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Die
vorliegende Erfindung betrifft Polymorphismen im menschlichen KDR-Gen
sowie entsprechende, davon kodierte neuartige allelische Polypeptide.
Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren und Materialien zur Analyse
der Allelvariation im KDR-Gen sowie die Verwendung des KDR-Polymorphismus
bei der Behandlung von durch KDR-Liganden (VEGF [Vascular Endothelial
Growth Factor]) vermittelten Krankheiten, wie beispielsweise Krebs
und verschiedene Entzündungskrankheiten
(Übersichtsartikel
von Carmeliet und Jain (2000) Nature 407: 249-257; Ferrara und Alitalo
(1999) Nature Medicine 5:1359-1364) mit KDR-Inhibitoren.
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Die
KDR-cDNA(EMBL Accession Number AF035121, 5830 bp) kodiert für ein reifes
Protein mit 1356 Aminosäuren.
Das KDR-Protein besteht aus einer externen Domäne mit sieben immunglobulinähnlichen
Domänen,
einem Transmembranbereich sowie einem zytoplasmatischen Bereich
mit einer Tyrosinkinasedomäne.
Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der Familie der Rezeptortyrosinkinasen
besteht die Kinasendomäne des
KDR aus zwei Abschnitten mit einer dazwischenliegenden Sequenz von
~ 70 Aminosäuren.
Die Biologie der VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)-Rezeptorfamilie
wurde in einem Übersichtsartikel
(Neufeld et al., (1999) FASER Journal. 13:11-22; Zachary (1998)
Experimental Nephrology 6:480-487) behandelt, und die Tyrosinphosphorylierungsstellen
wurden charakterisiert. Die Ligandenbindungsstellen in der extrazellulären KDR-Domäne wurden
identifiziert (Lu et al., (2000) J Biol Chem 275:14321-14330). Die
genomische Struktur des menschlichen KDR-Gens ist beschrieben (Yin
et al (1998) Mammalian Genome. 9:408-410). Das Gen enthält 28 Exons,
die 45 kb umfassen, und wurde auf Chromosom 4 q11-q12 lokalisiert
(Saft et al (1995) Cytogen Cell Genet 70:145-146; Spritz et al.
(1994) Genomics 22:431-436). Die genomische Sequenz von Contigs,
die den Bereich mit dem KDR-Gen umfassen, ist veröffentlicht
(EMBL Accession AC021220, 226334 pb). Die Veröffentlichung von Patterson
et al. (29. September 1995) umfaßt die Klonierung und Funktionsanalyse
des Promotors für
KDR, einen Rezeptor für
den vaskulären
Endothelwachstumsfaktor (Journal of Cellular Biology, Band 270,
Nummer 39, Seiten 23111-23118). Zwar umfaßt dieses Dokument einen Cytosinrest
an Position 162, doch handelt es sich hierbei um eine zufällige Angabe
und nicht um eine Vorwegnahme des Ergebnisses der zugrundeliegenden
Anmeldung, wodurch diese bestimmte Position (1.) als ein Einzelnukleotidpolymorphismus
und (2.) als mit einer durch VEGF vermittelten Krankheit verbunden
identifiziert wurde.
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Der
Ort der Polymorphismen läßt sich
unter Bezugnahme auf die veröffentlichten
Sequenzzugangsnummern von EMBL (oder einer anderen Sequenzdatenbank)
(d.h. EMBL Accession Number AC021220 oder AF035121) präzise kartieren,
wobei der Fachmann andererseits in der Lage ist, den Ort des Polymorphismus im
KDR-Gen präzise
zu identifizieren, indem er einfach genügend neben dem Polymorphismus
liegende flankierende Sequenz bereitstellt, um so den Polymorphismus
eindeutig zu lokalisieren. Dabei sollte die Bereitstellung von 10
oder mehr Nukleotiden auf beiden Seiten des Polymorphismus ausreichen,
um die präzise Ortskartierung
des jeweiligen Polymorphismus zu erreichen.
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Man
nimmt an, daß KDR
(VEGFR2) die mitogenen und angiogenen Effekte von VEGF in Endothelzellen
vermittelt, während
ein weiterer VEGF-Rezeptor (flt-1) eine wichtige Rolle bei der Regulation
der Gewebearchitektur im sich entwickelnden Gefäßsystem spielt. Hinweise zur
Unterstützung
dieser Theorie ergaben sich aus Knockout-Untersuchungen in Mäusen (Fong
et al., (1995) Nature 376:66-70; Shalabay et al., (1995) Nature
376:62-66) sowie aus biochemischen Untersuchungen (Waltenberger
et al., (1994) J Biol Chem. 269:26988-26995). Die Aktivierung von
Endothelzellen durch VEGF führt
zu Autophosphorylierung von KDR und anschließender Tyrosinphosphorylierung
mehrerer nachgeschalteter Ziele (Übersichtsartikel von Gingras et
al., (2000) Biochem J. 348:273-280).
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VEGF
und seine Rezeptoren werden in vielen Tumorarten überexprimiert,
wobei die Blockierung der VEGF-Funktion,
die Angiogenese hemmt und das Wachstum von Tumoren unterdrückt, während die Überexpression
von VEGF die Angiogenese bzw. das Tumorwachstum verstärkt. (Skobe
et al., (1997) Nature Medicine 3:1222, 12227). Am KDR-Rezeptor wirkende
Verbindungen sind daher als Pharmazeutika zur Verwendung bei der
Behandlung vieler verschiedener Tumore indiziert (Ferrara und Alitalo
(1999) Nature Medicine 5:1359-1364).
