DE60026624T2

DE60026624T2 - Verfahren und Zusammensetzungen für die Detektion pathologischer Ereignisse

Info

Publication number: DE60026624T2
Application number: DE60026624T
Authority: DE
Inventors: Bruno Tocque; Laurent Bracco; Fabien Schweighoffer
Original assignee: ExonHit Therapeutics SA
Current assignee: ExonHit Therapeutics SA
Priority date: 1999-09-16
Filing date: 2000-09-05
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2020-09-06
Also published as: EP1198595B1; US6372432B1; CA2383880C; EP1198595A1; FR2798673B1; JP2003515317A; ES2209984T3; EP1382693B1; DK1198595T3; DE60006392T2; EP1382693A1; ATE253647T1; IL187097A; US20090264301A1; ATE319860T1; DE60006392D1; AU7425200A; DE60026624D1; DK1382693T3; ES2256629T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis pathologischer Ereignisse. Sie betrifft im besonderen Zusammensetzungen und Verfahren zum Fernnachweis pathologischer Ereignisse. Die Erfindung betrifft ebenfalls Mittel, Kits und Zusammensetzungen zur Anwendung derartiger Verfahren wie auch ihre Anwendungen auf dem Gebiete der Human- oder Veterinärmedizin oder zum Beispiel in der experimentellen Forschung.
Mit zunehmendem Alter der Bevölkerung in den industrialisierten Ländern entsteht ein neuer Bedarf an diagnostischen Mitteln. Krankheiten wie beispielsweise Krebs oder neurodegenerative Krankheiten wären zum Vorteil der Patienten und der Gesellschaft besser zu behandeln, falls man über prädiktive Diagnosen sowohl zum Auftreten als auch zur Entwicklung der Krankheit verfügen könnte.
Die Erfahrung zeigt, dass je früher die Diagnose gestellt ist, desto größer die Chancen für eine Kontrolle der eventuellen Krankheitsentwicklung sind. Dies ist eindeutig bei Krebs der Fall. Die Kampagnen zur Früherkennung von Brustkrebs mit Hilfe der systematischen Mammographie haben die Überlebensraten bei diesen Krebsarten verbessert. Ebenso kann man abschätzen, dass ein frühes Einbeziehen von Patienten, die die Alzheimer Krankheit entwickeln, die Entwicklung der Krankheit signifikant verzögern würde.
Diese Krankheiten wie beispielsweise Krebs und neurodegenerative Krankheiten zeigen eine Inzidenz, die sich mit dem Alter der Bevölkerung stark erhöht. Es ist zu vermuten, dass diese Krankheiten Jahre zum Ausbruch benötigen und festgestellt werden können. Daraus ergibt sich zum Beispiel, dass die Anhäufung von sukzessiven Störungen auf Ebene des menschlichen Genoms erforderlich ist, um zu einer Krebsentstehung zu führen. Ebenso unterstreichen genetische Untersuchungen, die bei ausgewählten Populationen mit einer auffallenden Inzidenz für die Alzheimer Krankheit durchgeführt wurden und die mit genetischen Versuchen bei Tieren verbunden waren, ebenfalls den multifaktoriellen Charakter der Entstehung dieser Krankheit.
Diese mit der Alterung verbundenen Krankheiten weisen allgemeine Kennzeichen auf, wie beispielsweise:

– Zellstörungen, die sich als Folge von Ungleichgewichten der Umgebung von inkriminierten Geweben ereignen und mit physikalischen, chemischen oder biologischen Angriffen verbunden sind;
– der Beitrag von Zellen des Immunsystems.

