DE102017125013B4

DE102017125013B4 - MCC als epigenetischer Marker zur Identifizierung von Immunzellen, insbesondere basophiler Granulozyten

Info

Publication number: DE102017125013B4
Application number: DE102017125013.1A
Authority: DE
Inventors: Sven Olek; Udo Baron
Original assignee: Epiontis GmbH
Current assignee: Precision for Medicine GmbH
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2019-10-17
Anticipated expiration: 2037-10-26
Also published as: CA3080057A1; CN111295452A; US11753683B2; WO2019081584A1; DE102017125013A1; AU2018356433A1; JP2021501574A; US20210189489A1; EP3669002A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung von basophilen Granulozyten in einer Probe, umfassend das Analysieren einer Modifikation, wie z.B. den Methylierungsstatus von mindestens einer CpG-Position in der Säuger-Genregion für Mutated in Colorectal Cancer (MCC), wobei vorzugsweise die analysierte Genregion gemäß der SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder fehlende Modifikation, wie z.B. Methylierung der Genregion für einen basophilen Granulozyten im Vergleich zu einem nicht-basophilen Granulozyten indikativ ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung von basophilen Granulozyten, umfassend die Analyse einer Modifikation, wie z.B. dem Methylierungsstatus von mindestens einer CpG-Position in der Säuger-Genregion für das Gen Mutated in colorectal cancer (MCC), wobei eine Demethylierung oder fehlende Modifikation oder Methylierung in dieser Genregion für einen basophilen Granulozyten indikativ ist, wenn dieser mit einem nicht-basophilen Granulozyten verglichen wird, oder einem anderen Zelltyp im peripheren Blut oder in anderem Gewebe. Die Analysen gemäß der Erfindung können basophile Granulozyten auf epigenetischer Ebene identifizieren und von allen anderen Zellen in komplexen Proben, wie zum Beispiel anderen Blut- oder Immunzellen, unterscheiden. Zudem bietet die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung basophiler Granulozyten, insbesondere in komplexen Proben. Das Verfahren kann ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung der Zellen, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe, durchgeführt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung der oben genannten Verfahren sowie dessen jeweilige Anwendungen. Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein neuartiges, robusteres Mittel zum quantitativen Nachweis und zur Messung basophiler Granulozyten des Blutes in allen soliden Organen oder Geweben oder Körperflüssigkeiten eines Säugers bereitzustellen.
Hintergrund der Erfindung
Granulozyten stellen 60% aller weißen Blutzellen dar, die auch als Leukozyten bezeichnet werden. Ihre Hauptfunktion ist die Phagozytose, d.h. der Verdau von fremden Zellen, wie Bakterien, Viren, und andere Parasiten. Granulozyten können von anderen Leukozyten, wie Monozyten und Lymphozyten, durch die Anwesenheit von intrazellulären Granula unterschieden werden, welches aus Enzymen bestehen, die beim Verdau fremder Zellen helfen. Granulozyten sind aufgrund der variierenden Formen ihrer Nuklei, welche normalerweise in drei Segmente aufgeteilt sind, auch als polymorphonukleare Leukozyten (PMN, PML, oder PMNL) bekannt. Es existieren drei Formen der Granulozyten, die so genannten neutrophilen, eosinophilen und basophilen Granulozyten. Ihre Namen stammen von der Fähigkeit durch verschiedene Farbstoffe angefärbt zu werden, zum Beispiel können die Granula in Neutrophilen durch neutrale Farbstoffe angefärbt werden, während Granula in Basophilen durch basische Farbstoffe angefärbt werden können.
Basophile Granulozyten sind die am wenigsten vorhandenen Granulozyten und machen etwa 0,01% bis 0,3% aller zirkulierenden Leukozyten aus. Sie sind an der Hypersensitivität von Entzündungsreaktionen beteiligt, die allergische Reaktionen verursachen. Bei Stimulation setzen basophile Granulozyten Histamin frei, was dabei hilft Entzündungen auszulösen, sowie Heparin, das die Blutgerinnung verhindert. Das Vorhandensein von Protein-Rezeptoren auf der Zelloberfläche von basophilen Granulozyten ermöglicht die Bindung von IgE, was eine selektive Reaktion auf Umweltsubstanzen, wie beispielsweise Pollenproteine, erleichtert.
Obwohl nahezu alle Zellen in einem Individuum das exakt gleiche Komplement des DNA-Codes enthalten, müssen höhere Organismen unterschiedliche Muster der Genexpression in den verschiedenen Gewebetypen aufweisen und aufrechterhalten. Die meisten Genregulationen sind vorübergehend, abhängig vom aktuellen Zustand der Zelle und Veränderungen der äußeren Reize. Persistente Regulation hingegen ist eine primäre Rolle der Epigenetik - vererbbare Regulationsmuster, die die grundlegende genetische Codierung der DNA nicht verändern. Die DNA-Methylierung ist die archetypische Form der epigenetischen Regulation; sie dient als stabiles Gedächtnis für Zellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der langfristigen Identität verschiedener Zelltypen. Kürzlich wurden andere Formen der epigenetischen Regulation entdeckt. Neben der „fünften Base“ 5-Methylcytosin (mC), finden sich eine sechste (5-Hydroxymethylcytosin, hmC), siebte (5-Formylcytosin, fC) und achte (5-Carboxycytosin, cC) (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937).
