DE60128434T2

DE60128434T2 - Polymorphismen im menschlichen KDR Gene

Info

Publication number: DE60128434T2
Application number: DE60128434T
Authority: DE
Inventors: John Craig Cheshire Smith
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2021-10-31
Also published as: EP1203827A2; DE60128434D1; EP1469084A3; EP1203827B1; ES2284596T3; US20030129596A1; US20050059067A1; ATE362547T1; JP2002345489A; EP1203827A3; EP1469084A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polymorphismen im menschlichen KDR-Gen sowie entsprechende, davon kodierte neuartige allelische Polypeptide. Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren und Materialien zur Analyse der Allelvariation im KDR-Gen sowie die Verwendung des KDR-Polymorphismus bei der Behandlung von durch KDR-Liganden (VEGF [Vascular Endothelial Growth Factor]) vermittelten Krankheiten, wie beispielsweise Krebs und verschiedene Entzündungskrankheiten (Übersichtsartikel von Carmeliet und Jain (2000) Nature 407: 249-257; Ferrara und Alitalo (1999) Nature Medicine 5:1359-1364) mit KDR-Inhibitoren.
Die KDR-cDNA(EMBL Accession Number AF035121, 5830 bp) kodiert für ein reifes Protein mit 1356 Aminosäuren. Das KDR-Protein besteht aus einer externen Domäne mit sieben immunglobulinähnlichen Domänen, einem Transmembranbereich sowie einem zytoplasmatischen Bereich mit einer Tyrosinkinasedomäne. Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der Familie der Rezeptortyrosinkinasen besteht die Kinasendomäne des KDR aus zwei Abschnitten mit einer dazwischenliegenden Sequenz von ~ 70 Aminosäuren. Die Biologie der VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)-Rezeptorfamilie wurde in einem Übersichtsartikel (Neufeld et al., (1999) FASER Journal. 13:11-22; Zachary (1998) Experimental Nephrology 6:480-487) behandelt, und die Tyrosinphosphorylierungsstellen wurden charakterisiert. Die Ligandenbindungsstellen in der extrazellulären KDR-Domäne wurden identifiziert (Lu et al., (2000) J Biol Chem 275:14321-14330). Die genomische Struktur des menschlichen KDR-Gens ist beschrieben (Yin et al (1998) Mammalian Genome. 9:408-410). Das Gen enthält 28 Exons, die 45 kb umfassen, und wurde auf Chromosom 4 q11-q12 lokalisiert (Saft et al (1995) Cytogen Cell Genet 70:145-146; Spritz et al. (1994) Genomics 22:431-436). Die genomische Sequenz von Contigs, die den Bereich mit dem KDR-Gen umfassen, ist veröffentlicht (EMBL Accession AC021220, 226334 pb). Die Veröffentlichung von Patterson et al. (29. September 1995) umfaßt die Klonierung und Funktionsanalyse des Promotors für KDR, einen Rezeptor für den vaskulären Endothelwachstumsfaktor (Journal of Cellular Biology, Band 270, Nummer 39, Seiten 23111-23118). Zwar umfaßt dieses Dokument einen Cytosinrest an Position 162, doch handelt es sich hierbei um eine zufällige Angabe und nicht um eine Vorwegnahme des Ergebnisses der zugrundeliegenden Anmeldung, wodurch diese bestimmte Position (1.) als ein Einzelnukleotidpolymorphismus und (2.) als mit einer durch VEGF vermittelten Krankheit verbunden identifiziert wurde.
Der Ort der Polymorphismen läßt sich unter Bezugnahme auf die veröffentlichten Sequenzzugangsnummern von EMBL (oder einer anderen Sequenzdatenbank) (d.h. EMBL Accession Number AC021220 oder AF035121) präzise kartieren, wobei der Fachmann andererseits in der Lage ist, den Ort des Polymorphismus im KDR-Gen präzise zu identifizieren, indem er einfach genügend neben dem Polymorphismus liegende flankierende Sequenz bereitstellt, um so den Polymorphismus eindeutig zu lokalisieren. Dabei sollte die Bereitstellung von 10 oder mehr Nukleotiden auf beiden Seiten des Polymorphismus ausreichen, um die präzise Ortskartierung des jeweiligen Polymorphismus zu erreichen.
Man nimmt an, daß KDR (VEGFR2) die mitogenen und angiogenen Effekte von VEGF in Endothelzellen vermittelt, während ein weiterer VEGF-Rezeptor (flt-1) eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gewebearchitektur im sich entwickelnden Gefäßsystem spielt. Hinweise zur Unterstützung dieser Theorie ergaben sich aus Knockout-Untersuchungen in Mäusen (Fong et al., (1995) Nature 376:66-70; Shalabay et al., (1995) Nature 376:62-66) sowie aus biochemischen Untersuchungen (Waltenberger et al., (1994) J Biol Chem. 269:26988-26995). Die Aktivierung von Endothelzellen durch VEGF führt zu Autophosphorylierung von KDR und anschließender Tyrosinphosphorylierung mehrerer nachgeschalteter Ziele (Übersichtsartikel von Gingras et al., (2000) Biochem J. 348:273-280).
VEGF und seine Rezeptoren werden in vielen Tumorarten überexprimiert, wobei die Blockierung der VEGF-Funktion, die Angiogenese hemmt und das Wachstum von Tumoren unterdrückt, während die Überexpression von VEGF die Angiogenese bzw. das Tumorwachstum verstärkt. (Skobe et al., (1997) Nature Medicine 3:1222, 12227). Am KDR-Rezeptor wirkende Verbindungen sind daher als Pharmazeutika zur Verwendung bei der Behandlung vieler verschiedener Tumore indiziert (Ferrara und Alitalo (1999) Nature Medicine 5:1359-1364).
Die Verwendung der Kenntnis von Polymorphismen als Hilfe bei der Identifizierung von Patienten, die sich am besten für eine Therapie mit bestimmten Pharmazeutika eignen, wird häufig "Pharmakogenetik" genannt. Die Pharmakogenetik läßt sich auch in der pharmazeutischen Forschung zur Unterstützung des Wirkstoffauswahlprozesses einsetzen. Polymorphismen werden bei der Kartierung des menschlichen Genoms sowie zur Aufklärung der genetischen Komponenten von Krankheiten verwendet. Hinsichtlich Hintergrundinformationen zur Pharmakogenetik sowie zu anderen Verwendungen für den Polymorphismusnachweis wird der Leser auf die folgenden Literaturstellen verwiesen: Linder et al. (1997), Clinical Chemistry, 43:254; (Marshall (1997), Nature Biotechnology. 15:1249; Internationale Patentanmeldung WO 97/40462 , Spectra Biomedical; und Schafer et al, (1998), Nature Biotechnology. 16:33.
In klinischen Versuchsstudien konnte gezeigt werden, daß das Ansprechen von Patienten auf eine Behandlung mit Pharmazeutika häufig heterogen ist. Somit besteht ein Bedarf an verbesserten Ansätzen zur Konstruktion von und Therapie mit Pharmazeutika.
Punktmutationen in Polypeptiden werden wie folgt bezeichnet: Natürliche Aminosäure (unter Verwendung der 1- bzw. 3-Buchstaben-Nomenklatur), Position, neue Aminosäure. Beispielsweise bedeutet in einem hypothetischen Beispiel "D25K" bzw. "Asp25Lys", das an Position 25 eine Asparaginsäure (D) gegen Lysin (K) ausgetauscht wurde. Mehrere Mutationen in einem einzigen Polypeptid sind zwischen eckigen Klammern angegeben, wobei einzelne Mutationen durch Kommas getrennt sind. Das Vorliegen einer bestimmten Base an einer Polymorphismusposition wird durch die der Polymorphismusposition folgende Base repräsentiert. Beispielweise wird in einem hypothetischen Beispiel das Vorliegen von Adenin an Position 300 als: 300 A dargestellt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung von Polymorphismen im KDR-Gen. Insbesondere wurden dabei 2 Polymorphismen in der kodierenden Sequenz des KDR-Gens gefunden, die jeweils zu einem Aminosäureaustausch in der Sequenz des exprimierten Proteins führen. Ebenso wurden drei einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) im Promotorbereich, ein SNP im 5'-UTR und sieben SNPs in der Intronsequenz gefunden.
Das KDR-Gen, wie es hier definiert ist, umfaßt kodierende Exonsequenz, zwischen den Exonsequenzen liegende Intronsequenzen sowie Sequenzen des 3'- bzw. 5'-nichttranslatierten Bereichs (3'UTR bzw. 5'UTR) und das Promotorelement des KDR-Gens stromaufwärts des 5'-UTR.
Um Zweifel zu vermeiden, ist die Lage der beiden codonändernden Polymorphismen (in Fettdruck; nur das nicht veröffentlichte Allel ist dargestellt) sowie der die Polymorphismusstellen unmittelbar flankierenden Nukleinsäuresequenz wie folgt:

(a) (Codon 297) TTAACTATAGATGGTATAACCCGGAGTGACC SEQ ID NO: 8
(b) (Codon 472) TCTTTCTTATAGCCATGCTGTCTCAGTGACA SEQ ID NO: 9 (Codon 297 wird von den Nukleotiden 1192-1194 von AF035121 und Codon 472 von den Nukleotiden 1717-1719 von AF035121 kodiert.)

Zu den hier identifizierten bestimmten polymorphen Positionen gehören:

162, 423, 461 gemäß SEQ ID NO: 1;
345 gemäß SEQ ID NO: 2;
112, 329 gemäß SEQ ID NO: 3;
224 gemäß SEQ ID NO: 4;
339 gemäß SEQ ID NO: 5;
103, 145 gemäß SEQ ID NO: 6;
32, 94 gemäß SEQ ID NO: 7; und
26 gemäß SEQ ID NO: 24.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Polymorphismus in KDR in einem Menschen bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren die Sequenz des Menschen in Position 162 gemäß SEQ ID NO: 1 von KDR in einer dem Menschen entnommenen Nukleinsäuretestprobe bestimmt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Polymorphismus in KDR in einem Menschen bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren die Sequenz des Menschen an Position 162 im Promotorbereich des KDR-Gens (wie durch die Position in SEQ ID NO: 1 definiert) in einer dem Menschen entnommenen Nukleinsäuretestprobe bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Beurteilung der Pharmakogenetik eines auf KDR wirkenden Arzneistoffs verwendet.
Der Begriff Mensch umfaßt sowohl einen Menschen, der eine durch KDR vermittelte Krankheit aufweist oder von dem vermutet wird, daß er eine von KDR vermittelte Krankheit aufweist, als auch einen asymptomatischen Menschen, der auf die Veranlagung oder Anfälligkeit gegenüber einer solchen Krankheit getestet werden kann. Dabei kann der Mensch an jeder Position jeweils homozygot für ein Allel oder heterozygot sein.
Der Begriff Polymorphismus umfaßt eine Einzelnukleotidsubstitution, Nukleotidinsertion und Nukleotiddeletion, wobei im Falle einer Insertion und Deletion die Insertion bzw. Deletion eines oder mehrerer Nukleotide an einer Position eines Gens und die entsprechenden Veränderungen im exprimierten Protein umfaßt sind.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei dem hier beschriebenen Diagnoseverfahren vorzugsweise um ein Verfahren, bei dem der Polymorphismus an Position 162 (gemäß der Position in SEQ ID NO: 1) das Vorliegen von T und/oder C ist.
Wie oben angemerkt, kann der Mensch an jeder Position für ein Allel homozygot oder heterozygot sein. Falls es sich bei dem Individuum um ein heterozygotes Individuum handelt, so können beide alternativen Polymorphismen vorhanden sein.
Bei dem Nukleinsäuresequenzdiagnoseverfahren handelt es sich vorzugsweise um ein Verfahren, das von einem Verfahren, ausgewählt aus Amplifikationsrefraktionsmutationssystem, Restriktions fragmentlängenpolymorphismus und Primerverlängerung bestimmt wird. Bei dem Aminosäurensequenz-Diagnoseverfahren handelt es sich vorzugsweise um ein Verfahren, das von immunologischen Verfahren, wie beispielsweise ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) bestimmt wird.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Diagnose oder Prognose einer durch VEGF vermittelten Krankheit bereitgestellt, bei dem man

i) das Vorliegen oder Fehlen einer Nukleotidvariante in Position 162 (gemäß SEQ ID NO: 1) im KDR-Gen in einer Testprobe aus einem Individuum nachweist und
ii) den diagnostischen oder prognostischen Zustand des Individuums unter Bezugnahme auf den Polymorphismus im KDR-Gen bestimmt.

In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Diagnose oder Prognose einer VEGF-vermittelten Krankheit bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren

i) einem Individuum Probennukleinsäure entnimmt,
ii) das Vorliegen oder Fehlen einer Nukleotidvariante an Position 162 (gemäß SEQ ID NO: 1) im KDR-Gen nachweist und
iii) den diagnostischen oder prognostischen Zustand des Individuums unter Bezugnahme auf den Polymorphismus im KDR-Gen bestimmt.

