DE19909878C2 - Neue Sequenzvarianten des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens und ihre Verwendung - Google Patents
Neue Sequenzvarianten des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens und ihre VerwendungInfo
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- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Description
Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen MSH6 - Mismatch Repair Gens
und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, insbesondere zur
Feststellung von Neoplasie-Prädispositionen und zur Therapeutika-Entwicklung auf der Basis
pharmakogenetischer Prinzipien.
Das menschliche MSH6-Gen gehört zur Gruppe der Mismatch Repair Gene und stellt eine
wichtige Komponente des Komplexes zur Reparatur von Basenfalschpaarungen dar. Das
Genprodukt bildet gemeinsam mit dem Genprodukt von hMSH2, einem weiteren Mismatch
Repair Gen, den mutSα-Proteinkomplex, der vor allem für die Reparatur von Basen-
Substitutionen und Deletionen/Insertionen von einer bis weniger Basen verantwortlich ist. Für
die Reparatur von Deletionen/Insertionen von zwei und mehr Basen besteht eine funktionelle
Redundanz mit einem weiteren Mismatch Repair-Proteinkomplex, welcher ebenfalls das
Genprodukt von hMSH2, sowie das Genprodukt von hMSH3 beinhaltet. Daraus ergibt sich die
Notwendigkeit eines funktionellen hMSH6-Gens für die Reparatur von Insertionen und -
Deletionen einzelner Basen und vor allem für die Reparatur von Basen-Substitutionen. Der durch
vererbte und/oder erworbene Mutationen bedingte Funktionsverlust eines der beiden Gene
hMSH6 und hMSH2 führt zu einer massiven Erhöhung von Mutationen in den entsprechenden
Zellen, was durch Veränderungen (Instabilitäten) in der Anzahl von Wiederholungen innerhalb
einfacher Nukleotidabfolgen (Mikrosatelliten) angezeigt wird. Entsprechend den oben
aufgeführten Zusammenhängen sind Mutationen im hMSH6-Gen vor allem mit Instabilitäten in
Mononukleotid-Wiederholungen verbunden. Weiterhin gibt es Hinweise, daß hMSH6-
Mutationen auch zu einer erhöhten Rate von Basen-Substitutionen ohne erkennbare
Mononukleotid-Instabilitäten führen können.
Mutationen im hMSH6-Gen können zur Entstehung von Neoplasien, vor allem Kolon- und
Endometriumkarzinomen, führen. Keimbahnmutationen in einem Allel des hMSH6-Gens
prädisponieren zur Entstehung von Karzinomen, und sind, wie auch Keimbahnmutationen
anderer Mismatch Repair Gene, mit dem Syndrom für erblichen nicht-polypösen Darmkrebs
(Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer - HNPCC) assoziiert. Darüber hinaus gibt es
Hinweise auf die Prädisposition für weitere Erkrankungen aufgrund von hMSH6-
Keimbahnmutationen, wie beispielsweise Leukämien. Etwa 15% aller kolorektalen Karzinome
weisen Mikrosatelliten-Instabilitäten auf, welche auf Mismatch Repair-Gen-Defekte
zurückzuführen sind. Solche Tumoren weisen Resistenzen gegen eine Reihe von Chemo-
Therapeutika, wie Cisplatin, auf, woraus sich Konsequenzen für die Therapie entsprechender
Tumoren ableiten lassen.
Die Erfindung hat das Ziel, Varianten, Polymorphismen, Mutationen und resultierende
Haplotypen in der DNA-Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens zu ermitteln
und deren Korrelationen mit Krankheitsprädispositionen und -dispositionen festzustellen.
Ausgehend von diesen Korrelationen soll ein Verfahren zur Diagnose dieser
Krankheitsprädispositionen und -dispositionen, sowie zur Prädiktion von Schweregrad, Verlauf
und Überlebenszeit entsprechender Erkrankungen entwickelt werden.
Außerdem soll ein System zur Prädiktion der individuellen Ansprechbarkeit von Neoplasien auf
verschiedene Chemo-Therapeutika und ein System zur Entwicklung individuell spezifischer
Chemo-Therapeutika, sowie die Entwicklung von Testsystemen zur Erforschung
pathophysiologischer Zusammenhänge und Entwicklung oben genannter Therapeutika,
entwickelt werden. Zusammenfassend kann für jeden hMSH6-Genotyp ein individuelles Risiko
an einer bestimmten Krankheit zu erkranken, vorhergesagt oder entwickelt werden. Die Aufgabe
wird gemäß den Ansprüchen gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Es wurde gefunden, daß in der genomischen Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair
Gens neben drei bekannten Sequenzvarianten in der kodierenden Region (an den Positionen 116,
186 und 276) weitere Varianten vorhanden sind. Es wurde ferner gefunden, daß diese
genetischen Varianten mit der Prädisposition für verschiedene Krankheiten, z. B. kolorektales
Karzinom, korrelieren.
