DE69828647T2

DE69828647T2 - Diagnostisches assay zur krebsanfälligkeit

Info

Publication number: DE69828647T2
Application number: DE69828647T
Authority: DE
Inventors: R. Eldon JUPE; F. Linda THOMPSON; Regina Resta; T. Robert DELL'ORCO
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1997-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-11-07
Also published as: US7094538B2; CA2308766C; AU744455B2; US20030073107A1; JP2002502584A; AU1385199A; EP1038026A1; CA2308766A1; EP1038026B1; DE69828647D1; WO1999024614A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen diagnostischen Assay zur Bestimmung des Risikos einer Krebserkrankung, der auf der Sequenz der 3'untranslatierten Region des Prohibitin-Gens beruht.
Hintergrund der Erfindung
Obwohl der Erfolg von Krebsbehandlungen stark von einem frühen Nachweis abhängt, werden viele Krebsarten in frühen Krankheitsstadien nicht diagnostiziert. Brustkrebs ist die zweithäufigste Ursache für mit Krebs im Zusammenhang stehende Todesfälle bei Frauen in Nordamerika. Prostatakrebs ist die häufigste, nicht die Haut betreffende maligne Erkrankung bei Männern. Das Auftreten von Prostatakrebs erhöht sich mit zunehmendem Alter schneller als jede andere Krebsform, und er führt häufig zum Tode, ohne vorher diagnostiziert zu werden. Blasenkrebs kann potentiell geheilt werden, wenn er in den frühen Stadien der Tumorentwicklung behandelt wird, aber die Rückfallraten sind hoch. Ovarialkrebs ist die häufigste Ursache von gynäkologischen Krebs-Todesfällen, wobei bei den meisten Patientinnen die Diagnose in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung gestellt wird. Lungenkrebs ist die häufigste Ursache bei Todesfällen durch Krebs und liegt in Bezug auf die Wahrscheinlichkeit des Auftretens bei Männern an zweiter Stelle hinter Prostatakrebs und bei Frauen an dritter Stelle hinter Brust- und Kolorektalrebs.
Ein fortgeschrittener Bereich bei der Früherkennung von Krebs hat sich auf die Identifikation von Tumorsuppressor-Genen konzentriert. Es wurde gezeigt, daß Tumorsuppressor-Gene die Entwicklung vieler Krebsformen regulieren. Beispielsweise konnte in Zellinien und/oder Tumorproben von Brust-, Prostata- und Ovarialkarzinoma eine unnormale Expression eines mutierten p53-Tumorsuppressor-Gens gezeigt werden.
Rubin, et al., „Two prostate carcinoma cell lines demonstrate abnormalities in tumor suppressor genes," J Surg Oncol 46:1-6 (1991); Munshi, et al., „p53 molecule as a prognostic marker in human malignancies," J La State Med Soc 150:175-178 (1998); Suzuki, et al., „Loss of heterozygosity on chromosome 6q27 and p53 mutations in epithelial ovarian cancer," Med Oncol 15:119-123 (1998). Keimbahnmutationen wurden bei Patienten mit Brust- und Ovarialkrebs sowohl im BRCA1- als auch im BRCA2-Gen gefunden. Randall, et al., „Germline mutations of the BRCA1 and BRCA2 genes in a breast and ovarian patient," Gynecol Oncol 70:432-434 (1998).
Das antiproliferative humane Prohibitin-Gen, das sich auf Chromosom 17q21 befindet (White, et al., „Assignment of the human prohibition gene (PHB) to chromosome 17 and identification of a DNA polymorphism), wurde im Zusammenhang mit verschiedenen Krebsarten untersucht," Genomics 11:228-230 (1991)). In einer Studie wurde eine große Anzahl humaner Tumore der Brust, Ovarien, Leber und Lunge bezüglich somatischer Mutationen im Prohibitin-Gen untersucht, und obwohl bei ein paar sporadischen Brustkrebsfällen Mutationen gefunden wurden, wurden keine bei irgendeiner der anderen Krebsarten identifiziert. Sato, et al., „The human prohibitin (PHB) gene family and its somatic mutations in human tumors," Genomics 17:762-764 (1993). Cliby et al. zeigten auch, daß das Prohibitin-Gen keine Rolle bei der Ovarialkarzinogenese spielt. Cliby, et al., „Absence of prohibitin gene mutations in human epithelial ovarian tumors," Gynecol Oncol 50:34-37 (1993). Asamoto und Cohen zeigten, daß Prohibitin-Überexpression aber nicht Mutation im frühen Stadium der Ratten-Blasenkarzinogenese involviert war. Asamoto, M. und Cohen, S.M., „Prohibitin gene is overexpressed but not mutated in rat bladder carcinomas and cell lines," Cancer Lett 83:201-207 (1994).
Obwohl Prohibitin ein initiales Kandidaten-Gen für einen familiären Brust- und Ovarialtumorsuppressor-Lokus war, was auf einem häufigen Verlust von Heterozygozität in dieser Region bei Fällen von familiärem und sporadischen Brustkrebs beruhte (Sato, et al., „The human prohibitin gene located on chromosome 17q21 in sporadic breast cancer," Cancer Res 52:1634-1646 (1992)), resultierten Positional-Cloning-Studien in der Identifizierung von BRCA1 und nicht Prohibitin als familiäres Brustkrebs-Gen auf Chromosom 17 (Miki, et al., „A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1," Science 266:66-71 (1994)). Zusätzliche Studien haben keine somatischen Mutationen in der für das Prohibitin-Protein kodierenden Region in Fällen von familiärem/vererbtem Brustkrebs identifiziert, was darauf hindeutet, daß die proteinkondierende Region bei Brustkrebs nicht häufig mutiert ist. Sato et al., Genomics 17:762-764 (1993).