Das primäre Ziel der genannten DNA-Modifikationen ist die Zwei-Nukleotidsequenz Cytosin-Guanin (eine ‚CpG-Position‘); in diesem Zusammenhang kann Cytosin (C) einer einfachen chemischen Modifikation unterzogen werden, um formyliert, methyliert, hydroxymethyliert oder carboxyliert zu werden. Im menschlichen Genom ist die CG-Sequenz viel seltener als erwartet, außer in bestimmten, relativ dichten Clustern, den sogenannten ,CpG-Inseln‘. CpG-Inseln sind häufig mit Gen-Promotern assoziiert, und es wird geschätzt, dass mehr als die Hälfte der menschlichen Gene CpG-Inseln aufweisen (Antequera und Bird, Proc Natl Acad Sei USA 90: 11995-9, 1993).
Eine abweichende Methylierung der DNA ist häufig mit der Transformation von gesunden zu kanzerogenen Zellen verbunden. Zu den beobachteten Effekten gehören genomweite Hypomethylierung, erhöhte Methylierung von Tumorsuppressorgenen, und Hypomethylierung vieler Onkogene (zusammengefasst, zum Beispiel, von Jones und Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999; Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002; und Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003). Methylierungsprofile wurden als tumorspezifisch erkannt (d.h. Veränderungen im Methylierungsmuster bestimmter Gene oder sogar einzelner CpGs sind diagnostisch für bestimmte Tumorarten), und es gibt jetzt eine umfassende Sammlung an diagnostischen Markern für Blut-, Brust- , Darm-, Speiseröhren-, Magen-, Leber-, Lunge-, und Prostata-Krebs (z.B. zusammengefasst von: Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003).
Für eine der kürzlich beschriebenen Modifikationen des Cytosins, 5-Hydroxymethylierung, wurde der Nutzen einer oxidativen Bisulfit-Sequenzierung zur Kartierung und Quantifizierung von 5hmC in den CpG-Inseln gezeigt (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937). Hohe Konzentrationen von 5hmC wurden in CpG-Inseln in Verbindung mit Transkriptionsregulatoren und in langgestreckten Kernelementen gefunden. Es wird vermutet, dass sich diese Regionen epigenetischer Reprogrammierung in embryonalen Stammzellen unterziehen können.
WO 2012/162660 beschreibt Verfahren unter Verwendung von DNA-Methylierungs-Assays zur Identifizierung einer Zelle oder eines Zellgemisches und zur Quantifizierung von Veränderungen in der Verteilung der Zellen im Blut oder in Geweben sowie zur Diagnose, Prognose und Behandlung von Krankheiten, insbesondere Krebs. Diese Verfahren verwenden frische und archivierte Proben.
US 2007/0243531 offenbart ein Verfahren zur Diagnose von Darmkrebs durch Bestimmung des Ausmaßes an Methylierungs von einer Nukleinsäure, die die Expression der MCC-Gene reguliert. Die Methylierung der MCC-Gene an sich ist nicht erwähnt.
Kohonen-Corish et al. (in: Kohonen-Corish et al. Promoter methylation of the mutated in colorectal cancer gene is a frequent early event in colorectal cancer) beschreiben die Hypermethylierung des MCC-Gens auf den CpG-Inseln des Promotors, die eine häufige und frühe Veränderung während der kolorektalen-Karzinogenese ist. Die Promoter-Methylierung verursacht die Stilllegung des Genes für das kolorektalen Tumorsuppressor-Gens MCC und fördert das Fortschreiten der Krankheit. Es werden keine Beweise für die Methylierung von CpG-Positionen außerhalb des MCC-Promotors beschrieben.
Accomando et al. (in: Accomando et al. Quantitative reconstruction of leukocyte subsets using DNA methylation. Genome Biol. 2014 Mar 5;15(3)) offenbaren, dass Zelllinien-spezifische DNA-Methylierungsmuster normale humane Leukozyten-Untergruppen unterscheiden und zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Untergruppen im peripheren Blut verwendet werden können. Sie verwendeten DNA-Methylierung, um mehrere Leukozyten-Untergruppen gleichzeitig zu quantifizieren und Zelllinien-spezifische DNA-Methylierungs-Signaturen zu identifizieren, die humane T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Monozyten, Eosinophile, Basophile und Neutrophile unterscheiden. MCC wird nicht erwähnt.
Vor diesem Hintergrund ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes und vor allem robusteres Verfahren basierend auf der DNA-Methylierungsanalyse als überlegenes Werkzeug bereitzustellen, um basophile Granulozyten komfortabler und zuverlässiger nachzuweisen, zu identifizieren, zu unterscheiden und zu quantifizieren.
