JP2950520B2 - 毛胞に有益な配合物を送達する方法 - Google Patents

毛胞に有益な配合物を送達する方法

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JP2950520B2 JP6522428A JP52242894A JP2950520B2 JP 2950520 B2 JP2950520 B2 JP 2950520B2 JP 6522428 A JP6522428 A JP 6522428A JP 52242894 A JP52242894 A JP 52242894A JP 2950520 B2 JP2950520 B2 JP 2950520B2
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    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は毛胞からの毛髪の成長を改善するために毛
胞に特に治療用またはその他の有益な組成物を送達する
ための方法に関するものである。
発明の背景 毛髪の成長、色および外観、特に人間における脱毛症
の治療用に直接効果を持つ方法は、長い間その発見が望
まれてきたものである。
生育力のある毛胞を持つ皮膚の小片を、不活性な毛胞
を持つ領域に外科的に移植することは、高価につき、労
力を要し、比較的短期間しか有効でない。また、米国特
許第4,919,664号でR.F.Oliverらが示したように胞状皮
膚細胞は皮膚切開に挿入可能であり、その結果切開に沿
って毛髪が成長する。しかしながら、これは複雑な技術
であるうえに、既存の毛胞には何らの効果も持たない。
生物学的に活性な要素を含むクリームやローションで
毛髪や皮膚を処理し、これによって毛髪の成長と状態を
改善する方法は一般的に効率が良くない。毛髪に対して
外部的に塗布して本体、柔軟性、カールなどを改善する
様々な物質もある。これらの効果は限定されており、短
期間しか有効でない。様々な染料で毛髪を染める場合、
頻繁に繰り返して実施する必要があり、また、多くの場
合、不自然に見える。
毛髪の成長を刺激し、または他の毛髪の特徴、例えば
色に望ましい変化をもたらす生物学的に活性な化合物の
使用は、より自然であり、魅力的な手法である。特に、
毛髪の胞細胞がまだ存在しているにもかかわらず、未知
の理由によって毛髪の成長が阻止されているような場合
に、望ましい手法である。しかし、この手法は従来、効
を奏していなかったが、その理由は多分、刺激物が毛髪
の胞細胞の細胞膜を浸透してその活動が要求される細胞
内部に侵入することができなかったからである。
皮膚の処理を吸収可能なローションやその類のもので
行なう場合、胞密度の高い皮膚部分において吸収が良く
行なわれることが長いあいだ知られていた。例えば、Ma
igach et al.,Arch.Environ,Health,23:208−211（197
1）を参照。しかしながら、吸収された物質はリポソー
ムとは全く異なるものである。本発明以前においては、
リポソームが持つ有益な組成物を毛胞に選択的に送達す
る方法としての能力は利用されていなかった。
リポソームとは人工的なリン脂質分泌小胞で、多様な
低分子量の水溶性および油溶性化合物を多様な細胞に送
達するために使用されて成功してきた。例えばG.Gregor
iadis,Trends in Biotechnology,3:235−241（1985）お
よびK.H.シュミット、ed.,Liposomeses as drug carrie
rs,Stuttgart:George Thieme Verlag（1986）参照。
リポソームは、乾燥したリン脂質を水溶液と混ぜ合わ
せ、リン脂質分子の２分子層を発生させると、それが自
然に密集した多層球状体を形成するという過程を経て作
られる。その生成の過程においてリポソームは液体と、
それに可溶なそこに存在する任意の溶質を内部に閉じこ
める。リポソームの生成の邪魔にならないものであるか
ぎり、可溶性、荷電状態、大きさ、およびその他の構造
的特性に関係なく広範囲の物質をこの手法で利用するこ
とが可能である。ただし、これらの特性は、ある種の環
境下においては、リポソームの用途を限定することもあ
る。
特定の目標に対して付加された抗体分子を含んでいる
リポソームは、付加された抗体に対して免疫反応性の抗
原を含む目標の細胞に内包された物質を送達する手段と
して掲示されてきており、免疫リポソームと呼ばれてい
る。例えば、米国特許第4,755,388号、第4,925,661号お
よび第4,957,735号は免疫リポソームの提示を行なって
いる。さらに蛋白質を含むリポソーム組成物がほ乳類動
物の皮膚に投与された場合、皮膚のケラチン合成細胞に
侵入することが示されている。米国特許第5,190,762号
参照。さらにDNA−リポソーム組成物も提示されたが、
局所投与によって毛胞に核酸を選択的に送達することは
示されていなかった。米国特許第5,077,211号および第
5,223,263号およびHoffman et al.,FEBS Letts.,93:365
−368（1978）参照。
リポソームを使用して送達の特定化を増強するために
様々な標的メカニズムが試みられたが、内包された物質
の目標とされた細胞または組織への送達は必ずしも達成
できない。
送達すべき薬剤が、その薬剤を投与したとき、目標の
組織と隣り合う組織に有害作用を及ぼす可能性があると
きは、特に特定の組織への投与が重要になる。例えば、
ある薬剤は毛胞においては許される効果を生じるが、隣
り合う皮膚の組織には望ましくない効果を生む可能性も
あり得る。例えばメラニンの送達は毛髪の色素沈着には
望ましいが、一般的には皮膚の色素沈着には望ましくな
く、したがって皮膚全般にわたる送達は望ましくなく、
胞細胞の特定化が要求される。同様にメラニンまたはチ
ロナーゼを発現する遺伝子組み換え治療は皮膚の場合望
ましくないが、毛髪の色素沈着には望ましい結果であ
る。
経皮性薬剤送達は、薬剤が真皮細胞でなく、循環系統
に乗せることを目的としている場合には、もう一つの問
題が生じる。特定の場合には、皮膚の細胞への薬剤の吸
収を最小に留め、なるべく血液循環に乗る量を多くする
ことができる経皮薬剤送達方法が望ましい。一方、薬剤
の送達が毛胞に限定されることが望まれる場合は、投与
された薬剤が望ましくない結果を生じるおそれのある循
環系統に入ったり、皮膚に吸着することは最小に留める
必要がある。
分子量の小さい染料であるカルボキシフルオレセイン
をハムスターの鼓膜の毛胞脂腺に送達することは、Lieb
らがThe Journal of Investingative Dermatology,99:1
08−113（1992）にごく最近述べた方法に基づき特定の
リポソーム組成物にそれを組み込むことによって可能で
ある。同様にLiらはIn Vitro Cell.Dev.Biol.28A:679−
681（1992）に試験管内での皮膚組織培養システムにお
いてリポソームを媒体とする小分子の染料であるカルセ
インの毛胞に対する送達について述べている。
しかしながら、従来の研究は、分子量の大きい物質、
例えば蛋白質や核酸、脂質の障壁を越えて移動できない
嫌油性物質または毛胞以外の組織に望ましくない副作用
を及ぼす可能性を持つ親油性物質などを含むリポソーム
を用いて，毛胞を特異的に、また選択的（優先的）に標
的とする方法については述べていない。
さらに特定の化合物が毛胞細胞に送達された度合、送
達された化合物の有効性、または毛胞への選択的な送達
を最適化するリポソームの処方に関して試験管内で正確
に試験する方法については従来なんらの記述もなかっ
た。
したがって、毛胞に対して有益な化合物を選択的に送
達し、かつ、その送達の有効性を測定するさらに良い方
法の必要性は依然として存在する。
発明の概要 リポソームが有益な化合物を毛胞に選択的に送達する
能力を持つことが発見された。
基本的に、本発明は、有益な化合物をリポソームの生
成中に、またはその後に組み込むことによるリポソーム
の準備方法と、そのリポソームをそのような有益物質で
処理する必要性を持つ皮膚の部分に適用する方法を提示
するものである。この方法によると、リポソームは有益
化合物を毛胞に優先的に送達し、その結果、有益化合物
は胞細胞内に入る。リポソームを媒体とする送達方法の
選択性によって、投与された化合物は真皮や内部の循環
系統に多く送達されることはなく、したがって、投与さ
れた化合物が真皮組織や全身性の循環系統に望ましくな
い効果を及ぼす可能性を最小に留めることができる。
典型的な場合、この方法は、この方法による処理を必
要とするほ乳動物、例えば人間の皮膚に適用される。す
なわち、この方法は生体内で実施可能である。
本発明の毛胞特定処理方法の有効性を確定するため、
斬新な組織培養手法を使って特定なリポソーム薬剤を試
験管内で試験する方法が開発された。
上述のように、多数の化合物、例えば染料などは、皮
膚に適用された場合、重度に胞状化した領域により迅速
に吸収されることが知られている。ところが巨大分子ま
たは嫌油性物質の多くはプラズマ膜やその他の脂質障壁
を越えて小胞および胞細胞の中に入ることができない。
一方、それらの巨大分子化合物はリポソーム内に組み込
まれた場合、循環系統や、近辺の皮膚組織に入ることな
く、胞細胞に送り込まれ、さらに選択的に角質層を越え
て小胞に入ることができることが発見されたが、これ
は、有効性と安全性の面で偉大な効果をもたらす可能性
を秘めている。
よって、本発明の一つの実施態様では有益な化合物を
ある有効量だけ含むリポソームを含むリポソーム組成物
を提示する。このリポソーム組成物に使われるリポソー
ムは有益な化合物をここにさらに詳述するように毛胞へ
選択的に送達することが可能である。投与されるべき有
益な化合物は、角質層または細胞膜を通過することが不
可能でリポソームを媒体として毛胞に選択的かつ優先的
に送達されることを必要とする巨大分子または嫌油性分
子であり、または、毛胞の外側の細胞には望ましくない
効果を持ち、リポソームを媒体として毛胞に選択的かつ
優先的に送達されることを必要とする好油性分子であ
る。
このリポソーム組成物はここに述べるように様々な用
途に利用できるので、メラニン、染髪料、チロシナー
ゼ、または人間のチロシナーゼを発現し得る核酸などの
毛髪の色を修復する薬剤、毛髪の成長を刺激し、毛髪を
強化する薬剤、化学療法に対する敏感さを抑制する薬剤
などを含む多様な有益な化合物を組み込むことが可能で
ある。
このリポソーム組成物は選択的に毛胞に送達するため
に設計された多種のリポソームを含むことが可能であ
り、それらのリポソームとしてはpHに感応するリポソー
ム、PC、EPC、DOPC、DPPC、PE、DOPEおよびコレステロ
ールからなるグループから選ばれたリン脂質の一つを含
むリポソーム、D282、D378、D383、D3886、D3897および
D3899（各々の化学構造を図8A−8Fに示す）からなるグ
ループから選ばれた陽イオン性脂質の一つをさらに含む
リポソームなどが挙げられる。
本発明はまた、ほ乳動物の毛髪に、毛髪の色を復元す
る方法を提示し、その方法は複数の毛胞を持つ該動物の
皮膚の部分に治療上有効な量のリポソーム組成物を適用
することから成り、その場合、本発明のリポソーム組成
物には少なくとも一種類の毛髪色復元薬剤を有効量含む
リポソームが含まれている。望ましい毛髪色復元薬剤に
はメラニン、染髪料、チロシナーゼ、および毛胞細胞中
に人間のチロシナーゼを発現し得る核酸が含まれる。
本発明はさらに、ほ乳動物の複数の毛胞を持つ皮膚の
領域に局所的に本発明のリポソーム組成物を適用する段
階を含む、ほ乳動物の毛胞に有益な化合物を直接的およ
び選択的に送達する方法を提示し、そのリポソーム組成
物は少なくとも一つの選択された有益な化合物を有効量
含むリポソームを含み、またその有益な化合物は巨大分
子であるか、嫌油性分子であるか、または毛胞細胞の外
側の細胞に望ましくない効果をもたらす親油分子であ
る。望ましい実施態様の場合、有益な化合物はメラニ
ン、染髪剤またはチロシナーゼなどの髪の色を修復する
薬剤である。関連する実施態様では、有益な化合物がサ
イクロスポリンＡまたはそれに関連する化合物のような
毛髪の成長刺激剤である。また、別の実施態様の場合、
有益な化合物は置換療法蛋白質の有効量を発現する能力
を持つ核酸である。特に望ましいのは、チロシナーゼを
発現し得る核酸分子、または毛髪成長刺激蛋白質、また
は化学療法に起因する脱毛症に対して抵抗力をもたらす
多薬剤抵抗蛋白質などである。
別の実施態様においては、本発明は化学療法に起因す
る脱毛症を抑制するために本発明の方法による本リポソ
ーム組成物を使用することを意図する。リポソーム組成
物は、毛胞において化学療法の毒性を低減する化合物を
含んでいる。
図面の簡単な説明 本発明の詳細、およびその望ましい実施態様は、図面
を参照することによりさらに理解しやすくなる。
図1Aは、実施例１で述べる、カルセインを含むリポソ
ームで処理した皮膚の組織培養の蛍光顕微鏡写真（倍率
500X）で、毛胞へかなり優先的に染料が送達されること
を示す。
図1Bは、実施例１で述べる、リポソームなしにカルセ
インで処理した皮膚を組織培養したものの蛍光顕微鏡写
真（倍率500X）で、染料による染色が弱く、皮膚構造へ
の染料の優先的な送達がないことを示す。
図２は、実施例２で説明するように、メラニンを内包
するリポソームで12時間処理した白い毛のマウスの皮膚
をヘマトキシリン−エオシンで染色したもののパラフィ
ン断面（倍率500X）であり、矢印で示したとおり、リポ
ソームに内包されたメラニンは主として毛胞に送達され
ていることを示す。
図３は、実施例２で述べる、ヘマトキシリンとエオシ
ンで染色された図２と同様な皮膚を組織培養したものの
パラフィン断面の光学顕微鏡写真（倍率250X）であり、
矢印で示したとおり毛幹そのものにメラニンが送達され
ていることを示す。
図４は、放射能で標識した高分子量DNAを内包するリ
ポソームで処理した皮膚を組織培養したものの組織学的
放射能写真で、実施例３で述べるようにDNA（矢印）が
毛胞細胞膜と細胞形質に集中していることを示す。
図5A−5Dは、実施例4bで述べたようにして作られた皮
膚の組織培養の断面の光学的顕微鏡写真（図5Aと5Cは倍
率125X、図5Bと5Dは倍率250X）で、図5Aと5BはLac−Ｚ
を発現する能力を持つリポソームに内包されたプラスミ
ド（pM−MuLV−SV−Lac−Ｚ）を使用した結果を示し、
図5Cと5Dは裸のプラスミドを使用した結果を示す。矢印
は、毛胞と毛幹中に青色（黒色）の点々が均一に分布し
ていることを指しており、毛胞に活性遺伝子が送達され
たことを示している。
図6A−6Cは、実施例５で述べたように、生体内で処理
したマウスの皮膚サンプル断面の蛍光顕微鏡写真（倍率
