Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, einen möglichst großen Teil der für den Haarzyklus
bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten
Gene der Haarzyklus bestimmt und Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen
zur Beeinflussung des Haarzyklus bereitgestellt werden.
Diese
erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren (1) zur Identifizierung der für den Haarzyklus bedeutsamen
Gene (Haarzyklus-Marker) bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) ein erstes Gemisch von in anagenen menschlichen
Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls
auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen,
mRNA-Molekülen oder
Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher
Haut, vorzugsweise aus behaarter Kopfhaut, gewinnt,
- b) ein zweites Gemisch von in katagenen menschlichen Haarfollikeln
exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten
gene tisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder
Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher
Haut, vorzugsweise aus behaarter Kopfhaut, gewinnt und
- c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse
der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert,
die in anagenen und katagenen menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich
stark (differentiell) exprimiert werden.
Durch
das erfindungsgemäße Verfahren
wird es vorteilhafterweise möglich,
den komplexen Prozess des Haarzyklus und die kausalen Zusammenhänge der
Veränderungen
am Haarfollikel zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue
Konzepte für
kosmetische Haar-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf
das breite Spektrum der Genexpression im Haarfollikel ausüben. Die
im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens
durchgeführte
SAGETM-Analyse
zeigt erstmals in einer sehr umfassenden Weise, welche Gene in anagenen
und katagenen Haarfollikeln unterschiedlich exprimiert werden.
Die
Gesamtheit aller mRNA-Moleküle,
die von einer Zelle oder einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt
synthetisiert werden, bezeichnet man als "Transkriptom". Zur Erfassung des Transkriptoms humaner Haarfollikel
wurde die Technik der „Seriellen
Analyse der Genexpression" (SAGETM) (Velculescu, V.E. et al., 1995 Science
270, 484–487)
eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation
und Quantifizierung der in Haarfollikeln exprimierten Gene. Der
Vergleich des Transkriptoms von anagenen Haarfollikeln mit dem Transkriptom
von katagenen Haarfollikeln erlaubt die Identifikation relevanter
Gene des Haarzyklus. Dies können
Gene sein, die in anagenen Haarfollikeln besonders stark exprimiert
werden oder auch Gene, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie
im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln nur gering exprimiert werden.
Die
Analyse der Genexpression ist zwar auch mit der Quantifizierung
spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z.B.
Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente).
Mit
diesen Techniken können
jedoch nur eine relativ begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden. Theoretisch
könnten
die Techniken MPSS (Massive Parallel Signiture Sequencing) oder
Techniken, die auf Differential display beruhen, die SAGETM-Analyse
ersetzen. Praktisch ist die SAGETM-Technik
jedoch schneller und zuverlässiger
als Alternativmethoden und somit zu bevorzugen.
Die
SAGE-Methode basiert auf zwei Prinzipen: Zum einen ist nur eine
kurze Nukleotidsequenz aus der 3'-Region
der mRNA für
die Identifikation des Gens erforderlich. Eine Sequenz von neun
Basenpaaren ermöglicht
die Unterscheidung von 262.144 (49) Transkripten.
Das ist mehr als die Anzahl aller im Genom vorhandenen Gene. Zum
zweiten erlaubt die Aneinanderreihung der kurzen Sequenzen eine
effiziente automatisierte Analyse mittels Sequenzierung. Ein nicht
zu unterschätzender
Vorteil dieser Technik ist die Bestimmung der Leserichtung der Gene.
Werden zwei in der Ableserichtung entgegengesetzte Transkripte eines
Gens gestartet, so läßt sich
dies nur mit der SAGE-Technik feststellen.
Typischerweise
wird mit biotinylierten Primern aus polyA-RNA doppelsträngige cDNA
synthetisiert. Die cDNA wird mit einem 4bp erkennendem Restriktionsenzym
(anchoring enzyme) verdaut, die statistisch alle 256bp schneiden.
Das 3'-Ende der cDNA wird
durch Bindung an Streptavidin beads isoliert. Die Probe wird in zwei
Hälften
unterteilt und das cDNA-Ende mit jeweils einem Linker (1 bzw. 2)
ligiert, der eine Erkennungstelle für ein TypIIS-Restriktionsenzym
(tagging enzyme) besitzt. Dieses schneidet bis zu 20bp versetzt
von der asymmetrischen Erkennungsstelle. Dadurch entsteht eine an
dem Linker gebundene kurze Sequenz (Tag), die für jedes Gen einzigartig ist.
Um größere Mengen
an Material zu gewinnen, werden die Linker1-Tags nach Auffüllen der überstehenden
Enden mit den Linker2-Tags ligiert (Linkerditag). Die Ligationsprodukte
werden mit Linker-spezifischen Primern (1 bzw. 2) amplifiziert.
Danach wird der nicht mehr gebrauchte Linker durch einen weiteren
enzymatischen Verdau mit dem anchoring enzyme freigesetzt. Die isolierten
Ditags werden durch Ligation aneinandergereiht (Concatemere), in
einen Vektor kloniert und in Zellen transfi ziert. Aus den Zellen
werden die Concatemere über
PCR amplifiziert und schließlich
sequenziert.
