EP0991780A2 - Verfahren und testkit zum nachweis bösartiger tumore - Google Patents

Verfahren und testkit zum nachweis bösartiger tumore

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EP0991780A2
EP0991780A2 EP98942468A EP98942468A EP0991780A2 EP 0991780 A2 EP0991780 A2 EP 0991780A2 EP 98942468 A EP98942468 A EP 98942468A EP 98942468 A EP98942468 A EP 98942468A EP 0991780 A2 EP0991780 A2 EP 0991780A2
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EP
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dna
bax
detection
primer
test kit
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Withdrawn
Application number
EP98942468A
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Inventor
Timo Hillebrand
Bernd DÖRKEN
Gerhard Wolff
Peter Bendzko
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Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
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Invitek GmbH
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of malignant tumors on the basis of the detection of mutations in the Bax gene and to a test kit.
  • Apoptosis or programmed cell death plays a crucial, physiological role in the regulation of cells and tissues.
  • Dysregulations in this finely balanced system of activators and inhibitors of apoptosis play a decisive role in the development of malignant tumors.
  • inactivators of apoptosis are overregulated and activators of apoptosis are inactivated and / or mutated or deleted. It follows that the exact, molecular biological analysis of the damage to the molecules involved provides important information about the pathogenesis of malignant diseases. In addition, the detection of damage in the relevant genes makes it possible to identify those that should be substituted in the context of gene therapy in order to enable causal therapy.
  • a key activator of apoptosis mediation is represented by the Bax protein.
  • This molecule belongs to the family of bcl-2 related genes that regulate the apoptosis ability of a cell.
  • the protein bcl-2 is one of the inhibitors of apoptosis
  • Bax is assigned to the genes that promote apoptosis.
  • the Bax mRNA is expressed in three different splice variants, Bax-alpha, Bax-beta and two Bax-gamma forms. Bax-alpha is of particular importance for the induction of programmed cell death.
  • the Bax gene it has recently been possible to show that specific damage to the DNA sequence is present in tumors of the digestive tract ("frame shift mutation”) / somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype; Rampino-H et al., (1997) Science 275 (5302): 967-9 /.
  • the detection of this DNA damage is essential not only for the explanation of the development of tumors. Therefore, the Bax gene is also a candidate gene for the molecular diagnosis of malignant tumors, which should be replaced as part of gene therapy strategies in order to restore the tumor cell to programmed cell death.
  • the invention was therefore based on the object of developing a clinically usable detection method for molecular characterization of mutative changes in the Bax gene, which avoids the disadvantages of radioactive methods and can be used for routine diagnostics.
  • nucleic acids such as RNA and / or DNA
  • the detection of malignant tumors is characterized in that the genomic DNA or the RNA is isolated from clinical sample materials and insertion and deletion mutations in the human Bax gene in a guanosine repeat tract of the nucleotide region within the coding region of the gene in exon-3 - Examine the range of nucleotides with guanosine bases by amplifying this DNA section using a primer pair, the primer pair being selected so that the amplification length is between 90 and 120 base pairs and a primer is labeled with a fluorescent dye.
  • the amplified DNA fragment is applied to a sequencing gel or a separation matrix, separated and the insertions and deletions are detected over the length of the fragment.
  • genomic DNA is isolated from the clinical tissue samples to be examined by treating the sample with a lysis binding buffer, e.g. Incubated guanidine isothiocyanate, lithium chloride or guanidine hydrochloride, optionally in combination with detergents and alcohols, as well as with a mineral carrier material for binding the genomic DNA.
  • a lysis binding buffer e.g. Incubated guanidine isothiocyanate, lithium chloride or guanidine hydrochloride, optionally in combination with detergents and alcohols, as well as with a mineral carrier material for binding the genomic DNA.
  • known silica materials ⁇ 50 nm are preferably used, particularly preferably non-porous silicon dioxide with a particle size of 7 nm-1 ⁇ m.
  • the genomic DNA fixed to the carrier material under lysis binding buffer is applied to a membrane made of polysulfone ether with a pore size of 0.05 to 1 ⁇ m, preferably 0.2 ⁇ m to 0.5 ⁇ m.