150X）であり、図6Aと6Bはリポソームに内包されたカル
セインを使用した結果であり、図6Cは裸のカルセインを
使用した結果を示す。矢印は毛幹の中の蛍光を指してお
り、カルセインが毛胞に活性化した状態で送達されてい
ることを示す。
図7A−7Cは、実施例５で述べたように、生体内で処理
したマウスの皮膚サンプル断面の光学的顕微鏡写真（倍
率500X）であり、図7A−7Cはリポソームに内包されたメ
ラニンを使用した結果を示す。
図8A−8Fは各々陽イオン脂質D282、D378、D383、D388
6、D3897およびD3899の化学構造を示す。
発明の詳細な説明 A.リポソームを媒体とする巨大分子と核酸の毛胞に目標
を定めた送達 本発明は活性組成物の直接的かつ選択的（特定的）な
毛胞の細胞および毛幹そのものへの投与に関するもので
ある。
本発明に基づく毛胞への特定化された送達の故に、本
発明は有益な組成物を真皮や循環系に一般的に送達する
代わりに、毛胞へ特定的に送達するという利点があり、
それによってより少ない組成物の量で望ましい効果を得
ることができ、その結果その組成物による皮膚全般又は
全身的な循環系への悪影響を減少することができる。
1.皮膚組織培養の評価分析 有益化合物を内包するリポソームが選択的送達に有効
であることを明示し、かつリポソームを媒体とする組成
物の最適化をはかるために、生体内の評価分析法が開発
された。基本的には、毛胞を含む皮膚の断片を、Li et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1908−1912（1991）;L
i et al.,Proc.Natol.Acad.Sci.USA,89:8764−8768（19
92）;Li et al.,In Vitro Cell.Dev.Biol.,28A:479−48
1（1992）;Li et al.,In Vitro Cell.Dev.Biol.,28A:67
9−681（1992）;Li et al.,In Vitro Cell.Dev.Biol.,2
8A:695−698（1992）;Li et al.,In Vitro Cell.,Dev.B
iol.,29A:192−194（1993）；およびLi et al.,In Vitr
o Cell.Dev.Biol.,29A:449−450（1993）に記載されて
いるように、コラーゲン−ゲル−担持スポンジ上で組織
培養した。上記文献の開示は、引用することにより本明
細書に含められる。このシステムは毛胞の中で少なくと
も10−16日間にわたり毛幹の成長を許し、かつ、毛胞お
よび周囲の組織の３次元的な様相を染料の選択使用によ
って共焦顕微鏡写真で評価する能力をもたらすものであ
り、さらにそれによって使用した治療用試薬の効果を評
価するためのシステムを与えるものである。３次元的組
織培養と共焦顕微鏡写真によって、候補となる有益な
（治療用）物質を送達するリポソームと毛胞との相互作
用を微細にわたり細胞および細胞以下のレベルで観察す
ることが可能である。よって、この組織培養システムは
リポソーム組成物を最適化し、またリポソームの内容物
を目標の細胞に送達するための最適条件を規定すること
が可能である。
典型的な皮膚組織培養調整法はLiらによって1992年２
月28日出願され、本願出願人に譲渡された米国特許第5,
849,579号にも詳述されており、その開示は、引用する
ことにより本明細書に含められる。
毛胞と内外表面を持った皮膚のサンプルの自然状態に
おける組織培養は、皮膚のサンプルを培地に浸した細胞
外支持マトリックス上に置いて、内表面はマトリックス
に接し、外表面は培地の表面より露出して大気に触れる
ようにし、皮膚をのせたマトリックスを皮膚培養条件下
に保つことを含む。
可能性としては、いかなる動物の皮膚サンプルでも、
本評価分析に使用することができる。例を挙げれば、マ
ウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、キヌ
ザル、サルおよび人間などのほ乳動物がこれに含まれ
る。より望ましいのはその動物が人間であることであ
る。
動物から切り取られる皮膚サンプルは通常真皮層と表
皮層を含む。脂肪がつき過ぎている場合は取り除く。皮
膚サンプルは毛の生えた動物で、その毛髪の成長を許す
ような皮膚から切り取ったものでも良く、あるいは無胸
腺のヌード動物などの無毛の動物から切り取ったもので
も良い。毛のある動物から皮膚サンプルを切り取る場
合、皮膚を切り取る前に毛をそるか、刈り取ってもよ
い。
皮膚サンプルは本明細書では内表面と外表面を持つも
のとして定義する。用語「内表面」とは真皮的な表面、
すなわち、動物においてそれが自然の状態で存在してい
るとき、露出していない表面である。用語「外表面」と
は表皮的な表面、すなわち、動物においてそれが自然の
状態で存在しているとき、露出している表面である。
本発明において用いられる皮膚は表面積の制限はな
い。一般的には、皮膚サンプルは、１ないし10,000平方
ミリメートル（mm2）の外表面積を持つことができる。
望ましい表面積は４ないし100mm2である。さらに望まし
い表面積は約10mm2である。厚さは切り取ってくる動物
による。マウスの場合、望ましい厚さは約１ないし2mm
である。
皮膚サンプルは支持マトリックス上で培養される。本
発明の支持マトリックスは、自然の状態と同様に皮膚の
内表面（基定部）に培地から水溶性栄養分を送達するた
めの毛細管作用に適した間隙を持った小柱状構造を提供
する。したがってこの能力を持ついかなる支持体でもよ
く、例えば、ナイロン、ホウケイ酸ガラス繊維またはポ
リプロピレン、またはセルロースもしくはコラーゲンの
ような有機物網状組織が挙げられる。支持マトリックス
は細胞外支持マトリックスであることが望ましい。本明
細書で使用するとき、「細胞外支持マトリックス」と
は、ゲルやスポンジのような固体であり、１個ないし複
数個の有機分子または分子凝集体であり、その分子また
は凝集体は，細胞によって細胞外に生成され、分泌され
たものであり、生体内において支持体、接着剤および枠
構造として作用し、３次元的組織の構造および機能を保
つものである。そのような分子の例としては、高分子量
の蛋白質や糖蛋白質（例えばコラーゲン、ラミニン、フ
ィブロネクチンなど）複合多糖類などがある。
好ましい態様では、細胞外支持マトリックスがコラー
ゲン含有ゲルである。コラーゲン含有ゲルの例として
は、ゼラチン化された豚皮、例えばGELFGOAM（商標、Th
e Upjohn Company、ミシガン州カラマズー市）ならびに
ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカンおよびエンタ
クチンを含む配合物、例えばMARTIGEL（商標、Collabor
ative Research,Inc.,マサチューセッツ州ベッドフォー
ド市）などがある。
GELFORMは米国特許第2,465,357号で開示された特許製
品で、その特許の開示内容は引用することにより本明細
書に含められる。
別の望ましい態様の場合、細胞外支持マトリックスは
ホモ多糖スポンジである（Leighton J.,J.Nat'l Cancer
Instit.,12:545−561（1951））。望ましいホモ多糖は
セルロースである。本発明で意図されているホモ多糖ス
ポンジは織り目やネット・サイズは任意である。
さらに別の好ましい態様の場合、細胞外支持マトリッ
クスはコラーゲン含有ゲルとホモ多糖スポンジの組み合
わせである。さらにそのような組み合わせは上層がコラ
ーゲン含有ゲルで、下層がホモ多糖スポンジで構成され
ることが望ましい。コラーゲン含有ゲルはゼラチン化さ
れた豚皮であることが望ましく、ホモ多糖はセルロース
であることが望ましい。特に望ましい支持マトリックス
の態様においては、上層がGELFOAMで、下層がセルロー
ス・スポンジであり、そのようなマトリックスは組織が
培養される皮膚の正常な毛髪の成長を保つ上で特に有効
であることが分かった。
皮膚サンプルの大きさと細胞外支持マトリックスの大
きさの間には特に決められた比率はない。マトリックス
は皮膚サンプルを支持するのに十分な直径から、皮膚サ
ンプルよりはるかに大きいものまで、任意の大きさとす
ることができる。一つのマトリックスの上に複数の皮膚
サンプルを置くことも、実際に皮膚サンプル同志が接触
しないかぎり許される。皮膚サンプル間の望ましい距離
は約１ないし2mmである。
皮膚サンプルは、マトリックスの上に置かれたとき、
皮膚の内表面がマトリックスに接し、皮膚の外表面がマ
トリックスの反対側にあるようにする。望ましい態様の
場合、皮膚の内表面はマトリックスと接している。この
ようにした場合、本方法に従って、皮膚の外表面は毒素
や他の配合物と接触することになる。
皮膚のサンプルを上にのせたマトリックスは、マトリ
ックスと十分に接触はするが、皮膚を完全に覆わない程
度の量の培地、すなわち皮膚の外表面は潜ってしまうこ
となく、培地の表面はマトリックスの上面から0.5ない
し2mmにあり、皮膚サンプルに対して毛細管作用で水溶
液を供給できることが望ましい。例えば、皮膚サンプル
の厚さが１ないし2mmであるときは、培地の表面が皮膚
の外表面より0.5ないし約2mm下にあることが望ましい。
細胞外支持マトリックスは一般的に柔らかく、皮膚サ
ンプルをのせたときに凹みを生じ、その結果、マトリッ
クスのエッジが皮膚サンプルの縦方向の端面に接触する
こともある。
細胞外支持マトリックスは皮膚サンプルを上にのせる
前に、マトリックスを培地と平衡させるために、予備処
理をしておく。マトリックスの予備処理はマトリックス
を所定の大きさに切断し、切り取られたマトリックスを
殺菌された容器に入った培地に、マトリックスを培地で
飽和させ、培地と平衡させるのに十分な時間浸漬するこ
とを含む。望ましい浸漬時間は37℃で４時間である。
本発明で意図されている培地は、皮膚サンプルの活性
を促進し、保持するように作られた水溶性の栄養培地で
ある。望ましい培地はイーグルの最少必須培地（MEM）
に10％（v/v）のウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を
添加したものである。抗生物質の例としては、ゲンタマ
イシン、ストレプトマイシン、ペニシリン、カノマイシ
ンなどである。望ましい抗生物質はゲンタマイシンであ
る。培地中の最終的な抗生物質の濃度は使用される特定
の抗生物質による。抗生物質としてゲンタマイシンを使
う場合、望ましい濃度は培地の1ml当り約0.2mgとする。
他の培地も使用可能であり、ウシ胎児血清か、無血清培
地をこの分野で公知のように併用することが望ましい。
皮膚サンプルをのせたマトリックスは、培地中に無期
限的に保管することができる。培地は２−３日で１回交
換することが望ましい。
適当な組織培養期間後、選ばれた有益な巨大分子化合
物を含むリポソームのある量を、皮膚の組織培養に適用
する。対照として、第二の組織培養された皮膚サンプル
を化合物だけで処理する。次に、皮膚の組織培養を処理
し、調整して、処理を行なった皮膚細胞中の組織の活性
を評価し、リポソーム中の有益化合物の送達の特異性を
測定する。
一つの態様においては、活性および／または送達は活
性細胞に特異的な標示薬の皮膚サンプル細胞への取込み
を測定することにより評価される。ここで「活性細胞に
特異的な」とはその標示薬が、生きている、死んでいな
い細胞に吸収され、または取り込まれることを意味す
る。
活性細胞に特異的な標示薬は、生きている細胞に接近
できる代謝前駆体または非代謝物質であってもよい。代
謝前駆体としては、リボまたはデオキシリボ核酸前駆
体、例えばプリン体、ピミジン類、ヌクレオシドおよび
ヌクレオチドである。代謝前駆体は検知を容易にするた
め、指示手段と機能を発揮するように連結されているこ
とが望ましい。代謝前駆体標示薬の望ましい指示手段は
放射性ラベル、例えば35Ｓ、32Ｐ、125Ｉ、3Ｈなどであ
る。特に望ましい放射性ラベルつきの代謝前駆体標示薬
は3Ｈ−チミジンである。
活性細胞に特異的な望ましい非代謝物質標示薬として
は、光学的に検知できるような染料である。活性細胞に
特異的なものとしてこの分野で認められた染料ならば、
どんなものでも本発明の皮膚毒素評価に使用することが
できる。例えばR.P.Haugland編Handbook of Fluorescen
t Probes and Research Chemicals出版者Molecular Pro
bes社、オレゴン州ユージーン市（1989−1991および199
2−1993）を参照。
望ましい態様において、染料は蛍光染料である。活性
細胞に特異的な蛍光染料の例としては、BCECF−AM（Ｂ
−1150）、カルセイン−AM（Ｃ−1430）、CFDA（カルボ
キシフルオレセイン・ジアセテート;C−195）、アクリ
ジン・オレンジ（Ａ−1301）、カルセイン・ブルー（Ｈ
−1426）、フラー2AM（Ｆ−1201）、フロオレセイン・
ジアセテート（Ｆ−1303）またはカルボキシ・アナログ
（Ｃ−1431）などがある。それらの染料はこの分野では
公知のものであり、商業的に入手し得る（Molecular Pr
obes社、オレゴン州ユージーン市）。特に望ましいもの
はBCECF−AMまたはカルセイン−AMである。上記で
（ ）内の数字はMolecular Probes社から入手し得る蛍
光染料の製品番号を示す。
一つの態様においては、活性細胞に特異的な蛍光染料
の取り込み、または吸収は活性細胞の代謝活性に依存す
る。この態様によれば、非蛍光染料は活性細胞に吸収さ
れ、エステラーゼのような細胞内酵素によって蛍光物質
に変換される。細胞内蛍光の存在により活性が示され
る。
別の態様の場合、活力は死亡細胞に特異的な標示薬の
皮膚サンプル細胞への吸収または取り込みを測定するこ
とによって評価される。ここで「死亡細胞に特異的な」
とは、その標示薬が、死んだ、活性のない細胞にのみ吸
収され、または取り込まれることを意味する。
一般的に、死亡細胞に特異的な染料とは、高いイオン
電位を持ち、しかも低い透過性を持つので、細胞膜を透
過できないような化合物である。細胞が死ぬと、細胞膜
は構造的または機械的に破壊され、死亡細胞に特有な染
料が細胞内空間に入り込むことができるようになり、そ
こで核膜のような細胞内成分と結合する。
望ましい死亡細胞に特異的な標示薬は光学的検知が可
能な染料である。望ましい死亡細胞に特異的な染料は蛍
光染料であり、例えば、ヨウ化プロピジウム、臭化エチ
ジウム、エチジウム・ホモダイマー［（5,5′−ジアザ
デカメチレン）ビス（3.8−ジアミノ−６−フェニル−
フェナントリジウム）ジクロリド、ジハイドロクロリ
ド］などである。最も望ましいのはヨウ化プロピジウム
である。死亡細胞に特異的なヨウ化プロピジウム（PI）
およびその他の染料はこの分野では公知のものであり、