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Die
Verwendung der Kenntnis von Polymorphismen als Hilfe bei der Identifizierung
von Patienten, die sich am besten für eine Therapie mit bestimmten
Pharmazeutika eignen, wird häufig "Pharmakogenetik" genannt. Die Pharmakogenetik
läßt sich
auch in der pharmazeutischen Forschung zur Unterstützung des
Wirkstoffauswahlprozesses einsetzen. Polymorphismen werden bei der
Kartierung des menschlichen Genoms sowie zur Aufklärung der
genetischen Komponenten von Krankheiten verwendet. Hinsichtlich
Hintergrundinformationen zur Pharmakogenetik sowie zu anderen Verwendungen
für den
Polymorphismusnachweis wird der Leser auf die folgenden Literaturstellen
verwiesen: Linder et al. (1997), Clinical Chemistry, 43:254; (Marshall (1997),
Nature Biotechnology. 15:1249; Internationale Patentanmeldung
WO 97/40462 , Spectra Biomedical; und
Schafer et al, (1998), Nature Biotechnology. 16:33.
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In
klinischen Versuchsstudien konnte gezeigt werden, daß das Ansprechen
von Patienten auf eine Behandlung mit Pharmazeutika häufig heterogen
ist. Somit besteht ein Bedarf an verbesserten Ansätzen zur Konstruktion
von und Therapie mit Pharmazeutika.
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Punktmutationen
in Polypeptiden werden wie folgt bezeichnet: Natürliche Aminosäure (unter
Verwendung der 1- bzw. 3-Buchstaben-Nomenklatur), Position, neue
Aminosäure.
Beispielsweise bedeutet in einem hypothetischen Beispiel "D25K" bzw. "Asp25Lys", das an Position
25 eine Asparaginsäure
(D) gegen Lysin (K) ausgetauscht wurde. Mehrere Mutationen in einem
einzigen Polypeptid sind zwischen eckigen Klammern angegeben, wobei
einzelne Mutationen durch Kommas getrennt sind. Das Vorliegen einer
bestimmten Base an einer Polymorphismusposition wird durch die der
Polymorphismusposition folgende Base repräsentiert. Beispielweise wird
in einem hypothetischen Beispiel das Vorliegen von Adenin an Position
300 als: 300 A dargestellt.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung von Polymorphismen
im KDR-Gen. Insbesondere wurden dabei 2 Polymorphismen in der kodierenden
Sequenz des KDR-Gens gefunden, die jeweils zu einem Aminosäureaustausch
in der Sequenz des exprimierten Proteins führen. Ebenso wurden drei einzelne Nukleotidpolymorphismen
(SNPs) im Promotorbereich, ein SNP im 5'-UTR und sieben SNPs in der Intronsequenz
gefunden.
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Das
KDR-Gen, wie es hier definiert ist, umfaßt kodierende Exonsequenz,
zwischen den Exonsequenzen liegende Intronsequenzen sowie Sequenzen
des 3'- bzw. 5'-nichttranslatierten
Bereichs (3'UTR
bzw. 5'UTR) und
das Promotorelement des KDR-Gens stromaufwärts des 5'-UTR.
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Um
Zweifel zu vermeiden, ist die Lage der beiden codonändernden
Polymorphismen (in Fettdruck; nur das nicht veröffentlichte Allel ist dargestellt)
sowie der die Polymorphismusstellen unmittelbar flankierenden Nukleinsäuresequenz
wie folgt:
- (a) (Codon 297) TTAACTATAGATGGTATAACCCGGAGTGACC
SEQ ID NO: 8
- (b) (Codon 472) TCTTTCTTATAGCCATGCTGTCTCAGTGACA SEQ ID NO: 9
(Codon 297 wird von den Nukleotiden 1192-1194 von AF035121 und Codon
472 von den Nukleotiden 1717-1719 von AF035121 kodiert.)
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Zu
den hier identifizierten bestimmten polymorphen Positionen gehören:
- 162,
423, 461 gemäß SEQ ID
NO: 1;
- 345 gemäß SEQ ID
NO: 2;
- 112, 329 gemäß SEQ ID
NO: 3;
- 224 gemäß SEQ ID
NO: 4;
- 339 gemäß SEQ ID
NO: 5;
- 103, 145 gemäß SEQ ID
NO: 6;
- 32, 94 gemäß SEQ ID
NO: 7; und
- 26 gemäß SEQ ID
NO: 24.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis
eines Polymorphismus in KDR in einem Menschen bereitgestellt, wobei
man in dem Verfahren die Sequenz des Menschen in Position 162 gemäß SEQ ID
NO: 1 von KDR in einer dem Menschen entnommenen Nukleinsäuretestprobe bestimmt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines
Polymorphismus in KDR in einem Menschen bereitgestellt, wobei man
in dem Verfahren die Sequenz des Menschen an Position 162 im Promotorbereich
des KDR-Gens (wie durch die Position in SEQ ID NO: 1 definiert)
in einer dem Menschen entnommenen Nukleinsäuretestprobe bestimmt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Verfahren zur Beurteilung der Pharmakogenetik eines auf
KDR wirkenden Arzneistoffs verwendet.
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Der
Begriff Mensch umfaßt
sowohl einen Menschen, der eine durch KDR vermittelte Krankheit
aufweist oder von dem vermutet wird, daß er eine von KDR vermittelte
Krankheit aufweist, als auch einen asymptomatischen Menschen, der
auf die Veranlagung oder Anfälligkeit
gegenüber
einer solchen Krankheit getestet werden kann. Dabei kann der Mensch
an jeder Position jeweils homozygot für ein Allel oder heterozygot
sein.
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Der
Begriff Polymorphismus umfaßt
eine Einzelnukleotidsubstitution, Nukleotidinsertion und Nukleotiddeletion,
wobei im Falle einer Insertion und Deletion die Insertion bzw. Deletion
eines oder mehrerer Nukleotide an einer Position eines Gens und
die entsprechenden Veränderungen
im exprimierten Protein umfaßt sind.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
handelt es sich bei dem hier beschriebenen Diagnoseverfahren vorzugsweise
um ein Verfahren, bei dem der Polymorphismus an Position 162 (gemäß der Position in
SEQ ID NO: 1) das Vorliegen von T und/oder C ist.