  • the carrier material with the genomic DNA is then fixed on the membrane by a centrifugation step or a vacuum filtration, washed on the membrane by adding a washing buffer of ethanol, sodium chloride and Tris-HCl and eluted with a low salt buffer of Tris-HCl and EDTA.
  • the guanosine repeat tract to be examined for "frame shift" mutations within the coding region of the Bax gene is amplified enzymatically with a pair of primers, one of the primers being provided with a fluorescent label. After the enzymatic duplication, the duplicated DNA fragment is thus also provided with the fluorescent label.
  • the primer pair is selected so that the amplification length is between 90 and 120 base pairs. This subsequently enables a highly sensitive electrophoretic separation of the amplified DNA fragment.
  • a pair of primers of the sequence is preferred:
  • Primer 1 5'-TCATCCAGGATCGAGCAGG-3
  • Primer 2 5'-CTCGCTCAGCTTCTTGGTGG-3 used.
  • the DNA fragment generated via the amplification reaction is separated for analysis of its exact length on a sequencing gel (e.g. ABI 373) or in a capillary with a separation matrix (e.g. ABI 310) and analyzed by means of the DNA sequencer.
  • a sequencing gel e.g. ABI 373
  • a separation matrix e.g. ABI 310
  • the inventive method ideally solves the listed problems of radioactive techniques and allows simple and quick analysis of the Bax gene and thus a molecular characterization of malignant tumors.
  • the invention is furthermore also suitable for subjecting non-invasively obtainable sample materials to a mutation test in the Bax gene, which means that early detection of malignant changes is also possible by detecting mutations in the Bax gene.
  • the method according to the invention is particularly suitable for early detection or molecular characterization of tumors of the lungs, gastrointestinal tumors, preferably Lac, pancreas, and tumors of the hematopoietic system.
  • non-invasively obtainable clinical sample materials e.g. Stool samples, lavage or exhaled condensates are fed to the mutation analysis. It has been shown that Bax frameshift mutations are not limited to gastrointestinal tumors.
  • the method is also advantageously suitable for the examination of blood, saliva, swab materials or plasma samples. This is crucial for the possible early detection of malignant changes and for the planning of necessary therapeutic measures.
  • the invention also relates to a test kit for the examination of clinical samples for mutations in the Bax gene, which contains all the necessary reagents for the examination of mutations in the Bax gene.
  • a test kit for the examination of clinical samples for mutations in the Bax gene, which contains all the necessary reagents for the examination of mutations in the Bax gene.
  • DNA extraction from a wide variety of sample materials and the generation of a fluorescence-labeled DNA fragment can be achieved.
  • such a test kit also contains the necessary positive and negative controls and a fragment length standard.
  • the test kit according to the invention is characterized by: 1. a DNA and / or RNA extraction system 2. primer mix including a fluorescence-labeled primer (e.g. a hex-labeled primer)
  • Fragment length standard e.g. Rox-marked
  • Such a test kit thus also allows people who are not highly specialized in molecular biology to carry out Bax gene diagnostics in a routine laboratory operation.
  • the method on which the invention is based and the means for carrying out this method make it possible to routinely detect mutations in the Bax gene.
  • the procedure is particularly advantageous if the number of tumor biopsy materials is very limited. Due to the higher number of copies of Bax-RNA molecules, the detection can be carried out very efficiently.
  • the total RNA of the sample is isolated in a manner known per se.
  • the isolated RNA is then rewritten into cDNA using reverse transcription and can then be examined again for the detection of frameshift mutations.
  • the cell lines Lovo which has an insertion and a deletion mutation in the Bax guanosine extract (G) ⁇ , and the cell line SW620 (Bax wild type) were used.
  • the DNA isolation of the genomic DNA was carried out from the cell lines as well as from cell line mixtures.
  • the isolated genomic DNA was then used for the selective duplication of the DNA section of the Bax gene to be examined.
  • DNA 1-5 ⁇ l DNA is used for the amplification reaction.
  • a primer is used which is provided with a standard fluorescent label (hex label).
  • 0.5 ⁇ l of the DNA fragment generated is mixed with 2 ⁇ l water and 2 ⁇ l formamide and incubated for 5 minutes at 95 ° C.
  • This approach is applied to a 6% denaturing polyacrylamide sequencing gel and separated on an automatic sequencer (ABI 373) at 2500 V, 25 mA and 30 watts for 2 hours.