Falls die Störungen von inkriminierten Geweben nur als Folge von Biopsien bevorzugt festgestellt werden, wäre es möglich, dass Störungen der Immunzellen eine sich ausbildende pathologische Entwicklung widerspiegeln, und die Entwicklungsherde dieser Krankheiten könnten aus der Ferne detektiert werden, da die meisten Zellen des Immunsystems sich im Gewebe und Blut oder in Lymphknoten entwickeln.
Lymphzellen und Makrophagen sind die Zellen, die hauptsächlich zelluläre Immunantworten vermitteln. Lymphocyten und Makrophagen sind in den Geweben wie auch im Blut vorhanden. Es sind die Zellen, die als erste mit Fremdgewebe im Organismus in Kontakt kommen. Die Makrophagen bauen inkriminierte Gewebe und Substanzen ab. Die von den abgebauten Proteinen freigesetzten Peptide werden anschließend von den Molekülen des Klasse II Haupthistokompatibilitätskomplexes gebunden, die sie dann auf der Oberfläche des Makrophagen präsentieren, wo diese Komplexe von den T-Lymphocyten wiedererkannt werden. Es gibt weitere Systeme für die Präsentation von Peptiden und Aktivierung von Immunantworten, die besonders im Falle der Krebsentwicklung beschrieben worden sind.
Heutzutage erfolgen die Diagnosen dieser Krankheiten, wenn die Krankheit ausgebrochen ist. Was Krebs anbelangt, wird zum Beispiel die Diagnose ausgehend von einer medizinischen bildgebenden Darstellung und einer morphologischen Diagnose von Geweben, die aus Biopsien erhalten sind, gestellt. Für eine Krankheit wie die Alzheimer Krankheit gibt es ganzes Bündel medizinischer Beobachtungen, die eine Erstellung einer Diagnose erlauben.
Es besteht folglich ein wirklicher Bedarf an einer Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die ein frühes, einfaches und zuverlässiges Bestimmen des Auftretens von Krankheiten erlauben, besonders von Krankheiten, die mit einer Deregulierung von Regulationsmechanismen der zellulären Signalübertragung verbunden sind, insbesondere von Krankheiten, die durch eine übermäßige Zellproliferation (Krebs, Nerven-Degeneration, Stenose etc.) gekennzeichnet sind.
Die Einführung von molekularbiologischen Techniken, verbunden mit der Bioinformatik, hat die Erstellung von Bibliotheken (oder Banken) von DNA-Fragmenten erlaubt, die einen gegebenen pathologischen Zustand kennzeichnen, was die Bestimmung des Vorliegens oder nicht Vorliegens von Hinweisen auf Krankheiten aus einer sehr kleinen Probe aus beliebigen Geweben erlaubt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen zurzeit neuen Ansatz zum Nachweis von Krankheiten in vitro. Im besonderen beschreibt die vorliegende Erfindung neue Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis von pathologischen Ereignissen, besonders von pathologischen genetischen Signaturen. Die Erfindung beschreibt außerdem Verfahren und Zusammensetzungen, die zum Fernnachweis von pathologischen Ereignissen zweckdienlich sind, nämlich über verschiedene biologische Materialien von pathologischen Geweben. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung bieten heute Ärzten, Biologen und der Industrie neue Wege in der in vivo Diagnose, die sich auf direkte, schnelle, empfindliche und wirtschaftliche und automatisierbare Verfahren stützt.
Im besonderen beruht die Erfindung besonders darauf, dass sie die Möglichkeit aufzeigt, aus biologischen Proben, umfassend Zellen des Blutkreislaufs, das Vorliegen oder das Risiko der Entwicklung einer Krankheit zu bestimmen. Im besonderen beruht die Erfindung darauf, dass sie die Möglichkeit aufzeigt, in einer biologischen Probe, umfassend Blutzellen, das Vorliegen einer Krankheit, einschließlich sehr früher Stadien des Ausbruchs oder der Entwicklung nachzuweisen, bei denen bereits vorhandene Diagnosemöglichkeiten nicht effektiv wären.
Ein erster Gegenstand der Erfindung beruht im besonderen auf einem Verfahren zum in vitro Nachweis des Vorliegens einer Krankheit bei einer Person, umfassend die Entnahme einer Probe von Blutzellen der Person und die Bestimmung des Vorliegens von Blutzellen in dieser Probe, die einen für die Krankheit charakteristischen physiologischen Zustand aufweisen.
In einer besonderen Form umfasst das Verfahren der Erfindung die Bestimmung des Vorliegens von Blutzellen in der Probe, die ein für die Krankheit charakteristisches Protein oder charakteristische Proteindomäne aufweisen. In diesem Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck „aufweisen" ebenso das Vorliegen dieses Proteins oder dieser Proteindomäne im Zellinnern (egal in welchem Zellkompartiment) wie auch sein/ihr Vorliegen in der Zellmembran oder an der Zelloberfläche. In dieser Anwendungsform kann das Vorliegen des Proteins (oder der Proteindomäne) mit Hilfe von Antikörpern (oder Fragmenten oder Antikörper-Derivaten) oder mit jeder anderen dem Fachmann bekannten Technik bestimmt sein.
In einer anderen besonderen Form umfasst das Verfahren der Erfindung die Bestimmung des Vorliegens von Blutzellen in der Probe, die ein für die Krankheit charakteristisches genetisches Profil aufweisen.
Noch bevorzugter umfasst das Verfahren der Erfindung den Nachweis des Vorliegens von Blutzellen in der Probe, die für das Vorliegen der Krankheit charakteristische Störungen der Genexpression aufweisen.
Ebenso beruht die vorliegende Erfindung einerseits auf der Verwendung von Blutzellen zur Durchführung eines Ferntests auf das Vorliegen eines pathologischen Ereignisses und andererseits auf der Anwendung von genomischen Techniken, die den Nachweis von Störungen der Expression (insbesondere der Transkription) des Genoms in den Zellen erlauben.
Gemäß einer besonderen Variante umfasst die vorliegende Erfindung folglich bevorzugter die Bestimmung des Vorliegens in einer biologischen Probe von Blutzellen, die transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Störungen der Genexpression aufweisen, die für das Vorliegen einer Krankheit charakteristisch sind.
Die Erfindung zeigt auf, dass es möglich ist, eine Krankheit in der Entstehung aus identifizierten genomischen Signaturen in den Blutzellen nachzuweisen, wobei die in der Entstehung befindlichen Krankheitsherde in Nervengeweben, wie im Gehirn oder Rückenmark (Orte von neurodegenerativen Krankheiten), oder in ganz anderen Geweben zum Beispiel bei Beginn einer Krebserkrankung (Brust, Lunge, Prostata, Leber, Knochengewebe etc.) vorliegen können.
Die Erfindung zeigt in einer unerwarteten Weise, dass es auf Ebene der Blutzellen (bevorzugt Zellkerne enthaltende Zellen wie beispielsweise Lymphocyten, Makrophagen, Monocyten, dendritische Zellen etc.) transkriptionelle oder post-transkriptionelle Störungen der Genexpression in Folge von (einer) direkten oder indirekten Wechselwirkung(en) mit den Zellen bei der Krankheitsentstehung gibt.
Im besonderen zeigt die Erfindung in einer unerwarteten Weise, dass es auf Ebene der Blutzellen (bevorzugt Zellkerne enthaltende Zellen wie beispielsweise Lymphocyten, Makrophagen, Monocyten, dendritische Zellen etc.) qualitative Störungen der Transkription von Genen in Folge von (einer) direkten oder indirekten Wechselwirkung(en) mit den Zellen bei der Krankheitsentstehung gibt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Variante umfasst das Verfahren der Erfindung (i) die Präparation von Nucleinsäuren der Probe und (ii) die Hybridisierung der präparierten Nucleinsäuren mit wenigstens einer Bank an Nucleinsäuren, die für einen pathologischen Zustand charakteristisch sind, wobei das Hybridisierungsmuster auf das Vorliegen von Blutzellen, die für die Krankheit charakteristisch sind, in der Probe hinweist.
Im besonderen umfasst die verwendete Bank in einer Anwendungsform der Erfindung außerdem Nucleinsäuren, die für Gene spezifisch sind, deren Expressionsniveau in einer Blutzelle, die aus einem einen Krankheitszustand aufweisenden Organismus stammt, modifiziert ist.
In einer anderen Anwendungsform der Erfindung umfasst die verwendete Bank Nucleinsäuren, die für die Spleißformen von Genen spezifisch sind, die für eine Blutzelle charakteristisch sind, die von einem eine pathologische Situation aufweisendem Organismus stammt.
Die Erfindung basiert besonders auf einem neuartigen Verfahren, nämlich der qualitativen Analyse von Differenzen, die mit dem Vorhandensein von Insertionen oder Deletionen (alternative Spleißungen) in für die Funktion der Genprodukte wesentlichen Bereichen verbunden sind. Diese Insertionen und Deletionen sind genau reguliert und sind für physiologische und pathophysiologische Zustände (besonders proliferierende und differenzierte Zustände) von Zellen des Organismus charakteristisch. Diese Regulationsniveau ist während der Entstehung, der Aufrechterhaltung und der Entwicklung einer großen Anzahl an Krankheiten beeinflusst. In einer bevorzugten Form beruht die Erfindung folglich auch auf der Anwendung einer genomischen Technik, die zur systematischen Analyse dieser Deregulationen zur Entwicklung prädiktiver Diagnosen bestimmt ist. Die Erfindung erlaubt sogar die Identifizierung deregulierter Gene in zirkulierenden Zellen bei Krankheitsereignissen und die Verwendung dieser qualitativen genetischen Ereignisse in prädiktiven Diagnose-Tests, zur Vorhersage oder zum Nachweis von pathologischen Ereignissen, die zur Kostendämpfung im Gesundheitswesen beitragen.
Hinsichtlich der Identifizierung von Genexpressionsmarker, die spezifisch in Blutzellen eines eine Krankheit aufweisenden Organismus vorliegen, zum Beispiel in einem zu frühen Stadium, um mit Hilfe klinischer Prüfungen oder klassischen Diagnose-Tests diagnostiziert werden zu können, bietet die Erfindung den Vorteil, posttranskriptionelle Störungen zu identifizieren. Denn diese Störungen sind hauptsächlich die Folge der Modifikation der Regulation eines Schlüsselschrittes der Genexpression: die Spleißung. Die Spleißvariationen modifizieren in qualitativer Weise die RNA durch Einschließen oder Ausschließen von Exons oder Introns, deren Anwesenheit oder Abwesenheit, verbunden mit einer gegebenen physiopathologischen Situation, die Basis für eine Diagnose liefern kann. Diese Diagnose kann auf dem Einsatz der PCR oder Hybridisierungen beruhen, die ein spezifisches Detektieren der gespleißten Sequenz in differentieller Weise von den beiden Situationen erlauben. Oft beeinflussen die Spleißvariationen, durch Verwendung alternativen Exon(s) oder durch Beibehaltung von Intron(s) in einer Messenger RNA die Sequenz des entsprechenden Proteins. Diese Unterschiede in der Aminosäure-Kette erlauben an eine Diagnose zu denken, die auf dem Einsatz von Antikörpern basiert, die spezifisch die alternative Proteinsequenz wiedererkennen.