Gegenstand der Erfindung ist danach die Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair
Gens, die an den Positionen 116, 186, 276, 540, 642, 652, 1019, 1186, Intron 1 +22, Intron 1
-36, Intron 2 +52, Intron 2 +63, Intron 2 -52, Intron 3 -56, Intron 4 -101, Intron 5 +14, Intron 6
+146, Intron 6 +160, Intron 7 +35, Intron 7 +87, Intron 7 -51, Intron 8 -40, Intron 8 -42 und
Intron 9 -7 ganz oder teilweise mutiert ist, mit der Maßgabe, daß ein Austausch an den
Positionen 116, 186, 276 immer in Kombination mit mindestens einer der übrigen genannten
vorliegt. Es handelt sich insbesondere um eine Sequenz, die ganz oder teilweise die Mutationen
in Form von Basenaustauschen bzw. Insertionen und Deletionen A→G (Position 116), C→A
(Position 186), A→G (Position 276), T→C (Position 540), C→T (Position 642), Insertion T
(Position 652), T→C (Position 1019), C→G (Position 1186), C→G (Intron 1 Position +22),
A→G (Intron 1 Position -36), T→A (Intron 2 Position +52), Deletion GA (Intron 2 Position
+63), T→G (Intron 2 Position -52), C→T (Intron 3 Position -56), C→G (Intron 4 Position
-101), A→T (Intron 5 Position +14), A→G (Intron 6 Position +146), T→C (Intron 6 Position
+160), Insertion ATCT (Intron 7 Position +35), C→T (Intron 7 Position +87), Deletion 17 bp
(Intron 7 Position -51), G→C (Intron 8 Position -40), Insertion T (Intron 8 Position -42), und
Insertion 22 bp (Intron 9 Position -7) enthält (Abb. 1 und 2).
Besonders wichtig sind folgende Sequenzen (Haplotypen):
- - Sequenz mit der Mutation 642 T,
- - Sequenz mit der Mutation 1019 C,
- - Sequenz mit der Mutation 1186 G,
- - Sequenz mit der Mutation Intron 1 Position +22 G,
- - Sequenz mit der Mutation Intron 7 Position -51 Deletion 17 bp,
- - Sequenz mit der Mutation Intron 9 Position -7 Insertion 22 bp,
- - Sequenz mit den Mutationen 116 A und 642 T
- - Sequenz mit Intron 3 Position -56 C und der Mutation 642 T.
- - Sequenz mit den Mutationen 186 A und 540 C,
- - Sequenz mit den Mutationen 276 G und Intron 1 Position +22 G, sowie die
- - Sequenz mit den Mutationen 642 T und Intron 7 Position -51 Deletion 17 bp.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung von
Krankheitsprädispositionen, wobei alle Sequenzen und Varianten des MSH6-Mismatch Repair
Gens von der Einzelmutation bis zu allen möglichen Kombinationen aller Varianten an den
Positionen 116, 186, 276, 540, 642, 652, 1019, 1186, Intron 1 +22, Intron 1 -36, Intron 2 +52,
Intron 2 +63, Intron 2 -52, Intron 3 -56, Intron 4 -101, Intron 5 +14, Intron 6 +146, Intron 6
+160, Intron 7 +35, Intron 7 +87, Intron 7 -51, Intron 8 -40, Intron 8 -42 und Intron 9 -7
(einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten, die mit einbezogen werden
können) genotypisiert werden können und die entsprechende Aussagen über
Krankheitsprädispositionen ermöglichen.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und
mindestens an einer der ausgetauschten/veränderten Positionen genotypisiert und nachfolgend
mit der Referenz-DNA-Sequenz von hMSH6 verglichen wird. Bevorzugt sind
Ausführungsformen, in denen mindestens die Position 642, 1019, 1186, 1633, Intron 1 +22,
Intron 7 -51 oder Intron 9 -7, oder mindestens die beiden Positionen 116 und 642, 186 und 540
oder 276 und Intron 1 +22 genotypisiert werden.
Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die
Detektion von Punktmutationen oder Insertionen/Deletionen von einer Größe bis zu ca. 30
Basenpaaren geeignet sind. Dazu gehören Polymerasekettenreaktion (PCR)-gestützte
Genotypisierungsverfahren wie z. B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren
unter Verwendung von Oligonukleotiden (Beispiele wären "dot blotting", oder "Oligonucleotide
Ligation Assays" (OLA)), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, und "Single
Nucleotide Polymorphism" (SNP) Analyse mittels 'Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization
Mass Spectrometry (MALDI), sowie prinzipiell jedweden zukünftig zur Verfügung stehende
Methoden zur Variantendetektion einschließlich der Chip-Technologie in all ihren
technologischen Ausführungen. Die Insertions- und Deletionsvarianten können des weiteren
durch Fragmentlängenbestimmung auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen oder anderen
geeigneten Separationsmedien, manuell oder mittels Automaten, bestimmt werden.
Ausgehend davon ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines breiten Spektrums
verschiedenster Neoplasieprädispositionen geeignet.
Eine Ausführungsvariante z. B. beinhaltet die Bestimmung einer Prädisposition für das Entstehen
von kolorektalen Adenomen und deren Weiterentwicklung zum kolorektalem Karzinom.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsvariante gestattet z. B. die Bestimmung einer Prädisposition
für die Entstehung von Endometrium- und Ovarialkarzinomen bei Frauen.
Das Verfahren eignet sich für den Nachweis von Krankheitsprädispositionen in Populationen, als
auch in Familien.
Eine weitere Ausführungsvariante beinhaltet therapeutische Konsequenzen, wie der Prädiktion
von Resistenzen auf bestimmte Chemo-Therapeutika bei Neoplasien, z. B.: Cysplatin bei
kolorektalem Karzinom.
Des weiteren erlaubt das Verfahren auch die Bestimmung des Verlaufs und des Schweregrades
von Erkrankungen, sowie die Prädikation der Überlebensdauer nach schweren medizinischen
Erkrankungen, z. B. nach Kolon- oder Endometriumkarzinom.
Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der beanspruchten
Sequenzvarianten zum Aufbau von Genen bzw. Vektoren, insbesondere zur Entwicklung von
pharmazeutisch relevanten Substanzen sowie zur Entwicklung eines diagnostischen Kits oder
jedweder diagnostischer Verfahren. Solche Kits oder Verfahren können vorteilhaft zur
Vorhersage der individuellen Krankheitsprädisposition oder der individuellen Ansprechbarkeit
von Neoplasien auf verschiedene Chemo-Therapeutika eingesetzt werden.
Kulturen von neoplastischen Zellen, welche die genannten individuellen hMSH6 Gen-Varianten
oder unterschiedlichste Kombinationen davon aufweisen, können somit als Testmodelle für die
Entwicklung individuell spezifischer Therapeutika (z. B.: Chemo-Therapeutika, die nicht zu einer
Resistenz der neoplastischen Zellen führen) dienen. Das entspricht Testmodellen in vitro, aber
auch in vivo Testmodelle sind eingeschlossen (transgene Tiere bzw. Hefe-Stämme, die diese
individuellen hMSH6 Gen-Varianten tragen).
Als individuelle Testmodelle erlauben sie in vitro (= ex vivo) eine Vorhersage zum individuellen
Funktionszustand von Chemo-Therapeutika bei der Behandlung von Neoplasien, deren
Entstehung durch die Defizienz des hMSH6 Mismatch Repair-Gens vermittelt wird.
Der Umfang der beanspruchten Erfindung wird im folgenden ausführlich dargestellt. Zur
Erarbeitung der Erfindung wurde die genomische DNA-Sequenz des menschlichen MSH6
Mismatch Repair Gens, welche Teile der 5' und 3' nichttranslatierten Region, sowie alle zehn
codierenden Exons und deren flankierende Intronbereiche beinhaltet, in Patienten mit vererbten
oder sporadischen Neoplasien und nicht betroffenen Kontrollpersonen mittels der DNA-
Sequenzierung nach Sanger (nach erfolgter Amplifikation der entsprechenden Gen-Abschnitte
mittels Polymerasekettenreaktion und spezifischen Primern) untersucht, und zunächst eine Reihe
von genetischen Varianten identifiziert. In den untersuchten Gen-Abschnitten wurden zum
bestehenden Zeitpunkt 21 neue Varianten entdeckt, deren wichtigste der Austausch eines
hochkonservierten Leucin zu Valin (C→G, Position 1186) zu sein scheint. Diese Mutation
befindet sich in einer Bindungsdomäne für hMSH2.
