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Die vorliegende Erfindung betrifft
neue Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis pathologischer
Ereignisse. Sie betrifft im besonderen Zusammensetzungen und Verfahren
zum Fernnachweis pathologischer Ereignisse. Die Erfindung betrifft ebenfalls
Mittel, Kits und Zusammensetzungen zur Anwendung derartiger Verfahren
wie auch ihre Anwendungen auf dem Gebiete der Human- oder Veterinärmedizin
oder zum Beispiel in der experimentellen Forschung.
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Mit zunehmendem Alter der Bevölkerung
in den industrialisierten Ländern
entsteht ein neuer Bedarf an diagnostischen Mitteln. Krankheiten
wie beispielsweise Krebs oder neurodegenerative Krankheiten wären zum
Vorteil der Patienten und der Gesellschaft besser zu behandeln,
falls man über
prädiktive Diagnosen
sowohl zum Auftreten als auch zur Entwicklung der Krankheit verfügen könnte.
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Die Erfahrung zeigt, dass je früher die
Diagnose gestellt ist, desto größer die
Chancen für
eine Kontrolle der eventuellen Krankheitsentwicklung sind. Dies
ist eindeutig bei Krebs der Fall. Die Kampagnen zur Früherkennung
von Brustkrebs mit Hilfe der systematischen Mammographie haben die Überlebensraten
bei diesen Krebsarten verbessert. Ebenso kann man abschätzen, dass
ein frühes
Einbeziehen von Patienten, die die Alzheimer Krankheit entwickeln,
die Entwicklung der Krankheit signifikant verzögern würde.
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Diese Krankheiten wie beispielsweise
Krebs und neurodegenerative Krankheiten zeigen eine Inzidenz, die
sich mit dem Alter der Bevölkerung
stark erhöht.
Es ist zu vermuten, dass diese Krankheiten Jahre zum Ausbruch benötigen und
festgestellt werden können.
Daraus ergibt sich zum Beispiel, dass die Anhäufung von sukzessiven Störungen auf
Ebene des menschlichen Genoms erforderlich ist, um zu einer Krebsentstehung
zu führen.
Ebenso unterstreichen genetische Untersuchungen, die bei ausgewählten Populationen
mit einer auffallenden Inzidenz für die Alzheimer Krankheit durchgeführt wurden
und die mit genetischen Versuchen bei Tieren verbunden waren, ebenfalls
den multifaktoriellen Charakter der Entstehung dieser Krankheit.
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Diese mit der Alterung verbundenen
Krankheiten weisen allgemeine Kennzeichen auf, wie beispielsweise:
- – Zellstörungen,
die sich als Folge von Ungleichgewichten der Umgebung von inkriminierten
Geweben ereignen und mit physikalischen, chemischen oder biologischen
Angriffen verbunden sind;
- – der
Beitrag von Zellen des Immunsystems.
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Falls die Störungen von inkriminierten Geweben
nur als Folge von Biopsien bevorzugt festgestellt werden, wäre es möglich, dass
Störungen
der Immunzellen eine sich ausbildende pathologische Entwicklung
widerspiegeln, und die Entwicklungsherde dieser Krankheiten könnten aus
der Ferne detektiert werden, da die meisten Zellen des Immunsystems sich
im Gewebe und Blut oder in Lymphknoten entwickeln.
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Lymphzellen und Makrophagen sind
die Zellen, die hauptsächlich
zelluläre
Immunantworten vermitteln. Lymphocyten und Makrophagen sind in den Geweben
wie auch im Blut vorhanden. Es sind die Zellen, die als erste mit
Fremdgewebe im Organismus in Kontakt kommen. Die Makrophagen bauen
inkriminierte Gewebe und Substanzen ab. Die von den abgebauten Proteinen
freigesetzten Peptide werden anschließend von den Molekülen des
Klasse II Haupthistokompatibilitätskomplexes
gebunden, die sie dann auf der Oberfläche des Makrophagen präsentieren,
wo diese Komplexe von den T-Lymphocyten wiedererkannt werden. Es
gibt weitere Systeme für
die Präsentation
von Peptiden und Aktivierung von Immunantworten, die besonders im
Falle der Krebsentwicklung beschrieben worden sind.
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Heutzutage erfolgen die Diagnosen
dieser Krankheiten, wenn die Krankheit ausgebrochen ist. Was Krebs
anbelangt, wird zum Beispiel die Diagnose ausgehend von einer medizinischen
bildgebenden Darstellung und einer morphologischen Diagnose von
Geweben, die aus Biopsien erhalten sind, gestellt. Für eine Krankheit
wie die Alzheimer Krankheit gibt es ganzes Bündel medizinischer Beobachtungen,
die eine Erstellung einer Diagnose erlauben.
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Es besteht folglich ein wirklicher
Bedarf an einer Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die ein frühes, einfaches
und zuverlässiges
Bestimmen des Auftretens von Krankheiten erlauben, besonders von Krankheiten,
die mit einer Deregulierung von Regulationsmechanismen der zellulären Signalübertragung verbunden
sind, insbesondere von Krankheiten, die durch eine übermäßige Zellproliferation
(Krebs, Nerven-Degeneration, Stenose etc.) gekennzeichnet sind.
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Die Einführung von molekularbiologischen Techniken,
verbunden mit der Bioinformatik, hat die Erstellung von Bibliotheken
(oder Banken) von DNA-Fragmenten erlaubt, die einen gegebenen pathologischen
Zustand kennzeichnen, was die Bestimmung des Vorliegens oder nicht
Vorliegens von Hinweisen auf Krankheiten aus einer sehr kleinen
Probe aus beliebigen Geweben erlaubt.
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Die vorliegende Erfindung beschreibt
einen zurzeit neuen Ansatz zum Nachweis von Krankheiten in vitro.
Im besonderen beschreibt die vorliegende Erfindung neue Verfahren
und Zusammensetzungen zum Nachweis von pathologischen Ereignissen,
besonders von pathologischen genetischen Signaturen. Die Erfindung
beschreibt außerdem
Verfahren und Zusammensetzungen, die zum Fernnachweis von pathologischen
Ereignissen zweckdienlich sind, nämlich über verschiedene biologische
Materialien von pathologischen Geweben. Die Zusammensetzungen und
Verfahren der Erfindung bieten heute Ärzten, Biologen und der Industrie
neue Wege in der in vivo Diagnose, die sich auf direkte, schnelle,
empfindliche und wirtschaftliche und automatisierbare Verfahren
stützt.
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Im besonderen beruht die Erfindung
besonders darauf, dass sie die Möglichkeit
aufzeigt, aus biologischen Proben, umfassend Zellen des Blutkreislaufs,
das Vorliegen oder das Risiko der Entwicklung einer Krankheit zu
bestimmen. Im besonderen beruht die Erfindung darauf, dass sie die
Möglichkeit
aufzeigt, in einer biologischen Probe, umfassend Blutzellen, das
Vorliegen einer Krankheit, einschließlich sehr früher Stadien
des Ausbruchs oder der Entwicklung nachzuweisen, bei denen bereits
vorhandene Diagnosemöglichkeiten
nicht effektiv wären.
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Ein erster Gegenstand der Erfindung
beruht im besonderen auf einem Verfahren zum in vitro Nachweis des
Vorliegens einer Krankheit bei einer Person gemäß den Ansprüchen.
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Bevorzugter umfasst das Verfahren
der Erfindung den Nachweis des Vorliegens von Blutzellen in der
Probe, die für
das Vorliegen der Krankheit charakteristische Störungen der Genexpression aufweisen.
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Ebenso beruht die vorliegende Erfindung
einerseits auf der Verwendung von Blutzellen zur Durchführung eines
Ferntests auf das Vorliegen eines pathologischen Ereignisses und andererseits
auf der Anwendung von genomischen Techniken, die den Nachweis von
Störungen
der Expression (insbesondere der Transkription) des Genoms in den
Zellen erlauben.
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Gemäß einer besonderen Variante
umfasst die vorliegende Erfindung folglich bevorzugter die Bestimmung
des Vorliegens in einer biologischen Probe von Blutzellen, die transkriptionelle
und/oder posttranskriptionelle Störungen der Genexpression aufweisen,
die für
das Vorliegen einer Krankheit charakteristisch sind.
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Die Erfindung zeigt auf, dass es
möglich
ist, eine Krankheit in der Entstehung aus identifizierten genomischen
Signaturen in den Blutzellen nachzuweisen, wobei die in der Entstehung
befindlichen Krankheitsherde in Nervengeweben, wie im Gehirn oder
Rückenmark
(Orte von neurodegenerativen Krankheiten), oder in ganz anderen
Geweben zum Beispiel bei Beginn einer Krebserkrankung (Brust, Lunge,
Prostata, Leber, Knochengewebe etc.) vorliegen können.
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Die Erfindung zeigt in einer unerwarteten Weise,
dass es auf Ebene der Blutzellen (bevorzugt Zellkerne enthaltende
Zellen wie beispielsweise Lymphocyten, Makrophagen, Monocyten, dendritische Zellen
etc.) transkriptionelle oder post-transkriptionelle Störungen der
Genexpression in Folge von (einer) direkten oder indirekten Wechselwirkungen)
mit den Zellen bei der Krankheitsentstehung gibt.
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Im besonderen zeigt die Erfindung
in einer unerwarteten Weise, dass es auf Ebene der Blutzellen (bevorzugt
Zellkerne enthaltende Zellen wie beispielsweise Lymphocyten, Makrophagen,
Monocyten, dendritische Zellen etc.) qualitative Störungen der
Transkription von Genen in Folge von (einer) direkten oder indirekten
Wechselwirkung(en) mit den Zellen bei der Krankheitsentstehung gibt.