In WO 96/40919 identifizierten Dell'Orco et al. Mutationen in der 3'untranslatierten Region (3'UTR) des Prohibitin-Gens (SEQ ID NO:1), die ein diagnostischer Hinweis auf ein erhöhtes Risiko einer Krebserkrankung und insbesondere auf Brustkrebs sind. Es wurden die Vollängen-cDNAs der Brustkrebs-Zellinien BT-20, MCF7 und SK-BR-3 sequenziert und die auf die 3'UTR beschränkten Mutationen identifiziert. Bei diesen drei Zellinien war auch die Zellzyklus-Progression angehalten wenn Vollängen-Prohibitin Transskript durch Mikroinjektion eingeführt wurde. Alle waren auch homozygot für das B-Allel. Verglichen mit der Sequenz der Wildtyp-Prohibitin 3'UTR (WT) (SEQ ID NO:1) wurden zwei Punktmutationen bei BT-20 gefunden: G (Guanin) zu A (Adenin) an Position 758 und T (Thymin) zu C (Cytosin) an Position 814. MCF7 hatte ebenfalls zwei Punktmutationen: G zu A an Position 236 und C zu T an Position 729. SK-BR-3 zeigte 26 Punktmutationen, einschließlich einer Veränderung von C zu T in Position 729. MCF7 und SK-BR-3 hatten demnach beide eine Mutation von C zu T an Position 729.
In WO 98/20167 offenbarten Jupe et al., im Gegensatz zu den Lehren früherer Arbeiten auf dem Prohibitingebiet, daß diese Veränderung von C zu T an Position 729 nicht das Resultat einer somatischen Mutation darstellt, sondern vielmehr das Resultat einer natürlichen allelischen Variation an diesem Punkt ist, d.h. daß es sich um einen Keimbahnpolymorphismus handelt. Weiterhin ist es ein Keimbahnpolymorphismus, der als Suszeptibilitätsmarker für Brustkrebs verwendet werden kann. Träger des T-Allels (C/T) haben ein etwa zweifach erhöhtes Risiko Brustkrebs zu entwikkeln. Weiterhin zeigen Daten, daß die Häufigkeit für das homozygote Auftreten von 729-T bei Brustkrebspatientinnen in etwa vier- bis fünfmal höher zu sein scheint als bei nichtbetroffenen Frauen, daß 4% aller Fälle von Brustkrebs sich bei Frauen entwickeln, die homozygot T/T sind (die wohl weniger als 1% der nichtbetroffenen Frauen ausmachen) und daß deren Risiko, im Laufe des Lebens Brustkrebs zu entwickeln, etwa 50% beträgt.
Es wurde nun gefunden, daß das Prohibitin-Gen, das auf Chromosom 17q21 in der Nähe des BRCA1-Locus lokalisiert ist, einen Keimbahnpolymorphismus in der 3'UTR aufweist, der als Suszeptibilitätsmarker für andere Krebsarten verwendet werden kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 illustriert die 5'-3'-Sinn-Sequenz der Wildtyp-Prohibitin 3'UTR und die Lage der Primer (unterstrichen), die für einen AflIII Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)-Assay zur Genotypsisierung eingesetzt werden können. Der Assay wird in zwei Schritten durchgeführt, wobei das initiale Primer-Paar P1/P2 zur PCR-Amplifikation verwendet wird.
Die initialen PCR-Reaktionsprodukte werden dann auf einem 2,5% Agarosegel laufengelassen, und die 852 bp Bande wird ausgeschnitten und aufgereinigt. Das 852 bp Fragment wird mit einem der Primer-Sätze P3/P2 oder P4/P2 als Templat in einer PCR-Reaktion eingesetzt, um ein Subfragment herzustellen. Dieses Subfragment wird mit Microspin-Säulen (Pharmacia) aufgereinigt und mit AFlIII verdaut. Die Primer P1, P3 und P4 sind allesamt Sinn-Primer. Primer P2 ist ein Antisinn-Primer, dessen Sequenz 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (SEQ ID NO:2) ist.
2 illustriert die 5'-3'-Sinn-Sequenz des Prohibitin-Gens, die in Intron 6 beginnt, die proteinkodierende Region von Exon 7 enthält und sich bis zum Ende der 3'UTR fortsetzt. Die Primer P1' (SEQ ID NO: 3) (vorwärts) und P2 (SEQ ID NO: 2) (rückwärts) werden dazu verwendet, um das PCR-Fragment zu synthetisieren, das für einen AFlIII RFLP Genotypisierungs-Assay verwendet wird. Das 1237 bp Fragment (von Position 93 bis Position 1328 in 2), das synthetisiert wird, wird mit AflIII verdaut, um den Genotyp zu bestimmen. Das Symbol "*" ist unter dem Nukleotid, das den Beginn der 852 bp 3'UTR kodierenden Sequenz markiert (1), und die Zahlen rechts von der Sequenz bezeichnen die Basennummer für die 852 bp 3'UTR kodierende Sequenz. Das Symbol "++++++" ist unter der Lage der konstitutiven AflIII Stelle, während das Symbol "******" unterhalb der Lage der polymorphen Stelle ist. Spaltung durch AflIII geht verloren, wenn die Stelle ATGTGT ist. Der C zu T Polymorphismus tritt an Position 729 in der 852 bp UTR (1 und SEQ ID NO:1) und an Position 1205 in dieser Sequenz (2 und SEQ ID NO:9) auf. Diese Abbildung zeigt weiterhin den VorwärtsP3'-Primer (SEQ ID NO: 4) und den Rückärts-P4'-Primer (SEQ ID NO: 5), die verwendet werden, um die 442 bp Sonde zu synthetisieren, die in Southern Blotting-Experimenten verwendet wird, die in Beispiel 1 beschrieben sind. 3 zeigt die diagnostischen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismusanalyse (RFLP)-Muster, die mit dem PCR Assay erhalten wurden, der in 2 beschrieben ist.