Die vorliegende Erfindung löst das oben genannte Problem durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von basophilen Granulozyten in einer Probe, umfassend Analysieren einer Modifikation, wie z.B. des Methylierungsstatus (Bisulfit-Konvertibilität) von mindestens einer CpG Position in der Säugetier-Genregion für Mutated in Colorectal Cancer (MCC), wobei die analysierte Genregion vorzugweise gemäß SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder ein Fehlen der Modifikation in der Genregion, wie z.B. eine Methylierung der Genregion, für einen basophilen Granulozyten indikativ ist, wenn dieser mit einem nicht-basophilen Granulozyten verglichen wird. Eine „Modifikation“ umfasst die epigenetische Regulation zusätzlich zur“fünften Base“ 5-Methylcytosin (mC), d.h. 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), 5-Formylcytosin (fC), und 5-Carboxycytosin (cC).
Das humane Mutated in Colorectal Cancer (MCC)-Gen ist ein kolorektales Tumor-Suppressorgen. Das MCC-Protein ist dafür bekannt, den Verlauf des Zellzyklus negativ zu regulieren und den Wnt/Beta-Catenin Signalweg zu unterdrücken. Zu den stromabwärts von MCC liegenden Targets gehören Phospho-ERK, c-Myc, p27, Cyclin B1, Mc1-1, Caspasen 8 und 3. Ferner ist MCC an der Zellmigration unabhängig von der Aktivierung von RAC1, CDC42 und p21-aktivierte Kinase beteiligt. Das Gen für humanes MCC befindet sich auf dem Chromosom 5, 113,022,099-113,488,830 Reverser Strang, Ensembl-ID: ENSG00000171444.
Granulozyten (GRCs) sind eine Gruppe aus Zellen, umfassend Basophile (bGRCs), Neutrophile (nGRCs), und Eosinophile (eGRCs).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollte ein „Gen“ oder eine „Genregion“ die gesamte genomische Region umfassen, die sich auf MCC bezieht (z.B. Regulierung) und dieses kodiert. Dazu zählen Enhancer-Regionen, Promoter-Region(en), Introns, Exons und nicht-kodierende Regionen (5'- und/oder 3'-Regionen), die zu MCC gehören. Bevorzugt ist also ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine CpG-Position in der 5'-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, der Promoterregion, den 5'- oder 3'- untranslatierten Regionen, Exon, Intron, Exon/Intron-Grenzen und/oder in der 3'-Region stromabwärts vom Transkriptionsstopp des analysierten Gens vorhanden ist.
Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der überraschenden Identifizierung einer Region des MCC-Gens durch die Erfinder als spezifischer epigenetischer Marker, der die Identifizierung von basophilen Granulozyten, ebenso wie die klinische Routineanwendung dieser Analyse, erlaubt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erlaubt die genomische Region von MCC, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 1, die Identifizierung von basophilen Granulozyten. Überraschenderweise ist das unterscheidende Muster der Bisulfit-konvertierbaren und nicht-konvertierbaren Cytosine für basophile Granulozyten besonders und sogar ausschließlich auf die genomische Region gemäß SEQ ID Nr. 1 beschränkt, wie durch Verwendung des Amplikons gemäß SEQ ID Nr. 1 und insbesondere der Bisulfit-konvertierten Sequenzen gemäß der SEQ ID Nr. 2 und/oder 3 gezeigt wird.
Die Erfinder konnten zeigen, dass in basophilen Granulozyten die CpG-Motive wie offenbart nahezu vollständig demethyliert sind (d.h. zu mehr als 70%, vorzugsweise 80%, vorzugsweise mehr als 90% und am meisten bevorzugt mehr als 95%), wobei die gleichen Motive in allen anderen Immunzellen vollständig methyliert sind.
Die differentielle Methylierung der CpG-Motive innerhalb der zuvor genannten Regionen ist ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung von basophilen Granulozyten, wie es benötigt wird/oder zumindest wertvoll ist zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Zellen bei Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen, Krebs, Allergien, primären und sekundären Immundefekten, wie z.B. HIV-Infektionen und AIDS, Graft versus Host (GvH), hämatologischen Malignomen, rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose, oder einem zytotoxischen T-Zell-abhängigen Immunstatus in jedem vorstellbaren diagnostischem Zusammenhang. Der Assay ermöglicht die Messung von basophilen Granulozyten ohne Aufreinigung oder Färbeverfahren.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiterhin eine Quantifizierung der relativen Menge an basophilen Granulozyten, basierend auf dem Vergleich der relativen Menge der Methylierungsfrequenz in der analysierten Region mit der relativen Menge der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie z.B. GAPDH. Diese Quantifizierung wird somit auf der Grundlage des Verhältnisses der Bisulfit-konvertierbaren DNA zur nicht-konvertierbaren DNA in der genetischen Region von MCC (z.B. von SEQ ID Nr. 1) erreicht, wie hierin beschrieben und analysiert. Am meisten bevorzugt ist eine Quantifizierung der relativen Menge an basophilen Granulozyten, basierend auf einer (vorzugsweise parallelen oder gleichzeitigen) Analyse der relativen Menge an Bisulfit-konvertierbarer DNA der zellspezifischen Region für MCC und der relativen Menge an Bisulfit-konvertierbarer DNA der nicht-zellspezifischen Gene (vorzugsweise ausgewählte „Kontrollgene“ oder „Kontrollregionen“, wie z.B. das Gen für GAPDH).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse der Bisulfit-Konvertibilität die Amplifikation mit mindestens einem Primer geeigneter Primerpaare, die basierend auf SEQ ID Nr. 1 geeignet gestaltet werden können, vorzugsweise Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 4 bis 11.
