白質推定キットを用いて決定された。
【０１１６】
結果：
リポソーム表面に結合したＣＴＢサブユニットを有するリポソームの使用は、腎臓細管上皮細胞（ＣＯＳ細胞）へではなく、胃腸癌細胞（ＨｕＴｕ細胞）への標識蛋白質のデリバリーの増加をもたらした。ＣＴＢサブユニットによって与えられた効率の増加は、過剰の遊離Ｍ１ガングリオシド受容体の存在下でクエンチされた。これらの結果は、リポソームがＣＴＢサブユニットのその表面への組み込みによって、胃腸上皮の細胞を標的とするように有効に修飾されることを明らかにする。
【０１１７】
実施例７
化学療法誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおける化学保護誘導剤のさらなる試験
該実施例に示される実験は、化学療法誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおいて種々の化学保護誘導剤の効力を試験するために設計された。
【０１１８】
材料および方法
仔ラットを有する泌乳性スプレーグ・ドーリー母ラットをＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）から購入した。全ての化学保護誘導化合物はＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。それらを、もともとＨｕｓｓｅｉｎ Ａ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ： ２４９， １５６４ （１９９０）によって記載された、実施例１に記載の化学療法誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおいて試験した。シトキサン（ＣＴＸ）によって誘導される脱毛症を生ずるために、７ないし１０日齢の仔ラットにリン酸緩衝化セーライン中で調製された３５ｍｇ／ｍｌのＣＴＸを腹腔内注射した。化学保護誘導剤は、１００％エタノールよりなるデリバリービヒクル中で調製した。エタノール中における化学保護剤の５０−１５０μｌを仔の背中に１日１回、ＣＴＸ攻撃の前後に局所投与した。特に、仔は、ＣＴＸ攻撃前の５日間、ＣＴＸ攻撃日の数時間前、およびその後５日間、毎日１回処理された。デリバリービヒクル対照の仔は、エタノールのみを与えられた。ＣＴＸ処理の約７ないし１０日後、仔を脱毛症の存在について評価した。体毛喪失は、Ｃｈｅｎ Ｇ．ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ： ７５， ３０３ （１９９８）によって記載された修飾脱毛症スコアリング指標を用いて評価された。スコア０＝体毛喪失なし；スコア１＝１０−３０％体毛喪失；スコア２＝４０−６０％体毛喪失；スコア３＝７０−９０％体毛喪失；およびスコア４＝１００％体毛喪失。
【０１１９】
結果
第ＩおよびＩＩ相解毒分子のいくつかの誘導剤は、仔ラットにおけるＣＴＸ誘導性脱毛症モデルにおいて体毛喪失の予防に有効であることが見出された。化学療法誘導性仔ラットモデルにおいて異なる誘導化学保護剤を用いる結果を下記の表に示す。表１は、１０ｍＭの単一濃度で投与された化学保護誘導剤の結果を示す。わかるように、該濃度にて、いくつかの化合物は他よりも大きな効力を示した。しかしながら、投与量または担体ビヒクルの改変の効果は、これらの実験において試験されなかった。これらのパラメーターのいずれかにおける変化は、エタノール中１０ｍＭにて送達されたあまり有効ではない薬剤の効力に影響を及ぼすことができた。
【０１２０】
【表１】
表２における結果は、レスベラトロールおよびリモネンのような、細胞増殖の阻害のような他の生物学的効果を誘導することができるある特定の第ＩＩ相誘導剤もまた、脱毛症モデルにおける体毛喪失の保護において非常に有効であったことを示す。表３の結果は、異なる濃度のレスベラトロールを用いるときの動物モデルにおける用量応答を明らかにする。５０ｍＭの局所的レスベラトロール用量は、ＣＴＸ攻撃後の仔ラットにおける脱毛症の予防に非常に有効であった。投与量が低ければ低いほど、脱毛症の予防に対する効力が減少することが見出された。
【０１２２】
【表２】
【表３】
実施例８
第Ｉ−ＩＩ相化学保護誘導剤での処理は化学療法誘導性脱毛症モデルにおいて異なる化学療法剤に対して有効である