  • the analysis result is shown in Figure 1. The percentages of LoVo or SW620 are given in brackets.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen des Bax-Genes in Tumoren unter Verwendung nichtradioaktiver Techniken sowie einen entsprechenden Testkit, der 1) DNA oder RNA Extraktionsmodul, 2) Primermix (mit einem Hex-markierten Primer), 3) Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation der Bax-Wildtypsequenz, 4) Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation von mutiertem Bax, 5) Fragmentlängenstandard (Rox-markierte Fragmentleiter) enthält.

Description

Verfahren und Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis bösartiger Tumore auf der Basis des Nachweises von Mutationen des Bax-Genes sowie einen Testkit.
Apoptose oder programmierter Zelltod spielt eine entscheidende, physiologische Rolle in der Regulation von Zellen und Geweben. Dysregulationen in diesem fein ausbalancierten System von Aktivatoren und Inhibitoren der Apoptose haben entscheidenden Anteil in der Entstehung von bösartigen Tumoren. Diese sind dadurch gekennzeichnet, daß Inaktivatoren der Apoptose überreguliert und Aktivatoren der Apoptose inaktiviert und/oder mutiert oder deletiert sind. Daraus ergibt sich, daß die exakte, molekularbiologische Analyse der Schädigung von beteiligten Molekülen, wichtige Informationen über die Pathogenese von malignen Erkrankungen liefert. Darüber hinaus ermöglicht die Erfassung von Schädigungen in den relevanten Genen diejenigen zu identifizieren, welche im Rahmen einer Gentherapie substituiert werden sollten, um eine kausale Therapie zu ermöglichen. Ein entscheidender Aktivator der Apoptosevermittlung wird durch das Bax-Protein repräsentiert. Dieses Molekül gehört zur Familie der bcl-2 verwandten Gene, welche die Apoptosefähigkeit einer Zelle regulieren. Während z.B. das Protein bcl-2 zu den Inhibitoren der Apoptose zählt, wird Bax den Apoptose-fördernden Genen zugerechnet. Die Bax mRNA wird in drei unterschiedlichen Splicevarianten exprimiert, Bax-alpha, Bax-beta und zwei Bax- gamma Formen. Von spezieller Bedeutung zur Induktion des programmierten Zelltodes ist Bax-alpha. Für das Bax-Gen konnte kürzlich gezeigt werden, daß in Tumoren des Verdauungstraktes eine spezifische Schädigung der DNA-Sequenz vorliegt ("frame shift mutation")/Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype; Rampino-H et al., (1997), Science 275 (5302): 967-9/. Die Aufdeckung dieser DNA-Schädigung ist von wesentlicher Bedeutung nicht nur für die Erklärung der Entstehung von Tumoren. Daher stellt das Bax-Gen auch ein Kandidatengen dar für die molekulare Diagnostik von bösartigen Tummoren, welches im Rahmen von Gentherapiestrategien ersetzt werden sollte, um die Tumorzelle dem programmierten Zelltod wieder zuzuführen.
Mutative Veränderungen im Bax-Gen wurden bisher nur in einer hochspezifischen Gruppe von Tumoren des Verdauungstraktes nachgewiesen, welche allerdings prozentual nur ca. 10% dieser Tumorklasse manifestieren.
Der Nachweis dieser frame-shift Mutationen (Insertion bzw. Verlust einer Guanosinbase einem Guanosin-Repeat-Trakt des Bax-Genes) /Rampino et al./ über die enzymatische Vervielfältigung eines DNA-Fragmentes erbracht, innerhalb dessen sich die zu untersuchende Zielsequenz befand und der anschließenden Auftrennung des generierten DNA-Fragmentes in einem Polyacrylamidgel zur Analyse der exakten Länge des Fragmentes. Die Visualisierung der mutierten DNA-Fragmente erfolgte dabei mittels einer radioaktiven Methode auf einem Röntgenfilm.