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Wie
oben angemerkt, kann der Mensch an jeder Position für ein Allel
homozygot oder heterozygot sein. Falls es sich bei dem Individuum
um ein heterozygotes Individuum handelt, so können beide alternativen Polymorphismen
vorhanden sein.
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Bei
dem Nukleinsäuresequenzdiagnoseverfahren
handelt es sich vorzugsweise um ein Verfahren, das von einem Verfahren,
ausgewählt
aus Amplifikationsrefraktionsmutationssystem, Restriktions fragmentlängenpolymorphismus
und Primerverlängerung
bestimmt wird. Bei dem Aminosäurensequenz-Diagnoseverfahren handelt
es sich vorzugsweise um ein Verfahren, das von immunologischen Verfahren,
wie beispielsweise ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) bestimmt
wird.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
wird ein Verfahren zur Diagnose oder Prognose einer durch VEGF vermittelten
Krankheit bereitgestellt, bei dem man
- i) das
Vorliegen oder Fehlen einer Nukleotidvariante in Position 162 (gemäß SEQ ID
NO: 1) im KDR-Gen in einer Testprobe aus einem Individuum nachweist
und
- ii) den diagnostischen oder prognostischen Zustand des Individuums
unter Bezugnahme auf den Polymorphismus im KDR-Gen bestimmt.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
wird ein Verfahren zur Diagnose oder Prognose einer VEGF-vermittelten Krankheit
bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren
- i)
einem Individuum Probennukleinsäure
entnimmt,
- ii) das Vorliegen oder Fehlen einer Nukleotidvariante an Position
162 (gemäß SEQ ID
NO: 1) im KDR-Gen nachweist und
- iii) den diagnostischen oder prognostischen Zustand des Individuums
unter Bezugnahme auf den Polymorphismus im KDR-Gen bestimmt.
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Der
Zustand des Individuums kann unter Bezugnahme auf eine Allelvariation
an 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder mehr beliebigen
Positionen unter Verwendung der hier identifizierten Allelvarianten,
gegebenenfalls zusammen mit anderen Varianten, bestimmt werden.
Dabei eignet sich insbesondere die Haplotypanalyse zur Bestimmung
des Zustands des Individuums.
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Bei
der Nukleinsäuretestprobe
handelt es sich zweckmäßigerweise
um eine Probe von Blut, bronchoalveolärer Lavage, Speichel oder einer
anderen Körperflüssigkeit
bzw. Gewebe, das bzw. die einem Individuum entnommen wurde. Dabei
ist ersichtlich, daß es
sich bei der Testprobe gleichermaßen um eine der Sequenz in
der Testprobe entsprechende Nukleinsäuresequenz handeln kann, das
heißt,
daß der
gesamte Bereich in der Probennukleinsäure oder ein Teil davon zunächst unter
Verwendung einer beliebigen herkömmlichen
Technik z.B. PCR, vor der Analyse der Allelvariation amplifiziert
werden kann.
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Dem
Fachmann ist ersichtlich, daß es
eine große
Anzahl analytischer Verfahrensweisen gibt, die zum Nachweis des
Vorliegens bzw. des Fehlens von Nukleotidvarianten in einer oder
mehreren erfindungsgemäßen polymorphen
Positionen verwendet werden können.
Im allgemeinen erfordert der Nachweis einer Allelvariation eine
Mutationsdiskriminierungstechnik, gegebenenfalls eine Amplifikationsreaktion
und gegebenenfalls ein Signalerzeugungssystem. In Tabelle 1 sind
eine Reihe von Mutationsnachweistechniken aufgeführt, von denen einige auf der
PCR beruhen. Diese können
in Kombination mit einer Reihe von Signalerzeugungsystemen, von
denen eine Auswahl in Tabelle 2 aufgeführt ist, verwendet werden.
Weitere Amplifikationstechniken sind in Tabelle 3 aufgeführt. Viele
gegenwärtig
verwendete Verfahren zum Nachweis einer Allelvariation werden in
einem Übersichtsartikel
von Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120, 1997; sowie in Standardlehrbüchern, beispielsweise "Laboratory Protocols
for Mutation Detection",
Hrsg. von U. Landegren, Oxford University Press, 1996 und "PCR", 2
nd Edition
von Newton & Graham,
BIOS Scientific. Publishers Limited, 1997 behandelt. Abkürzungen
ALEX | Amplification
Refractory Mutation System Linear Extension |
APEX | Arrayed
Primer Extension |
ARMSTM | Amplification
Refractory Mutation System |
b-DNA | Branched
DNA [Verzweigte DNA] |
bp | Basenpaar |
CMC | Chemical
Mismatch Cleavage |
COPS | Competitive
Oligonucleotide Priming System |
DGGE | Denaturierende
Gradientengelelektrophorese |
ELISA | Enzyme
Linked ImmunoSorbent Assay |
FRET | Fluoreszenzresonanzenergietransfer |
LCR | Ligasekettenreaktion |
MASDA | Multiple
Allele Specific Diagnostic Assay |
NASBA | Nucleic
Acid Sequence Based Amplification |
OLA | Oligonucleotide
Ligation Assay |
PCR | Polymerasekettenreaktion |
PTI | Protein
truncation test [Proteinverkürzungstest] |
RFLP | Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus |
SDA | Strand
displacement amplification [Strangverdrängungsamplifikation] |
SNP | Einzelnukleotidpolymorphismus |
SSCP | Einzelstrangkonformationspolymorphismus-Analyse |
SSR | Self
sustained replication [selbst erhaltende Replikation] |
TGGE | Temperaturgradientengelelektrophorese |
Tabelle
1 – Mutationsnachweistechniken
- Allgemein: DNA-Sequenzierung, Sequenzierung über Hybridisierung
- Scanning: PTT*, SSCP, DGGE, TGGE, Cleavase, Heteroduplexanalyse,
CMC,
Enzymatische Fehlpaarungsspaltung
*Anmerkung: nicht
zum Nachweis von Promotorpolymorphismen geeignet.