Im Gegensatz zu FACS- und mRNA-Messungen können durch Anwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Messung(en) und Analysen unabhängig von der Aufreinigung, Lagerung - und bis zu einem gewissen Grad auch in Bezug auf die Gewebequalität - durchgeführt werden.
Vorzugsweise erfolgt die Amplifikation durch ein Polymerase-Enzym, eine PCR oder eine chemische Amplifikationsreaktion oder andere Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann wie nachfolgend beschrieben bekannt sind, d.h. im Rahmen von MSP, HeavyMethyl, Scorpion, MS-SNUPE, MethylLight, Bisulfit-Sequenzierung, methylspezifische Restriktionsassays, und/oder digitalen PCR (siehe, zum Beispiel Kristensen und Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009)).
Mit der Amplifikation wird ein Amplikon der MCC-Genregion erzeugt, das ein besonders bevorzugtes „Werkzeug“ zur Durchführung des/der Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Folglich stellen Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 4 und 5 oder ein amplifiziertes Amplikon unter Verwendung eines Primerpaares basierend auf SEQ ID Nrn. 4 und 5 oder 6 und 7 oder 9 und 10, wie hierin erwähnt, eine bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung dar. So können die SEQ ID Nrn. 1 bis 3 (und, sofern benötigt, die dazu komplementären Sequenzen) verwendet werden, um Primer für die Amplifikation zu gestalten, d.h. in der relevanten Sequenz als „beacons“ dienen. Gleichermaßen können zusätzliche Primer und Sonden basierend auf dem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 aufgebaut werden. Die Amplifikation kann entweder in der genomischen und/oder der Bisulfit-(d.h. „konvertierten“) DNA-Sequenz erfolgen.
Der Fachmann wird darüber hinaus in der Lage sein, spezifische Untergruppen der CpG-Positionen auszuwählen, um so die Anzahl der zu analysierenden Stellen zu minimieren, beispielsweise mindestens eine der CpG-Positionen, die aus einer CpG-Position in einem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 ausgewählt ist, und vorzugsweise ausgewählt ist aus den CpG-Positionen 57, 69, 76, 80, 119, 136, 142, 162, 186, 198, 233, 281, 292, 303, 307, 339, 351, und 362 im Amplikon 2694 gemäß der SEQ ID Nr. 1. Die Positionen werden numerisch ab dem 5'-Ende eines erzeugten und amplifizierten Amplikons gezählt und sind in 1 bezeichnet. Bevorzugt sind Kombinationen von allen, 9, 4 oder 5 Positionen (siehe Kästchen), deren Analyse ausreichend Daten und/oder Informationen liefert, um im Kontext der vorliegenden Erfindung aussagekräftig zu sein.
Der Fachmann wird darüber hinaus in der Lage sein, spezifische Untergruppen der CpG-Positionen auszuwählen, um so die Anzahl der zu analysierenden Stellen zu minimieren, beispielsweise mindestens eine der CpG-Positionen 186 und/oder 198 im Amplikon Nr. 2694 der MCC-spezifischen Bisulfit-konvertierbaren Region (SEQ ID Nr. 1), oder alle in der Bisulfit-konvertierbaren Region gemäß SEQ ID Nr. 1 vorhandenen Positionen.