商業的に入手可能である（Molecular Probes社、オレゴ
ン州ユージーン市）。
さらに別な望ましい態様の場合、活力の評価は活性細
胞に特異的な標示薬と死亡細胞に特異的な標示薬の両方
の吸収、または取り込みを同時に測定することによって
達成される。活力は活性細胞と死亡細胞との比で評価さ
れる。もし活性細胞に特異的な標示薬と、死亡細胞に特
異的な標示薬とが共に蛍光染料である場合は、活性細胞
と死亡細胞とを区別する上で便利なように、両者の発行
スペクトルが異なっていなければならない。細胞の活力
を、活性細胞と死亡細胞、および培養サンプルに特異的
な標示薬の吸収の違いから判定する様々な配合物と方法
は、この分野で公知である。前出Haugland。
活性細胞に特異的な標示薬の吸収または取り込みを検
知する手段は使用する標示薬に依存し、この分野に熟達
した者には公知である。放射能標示された代謝前駆体を
検出する望ましい手段は、その前駆体を吸収した皮膚サ
ンプルの組織片のオートラジオグラフィーである。
染料の望ましい検出手段は顕微鏡検査である。顕微鏡
検査は、３次元の自然状態の皮膚組織培養において様々
な場所で皮膚サンプルの特定の細胞における標示薬の取
り込みを選択的かつ再現可能に評価し得る任意の顕微鏡
の使用を含むものである。
一般的に顕微鏡検査は、光学的切断の能力を必要とす
る。光学的切断とは、皮膚の３次元構造の中であらかじ
め選択した深さの位置を皮膚中に存在するミクロソー
ム、気泡、脂球、およびその他の組織成分によって、光
の反射や、光学的干渉がない状態で観測する能力を言
う。
さらに、光学的切断によって、３次元的皮膚組織培養
内の各種断面を観測することができる。皮膚を順次に切
断して観測することにより、皮膚と毛胞の全体像、別な
言い方をすれば、目標である特定の細胞が存在する皮膚
と毛胞の領域の像を作成することができる。かくして、
皮膚の様々な深さと部分の比較研究が可能となる。この
ように表面細胞、真皮層の下の細胞、表皮層の細胞、ま
た、その他の特定な細胞、例えば神経細胞、油脂分泌細
胞、毛胞細胞などの活力を評価することができる。
光学的切片の厚さは、観測すべき細胞の大きさ、およ
び組織に応じて変化させ、約0.1から1000ミクロンの範
囲が可能である。望ましい切片の厚さは0.5ないし10ミ
クロンであり、さらに望ましいのは約２ないし６ミクロ
ンである。
光学的切断を行う能力のある望ましい顕微鏡は、共焦
スキャニング・レーザー顕微鏡、例えば10xのPlanApoプ
ラン対物レンズをつけたニコンOptiphotに搭載したMRC
−600 Confocal Imaging System（Bio−Rad社、カリフ
ォルニア州リッチモンド市）などが望ましい。そのよう
な共焦スキャニング顕微鏡は、送達の評価分析に使用さ
れて成果を挙げている（実施例参照）。本発明において
は組織サンプルを他の光学的スキャニングまたは切断法
で観察することも意図されている。
活力は皮膚の中の任意の場所において、活性細胞と死
亡細胞各々に対して特異的な標示薬の吸収を基礎に、全
細胞に対する活性細胞または死亡細胞の比率または活性
細胞の死亡細胞に対する比率によって評価される。推定
される有益な化合物との接触の前後において活力を評価
するとき、推定される有益な化合物との接触の前後に評
価された活性細胞と死亡細胞との比率を比較することに
より、投与された化合物によりもたらされた毒性または
利益を標示することができる。
標示薬を皮膚の培養組織に適用する手続きは、各々の
標示薬によって異なる。一般的に皮膚サンプルを培地に
入れてから約６時間後、望ましくは約24時間後に、標示
薬を加える。培地に標示薬を加えたのち、皮膚サンプル
の中に標示薬が入り、その細胞の標示ができるように十
分な期間、培養組織を培養条件下に保つ。
培養組織は標示薬の存在下に、望ましくは約５分間な
いし約２時間、さらに望ましくは約10ないし20分間保
つ。
培地に加えられた標示薬の濃度は、各々の標示薬によ
って異なる。蛍光染料PIとBCECF−AMが用いられた場
合、染料の濃度は約１ないし100マイクロモル、望まし
くは約２ないし50マイクロモル、そしてさらに望ましく
は各々約５マイクロモルである。
試験管内の皮膚組織培養法の例は実施例に述べてあ
る。
ここに述べるリポソームを媒体とする送達の研究結果
によれば、有益な巨大細胞化合物は毛胞に集中してお
り、細胞膜を越え、細胞形質を通って核に達している。
リポソームに組み込まれた物質（有益化合物）は毛胞に
優先的に送達されているが、それは、毛胞中に比べて、
周辺の皮膚組織中の有益化合物のレベルがかなり低いこ
とによって明らかである。ここに開示されたリポソーム
配合物を使った時の毛胞への送達の極端な選択性の故
に、また送達すべき化合物に基づく選択性と利用された
リポソーム配合の故に、この選択性のことを、毛胞への
送達量と周辺の皮膚組織への送達量との比率に応じて、
「指向送達」、「優先送達」、「選択送達」、また、と
きには「特定送達」と呼ぶ。さらに、選択性は毛胞に対
する薬学的効果を周辺の皮膚組織に対するものと比較し
て表現することも可能である。
リポソームに組み込まれていない状態の巨大分子化合
物で組織サンプルを処理した場合、胞細胞または胞細胞
核に到達する量はわずかである。したがって、リポソー
ムを使ったシステムはさもなければ毛髪には集中し得な
い化合物を毛胞に特定的、選択的、そして効果的に指向
させるのである。
試験管内の組織培養評価分析は、様々な方法で利用す
ることができる。その評価分析は、有益化合物の送達効
率を改善する目的でリポソーム組成物を評価し、最適化
するために、または指向組成物におけるリポソームの利
用効果の他の様相を研究するために利用することができ
る。その評価分析は、ここにさらに述べる毛胞を覆う状
態を処理するために有益な他の化合物を見つけるための
スクリーニング・システムとしても利用することができ
る。
さらに、試験管内の組織培養評価分析法は、本発明の
方法に使用される有益な化合物の有効な投与量を決定す
るために利用することもできる。
2.有益化合物を内包するリポソームとリポソーム組成物
の製法 本発明の有益なリポソーム組成物は一般的に意図され
た用途に適した一つないし複数の組成物状態で得られ
る。リポソーム中で使われる蛋白質、核酸または他の化
合物は、各種の緩衝液や溶液中で生物学的活性を保つ
が、リン脂質組成物中に配合されるのが望ましい。さら
に望ましいのは、その組成物に有益化合物の最大の安定
性と生物学的活性を提供するようなリン脂質組成物であ
る。一般的にこの分野で公知のように、そのようなリン
脂質組成物はリポソーム組成物を形成するように配合さ
れることが望ましい。一般的に、その組成物は目的とす
る用途に適した生物学的に活性な有益化合物の一定量を
含むものである。
リポソームの製法と、その薬物療法における利用法に
ついては今までに述べられてきた。例えば、米国特許第
4,241,046号、第4,394,448号、第4,529,561号、第4,75
5,388号、第4,828,837号、第4,925,661号、第4,954,345
号、第4,957,735号、第5,043,164号、第5,064,655号、
第5,077,211号および第5,264,618号を参照。これらの開
示内容は引用することにより本明細書に含まれる。核酸
のリポソーム中への内包については米国特許第5,223,26
3号に述べられている。
本発明方法で使用するための有益な化合物を内包する
リポソームの製法の望ましい例は、実施例に述べた。特
に、有益化合物として毛胞に送達されるメラニン、蛋白
質または核酸の組み込みについては、ここに述べる。
本発明のリポソーム組成物は一般的に1mgのリン脂質
混合物中に約0.1mgないし3mgの蛋白質、または約0.1μ
ｇから0.5mgの核酸を含んでいる。
活性化合物のリン脂質混合物に対する比率が結果とし
て生じる試薬の感度を決める可能性がある。よって、リ
ン脂質混合物1mg当りの蛋白質約１ないし2mgの割合が国
際感度指数（「ISI」）約1.0の蛋白質試薬に対して適当
であろう。ISI値約1.6ないし2.0の配合物を作るために
は、リン脂質混合物1mg当り約0.25ないし0.5mgの蛋白質
が適当であろう。
以上の他に、約0.5ないし1.5％（w/v）のグリシンを
含む組成物が望ましい。リポソーム組成物を貯蔵してお
いて、後に再生する目的で凍結乾燥することができるよ
うにするためには、試薬は低温保存剤、望ましくは炭水
化物の保存剤、最も望ましくはトレハロースを含むこと
が必要である。
リポソームの脂質２分子層はリン脂質、望ましくはホ
スホグリセリド類を含む。リポソーム組成物の例として
は、ホスファチジルコリン（PC）・リポソーム、特に卵
PC（EPC）およびジパルミトイルPC（DPPC）を含む。こ
の他のリポソーム組成物の候補は、米国特許第4,394,48
8号の教示に従って製作される。該特許の開示内容は、
引用することによって、本明細書に含まれるが、特にリ
ポソームの記載としては、ホスホチジルエタノールアミ
ン（PE）、ホスホチジルセリン（PS）、スフィンゴリピ
ド、ホスホチジルグリセロール（PG）、ホスファチジン
酸（PA）、コレステロール、スピンゴミエリン、カルジ
オリピン、各種陽イオン・リン脂質、糖脂質、ガングリ
オシド、セレブリオシドなどが挙げられ、単独または組
み合わせて使用される。
「リン脂質」とはグリセロール（最も一般的）または
スフィンゴジンから作られる有機分子である。グリセロ
ール（またはフォスフォグリセリド類）から作られるリ
ン脂質は、グリセロールの骨格、グリセロールの第１お
よび第２炭素にエステル化した脂肪酸の二つの鎖と第３
炭素にエステル化したリン酸とを含む。また、アルコー
ル成分の一部がエステル化してリン酸になったものでも
良い。
本発明のリポソーム組成物に使われる望ましいリン脂
質としては、12ないし20の炭素原子を持つ脂肪酸を含む
リン脂質がある。その脂肪酸は飽和脂肪酸でも良く、ま
た不飽和脂肪酸でも良い。リン脂質は天然の資源から得
たものでも良く、その場合、様々な脂肪酸を有する分子
から成るものでも良い。単なる産出源からのリン脂質を
混合して使用しても良い。例えば、PC、PGおよびPEは卵
黄から得ることができ、PSは動物の脳または脊髄から得
ることができる。これらのリン脂質は合成された物質か
ら作られても良い。
リン脂質（PL）の混合物は各種のPLを適当な割合で混
ぜても良い。しかし、各リン脂質を適当な割合で混ぜて
も良いが、個々のリン脂質を特定の割合で混ぜた場合、
有利な活性および活性の安定性を持つリポソームが生ま
れる。したがって、広範囲の割合の個別リン脂質を使用
できるが、得られるリポソーム組成物の有利な活性およ
び安定性のためには、ある特定のリン脂質組成物が望ま
しい。
リン脂質は適正性な割合で容易に混合されて、本発明
のリポソーム組成物を作るのに使われるPL混合物を提供
することができる。
リポソーム、塩化（Ｎ−（１−（2,3−ジオレオイル
オキシ）プロピル）−N,N,N−トリメチルアンモニウ
ム）（DOTMA）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノ
ールアミン（DOPE）、ジオレオイル−ホスファチジルコ
リン（DOPC）、ホスファチジルエタノールアミン（P
E）、卵PC（EPC）、ホスファチジルコリン（PC）、ジパ
ルミトイルPC（DPPC）、コレステロールなどのリン脂質
の一つまたは数種から作られることが望ましい。リン脂
質は、Avanti（アラバマ州バーミンガム市）、GIBCO BR
L（メリーランド州ゲイザースバーグ市）、Aldrich（ウ
ィスコンシン州ミルウォーキー市）などの各社から入手
でき，または、周知のように入手可能な材料から製造で
きる。
望ましいリポソームはPC、EPCまたはDPPCを均質に含
んでいる。さらに望ましいリポソームの配合物は、PC型
リン脂質（例えば、PC、EPC、DOPC、DPPCなど）とPE型
リン脂質（PE、DOPEなど）をモル比で約2:5から約5:2で
含み、より望ましくは、その比が5:2PC:PEである。望ま
しいリポソーム配合物はPC:PE:Cholを5:2:3のモル比で
含む。
本発明に使われる望ましいリポソームはさらに陽イオ
ン脂質を含む。一つの望ましい陽イオン脂質は単一陽イ
オン脂質で二つの同一アルキル側鎖を持つものである。
望ましい陽イオン脂質はまた、上述の業者を含む様々
の業者から入手することができる。特に望ましい陽イオ
ン脂質はMolecularProbes（オレゴン州ユージーン市）
から入手可能な、D282、D378、D383、D3886、D3897およ
びD3899のような陽イオン脂質を含み、その構造と合成
方法は公知であり、R.P.Haugland編Handbook of Fluore
scent Probes and Research Chemicals、出版者Molecul
ar Probes社、オレゴン州ユージーン市（1989−1991お
よび1992−1993）に述べられている。陽イオン脂質D28
2、D378、D383、D3886、D3897およびD3899の構造は図８
に示してある。
D282のまたの名は、1,1′−ジオクタデシル−3,3,
3′,3′−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸
塩である。D378のまたの名はヨウ化3,3′−ジヘプチル
オキサカルボシアニンである。D383のまたの名は1,1′
−ジドデシル−3,3,3′,3′−テトラメチルインドカル
ボシアニン過塩素酸塩である。D3866のまたの名は1,1′
−ジオレイル−3,3,3′,3′−テトラメチルインドカル
ボシアニン・メタンスルフォネートである。D3897のま
たの名はヨウ化Ｎ−４−（４−ジリノレイルアミノスチ
リル）−Ｎ−メチルピリジニウムである。D3899のまた
の名は1,1−ジリノレイル−3,3,3′,3′−テトラメチル
インドカルボシアニン過塩素酸塩である。
一つの態様においては、本発明のリポソーム組成物は
上記の一つまたは数種の陽イオン脂質を含んでいる。本
発明のリポソーム組成物は、（ａ）PC、EPC、DOPC、DPP
C、PE、DOPE、コレステロールなどのリン脂質の１以上
および（ｂ）D282、D378、D383、D3886、D3897、D3899
などの陽イオン脂質の１以上の混合物を含む脂質の構成
を持つことが望ましい。特に望ましいリポソーム組成物
は、リン脂質（ａ）と陽イオン脂質（ｂ）を約0.5ない
し2.0モルのリン脂質（ａ）対約0.5ないし1.5モルの陽
イオン脂質（ｂ）の割合で混合した構成であり、さらに
約1.0ないし1.2のモルのリン脂質（ａ）対0.8モルの陽
イオン脂質で混合したものであればさらに望ましい。本
態様の望ましいリン脂質組成物は、DOPCまたはDOPEと上
記の１以上の陽イオン脂質を約0.8モル対約1.0ないし1.
