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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung von Endothel-Vorläuferzellen (EPCs), umfassend ein Analysieren epigenetischer Modifikationen/Eigenschaften (einschließlich des Methylierungsstatus) von mindestens einer CpG-Position im Säugetier-Genbereich für Muskelmyosin schwere Kette 11 (MYH11) und Kernverteilungsprotein nudE Homolog 1 (NDE1), wobei eine Demethylierung oder fehlende Methylierung dieser Genregion eine EPC im Vergleich zu einer Nicht-EPC anzeigt. Die erfindungsgemäße Analyse kann EPCs auf epigenetischer Ebene identifizieren und von allen anderen Zellen in komplexen Proben, wie z.B. anderen Blut-, nicht-Blut- oder Immunzellen, unterscheiden. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von EPCs, insbesondere in komplexen Proben, zur Verfügung. Das Verfahren kann ohne einen Schritt der Reinigung und/oder Anreicherung von Zellen durchgeführt werden, vorzugsweise in Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe
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Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung der oben genannten Verfahren sowie deren jeweilige Verwendung. Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein neuartiges, robusteres Mittel zur quantitativen Erkennung und Messung von EPCs des Blutes in jeglichen festen Organen, Geweben oder Körperflüssigkeiten eines Säugetiers bereitzustellen, insbesondere Nabelschnurblut.
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Hintergrund der Erfindung
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Menschliche Endothel-Vorläuferzellen (EPCs) spielen eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizin und tragen zur Neovaskularisation bei Gefäßverletzungen bei. Sie werden normalerweise aus peripherem Blut, Nabelschnurblut und Knochenmark angereichert.
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Trotzdem wurde der Begriff EPC auf viele verschiedene Zelltypen angewendet, die bei der Regeneration der Endothelauskleidung von Blutgefäßen eine Rolle spielen. EPCs zeigen variable phänotypische Marker, die zur Identifizierung verwendet wurden, und leider gibt es keine eindeutigen Marker für Endothel-Vorläufer, die nicht mit anderen endothelialen oder hämatopoietischen Zellen geteilt werden, was zu der historischen Kontroverse um das Feld beigetragen hat.
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Endothel-Vorläuferzellen sind wahrscheinlich wichtig für das Tumorwachstum und werden als kritisch für die Metastasierung und die Angiogenese angesehen. Höhere Spiegel von zirkulierenden „Endothel-Vorläuferzellen“ wurden im Blutkreislauf von Patienten nachgewiesen, prognostizierten bessere Ergebnisse und die Patienten erlebten weniger wiederholte Herzinfarkte. Weitere prospektive Funktionen sind bei der Wundheilung und Endometriose.
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Brodowski et al. (in: Preeclampsia-Associated Alteration of DNA Methylation in Fetal Endothelial Progenitor Cells. Front Cell Dev Biol. 2019 Mar 19;7:32) zeigen eine verringerte Funktion von fötalen endothelialen koloniebildenden Zellen (ECFC), einer proliferativen Untergruppe von Endothel-Vorläuferzellen (EPC) bei Präeklampsie. Sie untersuchten weiter, ob die DNA-Methylierung von fötalen EPC bei Präeklampsie beeinträchtigt wird, und ein unterschiedliches Methylierungsmuster von fötalen ECFC gegenüber Präeklampsie im Vergleich zu einer unkomplizierten Schwangerschaft wurde für insgesamt 1266 CpG-Stellen in Passage 3 und für 2362 Stellen in Passage 5 festgestellt. Zu den Schlüsselmerkmalen von primären Netzwerken die durch Methylierungsunterschiede beteiligt waren, gehörten der Zellstoffwechsel, der Zellzyklus und die Transkription sowie insbesondere Gene, die an der Zell-Zell-Interaktion und der Wnt-Signalübertragung beteiligt sind. Wir identifizierten eine Überlappung zwischen differentiell regulierten Signalwegen bei Präeklampsie und Entwicklung und Funktion des Herz-Kreislauf-Systems.
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Wang et al. (in: MeCP2-mediated epigenetic regulation in senescent endothelial progenitor cells. Stem Cell Res Ther. 2018 Apr 3;9(1):87) zeigen eine Methyl-CpG-bindendes Protein 2 (MeCP2) vermittelte seneszente EPC Dysfunktion aufgrund epigenetischer Regulation.
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Häjkovä et al. (in: CBFB-MYH11 hypomethylation signature and PBX3 differential methylation revealed by targeted bisulfite sequencing in patients with acute myeloid leukemia J Hematol Oncol. 2014 Sep 30;7:66) beschreiben ein Hypomethylierungsmuster, das für eine CBFB-MYH11 Fusion spezifisch ist, die sich aus einem inv(16) Re-Arrangement ergibt, das mit Gene assoziiert ist, die vorher als in inv(16) AML hochreguliert beschreiben wurden. Weiterhin wurde von PBX3 differentieller Methylierung gefunden, dass diese mit seiner Genexpression korreliert.