Eine
weitere vielversprechende Methode ist die Mikro-Array- oder Chip-Technik. Hier werden
ganze Genbibliotheken auf einen Chip gebracht. Die Gene auf dem
Chip werden mit Fluoreszenz-markierter cDNA, die aus der mRNA der
zu untersuchenden Gewebeprobe generiert wurde, hybridisiert. Durch
Vergleiche von anagenem mit katagenem Follikel-Material können alle
interessanten Gene in einem Versuch anhand der Fluoreszenzunterschiede
detektiert werden. Dabei ist allerdings die Kenntnis der Klone in
der Genbibliothek erforderlich.
Eine
sehr vorteilhafte Analysemethode ist die Kombination der SAGE- und
der Mikro-Array-Technik. Die SAGE-Methode liefert neue oder bekannte
Gene, die für
den Haarzyklus bedeutsam sein können.
Diese werden auf einen Chip projeziert, mit dem sich nun Proben
von individuellen Kandidaten messen lassen.
Für die SAGETM-Analyse wurden humane Haarfollikel gesunder
weiblicher Spender verwendet. Die Follikel wurden aus Gewebestücken isoliert,
die über
dem Ohr der Spenderinnen entnommen wurden, und aufgrund ihrer Morphologie
nach katagenen und anagenen Haarfollikeln sortiert. Um die Detektion
von spenderspezifischen Varianzen möglichst gering zu halten, wurden
jeweils die katagenen und anagenen Haarfollikel von insgesamt fünf Spenderinnen
vereinigt. Dabei wurde die gleiche Anzahl katagener und anagener
Follikel eines Spenders verwendet sowie die Gesamtzahl an Follikeln
der einzelnen Spender aneinander angeglichen.
Die
Durchführung
der SAGETM-Analyse erfolgte wie bei Velculescu,
V.E. et al., 1995 Science 270, 484–487 beschrieben. Analysiert
wurde je eine SAGETM-Bank für katagene und für anagene
Haarfollikel. Zur weiteren Analyse wurden beide SAGETM-Banken
auf die durchschnittliche Tag-Anzahl normiert. Die beiden Banken
wurden miteinander verglichen, um Gene mit einer Haarzyklusspezifischen
Regulation zu identifizieren.
Wie
für zwei
Banken desselben Gewebetyps erwartet, ist das Tag-Repertoire der
beiden Follikel-Banken weitgehend ähnlich. Trotz der Ähnlichkeit
der Ge webe und der relativ geringen Tag-Zahl zeigen 197 Tags eine
differentielle Expression mit einer Signifikanz von p > 0,05. Die Bestimmung
der Signifikanz erfolgte, wie bei Audic S, Claverie JM (1997), „The significance
of digital gene expression profiles", Genome Res 7: 986–95, beschrieben.
Tabelle
1 listet Marker auf, für
die bereits eine differentielle Expression in Abhängigkeit
vom Stadium des Haarzyklus beschrieben wurde. Sie dienen als Positivkontrollen
für das
Experiment.
Angegeben
sind:
- • die
relative Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte
1,
- • die
relative Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte
2,
- • der
Quotient der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen
Haarfollikeln und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz
in katagenen Haarfollikeln in Spalte 3,
- • die
Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4,
- • die
UniGene-Accession-Number in Spalte 5,
- • die
Swissprot-Accession-Number in Spalte 6 und
- • die
Bezeichnung des Gens, aus dem der entsprechende Tag stammt, in Spalte
7
Der
Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige
Gen in anagenen Haarfollikeln stärker
exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Unter
ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte
in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information
(NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender
Adresse zugänglich:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die
Gene bzw. Genprodukte sind außerdem
unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html
oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide direkt zugänglich.
Mäuse, deren
Vitamin D Rezeptor inaktiviert wurde, sind durch Haarverlust gekennzeichnet.
Es konnte gezeigt werden, dass nach der Stimulation des Anagenstadiums
durch eine Rasur Mäuse
mit inaktivem Vitamin D Rezeptor den Haarzyklus nicht initiieren
können
(Kong et al. (2002), J Invest Dermatol, 118: 631–8).
Für Thrombospondin-1
konnte gezeigt werden, dass es eine Rolle in der Induktion der Haarfollikel-Involution
und im Gefäßabbau während der
Katagenphase spielt (Yano et al. (2003), J Invest Dermatol, 120: 14–9). Während sich
in der frühen
bis mittleren Anagenphase keine Expression des Thrombospondins detektieren
lässt,
zeigt sich, in Übereinstimmung
mit den hier gefundenen Expressionsdaten, eine starke Expression während der
katagenen Phase.
Die
Rolle von Neurotrophin-5 für
die humanen Haarfollikel wurde bislang nicht beschrieben, allerdings gibt
es Untersuchungen zum Familienmitglied Neurotrophin-3 in murinen
Haarfollikeln. Maximale Expression des Neurotrophins wurde dabei
im katagenen Stadium beobachtet (Botchkarev et al. (1998), Am J
Pathol, 153: 785–99).
Ein entsprechendes Expressionsmuster wurde hier für das Neurotrophin-5
gefunden.