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Im besonderen umfasst die verwendete Bank
in einer Anwendungsform der Erfindung außerdem Nucleinsäuren, die
für Gene
spezifisch sind, deren Expressionsniveau in einer Blutzelle, die
aus einem einen Krankheitszustand aufweisenden Organismus stammt,
modifiziert ist Die Erfindung basiert besonders auf einem neuartigen
Verfahren, nämlich der
qualitativen Analyse von Differenzen, die mit dem Vorhandensein
von Insertionen oder Deletionen (alternative Spleißungen)
in für
die Funktion der Genprodukte wesentlichen Bereichen verbunden sind. Diese
Insertionen und Deletionen sind genau reguliert und sind für physiologische
und pathophysiologische Zustände
(besonders proliferierende und differenzierte Zustände) von
Zellen des Organismus charakteristisch. Diese Regulationsniveau
ist während der
Entstehung, der Aufrechterhaltung und der Entwicklung einer großen Anzahl
an Krankheiten beeinflusst. In einer bevorzugten Form beruht die
Erfindung folglich auch auf der Anwendung einer genomischen Technik,
die zur systematischen Analyse dieser Deregulationen zur Entwicklung
prädiktiver
Diagnosen bestimmt ist. Die Erfindung erlaubt sogar die Identifizierung
deregulierter Gene in zirkulierenden Zellen bei Krankheitsereignissen
und die Verwendung dieser qualitativen genetischen Ereignisse in prädiktiven
Diagnose-Tests, zur Vorhersage oder zum Nachweis von pathologischen
Ereignissen, die zur Kostendämpfung
im Gesundheitswesen beitragen.
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Hinsichtlich der Identifizierung
von Genexpressionsmarker, die spezifisch in Blutzellen eines eine
Krankheit aufweisenden Organismus vorliegen, zum Beispiel in einem
zu frühen
Stadium, um mit Hilfe klinischer Prüfungen oder klassischen Diagnose-Tests
diagnostiziert werden zu können,
bietet die Erfindung den Vorteil, posttranskriptionelle Störungen zu
identifizieren. Denn diese Störungen
sind hauptsächlich
die Folge der Modifikation der Regulation eines Schlüsselschrittes
der Genexpression: die Spleißung.
Die Spleißvariationen
modifizieren in qualitativer Weise die RNA durch Einschließen oder
Ausschließen
von Exons oder Introns, deren Anwesenheit oder Abwesenheit, verbunden
mit einer gegebenen physiopathologischen Situation, die Basis für eine Diagnose
liefern kann. Diese Diagnose kann auf dem Einsatz der PCR oder Hybridisierungen
beruhen, die ein spezifisches Detektieren der gespleißten Sequenz
in differentieller Weise von den beiden Situationen erlauben. Oft
beeinflussen die Spleißvariationen,
durch Verwendung alternativen Exon(s) oder durch Beibehaltung von
Intron(s) in einer Messenger RNA die Sequenz des entsprechenden
Proteins. Diese Unterschiede in der Aminosäure-Kette erlauben an eine
Diagnose zu denken, die auf dem Einsatz von Antikörpern basiert,
die spezifisch die alternative Proteinsequenz wiedererkennen.
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Wie zuvor angegeben, beruht das Verfahren der
Erfindung besonders auf der Verwendung von zirkulierenden Zellen
als biologisches Material. Im besonderen handelt es sich um Blutzellen
und bevorzugt um Zellen mit Kern. Man kann besonders die Lymphocyten,
Makrophagen, Monocyten, dendritische Zellen, etc. nennen. Die Zellen
können
von einer Person mittels jeder dem Fachmann bekannten Technik entnommen
werden, Cytapherese, Ficoll Gradienten, Präparation von mononukleären Zellen des
peripheren Bluts etc. Zur Anwendung der vorliegenden Erfindung können die
verschiedenen Blutzellpopulationen voneinander getrennt sein, um
nur einen bestimmten Typ zu verwenden, der eine spezifische genomische
Signatur aufweist. Allerdings kann der Test der Erfindung ebenfalls
mit einer biologischen Probe durchgeführt sein, die nicht getrennte Blutzellen
umfasst. Übrigens
können
die zirkulierenden Zellen ebenfalls Tumorzellen, von pathologischem
Gewebe abgelöste
Zellen, zum Beispiel bei Metastase-Prozessen, sein (oder umfassen).
Die Nucleinsäuren
können
aus der Probe gemäß jeder
dem Fachmann bekannten Technik (Zelllyse, Zellextraktion, RNA-Isolierung,
etc.) präpariert
sein. Außerdem sind
diese Nucleinsäuren
vor dem Hybridisierungsschritt, zum Beispiel zur Herstellung von
cDNA, zur Amplifikation dieser Nucleinsäuren, zur deren Markierung,
etc. vorzugsweise behandelt. In dieser Hinsicht kann die Markierung
radioaktiver, enzymatischer, fluoreszierender, colorimetrischer
oder beliebig anderer Natur sein. Typischerweise umfasst das Verfahren
der Erfindung die Entnahme einer biologischen Blutprobe, die Behandlung
der Blutzellen zur Freisetzung der Nucleinsäuren, die Amplifikation von Nucleinsäuren (und
gegebenenfalls ihre inverse Transkription), die Markierung von Nucleinsäuren und
ihre Hybridisierung mit der oder den Banken.
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Das Verfahren der Erfindung kann
angewandt sein zum Nachweis des Vorliegens einer Krankheit (oder
eines Krankheitsereignisses), nämlich
des Vorliegens von zellulären
Prozessen, die für Beginn
oder Entwicklung einer Krankheit charakteristisch sind, obwohl die
klinischen Symptome noch nicht evident sind. Das Verfahren der Erfindung
kann in dieser Hinsicht ebenfalls die in vitro Feststellung eines
Entwicklungsstadiums einer Krankheit bei einer Person erlauben.
Die genetischen Signaturen der Zellen entwickeln sich als Funktion
der fortschreitenden Stadien der Krankheit, deshalb ist es folglich möglich, aufgrund
der spezifischen Banken die Entwicklung einer Krankheit festzustellen.
Andererseits erlaubt das Verfahren der Erfindung auch die Lokalisierung
einer Krankheit in einer Person, nämlich zum Beispiel der Entstehungsort
eines Krankheitsherdes im Gewebe.
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Wie zuvor erwähnt, kann das Verfahren der Erfindung
zum Nachweis verschiedener Krankheitsarten angewandt sein, besonders
von Krankheiten, die mit Deregulationen der zellulären Signalübertragung
assoziiert sind. Es kann sich um Krankheiten handeln, die mit Alterung
wie zum Beispiel neurodegenerative Krankheiten verbunden sind, oder
jeder anderen Krankheit, die insbesondere eine anormale Zellproliferation
(Krebs, Stenose) umfasst.
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Gemäß einer besonderen Form betrifft
die Erfindung ein Verfahren, wie zuvor definiert, zum in vitro Nachweis
des Vorliegens, des Entwicklungsstadiums oder der Lokalisierung
einer neurodegenerativen Krankheit.
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Gemäß einer anderen besonderen
Form betrifft die Erfindung ein Verfahren, wie zuvor definiert, zum
in vitro Nachweis des Vorliegens, des Entwicklungsstadiums oder
der Lokalisierung einer Krebserkrankung. Es kann sich um verschiedene
Krebsarten handeln, wie zum Beispiel feste Tumore (von Leber, Lunge,
Schädel
und Hals, Melanom, von Blase, Brust etc.).
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Die Erfindung beschreibt ebenfalls
ein Verfahren zum in vitro Nachweis von Blutzellen, die für einen
Krankheitszustand charakteristisch sind, umfassend die Entnahme
einer Probe von Blutzellen bei einer Person und die Bestimmung des
Vorhandenseins in der Probe von Blutzellen, die ein für eine Krankheit
charakteristisches genetisches Profil aufweisen.
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Wie bereits oben beschrieben, beruht
die Erfindung zum Teil auf der Bildung oder Verwendung von Banken
an Nucleinsäuren,
die für
einen Krankheitszustand charakteristisch sind. In einer ersten Anwendungsform
handelt es sich um Banken (oder Präparate) von Nucleinsäuren, umfassend
Nucleinsäuren,
die für
Gene spezifisch sind, deren Expressionsniveau in einer Blutzelle
modifiziert ist, die von einem Organismus in einer Krankheitssituation stammt.
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Gemäß einer anderen Anwendungsform handelt
es sich um Banken (oder Präparate)
von Nucleinsäuren,
umfassend Nucleinsäuren,
die für Spleißformen
von charakteristischen Genen einer Blutzelle spezifisch sind, die
von einem Organismus in einem Krankheitszustand stammt.
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Die Präparate oder Banken der Erfindung können auf
Trägern,
in Reinform oder als Mischung, angebracht sein, wie es detaillierter
nachfolgend beschrieben ist.
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Die Erfindung beschreibt noch Verfahren
zur Herstellung derartiger Banken. Insbesondere umfassen diese Verfahren
(i) Gewinnung eines ersten Nucleinsäure-Präparates aus einer Blutzelle,
die aus einem eine neurodegenerative Krankheit oder einen festen
Tumor aufweisenden Organismus isoliert ist, (ii) Gewinnung eines
Präparates
aus Referenz-Nucleinsäuren aus
einer Blutzelle, die aus einem besagte Krankheit nicht aufweisenden
Organismus isoliert ist, (iii) einen Hybridisierungsschritt mit
besagtem ersten Präparat
und dem Referenz-Präparat,
und (iv) die Wiedergewinnung, aus den gebildeten Hybriden, der Nucleinsäure-Klone,
die für
Spleißformen
von charakteristischen Genen der Blutzelle spezifisch sind, die
vom Organismus in dem Krankheitszustand stammt.