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Obwohl fast alle Zellen in einem Individuum genau das gleiche Komplement an DNA-Code enthalten, müssen höhere Organismen unterschiedliche Muster der Genexpression in den verschiedenen Gewebetypen auferlegen und beibehalten. Die meiste Genregulation ist vorübergehend, abhängig vom aktuellen Zustand der Zelle und Veränderungen in externen Reizen. Eine dauerhafte Regulierung hingegen ist eine primäre Rolle der Epigenetik - vererbbare Regulierungsmuster, die die grundlegende genetische Codierung der DNA nicht verändern. DNA-Methylierung ist die archetypische Form der epigenetischen Regulation; Sie dient als stabiles Gedächtnis für Zellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der langfristigen Identität verschiedener Zelltypen. Kürzlich wurden andere Formen der epigenetischen Regulation entdeckt. Neben der „fünften Basis“ 5-Methylcytosin (mC) kann eine sechste (5-Hydroxymethylcytosin, hmC), siebente (5-Formylcytosin, fC) und achte (5-Carboxycytosin, cC) gefunden werden (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937).
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Das primäre Ziel der erwähnten DNA-Modifikationen ist die Zwei-Nukleotid-Sequenz Cytosin-Guanin (eine „CpG-Site“); in diesem Zusammenhang kann Cytosin (C) einer einfachen chemischen Modifikation unterzogen werden, um formyliert, methyliert, hydroxymethyliert oder carboxyliert zu werden. Im menschlichen Genom ist die CG-Sequenz viel seltener als erwartet, außer in einigen relativ dichten Clustern, die als „CpG-Inseln“ bezeichnet werden. CpG-Inseln werden häufig mit Genpromotoren in Verbindung gebracht, und es wurde geschätzt, dass mehr als die Hälfte der menschlichen Gene CpG-Inseln aufweisen (Antequera und Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993).
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Die aberrante Methylierung von DNA wird häufig mit der Transformation von gesunden zu Krebszellen in Verbindung gebracht. Zu den beobachteten Effekten gehören die genomweite Hypomethylierung, die erhöhte Methylierung von Tumorsuppressorgenen und die Hypomethylierung vieler Onkogene (zusammengefasst, beispielsweise von Jones und Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999; Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002; und Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003). Methylierungsprofile wurden als tumorspezifisch erkannt (d.h. Veränderungen im Methylierungsmuster bestimmter Gene oder sogar einzelner CpGs sind diagnostische für bestimmte Tumortypen), und es gibt jetzt eine umfangreiche Sammlung diagnostischer Marker für Blasen-, Brust-, Dickdarm-, Speiseröhren-, Magen-, Leber-, Lungen- und Prostatakrebs (zusammengefasst beispielsweise von Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003).
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Für eine der kürzlich beschriebenen Modifikationen von Cytosin 5-Hydroxymethylierung, wurde die Nützlichkeit der oxidativen Bisulfitsequenzierung zur Kartierung und Quantifizierung von 5hmC auf CpG-Inseln gezeigt (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937). Hohe Spiegel an 5hmC wurden in CpG-Inseln die mit Transkriptionsregulatoren assoziiert sind und in langen, eingestreuten Kernsequenzelementen gefunden. Es wird vermutet, dass diese Regionen epigenetisch in embryonalen Stammzellen reprogrammiert werden könnten.
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WO 2012/162660 beschreibt Methoden unter der Verwendung von DNA Methylierungsarrays, die zur Identifizierung einer Zelle oder eines Zellgemischs und zur Quantifizierung von Veränderungen in der Zellverteilung im Blut oder im Gewebe sowie zur Diagnose, Prognose und Behandlung von Krankheitszuständen, insbesondere Krebs, zur Verfügung gestellt werden Die Methoden verwenden frische und archivierte Proben.
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US 2003-0143606 beschreibt eine Nukleinsäure umfassend ein mindestens 18 Basen langes Sequenzsegment der chemisch vorbehandelten DNA von 2420 Genen, die mit dem Immunsystem assoziiert sind, einschließlich des Gens MYH11 (NM002474).
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Angesichts des Vorstehenden ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes und insbesondere spezifisches und robustes Verfahren auf Grundlage der DNA-Methylierungsanalyse als überlegenes Werkzeug bereitzustellen, um einen besseren und zuverlässigeren Nachweis, Identifizierung, Unterscheidung und Quantifizierung von Endothel-Vorläuferzellen zu ermöglichen.
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Die vorliegende Erfindung löst die oben genannte Aufgabe durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Identifizierung von Endothel-Vorläuferzellen (EPC) in einer Probe, umfassend ein Analysieren des Methylierungsstatus (Bisulfit-Umwandelbarkeit) von mindestens einer CpG Position in der Säugetier- (z.B. menschlichen) Genregion für Muskelmyosin schwere Kette 11/Kernverteilungsprotein nudE Homolog 1 (MYH11/NDE1) gemäß SEQ ID Nr. 1, wobei bevorzugt die Genregion wie analysiert basierend auf/gemäß SEQ ID Nr. 2 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder ein Fehlen von Methylierung der Genregion eine EPC anzeigt, wenn mit einer nicht-EPC verglichen.