Im
Zuge der SAGETM wurde in einem ersten Schritt
die Anzahl der einzelnen Tags bestimmt und, soweit das möglich war,
Genen oder Einträgen
der Datenbank UniGene zugeordnet. Durch den Vergleich der Tags in
den unterschiedlichen SAGETM-Banken lassen
sich differentiell exprimierte Gene identifizieren. Eine erste Klassifizierung
erfolgt demnach über
die Signifikanz der differentiellen Expression der identifizierten
Gene. Es ist davon auszugehen, dass Gene, die signifikant differentiell
exprimiert sind, Markergene für
die Stadien des Haarzyklus sind.
Die
Gene, für
die eine signifikante differentielle Expression gefunden wurde,
sind in den Tabellen 2 bis 6 wiedergegeben.
Die
Tabellen 2 bis 6 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln
differentiell exprimierten Gene unter Angabe
- • der relativen
Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 1,
- • der
relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte
2,
- • des
Quotienten der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen
Haarfollikeln und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz
in katagenen Haarfollikeln in Spalte 3,
- • der
Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4,
- • der
UniGene-Accession-Number in Spalte 5,
- • der
Swissprot-Accession-Number in Spalte 6 und
- • einer
Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 7
Der
Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige
Gen in anagenen Haarfollikeln stärker
exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Unter
ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte
in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information
(NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender
Adresse zugänglich:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die
Gene bzw. Genprodukte sind außerdem
unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html
oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/penome/guide direkt zugänglich.
In
Tabelle 2 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln
im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p > 0,01 (Signif > 2,0) mindestens 5-fach
differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln
im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p > 0,01 (Signif > 2,0) mindestens 2-fach
differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln
im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p > 0,01 (Signif > 2,0) mindestens 1,3-fach
differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 5 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln
im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p > 0,05 (Signif > 1,3) mindestens 5-fach
differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 6 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln
im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p > 0,05 (Signif > 1,3) mindestens 2-fach
differentiell exprimiert werden.
Auffällig ist
hier insbesondere der deutliche Expressionsunterschied der ribosomalen
RNAs. Geringe Expressionsunterschiede in ribosomalen RNAs sind bisher
als typische Artefakte der SAGETM beschrieben worden.
Im vorliegenden Fall sind die Expressionunterschiede aber auffällig hoch
und gleichförmig.
Es findet sich eine wesentlich stärkere Expression an rRNA in
anagenen Haarfollikeln als in katagenen Haarfollikeln. Demnach ist
bereits die Expressionsstärke
ribosomaler RNA ein Markerkriterium für anagene Haarfollikel.
Außerdem finden
sich einige weitere, biologisch interessante Expressionsunterschiede.
Zum einen ist die Expression von Attractin in katagenen Haarfollikeln
gesteigert. Attractin ist ein Protein aus dem Agouti/Melanocortin-Signaltransduktionsweg.
Das Genprodukt spielt eine Rolle in der Bestimmung der Haarfarbe
von Mäusen
(Gunn et al. (1999), Nature, 398: 152–6; Barsh et al. (2002), J
Recept Signal Transduct Res, 22: 63–77).
Desweiteren
findet sich in katagenen Haarfollikeln eine Induktion der Cobalamin
Adenosyltransferase, einem Enzym des Vitamin B12-Metabolismus. Eine
Vitamin B12-Defizienz führt
im Menschen zu einer Depigmentierung des Haares (Mori et al. (2001),
J Dermatol, 28: 282–5).
Die
Dopachrome-Tautomerase, ein Enzym der Melanin-Biosynthese, ist ebenfalls
in katagenen Haarfollikeln induziert. Alle oben genannten Gene sind
relevant für
die Haarfollikelbiologie, speziell für die Pigmentierung, bisher
aber nicht im Zusammenhang mit dem Haarzyklus beschrieben.
Weiterhin
fällt auf,
dass in den katagenen Haarfollikeln die Trankriptionsfaktoren Fos-B
und Egr1 induziert sind. Beide Transkriptionsfaktoren gehören zu der Gruppe
der sogenannten immediate-early genes und haben weitreichende regulatorische
Funktionen.
Andererseits
ist in den katagenen Haarfollikeln eine Repression des Angiopoietin-ähnlichen
Proteins CDT6 zu finden, ein Protein, für das eine regulatorische Funktion
in der Angiogenese vermutet wird (Peek et al. (2002), J Biol Chem,
277: 686–93).
Eine Kontrolle der Angiogenese und damit der Blutversorgung der
Haarfollikel ist an den Haarzyklus gekoppelt (s.o. Thrombospondin-1).
Auffällig ist
auch die Induktion der 14-3-3 sigma Proteins Stratifin bei gleichzeitiger
Repression des 14-3-3 tau/theta Proteins. Die Familie der 14-3-3
Proteine regulieren eine Vielzahl von Enzymen, darunter die des
Primärmetabolismus
und des Zellzykluses. Weiterhin haben sie eine Chaperonfunktion,
sie können
die Transkription induzierbarer Gene aktivieren, und regulieren
Signal-Transduktions-
und Apoptosevorgänge. Insbesondere
für das
Protein 14-3-3 sigma (Stratifin) wurde eine Rolle bei der Differenzierung
von Keratinozyten beschrieben (Dellambra et al. (1995), J Cell Sci
108: 3569–79)
. Eine spezifische Regulation der Mitglieder dieser Proteinfamilie
in den verschiedenen Haarfollikelstadien ist daher ausgesprochen
wahrscheinlich.