Der Zustand des Individuums kann unter Bezugnahme auf eine Allelvariation an 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder mehr beliebigen Positionen unter Verwendung der hier identifizierten Allelvarianten, gegebenenfalls zusammen mit anderen Varianten, bestimmt werden. Dabei eignet sich insbesondere die Haplotypanalyse zur Bestimmung des Zustands des Individuums.
Bei der Nukleinsäuretestprobe handelt es sich zweckmäßigerweise um eine Probe von Blut, bronchoalveolärer Lavage, Speichel oder einer anderen Körperflüssigkeit bzw. Gewebe, das bzw. die einem Individuum entnommen wurde. Dabei ist ersichtlich, daß es sich bei der Testprobe gleichermaßen um eine der Sequenz in der Testprobe entsprechende Nukleinsäuresequenz handeln kann, das heißt, daß der gesamte Bereich in der Probennukleinsäure oder ein Teil davon zunächst unter Verwendung einer beliebigen herkömmlichen Technik z.B. PCR, vor der Analyse der Allelvariation amplifiziert werden kann.

Dem Fachmann ist ersichtlich, daß es eine große Anzahl analytischer Verfahrensweisen gibt, die zum Nachweis des Vorliegens bzw. des Fehlens von Nukleotidvarianten in einer oder mehreren erfindungsgemäßen polymorphen Positionen verwendet werden können. Im allgemeinen erfordert der Nachweis einer Allelvariation eine Mutationsdiskriminierungstechnik, gegebenenfalls eine Amplifikationsreaktion und gegebenenfalls ein Signalerzeugungssystem. In Tabelle 1 sind eine Reihe von Mutationsnachweistechniken aufgeführt, von denen einige auf der PCR beruhen. Diese können in Kombination mit einer Reihe von Signalerzeugungsystemen, von denen eine Auswahl in Tabelle 2 aufgeführt ist, verwendet werden. Weitere Amplifikationstechniken sind in Tabelle 3 aufgeführt. Viele gegenwärtig verwendete Verfahren zum Nachweis einer Allelvariation werden in einem Übersichtsartikel von Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120, 1997; sowie in Standardlehrbüchern, beispielsweise "Laboratory Protocols for Mutation Detection", Hrsg. von U. Landegren, Oxford University Press, 1996 und "PCR", 2^nd Edition von Newton & Graham, BIOS Scientific. Publishers Limited, 1997 behandelt. Abkürzungen

ALEX	Amplification Refractory Mutation System Linear Extension
APEX	Arrayed Primer Extension
ARMS^TM	Amplification Refractory Mutation System
b-DNA	Branched DNA [Verzweigte DNA]
^bp	Basenpaar
CMC	Chemical Mismatch Cleavage
COPS	Competitive Oligonucleotide Priming System
DGGE	Denaturierende Gradientengelelektrophorese
ELISA	Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
FRET	Fluoreszenzresonanzenergietransfer
LCR	Ligasekettenreaktion
MASDA	Multiple Allele Specific Diagnostic Assay
NASBA	Nucleic Acid Sequence Based Amplification
OLA	Oligonucleotide Ligation Assay
PCR	Polymerasekettenreaktion
PTI	Protein truncation test [Proteinverkürzungstest]
RFLP	Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
SDA	Strand displacement amplification [Strangverdrängungsamplifikation]
SNP	Einzelnukleotidpolymorphismus
SSCP	Einzelstrangkonformationspolymorphismus-Analyse
SSR	Self sustained replication [selbst erhaltende Replikation]
TGGE	Temperaturgradientengelelektrophorese

Tabelle 1 – Mutationsnachweistechniken

Allgemein: DNA-Sequenzierung, Sequenzierung über Hybridisierung
Scanning: PTT*, SSCP, DGGE, TGGE, Cleavase, Heteroduplexanalyse, CMC, Enzymatische Fehlpaarungsspaltung *Anmerkung: nicht zum Nachweis von Promotorpolymorphismen geeignet.

Auf Hybridisierung beruhend
Festphasenhybridisierung: Dotblots, MASDA, Umkehr-Dotblots, Oligonukleotid-Arrays (DNA-Chips).
Lösungsphasenhybridisierung: Taqman^TM – US-5210015 & US-5487972 (Hoffmann-La Roche), Molecular Beacons – Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303; WO 95/13399 (Public Health Inst., New York)
Auf Verlängerung beruhend:
ARMS^TM, ALEX^TM-Europäisches Patentnr. EP 332435 B1 (Zeneca Limited), COPS – Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347.
Auf Einbau beruhend:
Minisequenzierung, APEX
Auf Restriktionsenzymen beruhend:
RFLP, Restriktionsstelle erzeugende PCR
Auf Ligation beruhend:
OLA
Andere:
Invader Assay
Tabelle 2 – Signalerzeugungs- oder Nachweissysteme
Fluoreszenz:
FRET, Fluoreszenzquenching, Fluoreszenzpolarisation – Britische Patentnr. 2228998 (Zeneca Limited)
Andere:
Chemilumineszenz, Elektrochemilumineszenz, Raman, Radioaktivität, Colorimetrischer Test, Hybridisation Protection Assay, Massenspektrometrie.
Tabelle 3 – Weitere Amplifikationsverfahren
SSR, NASBA LCR, SDA, b-DNA
Tabelle 4 – Proteinvariationsnachweisverfahren