β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）は、異なる化学療法剤を用いる脱毛症仔ラットモデルにおける体毛喪失の予防に有効であることが見出された。結果を表４に示す。仔は、シトキサン（３５ｍｇ／ｋｇ）またはシタラビン（１５ｍｇ／ｋｇ）またはドクソルビシン（２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの単一投与量を６日間、１日１回投与で与えられた。仔は１日１回局所的に、実施例１に記載のように調製された非イオン性リポソームビヒクル中における１０ｍＭのβ−ＮＦで処理された。非処理の仔を対照とした。シタラビンおよびドクソルビシン処理の仔の場合、β−ＮＦ処理を化学療法処理期間の間中、行った。シトキサン処理の仔の場合、β−ＮＦをシトキサン処理前の２日間および処理後の６日間投与した。β−ＮＦ処理の終了後の２日間、Ｃｈｅｎらによって記載されたスケールを用いて脱毛症の程度をスコア付した。β−ＮＦは、３つ（シトキサン、シタラビンおよびドクソルビシン）の化学療法の全てに対して仔ラットにおける体毛喪失を有効に予防することが見出された。非処理の仔は全て、重篤な体毛喪失を生じ、全て、脱毛症スコアは４であった（１００％体毛喪失）。全体的に、結果は、β−ＮＦのような単一の化学保護剤が異なる作用様式を有する複数の化学療法剤に対して有効でありうることを示す。
【０１２５】
【表４】
実施例９
放射線誘導性脱毛症の仔ラットモデルにおける化学保護誘導剤処理
化学保護誘導剤処理が放射線誘導性脱毛症を有効に予防できたかどうかを決定するために、β−ＮＦで局所処理した仔ラットを次いで、脱毛症を誘導するレベルで全身放射線に曝露した。Ｍａｒｋ Ｉ、Ｍｏｄｅｌ ３０、Ｃｓ１３７イラジエーター（Ｊ．Ｌ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いてスプレーグ・ドーリー仔ラットを照射した。２、５および７．５Ｇｙ（１グレイ（Ｇｙ）＝１００ｍｒｅｍ）での最初の全身放射線線量応答研究は、７．５Ｇｙの線量が照射された仔の背中に脱毛症を有効に引き起こしたことを示した。仔は、７．５Ｇｙでの放射能攻撃の前に、非イオン性リポソームデリバリービヒクル中における１０ｍＭ β−ＮＦで６日間、１日１回局所的に処理された。非処理の仔を対照とした。照射の７日後に、仔における脱毛症の程度をＣｈｅｎらによって記載されたスコアリングスケールを用いて評価した。結果を表５に示す。β−ナフトフラボンは、仔ラットにおいて放射線誘導性脱毛症の予防に有効であることが見出された。７．５Ｇｙに曝露された非処理の子の背中は、７日後に完全に禿げた。対照的に、β−ＮＦでの処理は、仔における重篤な体毛喪失を予防した。これらの結果は、局所的化学保護剤が放射線誘導性脱毛症を有効に予防できることを示す。
【０１２７】
【表５】
本発明は、上記に記載および例示された具体例に限定されないが、付随の特許請求の範囲の範囲から逸脱することのない変更および修飾が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】シトキサンで処理した仔ラットにおける体毛喪失に対する化学保護誘導剤の効果。化学保護剤は、脂質小滴懸濁またはＤＭＳＯ中においてデリバリー用に調製された（実施例１）。上方挿入図：実験プロトコール（実施例１）；下方挿入図：異なる化学保護誘導剤で前処理したシトキサン処理仔ラットにおける体毛密度を示すヒストグラム；写真（左から右へ、上方から下方へ）：対照（シトキサンまたは化学保護誘導剤で処理されない）；シトキサン処理した；シトキサン処理し、かつ、（１）β−ＮＦで前処理した（３つのパネル）、（２）オルチプラズで前処理した（２つのパネル）、（３）ＢＨＡで前処理した（１つのパネル）、（４）ｔＢＨＱで前処理した（１つのパネル）、（５）スルフォラフェンで前処理した（１つのパネル）および（６）ＣＧ０９で前処理した（２つのパネル）。
【図２】シトキサンで処理した仔ラットにおける体毛喪失に対する化学保護誘導剤の効果。化学保護誘導剤は、ミノキシジルのデリバリーに用いられた型のプロピレングリコール：エタノール：水混合物中においてデリバリー用に調製された（実施例１）。結果は、ミノキシジル担体が化学保護誘導剤のデリバリーにおいて効果的でなかったことを示す。ミノキシジル担体中のＣＧ０９またはβ−ＮＦで処理した仔ラットは、化学保護誘導剤で前処理されなかったシトキサン処理動物において観察されたのと同等の体毛喪失を被った。
【図３】β−ＮＦおよびシトキサンで処理した仔ラットにおけるストレス遺伝子の遺伝子発現パターン。仔ラットは、担体のみ（対照）、シトキサン、またはβ−ＮＦのいずれかで処理された。異なる時間間隔にて、試料を収集し、ｃＤＮＡ試料を試料から抽出したｍＲＮＡから調製した。合成された放射能標識ｃＤＮＡを用いて、製造者のプロトコールにしたがい、２０７個のストレス関連遺伝子よりなるラットストレス遺伝子ｃＤＮＡ発現アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプローブした。