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Die Erfindung beschreibt ebenfalls
Verfahren zur Herstellung einer Bank an Nucleinsäuren, die für das Entwicklungsstadium einer
Krankheit charakteristisch sind, umfassend (i) Gewinnung eines ersten Nucleinsäure-Präparates
aus einer Blutzelle, die aus einem eine neurodegenerative Krankheit
oder einen festen Tumor in einem bestimmten Entwicklungsstadium
aufweisenden Organismus isoliert ist, (ii) Gewinnung eines Präparates
aus Referenz-Nucleinsäuren
aus einer Blutzelle, die aus einem besagte Krankheit in einem anderen
Entwicklungsstadium aufweisenden Organismus isoliert ist, (iii)
einen Hybridisierungsschritt mit besagtem ersten Präparat und
dem Referenz-Präparat,
und (iv) die Wiedergewinnung, aus den gebildeten Hybriden, der Nucleinsäure-Klone,
die für
Spleißformen
von charakteristischen Genen der Blutzelle spezifisch sind, die
vom Organismus in dem bestimmten Entwicklungsstadium der Krankheit
stammt.
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Wie es später noch detaillierter erläutert wird, kann
der Schritt der Wiedergewinnung von Klonen entweder die Wiedergewinnung
von nicht hybridisierten Nucleinsäure-Klonen oder die Wiedergewinnung, aus
den gebildeten Hybriden, von Nucleinsäure-Klonen umfassen, die für Spleißformen
von Genen spezifisch sind.
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Die Erfindung betrifft ebenfalls
beliebige Kits, die zur Anwendung eines wie oben beschriebenen Verfahrens,
umfassend eine Bank an Nucleinsäuren, umfassend
Nucleinsäuren,
die für
charakteristische Störungen
der Genexpression von Blutzellen eines Organismus in der Krankheitssituation
spezifisch sind.
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Identifikation für transkritionelle und post-transkriptionelle
Modifikationen spezifische Marker Wie oben angegeben, beschreibt
die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure-Banken, die für das Entwicklungsstadium
einer Krankheit charakteristisch sind, umfassend (i) Gewinnung eines
ersten Nucleinsäure-Präparates
aus einer Blutzelle, die aus einem eine Krankheit in einem bestimmten
Entwicklungsstadium aufweisenden Organismus isoliert ist, (ii) Gewinnung
eines Präparates aus
Referenz-Nucleinsäuren
aus einer Blutzelle, die aus einem besagte Krankheit in einem anderen
Entwicklungsstadium aufweisenden Organismus isoliert ist, (iii)
einen Hybridisierungsschritt mit besagtem ersten Präparat und
dem Referenz-Präparat,
und (iv) die Wiedergewinnung von Nucleinsäuren, die für die Blutzelle charakteristisch
sind, die vom Organismus in dem bestimmten Entwicklungsstadium der
Krankheit stammt.
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Die Verfahren der Erfindung umfassen
im besonderen die Bildung von Klonen und von Nucleinsäure-Banken
aus RNA-Extrakten bei verschiedenen Krankheiten, bei verschiedenen
Entwicklungsstadien und die ebenso aus den kranken Geweben wie auch aus
Blutzellen erhalten sind, deren Genexpression durch diese Gewebe
beeinflusst worden ist. Die Gewinnung dieser Klone und dieser Banken
erfolgt vorteilhafterweise mittels differentieller Analyse-Techniken
der Genexpression. Die erhaltenen differentiellen Signaturen sind
folglich einerseits für
die Differenzen zwischen krankem und gesundem Gewebe und andererseits
Blutzellen von Kranken und Kontrollblutzellen von Gesunden spezifisch.
Diese Signaturen können
folglich entweder in den pathologischen Proben oder den Kontrollproben
bevorzugt gezeigt sein.
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Die Nucleinsäure-Populationen, die zur Gewinnung
von Klonen oder zur Bildung von Banken dienen, sind zum Beispiel
RNA (Gesamt-RNA oder mRNA) aus Zellextrakten in einem Krankheitszustand
und entsprechende RNA (Gesamt-RNA oder mRNA) von einem Kontrollzustand,
oder von dieser Gesamt-RNA oder mRNA abstammende Nucleinsäuren (durch
inverse Transkription, Amplifikation, Klonierung in Vektoren, etc.).
Diese Nucleinsäuren können gemäß dem Fachmann
bekannten Verfahren hergestellt sein. Zusammengefasst umfassen diese Verfahren
allgemein eine Lyse von Zellen, Gewebe oder Probe und Isolierung
von RNAs mittels Extraktionsverfahren. Es handelt sich insbesondere
um eine Behandlung mit chaotropen Mitteln wie beispielsweise Guanidinthiocyanat
(das die Zellen zerstört
und die RNA schützt)
und anschließende
RNA-Extraktion mit Lösemitteln
(zum Beispiel Phenol, Chloroform). Derartige Verfahren sind dem
Fachmann wohl bekannt (siehe Maniatis et al., Chomczynski et al.,
Anal. Biochem. 162 (1987) 156), und können ohne weiteres mittels
Verwendung von im Handel erhältlichen Kits
angewandt sein wie zum Beispiel das Kit US73750 (Amersham) für die Gesamt-RNA.
Es ist nicht erforderlich, dass die eingesetzten RNAs ganz rein
sind und insbesondere stört
es nicht, wenn Spuren genomischer DNA oder anderer Zellbestandteile (Proteine,
etc.) in den Präparaten
verbleiben, da sie die Stabilität
der RNAs nicht signifikant beeinflussen. Außerdem ist es wahlweise möglich, nicht
Gesamt-RNA Präparate
sondern Messenger-RNA Präparate
zu verwenden. Diese können
entweder direkt aus einer biologischen Probe oder aus Gesamt-RNA mit
Hilfe von polyT-Sequenzen gemäß herkömmlichen
Verfahren isoliert sein. Die Gewinnung von Messenger-RNA kann in
dieser Hinsicht mit Hilfe kommerzieller Kits durchgeführt sein,
wie beispielsweise mit Kit US72700 (Amersham). Die RNAs können ebenfalls
direkt aus Banken oder anderen Proben gewonnen sein, die bereits
hergestellt und/oder in Sammlungen zugänglich und unter geeigneten
Bedingungen aufbewahrt sind.
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Die Hybridisierung kann unter verschiedenen
Bedingungen durchgeführt
sein, die vom Fachmann angepasst werden können. Vorzugsweise setzt man
für die
Hybridisierung die Population an Nucleinsäuren, die vom deregulierten
Zustand stammen, in einem Überschuss
bezogen auf die Population an Nucleinsäuren ein, die vom Kontrollzustand stammen.
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Um aus dem Produkt der Hybridisierungsreaktion
Klone zu isolieren, die für
die Deregulationen (Krankheiten) gemäß der Erfindung charakteristisch sind,
können
zwei prinzipielle Ansätze
angewandt sein. Der erste Ansatz, ein lediglich quantitativer, erlaubt
die Bildung eines Nucleinsäure-Präparates,
das die gesamten (oder einen signifikanten Teil) der aus dem unterschiedlichen
Expressionsniveau der beiden Zustände resultierenden Klone zusammenfasst. Derartige
Klone (und Banken) werden gemäß den bekannten
subtraktiven Hybridisierungsverfahren erhalten, die im Wesentlichen
darin bestehen, die bei dem Hybridisierungsschritt gebildeten Hybride
zu eliminieren, um nur die nicht hybridisierten Klone zu behalten,
die für
den deregulierten Zustand verglichen mit dem ausgewählten Kontrollzustand
charakteristisch sind.
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In einer bevorzugten Anwendungsform
verwendet man jedoch ein qualitatives Verfahren, das die Bildung
eines Nucleinsäure-Präparates
erlaubt, das die gesamten (oder einen bedeutenden Teil) der Klone
zusammenfasst, die aus funktionellen genetischen Störungen resultieren,
die für
den deregulierten Zustand verglichen mit dem ausgewählten Kontrollzustand
charakteristisch sind. Im besonderen umfasst eine derartige qualitative
Bank nicht die gesamten Klone, deren Expression modifiziert ist,
sondern zum Beispiel die Klone, die unterschiedlichen Spleißungen oder
Deletionen bei beiden Zuständen entsprechen.
Wenn man die Rolle der alternativen Spleißungen in den zellulären Regulations-
und Umsetzungspfaden berücksichtigt,
umfassen vorteilhafterweise derartige Präparate (und Banken) Klone mit einem
bedeutenden funktionellen Wert und sind folglich geeignet, an der
Deregulation beteiligte genetische Modifikationen wiederzugeben.
Derartige Klone erlauben folglich die Bildung von mehr prädiktiven Banken
und die Generierung von repräsentativeren genetischen
Markern.
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Die Bildung derartiger qualitativer
Banken kann durch Isolieren von Nucleinsäure-Bereichen aus den beim
Hybridisierungsschritt gebildeten Hybriden erfolgen, die unterschiedlichen Spleißungen oder
Deletionen entsprechen. Gemäß den eingesetzten
Verfahren entsprechen diese Bereiche entweder ungepaarten oder gepaarten
Bereichen.
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Die beiden Ansätze sind nachfolgend detaillierter
beschrieben.