Schließlich finden
sich auch noch das Keratin 6A und das acidic hair Keratin in katagenen
Haarfollikeln repremiert.
Die
Beurteilung, ob die differentielle Expression verschiedener Gene
signifikant ist oder nicht, wird maßgeblich durch die Anzahl der
sequenzierten Tags bestimmt. Durch eine Erhöhung der Zahl sequenzierter Tags
können
nicht signifikante Expressionsunterschiede statistisch signifikant
werden.
Um
die Relevanz subsignifikanter Expressionsunterschiede zu beurteilen,
können
verschiedene Methoden der Datenanalyse herangezogen werden, über die
biologisches Fachwissen in die Beurteilung der Expressionsunterschiede
einfließt.
Eine
Methode ist das Clustern der identifizierten Gene nach ihrer GO-Annotation. Die GO-Annotation ergibt
sich aus den Einträgen
in der Datenbank des Gene Ontology (GO)-Konsortiums, in der einzelne
Genen/Proteinen nach ihrer (übergeordneten)
Funktion klassifiziert werden [http://www.geneontology.org/]. Durch Verwendung
dieser Verwandschaftsmerkmale bekommen auch Expressionsunterschiede
eine Bedeutung, die statistisch nicht außerhalb des Konfidenzintervalls
liegen.
Tabelle
7 enthält
eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln
differentiell exprimierten Gene unter Angabe
- • der relativen
Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 1,
- • der
relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte
2,
- • des
Verhältnisses
der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln
und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln
zueinander in Spalte 3,
- • der
Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4,
- • der
GO-Nummer in Spalte 5,
- • einer
Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 6 und
- • der
Swissprot-Accession-Number in Spalte 7
Der
Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige
Gen in anagenen Haarfollikeln stärker
exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Unter
ihrer GO-Nummer sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte im Internet
unter folgender Adresse zugänglich:
http://www.geneontology.org/.
Beispielsweise
zeigt sich im katagenen Haarfollikel eine deutliche Induktion von
Genen des DPP-IV Clusters, einer Familie von Dipeptidylpeptidasen
(Attractin [Anagen 8 Tags: Katagen 23 Tags], DPP-9 [0:9], DPP-4
[0:2], DPP-8 [0:1]).
Die
Dipeptidylpeptidasen der DPP-IV-Familie sind Prolin-spezifische
Proteasen, deren hauptsächliche Funktion
offensichtlich die Regulation verschiedener pathologischer und physiologischer
Prozesse zu sein scheint (Aleski und Malik (2001), Biochim Biophys
Act, 1550: 107–116).
Darüber hinaus
findet sich eine schwache aber konsistente Induktion verschiedener
DNA Reparatur-Helikasen, beispielsweise RecQ-like 5 [3:8], RecQ-like
4 [1:2], RuvB-like [0:3] usw. Diese Induktion ist bei allen annotierten
Helikasen dieses Datensatzes zu finden.
Außerdem findet
sich eine deutliche Induktion des Melanin-Biosynthese Clusters,
unter den u.a. die Dopachrome Tautomerase [0:7] und Silver/pMEL17
[7:17] fallen.
Im
Gegensatz dazu findet sich in anagenen Haarfollikeln eine Induktion
verschiedener Untereinheiten des Typ IV Kollagens (α1 [5:1], α2 [1:0], α6 [4:0]).
Kollagen Typ IV ist ein typischer Bestandteil der Follikelmatrix,
und eine gesteigerte Expression dieses Proteins ist in der Wachstumsphase
des Follikels zu erwarten.
Der "Synaptosome"-Cluster ist ebenfalls
in den anagenen Haarfollikeln induziert. Unter diesem Cluster finden
sich die SNARE-Proteine VAMP-2 [5:0] und VAMP-3 [4:0], die eine
generelle Rolle bei der Sekretion besitzen. Unterstützt wird
diese Beobachtung durch die allgemeine Induktion von Genen, die
eine Rolle in der Exozytose spielen. Diese Induktion von Genen der
Exozytose steht wahrscheinlich im Zusammenhang mit dem Prozess der
Pigmentierung des Haares. Voraussetzung der Pigmentierung ist der
Transfer melaninsynthetisierender Organellen, sogenannter Melanosomen,
aus Melanozyten in Keratinozyten des Haarfollikels. Melanosomen
zeigen eine große
mikroskopische Ähnlichkeit
zu den Synaptosomen der Nervenzellen, sekretorische Vesikel, die
ein Auschüttung
von Neurotransmittern ermöglichen.
Die Rolle von SNARE-Proteinen für die
Synaptosomen ist hinreichend dokumentiert, die Rolle dieser Proteine
in Melanosomen wird zur Zeit diskutiert (Scott et al. (2002), J
Cell Sci, 115: 1441–51).
Schließlich sind
in den anagenen Haarfollikeln noch Gene der Gruppe mit N-Acetyllactoseamin
Synthase-Aktivität
induziert (Kette 1 [3:0], Kette 2 [8:2], Kette 3 [1:0]). Poly-N-acetyllactosamin-Strukturen
finden sich sowohl in N- als auch in O-verknüpften Glycanen der Glycoproteine
aus Säugetieren.