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Auf Hybridisierung beruhend
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Festphasenhybridisierung:
Dotblots, MASDA, Umkehr-Dotblots,
Oligonukleotid-Arrays (DNA-Chips).
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Lösungsphasenhybridisierung:
Taqman
TM –
US-5210015 &
US-5487972 (Hoffmann-La
Roche), Molecular Beacons – Tyagi
et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303;
WO 95/13399 (Public Health Inst.,
New York)
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Auf Verlängerung beruhend:
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ARMS
TM, ALEX
TM-Europäisches Patentnr.
EP 332435 B1 (Zeneca
Limited), COPS – Gibbs
et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347.
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Auf Einbau beruhend:
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Minisequenzierung,
APEX
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Auf Restriktionsenzymen beruhend:
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RFLP,
Restriktionsstelle erzeugende PCR
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Auf Ligation beruhend:
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OLA
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Andere:
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Invader
Assay
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Tabelle 2 – Signalerzeugungs- oder Nachweissysteme
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Fluoreszenz:
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FRET,
Fluoreszenzquenching, Fluoreszenzpolarisation –
Britische Patentnr. 2228998 (Zeneca
Limited)
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Andere:
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Chemilumineszenz,
Elektrochemilumineszenz, Raman, Radioaktivität, Colorimetrischer Test, Hybridisation
Protection Assay, Massenspektrometrie.
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Tabelle 3 – Weitere Amplifikationsverfahren
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SSR,
NASBA LCR, SDA, b-DNA
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Tabelle 4 – Proteinvariationsnachweisverfahren
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- Immuntest
- Immunhistologie
- Peptidsequenzierung
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Zu
bevorzugten Mutationsnachweistechniken zählen ARMSTM,
ALEXTM, COPS, Taqman, Molecular Beacons,
RFLP, sowie auf Restriktionsstellen beruhende PCR- und FRET-Techniken.
Immuntesttechniken sind im Fachgebiet bekannt, beispielsweise A
Practical Guide to ELISA von D M Kemeny, Pergamon Press 1991, Principles
and Practice of Immunoassay, 2. Auflage, C P Price & D J Newman, 1997,
veröffentlicht
von Stockton Press in USA & Canada
und von Macmillan Reference in Großbritannien.
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Zu
den besonders bevorzugten Verfahren zählen ARMSTM-allelspezifische
Amplifikation und auf OLA und RFLP beruhende Verfahren. Dabei ist
die im Fachgebiet als ARMSTM bekannte allelspezifische
Amplifikationstechnik ein ganz besonders bevorzugtes Verfahren.
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ARMS
TM-allelspezifische Amplifikation (beschrieben
im europäischen
Patent Nr. EP-B-332435, dem
US-Patent
Nr. 5,595,890 und bei Newton et al. (Nucleic Acids Research,
Bd. 17, S. 2503; 1989)) beruht auf der Komplementarität des 3'-terminalen Nukleotids
des Primers und seiner Matrize. Dabei ist das 3'-terminale Nukleotid des Primers entweder
komplementär
oder nicht komplementär
zu der nachzuweisenden spezifischen Mutation, dem nachzuweisenden
spezifischen Allel oder Polymorphismus. Dabei besteht ein selektiver Vorteil
für die
Primerverlängerung
von demjenigen Primer, dessen 3'-terminales
Nukleotid die Basenmutation bzw. das Allel oder den Polymorphismus
komplementiert. Eine enzymatische Primerverlängerung wird durch diejenigen
Primer, die eine 3'-terminale
Fehlpaarung mit der Matrizensequenz aufweisen, stark gehemmt oder verhindert.
Eine Polymerasekettenreaktion oder in einer Richtung ablaufende
Primerverlängerungsreaktionen führen daher
dann zur Produktamplifikation, wenn das 3'-terminale Nukleotid des Primers das
der Matrize komplementiert, jedoch nicht, oder wenigstens nicht
effizient, wenn das 3'-terminale
Nukleotid das der Matrize nicht komplementiert.
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In
einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren zur Beurteilung
der Pharmakogenetik eines auf KDR wirkenden Arzneistoffs verwendet.
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Dabei
können
Tests, beispielsweise Tests auf Reporterbasis, entwickelt werden,
um nachzuweisen, ob einer oder mehrere der obigen Polymorphismen
die Transkriptionsniveaus und/oder Message-Stabilität beeinflussen.
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Individuen,
die bestimmte Allelvarianten des KDR-Gens tragen, können daher
Unterschiede in ihrer Fähigkeit
zur Regulation der Proteinbiosynthese unter unterschiedlichen physiologischen
Bedingungen zeigen und präsentieren Änderungen
in ihrer Fähigkeit,
auf unterschiedliche Erkrankungen zu reagieren. Darüber hinaus
können
Unterschiede, die sich als Ergebnis einer Allelvariation ergeben,
eine direkte Auswirkung auf das Ansprechen eines Individuums auf
eine Arzneistofftherapie haben. Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren
können
sich sowohl zur Vorhersage der klinischen Reaktion gegenüber solchen
Mitteln als auch zur Bestimmung der therapeutischen Dosis eignen.