2モルの割合で混合したものである。
別の態様では、本発明は、PC、EPC、DOPC、DPPC、P
E、DOPEおよびコレステロールから成るグループから選
ばれた一つまたは数種のリン脂質をさらに一つまたは複
数のリン脂質と組み合わせることにより、pHに感応する
リポソームを形成したものから成るリポソーム組成物を
含む。pHに感応するリポソームは一般的に公知であり、
それらの製造法はStraubingerらによってFEBS Letts.,1
79:148−154（1985）に説明されている。望ましいpH感
応型リポソームはオレイン酸（OA）とPEをモル比で3:7
の割合で含んでいる。OAはSigma（ミズーリ州セントル
イス市）社のほか、多数の業者から入手できる。
本発明のリポソーム組成物の毛胞に対する優先的な目
標づけは、リポソーム組成物中のリン脂質の選択により
最適化が可能であり、またさらに、内包された有益化合
物に依存することもある。最適化はここに説明された試
験管内の組織培養評価分析法を使い、ここに説明された
リン脂質パラメータに基づくあらかじめ選択された一連
のリポソーム組成物を作成し、試験することによって容
易に行い得る。
有益な化合物を毛胞に目標づける上で特に望ましいパ
ラメータは両陽イオン脂質を持ち、pHに感応性のあるリ
ポソームの併用を含む。
リポソーム組成物が後の使用のために貯蔵される前
に、凍結乾燥される場合、一種類または複数種類の炭水
化物を保存剤として加え、凍結乾燥およびその後の再水
和の際に得られるリポソーム組成物中のリポソームの完
全性を保護することが望ましい。
冷凍保存とは、デリケートな物質の完全性を、それら
を含む液体が凍結されて乾燥される際に保護することを
意味する。冷凍し、その後凍結乾燥する際に、リポソー
ムの完全性を保つための冷凍保存剤として炭水化物を使
用することが報告されている（Racker,E.,Membrane Bio
l.,10:221−235（1972）;Sreter,F.et al.,Biochim.Bio
phys.Acta.,203:254−257（1970）;Crowe et al.,Bioch
em.J.,242:1−10（1987）;Croew et al.,Biochim.Bioph
ys.Acta.,987:367−384（1988））。
炭水化物冷凍保存剤として好適なものはトレハロー
ス、マルトース、ラクトース、グリコースおよびマンニ
トールなどが挙げられる。本発明の望ましい側面の一つ
によれば、トレハロースを、本発明のリポソーム組成物
の作成に用いる水溶性緩衝液に、好ましくは約50mMから
約250mMの範囲の濃度で含ませる（凍結乾燥前）。
リン脂質は、例えば製造業者から有機溶剤に含ませた
形で入手後、適当な割合で混合して特定の組成物を得
る。この際、リン脂質の脂肪酸部分のアルキル鎖の過酸
化反応を抑制するために酸化防止剤を加えても良いし、
また有機溶剤が存在していれば、蒸発によって除去す
る。酸化防止剤の好例はヒドロキシ・トルエン酪酸塩で
ある。酸化防止剤は約0.1％（重量比）使用される。
乾燥した（蒸発により）リン脂質混合物は次に水溶性
界面活性剤溶液に再溶解される。好適な界面活性剤とし
ては比較的高い臨界ミセル濃度（CMC）を持つものが用
いられる（Womack et al.,Biochim.Biophys.Acta,733:2
10（1983））。そのような界面活性剤には約2mM以上のC
MCを持つ界面活性剤を含む。望ましい界面活性剤は約２
ないし25mMの範囲のCMCを持つものである。そのような
望ましい界面活性剤としては３−［（３−コラミドプロ
ピル）−ジメチルアンモニア］−１−プロパンスルホネ
ート（CHAPS）およびオクチル・ベータ−Ｄ−グルコピ
ラノシド、オクチル・ベータ−Ｄ−チオグルコピラノシ
ドなどのアルキルグルコピラノシドが挙げられる。ま
た、界面活性剤には他の成分を含んでも良い。それらの
成分としては、HEPES、トリス、ホスフェートなどの緩
衝塩：その他の各種の塩、例えば、NaCl、KClなど；ト
レハロース、マルトース、グリコースなどの炭水化物冷
凍保存剤などの一つ；およびグリシンなどが挙げられ
る。
本発明の望ましい態様の一つによれば、界面活性剤溶
液は20mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、（TBS）を含んで
いる100mMのCHAPS、150mMのトレハロースおよび0.8％の
グリシンを含む。この好ましい態様によれば、リン脂質
は再びこの溶液に溶解されて約20mg/mlの最終的な濃度
となる。
リポソーム中に用いられる精製蛋白質は担体蛋白質と
共に、再溶解されたリン脂質と結合され、その結果とし
ての混合液の容積は上述のような、望ましくは冷凍保存
剤（最も望ましいのはトレハロース）とグリシンを含
み、界面活性剤を含まない緩衝液によって調整される。
蛋白質はウシのガンマ・グロブリンのような担体蛋白質
と混合され、十分な緩衝液を加えて、最終的な各濃度
が、活性蛋白質10mg/ml、ウシのガンマ・グロブリン1mg
/ml、リン脂質4mg/ml、界面活性剤20mMとなるようにす
る。好適な緩衝液は150mMトレハロースと0.8％グリシン
を含むTBSである。
その結果得られる、無色透明の溶液は、共可溶性を保
守する上で、なんらの渦流生成や音波破砕を必要としな
い。
リン脂質混合物における界面活性剤は様々な方法で除
去することが可能であり、それによって、脂質二重膜と
結合し、それを通って挿入される蛋白質や核酸を有する
安定したリポソーム組成物を得ることができる。界面活
性剤除去の好適な方法としては、透析、接線流れ透析ろ
過、クロス・フロー中空繊維ろ過、疎水性クロマトグラ
フィー樹脂による処理、および単純な希釈などがある。
リン脂質混合物からの界面活性剤の望ましい除去方法
は、透析を少なくとも30時間、室温で、150mMトレハロ
ース、0.8％グリシンおよび0.5％NaN3を含むTBSのよう
な緩衝液に対して透析膜チューブの中で行う。もう一つ
の望ましい界面活性剤除去法は樹脂処理を行う方法であ
る。好適な樹脂としてはAmberlite XAD−２（Rhom and
Haas Co.,ペンシルバニア州フィラデルフィア市）また
はBio−Beads SM−２（BioRad,カリフォルニア州リッチ
モンド市）などの疎水性クロマトグラフィー樹脂が挙げ
られる。これらの樹脂は界面活性剤を直接リン脂質溶液
混合物と接触して、または透析膜によってそれから分離
した後に除去するのに使われる。界面活性剤のリン脂質
混合物からの除去の割合は、溶液中の界面活性剤とクロ
マトグラフィー樹脂ビーズとの重量比に比例する。
洗剤除去を終ったリポソーム溶液は次に5mM CaCl2に
希釈する。一つの望ましい側面によれば、完全に活性な
化合物を含むリポソーム組成物を使用前に50mM Tris、p
H7.5、75mMトレハロース、0.8％グリシンおよび10ない
し15mM CaCl2の濃度に希釈する。また、別の方法として
は希釈された試薬は凍結乾燥して、その生物学的特性を
長期にわたり保存し、後に使用前に水に懸濁させて再形
成できるようにする。
界面活性剤を除去する別の望ましい方法では、透析や
樹脂処理を使わないが、それでも活性試薬の作成を可能
にする。この方法によると、蛋白質または核酸を含んで
いるリン脂質組成物は界面活性剤を可溶化されたのち
に、洗剤を含まない緩衝液に希釈され、CaCl2で完全に
活性化され得る状態に保たれる有益化合物を含む混合ミ
セルを生成する。本発明のこの側面においては、リン脂
質は界面活性剤、望ましくはアルキルグリコピラノシド
を含む緩衝液に20mg/mlの割合で溶解される。望ましい
緩衝液−界面活性剤溶液は50mMオクチル・ベータ−Ｄ−
チオグルコピラノシド（OTG）と150mM NaClを含む20mM
HEPES（pH6）を含む。次に担体蛋白質、活性蛋白質また
は核酸、とCaCl2が加えられ、その混合液は界面活性剤
を含まない緩衝液、例えば150mM NaClを含む20mM HEPES
（pH6）でさらに希釈され、活性蛋白質または核酸が約1
0mg/ml、担体蛋白質（ウシガンマグロブリン）が1mg/m
l、CaCl2が5mM、リン脂質が約4mg/ml、そしてOTGが10mM
の最終濃度を得る。この試薬は、上述のように貯蔵のた
めに凍結乾燥しても良いし、使用前には上述のように希
釈しても良い。
本発明の別の側面においては、この試薬は、リン脂質
から界面活性剤−リン脂質混合ミセルと分泌小包の作成
のための機械的手段による方法により、有機溶剤の除去
により、界面活性剤の除去により、そしてサイズの変換
により作成される。それらの方法は、Lichtenberg,D.お
よびBarenholz,Y.によるMethods of Biochemical Analy
sis,33:337−462（1988）に詳述されており、その開示
内容は引用することにより、本明細書に含まれる。
有益化合物のリポソームへの組み込みは、リポソーム
の形成中に、あるいは形成後にリポソームをその化合物
と組み合わせることによって行なわれる。リポソーム中
にその化合物を導入する方法は様々であり、ここではそ
の方法を制限しない。望ましい方法は実施例で示す。
既に述べたように、核酸がリン脂質組成物に閉じこめ
られるときは、核酸対リン脂質の割合は広範囲にわた
る。しかしながら、核酸（プラスミドDNAのような二重
鎖DNAの形態のもの）約100マイクログラム（μｇ）をリ
ン脂質約0.1ないし10ミリグラム（mg）と組み合わせて
使用することが望ましい。陽イオン・リン脂質がリン脂
質配合物に用いられる場合は、特に核酸100μｇをリン
脂質0.2ないし1.2マイクロモル（μmole）、さらに核酸
100μｇをリン脂質0.8μmoleと組み合わせることが望ま
しい。
本発明の望ましいリポソーム組成物は、本発明の有益
化合物の有効量を含むリポソームを含む。望ましい有益
化合物は、ここでさらに説明するようなリポソーム組成
物の用途によって決まるものであり、メラニン、染髪
料、チロシナーゼ、核酸、毛髪の色の修復剤、毛髪の生
長促進剤、および目標とされる毛胞に薬物抵抗性を与え
る薬剤などが挙げられる。
3.毛胞に目標を定めた薬物療法 一つの態様において、本発明はほ乳動物の毛胞に治療
化合物および組成物を選択的および有益的に目標づける
方法を述べる。
この開示に基づき、化合物および組成物、特にポリマ
ー、染料、蛋白質、核酸および巨大細胞は、それらがリ
ポソームに内包されている限り、毛胞組織に特定的に送
達することができる。
本発明は、広範囲の有益な、また治療に役立つ化合物
を毛胞に送達すること、特に周囲の皮膚組織よりも毛胞
そのものに送達することと、本発明の方法により得られ
る基本的な結果を意図している。治療的化合物とは、核
酸、ホルモン、蛋白質、酵素、ビタミンおよび毛胞細胞
の成長、条件、色などに治療効果を持つその他の生化学
共因子を指す。
よって、本発明の方法および組成物に用いられる有益
な化合物は、大きすぎて角質膜や細胞膜のような脂質の
障壁を通過できないような巨大細胞やポリマー、化学的
性質のために脂質の障壁を通過できない嫌油性分子のよ
うな通常では毛胞に到達できない分子など、各種の分子
を含む。本発明において使用される他の有益な化合物と
しては、脂質の障壁と作用し合い、通過する好油性の化
合物であるが、他の組織の障壁、例えば真皮を通過でき
て、毛胞以外の細胞に対して望ましくない効果を及ぼす
ようなものも含む。したがって、有益な化合物は巨大細
胞、ポリマー、嫌油性分子、毛胞以外の細胞に望ましく
ない効果を及ぼす好油性分子などを含む。
特に望ましいものは、毛幹の成長を改善する薬剤（有
益な化合物）、胞細胞や毛幹中の色素を除くか、または
毛幹に色をつける（染める）薬剤、毛髪の成長を刺激す
る薬剤、そして毛髪の損失を抑止する薬剤である。
毛髪の色を修復したり、染めたりすることに有益な薬
剤は、メラニンや染髪料のように色素として直接毛髪に
色をつけるものと、蛋白質チロシナーゼのように酵素で
メラニン色素前駆体の生産に触媒作用をもたらして、毛
胞細胞中の色素の生産を増加するものと、核酸のように
チロシナーゼをコードし、発現するものと、毛髪の成長
を刺激したり、毛髪の損失を抑止するその他の蛋白質が
ある。
公知のように、メラニンは様々な形態や、ポリマーの
長さを持ち得る、チロシンのポリマーである。したがっ
て、「メラニン」という単語を使った場合、ここでは本
発明に使われる様々の形態のものを指すものとする。ま
た、本発明に使用されることが意図されているものとし
ては誘導メラニン、抽出メラニン、修正メラニン、およ
び毛髪色素を提供する望ましい性質を持つその他のメラ
ニンの変種がある。
染髪料も非常に良く知られており、広範囲の形態をと
り得るが、それによって本発明が制限を受けるものでは
ない。一般的に、染髪料は芳香性化合物で、しばしば突
然変異誘導性を有し、また、毛幹または毛胞以外の細
胞、例えば真皮や循環系の細胞に望ましくない影響を及
ぼす。したがって、本発明は毛胞に選択的に送達し、投
与された染髪料が毛胞以外の真皮やその他の組織に接触
する程度を低減するという利点を提供することが強調さ
れるべきである。
毛髪が失われる状態（脱毛症）で有効な薬剤として
は、毛髪の成長を刺激するもの、毛髪の損失を抑止する
もの、毛髪の損失を発生する状態、例えば化学療法剤を
抑止するものなどが挙げられる。毛髪の成長刺激剤は一
般的に公知であり、ミノキシジル、物質−Ｐ、サイクロ
スポリンなどの毛髪刺激剤である。
望ましい態様の一つは、化学療法中の毛髪の損失（脱
毛症）の防止であり、化学療法の薬剤が、毛胞およびそ
の周囲の組織に及ぼす影響が原因で、患者が化学療法に
起因する脱毛を経験する場合である。この場合、本発明
は化学療法薬剤の有害作用に対する抑止剤の使用を意図
する。本発明のリポソームを媒体とする送達方法によっ
て抑止剤を毛胞に選択的に投与することによって、化学
療法薬剤の抑止は毛胞に局在化し、従って化学療法薬剤
の目的とする全身的な作用には影響を及ぼさない。この
態様の場合、化学療法に起因する脱毛症の望ましい抑止
剤は、複数薬剤抵抗（MDR）遺伝子の遺伝子産物、望ま
しくはヒトのMDR−１遺伝子によって発現されたｐ−糖
蛋白質である。毛胞に、リポソーム経由で、ヒトのｐ−
糖蛋白質を発現する能力を持つ発現ベクターを含む核酸
を投与することにより、細胞間のヒトｐ−糖蛋白質を提
供し、毛胞に対する化学療法の毒性作用を減少し、それ
によって化学療法に起因する脱毛症を抑制する。
別の態様では、ヒトの形質転換成長因子−α（TGF−
α）遺伝子を“ウェーブした”毛髪の表現型を逆行させ
るために使用することが考えられている。例えばMannほ
か、Cell,73:249−261（1993）およびLuettekeほか、Ce
ll,73:263−278（1993）を参照。すなわち、本発明はTG
F−α遺伝子を発現するcDNA発現ベクターを、TGF−α遺
伝子の欠損がウェーブした毛髪の表現型の原因と考えら
れる場合にウェーブした毛髪の発生を減少するための有
益化合物として使用することも意図する。
発明はさらに毛胞に有益な任意の遺伝子の投与を意図
する。遺伝子は、本発明の方法によって毛胞に選択的に
送達されて毛胞に有益な効果を与える場合、毛胞に対し
て有益である。有益な遺伝子の例としては、正常にかつ
優先的に毛胞に発現される遺伝子が挙げられ、したがっ
て正常な遺伝子機能にとって重要である。有益な遺伝子
は様々な分子生物学的手法によって確認することができ
る。例えば、発現された遺伝子のcDNAライブラリーは、
健康な毛髪を支持する毛胞組織から生成することが可能
であり、また毛髪を生成しないまたは細毛を生成する毛
胞組織から誘導されたcDNAライブラリーに対する差し引
きハイブリダイゼションにより濃縮することが可能であ
り、それによって毛髪に特異的な発現を行うcDNA分子の
ライブラリーを生成することができる。毛髪に特異的な
cDNAライブラリー由来の個々のcDNA分子はさらに、本明
細書に記載した皮膚組織培養アッセイを使用して治療効
果のスクリーニングを行うことができる。
特に望ましいのは、毛髪の成長を刺激することができ
る遺伝子であり、ここでは毛髪成長刺激遺伝子と呼ぶ。
毛髪成長刺激遺伝子は、このリポソームを媒体とする送
達方法によって皮膚の毛胞に投与した場合、毛髪の成長
を刺激するような任意の核酸を指す。毛髪成長刺激遺伝
子は上述のような毛髪に特異的なcDNAライブラリーから
生成することができる。毛髪成長刺激遺伝子は毛髪に特
異的なcDNAライブラリーから様々な方法で選択すること
ができる。この遺伝子は強力な毛幹生成力を持つ皮膚組
織から得たcDNAライブラリーを、強力な毛幹生成力の無
い皮膚組織、例えば毛髪が無かったり、薄くなっている
皮膚の部分から得たcDNAライブラリーに対して使用し、
差し引きハイブリダイゼションにより確認することがで
きる。皮膚のそれらの部分には、毛胞は存在するが胞細
胞が遺伝子発現に変化を起こしつつあり、それによって
毛髪の状態、特に毛幹の成長率が影響を受けているので
ある。毛髪の成長に欠陥を持ったcDNAライブラリーに対
する減法交雑の結果生じるcDNAライブラリーは、さらに
毛髪成長刺激遺伝子を見つけるために、毛髪成長を刺激
する能力を持っているcDNAを求めて試験管内皮膚組織培
養評価でスクリーニングされる。cDNAライブラリーを分
離する方法と減法交雑を実施する方法はこの分野におい
ては公知であり、本発明を限定するものと考えられては