Wie zuvor angegeben, beruht das Verfahren der Erfindung besonders auf der Verwendung von zirkulierenden Zellen als biologisches Material. Im besonderen handelt es sich um Blutzellen und bevorzugt um Zellen mit Kern. Man kann besonders die Lymphocyten, Makrophagen, Monocyten, dendritische Zellen, etc. nennen. Die Zellen können von einer Person mittels jeder dem Fachmann bekannten Technik entnommen werden, Cytapherese, Ficoll Gradienten, Präparation von mononukleären Zellen des peripheren Bluts etc. Zur Anwendung der vorliegenden Erfindung können die verschiedenen Blutzellpopulationen voneinander getrennt sein, um nur einen bestimmten Typ zu verwenden, der eine spezifische genomische Signatur aufweist. Allerdings kann der Test der Erfindung ebenfalls mit einer biologischen Probe durchgeführt sein, die nicht getrennte Blutzellen umfasst. Übrigens können die zirkulierenden Zellen ebenfalls Tumorzellen, von pathologischem Gewebe abgelöste Zellen, zum Beispiel bei Metastase-Prozessen, sein (oder umfassen). Die Nucleinsäuren können aus der Probe gemäß jeder dem Fachmann bekannten Technik (Zelllyse, Zellextraktion, RNA-Isolierung, etc.) präpariert sein. Außerdem sind diese Nucleinsäuren vor dem Hybridisierungsschritt, zum Beispiel zur Herstellung von cDNA, zur Amplifikation dieser Nucleinsäuren, zur deren Markierung, etc. vorzugsweise behandelt. In dieser Hinsicht kann die Markierung radioaktiver, enzymatischer, fluoreszierender, colorimetrischer oder beliebig anderer Natur sein.
Typischerweise umfasst das Verfahren der Erfindung die Entnahme einer biologischen Blutprobe, die Behandlung der Blutzellen zur Freisetzung der Nucleinsäuren, die Amplifikation von Nucleinsäuren (und gegebenenfalls ihre inverse Transkription), die Markierung von Nucleinsäuren und ihre Hybridisierung mit der oder den Banken.
Das Verfahren der Erfindung kann angewandt sein zum Nachweis des Vorliegens einer Krankheit (oder eines Krankheitsereignisses), nämlich des Vorliegens von zellulären Prozessen, die für Beginn oder Entwicklung einer Krankheit charakteristisch sind, obwohl die klinischen Symptome noch nicht evident sind. Das Verfahren der Erfindung kann in dieser Hinsicht ebenfalls die in vitro Feststellung eines Entwicklungsstadiums einer Krankheit bei einer Person erlauben. Die genetischen Signaturen der Zellen entwickeln sich als Funktion der fortschreitenden Stadien der Krankheit, deshalb ist es folglich möglich, aufgrund der spezifischen Banken die Entwicklung einer Krankheit festzustellen. Andererseits erlaubt das Verfahren der Erfindung auch die Lokalisierung einer Krankheit in einer Person, nämlich zum Beispiel der Entstehungsort eines Krankheitsherdes im Gewebe.
Wie zuvor erwähnt, kann das Verfahren der Erfindung zum Nachweis verschiedener Krankheitsarten angewandt sein, besonders von Krankheiten, die mit Deregulationen der zellulären Signalübertragung assoziiert sind. Es kann sich um Krankheiten handeln, die mit Alterung wie zum Beispiel neurodegenerative Krankheiten verbunden sind, oder jeder anderen Krankheit, die insbesondere eine anormale Zellproliferation (Krebs, Stenose) umfasst.
Gemäß einer besonderen Form betrifft die Erfindung ein Verfahren, wie zuvor definiert, zum in vitro Nachweis des Vorliegens, des Entwicklungsstadiums oder der Lokalisierung einer neurodegenerativen Krankheit.
Gemäß einer anderen besonderen Form betrifft die Erfindung ein Verfahren, wie zuvor definiert, zum in vitro Nachweis des Vorliegens, des Entwicklungsstadiums oder der Lokalisierung einer Krebserkrankung. Es kann sich um verschiedene Krebsarten handeln, wie zum Beispiel feste Tumore (von Leber, Lunge, Schädel und Hals, Melanom, von Blase, Brust etc.).
Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum in vitro Nachweis von Blutzellen, die für einen Krankheitszustand charakteristisch sind, umfassend die Entnahme einer Probe von Blutzellen bei einer Person und die Bestimmung des Vorhandenseins in der Probe von Blutzellen, die ein für eine Krankheit charakteristisches genetisches Profil aufweisen.
Wie bereits oben beschrieben, beruht die Erfindung zum Teil auf der Bildung oder Verwendung von Banken an Nucleinsäuren, die für einen Krankheitszustand charakteristisch sind. In einer ersten Anwendungsform handelt es sich um Banken (oder Präparate) von Nucleinsäuren, umfassend Nucleinsäuren, die für Gene spezifisch sind, deren Expressionsniveau in einer Blutzelle modifiziert ist, die von einem Organismus in einer Krankheitssituation stammt.
Gemäß einer anderen Anwendungsform handelt es sich um Banken (oder Präparate) von Nucleinsäuren, umfassend Nucleinsäuren, die für Spleißformen von charakteristischen Genen einer Blutzelle spezifisch sind, die von einem Organismus in einem Krankheitszustand stammt.
Die Präparate oder Banken der Erfindung können auf Trägern, in Reinform oder als Mischung, angebracht sein, wie es detaillierter nachfolgend beschrieben ist.
Die Erfindung beschreibt noch Verfahren zur Herstellung derartiger Banken. Insbesondere umfassen diese Verfahren (i) die Gewinnung eines ersten Nucleinsäure-Präparates aus einer Blutzelle, die aus einem eine Krankheit aufweisenden Organismus isoliert ist, (ii) die Gewinnung eines Präparates aus Referenz-Nucleinsäuren aus einer Blutzelle, die aus einem besagte Krankheit nicht aufweisenden Organismus isoliert ist, (iii) einen Hybridisierungsschritt mit besagtem ersten Präparat und dem Referenz-Präparat und die Wiedergewinnung der Nucleinsäuren, die für die Blutzelle charakteristisch sind, die von dem Organismus in einer pathologischen Situation stammt.
Die Erfindung beschreibt ebenfalls Verfahren zur Herstellung einer Bank an Nucleinsäuren, die für das Entwicklungsstadium einer Krankheit charakteristisch sind, umfassend (i) die Gewinnung eines ersten Nucleinsäure-Präparates aus einer Blutzelle, die aus einem eine Krankheit in einem bestimmten Entwicklungsstadium aufweisenden Organismus isoliert ist, (ii) die Gewinnung eines Präparates aus Referenz-Nucleinsäuren aus einer Blutzelle, die aus einem besagte Krankheit in einem anderen Entwicklungsstadium aufweisenden Organismus isoliert ist, (iii) einen Hybridisierungsschritt mit besagtem ersten Präparat und dem Referenz-Präparat, und (iv) die Wiedergewinnung der Nucleinsäuren, die für die Blutzelle charakteristisch sind, die aus dem Organismus in dem bestimmten Entwicklungsstadium der Krankheit stammt.
Wie es später noch detaillierter erläutert wird, kann der Schritt der Wiedergewinnung von Klonen entweder die Wiedergewinnung von nicht hybridisierten Nucleinsäure-Klonen oder die Wiedergewinnung, aus den gebildeten Hybriden, von Nucleinsäure-Klonen umfassen, die für Spleißformen von Genen spezifisch sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls beliebige Kits, die zur Anwendung eines wie oben beschriebenen Verfahrens, umfassend eine Bank an Nucleinsäuren, umfassend Nucleinsäuren, die für charakteristische Störungen der Genexpression von Blutzellen eines Organismus in der Krankheitssituation spezifisch sind.
Identifikation für transkritionelle und post-transkriptionelle Modifikationen spezifische Marker
Wie oben angegeben, beschreibt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure-Banken, die für das Entwicklungsstadium einer Krankheit charakteristisch sind, umfassend (i) Gewinnung eines ersten Nucleinsäure-Präparates aus einer Blutzelle, die aus einem eine Krankheit in einem bestimmten Entwicklungsstadium aufweisenden Organismus isoliert ist, (ii) Gewinnung eines Präparates aus Referenz-Nucleinsäuren aus einer Blutzelle, die aus einem besagte Krankheit in einem anderen Entwicklungsstadium aufweisenden Organismus isoliert ist, (iii) einen Hybridisierungsschritt mit besagtem ersten Präparat und dem Referenz-Präparat, und (iv) die Wiedergewinnung von Nucleinsäuren, die für die Blutzelle charakteristisch sind, die vom Organismus in dem bestimmten Entwicklungsstadium der Krankheit stammt.
Die Verfahren der Erfindung umfassen im besonderen die Bildung von Klonen und von Nucleinsäure-Banken aus RNA-Extrakten bei verschiedenen Krankheiten, bei verschiedenen Entwicklungsstadien und die ebenso aus den kranken Geweben wie auch aus Blutzellen erhalten sind, deren Genexpression durch diese Gewebe beeinflusst worden ist. Die Gewinnung dieser Klone und dieser Banken erfolgt vorteilhafterweise mittels differentieller Analyse-Techniken der Genexpression. Die erhaltenen differentiellen Signaturen sind folglich einerseits für die Differenzen zwischen krankem und gesundem Gewebe und andererseits Blutzellen von Kranken und Kontrollblutzellen von Gesunden spezifisch. Diese Signaturen können folglich entweder in den pathologischen Proben oder den Kontrollproben bevorzugt gezeigt sein.