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In
einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren zur Beurteilung
der Veranlagung und/oder Anfälligkeit
eines Individuums gegenüber
durch VEGF vermittelten Krankheiten verwendet. Dies kann insbesondere
bei der Entwicklung von Krebs und Entzündungskrankheiten relevant
sein, wobei die vorliegende Erfindung zur Erkennung von Individuen,
die einem besonderen Risiko der Entwicklung dieser Leiden ausgesetzt
sind, verwendet werden kann.
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In
einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren bei der
Entwicklung neuer Arzneistofftherapien verwendet, die selektiv auf
eine oder mehrere Allelvarianten des KDR-Gens abzielen. Die Identifizierung
einer Verbindung zwischen einer bestimmten Allelvariante und der
Veranlagung zur Entwicklung einer Krankheit oder dem Ansprechen
auf eine Arzneistofftherapie kann sich in signifikanter Weise auf
die Konstruktion neuer Arzneistoffe auswirken. Arzneistoffe können zur
Regulation der biologischen Aktivität von Varianten, die mit dem
Krankheitsverlauf in Zusammenhang gebracht werden, mit minimalen
Auswirkungen auf andere Varianten konstruiert werden.
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In
einem weiteren diagnostischen Aspekt der Erfindung wird das Vorliegen
oder Fehlen von Nukleotidvarianten unter Bezugnahme auf den Verlust
oder Gewinn von gegebenenfalls gentechnisch erzeugten, von Restriktionsenzymen
erkannten Stellen nachgewiesen. Dabei ist der Durchschnittsfachmann
in der Lage, diagnostische Verfahrensweisen zu entwickeln und zu
realisieren, die auf dem Nachweis von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
aufgrund des Verlusts oder Gewinns einer oder mehrerer der Restriktionsstellen durch
das Vorliegen eines Polymorphismus beruhen (siehe vorliegende Beispiele).
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure bereitgestellt,
die eine Nukleinsäuresequenz
aus mindestens 20 Basen umfaßt,
die den folgenden Polymorphismus besitzt: 162C (gemäß SEQ ID
NO: 1), oder einen komplementären,
den Polymorphismus umfassenden, Strang davon.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte oder
rekombinante produzierte Nukleinsäure bereitgestellt, die eine
Nukleinsäuresequenz
aus mindestens 20 Basen umfaßt,
die den folgenden Polymorphismus besitzt:: 162C (gemäß SEQ ID
NO: 1), oder einen komplementären,
den Polymorphismus umfassenden, Strang davon.
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Durch
die Erfindung werden ferner Nukleotidprimer bereitgestellt, die
die erfindungsgemäßen KDR-Genpolymorphismen
nachweisen. Diese Primer können
eine beliebige Länge
aufweisen, beispielsweise zwischen 8 und 100 Nukleotide, doch beträgt ihre
Länge vorzugsweise
zwischen 12 und 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt zwischen 17
und 30 Nukleotiden.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein allelspezifischer
Primer bereitgestellt, der zum Nachweis eines KDR-Gen-polymorphismus,
vorzugsweise an einer oder mehreren der Positionen, wie sie hier
definiert sind, fähig
ist.
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Ein
allelspezifischer Primer wird im allgemeinen zusammen mit einem
konstanten Primer in einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise
einer PCR-Reaktion,
mit der zwischen Allelen über
selektive Amplifikation eines Allels an einer bestimmten Sequenzposition,
wie sie beispielsweise für
ARMSTM-allelspezifische
Amplifikationstests verwendet wird, unterschieden wird, verwendet.
Dabei besteht der allelspezifische Primer vorzugsweise aus 17–50 Nukleotiden,
stärker
bevorzugt aus etwa 17–35
Nukleotiden, stärker
bevorzugt aus etwa 17–30
Nukleotiden.
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Ein
allelspezifischer Primer entspricht vorzugsweise genau dem nachzuweisenden
Allel, doch werden auch Derivate davon in Betracht gezogen, bei
denen etwa 6–8
der Nukleotide am 3'-Terminus
dem nachzuweisenden Allel entsprechen und bis zu 10, wie beispielsweise
bis zu 8, 6, 4, 2, oder 1 der restlichen Nukleotide variiert werden
können,
ohne daß sich
dies in signifikanter Weise auf die Eigenschaften des Primers auswirkt. Häufig bildet
das Nukleotid an der Position –2
und/oder –3
(relativ zum 3'-Terminus)
eine Fehlpaarung, um die differentielle Primerbindung und die bevorzugte
Verlängerung
nur vom korrekten alleldiskriminierenden Primer zu optimieren.
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Primer
können
mit allen herkömmlichen
Syntheseverfahren hergestellt werden. Beispiele für derartige Verfahren
finden sich in Standardlehrbüchern,
beispielsweise "Protocols
for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties", Methods in Molecular
Biology Series; Band 20; Hrsg. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7; 1993,
1st Edition. Falls erforderlich, kann der
Primer bzw. können
die Primer markiert werden, um den Nachweis zu erleichtern.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine allelspezifische
Oligonukleotidsonde bereitgestellt, die zum Nachweis eines KDR-Gen-Polymorphismus, vorzugsweise
an einer oder mehrerer der hier definierten Positionen, fähig ist.
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Die
allelspezifische Oligonukleotidsonde besteht vorzugsweise aus 17–50 Nukleotiden,
stärker
bevorzugt aus etwa 17–35
Nukleotiden, stärker
bevorzugt aus etwa 17–30
Nukleotiden.
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Die
Konstruktion derartiger Sonden ist dem durchschnittlich begabten
Molekularbiologen ersichtlich. Derartige Sonden können eine
beliebige zweckmäßige Länge, wie
beispielsweise bis zu 50 Basen, bis zu 40 Basen, noch zweckmäßiger bis
zu 30 Basen, wie beispielsweise 8–25 oder 8–15 Basen, aufweisen. Im allgemeinen
umfassen solche Sonden Basensequenzen, die zum entsprechenden Wildtyp-
oder Variantenlokus im Gen vollständig komplementär sind.