ならない。
治療薬剤は、色素沈着蛋白質または酵素そのもののよ
うな、活性組成物の形態で毛胞に送達するか、または遺
伝子置換療法によって提供され、それによって送達すべ
き蛋白質が発現されるように核酸が導入される。この遺
伝子治療と呼ばれるモードにおいては、置換療法蛋白質
が提供され、それが有益な効果を発起する。この蛋白質
は、この療法が蛋白質をベースとする、今まで存在して
いなかった機能を組織内に再形成する（置換える）とい
う意味を表すために置換療法蛋白質と呼ばれる。それは
遺伝子または蛋白質がまず最初に意図的に取り除かれ、
次に置換えられるという意味ではない。
再びくりかえすが、ある種の化合物は毛胞以外の組織
または細胞、例えば真皮や、循環系によって到達し得る
他の組織に望ましくない効果をもたらす可能性がある。
したがって、本発明がもたらす選択性によって、ある種
の有益な化合物がもたらす毒性または望ましくない効果
を低減するという長所が得られる。これは毛髪の成長刺
激剤としては有用であるが、循環系に接した場合、免疫
システムを抑圧する可能性を持つサイクロスポリンや、
循環系のように化学抵抗性を与えることは望ましくない
組織に化学抵抗性を与える薬剤などの場合、特に重要な
特性である。
本発明のリポソーム組成物において治療蛋白質の治療
適量は、望ましい結果を生むのに十分な量であり、病気
の状態と治療化合物の効力によって変化する。
よって、一つの態様においては、本発明は有益な化合
物をほ乳動物の毛胞に次のようなステップを経て直接的
かつ選択的に送達することを意図する。
ａ）少なくとも一種類の有益な化合物の有効量をリポソ
ームに取り込み ｂ）該リポソームをそのほ乳動物の毛胞を複数個持つ皮
膚部分に適用し、 それによって該有益化合物が該毛胞に優先的に伝達さ
れ、該毛胞に入る。
関連する一つの態様において、本発明は、ほ乳動物の
毛胞に有益な化合物を直接的かつ選択的に送達する方法
を記載し、該方法は、複数の毛胞を持つほ乳動物の皮膚
部分に本発明のリポソーム組成物を局所的に適用するス
テップを含む。そのリポソーム組成物は、少なくとも一
種類の選ばれた有益化合物の有効量を含むリポソームを
含み、その場合、そのリポソームは選択的に有益化合物
を毛胞に送達し、それによって有益化合物は優先的に毛
胞に伝達され、毛胞に入る。
上述のように、その有益化合物は蛋白質、核酸または
毛胞細胞に送達されたときに望ましい性質を持っている
その他の分子である。その化合物がメラニンや染髪料の
ような色素であれ、チロシナーゼなどの蛋白質であれ、
目的はここに示したように毛髪の色を修復することにあ
る。または、化合物がアロミターゼや、サイクロスポリ
ンである場合、目的は毛髪の成長を刺激することにあ
る。あるいは、化合物がチロシナーゼ、アロミターゼ、
ｐ−糖蛋白質、TGF−α、毛髪生育刺激遺伝子または他
の有益な蛋白質をコードする核酸であるか、あるいはア
ンチセンスまたはリボザイム核酸を上記のようにコード
し、発現することができる。
よって、関連する一つの態様においては、本発明は、
毛胞が群生しているほ乳動物の皮膚部分に治療上有効な
量のリポソーム組成物を適用することによってほ乳動物
の毛髪の色を修復する方法を意図する。リポソーム組成
物は毛髪の色を修復する能力のある有益な化合物（毛髪
修復薬剤）の有効量を含む。毛髪修復は各種の染髪料、
メラニン色素、蛋白質チロシナーゼ、またはここに述べ
たように、チロシナーゼcDNAを発現する能力を持った核
酸でも良い。
関連した一つの実施例において、本発明は、毛胞が群
生するほ乳動物の皮膚に治療上有効な量のリポソーム組
成物を適用することによって、化学療法を施されている
ほ乳動物の化学療法に起因する脱毛症を抑止する方法を
意図する。そのリポソーム組成物は化学療法の毒性効果
を胞細胞の環境において抑止し得る有益な化合物、例え
ば、毛胞細胞と毛胞に対して薬剤耐性を与える蛋白質の
有効量を含んでいる。化学療法の毒性を抑止するあらゆ
る化合物はこの意図に含まれるが、MDR−１遺伝子産物
（ｐ−糖蛋白質）が特に望ましい。
本方法は、牛、羊、馬、ヤギ、豚などの牧畜用動物、
猫、犬などのペット、人間などのほ乳動物において実施
することができる。一般的にほ乳動物の皮膚には毛胞が
存在しており、本方法は生きているほ乳動物の生体内
で、そのほ乳動物の毛胞や毛幹の状態を改善するために
実施される。
一つの態様においては、運ばれた有益な化合物は毛髪
の成長、脱毛症、毛髪の色または毛髪の状態に影響を及
ぼす蛋白質である。望ましい例としては蛋白質チロシナ
ーゼまたはアロミターゼおよび毛髪を改変する蛋白質を
コードする核酸である。関連する態様においては、選ば
れた有益な化合物はメラニンのような色素である。
メラニン、染髪料およびチロシナーゼは毛髪を染色す
るために望ましい材料である。アロミターゼ、ミノキシ
ジルおよびシクロスポリン−Ａは毛髪の成長を刺激する
ために望ましい材料である。脱毛症の状態において毛髪
の成長を刺激するために好適な治療用の化合物はシクロ
スポリン類似体、物質−Ｐ、エストロゲン類似体および
抗男性ホルモンである。例えば顔面の毛や陰毛などの毛
髪の成長を抑止するために好適な治療用の化合物として
は、脱毛誘起剤、カタゲン抑制剤、表皮成長因子および
その他の毛髪生長抑止剤が挙げられる。
別の態様においては選ばれた有益化合物は、毛髪の生
長、脱毛症、毛髪の色または毛髪の状態に影響を及ぼす
有益な蛋白質を発現する能力を持つ核酸である。望まし
いのは蛋白質チロシナーゼ、アロミターゼ、もしくはそ
の他の毛髪生長刺激剤を発現する核酸、化学療法に起因
する脱毛症を抑止するMDR−１遺伝子の蛋白質産物（例
えばｐ−糖蛋白質）、またはそれらの蛋白質を合成する
酵素である。
望ましい態様の一つにおいては、この発明は、ほ乳動
物、特に年齢を含む様々な理由のために毛の色が灰色に
なった人間の毛髪の色を修復する方法を意図している。
この方法は、色が薄弱になったり、灰色になっている複
数の毛胞を持っているほ乳動物の皮膚部分に本発明のリ
ポソーム組成物の治療上の有効な量を適用することから
なる。リポソーム組成物は染髪料、メラニン、チロシナ
ーゼまたは毛胞細胞においてヒトのチロシナーゼを発現
することができる核酸などの本発明の毛髪の色を修復す
る物質の有効量を含むことが望ましい。好ましくは、そ
の核酸は、SEQ ID No.1に示されたチロシナーゼ遺伝子
配列のヌクレオチド配列特性を含むヒトのチロシナーゼ
遺伝子をコードする。
態様の一つにおいては、リポソーム組成物の適用は、
長期にわたる毛髪の色の修復の、または長期にわたる薬
剤耐性のように、治療の目的に応じて長期にわたる効果
を提供するために所定の間隔で繰り返すことができる。
本発明のリポソーム組成物が治療に使用されるかぎり
においては、リポソーム組成物そのものは、治療用組成
物であり、その他の成分を含むこともある。
本発明の治療用組成物には、ここに述べたように少な
くとも一種類の本発明のリポソーム組成物を生理学的に
許容できる担体とともに含んでおり、リポソームはその
中に活性成分として分散されて存在している。望ましい
態様の一つにおいては、治療用組成物は治療の目的で人
間の患者に投与された場合免疫性がない。
ここで「薬学的に許容できる」と「生理学的に許容で
きる」という用語とそれらの文法上の変形は、組成物、
担体、希釈体および試薬について使われる場合、全く互
換的に用いられ、ほ乳動物または人間に投与した場合
に、吐き気、めまい、胃の調子を崩すなどの望ましくな
い生理学的効果を起さないような物質を指すものとす
る。
活性成分を分散した状態で含む薬剤組成物を作る方法
はこの分野においては公知である。一般的にそのような
組成物は、水溶性または非水溶性の溶液または懸濁液と
して作られるが、使用直前に液体に懸濁することも可能
である。
この活性成分は薬学的に許容でき、活性成分と適合性
のある付形剤をここに述べたような治療法に適応した量
だけ混合することができる。好適な付形剤は、例えば、
水、塩水、デキストローズ、グリセロール、エタノール
などとそれらの組み合わせである。さらにもし必要であ
れば、わずかな量の湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤など
の活性成分の効果を強化する補助剤を含んでいてもよ
い。
本発明の治療用組成物は、薬学的に許容できるそれら
成分の塩（例えば、蛋白質、核酸または他の化合物）を
含むことができる．薬学的に許容できる塩は、無機酸、
例えば、塩酸、リン酸、または有機酸、例えば、酢酸、
酒石酸、マンデル酸などによって生成された酸付加塩
（ポリペプチドの遊離アミノ基によって生成された）を
含む。また、遊離カルボキシル基によって生成される塩
は、ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウムま
たは水酸化鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミ
ン、トリメチルアミン、２−エチルアミノ・エタノー
ル、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導で
きる。
生理学的に許容できる担体はこの分野において公知で
ある。液状担体の例は無菌水溶液で、活性成分と水以外
には何も含んでいないか、または生理学的pH値のリン酸
ナトリウム、生理学的塩水またはその両方（例えばリン
酸塩緩衝塩水など）を含んでいる。さらに、水性担体
は、一種類以上の緩衝液塩、例えば塩化ナトリムウ、塩
化カリウム、デキストロース、プロピレン・グリコー
ル、ポリエチレン・グリコールおよびその他の溶質を含
むことができる。
液状組成物はまた、水に加え、または水以外の液相を
含むことができる。そのような追加の液相としては、グ
リセリン、植物油、例えば、綿実油、有機エステル例え
ばオレイン酸エチル、水−油乳濁液などが挙げられる。
治療用組成物は、本発明のリポソーム組成物を、典型
的には治療用組成物の全重量に対して、少なくとも0.1
重量パーセントの量で含む。重量パーセントは全組成物
に対するリポソーム組成物の重量の比率である。したが
って、0.1重量パーセントは全組成物の100グラムに対し
て、リポソーム組成物が0.1グラムあることを意味す
る。
リポソーム組成物またはその中の有益化合物の治療上
有効な量は、望ましい効果を与えるべく、すなわち、与
えるべき利益に応じて、目標となる毛胞に有効に利益を
与えるべく、計算された所定の量である。したがって、
有効な量は患者の毛胞または毛幹の状態に関連する一つ
または複数の症状の改善によって測定することができ
る。
よって、本発明のリポソーム組成物の投与量は処理す
べき毛胞の状態が改善されるような望ましい効果をもた
らすのに十分な範囲とする。投与量は、有害な副作用を
生じるほど大きくてはならない。一般的に、投与量は患
者の年齢、状態、性別および症状の程度に従って変化
し、この分野の一つの技能によって決定可能である。
投与量は、合併症が生じた場合は、個々の医師の判断
によって調節することができる。
組成物は投与の処方に適した方法で、かつ、治療上有
効な量で投与される。投与量は患者、活性成分を利用す
る患者のシステムの容量および望ましい治療効果に依存
する。投与されるべき活性成分の精密な分量は実施者の
判断により、各個人によって異なる。しかしながら全身
に適用するために好適な投与量はここに開示され、投与
の状態による。投与のために好適な方法は様々である
が、典型的な例としては、最初の投与のあと、１時間以
上の感覚でその後の投与を行う。
4.遺伝子治療のための核酸発現ベクター 特に望ましい一つの態様においては、本発明は本発明
のリポソームを媒体とする目標づけ方法によって有益な
蛋白を発現するための発現ベクターとして機能し得る組
み換え型DNA分子の使用を意図する。
「組み換え型DNA（rDNA）分子」は、二つのDNAセグメ
ントを、機能を発揮するように連結することによって生
成されるDNA分子を意味する。従って、組み換え型DNA分
子は、一般的には天然では一緒に発見されることのな
い、少なくとも二種類のヌクレオチド配列を含む雑種DN
A分子である。共通のオリジンを持っていない、すなわ
ち、発生的に異なるrDNAは「異種」と言われる。
生体においては蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸
残基配列は遺伝子コードを介して蛋白質をコードする構
造遺伝子のデオキシリボ核酸（DNA）配列に直接関連す
る。従って、構造遺伝子またはDNAセグメントはアミノ
酸残基配列、すなわちそれによってコードされる蛋白質
またはポリペプチドによって定義される。
遺伝子コードの重要で、公知の特長はその重複性であ
る。すなわち、蛋白質を作るのに用いられたアミノ酸の
大半にとっては、１種類より多くのコードするヌクレオ
チド・トリプレット（コドン）が、特定のアミノ酸残基
をコードし、指定する。したがって、多くのヌクレオチ
ド配列が特定のアミノ酸残基配列をコードし得る。それ
らのヌクレオチド配列はすべての生体において、同じア
ミノ酸残基配列を生成するので機能的に同等であると考
えられる。時によると、プリン体またはピリミジンのメ
チル化した変種が所与のヌクレオチド配列に組み込まれ
うる。しかしながら、そのようなメチル化はコーディン
グの関係に決して影響を及ぼすものではない。
本発明において使われるDNAセグメントは、ここに述
べられたような有益な蛋白質をコードするDNA配列を含
むことを特徴としている。特に望ましいセグメントはチ
ロシナーゼ、アロミナーゼ、他の毛髪生長刺激蛋白質、
メラニン、ｐ−糖蛋白質、TGF−α、またはそれらの蛋
白質を合成する酵素をコードする。すなわち、本発明の
DNAセグメントは、列挙した有益な蛋白質の１種または
数種をコードする構造遺伝子の存在によって特徴づけら
れている。望ましくは、その遺伝子はコドンの連続的な
直線配列として存在し、そこでは各コドンが有益な蛋白
質に存在するアミノ酸残基をコードしている、すなわち
イントロンのない遺伝子である。
望ましい態様の一つは、チロシナーゼ蛋白質に連鎖的
に対応するチロシナーゼを定義するアミノ酸残基配列を
コードするDNAセグメントであり、そのDNAセグメントは
チロシナーゼを発現することができる。望ましいDNAセ
グメントは、実質的にはチロシナーゼをコードする核酸
配列によって構成されるアミノ酸残基配列をコードす
る。ヒトのチロシナーゼ遺伝子とそのヌクレオチド配列
は、ヒトのチロシナーゼを発現するためのcDNA配列を含
み、公知であり、下記文献に詳述されている。Tamate
ら、J.Exp.Zool.,250:304−311（1980）；柴原ら、J.Ex
p.Med.,156:403−414（1989）；竹田ら，Biochem.Bioph
y.Res.Comm.,162:984−990（1989）;Bouchardら，J.Ex
p.Med.,169:2029−2042（1982）；およびBrichard,J.Ex
p.Med.,178:489−495（1993）。
遺伝子コードに重複性が存在するかぎり、各種のヌク
レオチド配列が特定のアミノ酸残基配列を発現するため
に利用されることがあるということが了解されている。
それゆえ、１態様では、本発明は、好ましくはSEQ ID N
O1.に示されるアミノ酸残基配列のアミノ酸残基配列特
性をもつヒト・チロシナーゼ蛋白質をコードするヌクレ
オチド配列の使用を意図している。本発明によれば、ヒ
ト・チロシナーゼを発現するのに特に好適なヌクレオチ
ド配列は、SEQ ID NO.1に示されるヌクレオチド配列の
ヌクレオチド配列特性をもつ。
ヒト・チロシナーゼ遺伝子の発現には、ベクターが哺
乳動物細胞、特にヒト細胞に対して拒絶反応を起こさな
いかぎり多様な発現ベクターのいずれも利用できる。適
切なベクターはよく知られている。好適なベクターは実
施例で説明するpRHOHT2ベクターであるが、他の哺乳動
物の発現ベクターも適切である。
他の好適な態様は、多重薬剤耐性（MDR）遺伝子産物
を定義するアミノ酸残基配列をコードするDNA断片であ
るが、より好適なのは、ｐ−糖蛋白質と呼ばれるMDR−
１遺伝子産物で、配列が野生型のｐ−糖蛋白質と一致す
るものであり、かつDNA断片がｐ−糖蛋白質を発現でき
るものである。好適なDNA断片は、本質的にｐ−糖蛋白
質をコードする核酸配列から成るアミノ酸残基配列をコ
ードする。ヒトｐ−糖蛋白質、MDR−１遺伝子およびMDR
−１ヌクレオチド配列は、ヒトｐ−糖蛋白質を発現する
ためのcDNA配列とともによく知られており、おつ、Chen
et al.,Cell.47:381:389（1986）、Ueda et al.,J.Bio
l.Chem.,262:505−508（1987）およびKioka et al.,Bio
chem.Biophys.Res.Comm.,162:224−231（1989）に記述
されている。
遺伝子コードに重複性がある限りにおいて、本発明は
ヒトｐ−糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列で、好
適にはSEQ ID NO.2に示されるアミノ酸残基配列のアミ
ノ酸残基配列特性をもつヌクレオチド配列の使用を意図
するものである。本発明によれば、ヒトｐ−糖蛋白質の
発現のため特に好適なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.