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Myosin schwere Kette 11 ist eine Komponente des Myosins des glatten Muskels, die zur Familie des schwere Kette Myosins gehört und durch das MYH11 Gen kodiert wird. Das Gen NDE1 kodiert das nudE Neuroentwicklungs-Protein 1, ein menschliches Ortholog des Ratten-NUDE1. Die zwei Gene MYH11 und NDE1 werden in gegengesetzten Richtungen transkribiert und überlappen mit ihrem 3'-Ende. Die perizentrische Inversion von Chromosom 16 [inv(16)(p13q22)] produziert ein chimäres Transkript, das für ein Protein kodiert, das aus den ersten 165 Resten vom N-Terminus des Kern-bindenden Faktors beta in einer Fusion mit dem C-terminalen Teil der glatter Muskel Myosin schweren Kette besteht und mit akuter myeloider Leukämie des M4Eo Subtyps assoziiert ist (Liu PP et al. Identification of the chimeric protein product of the CBFB-MYH11 fusion gene in inv(16) leukemia cells. Genes Chromosomes Cancer. 1996 Jun;16(2):77-87). Ein alternatives Splicing erzeugt Isoformen, die unterschiedlich exprimiert werden, wobei sich die Verhältnisse während der Muskelzellreifung verändern. Alternativ gesplicte Transkriptvarianten wurden identifiziert, die für verschiedene Isoformen kodieren.
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NDE1 ist ein Mitglied der Kernverteilung E (NudE) Proteinfamilie. Das Protein ist am Zentrosom lokalisiert und interagiert mit anderen Zentrosomkomponenten als Teil eines Multiproteinkomplexes, der die Dyneinfunktion reguliert. Dieses Protein spielt eine essentielle Rolle in der Mikrotubuli-Organisation, Mitose und neuronaler Migration. Mutationen in diesem Gen verursachen Lissencephalie 4, eine durch Lissencephalie, schwere Hirnatrophie, Mikrocephalie und schwere kognitive Behinderung charakterisierte Erkrankung. Alternatives Splicing führt zu multiplen Transkriptvarianten.
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Es gibt eine recht hohe Zahl an Genen im menschlichen Genom, die strukturell überlappen, z.B. im vorliegenden Fall der Gegenstrang-angeordneten Gene für MYH11 (ungefähr 154 kb groß und 38 Exone) und NDE1 (ungefähr 83 kb groß, 10 Exone) deren 3'-Enden für ungefähr 24 kb überlappen. Das vorliegende Amplicon AMP3968 kartiert in beiden Genen jeweils dicht vor dem letzten Intron. Daher ist die Region wahrscheinlich funktionell mit beiden Genen assoziiert, mit einer möglichen leichten Präferenz für MYH11 aufgrund dessen Beteiligung am glatten Muskel.
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Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll die Genregion die Gesamtheit der genomischen Region in Bezug auf und kodierend für MYH11/NDE1 umfassen. Daher sind Enhancer-Regionen, Promotorregion(en), Introns, Exons und nicht-kodierende Regionen (5'- und/oder 3'-Regionen) mit eingeschlossen, die zu MYH11 und/oder zu NDE1 gehören. Bevorzugt ist daher ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine CpG Position in der 5' Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, in der Promotorregion, den 5' oder 3' nicht translatierten Regionen, einem Exon, einem Intron, in der Exon/Intron-Grenze und/oder in der 3' Region stromabwärts des Transkriptionsstopps des Gens wie analysiert vorhanden ist
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Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der überraschenden Identifizierung einer Region des Gens für MYH11/NDE1 durch die Erfinder als spezifischen epigenetischen Marker, was die Identifizierung von EPC sowie die klinische Routineanwendung der Analyse ermöglicht.
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Im Kontext der vorliegenden Erfindung ermöglicht die genomische Region für Muskelmyosin schwere Kette 11/Kernverteilungsprotein nudE Homolog 1 (MYH11/NDE1) gemäß SEQ ID Nr. 1, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 2 (Amp 3968), die Identifizierung von EPCs. Überraschenderweise ist das unterscheidende Muster von Bisulfit-umwandelbaren und nichtumwandelbaren Cytosinen für EPC insbesondere und sogar exklusiv auf die genomische Region gemäß SEQ ID Nr. 1 beschränkt, wie unter der Verwendung des Amplikons gemäß SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
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Die Erfinder konnten zeigen, dass in EPCs die CpG Motive wie beschrieben fast vollständig demethyliert sind (d.h. zu mehr als 70%, bevorzugt 80%, bevorzugt zu mehr als 90% und am meisten bevorzugt zu mehr als 95%, sogar zu mehr als 98%), wohingegen dieselben Motive in nicht-EPCs nahezu vollständig und bevorzugt vollständig methyliert sind.
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Die unterschiedliche Methylierung der CpG Motive innerhalb der oben genannten Regionen ist ein wertvolles Werkzeug, um EPCs zu identifizieren, wie es erforderlich sein wird/oder zumindest von einigem Wert sein wird für die Identifizierung und Quantifizierung der Zellen in Autoimmunerkrankungen, Transplantat-Abstoßungen, Infektionserkrankungen, Krebs, Allergie, Endometriose, kardiovaskulären Erkrankungen, primären und sekundären Immundefizienzen, wie zum Beispiel HIV Infektionen und AIDS, Graft versus Host (GvH), hämatologischen Malignitäten, rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, oder einem mit zytotoxischen T Zellen zusammenhängendem Immunstatus in jedem vorhersehbaren diagnostischen Kontext. Der Test ermöglicht die Messung von EPCs ohne Reinigung oder jegliche Färbeverfahren.