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Herstellung
und Verwendung quantitativer differentieller Banken
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In einer ersten Anwendungsform verwendet man
folglich in der vorliegenden Erfindung eine quantitative differentielle
Bank, nämlich
eine Bank umfassend Nucleinsäure-Klone,
die Genen entsprechen, deren Expressionsniveau in Zellen im Krankheitszustand
verglichen mit dem Kontrollzustand modifiziert ist. Derartige Banken
können
zum Beispiel mittels quantitativer differentieller Analyse erstellt
sein und die Sequenzen zusammenfassen, deren Expression bei zellulären Deregulationserscheinungen
erhöht oder
vermindert ist. Die Methodologien für Etablierung dieses Banken-Typs
sind dem Fachmann bekannt und können
in folgende Kategorien zusammengefasst werden:
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Elektronische Subtraktion
der Hochdurchsatz-Sequenzierung
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Dieses Verfahren beruht auf der zufälligen Sequenzierung
einer bestimmten Anzahl an cDNAs. Eine Suchmaschine zur Informationsrecherche
kann danach verwendet sein, um eine Subtraktion der beiden Analysenzustände vorzunehmen.
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«Serielle Analyse der Genexpression
(SAGE)»
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Dieses Verfahren beruht auf der Wiedererkennung
einer mit jeder cDNA assoziierten Signatur unter Verwendung von
Restriktionsenzymen und Oligonucleotid-Adaptern. Dieses Etikett
entspricht einem Teil der cDNA-Sequenz (10 Nucleotide lang, um auf
diese eindeutige Weise die entsprechende cDNA zu identifizieren).
Diese Etiketten werden dann miteinander zusammengefügt, um sequenziert
und dann analysiert zu werden (Velculescu und Mitarbeiter, Science,
1995, 270:484–487).
Dieser Ansatz stellt folglich eine Verkürzung gegenüber der systematischen Sequenzierung
dar.
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«Nucleinsäure-Arrays»
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Diese Methode beruht auf der Anlagerung von
Nucleinsäuren
(Oligonucleotide, PCR-Fragmente, cDNAs) auf festen Trägern (Membranen,
Glasträger,
Gen-Chip) in mehr oder weniger hoher Dichte. Sonden, die von der
Messenger-RNA von gesunden oder pathologischen Proben stammen, werden
anschließend
zur Hybridisierung verwendet, um die Messenger-RNA zu identifizieren,
die überexprimiert oder
stark überexprimiert
oder stark reprimiert sind.
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«Differentielles Display»
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Diese Technik nutzt einen Oligo-dT
Primer und Zufallsprimer zur Durchführung von PCR-Reaktionen mit cDNA-Populationen.
Die PCR-Produkte werden dann mit Hilfe hoch auflösender Gele verglichen. Die
exprimierten Fragmente des differentiellen Typs werden anschließend isoliert
und ihr Vorhandensein ist mit Nothern-Blots vor der Sequenzierung bestätigt.
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Mehrere Variationen dieser Technologie
sind entwickelt worden (Prashar und Weissman, PNAS, 1996, 93:656–663). Aufgrund
der Primer und der Auswahl der Restriktionsenzyme und der eingesetzten
Adapter differieren die Variationen. Wie bei der SAGE-Technik richten
sie sich an das äußere Ende der
3'-cDNAs. Mehrere
Kits sind ebenfalls auf dem Markt erhältlich, um diesen Ansatz zu
ermöglichen.
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Subtraktionsklonierung
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Diese Technik beruht auf der Eliminierung von
cDNAs, die in beiden zu vergleichenden Proben vorhanden sind. So
werden verschiedene Subtraktionskits, in denen die cDNA 'Tester' mit einem Überschuss
an cDNA 'Driver' hybridisiert ist,
angeboten (Clontech). Das Endprodukt wird aus einem Pool von Fragmenten
gebildet, die mittels PCR amplifiziert sind, und stammt von cDNAs
ab, die differentiell exprimiert werden, und das in einen geeigneten
Vektor zur weiteren Analyse kloniert werden kann. Die RDA-Technik
(Representational Difference Analysis) beruht ebenfalls auf diesem
Subtraktionsprinzip (Lisitsyn und Mitarbeiter, Science, 1993, 259:946–951).
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Die Anwendung dieser differentiellen
Analysetechniken erlaubt folglich die Bildung von Klonen und quantitativen
Banken, nämlich
Zusammenfassungen der gesamten Sequenzen, deren Expression bei zellulären Deregulationserscheinungen,
die bei Krankheiten beteiligt sind, erhöht oder vermindert ist.
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Herstellung
und Verwendung von differentiellen qualitativen Banken
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In einer anderen Anwendungsform verwendet
man in der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise eine differentielle
qualitative Bank, nämlich eine
Bank, umfassend Nucleinsäure-Klone,
deren eine Teil wenigstens der Sequenz der differentiell gespleißten Gene
von Zellen entspricht, die einem pathologischen Zustand oder einem
Kontrollzustand entsprechen. Dieser Banken-Typ fasst folglich die
bei pathologischen Deregulationsvorgängen verschiedenartig gespleißten Sequenzen
zusammen.
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Die Verwendung dieses Banken-Typs
ist besonders vorteilhaft. Denn die unterschiedlichen Signalübertragungen,
die bei zahlreichen Krankheiten wie beispielsweise Krebs und neurodegenerative Krankheiten
gestört
sind, beziehen Gene und folglich mRNA mit ein, deren Expression
durch alternative Spleißung
reguliert ist. Darüber
hinaus zeigt eine größer werdende
Anzahl aus der Literatur entnommener Beispiele, dass RNA-Formen,
die spezifisch bei Krankheiten beobachtet werden, das Ergebnis einer Störung der
Spleißung
sind. In Verbindung mit den Neuerungen der Erfindung muss man unterstreichen, dass
ebenso der Aktivierungszustand verschiedener Zelltypen, die an der
Immunantwort beteiligt sind, von Signalkaskaden reguliert ist, wo
die Beteiligten durch Spleißen
reguliert sind.
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Die Alzheimer Demenz, die Huntington Krankheit,
die Parkinson Krankheit sind ebenfalls Beispiele für Krankheiten
mit einer erheblichen wirtschaftlichen Auswirkung und weisen eine
neurodegenerative Komponente auf. Selbst wenn die Beschreibung der
klinischen Symptome und die Identifizierung einiger suszeptibler
Gene erlaubt haben, entscheidende Kenntnisse über diese Krankheiten zu gewinnen,
sind die molekularen Grundlagen, die die Entwicklung dieser Krankheiten
unterstützen,
noch immer sehr rätselhaft.
Die Aufklärung
der Signalkaskaden, die bei diesen Krankheiten dereguliert sind, führt zweifellos
zur Entdeckung günstiger
Angriffspunkte für
diagnostische und therapeutische Eingriffe. Die Literatur unterstreicht
die Bedeutung von Störungen
bei Spleißvorgängen der
RNA.
- – Die
spinale Amyotrophie ist eine der häufigsten genetischen Erkrankungen.
Zwei Gene, SMN1 und SMN2, codieren identische Proteine, der Verlust
beider SMN1 Allele und eine Störung
der Spleißung
des SMN2 Gens tragen zur Entwicklung der Erkrankung bei (Lorson
und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:6307–6311).
- – In
Biopsien von Patienten mit Alzheimer Demenz sind spezifische Störungen der
Spleißung des
Presinillin-Gens PS1 festgestellt worden (Isoe-Wada und Mitarbeiter,
Eur. J. Neurol., 1999:163–167).
- – Der
Glutamat-Carrier ist von größter Bedeutung bei
neurodegenerativen Krankheiten wie beispielsweise die amyotrophe
Lateralsklerose oder Epilepsie. Störungen der Spleißung dieses
Carriers beeinflussen seine Funktionsfähigkeit (Meyer und Mitarbeiter,
Neurosci. Lett., 1998, 241:68-70).
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Zahlreiche Beispiele für eine Inaktivierung der
anti-onkogenen Aktivität,
die aus alternativen Spleißungen
der entsprechenden mRNA resultieren, sind heute bekannt:
- – Beim
kleinzelligen Lungencarcinom ist das Gen des Proteins p130, das
zur RB-Familie (Retinoblastom-Protein) gehört, auf Ebene der Konsensus-Spleiß-Stelle
mutiert. Die Folge dieser Mutation ist die Eliminierung des Exons
2, was eine ausbleibende Synthese des Proteins aufgrund des Vorhandenseins
eines zu frühen
Stop-Codons zur Folge hat. Es ist die erste Beobachtung gewesen, die
die Bedeutung der RB-Familienmitglieder in der Tumorgenese unterstrich.
- – Bei
Krebsarten des Schädels
oder Halses ist eine Mutation in der Konsensus-Spleiß-Stelle
bei der Inaktivierung von p53 beteiligt.
- – Bei
anderen Lungenkrebsarten ist das Gen des Proteins p16/tNK4A, ein
Protein , das die Cyclin-abhängigen
Kinasen CDK4 und CDK6 hemmt, auf Ebene einer Spleiß-Donorstelle
mutiert. Das Resultat dieser Mutation ein verstümmeltes Protein mit einer verkürzten Halbwertzeit.
Nun das p16 Protein ist normalerweise mit CDK4 und CDK6 assoziiert,
was ihre Assoziierung an Typ D Cycline und die Phosphorylierung
insbesonders von RB verhindert, hat dies die Anhäufung von aktiven hypophosphorylierten
Formen von RB zur Folge. Bei Abwesenheit von p16 ist RB durch Phosphorylierung
inaktiviert. Es ist anzumerken, dass der p16 Locus besonders komplex
ist und dass außerdem die Expression von p16 die von p19 durch alternative
Spleißung
erlaubt. Das p19 Protein, das keine Aminosäure mit dem p16 Protein gemeinsam
hat, kann an das proto-onkogene MDM2 assoziieren und den Zellcyclus
bei Vorhandensein von p53 blockieren, und eine «Tumorsuppressor»-Funktion
ausüben.