Um die Bisulfit-Konvertibilität der CpG-Positionen zu analysieren, kann jedes bekannte Verfahren zur Analyse der DNA-Methylierung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse des Methylierungsstatus ein Verfahren ausgewählt aus Methylierungs-spezifischem enzymatischem Verdau, Bisulfit-Sequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotermethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE oder anderen Methoden, die auf dem Nachweis amplifizierter DNA beruhen. Diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und finden sich in der entsprechenden Literatur.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren für Routineanwendungen, beispielsweise auf einem DNA-Chip, geeignet. Basierend auf den obigen Informationen und der entsprechenden Literatur kann der Fachmann das obere Verfahren wie oben beschrieben an diese Gegebenheiten anpassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Verfahren ohne einen Aufreinigungs- und/oder Anreicherungsschritt der zu identifizierenden Zellen durchgeführt, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Identifikation eine Unterscheidung der basophilen Granulozyten von allen wesentlichen peripheren Blutzelltypen und/oder nicht-Blutzellen, vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, von follikulären Helfer-T-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, eosinophilen Granulozyten, neutrophilen Granulozyten, NK-Zellen und T-Helfer-Zellen und andere Zelltypen, die von anderen Organen als Blut stammen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wird die Probe aus einer Körperflüssigkeit eines Säugertiers, einschließlich menschlicher Blutproben, oder einem Gewebe, Organ oder einer Probe von Leukozyten oder einer aufgereinigten oder separierten Fraktion eines solchen Gewebes, Organs oder Leukozyten oder einer Zelltypprobe, ausgewählt. Vorzugsweise ist der Säuger eine Maus, Ziege, Hund, Schwein, Katze, Kuh, Ratte, Affe oder Mensch. Die Proben können bei Bedarf entsprechend gepoolt werden.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiter den Schritt des Schlussfolgerns auf den Immunstatus des Säugers, basierend auf den basophilen Granulozyten. Die basophilen Granulozyten können quantifiziert werden und als Richtwert zur relativen Quantifizierung weiterer detaillierter Unterpopulationen verwendet werden oder sie können als prädiktiver und/oder Screening und/oder diagnostischer und/oder prognostischer und/oder unerwünschter Ereignisfaktor verwendet werden oder sie können verwendet werden, um diese Population schließlich zur Bestimmung des gesamten Immunaktivierungsstatus nachzuweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung leidet das Säugetier oder leidet wahrscheinlich an Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßungen, Infektionskrankheiten, Krebs und/oder Allergien, wie unter anderem an Trypansosoma Cruzi-Infektion, Malaria und HIV-Infektion, hämatologischen Malignomenr, wie chronische myeloischer Leukämie, Multiplem Myelom, Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Krankheit, chronischer lymphatischer Leukämie, Graft versus Host- und Host versus Graft-Krankheit, Mycosis fungoides, extranodalem T-Zell-Lymphom, kutaner T-Zell-Lymphome, anaplastischem Großzell-Lymphom, Angioimmunoblastischem T-Zell-Lymphom und anderen T-Zell-, B-Zell- und NK-Zell-Neoplasien, T-Zell-Mangel, wie Lymphozytopenie, schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID), Omenn-Syndrom, Knorpel-Haar-Hypoplasie, erworbenem Immundefizienz-Syndrom (AIDS) und Erbkrankheiten, wie DiGeorge-Syndrom (DGS), Chromosomenbruchsyndrom (CBS), Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus Erythematodes, Sjögren-Syndrom, systemischer Sklerose, Dermatomyositis, primärer biliärer Zirrhose, primärer sklerosierender Cholangitis, Colitis Ulcerosa, Morbus Crohn, Psoriasis, Vitiligo, bullösem Pemphigoid, Alopecia Areata, idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie, Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis, Myasthenia gravis, IgA-Nephropathie, membranöser Nephropathie und perniziöser Anämie; und B-Zell- und T-Zell-Kombinationsstörungen wie Ataxie-Telangiektasien (AT) und Wiskott-Aldrich-Syndrom (WAS); und Karzinomen wie Brustkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberzellkarzinom, Cholangiokarzinom, Melanom, sowie Kopf- und Halskrebs.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren wie oben, das weiterhin die Messung und/oder Überwachung der Menge an basophilen Granulozyten als Reaktion auf chemische und/oder biologische Substanzen, die dem Säuger verabreicht werden, d.h. als Reaktion auf eine Behandlung des Patienten, umfasst. Das Verfahren umfasst die Schritte wie oben und den Vergleich der relativen Menge der identifizierten Zellen mit einer früher oder gleichzeitig genommenen Probe von demselben Säuger und/oder mit einer Kontrollprobe. Basierend auf den Ergebnissen, wie erhalten durch die/das Verfahren der Erfindung, kann der behandelnde Arzt auf den Immunstatus des Patienten schließen und eine Behandlung der zugrunde liegenden Erkrankung anpassen.
Vorzugsweise wird das Verfahren ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung von Zellen durchgeführt, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe oder jeder anderen biologischen Probe, die potentiell die basophilen Granulozyten enthält, wie z.B. einer Probe für den Zelltransfer in einen Patienten.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren wie oben, das weiterhin die Formulierung der identifizierten basophilen Granulozyten für die Transplantation in einen Patienten umfasst. Pharmazeutische Präparate für diese Zwecke und Verfahren zu ihrer Herstellung werden nach den bekannten Verfahren in der Transplantationsmedizin durchgeführt.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nrn. 4 bis 11, oder ein Amplikon gemäß SEQ ID Nrn. 1 bis 3.