Als Referenz-Sequenz für die Varianten, deren Positionen und Konsequenzen für die
Aminosäurecodierung dient die genomische hMSH6 Mismatch Repair Gen-Sequenz (Acharya S.
et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 13629-13634/GenBank Accession Nr.: U73732-7).
Die Positionsangaben für die Sequenzvarianten in den Exons beziehen sich auf die erste Base des
Translations-Start-Codons (Position 1). Die Positionsangaben für die Sequenzvarianten in den
Introns (Intron 1 liegt zwischen Exon 1 und 2 usw.) beziehen sich entweder auf die erste Base
des jeweiligen Introns nach dem vorhergehenden Exon (Position +1), oder auf die letzte Base des
jeweiligen Introns vor dem nächsten Exon (Position -1). Für Insertionen und Deletionen ist
jeweils die in Leserichtung letzte Möglichkeit einer Mutation, die zur gefundenen Sequenz führt,
angegeben.
Diese Varianten sind in den Abb. 1 schematisch im Bezug auf die genomische
Organisation und in Abb. 2 im Bezug auf die Basenabfolge der Referenz-Sequenz des
hMSH6-Gens übersichtlich dargestellt. Abb. 3 zeigt für Insertionen und Deletionen die
mutierte Sequenz im Vergleich zur Referenz-Sequenz.
Einen spezifischen Einfluß auf das Risiko an einem Karzinom zu erkranken, konnte z. B. für die
Insertion T an Position 652 (Codon 218) nachgewiesen werden. Die Insertion führt bei der
Translation zum Proteinsyntheseabbruch an dieser Stelle, womit dem Protein ca. 80% seiner
Wildtypsequenz fehlen, und es damit große Teile seiner Funktion verliert. Ein Patient mit dieser
Mutation erkrankte mit 34 Jahren an einem Kolonkarzinom. Seine Mutter und zwei Schwestern
der Mutter erkrankten an Magen- bzw. Kolonkarzinomen. In Tumorzellen des Patienten ist das
zweite Allel des hMSH6-Gens durch eine weitere, somatische Mutation inaktiviert, so daß diese
Zellen ohne vollständiges hMSH6-Genprodukt bleiben. Übereinstimmend mit biochemischen
Daten zur Funktion des hMSH6-Genprodukts (siehe oben) weisen die Tumorzellen massive
Instabilitäten an Mononukleotid-Wiederholungen, aber nicht an Dinukleotid-Wiederholungen
auf.
Weiterhin wurde eine Korrelation zwischen der Sequenzvariante C→T an Position 642 und
einem erhöhten Risiko an Kolonkarzinom zu erkranken gefunden.
Die 17 bp Deletion beginnend 51 bp vor Exon 8 (Intron 7 Position -51) tritt bei bestimmten
Gruppen von Patienten mit nach molekulargenetischen Merkmalen subklassifizierten
kolorektalen Karzinomen häufiger auf, als in der Normalbevölkerung. Damit ergibt sich für diese
Variante ein weiterer hier identifizierter Risikofaktor.
Die Erfindung wird anschließend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert.
Für die Erhebung des gesamten polymorphen Spektrums des hMSH6-Mismatch Repair Gens
wurden die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die DNA-Sequenzierung nach Sanger
verwendet. Hierzu wurde die gesamte codierende Sequenz inklusive der flankierenden
Intronbereiche und Teile der 5'- und 3' nichttranslatierten Regionen in acht Fragmente unterteilt
und mittels PCR amplifiziert (siehe Abb. 2). Die hierfür erstellten und genutzten Primer
sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Die PCR wurde in 25 µl Reaktionsvolumen mit 30-50 ng genomische DNA, 1,7 mM MgCl,
200 nM jedes der vier Dinukleotide, 200 nM jeder der beiden Primer, 1 Unit Taq-Polymerase
(AmpliTaq von PE Applied Biosystems, Weiterstadt) und 10% des zur Taq-Polymerase
mitgelieferten 10 × PCR-Puffers durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren 5 min 94°C
gefolgt von 35 Zyklen mit 1 min 94°C, 1 min 58°C und 2 min 72°C und abschließend 7 min
72°C. Das erste Fragment, welches Exon 1 enthält, wurde abweichend zu den oben genannten
Bedingungen mit einer Denaturations-Temperatur von 96°C und einer Annealing-Temperatur
von 60°C amplifiziert, wobei als DNA-Polymerase und PCR-Puffer der Expand High Fidelity
Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim) genutzt wurde.