Allerdings können,
falls erforderlich, eine oder mehrere Fehlpaarungen eingeführt werden,
vorausgesetzt, daß davon
die Diskriminierungsleistung der Oligonukleotidsonde nicht übermäßig betroffen
wird. Die erfindungsgemäßen Sonden
können
zu Erleichterung des Nachweises eine oder mehrere Markierungen,
wie z.B. in Molecular Beacons, tragen. SED ID NO: 8, 9 oder deren
Komplement entsprechende einzelsträngige Oligonukleotide könnten als
Sonden zum Nachweis des jeweiligen Polymorphismus in der zentralen
Position (in Fettdruck) verwendet werden. Die Sonde würde mit
größerer Effizienz
an eine Zielsequenz binden, die die jeweilige komplementäre Polymorphismusbase
in dieser zentralen (Polymorphismus-)Lage besitzt, als an eine mit
einer Basenfehlpaarung.
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Gemäß einem
weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine allelspezifische
Oligonukleotidsonde bereitgestellt, die zum Nachweis des KDR-Gen-Polymorphismus in
Position 162 (gemäß SEQ ID
NO: 1) fähig
ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostischer
Kit bereitgestellt, der eine erfindungsgemäße allelspezifische Oligonukleotidsonde
umfaßt.
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Die
diagnostischen Kits können
eine geeignete Verpackung sowie Anweisungen zur Verwendung in den
erfindungsgemäßen Verfahren
umfassen. Ferner können
solche Kits einen geeigneten Puffer und eine geeignete Polymerase
bzw. geeignete Puffer und Polymerasen umfassen, wie beispielsweise
temperaturstabile Polymerasen, z.B. Taq-Polymerase. Ebenso können solche
Kits begleitende Primer und/oder Kontrollprimer oder -sonden umfassen.
Dabei handelt es sich bei einem begleitenden Primer um einen Primer,
der Teil des zur Durchführung
der PCR verwendeten Primerpaars ist. Ein derartiger Primer komplementiert
normalerweise den Matrizenstrang genau.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
können
die Polymorphismen der vorliegenden Erfindung als genetische Marker
in Verknüpfungsstudien
verwendet werden. Dies gilt insbesondere für die Polymorphismen mit relativ
hoher Häufigkeit.
Das KDR-Gen konnte auf Chromosom 4q11-q12 lokalisiert werden (Sait
et al (1995) Cytogen Cell Genet 70, 145–146; Spritz et al (1994) Genomics
22, 431–436).
Polymorphismen mit geringer Häufigkeit
können
besonders für
die Haplotypisierung, wie unten beschrieben, geeignet sein. Ein
Haplotyp ist ein Satz von Allelen, die an verknüpften polymorphen Stellen (wie
z.B. innerhalb eines Gens) auf einem einzigen (väterlichen oder mütterlichen)
Chromosom angetroffen werden. Falls die Rekombination innerhalb
des Gens zufällig
verläuft,
kann es bis zu 2" Haplotypen
geben, wobei 2 gleich der Anzahl von Allelen bei jedem SNP und n
gleich der Anzahl an SNPs ist. Ein Ansatz zur Identifizierung von
Mutationen oder Polymorphismen, die mit einer klinischen Reaktion
korreliert sind, besteht in der Durchführung einer Assoziationsstudie,
bei der alle Haplotypen, die sich in der interessierenden Population
identifizieren lassen, verwendet werden. Die Häufigkeit eines jeden Haplotyps
wird durch die Häufigkeit
seines seltensten Allels limitiert, so daß SNPs mit Allelen geringer
Häufigkeit
besonders geeignete Marker für
Haplotypen mit geringer Häufigkeit
darstellen. Da bestimmte Mutationen oder Polymorphismen, die mit
bestimmten klinischen Merkmalen, wie z.B. negativen oder abnormalen
Ereignissen, assoziiert sind, innerhalb der Population wahrscheinlich
mit geringer Häufigkeit
auftreten, können
SNPs mit geringer Häufigkeit
bei der Identifizierung dieser Mutationen besonders geeignet sein
(siehe beispielsweise: Linkage disequilibrium at the cystathionine
beta synthase (CBS) locus and the association between genetic variation
at the CBS locus and plasma levels of homocysteine. Ann Hum Genet
(1998) 62:481-90, De Stefano V. Dekou V, Nicaud V, Chasse JF, London
J, Stansbie D, Humphries SE und Gudnason V; und Variation at the
von willebrand factor (vWF) gene locus is associated with plasma
vWF:Ag levels: identification of three novel single nucleotide polymorphisms
in the vWf gene promoter. Blond (1999) 93:4277-83, Keightley Am,
Lam YM, Brady JN, Cameron CL, Lillicrap D).
-
Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
insbesondere diejenigen, die mit den hier identifizierten Einzelnukleotidpolymorphismen
in Verbindung stehen und diese identifizieren, repräsentieren
eine wertvolle Informationsquelle, mit der Individuen hinsichtlich
beispielsweise ihrer Identität,
ihrem Haplotyp und anderen Teilklassifizierungen, wie beispielsweise
der Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit bestimmten Arzneistoffen,
charakterisiert werden können.
Diese Ansätze
werden am einfachsten dadurch erleichtert, daß man die Sequenzangaben in
einem computerlesbaren Datenträger
speichert und anschließend
die Angaben in Standardprogrammen für makromolekulare Strukturen
oder zur Suche von Sequenzdatenbanken unter Verwendung von Suchwerkzeugen
des Standes der Technik, wie z.B. GCG (Genetics Computer Group),
BlastX BlastP, BlastN, FASTA (siehe Altschul et al. J. Mol. Biol.