Die illustrierten Genotypen sind folgende: 1-C/C; 2-C/T; 3-T/T. Die beobachteten Größen der Fragmente sind links neben der Abbildung gezeigt. Das 671 bp Fragment ist allen Genotypen gemein. Das Muster, das hier für die 566 bp und 442 bp Fragmente gezeigt ist, wird auch bei genomischen Southern Blots beobachtet, wenn die 442 bp Sonde verwendet wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es wurde ein einfacher Test entwickelt, um die Suszeptibilität eines Individuums zu bestimmen während seiner Lebenszeit Krebs zu entwickeln, der auf den Häufigkeiten der C/C, C/T und T/T Keimbahngenotypen an Position 729 (wie in 1 der Anmeldung definiert) in der Prohibitin 3'UTR bei Kontrollen und Krebsfällen basiert. Die Bestimmung des Keimjbahn-Prohibitin-Gentoyps eines Individuums in Bezug auf Position 729 der 3'UTR stellt ein Vorhersageinstrument für die Wahrscheinlichkeit eines Individuums, Krebs zu entwickeln, zur Verfügung; d.h. ob das Individuum homozygot Thymin (T/T) oder homozygot Cytosin (C/C) oder heterozygot (C/T) an Position 729 ist.
Um den Genotyp eines Individuums an Position 729 zu bestimmen, kann genomische DNA aus einer großen Vielzahl von Patientenproben mit Standardtechniken isoliert werden. Vorzugsweise wird die genomische DNA entweder aus Blut oder bukkalen Zellabstrichen isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Im Anschluß an die Präparation der genomischen DNA muß die Region, die die Base 729 der Prohibitin 3'UTR enthält, amplifiziert werden, oder die genomische DNA kann direkt verdaut werden (Beispiel 1). Wie die Präparation der genomischen DNA kann auch dies mit einer großen Vielzahl von Standardtechniken durchgeführt werden. Vorzugsweise wird diese Region mit Polymerase-Kettenreaktion ("PCR")-Techniken amplifiziert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Vorzugsweise wird im Anschluß an die PCR-Amplifizierung eine Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus ("RFLP")-Analyse durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Diese Analyse beruht darauf, daß die Substitution von C durch T an Position 729 der 3'UTR im Verlust der Spaltbarkeit durch die Restriktions-Endonuklease AflIII in deren Sechs-Basen-Erkennungsregion, die Position 729 überspannt, resultiert. Alternativ könnte die PCR-amplifizierte Sequenz an Position 729 auch mit jedem anderen Mittel zur Unterscheidung von Sequenzvarianten bestimmt werden, wie durch direkte Sequenzierung unter Verwendung von AmpliCycle^TM PCR Kit (Perkin Elmer) oder Southern Blotting.
Die Möglichkeit zur genauen Bestimmung des Genotyps eines Individuums in Bezug auf Position 729 dient einer Vielzahl von nützlichen Zwecken. Zu allererst, wie bereits oben beschrieben, stellt es ein Mittel zur Verfügung, mit dem die Wahrscheinlichkeit eines Individuums, während seiner Lebenszeit Krebs zu entwickeln, vorhergesagt werden kann. Bei denen, bei denen ein erhöhtes Risiko diagnostiziert wird, könnte eine erhöhte Aufmerksamkeit bezüglich des erhöhten Risikos im Zusammenhang mit häufigeren Untersuchungen zu einer früheren Erkennung des Krebses und höheren Überlebenschancen führen. Das wäre besonders nützlich für die Neugeborenen bis 40-Jährigen, die im Allgemeinen bisher nicht auf Krebsentwicklung untersucht werden.
Der Assay könnte ferner im Rahmen der genetischen Beratung eingesetzt werden. In Fällen, bei denen beide Eltern homozygot für das T-Allel (T/T an Position 729) sind, beträgt die Wahrscheinlichkeit für die Geburt eines Kindes mit dem T/T-Genotyp 100. Im Gegensatz dazu beträgt in Fällen, bei denen beide Eltern homozygot für das C-Allel (C/C an Position 729) sind, die Wahrscheinlichkeit für die Geburt eines Kindes mit dem T/T-Genotyp 0%.
Wenn nur ein Elternteil homozygot für das T-Allel ist, oder wenn ein oder beide Elternteile heterozygot (C/T an Position 729) sind, liegt die Wahrscheinlichkeit für die Geburt eines Kindes mit dem T/T-Genotyp irgendwo zwischen diesen beiden Extremen und kann gemäß klassischer Mendelscher Genetik bestimmt werden. In Abhängigkeit von ihren Genotypen könnten die Eltern eines Kindes dann den Genotyp des Kindes als Neugeborenes oder selbst pränatal bestimmen lassen. Diese Information könnte dann, wie oben beschrieben, verwendet werden, um einen optimalen Untersuchungsplan festzulegen, um frühe Erkennung und Behandlung von Krebs sicherzustellen.
Dieser Assay könnte ferner zur Krebsprognose, zur Vorhersage eines krankheitsfreien Intervalls, zur Vorhersage der Langzeitüberlebensrate und zur Festlegung der Therapie sowohl bei Frauen als auch bei Männern eingesetzt werden.
Prostatakrebs
Tabelle I zeigt Keimbahn-Prohibitin-Genotypen für Prostatakrebspatienten und männliche Kontrollen. Das Durchschnittsalter ± Standardabweichung für die Kontroll- bzw. Patientengruppe betrug 41,2 ± 13,6 und 73,9 ± 8,4 Jahre. Die Mehrheit der Patienten und Kontrollen (95%) sind kaukasische Männer, die in Oklahoma ansässig sind. Das potentielle relative Risiko von Prostatakrebs wurde im Sinne des Odds Ratio (OR) bestimmt.
Tabelle I: Genotyp- und Allelhäufigkeiten von 3'UTR-Varianten bei Prostatakrebsfällen und der männlichen Kontrollen^a
Ein geschätztes, kombiniertes Odds Ratio für Subjekte, die C/T haben, und Subjekte, die T/T haben, d.h. T-Träger, wurde ebenfalls berechnet als OR_T = [(Anzahl der Prostatakrebspatienten mit C/T + Anzahl der Prostatakrebspatienten mit T/T) × (Anzahl der nicht betroffenen Subjekte mit C/C)] – [(Anzahl der Prostatakrebspatienten C/C) × (Anzahl der nicht betroffenen Subjekte mit C/T + Anzahl der nicht betroffenen Subjekte mit T/T)], d.h. (9 × 25) ÷ (6 × 12) = 3,13. Obwohl die berechneten Odds Ratios in Abhängigkeit von der untersuchten Populationsgrösse schwanken könnten, wird erwartet, daß die hier offenbarten Ratios nützliche Richtwerte in Bezug auf das Risiko darstellen.