Diese Glycane interagieren vermutlich mit Selectinen und anderen
Glycan-bindenden Proteinen (Zhou (2003), Curr Protein Pept Sci,
4: 1–9).
Eine
weitere Möglichkeit,
die Relevanz subsignifikant differentiell exprimierter Gene zu steigern,
ist das Clustern nach Sequenzmotiven. Ein solches Clustern wird
durch den Abgleich der SAGE-Daten mit den Daten aus verfügbaren Domänen- und
Motivdatenbanken, beispielsweise PROSITE und Pfam, ermöglicht [http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml;
http://www.expasy.ch/prosite/].
Tabelle
8 enthält
eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln
differentiell exprimierten Gene unter Angabe
- • der relativen
Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 1,
- • der
relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte
2,
- • des
Verhältnisses
der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln
und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln
zueinander in Spalte 3,
- • der
Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4,
- • einer
Kurzbeschreibung des Motivs oder des Gens bzw. Genproduktes in Spalte
5 und
- • der
Swissprot-Accession-Number in Spalte 6
Der
Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige
Gen in anagenen Haarfollikeln stärker
exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Durch
diesen Abgleich wird auch die Signifikanz einiger bereits beschriebener
Gene weiter gesteigert. So wird der GO-Cluster mit Dipeptidylpepidase-Aktivität durch
weitere Mitglieder der PF:PEPTIDASE_S9 Familie erweitert. Weiterhin
findet sich in den katagenen Haarfollikeln eine deutliche Induktion
von Proteinen mit einer GRAM-Domäne.
Die Funktion der Domäne
ist zur Zeit noch nicht bekannt (Doerks et al. (2000), Trends Biochem
Sci, 25: 483–485).
Wie
bereits als GO-Cluster beschrieben, findet sich auch in diesem Ansatz
eine Repression der Typ IV Kollagen-Untereinheiten (C4-Domäne) in katagenen
Haarfollikeln.
Auffällig ist
eine Induktion von Proteinen mit einer Gla-Domäne in den anagenen Haarfollikeln.
Dabei handelt es sich um die Proteine Matrix-Gla und Osteocalcin.
Das Matrix-Gla-Protein wurde als Antagonist des BMP-2 in der Haarfollikelentwickung
und im -zyklus beschrieben (Nakamura et al. (2003), FASEB J., 17: 497–9).
Außerdem kann
die Signifikanz der differentiellen Expression verschiedener Gene
noch durch eine lexikalische Analyse gesteigert werden. In diesem
Fall werden übereinstimmende
Stichwörter
in den Beschreibungstexten zu den verschiedenen Genen, wie sie beispielsweise
in den Datenbank-Annotationen zu finden sind, gesucht.
Tabelle
9 enthält
eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln
differentiell exprimierten Gene unter Angabe
- • der relativen
Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 1,
- • der
relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte
2,
- • des
Verhältnisses
der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln
und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln
zueinander in Spalte 3,
- • der
Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4,
- • des
Suchwortes in Spalte 5,
- • einer
Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 6 und
- • der
Swissprot-Accession-Number in Spalte 7
Der
Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige
Gen in anagenen Haarfollikeln stärker
exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Aufgrund
dieser Analyse findet sich in katagenen Haarfollikeln eine signifikante
Induktion des Clusters mit dem Stichwort "Autophagy" (Apg4 [2:7], Apg3 [0:2], Apg10 [0:2],
Apg5 [0:1]). Autophagie ist ein Prozess, bei dem Zellen makroskopische
Zellbestandteile, wie beispielsweise Organellen, in Autophagosomen
einhüllen
und dann im Lysosom verdauen. Autophagie tritt vor allem bei Versorgungsmangel
der Zellen auf; exzessive Autophagie wird als ein Mechanismus des
nicht-apoptotischen programmierten Zelltodes angesehen.
Weiterhin
sind in katagenen Haarfollikeln Cluster reprimiert, die sich aufgrund
der Stichworte "dsc2" und "desmocollin" bilden. Insbesondere
für das
Desmocollin-3 ist eine Lokalisation im Haarfollikel beschrieben (Kurzen
et al. (1998), Differentiation, 63: 295–304; Nuber et al. (1996),
Eur J Cell Biol, 71:1–13).
Die
ribosomalen RNAs, für
die sich schon zuvor eine deutliche Repression in katagenen Haarfollikeln zeigte,
sind auch in dieser Analyse in den katagenen Haarfollikeln deutlich
reprimiert.
Auffällig ist
schließlich
noch die Repression von Selenoproteinen in katagenen Haarfollikeln.
Die
zweite der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird
erfindungsgemäß gelöst durch ein
Verfahren (2) zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen, insbesondere
bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder
Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher
Haut oder aus menschlichen Haarfollikeln gewinnt,
- b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller
Analyse der Genexpression (SAGE) als in anagenen und katagenen menschlichen
Haarfollikeln differentiell exprimiert identifiziert werden,
- c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller
Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern
vergleicht und
- d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar
zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in katagenen Haarfollikeln, oder das in b)
untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar
zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in anagenen Haarfollikeln.