Die Nucleinsäure-Populationen, die zur Gewinnung von Klonen oder zur Bildung von Banken dienen, sind zum Beispiel RNA (Gesamt-RNA oder mRNA) aus Zellextrakten in einem Krankheitszustand und entsprechende RNA (Gesamt-RNA oder mRNA) von einem Kontrollzustand, oder von dieser Gesamt-RNA oder mRNA abstammende Nucleinsäuren (durch inverse Transkription, Amplifikation, Klonierung in Vektoren, etc.). Diese Nucleinsäuren können gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt sein. Zusammengefasst umfassen diese Verfahren allgemein eine Lyse von Zellen, Gewebe oder Probe und Isolierung von RNAs mittels Extraktionsverfahren. Es handelt sich insbesondere um eine Behandlung mit chaotropen Mitteln wie beispielsweise Guanidinthiocyanat (das die Zellen zerstört und die RNA schützt) und anschließende RNA-Extraktion mit Lösemitteln (zum Beispiel Phenol, Chloroform). Derartige Verfahren sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe Maniatis et al., Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), und können ohne weiteres mittels Verwendung von im Handel erhältlichen Kits angewandt sein wie zum Beispiel das Kit US73750 (Amersham) für die Gesamt-RNA. Es ist nicht erforderlich, dass die eingesetzten RNAs ganz rein sind und insbesondere stört es nicht, wenn Spuren genomischer DNA oder anderer Zellbestandteile (Proteine, etc.) in den Präparaten verbleiben, da sie die Stabilität der RNAs nicht signifikant beeinflussen. Außerdem ist es wahlweise möglich, nicht Gesamt-RNA Präparate sondern Messenger-RNA Präparate zu verwenden. Diese können entweder direkt aus einer biologischen Probe oder aus Gesamt-RNA mit Hilfe von polyT-Sequenzen gemäß herkömmlichen Verfahren isoliert sein. Die Gewinnung von Messenger-RNA kann in dieser Hinsicht mit Hilfe kommerzieller Kits durchgeführt sein, wie beispielsweise mit Kit US72700 (Amersham). Die RNAs können ebenfalls direkt aus Banken oder anderen Proben gewonnen sein, die bereits hergestellt und/oder in Sammlungen zugänglich und unter geeigneten Bedingungen aufbewahrt sind.
Die Hybridisierung kann unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt sein, die vom Fachmann angepasst werden können. Vorzugsweise setzt man für die Hybridisierung die Population an Nucleinsäuren, die vom deregulierten Zustand stammen, in einem Überschuss bezogen auf die Population an Nucleinsäuren ein, die vom Kontrollzustand stammen.
Um aus dem Produkt der Hybridisierungsreaktion Klone zu isolieren, die für die Deregulationen (Krankheiten) gemäß der Erfindung charakteristisch sind, können zwei prinzipielle Ansätze angewandt sein. Der erste Ansatz, ein lediglich quantitativer, erlaubt die Bildung eines Nucleinsäure-Präparates, das die gesamten (oder einen signifikanten Teil) der aus dem unterschiedlichen Expressionsniveau der beiden Zustände resultierenden Klone zusammenfasst. Derartige Klone (und Banken) werden gemäß den bekannten subtraktiven Hybridisierungsverfahren erhalten, die im Wesentlichen darin bestehen, die bei dem Hybridisierungsschritt gebildeten Hybride zu eliminieren, um nur die nicht hybridisierten Klone zu behalten, die für den deregulierten Zustand verglichen mit dem ausgewählten Kontrollzustand charakteristisch sind.
In einer bevorzugten Anwendungsform verwendet man jedoch ein qualitatives Verfahren, das die Bildung eines Nucleinsäure-Präparates erlaubt, das die gesamten (oder einen bedeutenden Teil) der Klone zusammenfasst, die aus funktionellen genetischen Störungen resultieren, die für den deregulierten Zustand verglichen mit dem ausgewählten Kontrollzustand charakteristisch sind. Im besonderen umfasst eine derartige qualitative Bank nicht die gesamten Klone, deren Expression modifiziert ist, sondern zum Beispiel die Klone, die unterschiedlichen Spleißungen oder Deletionen bei beiden Zuständen entsprechen. Wenn man die Rolle der alternativen Spleißungen in den zellulären Regulations- und Umsetzungspfaden berücksichtigt, umfassen vorteilhafterweise derartige Präparate (und Banken) Klone mit einem bedeutenden funktionellen Wert und sind folglich geeignet, an der Deregulation beteiligte genetische Modifikationen wiederzugeben. Derartige Klone erlauben folglich die Bildung von mehr prädiktiven Banken und die Generierung von repräsentativeren genetischen Markern.
Die Bildung derartiger qualitativer Banken kann durch Isolieren von Nucleinsäure-Bereichen aus den beim Hybridisierungsschritt gebildeten Hybriden erfolgen, die unterschiedlichen Spleißungen oder Deletionen entsprechen. Gemäß den eingesetzten Verfahren entsprechen diese Bereiche entweder ungepaarten oder gepaarten Bereichen.
Die beiden Ansätze sind nachfolgend detaillierter beschrieben.
Herstellung und Verwendung quantitativer differentieller Banken
In einer ersten Anwendungsform verwendet man folglich in der vorliegenden Erfindung eine quantitative differentielle Bank, nämlich eine Bank umfassend Nucleinsäure-Klone, die Genen entsprechen, deren Expressionsniveau in Zellen im Krankheitszustand verglichen mit dem Kontrollzustand modifiziert ist. Derartige Banken können zum Beispiel mittels quantitativer differentieller Analyse erstellt sein und die Sequenzen zusammenfassen, deren Expression bei zellulären Deregulationserscheinungen erhöht oder vermindert ist. Die Methodologien für Etablierung dieses Banken-Typs sind dem Fachmann bekannt und können in folgende Kategorien zusammengefasst werden:
Elektronische Subtraktion der Hochdurchsatz-Sequenzierung
Dieses Verfahren beruht auf der zufälligen Sequenzierung einer bestimmten Anzahl an cDNAs. Eine Suchmaschine zur Informationsrecherche kann danach verwendet sein, um eine Subtraktion der beiden Analysenzustände vorzunehmen.
<<Serielle Analyse der Genexpression (SAGE)>>
Dieses Verfahren beruht auf der Wiedererkennung einer mit jeder cDNA assoziierten Signatur unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Oligonucleotid-Adaptern. Dieses Etikett entspricht einem Teil der cDNA-Sequenz (10 Nucleotide lang, um auf diese eindeutige Weise die entsprechende cDNA zu identifizieren). Diese Etiketten werden dann miteinander zusammengefügt, um sequenziert und dann analysiert zu werden (Velculescu und Mitarbeiter, Science, 1995, 270: 484–487). Dieser Ansatz stellt folglich eine Verkürzung gegenüber der systematischen Sequenzierung dar.
<<Nucleinsäure-Arrays>>
Diese Methode beruht auf der Anlagerung von Nucleinsäuren (Oligonucleotide, PCR-Fragmente, cDNAs) auf festen Trägern (Membranen, Glasträger, Gen-Chip) in mehr oder weniger hoher Dichte. Sonden, die von der Messenger-RNA von gesunden oder pathologischen Proben stammen, werden anschließend zur Hybridisierung verwendet, um die Messenger-RNA zu identifizieren, die überexprimiert oder stark überexprimiert oder stark reprimiert sind.
<<Differentielles Display>>
Diese Technik nutzt einen Oligo-dT Primer und Zufallsprimer zur Durchführung von PCR-Reaktionen mit cDNA-Populationen. Die PCR-Produkte werden dann mit Hilfe hoch auflösender Gele verglichen. Die exprimierten Fragmente des differentiellen Typs werden anschließend isoliert und ihr Vorhandensein ist mit Nothern-Blots vor der Sequenzierung bestätigt.
Mehrere Variationen dieser Technologie sind entwickelt worden (Prashar und Weissman, PNAS, 1996, 93: 656–663). Aufgrund der Primer und der Auswahl der Restriktionsenzyme und der eingesetzten Adapter differieren die Variationen. Wie bei der SAGE-Technik richten sie sich an das äußere Ende der 3'-cDNAs. Mehrere Kits sind ebenfalls auf dem Markt erhältlich, um diesen Ansatz zu ermöglichen.
Subtraktionsklonierung
Diese Technik beruht auf der Eliminierung von cDNAs, die in beiden zu vergleichenden Proben vorhanden sind. So werden verschiedene Subtraktionskits, in denen die cDNA ,Tester' mit einem Überschuss an cDNA ,Driver' hybridisiert ist, angeboten (Clontech). Das Endprodukt wird aus einem Pool von Fragmenten gebildet, die mittels PCR amplifiziert sind, und stammt von cDNAs ab, die differentiell exprimiert werden, und das in einen geeigneten Vektor zur weiteren Analyse kloniert werden kann. Die RDA-Technik (Representational Difference Analysis) beruht ebenfalls auf diesem Subtraktionsprinzip (Lisitsyn und Mitarbeiter, Science, 1993, 259: 946–951).
Die Anwendung dieser differentiellen Analysetechniken erlaubt folglich die Bildung von Klonen und quantitativen Banken, nämlich Zusammenfassungen der gesamten Sequenzen, deren Expression bei zellulären Deregulationserscheinungen, die bei Krankheiten beteiligt sind, erhöht oder vermindert ist.
Herstellung und Verwendung von differentiellen qualitativen Banken
In einer anderen Anwendungsform verwendet man in der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise eine differentielle qualitative Bank, nämlich eine Bank, umfassend Nucleinsäure-Klone, deren eine Teil wenigstens der Sequenz der differentiell gespleißten Gene von Zellen entspricht, die einem pathologischen Zustand oder einem Kontrollzustand entsprechen. Dieser Banken-Typ fasst folglich die bei pathologischen Deregulationsvorgängen verschiedenartig gespleißten Sequenzen zusammen.
Die Verwendung dieses Banken-Typs ist besonders vorteilhaft. Denn die unterschiedlichen Signalübertragungen, die bei zahlreichen Krankheiten wie beispielsweise Krebs und neurodegenerative Krankheiten gestört sind, beziehen Gene und folglich mRNA mit ein, deren Expression durch alternative Spleißung reguliert ist. Darüber hinaus zeigt eine größer werdende Anzahl aus der Literatur entnommener Beispiele, dass RNA-Formen, die spezifisch bei Krankheiten beobachtet werden, das Ergebnis einer Störung der Spleißung sind. In Verbindung mit den Neuerungen der Erfindung muss man unterstreichen, dass ebenso der Aktivierungszustand verschiedener Zelltypen, die an der Immunantwort beteiligt sind, von Signalkaskaden reguliert ist, wo die Beteiligten durch Spleißen reguliert sind.
Die Alzheimer Demenz, die Huntington Krankheit, die Parkinson Krankheit sind ebenfalls Beispiele für Krankheiten mit einer erheblichen wirtschaftlichen Auswirkung und weisen eine neurodegenerative Komponente auf. Selbst wenn die Beschreibung der klinischen Symptome und die Identifizierung einiger suszeptibler Gene erlaubt haben, entscheidende Kenntnisse über diese Krankheiten zu gewinnen, sind die molekularen Grundlagen, die die Entwicklung dieser Krankheiten unterstützen, noch immer sehr rätselhaft. Die Aufklärung der Signalkaskaden, die bei diesen Krankheiten dereguliert sind, führt zweifellos zur Entdeckung günstiger Angriffspunkte für diagnostische und therapeutische Eingriffe. Die Literatur unterstreicht die Bedeutung von Störungen bei Spleißvorgängen der RNA.