215:403-410, 1990), verwendet. Somit stellen die polymorphismushaltigen
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
besonders geeignete Komponenten in zur Sequenzidentität, Genomkartierung,
Pharmakogenetik und anderen Suchanalysen geeigneten Datenbanken dar.
Dabei können
die Sequenzangaben in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und
Polymorphismen auf einem greifbaren Datenträger, wie beispielsweise einer
Computerdiskette, vorzugsweise in computerlesbarer Form, verkleinert,
darin umgewandelt oder darauf gespeichert werden, beispielsweise
als chromatographische Rasterdaten oder Spitzenwertdaten, photographische
Raster- oder Spitzenwertdaten, massenspektrographische Daten, Sequenzgel-
(oder andere) daten.
-
Vorzugsweise
ist die Bestimmung des Zustands des Menschen klinisch geeignet.
Beispiele für
die klinische Eignung umfassen die Entscheidung darüber, welcher
Arzneistoff bzw. welche Arzneistoffe zu verabreichen sind, und/oder
die Entscheidung über
die wirksame Menge des Arzneistoffs bzw. der Arzneistoffe. Dabei
bedeutet der Begriff "auf
KDR wirkender Arzneistoff",
daß die
Arzneistoffbindung mit dem KDR-Protein beim Menschen einen wichtigen
Teil der Manifestierung des pharmazeutischen Effekts eines Arzneistoffs
beim Menschen darstellt.
-
Die
Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
veranschaulicht, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Alle Temperaturen
sind in Grad Celsius angegeben.
-
In
den nachfolgenden Beispielen wurden die folgenden Methoden und Materialien
angewandt, falls nicht anders angegeben.
-
AMPLITAQTM, erhältlich
von Perkin-Elmer Cetus, wird als Quelle für die temperaturstabile DNA-Polymerase
verwendet.
-
Allgemeine
molekularbiologische Verfahrensweisen lassen sich nach einem der
in "Molecular Cloning – A Laboratory
Manual" Second Edition,
Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)
oder "Current Protocols
in Molekular Biology Volumes 1–3,
herausgegeben von FM Asubel, R Brent, RE Kingston pub John Wiley
1998, durchführen.
-
Elekropherogramme
wurden routinemäßig erstellt:
Die Daten wurden mit der Datensammlungssoftware ABI377 gesammelt
und die Wellenform mittels ABI Prism-Sequenzieranalyse (2.1.2) erzeugt.
-
BEISPIEL 1
-
Identifizierung von Polymorphismen
-
1. Methoden
-
DNA-Präparation
-
DNA
wurde aus in EDTA gesammelten gefrorenen Blutproben nach Vorschrift
I (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p392, Sambrook, Fritsch
und Maniatis, 2nd Edition, Cold Spring Harbour
Press, 1989) mit den folgenden Modifikationen präpariert. Das aufgetaute Blut
wurde im gleichen Volumen Standardkochsalz-Citrat-Lösung statt phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
verdünnt,
um lysierte rote Blutzellen abzutrennen. Die Proben wurden mit Phenol,
danach mit Phenol-Chloroform und anschließend mit Chloroform statt mit drei
Phenolextraktionen extrahiert. Die DNA wurde in entionisiertem Wasser
gelöst.
Es wurden 29 einzelne Proben analysiert.
-
Matrizenherstellung
-
Matrizen
wurden mittels PCR unter Verwendung der unten angegebenen Oligonukleotidprimer
und Annealing-Temperaturen
hergestellt. Die Verlängerungstemperatur
betrug 72º und
die Denaturierungstemperatur 94º.
Im allgemeinen wurden bei jeder Reaktion 50 mg genomische DNA eingesetzt
und 35 Zyklen PCR unterzogen. Das primäre Fragment, wurde, wo es unten
beschrieben ist, 1:100 verdünnt,
und zwei Mikroliter wurden als Matrize für die Amplifikation sekundärer Fragmente
verwendet. Die PCR wurde in zwei Stufen durchgeführt (primäres Fragment, danach sekundäres Fragment),
um die spezifische Amplifikation der gewünschten Zielsequenz sicherzustellen. Neue
Polymorphismen innerhalb des kodierenden Bereichs von KDR
-
Der
Polymorphismus in Position 224 führt
zu einer Codonänderung
von Valin (GTA) zu Isoleucin (ATA) in Codonposition 297 (Codonnummerierung
gemäß EMBL Accession
Number AF035121). Codon 297 ist im Exon 7 lokalisiert, wobei der
Aminosäurerest
297 einen Teil der dritten Ig-ähnlichen
Domäne
im extrazellulären Bereich
von KDR bildet (Terman et al., (1992) Biochem Biophys Res Comm 187:1579-1586).
Man nimmt an, daß die
dritte Ig-ähnliche
Domäne
eine Rolle bei der Ligandenbindung spielt (Lu et al., supra).
-
Die
den G/A-Polymorphismus in Position 224 flankierenden Sequenzen sind
nachfolgend angegeben (Positionen 174–274, Nummerierung gemäß SEQ ID
NO: 4)
AGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTRTAAC
CCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTG(SEQ
ID NO: 10)
mit R = G oder A
-
Durch
gentechnische Manipulation des Nukleotids 225 (T–C) wird eine polymorphe RsaI-Stelle (GTAC)
geschaffen, die sich als diagnostischer Essay für den Polymorphismus in Position
224 verwenden läßt.
Vorwärtsprimer
1–20
-
Gentechnisch
manipulierter Primer 225-244 5' TCCTTGGTCACTCCGGGTTG
(SEQ ID NO: 25); geänderte
Base in Fettdruck.
-
Ein
von einem Wildtyp-Individuum (G-Variant) erzeugtes PCR-Produkt (244
bp) wird bei Verdauung mit RsaI (New England Biolabs) nicht gespalten.