Erkrankungen
bzw. Störungen
des Haarzyklus sind beispielsweise: Pili torti (Torsionshaare, gedrehte Haare),
Monilethrix (Spindelhaar), Wollhaare (Kräuselhaar), Haarschaftveränderungen
mit Brüchen
[Trichorrhexis nodosa, Trichorrhexis invaginata, Trichoschisis,
Trichoptilosis (Haarspliß)],
Haarschaftveränderungen bei
Stoffwechselstörungen,
Pili recurvati, Rollhaare, Veränderungen
der Haarfarbe [Heterochromie, Albinismus, Poliose (erworbene herdförmige Pigmentlosigkeit
der Haare), Canitis (physiologisches Ergrauen)], Hypertrichosen,
Hirsutismus, Alopezien (Irreversible Alopezie.: z.B. Androgenetische
Alopezie des Mannes und der Frau); Reversible Alopezie.: z.B. Symptomatische diffuse
Alopezien durch Infektionen, chem. Noxen und Arzneimittel, hormonelle
Störungen,
Krankheiten, etc.) sowie Alopezia areata.
Die
Gewinnung des Gemisches in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus kann aus Vollhautproben, behaarten
Hautäquivalenten,
isolierten Haarfollikeln, Haartollikeläquivalenten oder Zellen behaarter
Haut vorgenommen werden.
Es
kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus
ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein von
mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen
zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpression
(SAGE) als in anagenen und katagenen Haarfollikeln differentiell
exprimiert identifiziert werden, wenn diese ausschließlich in
anagenen oder ausschließlich
in katagenen Haarfollikeln exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt
b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht
werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.
In
Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus wird das
in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zugeordnet,
wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in katagenen, d. h., daß das Gemisch entweder mehr
unterschiedliche typischerweise in anagenen Haarfollikeln exprimierte
Verbindungen enthält,
als solche, die typischerweise in katagenen Haarfollikeln exprimiert
werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise
in anagenen Haarfollikeln exprimierten Verbindungen enthält, als
typischerweise in katagenen Haarfollikeln vorhanden sind (quantitative
Differenzierung). Für
die Zuordnung zu in Regression befindlichem bzw. krankem Haar wird
in komplementärer
Weise verfahren.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
9 in Spalte 7 durch ihre Swissprot-Accession-Number definiert werden
und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw.
gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch
in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in anagenen.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
8 in Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number definiert werden
und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw.
gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch
in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in anagenen.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
7 in Spalte 7 durch ihre Swissprot-Accession-Number definiert werden
und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw.
gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch
in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
stärker
exprimiert werden als in anagenen.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
6 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch
ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung des
Gens bzw. Genproduktes definiert werden und in Schritt d) das in
b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn
es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in katagenen,
oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw.
krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
5 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch
ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung
des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und
in Schritt
d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet,
wenn es überwiegend Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder
das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem
Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
mindestens 5-fach
so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine
weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
4 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch
ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung
des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und
in Schritt
d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet,
wenn es überwiegend Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
mindestens 1,3-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen,
oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw.
krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
mindestens 1,3-fach
so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine
weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
3 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch
ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung
des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und
in Schritt
d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet,
wenn es überwiegend Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
mindestens 2-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder
das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem
Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
mindestens 2-fach
so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine
weitere ganz besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
2 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch
ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung
des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und
in Schritt
d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet,
wenn es überwiegend Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln
mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder
das in b) unter suchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem
Haar zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln
mindestens 5-fach
so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Man
kann den Haarzyklus auch dadurch beschreiben, daß mehrere Marker (Expressionprodukte
der für
anagene oder katagene Haarfollikel bedeutsamen Gene) quantifiziert
werden, die dann untereinander in einem charakteristischen Verhältnis aktiv
sein müssen,
um wachsendes bzw. gesundes Haar zu repräsentieren, bzw. in einem hiervon
verschiedenen charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um
in Regression befindliches bzw. krankes Haar zu repräsentieren.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren
(3) zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen, insbesondere bei
Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder
Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher
Haut oder aus menschlichen Haarfollikeln gewinnt,
- b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels
Verfahren (1) als für
den Haarzyklus bedeutsam identifiziert werden,
- c) die Expressionsverhältnisse
der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen
zueinander bestimmt und den Expressionsquotienten bildet,
- d) die Expressionsverhältnisse
aus c) mit den Expressionsverhältnissen
vergleicht, die für
die in b) quantifizierten Moleküle
typischerweise in anagenen bzw. in katagenen Haarfollikeln vorliegen,
insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den
Tabellen 2 bis 6, Spalte 3 ergeben, und
- e) das in a) gewonnene Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar
zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Follikel
bzw. der unter suchten behaarten Haut den Expressionsverhältnissen
in anagenen Haarfollikeln entsprechen, oder das in a) gewonnene
Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn
die Expressionsverhältnisse
der untersuchten Follikel bzw. der untersuchten behaarten Haut den
Expressionsverhältnissen
in katagenen Haarfollikeln entsprechen.
Vorzugsweise
gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren das Gemisch aus
einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe.