– Die spinale Amyotrophie ist eine der häufigsten genetischen Erkrankungen. Zwei Gene, SMN1 und SMN2, codieren identische Proteine, der Verlust beider SMN1 Allele und eine Störung der Spleißung des SMN2 Gens tragen zur Entwicklung der Erkrankung bei (Lorson und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 6307–6311).
– In Biopsien von Patienten mit Alzheimer Demenz sind spezifische Störungen der Spleißung des Presinillin-Gens PS1 festgestellt worden (Isoe-Wada und Mitarbeiter, Eur. J. Neurol., 1999: 163–167).
– Der Glutamat-Carrier ist von größter Bedeutung bei neurodegenerativen Krankheiten wie beispielsweise die amyotrophe Lateralsklerose oder Epilepsie. Störungen der Spleißung dieses Carriers beeinflussen seine Funktionsfähigkeit (Meyer und Mitarbeiter, Neurosci. Lett., 1998, 241: 68–70).

Zahlreiche Beispiele für eine Inaktivierung der anti-onkogenen Aktivität, die aus alternativen Spleißungen der entsprechenen mRNA resultieren, sind heute bekannt:

– Beim kleinzelligen Lungencarcinom ist das Gen des Proteins p130, das zur RB-Familie (Retinoblastom-Protein) gehört, auf Ebene der Konsensus-Spleiß-Stelle mutiert. Die Folge dieser Mutation ist die Eliminierung des Exons 2, was eine ausbleibende Synthese des Proteins aufgrund des Vorhandenseins eines zu frühen Stop-Codons zur Folge hat. Es ist die erste Beobachtung gewesen, die die Bedeutung der RB-Familienmitglieder in der Tumorgenese unterstrich.
– Bei Krebsarten des Schädels oder Halses ist eine Mutation in der Konsensus-Spleiß-Stelle bei der Inaktivierung von p53 beteiligt.
– Bei anderen Lungenkrebsarten ist das Gen des Proteins p16/tNK4A, ein Protein, das die Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 hemmt, auf Ebene einer Spleiß-Donorstelle mutiert. Das Resultat dieser Mutation ein verstümmeltes Protein mit einer verkürzten Halbwertzeit. Nun das p16 Protein ist normalerweise mit CDK4 und CDK6 assoziiert, was ihre Assoziierung an Typ D Cycline und die Phosphorylierung insbesonders von RB verhindert, hat dies die Anhäufung von aktiven hypophosphorylierten Formen von RB zur Folge. Bei Abwesenheit von p16 ist RB durch Phosphorylierung inaktiviert. Es ist anzumerken, dass der p16 Locus besonders komplex ist und dass außerdem die Expression von p16 die von p19 durch alternative Spleißung erlaubt. Das p19 Protein, das keine Aminosäure mit dem p16 Protein gemeinsam hat, kann an das proto-onkogene MDM2 assoziieren und den Zellcyclus bei Vorhandensein von p53 blockieren, und eine <<Tumorsuppressor>>-Funktion ausüben.
– WT1, ein Anti-Onkogen, das einen transkriptionellen Repressor codiert, dessen Störungen die Ursache für Wilms Tumore sind, ist in mehreren messenger-RNAs transkribiert, die durch alternative Spleißungen entstanden sind. Bei Brustkrebs sind die relativen Verhältnisse verschiedener Varianten verglichen mit gesundem Gewebe modifiziert, was diagnostische Mittel und Wege für das Verständnis der Bedeutung verschiedener funktioneller Domänen von WT1 in der Tumorprogression liefert.
– Die gleiche Modifikationserscheinung bezüglich verschiedener Formen von messenger RNA und Proteinisoformen ist für das Neurofibrin NF1 bei den Neurofibromen wiedergefunden.
– Dieses Wissen über die Modulation von Spleißungserscheinungen, die die Tumor-Progression kennzeichnen, wird ebenfalls vom Beispiel HDM2 gestützt. Fünf alternative Spleißungen von HDM2 sind nämlich in Ovarial- und Pankreascarcinomen nachgewiesen worden und, was besonders interessant ist, ihre Expression verstärkt entsprechend die Tumorprogression.
– Das LTBP, ein Bestandteil der extrazellulären Matrix verschiedener Gewebe, das in die Sekretion und Speicherung von TGF-β eingreift, wird auch in verschiedenen Isoformen produziert. Eine davon, wahrscheinlich weniger Proteolyse-empfindlich, scheint die biologische Aktivität von TGF-β zu modulieren und könnte an verschiedenen physiopathologischen Zuständen der Leber beteiligt sein.

Die humoralen und zellulären Immunantworten stehen unter der Kontrolle der Transkription. Die Literatur liefert zahlreiche Beispiele für native Isoforme, die durch an diesen Immunantworten beteiligte alternative Spleißungen gebildet sind.

– die <<Müllabfuhr>> Rezeptoren von Makrophagen sind membranständige Glycoproteine, die für physiologische und pathologische Antworten dieser Blutzellen wesentlich sind und ihre Funktionen sind von Isoformen reguliert, die durch Spleißung erzeugt sind (Gough und Mitarbeiter, J. Lipid. Res.; 1998; 39: 531–543).
– Die Aktivierung von T-Lymphocyten erfordert die funktionale Anwesenheit mehrerer Rezeptoren und regulatorischer Proteine. Boriello und Mitarbeiter (J. Immunol. 1995; 155: 5490–5497) haben von der Anwesenheit von Isoformen des B7 Aktivierungscofaktors berichtet, als Folge der alternativen Spleißung dieses Gens, was ebenso die große Anpassungsfähigkeit der Immunantwort unterstreicht, die von den Spleißungsvarianten erbracht wird.