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Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiterhin eine Quantifizierung der relativen Menge an EPCs, basierend auf dem Vergleichen von relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in der Region wie analysiert mit relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie zum Beispiel GAPDH. Die Quantifizierung wird daher basierend auf dem Verhältnis der Bisulfit-umwandelbaren DNA zu nicht-umwandelbarer DNA in der genetischen Region für Muskelmyosin schwere Kette 11/Kernverteilungsprotein nudE Homolog 1 (MYH11/NDE1) (z.B. von SEQ ID Nr. 1) wie hier beschreiben und analysiert erhalten. Am meisten bevorzugt basiert eine Quantifizierung der relativen Menge an EPCs auf der (bevorzugt parallelen oder gleichzeitigen) Analyse der relativen Menge an Bisulfit-umwandelbarer DNA von Zellspezifischer Region für MYH11/NDE1 und von der relativen Menge an Bisulfit-umwandelbarer DNA von Zell-unspezifischen Genen (bevorzugt als „Kontrollgene“ oder „Kontrollregionen“ bezeichnet, wie zum Beispiel, das Gen für GAPDH).
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In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse der Bisulfit-Umwandelbarkeit eine Amplifikation mit mindestens einem Primer von geeigneten Primerpaaren, die geeignet basierend auf SEQ ID Nr. 1 oder 2 aufgebaut werden können, bevorzugt Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 3 bis 12.
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Im Unterschied zu Durchflusszytometrie und mRNA Messungen, können unter der Verwendung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, die Messung(en) und Analysen unabhängig von der Reinigung, Lagerung - und zu einigem Ausmaß - auch von der Gewebequalität durchgeführt werden.
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Bevorzugt beinhaltet die Amplifikation ein Polymeraseenzym, eine PCR oder chemische Amplifikationsreaktion oder andere Amplifikationsverfahren wie dem Fachmann bekannt wie unten beschrieben, z.B. im Kontext von MSP, HeavyMethyl, Scorpion, MS-SNUPE, MethylLight, Bisulfit-Sequenzierung, Methyl-spezifischen Restriktionstests und/oder digitaler PCR (siehe, zum Beispiel Kristensen und Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009)).
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Mit der Amplifikation wird ein Amplikon der MYH11/NDE1 Genregion hergestellt, das ein besonders bevorzugtes „Werkzeug“ zur Durchführung des/der Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Konsequenterweise stellen Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 3 bis 12 oder ein Amplikon wie durch ein Primerpaar basierend auf SEQ ID Nr. 3 und 4 oder 5 und 6 oder 8 und 6 oder 10 und 11 wie hier erwähnt amplifiziert bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Daher können die Sequenzen der SEQ ID Nr. 1 bis 2 (und, falls benötigt, die dazu komplementären Sequenzen) dazu verwendet werden, Primer für Amplifikationen aufzubauen, d.h. sie dienen als „Positionsmarker“ in der Sequenz wie relevant. Ähnlich können zusätzliche Primer und Sonden basierend auf dem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 2 aufgebaut werden. Die Amplifikation kann entweder in der genomischen und/oder der Bisulfit (d.h. „umgewandelten“) DNA Sequenz stattfinden.
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Der Fachmann wird weiterhin in der Lage sein, spezifische Subsets von CpG Positionen auszuwählen, um die Menge der zu analysierenden Stellen zu minimieren, zum Beispiel mindestens eine CpG Position ausgewählt aus einer CpG Position in einem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1, und ist bevorzugt ausgewählt aus den CpG Positionen 67, 113, 132, 176, 187, 204, 224, 268, 270, 273 und 282, gegebenenfalls mit 338 und 437 in dem Amplikon 3968 gemäß SEQ ID Nr. 2, und ist weiter bevorzugt ausgewählt aus den CpG Positionen 67, 113, 132, 187, 204, 224, 268, 270 und 273 oder CpG Positionen 67, 113, 204, 224, 268, 270 und 273, beide gegebenenfalls mit 338 und 437 in einem Fragment des Amplikons AMP 3968 gemäß SEQ ID Nr. 2. Bevorzugt sind Kombinationen von CpG Positionen 67, 113, 132, 187, 204, 224, 268, 270 und 273 zur Unterscheidung von EPCs von Blutzellen. Bevorzugt sind Kombinationen von 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 Positionen, deren Analysis ausreichende Daten und/oder Information produziert, um im Kontext der vorliegenden Erfindung informativ zu sein.
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Um die Bisulfit-Umwandelbarkeit von CpG Positionen zu analysieren, kann jedes bekannte Verfahren benutzt werden, um DNA Methylierung nachzuweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse des Methylierungsstatus ein Verfahren ausgewählt aus einem Methylierungs-spezifischen enzymatischen Verdau, einer Bisulfit-Sequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotormethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE oder anderen Verfahren, die auf dem Nachweis von amplifizierter DNA beruhen. These Verfahren sind dem Fachmann alle gut bekannt und können in der jeweiligen Literatur gefunden werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren für die Routineanwendung geeignet, zum Beispiel auf einem DNA-Chip. Basierend auf der obigen Information und der jeweiligen Literatur wird der Fachmann in der Lage sein, ein Verfahren wie oben an solche Anforderungen anpassen.
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In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren ohne einen Schritt des Aufreinigens und/oder der Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt, bevorzugt unter der Verwendung von Gesamtblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Identifizierung ein Unterscheiden der EPC von allen hauptsächlichen peripheren Blut-Zelltypen und/oder nicht-Blutzellen, bevorzugt, aber nicht beschränkt auf, CD15+ Granulozyten, CD14+ Monozyten, CD8+ T Zellen, CD4+ T Zellen, CD19+ B Zellen, CD56+ NK-Zellen, CD34+ HDCs und/oder nicht-Blutzellen wie zum Beispiel von mindestens einem Zelltyp ausgewählt von Endothelzellen, glatten Muskelzellen (Aorta oder intestinal) und dermalen Fibroblasten.