Noch ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Kit zur Identifizierung, Quantifizierung, und/oder Überwachung von basophilen Granulozyten in einem Säuger, basierend auf der Analyse der Bisulfitzugänglichkeit von CpG-Positionen in der Genregion von MCC, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der hier beschriebenen Erfindung, insbesondere ein Kit, umfassend a) ein Bisulfitreagenz und b) Materialien zur Analyse des Methylierungsstatus der CpG-Positionen ausgewählt aus den CpG-Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr: 1, wie etwa ein Oligomer ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nrn. 4 bis 11.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Oligomeren oder Amplikons oder eines Kits gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung und/oder Überwachung der basophilen Granulozyten in einem Säuger, wie hier beschrieben.
Wie bereits erwähnt, wurden kürzlich drei neue Cytosin-Modifikationen entdeckt. Deshalb wird erwartet, dass zukünftige wissenschaftliche Erkenntnisse die in der Vergangenheit beschriebenen epigenetischen Modifikationsmuster korrigieren. Diese bisherigen Muster der Cytosin-Modifikationen umfassen Bisulfit-konvertierbares (nicht-methyliertes, nicht-modifiziertes) und nicht-konvertierbares (methyliertes, modifiziertes) Cytosin. Beide Termini müssen wie beschrieben korrigiert werden. Nach den neueren wissenschaftlichen Erkenntnissen (i) umfasst nicht-konvertierbares Cytosin 5-Methylcytosin (mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), und (ii) Bisulfit-konvertierbares (d.h. die „Bisulfit-Konvertibilität“) Cytosin 5-Formylcytosin (fC), 5-Carboxycytosin (cC), ebenso wie nicht modifiziertes Cytosin.
Zusätzlich basieren die bisherigen Erfindungen auf i) dem Verhältnis von Bisulfit-konvertierbarem Cytosin zur gesamten Chromatinmenge (Zelltyp-unabhängiger, 100 % Bisulfit-konvertierbarer DNA-Lokus) oder ii) auf dem Verhältnis von Bisulfit-konvertierbarem Cytosin (fC, cC, nicht-modifiziertes Cytosin) zu nicht-Bisulfit-konvertierbarem Cytosin (hmC und mC). Diese Verhältnisse charakterisieren Zelltyp, Zelldifferenzierung, Zellstadium sowie pathologische Zellstadien. Daher werden neue Techniken zu neuartigen spezifischeren Ergebnisse führen und könnten aktuelle zellspezifische, Zellstadium-spezifische sowie pathologische Muster epigenetischer Modifikationen ergänzen und somit potenzielle neue Biomarker definieren. Es können neue Verhältnisse, die als Biomarker bestimmt werden sollen, definiert werden als: $Biomarker Verhältniss = a / b$

a = ∑ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC)
b = ∑ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC),

Für die Zwecke der Definition für die vorliegende Anwendung beziehen sich „epigenetische Modifikationen“ in der DNA-Sequenz durch die Terminologie auf (i) Bisulfit-konvertierbares Cytosin (5-Formylcytosin, (fC) und/oder 5-Carboxycytosin (cC)) und (ii) nicht-Bisulfit-konvertierbares Cytosin ((einschließlich 5-Methylcytosin (mC), 5-Hydroxymethylcytosin, (hmC)). Da beide Methylierungsarten, mC und hmC, nicht Bisulfit-konvertierbar sind, ist es nicht möglich, zwischen diesen beiden zu unterscheiden. Ebenso sind fC, cC und nicht-modifiziertes Cytosin Bisulfit-konvertierbar und können auch nicht voneinander unterschieden werden. Die Bezeichnung „methylierte“ DNA umfasst sowohl mC als auch hmC. Die Bezeichnung „nicht-methylierte“ DNA umfasst fC, cC, und nicht-modifizierte DNA. Es wird erwartet, dass in Zukunft neue Varianten von DNA-Modifikationen entdeckt werden. Jede Art der Modifikation wird entweder Bisulfit-konvertierbar sein oder nicht. Da die vorliegende Erfindung jedoch zuverlässig zwischen den beiden Gruppen unterscheidet, werden diese neuartigen Modifikationen auch als Marker einsetzbar sein.
Darüber hinaus werden neben den DNA-Modifikationen auch Histone post-translational modifiziert, die die Interaktion mit der DNA und nuklearen Proteinen verändern. Zu den Modifikationen gehören Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Sumoylierung, Citrullinierung und ADP-Ribosylierung. Der Kern der Histone H2A, H2B und H3 kann ebenfalls modifiziert werden. Histon-Modifikationen sind an verschiedenen biologischen Prozessen, wie der Genregulation, DNA-Reparatur, Chromosomenkondensation (Mitose) und Spermatogenese (Meiose) beteiligt. Auch für diese Modifikationen ist ein spezifisches Modifikationsmuster spezifisch für verschiedene Zelltypen, Zellstadien, Differenzierungsstatus und ein solches Muster kann analysiert werden für Bisulfit-Konvertibilität oder ähnliche Verfahren, um bestimmte Zellen und Zellstadien zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung dieser Modifikationen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Erfinder unter Verwendung der genetischen Region MCC und insbesondere des hier beschriebenen Amplikons als Marker sehr spezifisch basophile Granulozyten und in ihrem Verhältnis zu anderen Zelltypen in einer Probe, zum Beispiel zu anderen Blutzellen, identifiziert, quantifiziert und besonders unterschieden haben.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren und das Sequenzprotokoll näher beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle hier zitierten Referenzen in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
1 zeigt die Analyse der CpG-Positionen auf dem Amplikon Nr. 2694 (entsprechend SEQ ID Nr. 1) gemäß der Erfindung. Die horizontalen Kästchen in der Tabelle entsprechen den CpG-Positionen im analysierten Amplikon (z.B. CpG 1 bis 4, und CpG 6 bis 10) mit den angegebenen Positionen (AMP2694:57, entsprechend CpG 1 an Position 57 von AMP2694...etc.), und die Spalten entsprechen den analysierten Zelltypen.