Die fertigen Reaktionen wurden auf Agarosegelen (1% Agarose, 1 × TAE-Puffer) im
elektrischen Feld aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Anschließend wurden die
amplifizierten Fragmente unter UV-Licht aus den Agarose-Gelen ausgeschnitten und mit
sterilem, deionisiertem Wasser durch Inkubieren für 3 h bei 75°C oder für 10 h bei 30°C oder
durch Filterzentrifugation für 2 min bei 800 g eluiert.
Die so gewonnenen Eluate wurden mittels des Thermo SequenaseTM Fluorescent Cycle
Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) und Primer, die auch zur
Fragmentamplifikation genutzt wurden, sowie weitere, fragmentinterne Primer (wie in Tabelle 2
aufgeführt) sequenziert. Für jede zu generierende Sequenz wurden vier Reaktionen durchgeführt,
welche 5 µl Eluat, 1 µl eines 1 mM Sequenzier-Primers und 2 µl Sequenzierreagent-Mix (Thermo
Sequenase, dNTPs und jeweils ddATPs, ddCTPs, ddGTPs oder ddTTPs) in einem
Gesamtvolumen von 8 µl enthielten. Die Reaktionsbedingungen waren 2 min 94°C, gefolgt von
20 Zyklen 30 sec 94°C und 30 sec 60°C und abschließend 2 min 72°C. Alle für die
Sequenzierung genutzten Primer waren Cy5-Farbstoff markiert, was die Detektion der Produkte
der Sequenzierreaktionen auf Automated Laser Fluorescent (ALF) express Sequenzierautomaten
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) ermöglicht. Entsprechend erfolgte die Bestimmung der
Sequenzen mittels ALFexpress Sequenzierautomaten. Die Elektrophorese wurde mit
Standardplatten mit 0,3 mm starken Long RangerTM- (FMC BioProducts, Rockland, Maine,
USA) oder Polyacrylamid (PAA)-Gelen (6,5% Long Ranger oder PAA, 7 M Urea, 1 × TFBE-
Puffer) bei 950 V, 38 mA und 42 W für 10 Stunden durchgeführt.
Sämtliche PCR- und Sequenzierungsreaktionen wurden mittels GeneAmp® PCR Systemen 9700
(PE Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt.
Acharya S, Wilson T, Gradia S, Kane MF, Guerrette S, Marsischky GT, Kolodner R, Fishel R
(1996) hMSH2 forms specific mispair-binding complexes with hMSH3 and hMSH6. Proc
Natl Acad Sci 93: 13629-13634.
Nicolaides NC, Palombo F, Kinzler KW, Vogelstein B, Jiricny J (1996) Molecular cloning of N- terminus of GTBP. Genomics 31: 395-397.
Miyaki M, Konishi M, Tanaka K, Kikuchi-Yanoshita R, Muraoka M, Yasuno M, Igari T, Koike M, Chiba M, Mori T (1997) Germline mutation of MSH6 as the cause of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet 17: 271-272.
Nicolaides NC, Palombo F, Kinzler KW, Vogelstein B, Jiricny J (1996) Molecular cloning of N- terminus of GTBP. Genomics 31: 395-397.
Miyaki M, Konishi M, Tanaka K, Kikuchi-Yanoshita R, Muraoka M, Yasuno M, Igari T, Koike M, Chiba M, Mori T (1997) Germline mutation of MSH6 as the cause of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet 17: 271-272.
- 1. Die partiell dargestellte Referenzsequenz ist die von Acharya et al. (1996) publizierte hMSH6- Mismatch Repair Gen-Sequenz (GenBank Accesssion-Nr.: U73732-7).
- 2. Die Positionen der Sequenzänderungen beziehen sich immer auf die Positionen der Referenzsequenz.
- 3. Basen des codierenden Bereichs (der Exons) und der 5'- und der 3' nichttranslatierten Regionen (UTR) sind mit Großbuchstaben dargestellt.
- 4. Basen der Introns sind mit Kleinbuchstaben dargestellt.