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In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus einer Körperflüssigkeit eines Säugertiers, einschließlich menschlicher Blutproben, Nabelschnur-Blutprobe, oder ein Gewebe, Organ oder eine Probe an Lymphozyten oder einer gereinigten oder abgetrennten Fraktion von solchem Gewebe, Organ oder Lymphozyten oder einer Zelltyp-Probe. Bevorzugt ist das Säugetier eine Maus, Ziege, Hund, Schwein, Katze, Kuh, Ratte, Affe oder Mensch. Die Proben können geeignet vereinigt werden, falls erforderlich. Bevorzugt sind menschliche Zellen, wie zum Beispiel fötale Zellen.
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Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiter den Schritt von Schlussfolgern auf den Immunstatus des Säugetiers basierend auf den EPCs. Die EPCs können quantifiziert werden und als ein Vergleichswert verwendet werden, um weiter detaillierte Subpopulationen relativ zu quantifizieren oder sie können als ein prädiktiver und/oder Screening und/oder diagnostischer und/oder prognostischer und/oder adverse Ereignisse nachweisender Faktor verwendet werden, oder sie können dazu verwendet werden, um letztendlich diese Population nachzuweisen, um den Gesamtstatus der Immun- oder Erkrankungsaktivität zu bestimmen.
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In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung leidet das Säugetier an oder ist es wahrscheinlich, dass es leidet an Autoimmunerkrankungen, Transplantat-Abstoßungen, Infektionserkrankungen, Krebs und/oder Allergie, wie, aber nicht beschränkt auf Trypanosoma cruzi-Infektion, Malaria und HIV Infektion; Hämatologischen Malignitäten wie etwa, aber nicht beschränkt auf chronische myelogene Leukämie, Multiples Myelom, Non Hodgkin's Lymphom, Morbus Hodgkin, chronischer lymphozytischer Leukämie, Graft versus Host und Host versus Graft Erkrankung, Mycosis fungoides, Extranodalem T Zell-Lymphom, Kutanösen T Zell-Lymphomen, Anaplastischem große Zellen Lymphom, Angioimmunoblastischem T Zell-Lymphom und anderen T-Zell, B-Zell und NK-Zell-Neoplasmen, Endometriose, kardiovaskulärer Erkrankung, T Zell-Defizienzen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Lymphozytopänie, schwere kombinierte Immundefizienz (SCID), Omenn Syndrom, Knorpel-Haar Hypoplasie, erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS), und vererbbare Zustände, wie zum Beispiel DiGeorge Syndrom (DGS), Chromosomenbruch-Syndrome (CBSs), Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Sjögren Syndrom, systemische Sklerose, Dermatomyositis, primäre biliäre Zirrhose, primäre sklerodierende Cholangitis, Ulcerative Colitis, Morbus Crohn, Psoriasis, Vitiligo, bullöses Pemphigoid, Aalopekia Areata, idiopathische dilatative Kardiomyopathie, Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Grave, Hashimoto's Thyroiditis, Myasthenia Gravis, IgA Nephropathie, membranöse Nephropathie und perniziöse Anämie; und B-Zell und T-Zell kombinierte Erkrankungen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Ataxia Telangiectasia (AT) und Wiskott-Aldrich Syndrom (WAS); und Karzinomen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Brustkrebs, kolorektalem Krebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, hepatozellulärem Karzinom, Cholangiokarzinom, Melanom und Kopf und Hals Krebs.
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Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren wie oben, weiter umfassend ein Messen und/oder Überwachen der Menge der EPCs in Antwort auf chemische und/oder biologische Substanzen, die an das Säugetier verabreicht werden, d.h. in Antwort auf eine Behandlung des Patienten. Das Verfahren umfasst die Schritte wie oben und Vergleichen der relativen Menge der Zellen wie identifiziert mit einer Probe, die früher oder parallel von demselben Säugetier genommen wurde, und/oder mit einer Kontrollprobe. Basierend auf den Ergebnissen, die durch das Verfahren der Erfindung zur Verfügung gestellt werden, wird der behandelnde Arzt in der Lage sein, Schlussfolgerungen auf den Immunstatus des Patienten zu ziehen, und eine Behandlung der zugrundeliegenden Erkrankung demgemäß anzupassen.
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Bevorzugt wird das Verfahren ohne einen Schritt des Aufreinigens und/oder der Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt, bevorzugt in Gesamtblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe, oder jeder anderen biologischen Probe, die potentiell die EPCs enthält, wie z.B. eine Probe für den Zelltransfer in einen Patienten.
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Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren wie oben, weiter umfassend ein Formulieren der EPCs wie identifiziert für Transplantation in einen Patienten. Pharmazeutische Präparationen für diese Zwecke und Verfahren zu deren Herstellung werden gemäß Verfahren durchgeführt, die in der Technik der Transplantationsmedizin bekannt sind.
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Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann weiter ein Verfahren zur Behandlung eines Zustands oder Erkrankung in einem Säugetier, insbesondere in einem Menschen, umfassend ein Verfahren gemäß der Erfindung wie oben und den Schritt von Transplantieren von EPCs wie identifiziert und in Zellkultur isoliert/vermehrt in einen Patienten. Pharmazeutische Präparationen für diese Zwecke Verfahren zu deren Herstellung werden gemäß Verfahren, die in der Technik der Transplantationsmedizin bekannt sind, durchgeführt. Das Transplantat kann autolog oder allogen sein.