Ovarialkrebs
Tabelle II zeigt Keimbahn-Prohibitin-Genotypen bei Ovarialkrebspatientinnen und weiblichen Kontrollen. Das Durchschnittsalter ± Standardabweichung für die Kontrolle bzw. die Fälle betrug 40, 0 ± 12, 44 und 62, 3 ± 13, 7 Jahre. Die Mehrheit der Fälle bzw. Kontrollen (95%) sind kaukasische Frauen die ansässig in Oklahoma sind. Das potentielle relative Risiko von Ovarialkrebs wurde ebenfalls im Sinne des Odds Ratio (OR) untersucht.
Ein geschätztes, kombiniertes Odds Ratio für Subjekte, die C/T haben, und Subjekte, die T/T haben, d.h. T-Träger, wurde ebenfalls berechnet als OR_T = [(Anzahl der Ovarialkrebspatientinnen mit C/T + Anzahl der Ovarialkrebspatientinnen mit T/T) × (Anzahl der nicht betroffenen Subjekte mit C/C)] – [(Anzahl der Ovarialkrebspatientinnen C/C) × (Anzahl der nicht betroffenen Subjekte mit C/T + Anzahl der nicht betroffenen Subjekte mit T/T)], d.h. (7 × 67) – (7 × 29) = 2,31. Wiederum, obwohl die berechneten Odds Ratios in Abhängigkeit von der untersuchten Populationsgrösse schwanken könnten, wird erwartet, daß die hier offenbarten Ratios nützliche Richtwerte in Bezug auf das Risiko darstellen.
Tabelle II: Genotyp- und Allelhäufigkeiten von 3'UTR-Varianten bei Ovarialkrebspatientinnen und weiblichen Kontrollen^a
Ein diagnostischer Assay zur Bestimmung des Keimbahn-Prohibitin-Genotyps eines Patienten in Bezug auf Position 729 der Prohibitin-3'UTR, wie in SEQ ID NO: 1 angegeben, kann dazu verwendet werden, um die Suszeptibilität eines Patienten für alle Krebstypen vorherzusagen. Zu den Kandidaten für den diagnostischen Assay zählen die generelle Bevölkerung und im Besonderen Individuen, die von Krebsfällen in der Familiengeschichte berichten. Ferner kann ein Screening von Sequenzen aus Tumoren oder Zelllinien auf Anderungen an Position 729 aus der Wildtyp-Prohibitin-3'UTR dazu verwendet werden, um Individuen zu identifizieren, bei denen der Krebssuszeptibilitäts-Assay zweckdienlich ist. Beispielsweise wäre ein Patient, von dem die mit T98G bezeichnete Glioblastom-Zelllinie abgeleitet wurde, die eine C → T Änderung an Position 729 zeigt (Jupe et al., „The 3'untranslated region of prohibitin and cellular immortalization," Exp Cell Res 224:128-135 (1996)), ein Kandidat für den diagnostischen Assay bezüglich der Suszeptibilität für andere Krebstypen.
Als ein weiteres Beispiel wurde die 852 Basen-Prohibitin-Wildtypsequenz (Genbank Zugangsnummer U49725) als Suchanfragesequenz in einem BLASTN search (Altschul, et al., „Basic local alignment search tool," J Mol Biol 215:403-410 (1990)) gegen die nicht redundante Datenbank von expressed sequence tags (ESTs) verwendet. Bei dieser Suche wurden drei ESTs aus dissektierten Tumoren identifiziert, die potentiell Produkte des T-Allels an Position 729, wie durch SEQ ID NO: 1 definiert, der Prohibitin-3'UTR waren. Diese drei ESTs sind in Tabelle III weitergehend identifiziert. Weiterhin ist eine Sequenz aus einer humanen Karzinomzelllinie (T84 in Tabelle III), die von einer Lungenmetastase eines Kolonkarzinoms abgeleitet wurde, das Produkt eines T-Allels, das außerdem zusätzliche Änderungen in der 3'UTR aufweist. Das Vorhandensein des T-Allels an Position 729 in diesen Tumoren und der Zelllinie zeigt eine Änderung der 3'UTR an, die entweder eine somatische Mutation oder einen Keimbahnpolymorphismus darstellt. Durch Anwendung des Krebssuszeptibilitäts-Assays der vorliegenden Erfindung könnten die Patienten von denen diese Tumore bzw. Zelllinie abgeleitet wurden, untersucht werden, um den Keimbahn-Prohibitin-Genotyp in Bezug auf Position 729 der Prohibitin 3'UTR, wie in SEQ ID NO:1 definiert, zu bestimmen. Wenn ein Keimbahnpolymorphismus an Position 729 eindeutig nachgewiesen wird, würde das die erhöhte Suszeptibilität des Patienten für alle Krebstypen vorhersagen.
Tabelle III: ESTs mit dem T-Allel der Prohibitin-3'UTR
Beispiel 1: Methodologie des diagnostischen Assays
Im Folgenden wird der diagnostische Assay zur Bestimmung der Krebssuszeptibilität auf der Basis der Sequenz der 3'UTR des Prohibitin-Gens beschrieben. Der Assay ist für alle Krebsarten anwendbar.
Probennahme
Blutproben (ungefähr 10 ml) wurden auf dem Wege einer Routine-Venenpunktur in Antikoagulans enthaltende Röhrchen gesammelt.
Bukkale Zellabstriche wurden unter Verwendung steriler Zytologie-Bürsten gesammelt (Typ H-Histobrush, 174-600; Spectrum Laboratories, Dallas, TX). Der Studienteilnehmer wurde instruiert, die Bürste auf der inneren Wange für 30 Sekunden auf beiden Seiten umherzudrehen. Die Bürste wurde dann in ein steriles Sammelröhrchen eingeführt, eng verschlossen und bei 4°C bis zur DNA-Templatpräparation aufbewahrt.