- – WT1,
ein Anti-Onkogen, das einen transkriptionellen Repressor codiert,
dessen Störungen
die Ursache für
Wilms Tumore sind, ist in mehreren messenger-RNAs transkribiert,
die durch alternative Spleißungen
entstanden sind. Bei Brustkrebs sind die relativen Verhältnisse
verschiedener Varianten verglichen mit gesundem Gewebe modifiziert,
was diagnostische Mittel und Wege für das Verständnis der Bedeutung verschiedener
funktioneller Domänen
von WT1 in der Tumorprogression liefert.
- – Die
gleiche Modifikationserscheinung bezüglich verschiedener Formen
von messenger RNA und Proteinisoformen ist für das Neurofibrin NF1 bei den
Neurofibromen wiedergefunden.
- – Dieses
Wissen über
die Modulation von Spleißungserscheinungen,
die die Tumor-Progression kennzeichnen, wird ebenfalls vom Beispiel
HDM2 gestützt.
Fünf alternative
Spleißungen
von HDM2 sind nämlich
in Ovarial- und Pankreascarcinomen nachgewiesen worden und, was
besonders interessant ist, ihre Expression verstärkt entsprechend die Tumorprogression.
- – Das
LTBP, ein Bestandteil der extrazellulären Matrix verschiedener Gewebe,
das in die Sekretion und Speicherung von TGF- eingreift, wird auch in
verschiedenen Isoformen produziert. Eine davon, wahrscheinlich weniger
Proteolyse-empfindlich, scheint die biologische Aktivität von TGF-
zu modulieren und könnte
an verschiedenen physiopathologischen Zuständen der Leber beteiligt sein.
Die humoralen und zellulären
Immunantworten stehen unter der Kontrolle der Transkription. Die
Literatur liefert zahlreiche Beispiele für native Isoforme, die durch
an diesen Immunantworten beteiligte alternative Spleißungen gebildet
sind.
- – die «Müllabfuhr» Rezeptoren
von Makrophagen sind membranständige
Glycoproteine, die für
physiologische und pathologische Antworten dieser Blutzellen wesentlich
sind und ihre Funktionen sind von Isoformen reguliert, die durch
Spleißung erzeugt
sind (Gough und Mitarbeiter, J. Lipid. Res.; 1998; 39:531–543).
- – Die
Aktivierung von T-Lymphocyten erfordert die funktionale Anwesenheit
mehrerer Rezeptoren und regulatorischer Proteine. Boriello und Mitarbeiter
(J. Immunol. 1995; 155:5490–5497)
haben von der Anwesenheit von Isoformen des B7 Aktivierungscofaktors
berichtet, als Folge der alternativen Spleißung dieses Gens, was ebenso
die große
Anpassungsfähigkeit
der Immunantwort unterstreicht, die von den Spleißungsvarianten
erbracht wird.
-
Tröster et al. (J. Exp. Med. 180
(1994) 2059) berichtet zudem die Identifizierung einer Spleißform des
La/SS-B Gens, ohne einen Bezug auf eine Krankheit herzustellen.
-
Um diese Phänomene und diese Komplexität zu berücksichtigen
und auch für
einen Krankheitszustand spezifische und in Blutzellen vorliegende
Signaturen zu isolieren, verwendet das Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise
als genetische Marker charakteristische Spleißereignisse für Deregulationssituationen.
-
Um dies zu bewerkstelligen, verwendet
die vorliegende Erfindung zum Beispiel differentielle qualitative
Nucleinsäure-Banken,
die gemäß der «DATAS» Methodologie,
die in der nicht veröffentlichten internationalen
Patentanmeldung, Nr. PCT/FR99/00547, beschrieben ist, hergestellt
sind. Insbesondere können
derartige Banken hergestellt sein durch Hybridisierung von einer
Population Nucleinsäuren,
die von in einer pathologischen Situation aus dem Blutkreislauf
isolierten Zellen stammen, und der Population Nucleinsäuren, die
von zirkulierenden Zellen in der Kontrollsituation stammen, und
Isolieren, aus den gebildeten Hybriden, der Nucleinsäuren, die
differentiellen Spleißungen
entsprechen.
-
In diesem Ansatz erfolgt die Hybridisierung bevorzugt
in flüssigen
Phase. Außerdem
kann die Hybridisierung in jeder geeigneten Vorrichtung durchgeführt sein,
wie beispielsweise Röhrchen (zum
Beispiel Eppendorf), Platten oder jeden anderen geeigneten Träger, der üblicherweise
in der Molekularbiologie Verwendung findet. Die Hybridisierung erfolgt
vorteilhafterweise in Volumina zwischen 10 und 1000 μl zum Beispiel
zwischen 10 und 500 μl. Es
ist zu verstehen, dass die verwendete Vorrichtung und die verwendeten
Volumina ohne weiteres vom Fachmann angepasst sein können. Die
für die
Hybridisierung eingesetzten Mengen an Nucleinsäuren sind ebenfalls dem Fachmann
bekannt. Im Allgemeinen sind Mikrogramm-Mengen für Nucleinsäuren hinreichend, zum Beispiel
im Größenbereich
von 0,1 bis 100 μg.
Zudem ist es möglich,
die Nucleinsäuren in
einem Verhältnis
von Driver/Tester, variierend von 50 bis ungefähr 0,02, vorzugsweise von 40
bis 1, einzusetzen. Noch vorteilhafter ist es, ein Verhältnis von nahe
oder größer 1, vorteilhafterweise
zwischen etwa 1 und etwa 10, zu bevorzugen. Es ist sehr wohl zu
verstehen, dass das Verhältnis
vom Fachmann entsprechend den Verfahrensbedingungen (zur Verfügung stehende
Mengen an Nucleinsäuren,
physiologische Situationen, verfolgte Absicht) angepasst sein kann.
Die anderen Parameter der Hybridisierung (Zeit, Temperatur, Ionenstärke) werden
ebenfalls vom Fachmann angepasst. Im großen und ganzen erfolgt die
Hybridisierung nach Denaturierung von "Tester" und "Driver" (zum Beispiel durch Hitze) innerhalb
von etwa 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37°C (eventuell
Temperaturerhöhungen
unterworfen) und unter Standardbedingungen der Ionenstärke (kann
beispielsweise zwischen 0,1 bis 5 M NaCl variieren). Es ist bekannt,
dass die Ionenstärke
einer der entscheidenden Faktoren für die Stringenz einer Hybridisierung
ist, insbesonder im Falle einer Hybridisierung auf einem festen
Träger.
-
Gemäß einer bestimmten Anwendungsform der
Erfindung ist die Hybridisierung in einer Phenol-Emulsion durchgeführt, zum Beispiel gemäß der PERT-Technik
("Phenol-Emulsion
DNA-Reassoziierungstechnik),
die von Kohne et al. (Biochemistry, Vol. 16, Nr. 24, Seiten 5329–5341) beschrieben
ist. Vorteilhafterweise ist die Hybridisierung in Phenol-Emulsion
mit Hilfe von Thermocyclen (Temperaturerhöhungen von etwa 37°C auf etwa
60/65°C)
und nicht durch Rühren,
gemäß der von
Miller und Riblet beschriebenen Technik (NAR 23 (1995) 2339) durchgeführt.
-
Jede andere Hybridisierungstechnik
in Flüssigphase,
vorzugsweise in Emulsion, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung
eingesetzt sein. Überdies
kann die Hybridisierung ebenfalls mit einem auf einem Träger immobilisierten
Partner erfolgen. Vorteilhafterweise ist der Driver immobilisiert.
Dies kann besonders durch biotinylierte Primer oder durch jedes
andere dem Fachmann bekannte Immobilisierungsverfahren erfolgen.
-
Aus den durch Hybridisierung erzeugten
Populationen an Nucleinsäuren
können
die genetischen Marker der Erfindung (die Klone, die für qualitative genomische
Störungen
charakteristisch sind) mit beliebigen, dem Fachmann bekannten Techniken
identifiziert werden. Im Falle von heteroduplex RNA/DNA, zeigen
sich diese Bereiche im Wesentlichen in Form von nicht gepaarten
RNA-Bereichen (RNA-Schlaufen) und können durch Trennung von Heteroduplex und
von einzelsträngigen
Nucleinsäuren
(überschüssige Nucleinsäure, die
nicht reagiert hat), selektiven Verdau von doppelsträngiger RNA
(Domänen,
die am Heteroduplex beteiligt sind), dann Trennung von resultierender
einzelsträngiger
RNA und von einzelsträngiger
DNA identifiziert und kloniert werden. Im Fall von Heterotriplex
zeigen sich diese differentiellen Spleißbereiche im Wesentlichen in
Form von doppelsträngigen
DNA-Bereichen und können
durch Behandlung in Gegenwart geeigneter Enzyme, wie ein Enzym,
das den Verdau der RNA erlaubt, und dann ein Enzym, das den Verdau
der einzelsträngigen DNA
erlaubt, identifiziert und kloniert werden. Die so erhaltenen Nucleinsäuren werden
direkt in Form von doppelsträngiger
DNA erhalten und können
in jeden geeigneten Vektor inseriert werden.
-
Es ist zu verstehen, dass weitere
Variationen und genaue Bedingungen für die Isolierung von Nucleinsäuren, die
Hybridisierungen und Gewinnung qualitativer Klone in der Anmeldung,
Nr. PCT/FR99/00547, noch nicht offengelegt, angegeben sind.