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Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann weiter ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention eines Zustands oder Erkrankung in einem Säugetier, insbesondere in einem Menschen, umfassend ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben einschließlich einer geeigneten Behandlung des Zustands oder der Erkrankung umfassend ein Verabreichen von chemischen und/oder biologischen Substanzen wie oben und Anpassen der Behandlung der zugrundeliegenden Erkrankung oder des Zustands basierend auf den Ergebnissen wie durch das Verfahren der Erfindung zur Verfügung gestellt. Dies kann den Schritt von Schlussfolgern auf den Immunstatus des Säugetiers basierend auf den EPCs umfassen. Die EPCs können quantifiziert werden und als ein Vergleichswert verwendet werden, um weiter detaillierte Subpopulationen relativ zu quantifizieren oder sie können als ein prädiktiver und/oder Screening und/oder diagnostischer und/oder prognostischer und/oder adverse Ereignisse nachweisender Faktor verwendet werden, oder sie können dazu verwendet werden, um letztendlich diese Population nachzuweisen, um den Gesamtstatus der Immunaktivität zu bestimmen. Diese Basis ermöglicht ein Anpassen der Behandlung, falls erforderlich. Solche Anpassungen können den Schritt von Transplantieren von EPCs wie identifiziert und in Zellkultur isoliert/vermehrt in einen Patienten wie oben umfassen und/oder eine Verabreichung von weiteren chemischen und/oder biologischen Substanzen zur Anpassung der Behandlung und/oder Prävention.
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Ein besonderes Beispiel ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention eines Zustands oder Erkrankung in einem Säugetier, insbesondere in einem Menschen, wobei zuerst ein Medikament an das Säugetier verabreicht wird. Entsprechende Medikamente und Medikamentstrategien sind bekannt, gegebenenfalls mit geeigneten Trägern und Hilfsstoffen. Daher umfasst das Verfahren dann ein Messen und/oder Überwachen der Menge an EPCs in Antwort auf das Medikament/e, das/die an das Säugetier verabreicht wird/werden. Im Falle einer unzureichenden Zahl an EPCs wird die Behandlung (hier: Medikament) angepasst, d.h. mehr Wirkstoff wird verabreicht. Das Verfahren kann wiederholt werden, bis ausreichend erwünschte Zellen (d.h. eine wesentliche Population an EPCs) nachgewiesen werden können.
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Behandlung und/oder Prävention soll hier die Heilung, Prävention oder Linderung einer Abweichung oder Fehlfunktion des Körpers betreffen, d.h. Rückführung eines Körpers in seinen gesunden Zustand.
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Pharmazeutische Präparationen für diese Zwecke und Verfahren zu deren Herstellung werden gemäß Verfahren die in der Technik einer Behandlung unter der Verwendung von chemischen und/oder biologischen Substanzen oder Transplantationsmedizin bekannt sind durchgeführt. Wieder kann das Transplantat autolog oder allogen sein.
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Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nr. 3 bis 12 oder ein Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 2.
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Noch ein anderer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Kit zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder der Überwachung von EPCs in einem Säugetier, basierend auf der Analyse der Bisulfit-Zugänglichkeit von CpG Positionen in der Genregion für Muskelmyosin schwere Kette 11/Kernverteilungsprotein nudE Homolog 1 (MYH11/NDE1), umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der Erfindung wie hier beschrieben, insbesondere ein Kit umfassend a) ein Bisulfitreagenz, und b) Materialen für die Analyse des Methylierungsstatus von CpG Positionen ausgewählt aus den CpG Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie zum Beispiel ein Oligomer ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 3 bis 12, oder ein Amplikon wie mit einem Primerpaar basierend auf SEQ ID Nr. 3 und 4 oder 5 und 6 oder 8 und 6 oder 10 und 11 oder einem Primerpaar basierend auf jeweils SEQ ID Nr. 3 und 4 oder 5 und 6 oder 8 und 6 oder 10 und 11 amplifiziert.
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Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch die Verwendung der Oligomere oder Amplikons oder eines Kit gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung und/oder zur Überwachung von EPCs in einem Säugetier wie hier beschrieben.
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Wie oben erwähnt, würden kürzlich drei neue Cytosin-Modifikationen entdeckt. Daher wird erwartet, dass zukünftige wissenschaftliche Ergebnisse früher beschriebene epigenetische Muster an Modifikation korrigieren werden. Diese früheren Muster an Cytosin-Modifikation beinhalten Bisulfit-umwandelbares (nicht-methyliertes, nicht-modifizertes) und nichtumwandelbares (methyliertes, modifiziertes) Cytosin. Beide Begriffe müssen wie beschrieben korrigiert werden. Gemäß der neuen wissenschaftlichen Ergebnisse beinhaltet (i) nicht-Bisulfit umwandelbares Cytosin 5-Methylcytosin (mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), und (ii) Bisulfit umwandelbares (d.h. die „Bisulfit-Umwandelbarkeit“) Cytosin beinhaltet 5-Formylcytosin (fC), 5-Carboxycytosin (cC), sowie nicht-modifiziertes Cytosin.