DNA-Präparation
Die DNA aus den Blutproben wurde mit Hilfe des PureGene Kit (Gentra, Minneapolis, MN) präpariert.
Die DNA aus den bukkalen Zellabstrichen wurde mit einer Methode isoliert, wie von Horrigan et al., „Polymerase chain reactionbased diagnosis of Del(5q) in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome identifies a minimal deletion interval," Blood 88:2665-2670 (1996), beschrieben, welche eine Modifikation einer Methode ist, die ursprünglich von Richards et al., „Multiplex PCR amplification from the CFTR gene using DNA prepared from buccal brushes/swabs," Hum Mol Genet 2:159-160 (1993), veröffentlicht wurde.
Die Zytologie-Bürste wurde in ein 1,5 ml Röhrchen überführt, das 0, 6 ml einer 50 mM sterilen NaOH-Lösung enthielt. Der Stiel der Bürste wurde abgeschnitten und der Deckel verschlossen. Nach Vortexen für 30 Sekunden wurde die Probe für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Das Röhrchen wurde wieder gevortext und verbliebene Flüssigkeitsreste wurden von der Bürsten ablaufen gelassen, bevor diese aus dem Röhrchen entfernt wurde. Die Lösung wurde durch den Zusatz von 0,06 ml 1 mM Tris, pH=8,0 neutralisiert. Nach gründlicher Durchmischung wurde die Probe bei –20°C gelagert. Der Assay kann außerdem an DNA mit hohem Molekulargewicht durchgeführt werden, die aus Haut, aus Haarfolikeln, und aus nahezu jeder anderen Gewebsquelle sowie aus Fibroblasten oder Lymphoblasten-Zellinien aufgereinigt wurde. In diesem Falle kann die DNA mit Hilfe des PureGene Kits (Gentra, Minneapolis, MN) oder irgend einer ähnlichen Methode entsprechend den Herstellerangaben aufgereinigt werden.
Polymerase Kettenreaktion
Die PCR-Reaktionen wurden mit 0,1 μg der aus Blut aufgereinigten genomischen DNA oder 0,010 ml des bukkalen Zellabstrichextrakts mit Hilfe von Taq Gold Polymerase durchgeführt (Perkin Elmer, Foster City, CA). Die verwendeten Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 10 mM Tris-HCl, pH=8,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl, 100–200 μM von jeweils dATP, dGTP, dTTP, und dCTP, 0,1% Triton X-100, 0,5–1,0 Einheiten Taq Gold Polymerase, und 100 ng von jedem Primer in einem 50-μl Reaktionsgemisch.
In einer Form des Assays, wie in 1 und SEQ ID NO: 1 dargestellt, wird eine 852 bp 3'UTR, die mit den Primern 5'-CCCAGAAATCACTGTG-3' (Primer P1, Sinn) (SEQ ID NO: 6) und Primer P2 (SEQ ID NO: 2) synthetisiert wurde, in einem Gel aufgereinigt, und ein sekundäres PCR-Produkt wird mit den Primern 5'-TGAGTCCTGTTGAAGACTTCC-3' (Primer P3, Sinn) (SEQ ID NO: 7) und 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (Primer P2, Antisinn) (SEQ ID NO:2) synthetisiert.
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analysen
Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe des Restriktionsenzyms AflIII unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Puffers und der Reaktionsbedingungen verdaut (New England Biolabs, Cambridge, MA). Alle Verdaue bei einer Gruppe einzelner Proben wurden mit Hilfe eines verdünnten Master-Mixes durchgeführt. Jede Serie von Verdauen enthielt Kontrollen mit bestätigter Sequenz. Die Verdauprodukte wurden auf 20% Polyacrylamid-Gelen mittels Elektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und durch ultraviolettes Licht visualisiert.
Alternativ wurden hochmolekulare DNAs, die mit dem PureGene Kit aufgereinigt worden waren, in Bezug auf Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen mittels Southern Blotting analysiert. Im Allgemeinen wurden 10–15 μg DNA mit dem Restriktionsenzym AflIII (New England Biolabs) bei 37°C für 16 Stunden unter Verwendung des vom Hersteller gelieferten Puffers verdaut. Die Verdaue wurden beendet, indem die DNA durch Zusatz von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat und 2 Volumina absoluten Ethanols gefällt wurde. Im Anschluß an die Resuspension in Wasser und den Zusatz von Ladefarbstoff (Promega 6X) wurden die Proben in ein 1% Agarose-Gel geladen, und es wurde eine Elektrophorese durchgeführt, bis der Bromphenolblau Ladefarbstoff das untere Ende des Gels erreicht hatte. Die Gele wurden dann für 30 Minuten in 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl denaturiert und anschließend neutralisiert in 0,5 M Tris/1,5 M NaCl (pH=7,0). Ein Southern Blot wurde dann durch Kapillartransfer auf eine Hybond Membran durchgeführt (Amersham, Arlington Heights, IL). Die DNA wurde dann auf der Membran fixiert, entweder durch Erhitzen auf 80°C oder durch Kreuzverknüpfen mit ultraviolettem Licht.
Der RFLP wurde durch Sondierung mit einem Nukleinsäurefragment, das die Prohibitin 3'UTR enthielt, detektiert. Die routinemäßig verwendete Sonde war ein 442 bp Nukleinsäurefragment, das unmittelbar 5' von der polymorphen AflIII Schnittstelle liegt. Sie wurde mittels PCR unter Verwendung eines Vollängen 3'UTR-Klons als Templat und den Primern P3' und P4' (2) synthetisiert. Die Sonde wurde mit einem Random Primer Labeling Kit (Pharmacia, Piscataway, NJ) markiert. Die Membranen wurden wenigstens 12 Stunden bei 65°C hybridisiert und bei der gleichen Temperatur unter hoher Stringenz gewaschen. Mit dem Filter wurde anschließend ein Röntgenfilm oder ein Phosphoimager-Schirm belichtet, um den RFLP zur Interpretation abzubilden. Alternativ kann ein 124 bp Fragment 3' der polymorphen AflIII Stelle und auch das mit den Primern P3' und P2 (2) synthetisierte 566 bp Fragment als Sonde verwendet werden. Jede dieser Sonden zeigt einen RFLP, der die verschiedenen Genotypen unterscheidet. Southern Blots die mit der 442 bp Sonde untersucht wurden zeigten das 566 bp und 442 bp Bandenmuster, das in 3 abgebildet ist.