SEQ ID Nr. 1 zeigt die genomische Sequenz des Amplikons AMP2694 gemäß der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID Nr. 2 und 3 zeigen die Sequenzen der Bisulfit-konvertierten Target-Region des bevorzugten qPCR-Assay-Systems der Erfindung.
SEQ ID Nr. 4 bis 11 zeigen die Sequenzen der spezifischen Oligomere (Primer und Sonden) gemäß der vorliegenden Erfindung.
Beispiele
Beispiel 1
Um basophile Granulozyten zu identifizieren, wurde eine qPCR mit Bisulfit-konvertierten Proben aus dem humanen Genombereich entsprechend der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 1 (siehe AMP2694, SEQ ID Nr. 1) durchgeführt, relevante CpGs sind fett dargestellt.


 TGCTCTGGTCCTCCTTGCCCAAGAGGTGTGGGGATGGGTGTGGTGGAGGCACAGTCCGGG
 GTTGGTCTCGCCTGCCGCACGCCTGTTCAGTAGCCTTTTAATGAACTCAGTGACTCAGCG
 CTGTCCCTCCCCCACCGGCCTCGGATCTCATTCCTCTCAATCGCACTGATGCCCATGTGAC
 AGCACGTTGTCTCCACCGAGACTAATCCCTTATCAATAAGAGCTTTCAGCACGGCCCAGA
 CCAGATTACTCTGTCTCACAACCACTTTGCTGACCTGCCCGGGGGGCCACCGAATACTCC
 CCGAGCGCATACTATTTACAGAAGAGTCAAGATAAGCCGGATCACTTGGCGTGATTATT
 TCGCTTCCAAAGTTTGTGGCTTTAACAAAGCAAACCCACATTCAAC

Die entwickelten, Bisulfit-konvertierten Target-Regionen des bevorzugten qPCR-Assay-Systems waren:

TpG-spezifisch (SEQ ID Nr. 2, relevante Positionen sind fett dargestellt und unterstrichen):

CpG-spezifisch (SEQ ID Nr. 3, relevante Positionen sind fett dargestellt und unterstrichen):

Die folgenden Primer und Sonden wurden für die Amplifikation verwendet:

Vorwärts Amplifikationsprimer	2694r	TACTCTAATCCTCCTTACCCAA (SEQ ID Nr. 4)
Rückwärts Amplifikationsprimer	2694q	GTTGAATGTGGGTTTGTTTT (SEQ ID Nr. 5)
Vorwärtsprimer TpG- spezifisch	2694r_T_fw	AACACAATCCAAAATTAATCTCA (SEQ ID Nr. 6)
Rückwärtsprimer TpG- spezifisch	2694q_T_rev	GAGGAATGAGATTTGAGGTTG (SEQ ID Nr. 7)
Sonde TpG-spezifisch	2694_TP	ATTGAATAGGCGTGCGGTAGGCGA (SEQ ID Nr. 8)
Vorwärtsprimer CpG- spezifisch	2694r_C_fw	AACACAATCCGAAATTAATCTCGC (SEQ ID Nr. 9)
Rückwärtsprimer CpG-spezifisch	2694q_C_rev	GGAATGAGATTCGAGGTCG (SEQ ID Nr. 10)
Sonde CpG-spezifisch	2694_CP	AGGTTATTGAATAGGTGTGTGGTAGGTGAG (SEQ ID Nr. 11)

Obwohl in diesem Beispiel nicht explizit offenbart, sind die anderen Bisulfit-Stränge und ihre entsprechenden Primer gleichermaßen bevorzugt.