Ein solches Verfahren ist aber sehr zeitaufwendig und somit für eine Routinediagnostik nicht anwendbar. Aufgrund des Einsatzes radioaktiver Stoffe ist es außerdem sehr gesundheits- und umweltgefährdend.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, eine klinisch nutzbare Nachweismethode zur molekularen Charakterisierung auf mutative Veränderungen im Bax-Gen zu entwickeln, welches die Nachteile radioaktiver Methoden vermeidet und für eine Routinediagnostik eingesetzt werden kann.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Erfindungsgemäß werden Nukleinsäuren, wie RNA und/oder DNA, aus Probenmaterial nach an sich bekannten Verfahren isoliert, so z.B. gemäß WO 95/34569 und DE-C2 44 47 015. Der Nachweis von bösartigen Tumoren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die genomische DNA oder die RNA aus klinischen Probenmaterialien isoliert und Insertions- und Deletionsmutationen im humanen Bax-Gen in einem Guanosin- Repeat-Trakt der Nukleotidregion innerhalb der kodierenden Region des Gens im Exon-3-Bereich der Nukleotide mit Guanosinbasen untersucht, indem man diesen DNA-Abschnitt mittels eines Primerpaares amplifiziert, wobei das Primerpaar so ausgewählt ist, daß die Amplifikationslänge zwischen 90 und 120 Basenpaaren beträgt und ein Primer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Das amplifizierte DNA-Fragment wird auf ein Sequenzierungsgel oder eine Trennmatrix aufgetragen, aufgetrennt und die Insertionen und Deletionen werden über die Fragmentlänge nachgewiesen.
In einer Ausführung wird genomische DNA aus den zu untersuchenden klinischen Gewebeproben isoliert, indem die Probe mit einem Lyse-Bindungspuffer, wie z.B. Guanidinisothiocyanat, Lithiumchlorid oder Guanidinhydrochlorid gegebenenfalls in Kombination mit Detergenzien und Alkoholen, sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung der genomischen DNA inkubiert. Anschließend wird die genomische DNA nach Durchführung von Waschschritten vom Trägermaterial wieder abgelöst.
Als mineralisches Trägermaterial werden vorzugsweise an sich bekannte Silicamaterialieπ < 50 nm eingesetzt, besonders bevorzugt nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer Teilchengröße von 7 nm-1 μm.
In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens wird die unter Lyse-Bindungspuffer am Trägermaterial fixierte genomische DNA auf eine Membran aus Polysulfonether mit einer Porengröße von 0,05 bis 1 μm, vorzugsweise von 0,2 μm-0,5 μm, aufgetragen. Durch einen Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration wird anschließend das Trägermaterial mit der genomischen DNA auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines Waschpuffers aus Ethanol, Natriumchlorid und Tris-HCI auf der Membran gewaschen und mit einem Niedrigsalzpuffer aus Tris-HCI und EDTA eluiert.
Der auf "frame shift" Mutationen zu untersuchenden Guanosin-Repeat-Trakt innerhalb der kodierenden Region des Bax-Genes wird mit einem Primerpaar enzymatisch vervielfältigt, wobei einer der Primer mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen ist. Nach der enzymatischen Vervielfältigung ist somit auch das vervielfältigte DNA- Fragment mit der Fluoreszenzmarkierung versehen. Das Primerpaar wird so ausgewählt, daß die Amplifikationslänge zwischen 90 und 120 Basenpaaren beträgt. Diese ermöglicht nachfolgend eine hochempfindliche elektrophoretische Auftrennung des amplifizierten DNA-Fragmentes.
Bevorzugt wird ein Primerpaar der Sequenz:
Primer 1 : 5'-TCATCCAGGATCGAGCAGG-3
Primer 2: 5'-CTCGCTCAGCTTCTTGGTGG-3 eingesetzt.
Als Fluoreszenzmarkierungen werden kommerziell verfügbare Farbstoffe wie z.B. Hex oder Rox (Handelsname) eingesetzt, welche mittels DNA-Sequenzierungsautomaten detektiert werden können.
Das über die Amplifikationsreaktion generierte DNA-Fragment wird zur Analyse seiner exakten Länge auf einem Sequenziergel (z.B. ABI 373) oder in einer Kapillare mit Trennmatrix (z.B. ABI 310) aufgetrennt und mittels des DNA-Sequenzierautomaten analysiert.