【図４】２つのリポソーム処方で処理したラットにおける外来性ルシフェラーゼの発現を示すヒストグラム。非イオン性（ＮＩ）リポソームまたはＮＩ＋ＤＯＴＡＰを２５０μｇルシフェラーゼＤＮＡおよび２５０μｇβ−ガラクトシダーゼＤＮＡを包むように処方した。ルシフェラーゼ活性をリポソーム処方の投与後０、４、８、１６および２４時間で測定した。
【図５】異なるリポソーム処方で処理したラットにおける外来性β−ガラクトシダーゼ活性の発現を示すヒストグラム（実施例２）。リポソームまたは他の担体を２５０μｇルシフェラーゼＤＮＡおよび２５０μｇβ−ガラクトシダーゼＤＮＡを包むように処方した。ルシフェラーゼ活性を該処方の投与後０、４、８、１６および２４時間で測定した。
【図６】ラットの皮膚細胞における発現が毎日のβ−ＮＦ／非イオン性リポソームエマルジョンの皮膚への塗布後１−６（β−ＮＦ１−β−ＮＦ６）日で誘導される、ラットにおける一連の遺伝子の発現を示すヒストグラム。バーは、左から右へ、対照およびβ−ＮＦ１−β−ＮＦ６を示す。
【図７】ラットの皮膚細胞における発現が毎日のβ−ＮＦ／非イオン性リポソームエマルジョンの皮膚への塗布後５日で誘導される、ラットにおける一連の遺伝子の発現を示すヒストグラム。１回のシトキサンの腹腔内注射後の遺伝子発現と比較する。左から右へ、対照、シトキサン、βＮＦ。
【図８】ＧＦＰレポータープラスミドの構築。単一またはコンカテマー化した４１ｂｐ ＥｐＲＥモチーフおよび／またはＴＫプロモーターフラグメントを含有するフラグメントをＧＦＰベクター中のマルチプルクローニングサイト中に挿入した。
【図９】示されるＧＦＰレポーター遺伝子を安定に有するＨｅｐＧ２細胞クローンにおけるＧＦＰ発現の基底および誘導レベル。細胞を９０ｍＭ ｔＢＨＱで２４時間、または対照としてＤＭＳＯ（０．１％最終濃度）で処理した。細胞は下記の発現遺伝子を有したた：ＴＫ−ＧＦＰ、１ｘＥｐＲＥ／ＴＫ−ＧＦＰ、２ｘＥｐＲＥ／ＴＫ−ＧＦＰ、４ｘＥｐＲＥ／ＴＫ−ＧＦＰ。ＧＦＰ発現レベルは、蛍光プレートリーダーを用いて測定された。値は平均±Ｓ．Ｄ．として示される。
【図１０】播種された細胞数とＥｔＢｒまたはＧＦＰ蛍光に基づくウェル中のＤＮＡ含量との間の相関。ウェルあたりの蛍光強度を実施例４に記載のように測定した。値は３つの測定値の平均±Ｓ．Ｄ．として示される。
【図１１】ｔＢＨＱ処理したＨｅｐＧ２細胞中でのＧＦＰ発現の時間および用量依存。組み込まれた４ｘＥｐＲＥ／ＴＫレポーター構築物を有する細胞を（Ａ）９０ｍＭ ｔＢＨＱで所定の時間、または（Ｂ）所定のｔＢＨＱ濃度で２４時間処理した。ＧＦＰ発現レベルは、蛍光プレートリーダーを用いて測定された。値は３つの測定値の平均±Ｓ．Ｄ．として示される。
【図１２】既知の化学予防誘導分子によるＧＦＰ発現の用量依存性誘導。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルミクロタイタープレート（５ｘ１０４細胞／ウェル）中に２４時間播種し、次いで、材料および方法に記載のように、所定の化学物質で処理した。データは３つの平行培養の平均±ＳＤとして示される。相対蛍光強度率を対照皿を１として算出した。
【図１３】試験プレートから得られ、正の対照（ｔＢＨＱ、レーン１およびｂ−ＮＦ、レーン１２）および各試験化合物の誘導レベルを示すためにコンピューターによって分析された蛍光データを示すスクリーニング試験由来の典型的な３Ｄグラフ。化合物ＣＧ０９をレーン６に示す。
【図１４】既知の誘導剤および化学ライブラリースクリーニング由来のヒット化合物（０９Ｇ０６）の両方から誘導されたＧＦＰ発現のレベル。データは３つの測定値の平均±ＳＤとして示される。
【図１５】化学保護誘導活性を展示するＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリー由来のある特定の分子の構造。化合物ＣＧ０９は構造１である。
Claims (81)
- 少なくとも１種の化学保護誘導剤および化学保護誘導剤を非新生物細胞へ送達するためのデリバリービヒクルを含む、化学療法剤または放射線療法の毒性作用から非新生物細胞を保護するための組成物。
- 非新生物細胞が上皮細胞である請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤がβ−ナフトフラボン（β−ＮＦ）である請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤が図１５に示す構造を有するＣＧ０９である請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤がベンジルイソチオシアネートである請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤がフェネチルイソチオシアネートである請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤がオルチプラズである請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤が２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソールである請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤が第Ｉ相または第ＩＩ相薬物代謝酵素の生産を誘導または増加させる請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤が解毒遺伝子産物の生産を誘導または増加させる請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤が抗増殖剤でもある請求項１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤が３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンである請求項１１記載の組成物。
- 化学保護誘導剤が（Ｒ）−（＋）−リモネンである請求項１１記載の組成物。
- デリバリービヒクルがリポソーム、脂質小滴エマルジョン、油、ポリオキシエチレンエーテルの水性エマルジョン、水性アルコール混合物、プロピレングリコールを含有する水性エタノール混合物、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリンおよびトリグリセリドを含有する水性エタノール混合物、および生物分解性微粒子よりなる群から選択される請求項１記載の組成物。
- デリバリービヒクルが非イオン性リポソームを含み、プロピレングリコールを含有する水性タノール性混合物を任意に含む、局所投与用に処方された請求項１４記載の組成物。
- デリバリービヒクルが水性エタノール混合物を含む請求項１４記載の組成物。
- 癌治療または骨髄移植を受けている患者において化学療法剤または放射線療法の毒性作用から非新生物細胞を保護する方法であって、該患者に請求項１記載の組成物を含んでなる医薬調製物を、化学療法剤または放射線療法から患者の非新生物細胞を保護するのに十分な量および時間で投与することを特徴とする方法。
- 非新生物細胞が上皮細胞である請求項１７記載の方法。
- 医薬処方が経口、鼻腔内、局所、尿道膣、直腸、腹腔内、筋内および静脈内よりなる群から選択される経路によって投与される請求項１７記載の方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の少なくとも１日前の始めに投与される請求項１７記載の方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の過程の間中、投与される請求項１７記載の方法。
- （ａ）プロモーターおよび１以上のＥｐＲＥ調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物で形質転換された細胞を提供し；
（ｂ）該細胞を、その化学保護誘導活性について試験されるべき試験化合物に曝露し；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、ここに、試験化合物の不在下でのレポーター遺伝子の発現と比較した試験化合物の存在下でのレポーター遺伝子の発現の増加は、試験化合物が化学保護誘導剤であることを示している
ことを特徴とする、化学保護誘導剤を同定するためのアッセイ。 - リポーター遺伝子が緑色蛍光蛋白質をコードする請求項２２記載のアッセイ。
- ＤＮＡ構築物が複数のＥｐＲＥ調節エレメントを含む請求項２２記載のアッセイ。
- 細胞が哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞よりなる群から選択される型である請求項２２記載のアッセイ。
- 細胞がヒトＨｅｐＧ２細胞である請求項２５記載のアッセイ。
- ａ）プロモーターおよび１以上のＥｐＲＥ調節エレメントと作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物；および
ｂ）形質転換細胞中の該ＤＮＡ構築物を用いてアッセイを行うための説明書
を含有する容器を含む、化学保護誘導剤を同定するためのアッセイを行うためのキット。 - さらに１以上の
ａ）アッセイに使用するための細胞培養物；
ｂ）レポーター遺伝子の生産物を検出するための試薬；および
ｃ）細胞を培養するための試薬
を含む請求項２７記載のキット。 - 通常の食事摂生の一部として、１以上の化学保護誘導剤を細胞性解毒酵素の発現を刺激するのに十分な量で提供し、それにより、環境性発癌物質への曝露時に環境性発癌物質の影響から細胞を保護することを特徴とする、環境性発癌物質への細胞の曝露によって引き起こされる癌を予防する方法。