2で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列特性
を有する。
他の好適な態様は、配列が野生型のTGF−α蛋白質と
一致する形質転換中の成長因子アルファ（TGF−α）蛋
白質を定義するアミノ酸残基配列をコードするDNA断片
であり、該DNA断片はチロシナーゼを発現することがで
きる。好適なDNA断片は、本質的にTGF−αをコードする
核酸配列からなるアミノ酸残基配列をコードする。ヒト
TGF−α遺伝子およびそのヌクレオチド配列は、ヒトTGF
−αを発現するためのcDNA配列とともによく知られてお
り、Jakowlew et al.,Mol.Endocrinol.,2:1056−1063
（1998）に記述されている。
遺伝子コードに重複性がある限りにおいて、本発明は
ヒトTGF−α蛋白質をコードするヌクレオチド配列で、
好適にはSEQ ID NO.3で示されるアミノ酸残基配列のア
ミノ酸残基配列特性をもつヌクレオチド配列の使用を意
図するものである。本発明によれば、ヒトTGF−αを発
現するため特に好適なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.
3に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列特性
をもつ。
また、前述の有益な蛋白質をコードする相同性DNAお
よびRNA配列も意図している。
他の態様では、本発明は、毛胞細胞遺伝子の発現を選
択的に抑制するためのアンチセンスまたはリボザイム核
酸の毛胞細胞への送達、および毛胞細胞機能面の抑制を
意図している。
アンチセンス核酸は本分野では一般によく知られてお
り、メッセンジャーRNA（mRNA）のセンス鎖とハイブリ
ダイゼーションする機能を有し、その結果ハイブリダイ
ゼーションされたmRNA分子の通常の発現を阻止する。ア
ンチセンス核酸の配列は、公知のように、ハイブリダイ
ゼーションが行われるmRNAのヌクレオチド配列に左右さ
れる。例えば、Stein et al.,Science,261:1004−1012
（1993）を参照。
またリボザイム核酸は、ssRNAおよびssDNAを選択的に
分割できる１本鎖（ss）RNA分子として、本分野では一
般によく知られている。リボザイムは、毛胞細胞内で、
標的ssRNAまたはssDNA分子の開裂により、遺伝子発現を
選択的に抑制するのに有用である。
アンチセンスまたはリボザイム核酸の典型的な標的
は、脱毛症、抜け毛、毛髪の色素、強度、状態の低下な
ど、毛胞および毛幹の望ましくない特徴の原因となる遺
伝子のような毛胞細胞内の有害な遺伝子である。好適な
態様では、本発明はリポソームを媒介物として、アンド
ロゲン受容体を生成する遺伝子の発現を抑制することが
できるアンチセンスまたはリボザイム核酸を送達するこ
とで、受容体の毛胞細胞生成を抑制し、その結果毛髪の
脱落を阻止できることを意図している。
アンチセンスまたはリボザイム核酸の調整および使用
は本分野ではよく知られており、特定のアンチセンスま
たはリボザイム核酸のデザインそれ自体は、本発明の一
部とは考えられない。しかし、本発明が、送達される核
酸により発揮される効果の送達および選択性を改善する
ために、リポソームを媒介物としてアンチセンスまたは
リボザイム核酸を毛胞へ送達する方法を意図する限りに
おいて、本発明は特定の種類に限られるものではなく、
むしろ有益な化合物としてその送達の一般的方法を説明
するものである。
有益な蛋白質をコードするより大きなDNA断片の生成
に用いられるDNA断片（すなわち合成オリゴヌクレオチ
ド）は、例えば、Matteucci,et at.,（J.Am.Chem.Soc.,
103:3185−3191）のホスホトリエステル方法、あるいは
自動合成法を用いる化学的技法により容易に合成でき
る。さらに、より大きなDNA断片はより小型のDNA断片か
ら、DNA断片を定義づけるオリゴヌクレオチド・グルー
プの合成、続いて完全な断片を形成するためのオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーションおよび連結など、
公知の方法で容易に作製することができる。
さらに、本来有益な蛋白質をコードする構造遺伝子か
ら成るDNA断片は、自然源から単離された有益な蛋白質
を定義する遺伝子を含有する組換えDNA分子から得られ
る。自然源の例は本文で指摘した参考文献に記載されて
おり、そこには、cDNA配列が記述されている。
そのほか、本発明は本発明のDNA断片を含有する組換
えDNA分子（rDNA）の使用を意図している。rDNAは、ベ
クターを本発明のDNA断片に操作可能に結合することに
より作製することができる。
本文中で使用されているように、「ベクター」とは、
細胞内で自律的な複製が可能なDNA分子で、そのDNA分子
に他のDNA断片を操作可能に結合することにより、つな
がれた断片の複製を誘発することができるDNA分子を意
味する。有益な蛋白質をコードする遺伝子の発現を指令
できるベクターは、本文中では「発現ベクター」と呼ば
れている。従って、組換えDNA分子とは、自然界では通
常は共には存在しない少なくとも２つのヌクレオチド配
列を含むハイブリッドDNA分子である。
本発明のDNA断片が操作可能に結合するベクターの選
択は、本分野でよく知られているように、蛋白質の発現
や形質変換される宿主細胞などのような好ましい機能的
特性に直接依存しており、この事実は組換えDNA分子の
構造の分野に特有の限界である。しかし、本発明が意図
するベクターは、少なくとも、DNA断片に操作可能に結
合されて含まれている有益な蛋白質構造遺伝子の複製の
指令、そして好適には発現も指令することが可能であ
る。
好適な態様では、本発明が意図するベクターは、原核
生物のレプリコン、すなわち、形質転換された細菌宿主
細胞などの原核生物の宿主細胞内で、組換えDNA分子の
自律的な複製および維持を指令する能力をもつDNA配列
を含む。かかるレプリコンは本分野ではよく知られてい
る。さらに、原核生物のレプリコンを含めたそれらの態
様には、遺伝子の発現が細菌宿主に薬剤耐性を起すもの
も含まれる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピ
シリンまたはテトラサイクリンに対して耐性を与える遺
伝子である。
原核生物のレプリコンを含むベクターには、細菌宿主
細胞内、例えばそれによって形質転換される大腸菌など
において有益な蛋白質の遺伝子の発現（転写および翻
訳）を指令することができる原核生物のプロモータを含
めることができる。プロモータはDNA配列により作られ
た発現制御要素であり、RNAポリメラーゼの結合と転写
の開始を指令する。細菌宿主と適合するプロモータ配列
は、一般に、本発明のDNA断片の挿入に便利な制限部位
を含むプラスミド・ベクターのなかで準備される。かか
るベクター・プラスミドの典型的な例には、Biorad Lab
oratories（Richmond,CA）より入手できるpUC8,pUC9,pB
R322およびpBR329ならびに、Pharmacia,Piscataway,N.
J.より入手できるpPLおよびpKK223がある。
本発明で使用の組換えDNA分子を形成するため、真核
生物細胞と適合し、好適には哺乳動物の細胞、特に毛胞
細胞と適合する発現ベクターを用いることができる。哺
乳動物の細胞を発現するベクターは、本分野ではよく知
られており、数社より入手が可能である。一般に、かか
るベクターは、適切なDNA断片の挿入に都合のよい制限
部位を含めて提供され、また哺乳動物の細胞内の遺伝子
発現に必要な標識も提供している。かかるベクターの典
型的な例には、Invitrogen（San Diege,CA）より入手で
きるpREPシリーズ・ベクターおよびpEBVhis、American
Type Culture Collection（ATCC）より入手できるベク
ターpTDT1（ATCC＃31255）,pCP1（ATCC＃37351）および
pJ4W（ATCC＃37720）、ならびに類似の哺乳動物の発現
ベクターなどがある。
特に好適なベクターは、組織特異的に遺伝子の発現を
可能にする哺乳動物の発現ベクターであり、この場合、
遺伝子の発現を毛胞細胞に制限する調節プロモーターの
作用による。
首尾よく形質転換された毛胞細胞、すなわち本発明の
rDNA分子を含む毛胞細胞は、公知の手法で同定すること
が可能である。例えば、本発明のrDNAの導入により形成
される細胞は、Southern,J.Mol.Biol.,98:503（1975）
またはBerent et al.,Biotech.,3:208（1985）に記述さ
れているような核酸ハイブリダイゼーション法を用い
て、特定のrDNAの存在を検出するためのアッセイを行う
ことが可能である。
形質転換の成功を確認するには、rDNAの存在を検出す
るアッセイを直接行うほか、発現蛋白質を検出するため
の公知の免疫学的方法も可能である。例えば、発現ベク
ターで首尾よく形質転換された毛胞細胞は、有益な蛋白
質を示す蛋白質を生成し、それは免疫学的方法で直接ア
ッセイを行うことが可能である。
標的組織が首尾よく形質転換されたことを確認する別
の方法として、有益な化合物の投与により機能が発揮さ
れたかどうかを調べる標的組織の評価がある。例えば、
化合物がチロシナーゼを発現する核酸である場合、発揮
される色素機能や、チロシナーゼ活性の存在、あるいは
Ｌ−ドーパ産物への酵素的変換は、標的組織で直接検出
することができる。
B.毛胞に有益な蛋白質をコードする遺伝子を同定する方
法 他の態様では、本発明は毛胞に対して有益な効果を発
揮する蛋白質をコードする遺伝子を同定する方法を提供
する。その方法は次の幾つかのステップで構成されてい
る。（１）興味の対象である遺伝子を含む核酸分子を、
本発明のリポソーム組成物の中へ取り入れること。
（２）核酸含有（核酸を包み込んだ）リポソームを、本
文中に記述されている、少なくとも１つの毛胞をもつ皮
膚標本の組織培養と接触させることにより、核酸を毛胞
に送達すること。（３）コードされたいかなる蛋白質の
発現の時点で、送達された核酸が毛胞に有益な効果を発
揮しているかどうかを観察すること。観察された結果
は、毛髪の色、状態、成長率、活力等の変化や、関連す
る毛胞の細胞構造の条件の変化、細胞反応の現われなど
の変化であり得る。
１態様では、本方法は、毛胞に有益な効果をもたらす
蛋白質を発現できる遺伝子の存在を検出するための遺伝
子ライブラリーのスクリーニングによく適合している。
遺伝子ライブラリーは、公知のようにcDNAライブラリー
またはゲノムDNAライブラリーの形でもよい。有益な効
果が発揮されるかどうかは、本文中でさらに説明するよ
うに、効果を検出するためのスクリーニング法に依存さ
れる。
以下の実施例は、本発明の特定の態様の説明を提供す
るものであり、明細書および特許請求範囲をいかなる方
法にても限るものではない。本実施例は毛胞と毛髪の成
長問題に対するリポソームを基にした治療法の適用と試
験について詳しく説明している。部およびパーセントは
その旨の表示がないかぎり重量を表わす。
実施例 1.リポソームを媒介物とする色素の毛胞への送達 リポソームを媒介物とする有益な薬剤の毛胞への送達
は、毛胞を含む皮膚標本が培養されて毛胞の成長を可能
にする自然状態の皮膚サンプルの組織培養法、および、
治療学的リポソームで治療中の毛胞細胞の詳細な観察を
行うことにより立証される。
皮膚の組織培養のため、異系交配の白毛マウスまたは
ヌードマウスの剃毛された皮膚片約２×５×2mmが、解
剖顕微鏡の下で数片採取され、つづいて、Li et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1908−1912（1991）に記述さ
れているコラーゲン・ゲルで支持されたスポンジ上で組
織培養された。組織培養が約24時間続けられたあと、皮
膚の組織培養をリポソーム試料と接触させた。
リポソームは約15mgのフォスファチジルコリン（PC）
乳剤を、1ml当たり約20mgの蛍光染料カルセインを含有
するリン酸塩緩衝食塩水（PBS）の中で超音波をかける
ことにより準備された。また、リポソームは1ml当たり
約20mgのNBD化合物を含有する乳剤を使用してNBDフォス
ファチジルコリン蛍光染料を包み込むことにより準備さ
れた。リポソームは、リン酸塩緩衝食塩水で薄められた
セファロース4Bカラム上のゲル濾過により、包み込まれ
なかった染料から分離された。包み込まれた染料の量は
分光蛍光計で測定された。２種類のPC、すなわちエッグ
PC（EPC）およびジパルミトイルPC（DPPC）が用いられ
た。相変化温度の理由により、DPPCから作られたリポソ
ームは約37℃でゲル相にあり、一方EPCから作られたリ
ポソームは37℃で液体−結晶相にある。
マウス皮膚の組織培養のサンプルは、各リポソームな
らびにリポソームの準備で用いたものと同濃度の（包み
込まれなかった）「フリー」カルセイン染料の溶液によ
り、約20分間培養された。余分のリポソーム組成物を除
去するため、組織サンプルをリポソーム無含有の培地で
十分洗浄したあと、標本をBioRad社のBHSフィルター・
ブロック付きMRC600型レーザー共焦顕微鏡で分析した。
この顕微鏡は488nmの波長で組織を刺激し、520nmの波長
で放射される光を通すものである。これらのパラメータ
は、Haugland,（Ed.）Molecular Probes.Handbook of F
luorescent Probes and Research Chemicals,Molecular
Probes,Inc.,Eugene,（1989−1991および1992−1993）
により報告されているカルセインのための刺激と放射の
最大値に近い。これらの放射および刺激波長が使用され
るとき、組織の自己蛍光は見られない。MRC−600型共焦
映像装置（Bio−Rad社、Richmond,CA）をPlanApo社の10
Xの対物レンズを備えたニコンのOptiphotに装着した。
図1Aはカルセインを包み込んだEPCリポソームで培養
された皮膚の組織培養を示す。蛍光染料が高い効率で毛
胞へ優先的に送達されていることに注意。図1Bは「フリ
ー」カルセイン溶液で培養された皮膚の組織培養を示