Eine solche Auftrennung ermöglicht den hochsensitiven Nachweis der exakten Länge. Es können Unterschiede von nur einem Nukleotid nachgewiesen werden. Die zu detektierende Abweichungen von einem Basenpaar (Insertion oder Deletion einer Base) von der Bax-Wildtypsequenz können so hochspezifisch erkannt werden. Das erfinderische Verfahren löst in idealer Weise die aufgeführten Probleme radioaktiver Techniken und gestattet eine einfache und schnelle Analytik des Bax- Genes und somit eine molekulare Charakterisierung bösartiger Tumore.
Es ist extrem zeitsparend, einfach in der Durchführung und gesundheits- und umweltschonend, da es auf die Verwendung radioaktiver Chemikalien verzichtet.
Zudem können durch Verwendung einer idealen Isolierungstechnik der genomischen DNA eine Vielzahl von Proben gleichzeitig analysiert werden. Da DNA- Sequenzierautomaten zur Standard-Ausstattung von diagnostischen Laboratorien gehören, ermöglicht die Erfindung schnell und reproduzierbar, Mutationen im Bax-Gen nachzuweisen.
Die Erfindung ist auch darüber hinaus geeignet, nichtinvasiv gewinnbare Probeπmaterialien einer Mutationsuntersuchung im Bax-Gen zuzuführen, das bedeutet, daß über den Nachweis von Muationen im Bax Gen auch eine diagnostische Früherkennung maligner Veränderungen möglich wird.
Das erfmdungsgemäße Verfahren eignet sich in diesem Zusammenhang insbesondere zum frühen Nachweis bzw. zur molekularen Charakterisierung von Tumoren der Lunge, von gastrointestinalen Tumoren, vorzugsweise Coton, Pankreas, und Tumoren des hämatopoetischen Systems. Vor allem für den Nachweis von Bax- Frameshift-Mutationen bei Tumoren der Lunge sowie gastrointestinaler Tumoren können nichtinvasiv gewinnbare klinische Probenmaterialien, z.B. Stuhlproben, Lavage oder auch Ausatemkondensaten, der Mutationsanalyse zugeführt werden. So konnte gezeigt werden, daß Bax-Frameshift- Mutationen nicht nur auf gastrointestinale Tumoren beschränkt sind.
Das Verfahren ist darüber hinaus auch vorteilhaft für die Untersuchung von Blut-, Speichel- , Tupfermaterialien oder Plasmaproben geeignet. Dies ist entscheidend für eine mögliche Früherkennung maligner Veränderungen und für die Planung notwendiger Therapiemaßnahmen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Testkit für die Untersuchung klinischer Proben auf Mutationen im Bax-Gen, welcher alle notwendigen Reagenzien für die Untersuchung von Mutationen im Bax-Gen enthält. Mittels eines solchen Testkits kann die DNA-Extraktion aus unterschiedlichsten Probenmaterialien und die Erzeugung eines fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmentes erreicht werden. Darüber hinaus enthält ein solcher Testkit auch notwendige Positiv und Negativkontrollen sowie eine Fragmentlängenstandard.
Der erfindungsgemäße Testkit ist gekennzeichnet durch: 1. ein DNA und/oder RNA-Extraktionssystem 2. Primermix einschließlich einem fluoreszenz-markierten Primer (z.B. einem Hexmarkierten Primer)
3. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation der Bax-Wildtypsequenz
4. Kontrollzellinen-DNA zur Amplifikation von mutiertem Bax
5. Fragmentlängenstandard (z.B. Rox-markiert) für die exakte Zuordnung der auf dem Sequenziergel aufgetrennten Amplifikate
Ein solcher Testkit erlaubt damit auch molekularbiologisch nicht hochspezialisierten Personen die Durchführung einer Bax-Gen-Diagnostik in einem Laborroutinebetrieb. Das der Erfindung zugrunde liegende Verfahren und die Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens ermöglichen es, Mutationen im Bax-Gen routinemäßig nachzuweisen. Das bedeutet einen entscheidenden Schritt für den gezielten perspektivischen Einsatz der Gentherapie zur Behandlung epithelialer Tumoren und zur möglichen Früherkennung von Tumoren. Vorgehen ist besonders vorteilhaft, wenn die Anzahl des Biopsiematerials des Tumors sehr limitiert ist. Auf Grund der höheren Kopienzahl an Bax-RNA- Molekülen kann somit sehr effizient der Nachweis geführt werden.