Die Substitution von C durch T an Position 729 (1) in der 3'UTR hat einen Verlust der Spaltbarkeit durch AflIII an dessen Sechs-Basen-Erkennungssequenz zur Folge. Unsere Analysen mutierter Tumore, Krebszellinien und bukkaler Zellabstriche von Krebspatienten, die homozygot T sind, zeigen, daß die Veränderung von C zu T an 729 die einzige bisher entdeckte Veränderung in der Erkennungssequenz ist, die für den Verlust des AflIII-Schneidens verantwortlich ist. Bei Individuen, die homozygot C sind, werden beide Allele am polymorphen Ort geschnitten, während bei Individuen, die homozygot T sind, die Allele nicht geschnitten werden. Heterozygote Individuen haben je einen Allel mit C und T.
Beispiel 2: Alternative diagnostische Assaymethode
Ein alternativer Assay wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß das sekundäre PCR-Produkt unter Verwendung des Sinn-Primers P4, 5'-GGATGGACTTGTATAG-3' (SEQ ID NO: 8) und des Antisinn-Primers 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (Primer P2, Antisinn) (SEQ ID NO: 2) synthetisiert wurde.
Beispiel 3: Alternative diagnostische Assaymethode
Ein alternativer Assay wurde ausgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die verwendeten Primer, wie es in der in 2 und SEQ ID NO: 9 angegebenen 1237 bp genomischen Sequenz illustriert ist, 5'-AAGGTGGCTTTCTGGTGAAG-3' (Primer P1', Sinn) (SEQ ID NO: 3) und 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (Primer P2, Antisinn) (SEQ ID NO: 2) waren. In diesem Assay unter Verwendung von SEQ ID NO: 9 entspricht die Base an Position 1205 der Position 729 in SEQ ID NO: 1.
3 illustriert die Bandenmuster, die für jeden Genotyp in diesem Assay erzeugt werden. Das RFLP-Muster bei einem Individuum, das homozygot für C ist (C/C), zeigt unter Verwendung des Sinn-Primers SEQ ID NO: 3 und des Antisinn-Primers SEQ ID NO: 2, daß bei beiden DNA-Strängen die 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII-Schnittstelle bis zum Ende der 3'UTR, an Position 729/1205 in zwei distinkte Banden von 442 bp und 124 bp geschnitten wurden. Ein Individuum, das homozygot für T ist (T/T), erzeugte eine Bande bei 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII Schnittstelle bis zum Ende der 3'UTR, welche an Position 729/1205 auf beiden DNA-Strängen ungeschnitten blieb. Das heterozygote Individuum (C/T) ergab drei distinkte Banden, die zeigen, daß bei dem einem DNA-Strang die 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII Schnittstelle bis zum Ende der 3'UTR, an Position 729/1205 in zwei distinkte Banden von 442 bp und 124 bp zerschnitten wurde und daß beim anderen DNA-Strang eine Bande von 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII Schnittstelle bis zum Ende der 3'UTR, an Position 729/1205 nicht geschnitten wurde. In diesem Assay ist eine Bande, die allen Genotypen gemeinsam ist, das 671 bp Fragment, gemessen vom 5'-Ende des PCR-Produkts zur konstitutiven Schnittstelle.
Diese Methode erfordert eine einzige PCR-Reaktion und einen AflIII-Verdau und zeigt 100%ige Korrelation mit Southern Blot-Ergebnissen.
Beispiel 4 – Alternative Ansätze
Der Vorhersagewert dieses Assays involviert die Bestimmung des Keimbahngenotyps eines Individuums an Position 729 der Prohibitin 3'UTR. Es gibt viele potentielle spezifische Methoden, die dazu verwendet werden können, diese Aufgabe auszuführen. Wir haben zur Erfassung unserer Daten in erster Linie den in Beispiel 1 beschrieben RFLP und DNA-Sequenzierung verwendet. Zur Detektion des Polymorphismus kann jedoch jede andere Methode auf der Grundlage von Einzelbasen-Oligonukleotid mismatch screening (Jupe, E.R. und Zimmer, E.A., „Assaying differential ribosomal RNA gene expression with allele-specific oligonucleotide probes," in Methods in Enzymology-Molecular Evolution: Producing the Biochemical Data, Academic Press, Seiten 541–552, 1993), allelenspezifische PCR–Amplifikation (Allen, et al., BioTechniques 19:454 (1995); Ault, G., J Virological Methods 46:145-156 (1994); Tada, M., Cancer Research 53:2472-2474 (1993); Huang, Nucleic Acids Research 20:4567-4573 (1992); Sommer, BioTechniques 12:82-87 (1992); und Kwok, Nucleic Acids Research 18:999-1005 (1990)), oder eine Methode unter Verwendung einer hochspezifischen thermostabilen Ligase (Ampligase, Epicenter Technologies) eingesetzt werden.
Darüber hinaus kann jede Methode, die gegenwärtig verwendet wird, wie Einzelstrang-Konformationspolymorphismen oder denaturierende Gradient-Gel-Elektrophorese oder jede andere Methode, die in der Zukunft zur Detektion von Einzelbasenveränderungen entwickelt wird, verwendet werden um diese Genotypen zu detektieren. Dieser Test könnte auch ausgehend von RNA unter Verwendung einer Vielzahl von gegenwärtig verwendeten Techniken oder einer Methode, die in der Zukunft entwickelt wird, um Einzelbasenveränderungen zu detektieren, durchgeführt werden. Beispielsweise könnte die RNA direkt durch Sequenzierung analysiert werden oder mittels reverser Transkriptase in cDNA umgewandelt werden (Castles, et al., BioTechniques 21:425-428 (1996)), gefolgt von PCR und irgend einer Methode, die dazu in der Lage ist, Einzelbasenveränderungen zu detektieren.