Immuntest
Immunhistologie
Peptidsequenzierung

Zu bevorzugten Mutationsnachweistechniken zählen ARMS^TM, ALEX^TM, COPS, Taqman, Molecular Beacons, RFLP, sowie auf Restriktionsstellen beruhende PCR- und FRET-Techniken. Immuntesttechniken sind im Fachgebiet bekannt, beispielsweise A Practical Guide to ELISA von D M Kemeny, Pergamon Press 1991, Principles and Practice of Immunoassay, 2. Auflage, C P Price & D J Newman, 1997, veröffentlicht von Stockton Press in USA & Canada und von Macmillan Reference in Großbritannien.
Zu den besonders bevorzugten Verfahren zählen ARMS^TM-allelspezifische Amplifikation und auf OLA und RFLP beruhende Verfahren. Dabei ist die im Fachgebiet als ARMS^TM bekannte allelspezifische Amplifikationstechnik ein ganz besonders bevorzugtes Verfahren.
ARMS^TM-allelspezifische Amplifikation (beschrieben im europäischen Patent Nr. EP-B-332435, dem US-Patent Nr. 5,595,890 und bei Newton et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 17, S. 2503; 1989)) beruht auf der Komplementarität des 3'-terminalen Nukleotids des Primers und seiner Matrize. Dabei ist das 3'-terminale Nukleotid des Primers entweder komplementär oder nicht komplementär zu der nachzuweisenden spezifischen Mutation, dem nachzuweisenden spezifischen Allel oder Polymorphismus. Dabei besteht ein selektiver Vorteil für die Primerverlängerung von demjenigen Primer, dessen 3'-terminales Nukleotid die Basenmutation bzw. das Allel oder den Polymorphismus komplementiert. Eine enzymatische Primerverlängerung wird durch diejenigen Primer, die eine 3'-terminale Fehlpaarung mit der Matrizensequenz aufweisen, stark gehemmt oder verhindert. Eine Polymerasekettenreaktion oder in einer Richtung ablaufende Primerverlängerungsreaktionen führen daher dann zur Produktamplifikation, wenn das 3'-terminale Nukleotid des Primers das der Matrize komplementiert, jedoch nicht, oder wenigstens nicht effizient, wenn das 3'-terminale Nukleotid das der Matrize nicht komplementiert.
In einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren zur Beurteilung der Pharmakogenetik eines auf KDR wirkenden Arzneistoffs verwendet.
Dabei können Tests, beispielsweise Tests auf Reporterbasis, entwickelt werden, um nachzuweisen, ob einer oder mehrere der obigen Polymorphismen die Transkriptionsniveaus und/oder Message-Stabilität beeinflussen.
Individuen, die bestimmte Allelvarianten des KDR-Gens tragen, können daher Unterschiede in ihrer Fähigkeit zur Regulation der Proteinbiosynthese unter unterschiedlichen physiologischen Bedingungen zeigen und präsentieren Änderungen in ihrer Fähigkeit, auf unterschiedliche Erkrankungen zu reagieren. Darüber hinaus können Unterschiede, die sich als Ergebnis einer Allelvariation ergeben, eine direkte Auswirkung auf das Ansprechen eines Individuums auf eine Arzneistofftherapie haben. Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren können sich sowohl zur Vorhersage der klinischen Reaktion gegenüber solchen Mitteln als auch zur Bestimmung der therapeutischen Dosis eignen.
In einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren zur Beurteilung der Veranlagung und/oder Anfälligkeit eines Individuums gegenüber durch VEGF vermittelten Krankheiten verwendet. Dies kann insbesondere bei der Entwicklung von Krebs und Entzündungskrankheiten relevant sein, wobei die vorliegende Erfindung zur Erkennung von Individuen, die einem besonderen Risiko der Entwicklung dieser Leiden ausgesetzt sind, verwendet werden kann.
In einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren bei der Entwicklung neuer Arzneistofftherapien verwendet, die selektiv auf eine oder mehrere Allelvarianten des KDR-Gens abzielen. Die Identifizierung einer Verbindung zwischen einer bestimmten Allelvariante und der Veranlagung zur Entwicklung einer Krankheit oder dem Ansprechen auf eine Arzneistofftherapie kann sich in signifikanter Weise auf die Konstruktion neuer Arzneistoffe auswirken. Arzneistoffe können zur Regulation der biologischen Aktivität von Varianten, die mit dem Krankheitsverlauf in Zusammenhang gebracht werden, mit minimalen Auswirkungen auf andere Varianten konstruiert werden.
In einem weiteren diagnostischen Aspekt der Erfindung wird das Vorliegen oder Fehlen von Nukleotidvarianten unter Bezugnahme auf den Verlust oder Gewinn von gegebenenfalls gentechnisch erzeugten, von Restriktionsenzymen erkannten Stellen nachgewiesen. Dabei ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, diagnostische Verfahrensweisen zu entwickeln und zu realisieren, die auf dem Nachweis von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus aufgrund des Verlusts oder Gewinns einer oder mehrerer der Restriktionsstellen durch das Vorliegen eines Polymorphismus beruhen (siehe vorliegende Beispiele).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure bereitgestellt, die eine Nukleinsäuresequenz aus mindestens 20 Basen umfaßt, die den folgenden Polymorphismus besitzt: 162C (gemäß SEQ ID NO: 1), oder einen komplementären, den Polymorphismus umfassenden, Strang davon.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte oder rekombinante produzierte Nukleinsäure bereitgestellt, die eine Nukleinsäuresequenz aus mindestens 20 Basen umfaßt, die den folgenden Polymorphismus besitzt:: 162C (gemäß SEQ ID NO: 1), oder einen komplementären, den Polymorphismus umfassenden, Strang davon.
Durch die Erfindung werden ferner Nukleotidprimer bereitgestellt, die die erfindungsgemäßen KDR-Genpolymorphismen nachweisen. Diese Primer können eine beliebige Länge aufweisen, beispielsweise zwischen 8 und 100 Nukleotide, doch beträgt ihre Länge vorzugsweise zwischen 12 und 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt zwischen 17 und 30 Nukleotiden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein allelspezifischer Primer bereitgestellt, der zum Nachweis eines KDR-Gen-polymorphismus, vorzugsweise an einer oder mehreren der Positionen, wie sie hier definiert sind, fähig ist.