In
einer weiteren Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die
Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in „Microdialysis: A method for measurement
of local tissue metabolism",
Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161:12
1735–8;
sowie in „Cutaneous
microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et
al.; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231–244; und auch im Internet
unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf
hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei
der Anwendung der Mikrodialyse führt
man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer
geeigneten Trägerlösung die
Sonde langsam zu spülen.
Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert
die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen,
die im extrazellulären
Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit,
dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist
weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber
nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender
Verbindungen beschränkt.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein
und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder
Proteinfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifi zierung mindestens
zweier Proteine oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die
ausgewählt
ist unter
- i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
- ii. Affinitätschromatographie
- iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
- iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser
Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere
- v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen
dieser Methoden.
Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren
Methoden sind in dem Übersichtsartikel
von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes
and genomes", Nature,
Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000),
und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit
in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die
2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional
Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher,
Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols
in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 – 10.4.13;
oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham
Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die
massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente
erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den
folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular
Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor:
A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere:
Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487–512.
Carr, S. A. und
Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology;
Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1–10.21.27.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein
und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder
mRNA-Molekülfragmente;
bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder
mRNA-Molekülfragmente
mittels einer Methode durchführt,
die ausgewählt
ist unter
- i. Northern Blots,
- ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
- iii. RNase-Schutzexperimente,
- iv. Dot-Blots,
- v. cDNA-Sequenzierung,
- vi. Klon-Hybridisierung,
- vii. Differential Display,
- viii. Subtraktive Hybridisierung,
- ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting,
- x. Total Gene Expression Analysis (TOGA),
- xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE),
- xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®) und
insbesondere
- xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips,
oder
mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren
Methoden sind in den Übersichtsartikeln
von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes
and genomes", Nature,
Volume 405, Number 6788, 837 – 846 (2000),
und „Genomics,
gene expression and DNA arrays",
Nature, Volume 405, Number 6788, 827–836 (2000), und den dort angegebenen
Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen
wird.
Das
TOGA-Verfahren ist in "J.
Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing technology for
analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol.
97, No. 5, pp. 1976–1981
(2000)" beschrieben,
worauf hiermit vollumfänglich
Bezug genommen wird.
Das
MPSS®-Verfahren
ist in der US-A-6,013,445 beschrieben, worauf hiermit in vollem
umfang Bezug genommen wird.
Es
können
jedoch erfindungsgemäß auch andere
dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein
und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen eingesetzt werden.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge
von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa
10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt
etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa
50 der Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
8 in Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen
7 und 9 in Spalte 7 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie
in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number,
in Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 7 durch ihre
Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit
zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen in vitro, umfassend Mittel
zur Durchführung
der erfindungsgemäßen Verfahren
zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur
Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen in vitro, umfassend
- i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen
Träger
und
- ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung
an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen
befähigt
sind, die in Tabelle 8 in Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number,
in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 7 durch ihre Swissprot-Accession-Number
sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in
Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 7
durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert
werden.
Bei
einem Biochip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement
mit auf einer Oberfläche immobilisierten
Molekülen,
insbesondere Biomolekülen,
die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist
die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man
spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von
biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip
angeordnet sein können,
müssen
diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere
in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten
können
z. B. Einzelstränge,
Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide,
Peptide, Proteine (z. B. Antikörper,
Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z.
B. organische Moleküle).
Im
allgemeinen haben Biochips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch
oder biochemisch funktionellen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise
auch von Wänden
einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
Zum
Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen
werden: Nature Genetics, Vol. 21, supplement (Gesamt), Jan. 1999
(Biochips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981–983, Okt.
1998 (Biochips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301–306, Jul.
1998 (Biochips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh
Pandey und Matthias Mann: „Proteomics
to study genes and genomes",
Nature, Volume 405, Number 6788, 837– 846 (2000), und „Genomics,
gene expression and DNA arrays",
Nature, Volume 405, Number 6788, 827–836 (2000), und die dort angegebenen
Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche
Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA-Chiptechnologie
liefern die Bücher „DNA Microarrays:
A Practical Approach" (Editor:
Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und „Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena,
2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug
genommen wird.
Die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA-Chiptechnologie beruht
auf der Fähigkeit
von Nukleinsäuren
komplementäre
Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete
technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot-
und Northern-Blot-Analyse
eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen
lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die
DNA-Chiptechnologie
einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen.
Ein
DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z.B. Glas oder
Kunststoff), auf dem einzelsträngige,
genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle
(Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik
der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt.
Nach
dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden-Immobilisierung realisiert:
E.M.
Southern (E.M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20,
1679–1684
und E.M. Southern et al. ( 1997), Nucleic Acid Research 25, 1155–1161) beschreibt
die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese
an einer Glasoberfläche,
die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit
einem Glycol derivatisiert wurde.
Ein ähnliches
Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels
einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen
Techniken verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc.
Natl Acad Sci USA 91, 5022–5026).
Neben
diesen auf der in situ-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden
Techniken können
ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von
Trägermaterial
gebunden werden.
P.O.
Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680–686) beschreibt die Immobilisierung
von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen.
Die
Veröffentlichung
von L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22,
5456–5465)
legt ein ähnliches
Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an
eine Glasoberfläche
gebunden werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit
1,4-Phenyldiisothiocyanat
behandelt wurde.
Die
Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenannten „Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen
dünne Metallnadeln
mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein
und überführen anschließend das
anhängende
Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des
DNA-Chips.