Beispiel 5: Diagnostischer Assay für Krebs-Suszeptibilität
Die Identifizierung des Keimbahn-Prohibitin-Genotyps eines Patienten als homozygot Thymin (T/T), homozygot Cytosin (C/C), oder heterozygot (C/T) an Position 729, wie in SEQ ID NO: 1 definiert, kann dazu verwendet werden, um das Risiko einer Person zur Entwicklung einer Krebsform zu beurteilen.
Unter Verwendung der Methoden aus den Beispielen 1–4 wird die genomische DNA eines Patienten präpariert und mittels PCR amplifiziert und die Basenidentität an Position 729 mit Hilfe verschiedener, im Stand der Technik bekannter Methoden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Sequenzierung, RFLP, oder Größenunterscheidung, bestimmt.
Ein Patient mit einem Keimbahn–Prohibitin-Genotyp von homozygot Thymin (T/T) an Position 729 hat einen größeren Risikofaktor zur Entwicklung von Krebs als eine nichtbetroffene relevante Population. Ein Patient, der homozygot Cytosin (C/C) an Position 729 ist, hat einen Risikofaktor, der niedriger oder gleich ist wie der einer nichtbetroffenen relevanten Population. Schließlich hat ein Patient, der heterozygot Cytosin/Thymin (C/T) an Position 729 ist, einen Risikofaktor, der niedriger ist als der eines Individuums, das homozygot Thymin (T/T) ist aber höher als der einer nichtbetroffenen relevanten Population.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Bestimmen des Risikos einer Krebserkrankung, außer von Brustkrebs, das die Schritte umfaßt, bei denen man: a) die Basenidentität eines Teils der genomischen DNA aus einer Zellprobe eines Patienten bestimmt, wobei die genomische DNA ein Prohibitin-Gen umfaßt, das eine untranslatierte Region umfaßt, wobei der Teil der in SEQ ID NO:1 definierten Position 729 des Prohibitin-Gens in der untranslatierten Region entspricht; und b) die Basenidentität mit Keimbahnpolymorphismen korreliert, die auf das Risiko der Krebserkrankung hinweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Sequenzieren eines Teils des Teils der 3' untranslatierten Region des Prohibitin-Gens, das die Position 729 enthält, bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Detektieren von Einzelbasenübereinstimmungen oder fehlenden Übereinstimmungen zwischen dem Teil der 3' untranslatierten Region und dem C-Allel und/oder T-Allel des Prohibitins bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Verdauen des Teils der 3' untranslatierten Region des Prohibitin-Gens mit einer Restriktionsendonuklease bestimmt, die geeignet ist, die Basenidentität der Position 729 zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Restriktionsendonuklease AflIII ist und bei dem man bestimmt, daß die Schnittstelle, auf die sich AflIII auswirkt, vorhanden ist, wenn die Position 729 Cytosin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, das ferner Schritte umfaßt, bei denen man: a) den verdauten Teil der DNA-Stränge der 3' untranslatierten-Region trennt; b) die getrennten verdauten DNA-Stränge der 3' untranslatierten-Region auf einer Membran fixiert; c) die getrennten, verdauten DNA-Stränge der 3' untranslatierten-Region mit mindestens einer markierten Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten, getrennten, verdauten DNA-Stränge der 3' untranslatierten-Region hybridisieren kann und identifizieren kann, ob die Spaltung an der Position 729 erfolgt ist; und man d) detektiert, ob die markierte Nukleinsäuresonde an die fixierten, getrennten, verdauten DNA-Stränge der 3' untranslatierten-Region gebunden hat, wobei der Patient ein Krebsrisiko hat, wenn die markierte Nukleinsäuresonde, die an die fixierten, abgetrennten, verdauten DNA-Stränge der 3' untranslatierten-Region gebunden hat, anzeigt, daß die Spaltung an der Position 729 nicht erfolgt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität durch Untersuchen einer RNA-Fraktion aus der Zellprobe des Patienten bestimmt, wobei die Identität der genomischen DNA an Position 729 bestimmt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Risiko, während der Lebensdauer Krebs zu entwickeln, höher als das einer nichtbetroffenen relevanten Population beurteilt wird, wenn die Basenidentität an der Position 729 homozygot für Thymin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Risiko, während der Lebensdauer Krebs zu entwickeln, höher als das einer nichtbetroffenen relevanten Population, aber niedriger als das eines Individuums, das homozygot für Thymin ist, beurteilt wird, wenn die Basenidentität an Position 729 heterozygot Cytosin/Thymin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Risiko, während der Lebensdauer Krebs zu entwickeln, niedriger als oder gleich wie das einer nicht-betroffenen relevanten Population beurteilt wird, wenn die Basenidentität an Position 729 homozygot Cytosin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Teil der genomischen DNA synthetisierte doppelsträngige genomische DNA umfaßt, die man durch Polymerasekettenreaktionsmethodik erhält, die Schritte umfaßt, bei denen man: a) einen Teil doppelsträngiger genomischer DNA aus einer Zellprobe eines Patienten isoliert, wobei die genomische DNA ein Prohibitin-Gen umfaßt, das eine 3' untranslatierte Region umfaßt; b) die doppelsträngige genomische DNA in einer ersten Reaktionszone in eine erste einzelsträngige genomische DNA und eine zweite einzelsträngige genomische DNA auftrennt; c) der Reaktionszone einen Sense-Primer bereitstellt, wobei die Reaktionszone Bedingungen aufweist, die vorteilhaft für die Hybridisierung zwischen der ersten einzelsträngigen genomischen DNA und dem Sense-Primer sind; d) der Reaktionszone gleichzeitig einen Antisense-Primer bereitstellt, wobei die Reaktionszone Bedingungen aufweist, die vorteilhaft für die Hybridisierung zwischen der zweiten einzelsträngigen genomischen DNA und dem Antisense-Primer sind; e) mehrere Kopien des Teils der doppelsträngigen genomischen DNA durch Polymerasekettenreaktionsmethodik herstellt, um synthetisierte doppelsträngige DNA zu bilden; f) die Basenidentität der in SEQ ID NO:1 definierten Position 729 für die DNA-Stränge der 3' untranslatierten-Region bestimmt; und man g) die Basenidentität mit einem Keimbahnpolymorphismus korreliert, der auf das Risiko der Krebserkrankung hinweist, wobei der Patient das niedrigste Risiko mit homozygotem C/C, ein mittleres Risiko mit heterozygotem C/T und das höchste Risiko mit homozygotem T/T an Position 729 hat.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID NO:7 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID NO:6 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID NO:8 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID NO:3 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Antisense-Primer SEQ ID NO:2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Antisense-Primer SEQ ID NO:2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Antisense-Primer SEQ ID NO:2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der Antisense-Primer SEQ ID NO:2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der Antisense-Primer SEQ ID NO:2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 18, das ferner vor Schritt f) ein Aufreinigen umfaßt, um ein 852 bp Fragment zu bilden und man eine zweite Polymerasekettenreaktion durchführt, bei der man einen Sense-Primer, der SEQ ID NO:7 umfaßt, und einen Antisense-Primer, der SEQ ID NO:2 umfaßt, verwendet, um synthetisierte doppelsträngige DNA zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Sequenzieren bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Detektieren von Einzelbasen-Übereinstimmungen oder fehlende Übereinstimmungen zwischen der synthetisierten Doppelstrang-DNA und dem C-Allel und/oder T-Allel des Prohibitins bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem man ferner die synthetisierte doppelsträngige DNA mit der Restriktionsendonuklease AflIII verdaut, die die untranslatierte Region an der Base 729 spaltet, wenn die Base Cytosin ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem man ferner die synthetisierte doppelsträngige DNA mit der Restriktionsendonuklease AflIII verdaut, die die untranslatierte Region an der Base 729 spaltet, wenn die Base Cytosin ist.