Ein allelspezifischer Primer wird im allgemeinen zusammen mit einem konstanten Primer in einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise einer PCR-Reaktion, mit der zwischen Allelen über selektive Amplifikation eines Allels an einer bestimmten Sequenzposition, wie sie beispielsweise für ARMS^TM-allelspezifische Amplifikationstests verwendet wird, unterschieden wird, verwendet. Dabei besteht der allelspezifische Primer vorzugsweise aus 17–50 Nukleotiden, stärker bevorzugt aus etwa 17–35 Nukleotiden, stärker bevorzugt aus etwa 17–30 Nukleotiden.
Ein allelspezifischer Primer entspricht vorzugsweise genau dem nachzuweisenden Allel, doch werden auch Derivate davon in Betracht gezogen, bei denen etwa 6–8 der Nukleotide am 3'-Terminus dem nachzuweisenden Allel entsprechen und bis zu 10, wie beispielsweise bis zu 8, 6, 4, 2, oder 1 der restlichen Nukleotide variiert werden können, ohne daß sich dies in signifikanter Weise auf die Eigenschaften des Primers auswirkt. Häufig bildet das Nukleotid an der Position –2 und/oder –3 (relativ zum 3'-Terminus) eine Fehlpaarung, um die differentielle Primerbindung und die bevorzugte Verlängerung nur vom korrekten alleldiskriminierenden Primer zu optimieren.
Primer können mit allen herkömmlichen Syntheseverfahren hergestellt werden. Beispiele für derartige Verfahren finden sich in Standardlehrbüchern, beispielsweise "Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties", Methods in Molecular Biology Series; Band 20; Hrsg. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7; 1993, 1^st Edition. Falls erforderlich, kann der Primer bzw. können die Primer markiert werden, um den Nachweis zu erleichtern.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine allelspezifische Oligonukleotidsonde bereitgestellt, die zum Nachweis eines KDR-Gen-Polymorphismus, vorzugsweise an einer oder mehrerer der hier definierten Positionen, fähig ist.
Die allelspezifische Oligonukleotidsonde besteht vorzugsweise aus 17–50 Nukleotiden, stärker bevorzugt aus etwa 17–35 Nukleotiden, stärker bevorzugt aus etwa 17–30 Nukleotiden.
Die Konstruktion derartiger Sonden ist dem durchschnittlich begabten Molekularbiologen ersichtlich. Derartige Sonden können eine beliebige zweckmäßige Länge, wie beispielsweise bis zu 50 Basen, bis zu 40 Basen, noch zweckmäßiger bis zu 30 Basen, wie beispielsweise 8–25 oder 8–15 Basen, aufweisen. Im allgemeinen umfassen solche Sonden Basensequenzen, die zum entsprechenden Wildtyp- oder Variantenlokus im Gen vollständig komplementär sind. Allerdings können, falls erforderlich, eine oder mehrere Fehlpaarungen eingeführt werden, vorausgesetzt, daß davon die Diskriminierungsleistung der Oligonukleotidsonde nicht übermäßig betroffen wird. Die erfindungsgemäßen Sonden können zu Erleichterung des Nachweises eine oder mehrere Markierungen, wie z.B. in Molecular Beacons, tragen. SED ID NO: 8, 9 oder deren Komplement entsprechende einzelsträngige Oligonukleotide könnten als Sonden zum Nachweis des jeweiligen Polymorphismus in der zentralen Position (in Fettdruck) verwendet werden. Die Sonde würde mit größerer Effizienz an eine Zielsequenz binden, die die jeweilige komplementäre Polymorphismusbase in dieser zentralen (Polymorphismus-)Lage besitzt, als an eine mit einer Basenfehlpaarung.
Gemäß einem weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine allelspezifische Oligonukleotidsonde bereitgestellt, die zum Nachweis des KDR-Gen-Polymorphismus in Position 162 (gemäß SEQ ID NO: 1) fähig ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostischer Kit bereitgestellt, der eine erfindungsgemäße allelspezifische Oligonukleotidsonde umfaßt.
Die diagnostischen Kits können eine geeignete Verpackung sowie Anweisungen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren umfassen. Ferner können solche Kits einen geeigneten Puffer und eine geeignete Polymerase bzw. geeignete Puffer und Polymerasen umfassen, wie beispielsweise temperaturstabile Polymerasen, z.B. Taq-Polymerase. Ebenso können solche Kits begleitende Primer und/oder Kontrollprimer oder -sonden umfassen. Dabei handelt es sich bei einem begleitenden Primer um einen Primer, der Teil des zur Durchführung der PCR verwendeten Primerpaars ist. Ein derartiger Primer komplementiert normalerweise den Matrizenstrang genau.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt können die Polymorphismen der vorliegenden Erfindung als genetische Marker in Verknüpfungsstudien verwendet werden. Dies gilt insbesondere für die Polymorphismen mit relativ hoher Häufigkeit. Das KDR-Gen konnte auf Chromosom 4q11-q12 lokalisiert werden (Sait et al (1995) Cytogen Cell Genet 70, 145–146; Spritz et al (1994) Genomics 22, 431–436). Polymorphismen mit geringer Häufigkeit können besonders für die Haplotypisierung, wie unten beschrieben, geeignet sein. Ein Haplotyp ist ein Satz von Allelen, die an verknüpften polymorphen Stellen (wie z.B. innerhalb eines Gens) auf einem einzigen (väterlichen oder mütterlichen) Chromosom angetroffen werden. Falls die Rekombination innerhalb des Gens zufällig verläuft, kann es bis zu 2" Haplotypen geben, wobei 2 gleich der Anzahl von Allelen bei jedem SNP und n gleich der Anzahl an SNPs ist. Ein Ansatz zur Identifizierung von Mutationen oder Polymorphismen, die mit einer klinischen Reaktion korreliert sind, besteht in der Durchführung einer Assoziationsstudie, bei der alle Haplotypen, die sich in der interessierenden Population identifizieren lassen, verwendet werden. Die Häufigkeit eines jeden Haplotyps wird durch die Häufigkeit seines seltensten Allels limitiert, so daß SNPs mit Allelen geringer Häufigkeit besonders geeignete Marker für Haplotypen mit geringer Häufigkeit darstellen. Da bestimmte Mutationen oder Polymorphismen, die