す。いずれの特定皮膚構造にも優先的な着色が見られな
い比較的低い蛍光に注意。図1Bの写真は図1Aと同じレン
ズ口径および利得調節のパラメーターで作成された。
使用されるリポソームの型に依存するリポソーム媒介
の送達における相違の実験には、リポソームにDPPCを用
いたほかは上記と同様に準備した。カルセインまたはNB
Dフォスファチジルエタノールアミンのいずれかを蛍光
標識として用いて得られた結果は、EPCが使用されたと
き毛胞内よりもむしろ毛胞の表面において毛胞の選択的
標識を示した。従って、異なるリポソーム組成物によ
り、あらかじめ選択された毛胞の部位へ選択的に送達さ
れる可能性が増すことがわかる。
上述の結果は、DPPCまたはEPCリポソームに包み込ま
れた染料による毛胞への特に優先的な着色と、「フリ
ー」染料による毛胞への優先的な着色の欠如とを比較し
た場合の差異を示している。従って「フリー」染料に比
べ、リポソームに包み込まれた染料は毛胞と特異的に結
びつき、リポソームが特に毛胞を標的にすることを示し
ている。
2.リポソームを媒介物とするメラニンの毛胞への送達 毛胞を標的にした有益な化合物の送達は、メラニンを
モデルに使用して立証されている。それはメラニンが色
素沈着という利益を供するからである。
この目的で、超音波処理によりリポソームを準備し
た。5mlの丸底フラスコの表面に薄膜を形成するため、
クロロフォルム溶液から約20mgのエッグ・フォスファチ
ジルコリンを真空ドライヤーで約１時間回転蒸発させ
た。乾燥したリン脂質の薄膜は渦動ミキサー上の約0.5m
lのリン酸塩緩衝食塩水（pH7.4）の中で懸濁され、つづ
いて、マイクロチップを供えたBranson社のプローブ型
の超音波処理器で、パワーレベル３で約８分間超音波処
理が行われた。つづいて、超音波をさらに約４分かける
ことにより、0.5mlのメラニン溶液（10mg/ml）が上記の
懸濁物に包み込まれた。リポソームは包み込まれなかっ
たメラニンから、リン酸塩緩衝食塩水と平衡状態にある
セファロース4Bカラム上のゲル濾過により分離された。
異系交配された生後１、２週間の白毛マウスの皮膚の
一部を数片（各サイズは約２×５×2mm）解剖顕微鏡の
下で採取した。つづいて、これらのサンプルを、例１に
記述するように、コラーゲン・ゲルで支持されたスポン
ジ上で組織培養した。約24時間組織培養が続けられたあ
と、リポソームとこの皮膚標本との接触が開始された。
マウス皮膚の組織培養はリポソームとともに約12時間イ
ンキュベートされた。対照として、リポソームの標本で
用いられたものと同濃度の「フリー」メラニン溶液を、
組織培養された皮膚の一部とともに同じく約12時間イン
キュベートした。
皮膚の組織培養は、生きた細胞だけに存在する非特異
性のエステラーゼの作用により蛍光を放つ染料２′,7′
−bis（２−カルボキシエチル）−５で対比染色され
た。組織が十分洗浄されたあと、フルオレセイン・キュ
ーブを備えたニコンの蛍光顕微鏡で標本を分析した。顕
微鏡下では、生きた組織および細胞は緑色の蛍光を放
ち、組織に局在する黒くて濃いメラニンの沈着が、緑の
蛍光色をバックに鮮明に観察できる。つぎに、すべての
皮膚サンプルをフォルマリンで固定し、脱水、パラフィ
ン化、パラフィン埋込み、ヘマトキシリンおよびエオシ
ン（Ｈ＆Ｅ）染色などにより処理した。
図２は、リポソームを媒介物として、メラニンがＨ＆
Ｅで染色された皮膚の組織培養の毛胞へ標的送達された
ことを示している。メラニンを包む込んだリポソームで
約12時間処置が行われた白毛マウスの皮膚のパラフィン
切片標本では、大多数のメラニンが毛胞の周囲に局在し
ているのが観察される。図３はＨ＆Ｅ染色の毛胞の断面
である。リポソームに包め込まれたメラニンが、毛幹そ
のものに送達され、典型的な通常色をもつ毛幹の末端が
区別されたケラチノサイトにおいて、バンド様メラニン
分布模様が形成されていることを示している。図３で観
察されたリポソームによって送達されたメラニンが、自
然のメラニン色素をもつ毛幹を模倣して、毛幹に自然な
模様を描き出していることに注意。皮膚の組織培養が
「フリー」メラニンで培養された対照では（ここには図
示されていない）、毛幹にも毛胞細胞にも「フリー」メ
ラニンは観察することができない。
従って、リポソームは重要で大きなポリマーを毛胞へ
特異的に送達するだけでなく、通常の模様で毛幹そのも
のに入ることが可能である。
3.リポソームを媒介物とする核酸の毛胞への送達 a.核酸の培養細胞系への送達 核酸の毛胞への標的送達は、DNA発現ベクターの典型
的なサイズおよび、典型的な構造遺伝子のサイズの理由
から蛋白質を発現できる核酸のモデルとして、約１キロ
ベース（kb）の長さに分割されたマウスのゲノムDNAを
使用して証明された。
約1kbのDNAをマウスのゲノムDNAライブラリーから単
離し、低沸騰点をもつアガロースからMagic DNA Purifi
cation Kit（Promega社、Madison,WI）で精製された。
約50ngのDNAに、Random Primer DNA Labeling Kit（Bio
Rad社、Richmond,CA）で［35Ｓ］dATP（DuPont）の標識
を付した。35Ｓ−dATP標識のDNAの比放射能は、2.6×10
10cpm/μｇだった。
リポソームは凍結および解凍により準備された。5ml
の丸底フラスコの表面に薄膜を形成するため、クロロフ
ォルム溶液から約20mgのエッグ・フォスファチジルコリ
ン（EPC）を真空ドライヤーで約１時間回転蒸発させ
た。乾燥したリン脂質の薄膜を渦動ミキサー上の約0.5m
lのリン酸塩緩衝食塩水（pH7.4）の中に懸濁し、つづい
て、マイクロチップを供えたBranson社のプローブ型の
超音波処理器で、パワーレベル３で約８分間超音波処理
を行った。つづいて激しい渦動を約１分間行い、その後
凍結および解凍を行うことにより、上記の懸濁物にさら
に0.5mlの［35Ｓ］dATP標識のDNA溶液が加えられた。リ
ポソームは包み込まれなかった［35Ｓ］dATPから、PBS
と平衡状態にあるセファロース4Bカラム上のゲル濾過に
より分離された。分離が行われる間リポソームに標識を
付すため、約50μｌのカルセイン（約10mg/ml）が溶液
のなかに加えられた。［35Ｓ］dATP標識をもつ包み込ま
れたDNAの比放射能は、液体シンチレーション・カウン
トで測定して、2.5×1010cpm/μｌだった。
異系交配された生後１〜５週間の白毛マウスの皮膚の
一部を数片（各サイズは約２×５×2mm）解剖顕微鏡の
下で採取した。つづいて、これらの標本は、実施例１で
説明するように、コラーゲン・ゲルで支持されたスポン
ジ上で組織培養された。約24時間組織培養が続けられた
あと、リポソームとこの皮膚標本との接触が開始され
た。つづいてマウス皮膚の組織培養はリポソームととも
に約44時間インキュベートされた。対照として、同濃度
の裸の［35Ｓ］dATPの溶液がリポソーム標本で用いら
れ、皮膚の組織培養で同じく約12時間インキュベートさ
れた。
皮膚の組織培養は、pH7.0のリン酸塩緩衝食塩水で洗
浄され、組織学的カプセルに入れ、10％のフォルマリン
（v/v）で固定した。固定した皮膚の培養はつづいて脱
水、パラフィンへの埋込み、切片が行われ、組織学の分
野で熟練を積む者に公知の標準的な方法でスライド上に
置かれた。スライドからパラフィンを取り除いて、コダ
ックNTB乳剤で被膜され、５日露出して現象した。例え
ば、Freeman et al.,Proc.Soc.Natl.Acad.Sci.USA,83:2
694−2698（1986）;Hoffmam et al.,Proc.Soc.Acad.Sc
i.USA,88:2013−2017（1989）およびLi et al.,Proc.So
c.Acad.Sci.USA,88:1908−1912（1991）を参照。現像を
終えたスライドはすすがれ、ヘマトキシリンおよびエオ
シンで染色され、エピ・イルミネーショナ偏光フィルタ
ーを付けたニコンまたはオリンパスの写真用顕微鏡を用
いて観察した。
図４の組織学的オートラジオグラフは、皮膚がDNAリ
ポソームとともに44時間インキュベートされた後の、組
織培養皮膚にある［35Ｓ］DNA標識の毛髪および胞細胞
を示している。図４の矢印が示すように、細胞膜、細胞
質、および細胞核内に［35Ｓ］DNAによる高い放射性の
標識が見られる。これはリポソームが細胞膜を通してDN
Aを送達し、DNAが細胞質を通して核へ送達されたことを
表わしている。
組織培養皮膚が裸の［35Ｓ］DNAで処理されたとき、
放射能標識の細胞はわずかしか見られなかった。視野20
X当たりの標識毛胞のパーセントおよび、最大標識部位
の毛胞当たりの標識細胞のパーセントは、図４のオート
ラジオグラムから計算可能である。視野20X当たりの標
識毛胞のパーセントは、リポソーム送達の標識DNAの場
合、裸の標識DNAに比べて約７倍も高く、また、１毛胞
当たりの標識細胞は、リポソーム送達の標識DNAの場
合、裸の標識DNAに比べて少なくとも４倍も高いことが
判明した。
この実施例は、リポソームが特異的かつ効果的に標的
DNAを毛胞へ導くことを立証し、それゆえ、核酸を包み
込んだリポソームが、毛髪成長プロセスを標的にした遺
伝子療法により有効な試薬であることを確証している。
b.リポソームに包み込まれたヒト・チロシナーゼ遺伝子
を発現する核酸の培養細胞系への送達 リポソームを媒介物とする送達の有効性およびチロシ
ナーゼ遺伝子の発現を立証するため、クローン化された
ヒト・チロシナーゼ遺伝子をリポソームを用いて組織培
養細胞系へ移植した。
この目的で、公知の凍結および解凍方法でリポソーム
が準備された。5mlの丸底フラスコの表面に薄膜を形成
するため、フォスファチジルコリン（PC）、コレステロ
ール（Chol）、フォスファチジルエタノールアミン（P
E）を各々5:3:2の比率で含有する約20mgのリン脂質を、
クロロフォルム溶液から真空ドライヤーで約１時間回転
蒸発させた。乾燥したリン脂質の薄膜を渦動ミキサー上
のpH約7.4のリン酸塩緩衝食塩水（PBS）2mlの中に懸濁
し、つづいて、マイクロチップを備えたBranson社のプ
ローブ型超音波処理器で、パワーレベル３で約８分間超
音波処理を行った。つぎに、超音波処理した懸濁物にプ
ラスミドを加え、その混合物を水浴で２分間音波処理
し、凍結および解凍を３回繰り返して、核酸を含むリポ
ソーム組成を生成することにより、200μｇのプラスミ
ドpRHOHTがリポソームに包み込まれた。
プラスミドpRHOHT2は、Dr.S.Shibaharaより入手し、S
hibahara et al.,J.Biol.Chem.,262:12889−12892（198
7）および、Takeda et al.,Biochem.Biophvs.Res.Com
m.,162:984−990（1989）に記述されており、哺乳動物
細胞内のチロシナーゼ発現のためのプロモーターを含
む、ヒト・チロシナーゼcDNAの全長を含んでいる。
ヒト繊維芽細胞系FS−３およびマウス無メラニン性の
K1735細胞系は、各々10％のウシ胎児血漿（FBS）を含有
するイーグルMEM培地入りの60mmの培養皿、および10％
のFBSを含有するDulbeccoの改良イーグル培地入りの培
養皿で、24時間前培養された。その後、1.5mlの培地を
それぞれ含む各培養皿で、培養細胞を0.5mlのチロシナ
ーゼ遺伝子を包み込んだリポソーム組成物と接触させ、
接触細胞は培養条件下で48時間培養された。つづいてリ
ポソーム含有培地の吸引のあと、細胞は普通の培地でさ
らに７日間（FS−３）または３日間（K1735）培養され
た。つぎに細胞がトリプシン消化で採集され、細胞をサ
イトスピン・スライドに付着させるため、800×ｇで５
分間遠心分離器にかけられた。対照として、0.5mlのリ
ポソーム試料の代わりに、培地0.5mlの中の裸プラスミ
ド50マイクログラム（μｇ）が２種類の細胞に加えられ
た。
チロシナーゼの発現は、ドーパ酸化酵素反応および処
理細胞内のチロシナーゼのための免疫組織化学的染色を
測定して評価された。
ドーパ酸化酵素の活性を検出するため、Kugelman et
al.,J.Invest.Dermatol.,37:73−76（1961）に記述され
ているように、サイトスピン・スライドはPBS内の1mg/m
のＬ−ドーパとともに37℃で12時間インキュベートされ
た。つづいて、サイトスピン・スライドは確立された手
順でヘマトキシリンおよびエオシンにより対比染色さ
れ、ドーパ酸化酵素に陽性反応を示す細胞が同定され、
顕微鏡下で細胞数が数えられた。
チロシナーゼを免疫組織化学的に検出するため、チロ
シナーゼ含有細胞の染色にDako LSAB（標識されたスト
レプトアジピン−ビオチン）キットが用いられた。サイ
トスピン・スライドはアセトンで10分間固定され、その
後空気で乾燥された。つづいて、キット・メーカー（Da
ko社,Carpinteria,CA）の説明に従い、過酸化水素、遮
断血清、一次抗体（抗チロシナーゼ）の希釈物（1:40
0）、連鎖抗体、ペルオキシダーゼ複合ストレプトアジ
ピン、および、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基
質溶液の中で、連続的インキュベーションが各10分間逐
次行われた。一次抗体は、Tomita et al.,J.Invest.Der
matol.,:85:426−430（1985）およびJimenez et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,85:3830−3834（1988）に記述さ
れているラット抗ヒトチロシナーゼ・モノクロナール抗
体TMH1であった。連鎖抗体は、ビオチンにコンジュゲー
トした抗マウスおよび抗ラット1gGの混合物であり、メ
ーカー（Dako社）より入手した。つぎに、処理されたサ
イトスピン・スライドをマイヤーのヘマキシリン軽く対
比染色し、液体グリセロール・ゼラチン（Dako社）でス
ライドに固定した。陽性対照がヒト黒色腫組織の冷凍切
片を使用して同様に準備された。陰性対照は一次抗体を
PBSと置き換えることで準備された。
結果は、ドーパ酸化酵素反応法または免疫組織化学染
色法により検出された時、リポソームで処理されたPS−
３およびK1735両細胞内でのチロシナーゼ発現を示して
いる。チロシナーゼを発現している細胞のパーセント