-
Diese Verfahren erlauben die Bildung
von Nucleinsäure-Klone
und Banken, die den qualitativen genetischen Markern entsprechen,
die eine Unterscheidung von Blutzellen eines gesunden Zustands von
Zellen eines pathologischen Zustands erlauben. Wie im Beispielteil
angegeben ist, stellen diese Nucleinsäure-Präparate besonders zweckdienliche
Marker für
eine Diagnose aus entnommenem Blut für neurodegenerative Krankheiten
und Krebsarten dar.
-
Diversität der Banken
-
Die zuvor beschriebenen Methoden
erlauben folglich die Erzeugung von Gruppen von Nucleinsäure-Klonen,
die für
Unterschiede zwischen gesunden und pathologischen Situationen charakteristisch
sind. Jede Präparationstechnik
erzeugt zahlreiche Klone, die Banken bilden. Diese Banken können wie
diese eingesetzt, auf Trägern
angebracht oder durch Zufügen
oder Wegnehmen von Klonen, Zusammenfassung verschiedener Banken,
Zufügen von
Kontroll-Klone,
etc. modifiziert sein.
-
Die Banken der Erfindung können zum
Beispiel 10 bis 50 000 Klone, genereller 10 bis 10 000 Klone, noch
bevorzugter 50 bis 5000 Klone umfassen. Die Klone sind im Allgemeinen
in geordneter Weise auf einem oder mehreren Trägern angebracht, um so die
Analyse der Hybridisierungsergebnisse zu erleichtern. Der Träger kann
aus Glas, Nylon, Kunststoff, Fasern etc., im Grunde jeder feste
Träger
sein, der für
die Präsentation
von Nucleinsäuren
geeignet ist. Die Anlagerung von Banken auf den Trägern kann mit
herkömmlichen
dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt sein und zum Beispiel in
der Internationalen Patentanmeldung PCT/FR99/00547 beschiteben sind.
-
Die verwendeten Banken können gleichzeitig
Nucleinsäure-Klone,
die Genen entsprechen, deren Expressionsniveau modifiziert ist (quantitative Genmarker),
und Nucleinsäure-Klone
umfassen, deren eine Teil wenigstens der Sequenz von Exons und Introns
entspricht, die im gesunden Zustand und im pathologischen Zustand
verschiedenartig gespleißt sind
(qualitative Genmarker). So können
die Genmarker nach verschiedenen Ansätzen erzeugt und dann gemischt
werden, um eine Antwort so prädiktiv wie
möglich
zu erhalten. Es ist gleichfalls möglich Marker der Genexpression,
die spezifisch in Zellen des Blutkreislaufes bei verschiedenen Krankheiten exprimiert
sind, innerhalb der gleichen Bank auf einem gleichen Träger zu vereinigen.
Die Hybridisierung einer derartigen Bank erlaubt folglich ein Verfolgen
der Entwicklung mehrerer Krankheiten aus derselben Blutprobe.
-
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung beruht
folglich ebenfalls auf einem Nucleinsäure-Präparat,
das qualitative uquantitative Genmarker umfasst, die für zelluläre Deregulationen
in Zellen des Blutkreislaufes und für Krankheiten symptomatisch sind.
Ein besonderer Gegenstand der Erfindung beruht auf einer Bank, die
für verschiedene
Deregulationssituationen charakteristische Genmarker umfasst. Ebenfalls
Gegenstand der Erfindung ist jeder feste Träger, auf dem wenigstens zwei
Nucleinsäure-Banken
angebracht worden sind, die für
beide Krankheitsituationen charakteristisch sind. In dieser Hinsicht
betrifft die Erfindung noch ein Verfahren zur Präparation eines DNA-Chips, der
für Diagnose
von Krankheiten zweckdienlich ist, umfassend die Anlagerung auf
einem festen Träger
eines oder mehrerer Nucleinsäure-Präparate,
die für
Deregulationssituationen charakteristisch sind.
-
Zudem kann man gemäß einer
bevorzugten Anwendungsform Nucleinsäure-Banken einsetzen, die durch
Selektion der Klone je nach Verwendung entsprechend ihrer Implikation
an verschiedenen Krankheiten oder verschiedenen Stadien derselben Krankheit
gereinigt sind. Die Ausgangsbanken können nämlich zum Beispiel die gesamten
Klone umfassen, die für
genetische Ereignisse als Folge einer Etablierung einer Krankheit
entstandenen Krankheitssituation charakteristisch sind. Dann erlaubt
die Anwendung des Diagnoseverfahrens der Erfindung die Beobachtung,
dass bestimmte Klone mit Sonden hybridisieren, die von bestimmten
und intermediären Stadien
der Krankheitsentwicklung stammen. Diese Klone können folglich als Anzeiger
von Frühstadien identifiziert
werden und können
ein sehr wirkungsvolles diagnostisches Werkzeug liefern, das in
der Lage ist, jedem anderen Kriterium der klinischen Prüfung, jedem
anderen diagnostischen Mittel vorzugreifen.
-
Auf ganz spezifische Weise beschreibt
die vorliegende Erfindung die derzeitige Identifizierung und Charakterisierung
derartiger Klone, die als Genmarker für das Vorliegen und der Entwicklung
von Krankheiten einsetzbar sind. Eine der Hauptanwendungen der Identifizierung
und Klonierung dieser Genmarker betrifft die Abschätzung des
Hybridisierungspotenzials von RNA-Extrakten aus Blutzellen eines
gegebenen Individuums. Diese Abschätzung kann durch Hybridisierung
einer Sonde, die Messenger-RNA von Zellen diesen Individuums aufweist,
mit einer oder mehreren Banken an Signaturen, die für Krankheitssituationen,
wie zuvor beschriebenen, charakteristisch sind. Diese Anwendung
ist nachfolgend detaillierter beschrieben.
-
Verfahren
zur Analyse und Diagnose von pathologischen Signaturen
-
Die Erfindung erlaubt das Vorliegen
von spezifischen Signaturen für
verschiedene Krankheitsstadien durch Hybridisierung einer Probe
Nucleinsäuren von
Zellen aus dem Blutkreislauf mit oben definierten Genmarkern zu
bestimmen, wobei das beobachtete Hybridisierungsmuster auf die physiopathologischen Deregulationen
des Organismus hinweist, von dem die Blutprobe stammt. Für diesen
Zweck sind die eingesetzten Genmarker in Form vor. Banken zusammengefasst,
um eine Antwort so prädiktiv
wie möglich
zu liefern. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung beruht
ebenfalls auf der beträchtlichen
Anzahl an verwendeten Markern, die die generierte Information viel
prädiktiver
macht. Der prädiktive Charakter
der Information ist außerdem
durch die Natur der verwendeten und präparierten Marker gestützt.
-
Ein besonderer Gegenstand der Erfindung beruht
auf einem Analyseverfahren des Blutzellstatus, umfassend wenigstens
einen Hybridisierungsschritt von a) einer Nucleinsäure-Probe
von Blutzellen und b) einer Bank an Nucleinsäuren, die für Deregulationssituationen
von zellulären
Signalübertragungen
charakteristischen genetischen Ereignissen entsprechen, wobei das
Hybridisierungsmuster auf die physiopathologischen Deregulationen
des Organismus hinweist.
-
Weitere Aspekte und Vorteile der
vorliegenden Erfindung sind aus dem nachfolgenden experimentellen
Teil ersichtlich, der als Erläuterung
und nicht als Beschränkung
zu verstehen ist.
-
EXPERIMENTELLER
TEIL
-
Beispiel für neurodegenerative
Krankheiten: ALS
-
Die Tiermodelle ermöglichen
die Gewinnung biologischer Proben, die die Analyse verschiedener Entwicklungsstadien
einer Krankheit und den Vergleich dieser Stadien mit gesunden Kontrollen
ermöglichen.
-
Die amyotrophe Lateralsklerose (ALS)
ist eine neurodegenerative Krankheit, die mit verschiedenen Einschluss-Typen
wie Lewis Körperchen
verbunden ist und durch eine Apoptose der spinalen und cortikalen
motorischen Neurone gekennzeichnet ist und deren tödlicher
Ausgang manchmal mit einer Frontalhirn-Demenz verbunden ist. Sporadische
Formen, ohne jegliche beschriebene Mutation, gibt es zusammen mit
familiären
Formen (FALS), die mit Mutationen im SOD1-Gen, das die Superoxid-Dismutase
codiert, verbunden sind. Transgene Mäuse, die das menschliche SOD1-Gen
exprimieren, das eine der Mutationen trägt, das die FALS auslöst (G93A-Mutation),
sind beim Jackson Laboratory erhältlich,
unter Bedingungen einer Nutzungslizenz von der NorthWestern University.
Das Auftreten von ALS-Symptomen, verbunden mit der G9A3-Mutation in
SOD1, ist nicht die Folge einer Aktivitätsverminderung der Superoxid-Dismutase,
sondern einer Funktionssteigerung, die die Fähigkeit des Enzyms verstärkt, freie
Radikale zu erzeugen. Dieses Modell reproduziert in 120 Tagen den
tödlichen
Ausgang der Krankheit mit Symptomen, die mit denjenigen der Humankrankheit
vergleichbar sind. Dieses Modell ermöglicht die Gewinnung von Proben
von Gehirn, Rückenmark
und peripherem Blut.