Tröster et al. (J. Exp. Med. 180 (1994) 2059) berichtet zudem die Identifizierung einer Spleißform des La/SS-B Gens, ohne einen Bezug auf eine Krankheit herzustellen.
Um diese Phänomene und diese Komplexität zu berücksichtigen und auch für einen Krankheitszustand spezifische und in Blutzellen vorliegende Signaturen zu isolieren, verwendet das Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise als genetische Marker charakteristische Spleißereignisse für Deregulationssituationen.
Um dies zu bewerkstelligen, verwendet die vorliegende Erfindung zum Beispiel differentielle qualitative Nucleinsäure-Banken, die gemäß der <<DATAS>> Methodologie, die in der internationalen Patentanmeldung WO 99/46403 beschrieben ist, hergestellt sind. Insbesondere können derartige Banken hergestellt sein durch Hybridisierung von einer Population Nucleinsäuren, die von in einer pathologischen Situation aus dem Blutkreislauf isolierten Zellen stammen, und der Population Nucleinsäuren, die von zirkulierenden Zellen in der Kontrollsituation stammen, und Isolieren, aus den gebildeten Hybriden, der Nucleinsäuren, die differentiellen Spleißungen entsprechen.
In diesem Ansatz erfolgt die Hybridisierung bevorzugt in flüssigen Phase. Außerdem kann die Hybridisierung in jeder geeigneten Vorrichtung durchgeführt sein, wie beispielsweise Röhrchen (zum Beispiel Eppendorf), Platten oder jeden anderen geeigneten Träger, der üblicherweise in der Molekularbiologie Verwendung findet. Die Hybridisierung erfolgt vorteilhafterweise in Volumina zwischen 10 und 1000 μl zum Beispiel zwischen 10 und 500 μl. Es ist zu verstehen, dass die verwendete Vorrichtung und die verwendeten Volumina ohne weiteres vom Fachmann angepasst sein können. Die für die Hybridisierung eingesetzten Mengen an Nucleinsäuren sind ebenfalls dem Fachmann bekannt. Im Allgemeinen sind Mikrogramm-Mengen für Nucleinsäuren hinreichend, zum Beispiel im Größenbereich von 0,1 bis 100 μg. Zudem ist es möglich, die Nucleinsäuren in einem Verhältnis von Driver/Tester, variierend von 50 bis ungefähr 0,02, vorzugsweise von 40 bis 1, einzusetzen. Noch vorteilhafter ist es, ein Verhältnis von nahe oder größer 1, vorteilhafterweise zwischen etwa 1 und etwa 10, zu bevorzugen. Es ist sehr wohl zu verstehen, dass das Verhältnis vom Fachmann entsprechend den Verfahrensbedingungen (zur Verfügung stehende Mengen an Nucleinsäuren, physiologische Situationen, verfolgte Absicht) angepasst sein kann. Die anderen Parameter der Hybridisierung (Zeit, Temperatur, Ionenstärke) werden ebenfalls vom Fachmann angepasst. Im großen und ganzen erfolgt die Hybridisierung nach Denaturierung von „Tester" und „Driver" (zum Beispiel durch Hitze) innerhalb von etwa 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37°C (eventuell Temperaturerhöhungen unterworfen) und unter Standardbedingungen der Ionenstärke (kann beispielsweise zwischen 0,1 bis 5 M NaCl variieren). Es ist bekannt, dass die Ionenstärke einer der entscheidenden Faktoren für die Stringenz einer Hybridisierung ist, insbesonder im Falle einer Hybridisierung auf einem festen Träger.
Gemäß einer bestimmten Anwendungsform der Erfindung ist die Hybridisierung in einer Phenol-Emulsion durchgeführt, zum Beispiel gemäß der PERT-Technik („Phenol-Emulsion DNA-Reassoziierungstechnik), die von Kohne et al. (Biochemistry, Vol. 16, Nr. 24, Seiten 5329–5341) beschrieben ist. Vorteilhafterweise ist die Hybridisierung in Phenol-Emulsion mit Hilfe von Thermocyclen (Temperaturerhöhungen von etwa 37°C auf etwa 60/65°C) und nicht durch Rühren, gemäß der von Miller und Riblet beschriebenen Technik (NAR 23 (1995) 2339) durchgeführt.
Jede andere Hybridisierungstechnik in Flüssigphase, vorzugsweise in Emulsion, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt sein. Überdies kann die Hybridisierung ebenfalls mit einem auf einem Träger immobilisierten Partner erfolgen. Vorteilhafterweise ist der Driver immobilisiert. Dies kann besonders durch biotinylierte Primer oder durch jedes andere dem Fachmann bekannte Immobilisierungsverfahren erfolgen.
Aus den durch Hybridisierung erzeugten Populationen an Nucleinsäuren können die genetischen Marker der Erfindung (die Klone, die für qualitative genomische Störungen charakteristisch sind) mit beliebigen, dem Fachmann bekannten Techniken identifiziert werden. Im Falle von heteroduplex RNA/DNA, zeigen sich diese Bereiche im Wesentlichen in Form von nicht gepaarten RNA-Bereichen (RNA-Schlaufen) und können durch Trennung von Heteroduplex und von einzelsträngigen Nucleinsäuren (überschüssige Nucleinsäure, die nicht reagiert hat), selektiven Verdau von doppelsträngiger RNA (Domänen, die am Heteroduplex beteiligt sind), dann Trennung von resultierender einzelsträngiger RNA und von einzelsträngiger DNA identifiziert und kloniert werden. Im Fall von Heterotriplex zeigen sich diese differentiellen Spleißbereiche im Wesentlichen in Form von doppelsträngigen DNA-Bereichen und können durch Behandlung in Gegenwart geeigneter Enzyme, wie ein Enzym, das den Verdau der RNA erlaubt, und dann ein Enzym, das den Verdau der einzelsträngigen DNA erlaubt, identifiziert und kloniert werden. Die so erhaltenen Nucleinsäuren werden direkt in Form von doppelsträngiger DNA erhalten und können in jeden geeigneten Vektor inseriert werden.
Es ist zu verstehen, dass weitere Variationen und genaue Bedingungen für die Isolierung von Nucleinsäuren, die Hybridisierungen und Gewinnung qualitativer Klone in der Anmeldung WO 99/46043 angegeben sind.
Diese Verfahren erlauben die Bildung von Nucleinsäure-Klone und Banken, die den qualitativen genetischen Markern entsprechen, die eine Unterscheidung von Blutzellen eines gesunden Zustands von Zellen eines pathologischen Zustands erlauben. Wie im Beispielteil angegeben ist, stellen diese Nucleinsäure-Präparate besonders zweckdienliche Marker für eine Diagnose aus entnommenem Blut für neurodegenerative Krankheiten und Krebsarten dar.
Diversität der Banken
Die zuvor beschriebenen Methoden erlauben folglich die Erzeugung von Gruppen von Nucleinsäure-Klonen, die für Unterschiede zwischen gesunden und pathologischen Situationen charakteristisch sind. Jede Präparationstechnik erzeugt zahlreiche Klone, die Banken bilden. Diese Banken können wie diese eingesetzt, auf Trägern angebracht oder durch Zufügen oder Wegnehmen von Klonen, Zusammenfassung verschiedener Banken, Zufügen von Kontroll-Klone, etc. modifiziert sein.
Die Banken der Erfindung können zum Beispiel 10 bis 50000 Klone, genereller 10 bis 10000 Klone, noch bevorzugter 50 bis 5000 Klone umfassen. Die Klone sind im Allgemeinen in geordneter Weise auf einem oder mehreren Trägern angebracht, um so die Analyse der Hybridisierungsergebnisse zu erleichtern. Der Träger kann aus Glas, Nylon, Kunststoff, Fasern etc., im Grunde jeder feste Träger sein, der für die Präsentation von Nucleinsäuren geeignet ist.
Die Anlagerung von Banken auf den Trägern kann mit herkömmlichen dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt sein und zum Beispiel in der Internationalen Patentanmeldung WO 99/46403 beschrieben sind.
Die verwendeten Banken können gleichzeitig Nucleinsäure-Klone, die Genen entsprechen, deren Expressionsniveau modifiziert ist (quantitative Genmarker), und Nucleinsäure-Klone umfassen, deren eine Teil wenigstens der Sequenz von Exons und Introns entspricht, die im gesunden Zustand und im pathologischen Zustand verschiedenartig gespleißt sind (qualitative Genmarker). So können die Genmarker nach verschiedenen Ansätzen erzeugt und dann gemischt werden, um eine Antwort so prädiktiv wie möglich zu erhalten. Es ist gleichfalls möglich Marker der Genexpression, die spezifisch in Zellen des Blutkreislaufes bei verschiedenen Krankheiten exprimiert sind, innerhalb der gleichen Bank auf einem gleichen Träger zu vereinigen. Die Hybridisierung einer derartigen Bank erlaubt folglich ein Verfolgen der Entwicklung mehrerer Krankheiten aus derselben Blutprobe.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung beruht folglich ebenfalls auf einem Nucleinsäure-Präparat, das qualitative und quantitative Genmarker umfasst, die für zelluläre Deregulationen in Zellen des Blutkreislaufes und für Krankheiten symptomatisch sind. Ein besonderer Gegenstand der Erfindung beruht auf einer Bank, die für verschiedene Deregulationssituationen charakteristische Genmarker umfasst. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist jeder feste Träger, auf dem wenigstens zwei Nucleinsäure-Banken angebracht worden sind, die für beide Krankheitsituationen charakteristisch sind. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung noch ein Verfahren zur Präparation eines DNA-Chips, der für Diagnose von Krankheiten zweckdienlich ist, umfassend die Anlagerung auf einem festen Träger eines oder mehrerer Nucleinsäure-Präparate, die für Deregulationssituationen charakteristisch sind.
Zudem kann man gemäß einer bevorzugten Anwendungsform Nucleinsäure-Banken einsetzen, die durch Selektion der Klone je nach Verwendung entsprechend ihrer Implikation an verschiedenen Krankheiten oder verschiedenen Stadien derselben Krankheit gereinigt sind. Die Ausgangsbanken können nämlich zum Beispiel die gesamten Klone umfassen, die für genetische Ereignisse als Folge einer Etablierung einer Krankheit entstandenen Krankheitssituation charakteristisch sind. Dann erlaubt die Anwendung des Diagnoseverfahrens der Erfindung die Beobachtung, dass bestimmte Klone mit Sonden hybridisieren, die von bestimmten und intermediären Stadien der Krankheitsentwicklung stammen. Diese Klone können folglich als Anzeiger von Frühstadien identifiziert werden und können ein sehr wirkungsvolles diagnostisches Werkzeug liefern, das in der Lage ist, jedem anderen Kriterium der klinischen Prüfung, jedem anderen diagnostischen Mittel vorzugreifen.
Auf ganz spezifische Weise beschreibt die vorliegende Erfindung die derzeitige Identifizierung und Charakterisierung derartiger Klone, die als Genmarker für das Vorliegen und der Entwicklung von Krankheiten einsetzbar sind. Eine der Hauptanwendungen der Identifizierung und Klonierung dieser Genmarker betrifft die Abschätzung des Hybridisierungspotenzials von RNA-Extrakten aus Blutzellen eines gegebenen Individuums. Diese Abschätzung kann durch Hybridisierung einer Sonde, die Messenger-RNA von Zellen diesen Individuums aufweist, mit einer oder mehreren Banken an Signaturen, die für Krankheitssituationen, wie zuvor beschriebenen, charakteristisch sind. Diese Anwendung ist nachfolgend detaillierter beschrieben.
Verfahren zur Analyse und Diagnose von pathologischen Signaturen
Die Erfindung erlaubt das Vorliegen von spezifischen Signaturen für verschiedene Krankheitsstadien durch Hybridisierung einer Probe Nucleinsäuren von Zellen aus dem Blutkreislauf mit oben definierten Genmarkern zu bestimmen, wobei das beobachtete Hybridisierungsmuster auf die physiopathologischen Deregulationen des Organismus hinweist, von dem die Blutprobe stammt. Für diesen Zweck sind die eingesetzten Genmarker in Form von Banken zusammengefasst, um eine Antwort so prädiktiv wie möglich zu liefern. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung beruht ebenfalls auf der beträchtlichen Anzahl an verwendeten Markern, die die generierte Information viel prädiktiver macht. Der prädiktive Charakter der Information ist außerdem durch die Natur der verwendeten und präparierten Marker gestützt.
Ein besonderer Gegenstand der Erfindung beruht auf einem Analyseverfahren des Blutzellstatus, umfassend wenigstens einen Hybridisierungsschritt von a) einer Nucleinsäure-Probe von Blutzellen und b) einer Bank an Nucleinsäuren, die für Deregulationssituationen von zellulären Signalübertragungen charakteristischen genetischen Ereignissen entsprechen, wobei das Hybridisierungsmuster auf die physiopathologischen Deregulationen des Organismus hinweist.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus dem nachfolgenden experimentellen Teil ersichtlich, der als Erläuterung und nicht als Beschränkung zu verstehen ist.
EXPERIMENTELLER TEIL
Beispiel für neurodegenerative Krankheiten: ALS
Die Tiermodelle ermöglichen die Gewinnung biologischer Proben, die die Analyse verschiedener Entwicklungsstadien einer Krankheit und den Vergleich dieser Stadien mit gesunden Kontrollen ermöglichen.
Die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Krankheit, die mit verschiedenen Einschluss-Typen wie Lewis Körperchen verbunden ist und durch eine Apoptose der spinalen und cortikalen motorischen Neurone gekennzeichnet ist und deren tödlicher Ausgang manchmal mit einer Frontalhirn-Demenz verbunden ist. Sporadische Formen, ohne jegliche beschriebene Mutation, gibt es zusammen mit familiären Formen (FALS), die mit Mutationen im SOD1-Gen, das die Superoxid-Dismutase codiert, verbunden sind. Transgene Mäuse, die das menschliche SOD1-Gen exprimieren, das eine der Mutationen trägt, das die FALS auslöst (G93A-Mutation), sind beim Jackson Laboratory erhältlich, unter Bedingungen einer Nutzungslizenz von der NorthWestern University. Das Auftreten von ALS-Symptomen, verbunden mit der G9A3-Mutation in SOD1, ist nicht die Folge einer Aktivitätsverminderung der Superoxid-Dismutase, sondern einer Funktionssteigerung, die die Fähigkeit des Enzyms verstärkt, freie Radikale zu erzeugen. Dieses Modell reproduziert in 120 Tagen den tödlichen Ausgang der Krankheit mit Symptomen, die mit denjenigen der Humankrankheit vergleichbar sind. Dieses Modell ermöglicht die Gewinnung von Proben von Gehirn, Rückenmark und peripherem Blut.
Identifizierung von Spleißformen, die für das ALS-Modell spezifisch sind:
Das Unternehmen ExonHit Therapeutics entwickelt einen neuen Ansatz zur qualitativen differentiellen Durchmusterung basierend auf der DATAS(Differential Analysis of Transcripts Alternatively Spliced)-Technologie. Diese Technologie ist Gegenstand einer Patentanmeldung in Europa und den USA. Die mit DATAS identifizierten Sequenzen können von alternativen Exons oder von verbliebenen Introns in einer der beiden verglichenen physiopathologischen Situationen stammen. Die erhaltenen Daten kennzeichnen folglich Modifikationen der Expression von RNA-Sequenzen, die die funktionellen Domänen von Proteinen beeinflussen. Die differentielle qualitative Analyse wird mit transgenen Tierproben und syngenen Kontrollen im Alter von 60 bis 100 Tagen durchgeführt. 60 Tage entsprechen einem Stadium, das etwas vor den ersten Symptomen liegt, aber schon auf cerebraler Ebene durch Veränderungen der Zellphysiologie, insbesondere durch eine Störung des mitochondrialen Stoffwechsels, gekennzeichnet ist. Nach 100 Tagen sind 50% der corticalen und spinalen motorischen Neuronen abgestorben und ein aktiver neuronaler Apoptose-Prozess ist parallel mit einer Aktivierung von Astrocyten verbunden.
Die differentielle qualitative Analyse wird folglich durchgeführt:

– aus RNA-Extrakten von Proben aus Gehirn und Rückenmark ohne vorherige Isolierung von Neuronen, damit ein Maximum an alternativen Spleißereignissen, die mit der Entwicklung der Krankheit verbunden sind berücksichtigt werden.
– aus peripherem Gesamtblut oder Blutzellfraktionen

Die mit DATAS identifizierten Sequenzen entsprechen Introns und/oder Exons, deren unterschiedliche Expression durch Spleißung bei pathologischen Zuständen und gesundem Zustand mittels PCR bewertet wird.
Der Vergleich dieser Sequenzen mit Datenbanken erlaubt die Klassifizierung der erhaltenen Informationen und eine begründete Auswahl der beiden Sequenzen vorzuschlagen, deren Untersuchung weitergeführt werden soll.
Spätere Charakterisierung von erhaltenen Sequenzen:
Die mittels PCR bewerteten Sequenzen können in komplementären Modellen gesucht werden, die an neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind. So können RNAs, die von einem cerebralen Ischämie-Modell stammt, oder RNAs von einem Tiermodell mit einer Prionenkrankheit zweckdienlich untersucht werden, um selektive Expression von ALS-Markern oder allgemeiner von Markern neurodegenerativer Krankheiten zu bewerten. Die Expression von identifizierten Spleißformen wird in repräsentativen Humanproben von verschiedenen Krankheiten mit neurodegenerativen Komponenten gesucht:

– Blutproben von Patienten, die an neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer Krankheit oder Parkinson etc. leiden.