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Zusätzlich basieren frühere Erfindungen auf (i) dem Verhältnis von Bisulfit-umwandelbarem Cytosin zu gesamter Menge an Chromatin (Zelltyp-unabhängig, 100% Bisulfit-umwandelbarer DNA Locus) oder (ii) auf dem Verhältnis von Bisulfit-umwandelbarem (fC, cC, nicht-modifiziertes Cytosin) zu nicht-Bisulfit-umwandelbarem Cytosin (hmC und mC). Diese Verhältnisse charakterisieren Zelltyp, Zelldifferenzierung, Zellphase sowie pathologische Zellphasen. Daher werden neue Techniken zu neuen spezifischeren Verhältnissen führen und möglicherweise augenblickliche Zell-spezifische, Zellphasenspezifische sowie pathologische Muster von epigenetischen Modifikationen ergänzen und daher potentielle neue Biomarker definieren. Neue Verhältnisse die als Biomarker entdeckt werden, können definiert werden als:
- a = Σ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC)
- b = Σ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC),
- wobei a und b sich voneinander unterscheiden durch eine bis vier Arten an Modifikationen. Die Entdeckung von neuen DNA Modifikationen wird diese Aufzählung erweitern.
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Zum Zweck der Definition für die vorliegende Anmeldung betrifft „epigenetische Modifikationen“ in der DNA Sequenz die Terminologie von (i) Bisulfit-umwandelbarem Cytosin (5-Formylcytosin, (fC) und/oder 5-Carboxycytosin (cC)) und (ii) nicht-Bisulfit-umwandelbarem Cytosin ((einschließlich 5-Methylcytosin (mC), 5-Hydroxymethylcytosin, (hmC)). Da beide Arten von Methylierung, mC und hmC, nicht Bisulfit-umwandelbar sind, ist es nicht möglich zwischen diesen beiden zu unterscheiden. Ähnlich sind fC, cC sowie nicht-modifiziertes Cytosin Bisulfit-umwandelbar und können auch nicht voneinander unterschieden werden. Der Ausdruck „methylierte“ DNA beinhaltet mC sowie hmC. Der Ausdruck „nicht-methylierte“ DNA beinhaltet fC, cC, und nicht-modifizierte DNA. Es wird erwartet, dass neue Varianten an DNA Modifikationen in der Zukunft entdeckt werden. Jeder Typ an Modifikation wird entweder Bisulfit-umwandelbar sein oder nicht. Jedoch, da das vorliegende Verfahren verlässlich zwischen diesen zwei Gruppen unterscheidet werden diese neuen Modifikationen auch als Marker brauchbar sein.
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Weiterhin, außerhalb der Modifikationen an DNA können auch Histone posttranslationalen Modifikationen unterzogen werden, die deren Interaktionen mit DNA und Kernproteinen beeinflussen. Modifikationen schließen Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Sumoylierung, Citrullinierung und ADP-Ribosylierung. Der Kern der Histone H2A, H2B und H3 kann auch modifiziert werden. Histon-Modifikationen wirken in diversen biologischen Prozessen, wie zum Beispiel Genregulation, DNA Reparatur, Chromosomenkondensation (Mitose) und Spermatogenese (Meiose). Auch für diese Modifikationen ist ein spezifisches Muster an Modifikation für unterschiedliche Zelltypen, Zellphasen und Differenzierungsstatus spezifisch, und solch ein Muster kann auf die Bisulfit-Umwandelbarkeit oder durch ähnliche Verfahren analysiert werden, um bestimmte Zellen und Zellphasen zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine Verwendung dieser Modifikationen.
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Zusammengefasst, unter der Verwendung der MYH11/NDE genetischen Region und insbesondere des Amplikons wie hier als Marker beschrieben, identifizierten, quantifizierten und insbesondere differenzierten die Erfinder sehr spezifisch EPCs und in deren Verhältnis zu anderen Zelltypen in einer Probe, zum Beispiel zu anderen Blutzellen.
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Die Erfindung soll nun weiter in den folgenden Beispielen und mit Bezug auf die beigefügten Figuren und dem Sequenzprotokoll beschrieben werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind alle Referenzen wie hier zitiert durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
- 1 zeigt die Analyse von CpG Stellen auf Amplikon Nr. 3968 (SEQ ID Nr. 2) gemäß der Erfindung. Die Spalten in der Tabelle entsprechen den Zelltypen wie analysiert, und die Zeilen entsprechen den CpG Positionen im Amplikon wie analysiert (z.B. CpG 1, 2, usw.) mit den Positionen angegeben (AMP3968:67 entspricht CpG an Position 67 von Amplikon 3968 gemäß SEQ ID Nr. 2, ...usw.).
- 2 zeigt die genomische Region des Amplikons gemäß der vorliegenden Erfindung (SEQ ID Nr. 1, die Amplikon-Sequenz (SEQ ID Nr. 2) ist unterstrichen.
- 3 zeigt die genomische Sequenz des Amplikons gemäß der vorliegenden Erfindung (SEQ ID Nr. 2), die relevanten CpG Positionen sind fett und unterstrichen.
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SEQ ID Nr. 1 zeigt die Sequenz der MYH11/NDE1 genetischen Region, umgebend das Amplikon Nr. 3968 gemäß der vorliegenden Erfindung (siehe auch 2).
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SEQ ID Nr. 2 zeigt die genomische Sequenz von Amplikon Nr. 3968.