- 少なくとも１種の化学保護誘導剤および化学保護誘導剤を毛包の内面を覆う細胞へ送達するためのデリバリービヒクルを含む、化学療法剤または放射線療法での治療によって引き起こされる毛髪喪失を軽減または予防するための医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がβ−ナフトフラボン（β−ＮＦ）である請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が図１５に示される構造を有するＣＧ０９である請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がベンジルイソチオシアネートである請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がフェネチルイソチオシアネートである請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がオルチプラズである請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソールである請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が第Ｉ相または第ＩＩ相薬物代謝酵素の生産を誘導または増加させる請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が解毒遺伝子産物の生産を誘導または増加させる請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が抗増殖剤でもある請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンである請求項３９記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が（Ｒ）−（＋）−リモネンである請求項３９記載の医薬調製物。
- デリバリービヒクルが非イオン性リポソームを含む、局所投与用に処方された請求項３０記載の医薬調製物。
- デリバリービヒクルが非イオン性リポソームおよびプロピレングリコールを含有する水性エタノール性混合物の組み合わせを含む、局所デリバリー用に処方された請求項４２記載の医薬調製物。
- デリバリービヒクルが水性エタノール混合物を含む請求項３０記載の医薬調製物。
- 化学療法剤または放射線療法での治療によって引き起こされる毛髪喪失を軽減または予防するための方法であって、該患者に請求項３０記載の医薬調製物を、毛髪喪失を軽減または予防するのに十分な量および時間で投与することを特徴とする方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の少なくとも１日前の始めに投与される請求項４５記載の方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の過程の間中、投与される請求項４５記載の方法。
- 少なくとも１種の化学保護誘導剤および化学保護誘導剤を胃腸管の上皮細胞へ送達するためのデリバリービヒクルを含んでなる、化学療法剤または放射線療法によって引き起こされる胃腸の不快感を軽減または予防するための医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がβ−ナフトフラボン（β−ＮＦ）である請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が図１５に示される構造を有するＣＧ０９である請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がベンジルイソチオシアネートである請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がフェネチルイソチオシアネートである請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がオルチプラズである請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソールである請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が第Ｉ相またはＩＩ層薬物代謝酵素の生産を誘導または増加させる請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が解毒遺伝子産物の生産を誘導または増加させる請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が抗増殖剤でもある請求項４８記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンである請求項５７記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が（Ｒ）−（＋）−リモネンである請求項５７記載の医薬調製物。