Beispiel für Krebs: Krebs der Luftwege und des oberen Verdauungstraktes
Die Übertragung von Transgenen ist Gegenstand zahlreicher experimenteller Anwendungen auf dem Gebiet der experimentellen Krebsforschung. So verwendet man die dominanten Allele bestimmter kanzerogener Gene, um transgene Mäuse als Versuchsmodelle für die Krebsforschung zu erhalten.
Die Krebsarten bilden eine heterogene Gruppe von Krankheiten, wo jede durch einen ganzen Komplex genetischer Störungen gekennzeichnet ist, was eine unkontrollierte Zellproliferation und die Verbreitung von Metastasen zur Folge hat. Wenn die Identifizierung von genetischen Störungen, die das Auftreten und die Progression von Krebsarten hervorrufen, für Diagnose und Verfolgung der Tumor-Entwicklung heute wichtig erscheint, so wäre es die Aussicht, neue und noch frühere Diagnosen auf Basis dieses Wissens zu entwickeln, was der Bedeutung dieser Forschungsanstrengungen für die pharmazeutische Industrie Rechnung trägt. Es gibt zahlreiche Gene, deren Störungen einer Zelle Krebseigenschaften verleihen können. Diese Gene spielen wichtige Rollen nicht nur im Verlauf der Entwicklung, sondern auch über die gesamte Lebensdauer der Zelle. Sie greifen sogar ein, um essentielle Funktionen wie auch die Proliferation, die Differenzierung, die DNA-Reparatur oder das Überleben der Zelle sicherzustellen. Diejenigen Gene, deren Störungen zur Produktion von Proteinen führen, die den Zellcyclus abnorm aktivieren, werden als Onkogene bezeichnet. Man findet zum Beispiel in dieser Kategorie die zellulären Gene myc und ras. Die Anti-Onkogene haben im Gegenteil den Zellcyclus für eine normale Funktion zu bremsen. Die Hemmung ihrer Aktivität bringt die Zelle in Abhängigkeit von Genen mit Proliferationswirkung und fördert folglich die Tumor-Entwicklung. In dieser Kategorie findet man das RB (Retinoblastom) und das p53 Gen. Neben Onkogenen und Anti-Onkogenen erscheinen die Gene, die den programmierten Zelltod oder Apoptose modulieren, als wichtige Akteure der Kanzerogenität. Vergleichbar einem physiologischen Zelldifferenzierungsprozess ist der programmierbare Zelltod genetisch gesteuert. Die Tatsache, dass eine Zelle die Fähigkeit verloren hatte, diese terminale Differenzierung einzuschalten, die ihre Elimination erlaubt, versetzt sie nämlich in die Lage, anormal weiter zu überleben, und kann die Entstehung eines transformierten Zellklons erleichtern. Dies kann man bei humanen follikulären Lymphomen beobachten, wo das bcl-2 Gen aufgrund der unvermutet ereigneten Translokation zwischen den Chromosomen 14 und 18 überexprimiert ist. Diese Überexpression eines Gens für Anti-Apoptose-Aktivität erleichtert das lange anormale Weiterleben von Zellpopulation, innerhalb derer sich transformante Mutationen anhäufen können. Der programmierte Zelltod oder Apoptose ist heute als ein essentieller Mechanismus zur Elimination von unerwünschten Zellen erkannt, bei denen es sich um Virus infizierte Zellen wie um Zellen handelt, die funktionsunfähig machende oder anormal proliferierend machende Mutationen angehäuft haben. Das Niveau der Komplexizität, das die zelluläre Homöostase regelt, resultiert nicht nur in eine Anzahl wichtiger beteiligter Akteure, sondern auch zu verschiedenen Rollen, die jeder von ihnen alternativ als Funktion des Zelltyps oder der Bedingungen spielen kann. Das Anti-Onkogen p53 oder das Proto-Onkogen cMyc können zum Beispiel auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Apoptose spielen. Eine derartige Komplexität macht die Anwendung hinreichend umfassender Ansätze erforderlich, um die Expressionsmodulationen der gesamten Gene und hinreichend spezifisch zu analysieren, um schnellst möglich die erheblichsten Störungen zu identifizieren, der Tumorentwicklung zu folgen oder neue therapeutische Angriffspunkte zu identifizieren.
Durch Verwendung verschiedener Adressierungssysteme (Promotorregionen) ist es möglich, eine Art bevorzugte Expression des Transgens in einem bestimmten Gewebe zu erhalten. Man kann also Tumormodelle schaffen, die sich in einer bestimmten Gewebe-Umgebung entwickeln. Diese verschiedenen Modelle von anvisierten Tumoren lassen die Möglichkeit der Detektion spezifischer Signaturen auf Ebene von Zellen des Blutkreislaufs bei der Lokalisierung des Tumors erahnen.
Tumormodell der Leber
Bei der Maus gibt es ein Hepatocarcinom-Modell (HCC), das mit der eingeschränkten Expression von frühen Sequenzen des SV40 Virus in der Leber verbunden ist, die für groß T und klein t Antigene codieren (Dubois, N., Bennoun, M., Allemand, I., Molina, T., Grimber, G., Daudet-Monsac, M., Abelanet, R. und Briand, P. (1991) Time course developpement of differentiated hepatocarcinoma and lung metastasis in transgenic mice. J. Hepatol., 13, 227–239). Das Transgen steht unter der Kontrolle des Promotors des humanen Gens von Antithrombin III; dies hat eine frühe und konstante Expression von viralen Antigenen zur Folge. Aus diesem Grund unterliegt die Proliferation der Hepatocyten einer raschen Störung. Die Proliferationsrate der transgenen Hepatocyten ist proportional höher als die normale Proliferation während der Leberentwicklung (von der Geburt bis zur fünften Woche), dann empfindlich vermindert, ohne deswegen die geringe Rate zu erlangen, die für den Ruhezustand einer normalen Leber charakteristisch ist. Diese transgenen Mäuse entwickeln auf systematische Weise verschiedene HCC, die zum Tod aller Tiere vor dem siebten Monaten führen. Trotz einer frühen Deregulation der Hepatocytenproliferation zeigte sich die Hepatomegalie nur spät. Die Untersuchung der Präneoplasie-Phase vor Auftreten der HCC hat erlaubt, einen ausgleichenden Mechanismus durch Apoptose zu zeigen, wobei eine normale Lebergröße in diesem Modell beibehalten wird (Allemand et al., 1995). Es ist wichtig anzumerken, dass diese Apoptose zum selben Zeitpunkt stoppt, wo die normale Leber in einen Ruhezustand tritt. Von diesem Punkt aus scheint es, dass die Leber-Homöostase nicht mehr kontrolliert ist. Eine systematische Untersuchung über die Empfindlichkeit der Apoptose hat ergeben, dass die von diesem transgenen Modell stammenden Hepatocyten eine Eigenschaft erworben hatten, die dem vom CD95/Fas System abhängigen Zelltod widersteht (Rouquet N., Allemand I., Molina T., Bennoun M., Briand P. und Joulin V. (1995) Fas-dependent apoptosis is impaired by SV40 T-antigen in transgenic liver, Oncogene, 11, 1061–1067 (Rouquet N., Allemand I., Grimber G., Molina T., Briand P. und Joulin V. (1996) Protection of hepatocytes from Fas-mediated apoptosis by a non-transforming SV40 T-antigen mutant cell Death & Diff., 3, 91–96) durch einen von einer alternativen Spleißung unabhängigen Mechanismus des CD95/Fas-Rezeptors. Doch nur eine umfassende Analyse der Spleißmodifikationen kann eine Störung dieses Prozesses für die gesamten molekularen Partner, die in die Signalübertragung des CD95/Fas-Rezeptors eingreifen, anzeigen.
Dieses transgene Modell stellt ein ideales Mittel dar für die Identifizierung 1) von den Modifikationen der Genexpression, die den Übergang von der Präneoplasie zur Neoplasie begleiten, was unentbehrliche Gene für eine Transformation (Onkogene) oder Gene sind, die eine Tumorentwicklung hemmen (Apoptose-Gene) 2) von zirkulierenden Signaturen der Krebsentwicklung, die mit Ausstreuen von Tumorzellen aus dem Tumor verbunden sind 3) von Ereignissen der Störung der Genexpression in den Blutzellen, die für eine Krebsentwicklung charakteristisch sind.
Identifizierung spezifischer Signaturen
Der qualitative differentielle Ansatz erfolgt über RNA-Extrakte der Leber und Blutzellen von normalen Mäusen und von Mäusen, die Hepatocarcinome (HCC) entwickeln, die mit der Expression von T-Antigen von SV40 unter Kontrolle des Antithrombin III Promotors verbunden sind. Die Kontrolltiere und die das Transgen exprimierenden Tiere sind in unterschiedlichen Altersstufen ausgewählt, was einen Zugang für sehr frühe, präneoplastische und neoplastische Stadien erlaubt, die besonders in diesem Modell durch eine Aktivierung nach einer Inaktivierung der für eine Leber-Homöostase erforderlichen Apoptose gekennzeichnet ist.
Verwendung der identifizierten Sequenzen
Die Modulationen der Expression dieser Sequenzen kann später in Biopsien der humanen Tumore gesucht werden, um damit das Anwendungsgebiet in der Humantherapie und Diagnose zu erweitern.
Diese cDNAs werden verwendet, um die Tumorentwicklung in diesem transgenen Modell und in einer Reihe muriner HCC-Modelle, die mittels Gentransfers hergestellt sind (Bennoun M, Grimber G, Couton D, Seye A, Molina T, Briand P und Joulin V. (1998) The amino-terminal region of SV40 large T-antigen is sufficient to induce hepatic tumors in mice Oncogene, 17, in Druck), zu verfolgen. Sogar bei Verwendung der spezifischen cDNAs, die bei verschiedenen sehr frühen Stadien in den Blutzellen detektiert werden, vor dem Auftreten von Tumoren, kann man in einer gemischten Population gesunder und transgener Mäuse vorhersagen, welche davon einen Krebs entwickeln werden.
Nucleotid-Sonden oder PCR-Primer, die sich von diesen Tumor spezifischen cDNAs herleiten, können in Biopsien von Humantumoren zur Untersuchung der Expression von identifizierten Spleißformen und/oder der RNA, deren Menge in diesem Modell verändert ist, verwendet werden.
Gleichfalls können die im Blut von Tieren zu verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung identifizierten Sonden ebenfalls verwendet sein, um damit gemeinsame Signaturen in Blutproben von Patienten mit Krebs zu detektieren.
In einer Strategie, wo cDNA-Banken, die gemäß den weiter oben beschriebenen Verfahren der Erfindung erhalten werden, kann eine entsprechende Sonde, die aus Blutproben von Patienten mit Krebs präpariert ist, ebenfalls für die Suche nach gemeinsamen Signaturen in verschiedenen Banken eingesetzt sein, die einerseits von murinen Modellen zu verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung und andererseits aus Biopsien von verschiedenen humanen Tumorarten erhalten sind. Diese Hybridisierungen werden entsprechend dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt (siehe besonders die in der Anmeldung WO 99/46403 beschriebenen Hybridisierungsbedingungen).
ERMITTLUNG DER PRÄDIKTIVEN DIAGNOSE BEIM MENSCHEN
Die in diesem Kapitel beschriebene Methodologie kann gleichwohl bei Anwendung der oben beschriebenen qualitativen und quantitativen Analyse-Techniken angewandt werden. Die Erfindung bevorzugt jedoch die Anwendung und die Ermittlung von Markern, die mit qualitativen Störungen der Genexpression aufgrund der vorhergehend beschriebenen Vorteile verbunden sind.
Die Erfindung beschreibt die Identifizierung und Bildung von Banken an Signaturen aus Biopsien, die für die Entwicklung einer Krankheit charakteristisch sind. Es ist sogar möglich, Banken an cDNA-Sequenzen zu etablieren, die für die Entwicklung und Lokalisierung dieser Krankheiten repräsentativ sind. Es ist folglich aus einer Blutproben möglich, nach der Präsenz von DNA-Signaturen zu suchen, die mit denjenigen in Banken präsentierten identisch sind. Die Präsenz gemeinsamer Signaturen unterstreicht nun die Präsenz von Nucleinsäuren, die die selben Störungen aufweisen wie die in den krankheitsverdächtigen Biopsien, sehr wahrscheinlich von Zellen abstammend, die von krankem Gewebe sind.
Die Anwendung dieser Suche beruht besonders auf der Anfertigung von Sonden aus Blutzellen und die Hybridisierung dieser Sonden mit Filtern, die verschiedene Marker zusammenfassen, die für diese oder jene Krankheit spezifisch sind.
Die Erfindung beschreibt die Möglichkeit der Identifizierung von Störungen der Genexpression aus Blutzellen und dieser aus Versuchsmodellen, die vollständig oder teilweise eine Humankrankheit imitieren (als Beispiel murines ALS-Modell oder Lebertumor-Modell).
Die Verwendung von Nucleinsäure-Sonden, die von Blutzellen von Patienten mit einer anvisierten Krankheit (neurodegenerative Krankheit, Krebs etc.) oder ohne stammen, erlaubt die Suche nach der Existenz gemeinsamer Signaturen mit den experimentellen prädiktiven Banken, die aus pathologischen Versuchsmodellen geschaffen sind. Das Auftreten von gemeinsamer Signaturen schafft eine Diagnose des Risikos der Entwicklung einer derartigen Krankheit bei dem Individuum, das sich einer Diagnose unterzieht.
Die Erfindung erlaubt ebenfalls die folgende Vorgehensweise:

– Mischen von Blutproben von Patienten, die an einer anvisierten oder an keiner Krankheit leiden, um einen RNA-Bestand zu bilden, der für den pathologischen oder gesunden Zustand repräsentativ ist.
– Diese RNAs werden einer differentiellen Analyse gemäß den in der Erfindung beschriebenen Techniken unterzogen und es werden die cDNA-Banken, die für pathologische und gesunde Zustände charakteristisch sind, gebildet.
– Diese cDNA-Banken werden danach durch Hybridisierung mit Hilfe von Sonden bewertet, die aus individuellen Blutproben von Patienten oder gesunden Personen hergestellt sind.
– Die so bewerteten Banken werden danach durch Verwendung von Sonden analysiert, die aus Blutproben einer großen Population an Personen hergestellt sind, die einen Arzt zwecks Routineuntersuchungen konsultieren. Diese Banken bilden ein diagnostisches Mittel, das für die Erfindung charakteristisch ist. Auch einer Patientin, die eine Mammographie zur Brustkrebserkennung durchführen lässt, kann eine kleine Blutprobe entnommen werden. Eine Nucleinsäure-Sonde, die aus einer derartigen Probe hergestellt ist, kann dann eine sehr frühen Suche nach wahrscheinlichen Anzeichen einer Krebsentwicklung selbst ohne Röntgenaufnahme erlauben.

Die Erfindung kann in Form von Gen-Chips angewandt sein. Der Gen-Chip nutzt Eigenschaften der Hybridisierungsreaktion, mit der die beiden komplementären DNA-Stränge sich miteinander in sehr spezifischer Weise verbinden. Die Erfindung kann ebenfalls bei spezifischer Suche nach einem oder mehreren DNA-Marker der Krankheit bei Anwendung eines DNA-Amplifizierungsverfahrens mit Hilfe von Oligonucleotid-Primern, die für die zu suchende DNA spezifisch sind, angewandt sein.

Claims

Verfahren zum indirekten Nachweis des Vorliegens einer Krankheit bei einer Person, umfassend die in vitro Bestimmung des Vorliegens einer Form oder Formen alternativer Spleißungen eines für die Krankheit charakteristischen Gens oder Gene in einer Probe von Blutzellen der Person, wobei die Blutzellen der Probe sich von pathologischen Geweben unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst (i) die Präparation von Nukleinsäuren der Probe und (ii) die Hybridisierung der präparierten Nukleinsäuren mit wenigstens einer Bank von Nukleinsäuren, die für eine Spleißform oder Spleißformen eines Gens oder Gene charakteristisch sind, wobei das Hybridisierungsmuster das Vorliegen der Krankheit anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren der Bank mit einem Verfahren präpariert sind, umfassend (i) die Gewinnung eines ersten Präparates von Nukleinsäuren aus Blutzellen eines die Krankheit aufweisenden Organismus, (ii) die Gewinnung eines Präparates von Referenz-Nukleinsäuren aus Blutzellen eines die besagte Krankheit nicht aufweisenden Organismus, (iii) einen Hybridisierungsschritt zwischen besagtem ersten Präparat und dem Referenz-Präparat und aus den gebildeten Hybriden die Wiedergewinnung der Nukleinsäuren, die differentiellen Spleißungen entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank 50 bis 5000 Nukleinsäuren umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank oder Banken auf einem Träger angelagert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Probe präparierten Nukleinsäuren Gesamt-RNA oder Messenger-RNA oder von diesen abstammende cDNA sind.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren markiert sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutzellen kernhaltige Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die kernhaltigen Blutzellen Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten und/oder dendritische Zellen umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum in vitro Nachweis des Entwicklungsstadiums einer Krankheit bei einer Person.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum in vitro Nachweis der Lokalisation einer Krankheit bei einer Person.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum in vitro Nachweis einer Krankheit, die mit der Alterung verbunden ist oder eine anormale Zellproliferation umfasst.
Kit, das zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche verwendet sein kann, umfassend 50 bis 5000 Nukleinsäure-Klone, die auf einem für das Ausbreiten von Nukleinsäuren geeigneten festen Träger angeordnet sind und Sequenzen umfassen, die für Exons und Introns von Genen spezifisch sind, die zwischen Blutzellen eines Organismus in einer pathologischen Situation und Blutzellen eines Organismus in einer gesunden Situation in differentieller Weise gespleißt sind.