mit bestimmten klinischen Merkmalen, wie z.B. negativen oder abnormalen Ereignissen, assoziiert sind, innerhalb der Population wahrscheinlich mit geringer Häufigkeit auftreten, können SNPs mit geringer Häufigkeit bei der Identifizierung dieser Mutationen besonders geeignet sein (siehe beispielsweise: Linkage disequilibrium at the cystathionine beta synthase (CBS) locus and the association between genetic variation at the CBS locus and plasma levels of homocysteine. Ann Hum Genet (1998) 62:481-90, De Stefano V. Dekou V, Nicaud V, Chasse JF, London J, Stansbie D, Humphries SE und Gudnason V; und Variation at the von willebrand factor (vWF) gene locus is associated with plasma vWF:Ag levels: identification of three novel single nucleotide polymorphisms in the vWf gene promoter. Blond (1999) 93:4277-83, Keightley Am, Lam YM, Brady JN, Cameron CL, Lillicrap D).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere diejenigen, die mit den hier identifizierten Einzelnukleotidpolymorphismen in Verbindung stehen und diese identifizieren, repräsentieren eine wertvolle Informationsquelle, mit der Individuen hinsichtlich beispielsweise ihrer Identität, ihrem Haplotyp und anderen Teilklassifizierungen, wie beispielsweise der Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit bestimmten Arzneistoffen, charakterisiert werden können. Diese Ansätze werden am einfachsten dadurch erleichtert, daß man die Sequenzangaben in einem computerlesbaren Datenträger speichert und anschließend die Angaben in Standardprogrammen für makromolekulare Strukturen oder zur Suche von Sequenzdatenbanken unter Verwendung von Suchwerkzeugen des Standes der Technik, wie z.B. GCG (Genetics Computer Group), BlastX BlastP, BlastN, FASTA (siehe Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990), verwendet. Somit stellen die polymorphismushaltigen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen besonders geeignete Komponenten in zur Sequenzidentität, Genomkartierung, Pharmakogenetik und anderen Suchanalysen geeigneten Datenbanken dar. Dabei können die Sequenzangaben in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Polymorphismen auf einem greifbaren Datenträger, wie beispielsweise einer Computerdiskette, vorzugsweise in computerlesbarer Form, verkleinert, darin umgewandelt oder darauf gespeichert werden, beispielsweise als chromatographische Rasterdaten oder Spitzenwertdaten, photographische Raster- oder Spitzenwertdaten, massenspektrographische Daten, Sequenzgel- (oder andere) daten.
Vorzugsweise ist die Bestimmung des Zustands des Menschen klinisch geeignet. Beispiele für die klinische Eignung umfassen die Entscheidung darüber, welcher Arzneistoff bzw. welche Arzneistoffe zu verabreichen sind, und/oder die Entscheidung über die wirksame Menge des Arzneistoffs bzw. der Arzneistoffe. Dabei bedeutet der Begriff "auf KDR wirkender Arzneistoff", daß die Arzneistoffbindung mit dem KDR-Protein beim Menschen einen wichtigen Teil der Manifestierung des pharmazeutischen Effekts eines Arzneistoffs beim Menschen darstellt.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
In den nachfolgenden Beispielen wurden die folgenden Methoden und Materialien angewandt, falls nicht anders angegeben.
AMPLITAQ^TM, erhältlich von Perkin-Elmer Cetus, wird als Quelle für die temperaturstabile DNA-Polymerase verwendet.
Allgemeine molekularbiologische Verfahrensweisen lassen sich nach einem der in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" Second Edition, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) oder "Current Protocols in Molekular Biology Volumes 1–3, herausgegeben von FM Asubel, R Brent, RE Kingston pub John Wiley 1998, durchführen.
Elekropherogramme wurden routinemäßig erstellt: Die Daten wurden mit der Datensammlungssoftware ABI377 gesammelt und die Wellenform mittels ABI Prism-Sequenzieranalyse (2.1.2) erzeugt.
BEISPIEL 1
Identifizierung von Polymorphismen
1. Methoden
DNA-Präparation
DNA wurde aus in EDTA gesammelten gefrorenen Blutproben nach Vorschrift I (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p392, Sambrook, Fritsch und Maniatis, 2^nd Edition, Cold Spring Harbour Press, 1989) mit den folgenden Modifikationen präpariert. Das aufgetaute Blut wurde im gleichen Volumen Standardkochsalz-Citrat-Lösung statt phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt, um lysierte rote Blutzellen abzutrennen. Die Proben wurden mit Phenol, danach mit Phenol-Chloroform und anschließend mit Chloroform statt mit drei Phenolextraktionen extrahiert. Die DNA wurde in entionisiertem Wasser gelöst. Es wurden 29 einzelne Proben analysiert.
Matrizenherstellung
Matrizen wurden mittels PCR unter Verwendung der unten angegebenen Oligonukleotidprimer und Annealing-Temperaturen hergestellt. Die Verlängerungstemperatur betrug 72º und die Denaturierungstemperatur 94º. Im allgemeinen wurden bei jeder Reaktion 50 mg genomische DNA eingesetzt und 35 Zyklen PCR unterzogen. Das primäre Fragment, wurde, wo es unten beschrieben ist, 1:100 verdünnt, und zwei Mikroliter wurden als Matrize für die Amplifikation sekundärer Fragmente verwendet. Die PCR wurde in zwei Stufen durchgeführt (primäres Fragment, danach sekundäres Fragment), um die spezifische Amplifikation der gewünschten Zielsequenz sicherzustellen. Neue Polymorphismen innerhalb des kodierenden Bereichs von KDR
Der Polymorphismus in Position 224 führt zu einer Codonänderung von Valin (GTA) zu Isoleucin (ATA) in Codonposition 297 (Codonnummerierung gemäß EMBL Accession Number AF035121). Codon 297 ist im Exon 7 lokalisiert, wobei der Aminosäurerest 297 einen Teil der dritten Ig-ähnlichen Domäne im extrazellulären Bereich von KDR bildet (Terman et al., (1992) Biochem Biophys Res Comm 187:1579-1586). Man nimmt an, daß die dritte Ig-ähnliche Domäne eine Rolle bei der Ligandenbindung spielt (Lu et al., supra).