Dabei erfolgt die Isolierung der Total RNA der Probe in an sich bekannter Weise. Die isolierte RNA wird danach in cDNA mittels Reverstranskription umgeschrieben und kann anschließend wieder auf den Nachweis von Frameshift-Mutationen untersucht werden.
Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel dargestellt.
Beispiel
Nachweis von Insertions- oder Deletionsmutationen im Bax-Gen Bax und Bestimmung der Sensitivität an Zellinienmaterial
Für die Untersuchung wurden die Zellinien Lovo, welche im Bax Guanosintrakt (G)β eine Insertions-und eine Deletionsmutation aufweist und die Zellinie SW620 (Bax- Wildtyp) verwendet.
Die DNA-Isolierung der genomischen DNA erfolgte dabei aus den Zellinien als auch aus Zellinien-Mischungen.
Die isolierte genomische DNA wurde anschließend für die selektive Vervielfältigung des zu untersuchenden DNA-Abschnittes des Bax-Gene eingesetzt.
Für die Vervielfältigungsreaktion werden 1-5μl DNA verwendet. Für die enzymatische Vervielfältigungsreaktion wird ein Primer eingesetzt, welcher mit einer Standard- Fluoreszenzmarkierung versehen ist (Hex-Markierung). Nach der Vervielfältigungsreaktion werden 0,5 μl des erzeugten DNA-Fragmentes mit 2 μl Wasser und 2 μl Formamid gemischt und für 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Dieser Ansatz wird auf einem 6%igem denaturierenden Polyacrylamid-Sequenziergel aufgetragen und auf einem Sequenzierautomaten (ABI 373) bei 2500 V, 25 mA und 30 Watt für 2 Stunden aufgetrennt. Das Analysenergebnis ist auf der Abbildung 1 dargestellt. Die prozentualen Anteile von LoVo oder SW620 sind in Klammern angegeben.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von bösartigen Tumoren dadurch gekennzeichnet, daß man Nukleinsäuren aus klinischen Probenmaterialien isoliert und Insertions- und Deletionsmutationen im humanen Bax-Gen in einem Guanosin-Repeat-Trakt der Nukleotidregion innerhalb der kodierenden Region des Gens im Bereich der Nukleotide mit Guanosinbasen untersucht, indem man diesen DNA-Abschnitt mittels eines Primerpaares amplifiziert, wobei das Primerpaar so ausgewählt ist, daß die Amplifikationslänge zwischen 90 und 120 Basenpaaren beträgt und ein Primer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, das amplifizierte DNA-Fragment auftrennt und die Insertionen und Deletionen über die Fragmentlänge nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man genomische DNA isoliert oder RNA, wobei man die isolierte RNA nach an sich bekannten Reverstranskriptionstechniken in cDNA umschreibt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertions-und Deletionsmutationen in einem Guanosin-Repeat-Trakt der Nukleotidregion mit 8 Guanosinbasen innerhalb der kodierenden Region des Gens im Exon-3-Bereich untersucht werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Primerpaare der Sequenz: Primer 1 : 5'-TCATCCAGGATCGAGCAGG-3 Primer 2: 5'-CTCGCTCAGCTTCTTGGTGG-3 eingesetzt werden.
5. Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore auf der Basis des Nachweises von
Insertions-und Deletionsmutationen im Bax-Gen umfassend:
1.DNA oder RNA Extraktionsmodul
2. Primermix
3.Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation der Bax-Wildtypsequenz
4.Kontrollzellinen-DNA zur Amplifikation von mutiertem Bax
5. Fragmentlängenstandard
6. Testkit nach Anspruch 5 zum Nachweis von Tumoren unter Verwendung von Gewebeproben aus der Lunge, Biopsien, Lavages oder Atemluft bzw. Stuhlproben.
7. Testkit nach Anspruch 5 zum Nachweis für die molekulare Charakterisierung von soliden Tumoren, vorzugsweise gastroiπtestinalen Tumoren oder Mamma unter
Verwendung entsprechender Gewebeproben.
8. Testkit nach Anspruch 5 zum Nachweis für die molekulare Charakterisierung von hämatologischen Tumoren.
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