- デリバリービヒクルがリポソーム、脂質小滴エマルジョン、油、ポリオキシエチレンエーテルの水性エマルジョン、水性エタノール混合物、プロピレングリコールを含有する水性エタノール混合物、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリンおよびトリグリセリドを含有する水性エタノール混合物、および生物分解性微粒子よりなる群から選択される請求項４８記載の医薬調製物。
- 癌治療または骨髄移植を受けている患者において化学療法剤または放射線療法によって引き起こされる胃腸の不快感を軽減または予防する方法であって、該患者に請求項４８記載の医薬調製物を、胃腸の不快感を軽減または予防するのに十分な量および時間で投与することを特徴とする方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の少なくとも１日前の始めに投与される請求項６１記載の方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の過程の間中、投与される請求項６１記載の方法。
- 少なくとも１種の化学保護誘導剤および化学保護誘導剤を皮膚細胞へ送達するためのデリバリービヒクルを含む、化学療法剤または放射線療法での治療によって引き起こされる皮膚または粘膜細胞への損傷を軽減または予防するための医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がβ―ナフトフラボン（β−ＮＦ）である請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が図１５に示される構造を有するＣＧ０９である請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がベンジルイソチオシアネートである請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がフェネチルイソチオシアネートである請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤がオルチプラズである請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソールである請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が第Ｉ相またはＩＩ相薬物代謝酵素の生産を誘導または増加させる請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が解毒遺伝子産物の生産を誘導または増加させる請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が抗増殖剤でもある請求項６４記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が３，４，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンである請求項７３記載の医薬調製物。
- 化学保護誘導剤が（Ｒ）−（＋）−リモネンである請求項７３記載の医薬調製物。
- デリバリービヒクルが非イオン性リポソームを含む、局所投与用に処方された請求項６４記載の医薬調製物。
- デリバリービヒクルが非イオン性リポソームおよびプロピレングリコールを含有する水性エタノール性混合物の組み合わせを含む、局所デリバリー用に処方された請求項７６記載の医薬調製物。
- デリバリービヒクルが水性エタノール混合物を含む請求項６４記載の医薬調製物。
- 癌治療または骨髄移植を受けている患者において化学療法剤または放射線療法での治療によって引き起こされる皮膚または粘膜細胞への損傷を軽減または予防する方法であって、該患者に請求項４３記載の医薬調製物を、皮膚または粘膜細胞への損傷を軽減または予防するのに十分な量および時間で投与することを特徴とする方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の少なくとも１日前の始めに投与される請求項７９記載の方法。
- 医薬調製物が化学療法または放射線療法の過程の間中、投与される請求項７９記載の方法。
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