Die den G/A-Polymorphismus in Position 224 flankierenden Sequenzen sind nachfolgend angegeben (Positionen 174–274, Nummerierung gemäß SEQ ID NO: 4)
AGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTRTAAC
CCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTG(SEQ ID NO: 10)
mit R = G oder A
Durch gentechnische Manipulation des Nukleotids 225 (T–C) wird eine polymorphe RsaI-Stelle (GTAC) geschaffen, die sich als diagnostischer Essay für den Polymorphismus in Position 224 verwenden läßt.
Vorwärtsprimer 1–20
Gentechnisch manipulierter Primer 225-244 5' TCCTTGGTCACTCCGGGTTG (SEQ ID NO: 25); geänderte Base in Fettdruck.
Ein von einem Wildtyp-Individuum (G-Variant) erzeugtes PCR-Produkt (244 bp) wird bei Verdauung mit RsaI (New England Biolabs) nicht gespalten. Verdauung eines von einem heterozygoten Individuum abgeleiteten Produkts erzeugt Produkte mit 244 bp, 224 bp und 20 bp. Verdauung eines von einem für die A-Variante homozygoten Individuum abgeleiteten Produkts ergibt Produkte mit 224 bp und 20 bp.
Der Polymorphismus in Position 145 führt zu einer Codonänderung von Glutamin (CAA) zu Histidin (CAT) in Codonposition 472 (Codonnummerierung gemäß EMBL Accession Number AF035121). Codon 472 liegt im Exon 11, und der Aminosäurerest 472 liegt in der fünften Ig-ähnlichen Domäne im extrazellulären Bereich von KDR (Terman et al., 1992, supra).
Die den A/T-Polymorphismus (W) in Position 145 flankierenden Sequenzen sind nachfolgend angegeben (Positionen 95–195, Nummerierung gemäß SEQ ID NO: 6).
TAAAGAAAAATTAAATCATAATATGCGCTGTTATCTCTTTCTTATAGCCAWGCTG
TCTCAGTGACAAACCCATACCCTTGTGAAGAATGGAGAAGTGTGGAGGA(SEQ ID NO: 11)
mit W = A oder T.
Durch den Polymorphismus in Position 145 (A/T) wird eine NlaIII-Restriktionstelle (CATG) geschaffen, die sich als diagnostischer Test verwenden läßt. Ein von einem Wildtyp-Individuum (A-Variante) erzeugtes PCR-Produkt (499 bp) wird bei Verdauung mit NlaIII (New England Biolabs) nicht gespalten. Die Verdauung eines von einem heterozygoten Individuum abgeleiteten Produkts erzeugt Produkte mit 146 bp, 353 bp und 499 bp. Verdauung eines von einem für die T-Variante homozygoten Individuum abgeleiteten PCR-Produkts erzeugt Produkte mit 146 bp und 353 bp. Neue Polymorphismen im Promotor des KDR-Gens (SEQ ID NO: 1. Positionen 16–534 EMBL Accession Number No X89776)
Die den T/C-Polymorphismus (Y) in Position 162 flankierenden Sequenzen sind nachfolgend angegeben (Positionen 112–212, der SEQ ID NO: 1).
AGGTCACTTCAAACTTGGAGCCGCCAAATATTTTGGGAAATAGCGGGAATGYTGG
CGAACTGGGCAAGTGCGTTTTCTGATTAAGAGCAACCAGATTCAGCT (SEQ ID NO: 12)
mit Y = T oder C.
Die den T/C-Polymorphismus (S) in Position 423 flankierenden Sequenzen sind nachfolgend angegeben (entspricht Positionen 373–473 der SEQ ID NO: 1).
GCGCGATGGCGAAGAGGGTCCTGCACTTTGACGCGCCTGGTGAGGGAGCGSTGCT
CTTCGCAGCGCTCCTGGTGATGCTCCCCAAATTTCGGGGACCGGC (SEQ ID NO: 13)
mit S = C oder G
Die den T/C-Polymorphismus (Y) in Position 461 flankierenden Sequenzen sind nachfolgend angegeben (entspricht Positionen 411–511 der SEQ ID NO: 1).
GGTGAGGGAGCGGTGCTCTTCGCAGCGCTCCTGGTGATGCTCCCCAAATTYCGGG
GACCGGCAAGCGATTAAATCTTGGAGTTGCTCAGCGCCCGTTACCG (SEQ ID NO: 14)
mit Y = T oder C Neue Polymorphismen in flankierender Intronsequenz
Die den G/A-Polymorphismus (R) in Position 345 (der SEQ ID NO: 2) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (entspricht Positionen 295–395 der SEQ ID NO. 2).
GATTTCTTGTGTTAAGTAACTGATTGTTTATTGAGTGGAAATAATTTCCARTAGAG
CAGAATTATAATAGAGCTTGTAGTAATTGTTCATAAGTGGTGAGG (SEQ ID NO: 15)
mit R = G oder A
Die den G/A-Polymorphismus (R) in Position 112 (gemäß SEQ ID NO: 3) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 62–162 der SEQ ID NO: 3).
AAAAAATAAATCTGTGCAAAGTTATAGGCTTATTTGCTCTCTCATGTTCTRTTTT
TCAATTTACTTGCTCTAGGGTATAGGATTTATGATGTGGTTCTGA (SEQ ID NO: 16)
mit R = G oder A
Die den G/A-Polymorphismus (R) in Position 329 (gemäß SEQ ID NO: 3) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 279–379 der SEQ ID NO: 3).
ACGCTAATGATTCAAAGCCAGACCTCCAAATACTTACATAATAAGCCCCARTGAA
GTTTGCTTGAGAGATAGGGGCCTCTTTGGCCAGATAAAATGTAAGA (SEQ ID NO: 17)
mit R = G oder A
Die den G/A-Polymorphismus (R) in Position 339 (gemäß SEQ ID NO: 6) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 289–377 der SEQ ID NO: 6).
ACCACCGTTCCTCTGCCTCCTGCTGCTTCACTCATATCATGGCTGGGCCTRCGTAC
AAAAGTCATCTGGCGTGGTGAAGCTGAAGTGAA (SEQ ID NO: 18).
mit R = G oder A
Die den A/C-Polymorphismus (M) in Position 103 (gemäß SEQ ID NO: 7) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 53–153 der SEQ ID NO: 6).
AATAACCAAAGTCTGAATCTTTTCCTTACTCTTGACTCTAATTAAAGAAAMATTA
AATCATAATATGCGCTGTTATCTCTTTCTTATAGCCAAGCTGTCTC (SEQ ID NO: 19)
mit M = A oder C
Die den T/G-Polymorphismus (K) in Position 32 (gemäß SEQ ID NO: 7) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 1–82 der SEQ ID NO: 7).
TTGATGTCCTCCTTGTCTGCTTTTTAGTAGTKTCAATTATCTCCATGGTTTACTACA
TTTTAAAGGTTGTAAACTTTTAAAG (SEQ ID NO: 20)
mit K = T oder G
Die den A/T-Polymorphismus (W) in Position 94 (gemäß SEQ ID NO: 8) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 44–144 der SEQ ID NO: 7).
CATGGTTTACTACATTTTAAAGGTTGTAAACTTTTAAAGACTCATTTTGTWTTCAA
GGAGTTTGTTTGTTCCTTTGCTTTTTTATAGACCAAAGGGGCACG (SEQ ID NO: 21)
mit W = A oder T Neuer Polymorphismus im 5'-UTR des KDR-Gens
Die den G/A-Polymorphismus (R) in Position 26 (gemäß SEQ ID NO: 24) flankierenden Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 193–243 der SEQ ID NO: 22):
TCCCGGGACCCCGGGAGAGCGGTCARTGTGTGGTCGCTGCGTTTCCTCTGC
mit R = G oder A
SEQ ID NO: 24 ist eine Teilsequenz der SEQ ID NO: 23, welche eine Teilsequenz der SEQ ID NO: 22 ist.
BEISPIEL 2
Haplotypanalyse von KDR-Polymorphismen
Zwei kodierende Polymorphismen (Valin 297 Isoleucin; Glutamin 472 Histidin) im KDR-Gen wurden in Verbindung mit einem Intron-SNP (G/A-Position 339 gemäß SEQ ID NO: 5) zur Vorhersage von Haplotyphäufigkeiten verwendet.