-
Identifizierung von Spleißformen,
die für
das ALS-Modell spezifisch sind:
-
Das Unternehmen ExonHit Therapeutics entwickelt
einen neuen Ansatz zur qualitativen differentiellen Durchmusterung
basierend auf der DATAS (Differential Analysis of Transcripts Alternatively
Spliced)-Technologie. Diese Technologie ist Gegenstand einer Patentanmeldung
in Europa und den USA. Die mit DATAS identifizierten Sequenzen können von
alternativen Exons oder von verbliebenen Introns in einer der beiden
verglichenen physiopathologischen Situationen stammen. Die erhaltenen
Daten kennzeichnen folglich Modifikationen der Expression von RNA-Sequenzen, die die
funktionellen Domänen
von Proteinen beeinflussen. Die differentielle qualitative Analyse
wird mit transgenen Tierproben und syngenen Kontrollen im Alter
von 60 bis 100 Tagen durchgeführt.
60 Tage entsprechen einem Stadium, das etwas vor den ersten Symptomen
liegt, aber schon auf cerebraler Ebene durch Veränderungen der Zellphysiologie,
insbesondere durch eine Störung
des mitochondrialen Stoffwechsels, gekennzeichnet ist. Nach 100
Tagen sind 50% der corticalen und spinalen motorischen Neuronen
abgestorben und ein aktiver neuronaler Apoptose-Prozess ist parallel
mit einer Aktivierung von Astrocyten verbunden.
-
Die differentielle qualitative Analyse
wird folglich durchgeführt:
- – aus
RNA-Extrakten von Proben aus Gehirn und Rückenmark ohne vorherige Isolierung
von Neuronen, damit ein Maximum an alternativen Spleißereignissen,
die mit der Entwicklung der Krankheit verbunden sind berücksichtigt
werden.
- – aus
peripherem Gesamtblut oder Blutzellfraktionen
-
Die mit DATAS identifizierten Sequenzen entsprechen
Introns und/oder Exons, deren unterschiedliche Expression durch
Spleißung
bei pathologischen Zuständen
und gesundem Zustand mittels PCR bewertet wird.
-
Der Vergleich dieser Sequenzen mit
Datenbanken erlaubt die Klassifizierung der erhaltenen Informationen
und eine begründete
Auswahl der beiden Sequenzen vorzuschlagen, deren Untersuchung weitergeführt werden
soll.
-
Spätere Charakterisierung von
erhaltenen Sequenzen:, Die mittels PCR bewerteten Sequenzen können in
komplementären
Modellen gesucht werden, die an neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind.
So können
RNAs, die von einem cerebralen Ischämie-Modell stammt, oder RNAs
von einem Tiermodell mit einer Prionenkrankheit zweckdienlich untersucht
werden, um selektive Expression von ALS-Markern oder allgemeiner von
Markern neurodegenerativer Krankheiten zu bewerten. Die Expression
von identifizierten Spleißformen
wird in repräsentativen
Humanproben von verschiedenen Krankheiten mit neurodegenerativen
Komponenten gesucht:
- – Blutproben von Patienten,
die an neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer Krankheit oder Parkinson
etc. leiden.
-
Beispiel für Krebs:
Krebs der Luftwege und des oberen Verdauungstraktes
-
Die Übertragung von Transgenen ist
Gegenstand zahlreicher experimenteller Anwendungen auf dem Gebiet
der experimentellen Krebsforschung. So verwendet man die dominanten
Allele bestimmter kanzerogener Gene, um transgene Mäuse als
Versuchsmodelle für
die Krebsforschung zu erhalten.
-
Die Krebsarten bilden eine heterogene
Gruppe von Krankheiten, wo jede durch einen ganzen Komplex genetischer
Störungen
gekennzeichnet ist, was eine unkontrollierte Zellproliferation und
die Verbreitung von Metastasen zur Folge hat. Wenn die Identifizierung
von genetischen Störungen,
die das Auftreten und die Progression von Krebsarten hervorrufen,
für Diagnose
und Verfolgung der Tumor-Entwicklung heute wichtig erscheint, so
wäre es die
Aussicht, neue und noch frühere
Diagnosen auf Basis dieses Wissens zu entwickeln, was der Bedeutung
dieser Forschungsanstrengungen für
die pharmazeutische Industrie Rechnung trägt. Es gibt zahlreiche Gene,
deren Störungen
einer Zelle Krebseigenschaften verleihen können. Diese Gene spielen wichtige
Rollen nicht nur im Verlauf der Entwicklung, sondern auch über die
gesamte Lebensdauer der Zelle. Sie greifen sogar ein, um essentielle
Funktionen wie auch die Proliferation, die Differenzierung, die
DNA-Reparatur oder das Überleben
der Zelle sicherzustellen. Diejenigen Gene, deren Störungen zur Produktion
von Proteinen führen,
die den Zellcyclus abnorm aktivieren, werden als Onkogene bezeichnet.
Man findet zum Beispiel in dieser Kategorie die zellulären Gene
myc und ras. Die Anti-Onkogene haben im Gegenteil den Zellcyclus
für eine
normale Funktion zu bremsen. Die Hemmung ihrer Aktivität bringt
die Zelle in Abhängigkeit
von Genen mit Proliferationswirkung und fördert folglich die Tumor-Entwicklung. In dieser
Kategorie findet man das RB (Retinoblastom) und das p53 Gen. Neben
Onkogenen und Anti-Onkogenen erscheinen die Gene, die den programmierten
Zelltod oder Apoptose modulieren, als wichtige Akteure der Kanzerogenität. Vergleichbar
einem physiologischen Zelldifferenzierungsprozess ist der programmierbare
Zelltod genetisch gesteuert. Die Tatsache, dass eine Zelle die Fähigkeit verloren
hatte, diese terminale Differenzierung einzuschalten, die ihre Elimination
erlaubt, versetzt sie nämlich
in die Lage, anormal weiter zu überleben, und
kann die Entstehung eines transformierten Zellklons erleichtern.
Dies kann man bei humanen follikulären Lymphomen beobachten, wo
das bcl-2 Gen aufgrund der unvermutet ereigneten Translokation zwischen
den Chromosomen 14 und 18 überexprimiert
ist. Diese Überexpression
eines Gens für
Anti-Apoptose-Aktivität
erleichtert das lange anormale Weiterleben von Zellpopulation, innerhalb
derer sich transformante Mutationen anhäufen können. Der programmierte Zelltod
oder Apoptose ist heute als ein essentieller Mechanismus zur Elimination
von unerwünschten
Zellen erkannt, bei denen es sich um Virus infizierte Zellen wie
um Zellen handelt, die funktionsunfähig machende oder anormal proliferierend machende
Mutationen angehäuft
haben. Das Niveau der Komplexizität, das die zelluläre Homöostase regelt,
resultiert nicht nur in eine Anzahl wichtiger beteiligter Akteure,
sondern auch zu verschiedenen Rollen, die jeder von ihnen alternativ
als Funktion des Zelltyps oder der Bedingungen spielen kann. Das
Anti-Onkogen p53 oder das Proto-Onkogen cMyc können zum Beispiel auch eine
wichtige Rolle bei der Kontrolle der Apoptose spielen. Eine derartige
Komplexität
macht die Anwendung hinreichend umfassender Ansätze erforderlich, um die Expressionsmodulationen
der gesamten Gene und hinreichend spezifisch zu analysieren, um
schnellst möglich
die erheblichsten Störungen
zu identifizieren, der Tumorentwicklung zu folgen oder neue therapeutische
Angriffspunkte zu identifizieren.
-
Durch Verwendung verschiedener Adressierungssysteme
(Promotorregionen) ist es möglich, eine
Art bevorzugte Expression des Transgens in einem bestimmten Gewebe
zu erhalten. Man kann also Tumormodelle schaffen, die sich in einer
bestimmten Gewebe-Umgebung entwickeln. Diese verschiedenen Modelle
von anvisierten Tumoren lassen die Möglichkeit der Detektion spezifischer
Signaturen auf Ebene von Zellen des Blutkreislaufs bei der Lokalisierung
des Tumors erahnen.
-
Tumormodell
der Leber
-
Bei der Maus gibt es ein Hepatocarcinom-Modell
(HCC), das mit der eingeschränkten
Expression von frühen
Sequenzen des SV40 Virus in der Leber verbunden ist, die für groß T und
klein t Antigene codieren (Dubois, N., Bennoun, M., Allemand, I.,
Molina, T., Grimber, G., Daudet-Monsac, M., Abelanet, R. und Briand,
P. (1991) Time course developpement of differentiated hepatocarcinoma
and lung metastasis in transgenic mice. J. Hepatol., 13, 227–239). Das
Transgen steht unter der Kontrolle des Promotors des humanen Gens
von Antithrombin III; dies hat eine frühe und konstante Expression
von viralen Antigenen zur Folge. Aus diesem Grund unterliegt die
Proliferation der Hepatocyten einer raschen Störung. Die Proliferationsrate der
transgenen Hepatocyten ist proportional höher als die normale Proliferation
während
der Leberentwicklung (von der Geburt bis zur fünften Woche), dann empfindlich
vermindert, ohne deswegen die geringe Rate zu erlangen, die für den Ruhezustand
einer normalen Leber charakteristisch ist. Diese transgenen Mäuse entwickeln
auf systematische Weise verschiedene HCC, die zum Tod aller Tiere
vor dem siebten Monaten führen.
Trotz einer frühen
Deregulation der Hepatocytenproliferation zeigte sich die Hepatomegalie
nur spät.