- 5. Markierung über der Sequenz: I = Intron, E = Exon.
- 6. Unterstrichene Basen kennzeichnen verwendete Primersequenzen.
- 7. Kursiv geschriebene Basen kennzeichnen das Translations-Start-Codon in Exon 1 und das Translations-Stop-Codon in Exon 10.
- 8. Zahlen vor den Zeilen mit Großbuchstaben geben die Position der ersten Base in der jeweiligen Zeile an, wobei die erste Base (A) des Translations-Start-Codons in Exon 1 Position 1 ist. Die Positionsangaben der Sequenzvarianten im codierenden Bereich beziehen sich ebenfalls auf den Translations-Start.
- 9. Fettgedruckte Basen der Referenz-Sequenz kennzeichnen Basen, die durch die dargestellten Sequenzvarianten ausgetauscht oder deletiert werden.
- 10. Die Positionen für Sequenzvarianten in Introns werden ermittelt, indem ab der ersten Base eines Introns mit +1, bzw. ab der letzten Base eines Introns mit -1 gezählt wird.
- 11. Für Insertionen und Deletionen gibt es in der Regel eine Reihe verschiedener Möglichkeiten die zu der gleichen veränderten Sequenz führen. z. B.: würde eine 17 bp Deletion in Intron 7 Position -68 (Deletion der Basen -68 bis -52) zur selben veränderten Sequenz wie die dargestellte 17 bp Deletion in Intron 7 Position -51 (Deletion der Basen -51 bis -35) führen. Hier wurde immer die in Leserichtung letztmögliche Variante für die gefundene Sequenzveränderung angegeben.
- 12. Insertionen erfolgten vor der mit Pfeil gekennzeichneten Base, so daß in der veränderten Sequenz diese Position durch die erste Base der Insertion eingenommen wird.
- 13. Die drei Varianten an den Positionen 116, 186 und 276 wurden bereits von Nicolaides et al. (1996) beschrieben.
- 14. Es sind nur Bereiche dargestellt, in denen Sequenzvarianten identifiziert wurden.
- 15. Führen Sequenzvarianten zum Aminosäureaustausch, so ist dieser mittels des genetischen Codes für Aminosäuren angegeben, alle Sequenzvarianten im codierenden Bereich ohne Aminosäurebenennung ändern die Aminosäurecodierung nicht.
Claims (39)
1. Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens, dadurch
gekennzeichnet, daß die Basen an den Positionen 116, 186, 276, 540, 642,
652, 1019, 1186, Intron 1 +22, Intron 1 -36, Intron 2 +52, Intron 2 +63,
Intron 2 -52, Intron 3 -56, Intron 4 -101, Intron 5 + 14, Intron 6 +146, Intron
6 + 160, Intron 7 +35, Intron 7 +87, Intron 7 -51, Intron 8 -40, Intron 8 -42,
Intron 9 -7 ganz oder teilweise ausgetauscht sind, mit der Maßgabe, daß ein
Austausch an den Positionen 116, 186, 276 immer in Kombination mit
mindestens einer der übrigen genannten vorliegt.
2. Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder
teilweise die Basenaustausche A→G bzw. Insertionen und Deletionen A→G
(Position 116), C→A (Position 186), A→G (Position 276), T→C (Position 540),
C→T (Position 642), Insertion T (Position 652), T→C (Position 1019), C→G
(Position 1186), C→G (Intron 1 Position +22), A→G (Intron 1 Position -36),
T→A (Intron 2 Position +52), Deletion GA (Intron 2 Position +63), T→G (Intron
2 Position -52), C→T (Intron 3 Position -56), C→G (Intron 4 Position -101),
A→T (Intron 5 Position +14), A→G (Intron 6 Position + 146), T→C (Intron 6
Position +160), Insertion ATCT (Intron 7 Position +35), C→T (Intron 7 Position
+87), Deletion 17 bp (TTTGTTTTAATTCCTTT/Intron 7 Position -51), G→C
(Intron 8 Position -40), Insertion T (Intron 8 Position -42), und Insertion 22 bp
(AAAACTTTTTTTTTTTTTTTTTT/Intron 9 Position -7) enthält.
3. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation 642 T.
4. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation 1019 C.
5. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation 1186 G.
6. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation Intron 1
+22 G.
7. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation Intron 7
-51 Deletion 17 bp.
8. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation Intron 9
-7 Insertion 22 bp.
9. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 116 G
und Intron 2 -52 G.
10. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 186 A
und 540 C.
11. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 276 G
und Intron 1 +22 G.
12. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Intron 3 -56 C und
die Mutationen 642 T.
13. Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsprädispositionen, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und die Sequenz des
menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens mindestens an einer der folgenden
Positionen 116, 186, 276, 540, 642, 652, 1019, 1186, Intron 1 +22, Intron 1 -36,
Intron 2 +52, Intron 2 +63, Intron 2 -52, Intron 3 -56, Intron 4 -101, Intron 5 +14,
Intron 6 +146, Intron 6 +160, Intron 7 +35, Intron 7 +87, Intron 7 -51, Intron 8
-40, Intron 8 -42, Intron 9 -7 genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-
DNA-Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens verglichen wird,
wobei alle möglichen Kombinationen von Varianten von der Einzelmutation bis
zu allen möglichen Kombinationen aller Varianten einschließlich jeder
beliebigen absoluten Anzahl von Varianten einbezogen werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines
Probanden isoliert und mindestens an der Position 642 genotypisiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines
Probanden isoliert und mindestens an der Position 1186 genotypisiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines
Probanden isoliert und mindestens an Intron 1 Position +22 genotypisiert
wird.
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines
Probanden isoliert und mindestens an Intron 7 Position -51 für die Deletion 17 bp
genotypisiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines
Probanden isoliert und mindestens an den zwei Positionen 642 und 1186
genotypisiert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines
Probanden isoliert und mindestens an den vier Positionen 642, 1186,
Intron 1 + 22 und Intron 7 -51
genotypisiert wird.
20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines
Probanden isoliert und mindestens an den sieben Positionen 116, 186, 642,
1186, Intron 1 +22, Intron 7 +35 und Intron 7 -51 genotypisiert wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß
die Genotypisierung durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die
für den Nachweis von Varianten geeignet sind, erfolgt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
Prädisposition für Neoplasien.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
Prädisposition für kolorektales Karzinom.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
Prädisposition für Endometrium- und Ovarialkarzinom bei Frauen.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
Prädisposition für Leukämie.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
erhöhten Mutationsrate in eukaryotischen Zellen.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
erhöhten Frequenz von Basensubstitutionen in eukaryotischen Zellen.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
erhöhten Frequenz von Insertionen und/oder Deletionen in eukaryotischen
Zellen.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer
erhöhten Frequenz von Basensubstitutionen und Insertionen und/oder
Deletionen in eukaryotischen Zellen.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 43 bis 21 zur Prädikation des Verlaufs
und des
Schweregrades von, und der Überlebensdauer bei Erkrankungen, im
besonderen Neoplasien.
31. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 12 zur Entwicklung
von Therapeutika und/oder "lifestyle-drugs".
32. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Prädiktion der
individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf bisher bekannte Chemo-
Therapeutika sowie zukünftig, auch unter Anspruch 31 entwickelten Chemo-
Therapeutika.
33. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Prädiktion der
individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf Cisplatin.
34. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Kontrolle von
Mutationsraten in eukaryotischen Zellen in vivo und in vitro.
35. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Optimierung der
individuellen, gegen Neoplasien gerichteten Therapie bzw. Intervention.
36. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 12 zum Aufbau von
Genen bzw. Vektoren zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten
Substanzen.
37. Verwendung nach Anspruch 13 bis 34 zur Entwicklung eines diagnostischen
Kits, oder jedweden Verfahrens zur Genotypisierung.
38. Verwendung nach Anspruch 13 bis 34 für die Entwicklung eines
diagnostischen Kits zur Vorhersage der individuellen Ansprechbarkeit auf
verschiedene Chemo-Therapeutika bei der Behandlung von Neoplasien.
39. Verwendung nach Anspruch 1 bis 12 sowie 13 bis 37 zur Entwicklung von in
vitro und in vivo Testsystemen, die individuelle Formen des MSH6-Mismatch
Repair Gens exprimieren, wobei die Testsysteme zur Untersuchung der
Pathophysiologie von Erkrankungen von generell medizinisch wichtigen
Merkmalen mit Beteiligung des MSH6-Mismatch Repair Gens dienen, sowie
zur Entwicklung und Testung individuell spezifischer Therapeutika und
'lifestyle- drugs' und von MSH6-gerichteten Substanzen im allgemeinen.
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