Die Spezifität des TpG-spezifischen PCR-Systems wurde mit Hilfe von Test-Templates (Plasmid-DNA) nachgewiesen, wie in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Tabelle zeigt die Messung von aufgereinigten Zelltypen mit dem TpG-spezifischen Assay für MCC - und damit basophile Granulozyten- im Vergleich zu zwei alternativen „Kontollsystemen“. Die Zelltypen in der Tabelle werden wie folgt abgekürzt: MOC29 - aufgereinigte CD14 Monozyten; CTL11 - zytotoxische T-Zellen; Grc32 - alle CD15 Granulozyten; NKC - CD56 natürliche Killerzellen; THC13 - T-Helfer-Zellen; eGRC - Eosinophile; BLC28 - B-Zellen; nGRC03 - Neutrophile; NKT- natürliche Killer-T-Zellen und bGRC - Basophile Granulozyten. Im oberen Panel des Kontroll-Amplifikations-Systems befindet sich eigentlich das CpG-spezifische System. An dieser Stelle ist dieses System das bessere Kontrollsystem, da es in Zellen mit einer hohen Anzahl von Zellen vergleichsweise niedrig sein sollte, die an der analysierten Position genomisch unmodifiziert (demethyliert) sind und eine hohe Anzahl von Zellen mit einer Methyl-modifizierten Position. Jedoch basiert das endgültige Analysesystem auf einem System, bei dem alle Zelle gleichermaßen gemessen werden, und nur die spezifischen Zellen zeigen eine Amplifikation am gegebenen epigenetisch modifizierten Lokus.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von basophilen Granulozyten in einer Probe, umfassend das Analysieren einer Modifikation, wie z.B. den Methylierungsstatus von mindestens einer CpG-Position in der Säuger-Genregion für Mutated in Colorectal Cancer (MCC), wobei vorzugsweise die analysierte Genregion gemäß der SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder fehlende Modifikation, wie z.B. Methylierung der Genregion für einen basophilen Granulozyten im Vergleich zu einem nicht-basophilen Granulozyten indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine CpG-Position in der 5'-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, der Promotorregion, den 5'- oder 3' - nicht-translatierten Regionen, Exon, Intron, Exon/Intron-Grenze und/oder in der 3'-Region stromabwärts vom Transkriptionsstopp der analysierten Genregion vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine CpG-Position ausgewählt ist aus einer CpG der CpG-Positionen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 und 18 im Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 ausgewählt ist, und vorzugsweise ausgewählt ist aus den CpG-Positionen 57, 69, 76, 80, 119, 136, 142, 162, 186, 198, 233, 281, 292, 303, 307, 339, 351, und 362 in dem Amplikon Nr. 2694 oder gemäß der Bisulfit-konvertierten Sequenz gemäß der SEQ ID Nrn. 2 oder 3.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Analyse der Bisulfit-Konvertibilität ein Verfahren ausgewählt aus Methylierungs-spezifischen enzymatischen Verdau, Bisulfitsequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotermethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE, und anderen Verfahren, die auf dem Nachweis amplifizierter DNA beruhen, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend eine Quantifizierung der relativen Menge an basophilen Granulozyten, basierend auf einem Vergleich der relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in der analysierten Region, mit der relativen Menge der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie zum Beispiel GAPDH.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probe aus einer Körperflüssigkeit eines Säugertiers, einschließlich menschlicher Blutproben, oder einer Gewebe-, Organ- oder Zelltyp-Blutprobe, einer Probe von Blutlymphozyten oder einer Fraktion davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter umfassend ein Unterscheiden von basophilen Granulozyten von allen oder mindestens einem der Zelltypen, ausgewählt aus follikulären Helfer-T-Zellen, B-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, neutrophilen Granulozyten, Monozyten, NK-Zellen, und T-Helfer-Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt wird, vorzugsweise unter Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter umfassend den Schritt des Schlussfolgerns auf den Immunstatus des Säugers basierend auf den identifizierten basophilen Granulozyten.
Verfahren zu Überwachung der Menge an basophilen Granulozyten in einem Säuger, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 9, und weiterhin einen Vergleich der relativen Menge der identifizierten Zellen mit einer früher oder gleichzeitig entnommenen Probe aus demselben Säuger und/oder mit einer Kontrollprobe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, weiter umfassend das Messen und/oder Überwachen der Menge der basophilen Granulozyten als Reaktion auf chemische und/oder biologische Substanzen, die dem Säugetier verabreicht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Säuger an Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen, Infektionskrankheiten, Krebs, und/oder Allergien leidet oder wahrscheinlich daran leidet.
Kit zur Identifizierung, Quantifizierung, und/oder Überwachung von basophilen Granulozyten in einem Säuger, basierend auf der Analyse der Bisulfit-Zugänglichkeit von CpG-Positionen in der Genregion von MCC, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, insbesondere Kit umfassend a) ein Bisulfitreagenz und b) Materialien zur Analyse des Methylierungsstatus von CpG-Positionen, ausgewählt aus den CpG-Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr: 1, sowie ein Oligomer, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nrn: 4 bis 11.
Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nrn: 4 bis 11 oder der Amplikons gemäß SEQ ID Nrn: 1, 2, oder 3.
Verwendung des Kits nach Anspruch 13, oder des Oligomers oder Amplikons gemäß Anspruch 14 zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder Überwachung von basophilen Granulozyten in einem Säuger.