Die Untersuchung der Präneoplasie-Phase
vor Auftreten der HCC hat erlaubt, einen ausgleichenden Mechanismus
durch Apoptose zu zeigen, wobei eine normale Lebergröße in diesem
Modell beibehalten wird (Allemand et al., 1995). Es ist wichtig
anzumerken, dass diese Apoptose zum selben Zeitpunkt stoppt, wo
die normale Leber in einen Ruhezustand tritt. Von diesem Punkt aus
scheint es, dass die Leber-Homöostase
nicht mehr kontrolliert ist. Eine systematische Untersuchung über die
Empfindlichkeit der Apoptose hat ergeben, dass die von diesem transgenen
Modell stammenden Hepatocyten eine Eigenschaft erworben hatten,
die dem vom CD95/Fas System abhängigen
Zelltod widersteht (Rouquet N., Allemand I., Molina T., Bennoun
M., Briand P. und Joulin V. (1995) Fas-dependent apoptosis is impaired
by SV40 T-antigen in transgenic liver, Oncogene, 11, 1061–1067 (Rouquet
N., Allemand I., Grimber G., Molina T., Briand P. und Joulin V.
(1996) Protection of hepatocytes from Fas-mediated apoptosis by
a non-transforming SV40 T-antigen mutant cell Death & Diff., 3, 91–96) durch
einen von einer alternativen Spleißung unabhängigen Mechanismus des CD95/Fas-Rezeptors.
Doch nur eine umfassende Analyse der Spleißmodifikationen kann eine Störung dieses
Prozesses für
die gesamten molekularen Partner, die in die Signalübertragung
des CD95/Fas-Rezeptors eingreifen, anzeigen.
-
Dieses transgene Modell stellt ein
ideales Mittel dar für
die Identifizierung 1) von den Modifikationen der Genexpression,
die den Übergang
von der Präneoplasie
zur Neoplasie begleiten, was unentbehrliche Gene für eine Transformation
(Onkogene) oder Gene sind, die eine Tumorentwicklung hemmen (Apoptose-Gene)
2) von zirkulierenden Signaturen der Krebsentwicklung, die mit Ausstreuen
von Tumorzellen aus dem Tumor verbunden sind 3) von Ereignissen
der Störung
der Genexpression in den Blutzellen, die für eine Krebsentwicklung charakteristisch
sind.
-
Identifizierung spezifischer
Signaturen
-
Der qualitative differentielle Ansatz
erfolgt über
RNA-Extrakte der Leber und Blutzellen von normalen Mäusen und
von Mäusen,
die Hepatocarcinome (HCC) entwickeln, die mit der Expression von T-Antigen
von SV40 unter Kontrolle des Antithrombin III Promotors verbunden sind.
Die Kontrolltiere und die das Transgen exprimierenden Tiere sind
in unterschiedlichen Altersstufen ausgewählt, was einen Zugang für sehr frühe, präneoplastische
und neoplastische Stadien erlaubt, die besonders in diesem Modell durch
eine Aktivierung nach einer Inaktivierung der für eine Leber-Homöostase erforderlichen
Apoptose gekennzeichnet ist.
-
Verwendung der identifizierten
Sequenzen
-
Die Modulationen der Expression dieser
Sequenzen kann später
in Biopsien der humanen Tumore gesucht werden, um damit das Anwendungsgebiet
in der Humantherapie und Diagnose zu erweitern.
-
Diese cDNAs werden verwendet, um
die Tumorentwicklung in diesem transgenen Modell und in einer Reihe
muriner HCC-Modelle, die mittels Gentransfers hergestellt sind (Bennoun
M, Grimber G, Couton D, Seye A, Molina T, Briand P und Joulin V. (1998)
The amino-terminal region of SV40 large T-antigen is sufficient
to induce hepatic tumors in mice Oncogene, 17, in Druck), zu verfolgen.
Sogar bei Verwendung der spezifischen cDNAs, die bei verschiedenen
sehr frühen
Stadien in den Blutzellen detektiert werden, vor dem Auftreten von
Tumoren, kann man in einer gemischten Population gesunder und transgener
Mäuse vorhersagen,
welche davon einen Krebs entwickeln werden.
-
Nucleotid-Sonden oder PCR-Primer,
die sich von diesen Tumor spezifischen cDNAs herleiten, können in
Biopsien von Humantumoren zur Untersuchung der Expression von identifizierten
Spleißformen
und/oder der RNA, deren Menge in diesem Modell verändert ist,
verwendet werden.
-
Gleichfalls können die im Blut von Tieren
zu verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung identifizierten Sonden
ebenfalls verwendet sein, um damit gemeinsame Signaturen in Blutproben
von Patienten mit Krebs zu detektieren.
-
In einer Strategie, wo cDNA-Banken,
die gemäß den weiter
oben beschriebenen Verfahren der Erfindung erhalten werden, kann
eine entsprechende Sonde, die aus Blutproben von Patienten mit Krebs präpariert
ist, ebenfalls für
die Suche nach gemeinsamen Signaturen in verschiedenen Banken eingesetzt sein,
die einerseits von murinen Modellen zu verschiedenen Stadien der
Tumorentwicklung und andererseits aus Biopsien von verschiedenen
humanen Tumorarten erhalten sind. Diese Hybridisierungen werden
entsprechend dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt (siehe
besonders die in der Anmeldung PCT/FR99/00547 beschriebenen Hybridisierungsbedingungen).
-
ERMITTLUNG DER PRÄDIKTIVEN
DIAGNOSE BEIM MENSCHEN
-
Die in diesem Kapitel beschriebene
Methodologie kann gleichwohl bei Anwendung der oben beschriebenen
qualitativen und quantitativen Analyse-Techniken angewandt werden.
Die Erfindung bevorzugt jedoch die Anwendung und die Ermittlung von
Markern, die mit qualitativen Störungen
der Genexpression aufgrund der vorhergehend beschriebenen Vorteile
verbunden sind.
-
Die Erfindung beschreibt die Identifizierung und
Bildung von Banken an Signaturen aus Biopsien, die für die Entwicklung
einer Krankheit charakteristisch sind. Es ist sogar möglich, Banken
an cDNA-Sequenzen zu etablieren, die für die Entwicklung und Lokalisierung
dieser Krankheiten repräsentativ
sind. Es ist folglich aus einer Blutproben möglich, nach der Präsenz von
DNA-Signaturen zu suchen, die mit denjenigen in Banken präsentierten
identisch sind. Die Präsenz
gemeinsamer Signaturen unterstreicht nun die Präsenz von Nucleinsäuren, die
die selben Störungen
aufweisen wie die in den krankheitsverdächtigen Biopsien, sehr wahrscheinlich
von Zellen abstammend, die von krankem Gewebe sind.
-
Die Anwendung dieser Suche beruht
besonders auf der Anfertigung von Sonden aus Blutzellen und die
Hybridisierung dieser Sonden mit Filtern, die verschiedene Marker
zusammenfassen, die für
diese oder jene Krankheit spezifisch sind.
-
Die Erfindung beschreibt die Möglichkeit
der Identifizierung von Störungen
der Genexpression aus Blutzellen und dieser aus Versuchsmodellen,
die vollständig
oder teilweise eine Humankrankheit imitieren (als Beispiel murines
ALS-Modell oder Lebertumor-Modell).
-
Die Verwendung von Nucleinsäure-Sonden, die
von Blutzellen von Patienten mit einer anvisierten Krankheit (neurodegenerative
Krankheit, Krebs etc.) oder ohne stammen, erlaubt die Suche nach
der Existenz gemeinsamer Signaturen mit den experimentellen prädiktiven
Banken, die aus pathologischen Versuchsmodellen geschaffen sind.
Das Auftreten von gemeinsamer Signaturen schafft eine Diagnose des
Risikos der Entwicklung einer derartigen Krankheit bei dem Individuum,
das sich einer Diagnose unterzieht.
-
Die Erfindung erlaubt ebenfalls die
folgende Vorgehensweise:
-
- – Mischen
von Blutproben von Patienten, die an einer anvisierten oder an keiner
Krankheit leiden, um einen RNA-Bestand zu bilden, der für den pathologischen
oder gesunden Zustand repräsentativ
ist.
- – Diese
RNAs werden einer differentiellen Analyse gemäß den in der Erfindung beschriebenen Techniken
unterzogen und es werden die cDNA-Banken, die für pathologische und gesunde Zustände charakteristisch
sind, gebildet.
- – Diese
cDNA-Banken werden danach durch Hybridisierung mit Hilfe von Sonden
bewertet, die aus individuellen Blutproben von Patienten oder gesunden
Personen hergestellt sind,.
- – Die
so bewerteten Banken werden danach durch Verwendung von Sonden analysiert,
die aus Blutproben einer großen
Population an Personen hergestellt sind, die einen Arzt zwecks Routineuntersuchungen
konsultieren. Diese Banken bilden ein diagnostisches Mittel, das
für die Erfindung
charakteristisch ist. Auch einer Patientin, die eine Mammographie
zur Brustkrebserkennung durchführen
lässt,
kann eine kleine Blutprobe entnommen werden. Eine Nucleinsäure-Sonde,
die aus einer derartigen Probe hergestellt ist, kann dann eine sehr
frühen
Suche nach wahrscheinlichen Anzeichen einer Krebsentwicklung selbst
ohne Röntgenaufnahme
erlauben.
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Die Erfindung kann in Form von Gen-Chips angewandt
sein. Der Gen-Chip nutzt Eigenschaften der Hybridisierungsreaktion,
mit der die beiden komplementären
DNA-Stränge
sich miteinander in sehr spezifischer Weise verbinden. Die Erfindung
kann ebenfalls bei spezifischer Suche nach einem oder mehreren DNA-Marker
der Krankheit bei Anwendung eines DNA-Amplifizierungsverfahrens mit Hilfe
von Oligonucleotid-Primern, die für die zu suchende DNA spezifisch
sind, angewandt sein.