は、いずれの効力検定でも全細胞の約52％であった。陰
性対照細胞は酸化酵素法および免疫組織化学染色法のい
ずれの効力検定によっても陰性反応を示した。
核酸の培養細胞へのトランスフェクションを行うリン
酸カルシウム法に比べた時、チロシナーゼ遺伝子発現プ
ラスミドの細胞への移植の有効性は、リポソームを使用
すると、リン酸カルシウムと比較して約50％大きいこと
が観察された。
これらの結果は、リポソームが核酸発現ベクターを細
胞へ送達するのに効果的で効率がよいこと、さらにリポ
ソームが発現ベクター・プラスミドを送達でき、その結
果、コードされた遺伝子を発現しうることを立証してい
る。最後に、結果はチロシナーゼ遺伝子が哺乳動物の細
胞に効果的に導入でき発現できることを立証している。
c.組織培養皮膚の毛胞内におけるβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子の送達と表現 選択的送達および毛胞内での発現を立証するため、細
菌遺伝子lac−Ｚをコードするβ−ガラクトシダーゼ
が、リポソーム試料中の組織培養皮膚標本へ送達され
た。プラスミドpM−MuLV−SV−Lac−Ｚは、モロニーの
マウス白血病ウイルス（Ｍ−MuLV）および、哺乳動物細
胞内でβ−ガラクトシダーゼを発現できるβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子（Lac−Ｚ）の発現を制御するSV40ウイ
ルス（SV）から得られた哺乳動物のプロモーターを含ん
でいる。
リポソームは実施例3bで説明するように準備された。
ただし、リン脂質はPC,PEおよびコレステロールを5:2:3
の比率で包含し、またプラスミドDNAのリン脂質に対す
る割合は、全リン脂質の20mgに対しDNAが200μｇであ
る、 実施例１で説明されるように白毛マウス皮膚の組織培
養を行った。ただしリポソーム組成物は培地で４日間培
養された。つづいて皮膚組織培養培地は、おなじ培地で
リポソームを含有せず、かわりにLac−Ｚ基質Ｘ−galを
含有する培地へ取り替えられ、このＸ−galを含有する
培地を組織培養条件下で18時間培養した。これは組織培
養皮膚標本に存在するβ−ガラクトシダーゼが、Ｘ−ga
lを典型的な可視青色染料に変換できるようにするため
である。リポソームに包み込まれたプラスミド組成物と
同量のDNAを用いて、制御されたリポソームの送達が裸
のプラスミドDNA（pM−MuLV−SV−Lac−Ｚ）で行われ
た。
つぎに組織培養サンプルは、組織化学的検査のため切
片され、拡大率が125Xおよび250Xの顕微鏡で検査され
た。結果は図5A〜5Dに示される通りである。暗青色の点
で示される発現Lac−Ｚ遺伝子の存在は、リポソームに
取り入れられたプラスミドを受けた図5Aおよび図5Bだけ
に見られ，図5Cおよび図5Dには暗青色の点は見られな
い。さらに、暗青色の点は毛胞には見られるが、毛胞に
隣接する組織にはあまり見られない。
結果は、Lac−２遺伝子が毛胞で発現されたのに、組
織培養皮膚標本の他の部位では発現されなかったことを
示しており、リポソーム送達方法の選択性を示唆してい
る。
4.マウスの生体内でリポソーム媒介により有効な化合物
を毛胞へ送達する方法 生体内で有効な化合物を毛胞へ送達するため、本方法
を用いて、メラニンまたはカルセインのいずれかを含む
本発明のリポソーム組成物をマウスに投与した。
リポソームは主として実施例１に説明する方法で準備
された。説明したように20ミリグラム（mg）のPCが回転
蒸発され、0.5mlのPBSの中で超音波処理により再懸濁が
行われた。つづいて0.5mlのカルセイン（10mg/ml）また
はメラニン（10mg/ml）溶液が、超音波処理されたPCリ
ポソーム組成物にそれぞれ加えられ、さらに６分間超音
波処理され、次いで、凍結−解凍が３回行われた。その
結果得られたリポソーム組成物は、0.6〜1.0μＭのフィ
ルターを通じて押し出され、かつ、リポソーム組成物が
包み込まれなかったカルセインまたはメラニンからセフ
ァロース4Bカラム上のゲル濾過（PBSで溶離）で分離さ
れた。これはリポソームに包み込まれた有益な化合物の
組成物（カルセインまたはメラニン）を作り出すためで
ある。
リポソームに包み込まれた有益な化合物を生体内で局
所的に毛胞に送達する実験には、生後２〜４週間のあら
かじめ剃毛された異系交配白毛マウスが使用された。リ
ポソーム組成物を皮膚に固定しその蒸発を防ぐためのバ
ンドエイド・パッチを用いて、カルセインまたはメラニ
ンを包み込んだ約250マイクロリットルのリポソーム組
成物が、マウスの背面の皮膚の部位約1.5cm2に直接塗布
された。リポソーム組成の塗布は１時間ごとに６時間繰
り返され、最後の塗布は24時間放置され、その間に分析
のため皮膚標本がパンチ・バイオプシーで採取された。
経時的な実験として、各時間ごとにマウスが１匹ずつ使
用され、各マウスから合計６つのパンチ・バイオプシー
が0.5時間後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間
後、16時間後そして24時間後に採取された。パンチ・バ
イオプシーに先立ち、マウス皮膚の表面に残っている物
質を除くため、マウスの皮膚はアルコールを浸した綿棒
できれいに拭われた。対照には、リポソームに包み込ま
れた有益な化合物を含むサンプルと同量のカルセインま
たはメラニンがリポソームを含まないで塗布された。
リポソーム処置のあと、皮膚標本が採取され、それを
毛胞の垂直方向にきわめて薄くスライスして（5mm）組
織片を得た。つづいて、それを光学または蛍光顕微鏡の
いずれかで観察して撮影した。メラニン処置標本の場
合、組織標本は蛍光顕微鏡検査用にはBCECF−AMおよび
プロピジウム沃化物（PI）でまず対比染色され、また光
顕微鏡検査用には、組織学的に標本が準備されたあと、
パラフィン切片にしてヘマトキシリンおよびエオシンで
染色された。カルセイン処置標本の場合、組織標本は蛍
光顕微鏡検査用にまずプロピジウム沃化物（PI）で染色
された。
また、カルセインを含む皮膚標本は、選択組織へ送達
される有益な化合物の効果的な濃度を決定するため、分
光蛍光測光法により分析された。この目的で、各経過時
間点からの皮膚の2mmパンチ・バイオプシー２個を１枚
のサンプルに置いたものをそれぞれ３組ずつ用意し、そ
れを2mlのPBSに入れ、水浴超音波処理器で２分間超音波
処理を行った。つぎに、超音波処理された標本を、マイ
ク遠心分離器で10分間14,000×ｇで遠心分離した。その
結果得られた表面浮遊物は、カルセイン検出のため496n
mの励起波長および517nmの放射波長で分光蛍光測光法に
より測定された。皮膚組織へ送達されたカルセインの濃
度は、分光蛍光測光計による測定値を標準カーブと比較
して測定された。
図6A〜6Cは、リポソームに包み込まれたカルセイン
（図6Aおよび6B）および裸のカルセイン（図6C）を使用
したカルセイン送達の20時間後の結果を示している。リ
ポソームを媒介物とする送達により、カルセインが毛胞
および毛幹に深く浸透できたのに対し、対照カルセイン
は角質層に閉じ込められ、毛幹または毛胞には浸透しな
かったことに注意されたい。
リポソームに包み込まれたカルセインを媒介物とする
送達の有効性の経過的分析では、24時間までに１mm2当
たり22.15ナノグラム（ng）のカルセインが毛胞に送達
されるのが見られたのに対し、裸のカルセインでは２時
間後にわずかに約1.4ng/mm2の送達が見られただけで、
この量は時間の経過にもかかわらず増加しなかったこと
がわかった。
図7A〜7Cは、処置の24時間後にリポソームに包み込ま
れた化合物により、メラニンが送達された結果を示して
いる。図7Aおよび7Bは、送達されたメラニンが、自然に
メラニン化された毛幹と同じ模様を作っていることを表
わすパターンにより、メラニンが毛幹へ送達されたこと
を示している。図7Cは毛胞細胞に送達されたメラニンを
示している。従って、これらの結果は、メラニンがリポ
ソームの生体への局所的投与により、毛胞および毛幹の
両方へ送達されたことを立証している。
また選択組織へ送達される有益な化合物の効果的な濃
度を決定するため、メラニンを含む皮膚標本は分光光度
測定法により分析された。この目的で、各経過時間点か
らの皮膚の2mmパンチ・バイオプシー２個を１枚のサン
プルに置いたものをそれぞれ３組ずつ用意し、それを2m
lのPBSに入れ、水浴超音波処理機で２分間超音波処理を
行った。つぎに、超音波処理された標本を、マイクロ遠
心分離機で10分間14,000×ｇで遠心分離した。その結果
得られた表面浮遊物は、メラニンによる吸収を検出する
ため、300nmの吸収波長で分光光度測光法により測定さ
れた。皮膚組織へ送達されたメラニンの濃度は、分光光
度測光計による測定値を標準カーブと比較して決定され
た。
時間経過実験での皮膚標本からの数値は、リポソーム
に包み込まれたメラニン約19μg/mm2が、16時間後に特
異的に毛胞へ送達されたことを示している。しかし包み
込まれなかったメラニンを用いた経過時間実験では、2.
0μg/mm2未満のメラニンが送達されたのみであった。
上記の結果は、リポソーム標的メラニンまたはカルセ
インが毛胞および毛胞内の毛幹へ選択的に送達された
が、包み込まれなかった化合物は毛胞へは送達されず、
かわりに皮膚表面、特に角質に限られていることを示し
ている。従って、リポソームを媒介物とする有益な化合
物の送達は、生きた動物の毛胞および毛幹への特異的な
送達に効果的であることがわかり、本文中に説明される
リポソームを媒介物とする送達方法の生体内での有効性
を実証している。
また対象実験の追加として血漿カルセインの濃度の測
定が行われた。それには、リポソームに包み込まれたカ
ルセインの投与過程中、局所的投与の0.5時間後、１時
間後、２時間後、４時間後、６時間後そして24時間後
に、マウスの尻尾の側方静脈の血液のサンプルが採取さ
れた。採取された血液は、血漿を分離するため血清分離
管（Vacutainer,Becton Dickinson）に移され、2000×
ｇで10分間回転させた。つづいて、カルセイン検出のた
め、分光蛍光測光法により496nmの励起波長および517nm
の放射波長でカルセインが測定された。血漿中のカルセ
インの濃度は、分光蛍光測光計による測定値を標準カー
ブと比較して決定された。24時間の間に血流からカルセ
インはまったく検出されなかった。これは重要な観察で
ある。その理由は、有益な化合物が本発明のリポソーム
を媒介物とする方法で投与されるとき、体循環に入り望
ましくない副作用を引き起こすことなく、化合物が毛胞
および毛幹に選択的に送達され、毛胞および（または）
毛幹への安全な送達が可能であることを示唆しているか
らである。
本発明は、これまでいくつかの好適な態様によって説
明され、それに関して例示されてきたが、本分野に熟練
を積む者ならば、本発明の核心からはずれることなく、
さまざまな修正、変更、省略、そして置換が可能である
ことを容易に認めるであろう。
フロントページの続き (56)参考文献 米国特許5618798（ＵＳ，Ａ) 米国特許5030442（ＵＳ，Ａ) Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．29Ａ，Ｎｏ. ３，ｐｐ．192〜194（1993) Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．28Ａ：679− 681，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ〜Ｄｅｃｅｍｂ ｅｒ 1992 Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ ｉｏｎ（1992）10（４）；271−276 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 7/06 A61K 37/54 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】毛胞近辺の循環また皮膚組織に侵入するこ
    となく、毛胞への移行により被験者の毛胞へ少なくとも
    １つの活性成分を送達するためのリポソーム製剤であっ
    て、カルセイン、スクラルファート、ｎ−アセチル シ
    ステイン及びミノキシジル以外の少なくとも１つの活性
    成分を含むリポソーム組成物を含むリポソーム製剤。
  2. 【請求項２】毛胞近辺の循環また皮膚組織に侵入するこ
    となく、毛胞への移行により被験者の毛胞へ少なくとも
    １つの活性成分を送達するのに使用される製剤の製造に
    使用するための、少なくとも、一つのリポソーム調製物
    及び一つの活性成分からなる一組の構成成分であって、
    該活性構成成分は、カルセイン、スクラルファート、ｎ
    −アセチル システイン及びミノキシジル以外のもので
    ある一組の構成成分。
  3. 【請求項３】該活性構成成分が巨大分子である請求項１
    記載の製剤又は請求項２記載の一組の構成成分。
  4. 【請求項４】該活性構成成分が毛髪修復剤である請求項
    １記載の製剤又は請求項２記載の一組の構成成分。
  5. 【請求項５】該活性構成成分が毛髪染料である請求項１
    記載の製剤又は請求項２記載の一組の構成成分。
  6. 【請求項６】該活性構成成分が毛髪色素の内因性産生を
    刺激する物質である請求項１記載の製剤又は請求項２記
    載の一組の構成成分。
  7. 【請求項７】該活性構成成分が毛髪の損失を抑止する物
    質である請求項１記載の製剤又は請求項２記載の一組の
    構成成分。
  8. 【請求項８】該活性構成成分が多重薬剤耐性遺伝子の産
    物又はその発現系である請求項１記載の製剤又は請求項
    ２記載の一組の構成成分。
  9. 【請求項９】該活性構成成分がチロシナーゼ又はその産
    生のための発現系である請求項１記載の製剤又は請求項
    ２記載の一組の構成成分。
  10. 【請求項１０】該活性構成成分がTGF−αである請求項
    １記載の製剤又は請求項２記載の一組の構成成分。
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