Bevorzugterweise
erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezogesteuerten
Nanodispensers, der ähnlich
einem Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen mit einem Volumen von
100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.
Die
Immobilisierung der Sonden erfolgt z.B. wie in der EP-A-0 965 647
beschrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels
PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei
ein Primer am 5'-Ende modifiziert
ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist
sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an
einer Glasoberfläche
gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und
anschließend
mit 1,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen
PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz
in einer Länge
von 200–400
bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung
der PCR-Produkte über
den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts
durch eine Inkubation bei 96°C
für 10
Min entfernt.
In
einer für
DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu vergleichenden
Zellpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser
Transkription unter Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden
in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit
z.B. rot bzw. grün
fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit
den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und
anschließend
die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.
Ein
entscheidender Erfolgsfaktor für
den Einsatz der DNA-Chiptechnologie zur Analyse der Genexpression
der Haarfollikel ist die Zusammensetzung der genspezifischen Sonden
auf dem DNA-Chip. Hier werden insbesondere die bei der SAGETM-Analyse identifizierten relevanten Gene
des Haarzyklus eingesetzt. Da bei der Verwendung eines DNA-Chips
zur Analyse der relevanten Gene des Haarzyklus mitunter ausgesprochen
geringe mRNA-Mengen untersucht werden müssen, kann sich die Notwendigkeit
ergeben, die mRNA vor der Analyse mit Hilfe der sogenannten linearen
Amplifikation (Zhao et al. (2002), BMC Genomics, 3:31) anzureichern.
Dabei wird die mRNA einer Probe zunächst in cDNA umgeschrieben.
Die amplifizierte RNA wird aus dieser doppelsträngigen cDNA durch in vitro
-Transkription gewonnen.
Für die Herstellung
kleiner (bis etwa 500 Sonden umfassender) Biochips sind die in der
DE-A-100 28 257.1-52 und in der DE-A-101 02 063.5-52 genannten Analysechips
ganz besonders bevorzugt. Diese Analysechips weisen eine elektrisch
adressierbare Struktur auf, die eine Elektrofokussierung der Proben
gestattet. Hierduch wird es vorteilhafterweise ermöglicht,
Proben unabhängig
von ihrer Viskosität
mit Hilfe von Elektroden an definierten Punkten eines Punktrasters
(Arrays) zu fokussieren und zu immobilisieren. Durch die Fokussierfähigkeit
erfolgt gleichzeitig eine Erhöhung
der lokalen Konzentration der Proben und so eine höhere Spezifität. Während der
Analyse selbst besteht die Möglichkeit
das Testgut an die einzelnen Positionen des Arrays zu adressieren.
So kann potentiell jede untersuchte Information mit der höchst möglichen
Sensitivität aufgespürt werden.
Eine Kreuzkontamination durch benachbarte Spots ist nahezu ausgeschlossen.
Der
erfindungsgemäße Biochip
umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere
etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders
bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa
10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander
verschiedenen Sonden können
jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
Der
erfindungsgemäße Biochip
umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden,
insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.
Die Nukleinsäuresonden
weisen bevorzugt eine Länge
von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise
etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400
Nukleotiden auf.
Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt ist ein DNA-Chip, der Sonden aufweist, die ausgewählt sind unter
den in den Tabellen 2 und 5 aufgeführten Sonden, den in Tabelle
3 aufgeführten
Sonden (ohne mitochondriale und ribosomale Tags sowie den überrepräsentierten
Gruppen "DNA Helikase-Aktivität", "DPPIV-Aktivität" und "Melanin Biosynthese
aus Tyrosin" aus
Tabelle F.
In
einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip
Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
der Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte
6 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9
in Spalte 7 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen
2 bis 6 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number,
oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes
definiert werden, als Haarzyklus-Marker bei Menschen.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus insbesondere gegen
Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Haare und ihres Wachstums, in vitro, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung
des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt,
- b) einen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Haare und ihres Wachstums einmal oder mehrmals auf die behaarte
Haut aufbringt,
- c) erneut den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips
bestimmt, und
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse
aus a) und c) ermittelt.
Das
erfindungsgemäße Testverfahren
kann mit Vollhautproben, behaarten Hautäquivalenten, isolierten Haarfollikeln,
Haarfollikeläquivalenten
oder Zellen behaarter Haut durchgeführt werden.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres
Wachstums, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
der Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte
6 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9
in Spalte 7 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen
2 bis 6 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number,
oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes
definiert werden, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen
oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Haare und ihres Wachstums.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur Identifikation
von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen
oder Beeinträchtigungen
der Haare und ihres Wachstums in vitro, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
- a. den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips
bestimmt,
- b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Haare und ihres Wachstums einmal oder mehrmals auf die behaarte
Haut aufbringt,
- c) den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung
des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung
des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und
- d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus
a) und c) bestimmt.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
der Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte
6 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9
in Spalte 7 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen
2 bis 6 in Spalte 5 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 6 durch ihre Swissprot-Accession-Number,
oder in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes
definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres
Wachstums.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung
gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen
der Haare und ihres Wachstums, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens, oder
der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres
Wachstums bestimmt und
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch
geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