Polymorphismus Allelhäufigkeit

Codon 297 Val (GTA)/IIe (ATA) G 89% A 11%

Intronposition 339 in SEQ ID NO: 5 G 74% A 26%

Codon 472 GIn (CAA)/His (CAT) A 73% T 27%
Die Polymorphismen decken eine Strecke von 6,5 kb ab; Genotypen in 73 Individuen wurden durch Sequenzierung und Haplotyphäufigkeiten unter Verwendung einer Kombination aus Clarks Algorithmus und der EH (End Haplotype)-Software bestimmt. In den 73 Individuen wurden lediglich 5 Haplotypen beobachtet.

Haplotyp Häufigkeit(%)

GGA 40

GGT 24

GAA 26

AGT 6

AAA 4

Anmerkungen zum Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 (Entspricht Positionen 16–534 der EMBL Accession No X89776) Positionen 1–519 (Promoterbereich)

Polymorphismus T/C 162

C/G 423

T/C 461

Vorwärtsprimer 1–20; Rückwärtsprimer 500–519

SEQ ID NO: 2 (Entspricht Positionen 150523–151026 der EMBL Accession AC 021220)

Flankierendes Intron 1–178

Exon 2 178–272

Flankierendes Intron 273–503

Polymorphismus G/A 345

Vorwärtsprimer 1–20; Rückwärtsprimer 484–503

SEQ ID NO: 3 (Entspricht Positionen 143659–144055 der EMBL Accession AC 021220)

Vorwärtsprimer 1–20; Rückwärtsprimer 388–397

Flankierendes Intron 1–135

Exon 6 136–275

Flankierendes Intron 276–397

Polymorphismus G/A 112

Polymorphismus G/A 329

SEQ ID NO: 4

Vorwärtsprimer 1–20; Rückwärtsprimer 434–453

Flankierendes Intron 1–133

Exon 7 134–311

Flankierendes Intron 312–453

Polymorphismus G/A 224
Position 1–393 entspricht Positionen 143269–142877 der AC021220. Positionen 394–453 entsprechen neuer Sequenz, die durch Sequenzierung des BAC-Klons 81A1 bestimmt wurde. SEQ ID NO: 5 (Entspricht Positionen 11289–113265 der EMBL Accession Number AC021220)

Vorwärtsprimer 1–20; Rückwärtsprimer 358–377

Flankierendes Intron 1–57

Exon 9 58–221

Flankierendes Intron 221–377

Polymorphismus G/A 339

SEQ ID NO: 6 (Entspricht Positionen 109095–109593 der EMBL Accession Number AC021220)

Vorwärtsprimer 1–20; Rückwärtsprimer 480–499

Flankierendes Intron 1–141

Exon 11 142–275

Flankierendes Intron 276–499

Polymorphismus G/A 103

Polymorphismus A/T 145

SEQ ID NO: 7 (Entspricht Positionen 79362–79718 der AC021220)

Vorwärtsprimer 1–20; Rückwärtsprimer 338–357

Flankierendes Intron 1–130

Exon 21 131–284

Flankierendes Intron 285–357

Polymorphismus T/G 32

Polymorphismus A/T 94

SEQ ID NO: 22 (von EMBL Accession AC021220 abgeleitete Intronsequenz. Positionen 187–556 entsprechen Positionen 1–370 der EMBL Accession AF035121. Position 218 entspricht Position 32 in EMBL Accession AF035121).

Flankierendes Intron 1–186

Exon 1 187–556

Flankierendes Intron 557–628

Polymorphismus G/A 218

Vorwärtsprimer 1–24; Rückwärtsprimer 605–628

SEQ ID NO: 23 (von EMBL Accession AC021220 abgeleitete Intronsequenz. Positionen 124–315 entsprechen Positionen 1–192 der EMBL Accession AF035121. Position 145 entspricht Position 32 in EMBL Accession AF035121).

Flankierendes Intron 1–123

Exon 1 124–315

Polymorphismus G/A 145

Vorwärtsprimer 1–24; Rückwärtsprimer 292–315

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Polymorphismus in KDR in einem Menschen, wobei man in dem Verfahren die Sequenz des Menschen in Position 162 gemäß SEQ ID NO: 1 von KDR in einer dem Menschen entnommenen Nukleinsäuretestprobe bestimmt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Einzelnukleotidpolymorphismus in Position 162 (gemäß der Position in SEQ ID NO: 1) das Vorliegen von T und/oder C ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der den potentiellen Einzelnukleotidpolymorphismus enthaltende Nukleinsäurebereich mittels Polymerasekettenreaktion vor Bestimmung der Sequenz amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Vorliegen oder Fehlen des Einzelnukleotidpolymorphismus unter Bezugnahme auf den Verlust oder Gewinn von gegebenenfalls gentechnisch erzeugten, von Restriktionsenzymen erkannten Stellen nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 – 4, wobei der jeweilige Polymorphismus mit einem Verfahren, ausgewählt aus ARMS-allelspezifischer Amplifikation, allelspezifischer Hybridisierung, Oligonukleotidligationstest oder Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Beurteilung der Veranlagung und/oder Anfälligkeit eines Individuums gegenüber durch VEGF vermittelten Krankheiten.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die durch VEGF vermittelte Krankheit ausgewählt ist aus Krebs und Entzündungskrankheit.
Verfahren zur Diagnose oder Prognose einer VEGF-vermittelten Krankheit, bei dem man (i) das Vorliegen oder Fehlen einer Nukleotidvariante in Position 162 (gemäß SEQ ID NO: 1 im KDR-Gen in einer Testprobe aus einem Individuum nachweist und (ii) den diagnostischen oder prognostischen Zustand des Individuums unter Bezugnahme auf den Polymorphismus im KDR-Gen bestimmt.
Verfahren zur Identifizierung der Veranlagung eines Individuums zur Entwicklung einer VEGF-vermittelten Krankheit, wobei man in dem Verfahren (i) das in Position 162 (gemäß SEQ ID NO: 1) im KDR-Gen in einer dem Individuum entnommenen Testprobe vorliegende Nukleotid identifiziert und (ii) die Veranlagung eines Individuums zur Entwicklung einer VEGF-vermittelten Krankheit gemäß den in Schritt (i) erhaltenen Ergebnissen bestimmt
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei dem Nukleotid in Position 162 um T und/oder C handelt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die VEGF-vermittelte Krankheit ausgewählt ist aus Krebs und Entzündungskrankheit.
Allelspezifische Oligonukleotidsonde, fähig zum Nachweis eines Polymorphismus im KDR-Gen in Position 162 (gemäß SEQ ID NO: 1).
Allelspezifische Nukleotidsonde, die die in SEQ ID NO: 12 offenbarte Sequenz oder eine dazu komplementäre Sequenz umfaßt.
Diagnostischer Kit, umfassend eine oder mehrere allelspezifische Oligonukleotidsonde(n) mit der in Anspruch 12 oder 13 angegebenen Bedeutung.