Verfahren nach Anspruch 25, das ferner die Schritte umfaßt, bei denen man: h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge trennt; i) die getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge auf einer Membran fixiert; j) die getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge mit mindestens einer markierten Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge binden und nachweisen kann, ob die Spaltung an der Position 729 erfolgt ist; und man k) detektiert, ob die markierte Nukleinsäuresonde an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, wobei der Patient ein Krebsrisiko hat, wenn die markierte Nukleinsäuresonde, die an die fixierten, abgetrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, anzeigt, dass die Spaltung an Position 729 nicht erfolgt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, das ferner die Schritte umfaßt, bei denen man: h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge trennt; und man i) das verdaute, synthetisierte doppelsträngige DNA-Fragment-Muster durch Ethidiumbromidfärbung und Ultraviolett-Photographie visualisiert.
Verfahren nach Anspruch 26, das ferner die Schritte umfaßt, bei denen man: h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge trennt; i) die getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge auf einer Membran fixiert; j) die getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge mit mindestens einer markierten Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge binden und nachweisen kann, ob die Spaltung an der Position 729 erfolgt ist; und man k) detektiert, ob die markierte Nukleinsäuresonde an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, wobei der Patient ein Krebsrisiko hat, wenn die markierte Nukleinsäuresonde, die an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, anzeigt, dass die Spaltung an Position 729 nicht erfolgt ist.
Verfahren nach Anspruch 26, das ferner die Schritte umfaßt, bei denen man: h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge trennt; und man i) das verdaute, synthetisierte doppelsträngige DNA-Fragment-Muster durch Ethidiumbromidfärbung und Ultraviolett-Photographie visualisiert.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Teil der genomischen DNA SEQ ID NO:9 ist.
Verfahren nach Anspruch 31, bei dem man den Sense-Primer SEQ ID NO:3 zum Amplifizieren von SEQ ID NO:9 verwendet.
Verfahren nach Anspruch 31, bei dem man den Antisense-Primer SEQ ID NO:2 zum Amplifizieren von SEQ ID NO:9 verwendet.
Verfahren nach Anspruch 32, bei dem man den Antisense-Primer SEQ ID NO:2 zum Amplifizieren von SEQ ID NO:9 verwendet.
Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Sequenzieren bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Nachweis von fehlenden Einzelbasen-Übereinstimmungen zwischen der synthetisierten doppelsträngigen DNA und dem C-Allel und/oder T-Allel des Prohibitins bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man die Basenidentität der Position 729 durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man ferner die synthetisierte doppelsträngige DNA mit der Restriktionsendonuklease AflIII verdaut, die die untranslatierte Region an der Base 729 spaltet, wenn die Base Cytosin ist.
Verfahren nach Anspruch 38, das ferner die Schritte umfaßt, bei denen man: h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge trennt; i) die getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge auf einer Membran fixiert; j) die getrennten, verdauten synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge mit mindestens einer markierten Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge binden und nachweisen kann, ob die Spaltung an Position 729 erfolgt ist; und man k) detektiert, ob die markierte Nukleinsäuresonde an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, wobei der Patient ein Krebsrisiko hat, wenn die markierte Nukleinsäuresonde, die an die fixierten, getrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, anzeigt, dass die Spaltung an Position 729 nicht erfolgt ist.
Verfahren nach Anspruch 38, das ferner die Schritte umfaßt, bei denen man: h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-Stränge trennt; und man i) das verdaute, synthetisierte doppelsträngige DNA-Fragment-Muster durch Ethidiumbromidfärbung und Ultraviolett-Photographie visualisiert.
Verfahren zum Bestimmen des Risikos einer Krebserkrankung, außer von Brustkrebs, bei einem menschlichen Patienten, das die Schritte umfaßt, bei denen man: a) die Sequenz einer von dem Patienten isolierten RNA in einer Region bestimmt, die eine Transkription eines Teils genomischer DNA ist, wobei die genomische DNA ein Prohibitin-Gen umfaßt, das eine untranslatierte Region umfaßt, wobei der Teil der in SEQ ID NO:1 definierten Position 729 des Prohibitin-Gens in der untranslatierten Region entspricht; und man b) die Basenidentität mit Keimbahnpolymorphismen korreliert, die auf das Risiko der Krebserkrankung hinweisen.