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SEQ ID Nrn. 3 bis 12 zeigen die Sequenzen von spezifischen Oligomeren (Primer und Sonden) gemäß der vorliegenden Erfindung.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Um EPCs zu identifizieren, wurde qPCR mit Bisulfit-umgewandelten Proben durchgeführt, die aus der menschlichen genomischen Region gemäß der Sequenz SEQ ID Nr. 1 (siehe 2), insbesondere der Region AMP3968 (unterstrichen und siehe 3) stammten.
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Für das eigentliche epigenetische Profiling der Amplikonregion in Blutzell-Subtypen waren die Immunzell-Populationen wie analysiert wie in 1 gezeigt.
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Die Bisulfit-umgewandelten Zielregionen bevorzugter qPCR-Testsysteme wie entwickelt waren:
- Oligonukleotide zur Bisulfit-Sequenzierung (5' - 3')
- Vorwärts Primer - GAAGGGTTTTGTGTGTATTTTT (SEQ ID Nr. 3)
- Rückwärts Primer - AATTTTTCTTCCTTTCATACCA (SEQ ID Nr. 4)
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Oligonukleotide des qPCR Tests (TpG Variante d.h., Demethylierungs-spezifisch; 5' - 3') - I Vorwärts Primer - CCCCAACATTTATCAAACATCAC (SEQ ID Nr. 5) Rückwärts Primer - GGGTTATAAGTTAGAGATTATAAAGTTTATG (SEQ ID Nr. 6) Sonde - AAT+TACCA+CACCACAATTAC+CATAA (SEQ ID NO: 7)*
* Ein Pluszeichen vor dem Buchstaben zeigt an, dass dies ein LNA (locked nucleic acid)-basiertes Nukleotid ist.
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Oligonukleotide des qPCR Tests (TpG Variante d.h., Demethylierungs-spezifisch; 5' - 3') - II Vorwärts Primer - ATCACAATAAACTCATTTCCTTCA (SEQ ID Nr. 8) Rückwärts Primer - GGGTTATAAGTTAGAGATTATAAAGTTTATG (SEQ ID Nr. 6) Sonde - AACTAA+TTACCACAC+CACAAT+TACC (SEQ ID NO: 9)*
* Ein Pluszeichen vor dem Buchstaben zeigt an, dass dies ein LNA (locked nucleic acid)-basiertes Nukleotid ist.
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Oligonukleotide des qPCR Tests (CpG Variante d.h., Methylierungs-spezifisch; 5' - 3')
Vorwärts Primer - CCCGACATTTATCAAACATCG (SEQ ID Nr. 10)
Rückwärts Primer - GGTTATAAGTTAGAGATTATAAAGTTTACG (SEQ ID Nr. 11) Sonde - TTACCGCGCCGCAATTACCGT (SEQ ID Nr. 12)
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Die Analyse des Demethylierungsstatus von gereinigten (Immun-) Zellpräparationen mit dem EPC qPCR Assay (TpG PU /GAPDH PU) wurde wie folgt ermittelt (Tabelle 1):
| Zelltyp | Beschreibung | Demethylierung (%) |
| EPC (Nabelschnurblut) - Probe 1 | CD31>50%, vWF>50%, CD105>50%, CD34>34%, Ac-LDL>50% | 93,7 |
| EPC (Nabelschnurblut) - Probe 2 | CD31>50%, vWF>50%, CD105>50%, CD34>34%, Ac-LDL>50% | 91,4 |
| EPC (Nabelschnurblut) - Probe 3 | CD31>50%, vWF>50%, CD105>50%, CD34>34%, Ac-LDL>50% | 103,00 |
| Endothelzellen | vWB+; CD31+; CD146+; CD 105+ | 42,4 |
| Endothelzellen | vWB+; CD31+; CD146+; CD 105+ | 30,6 |
| HSC (CD34+ Stammzellen) | CD34+ | 0,0 |
| HSC (CD34+ Stammzellen) | CD34+ | 0,0 |
| Fibroblasten | - | 5,2 |
| Fibroblasten | - | 0,0 |
| Glatte Muskelzellen | Alpha-glatter Muskel Aktin | 21,5 |
| Glatte Muskelzellen | Alpha-glatter Muskel Aktin | 16,6 |
| T Helferzellen | CD3+/CD4+/CD8- | 0,0 |
| T Helferzellen | CD3+/CD4+/CD8- | 0,0 |
| Zytotoxische T Zellen | CD3+/CD8+/CD4- | 0,0 |
| Zytotoxische T Zellen | CD3+/CD8+/CD4- | 0,0 |
| B Zellen | CD19+/IgG-/CD3-/CD27+/CD14-/CD11c-/CD16-/CD56- | 4,0 |
| NK Zellen | CD3 -/CD 56+/CD 16+ | 0,0 |
| Monozyten | CD14+ | 0,0 |
| Granulozyten | CD15++ | 0,0 |
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SEQUENCE LISTING
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- <110> Precision for Medicine GmbH
- <120> MYH11/NDE1 Region als epigenetisher Marker für die Identifizierung von Endothel-Vorläuferzellen (EPCs)
- <130> E32061DE
- <160> 12
- <170> PatentIn version 3.5
- <210> 1
<211> 1083
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 1
- <210> 2
<211> 474
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 2
- <210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 3
- <210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 4
- <210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 5
- <210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 6
- <210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 7
- <210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 8
- <210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 9
- <210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 10
- <210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 11
- <210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
- <400> 12
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.