Verdauung eines von einem heterozygoten Individuum abgeleiteten
Produkts erzeugt Produkte mit 244 bp, 224 bp und 20 bp. Verdauung
eines von einem für
die A-Variante homozygoten Individuum abgeleiteten Produkts ergibt
Produkte mit 224 bp und 20 bp.
-
-
Der
Polymorphismus in Position 145 führt
zu einer Codonänderung
von Glutamin (CAA) zu Histidin (CAT) in Codonposition 472 (Codonnummerierung
gemäß EMBL Accession
Number AF035121). Codon 472 liegt im Exon 11, und der Aminosäurerest
472 liegt in der fünften
Ig-ähnlichen
Domäne
im extrazellulären
Bereich von KDR (Terman et al., 1992, supra).
-
Die
den A/T-Polymorphismus (W) in Position 145 flankierenden Sequenzen
sind nachfolgend angegeben (Positionen 95–195, Nummerierung gemäß SEQ ID
NO: 6).
TAAAGAAAAATTAAATCATAATATGCGCTGTTATCTCTTTCTTATAGCCAWGCTG
TCTCAGTGACAAACCCATACCCTTGTGAAGAATGGAGAAGTGTGGAGGA(SEQ
ID NO: 11)
mit W = A oder T.
-
Durch
den Polymorphismus in Position 145 (A/T) wird eine NlaIII-Restriktionstelle
(CATG) geschaffen, die sich als diagnostischer Test verwenden läßt. Ein
von einem Wildtyp-Individuum (A-Variante) erzeugtes PCR-Produkt (499 bp)
wird bei Verdauung mit NlaIII (New England Biolabs) nicht gespalten.
Die Verdauung eines von einem heterozygoten Individuum abgeleiteten
Produkts erzeugt Produkte mit 146 bp, 353 bp und 499 bp. Verdauung
eines von einem für
die T-Variante homozygoten Individuum abgeleiteten PCR-Produkts erzeugt
Produkte mit 146 bp und 353 bp. Neue
Polymorphismen im Promotor des KDR-Gens (SEQ ID NO: 1. Positionen
16–534
EMBL Accession Number No X89776)
-
Die
den T/C-Polymorphismus (Y) in Position 162 flankierenden Sequenzen
sind nachfolgend angegeben (Positionen 112–212, der SEQ ID NO: 1).
AGGTCACTTCAAACTTGGAGCCGCCAAATATTTTGGGAAATAGCGGGAATGYTGG
CGAACTGGGCAAGTGCGTTTTCTGATTAAGAGCAACCAGATTCAGCT
(SEQ ID NO: 12)
mit Y = T oder C.
-
-
Die
den T/C-Polymorphismus (S) in Position 423 flankierenden Sequenzen
sind nachfolgend angegeben (entspricht Positionen 373–473 der
SEQ ID NO: 1).
GCGCGATGGCGAAGAGGGTCCTGCACTTTGACGCGCCTGGTGAGGGAGCGSTGCT
CTTCGCAGCGCTCCTGGTGATGCTCCCCAAATTTCGGGGACCGGC
(SEQ ID NO: 13)
mit S = C oder G
-
Die
den T/C-Polymorphismus (Y) in Position 461 flankierenden Sequenzen
sind nachfolgend angegeben (entspricht Positionen 411–511 der
SEQ ID NO: 1).
GGTGAGGGAGCGGTGCTCTTCGCAGCGCTCCTGGTGATGCTCCCCAAATTYCGGG
GACCGGCAAGCGATTAAATCTTGGAGTTGCTCAGCGCCCGTTACCG
(SEQ ID NO: 14)
mit Y = T oder C Neue
Polymorphismen in flankierender Intronsequenz
-
Die
den G/A-Polymorphismus (R) in Position 345 (der SEQ ID NO: 2) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (entspricht Positionen 295–395 der
SEQ ID NO. 2).
GATTTCTTGTGTTAAGTAACTGATTGTTTATTGAGTGGAAATAATTTCCARTAGAG
CAGAATTATAATAGAGCTTGTAGTAATTGTTCATAAGTGGTGAGG
(SEQ ID NO: 15)
mit R = G oder A
-
Die
den G/A-Polymorphismus (R) in Position 112 (gemäß SEQ ID NO: 3) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 62–162 der
SEQ ID NO: 3).
AAAAAATAAATCTGTGCAAAGTTATAGGCTTATTTGCTCTCTCATGTTCTRTTTT
TCAATTTACTTGCTCTAGGGTATAGGATTTATGATGTGGTTCTGA
(SEQ ID NO: 16)
mit R = G oder A
-
Die
den G/A-Polymorphismus (R) in Position 329 (gemäß SEQ ID NO: 3) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 279–379 der
SEQ ID NO: 3).
ACGCTAATGATTCAAAGCCAGACCTCCAAATACTTACATAATAAGCCCCARTGAA
GTTTGCTTGAGAGATAGGGGCCTCTTTGGCCAGATAAAATGTAAGA
(SEQ ID NO: 17)
mit R = G oder A
-
Die
den G/A-Polymorphismus (R) in Position 339 (gemäß SEQ ID NO: 6) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 289–377 der
SEQ ID NO: 6).
ACCACCGTTCCTCTGCCTCCTGCTGCTTCACTCATATCATGGCTGGGCCTRCGTAC
AAAAGTCATCTGGCGTGGTGAAGCTGAAGTGAA
(SEQ ID NO: 18).
mit R = G oder A
-
Die
den A/C-Polymorphismus (M) in Position 103 (gemäß SEQ ID NO: 7) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 53–153 der
SEQ ID NO: 6).
AATAACCAAAGTCTGAATCTTTTCCTTACTCTTGACTCTAATTAAAGAAAMATTA
AATCATAATATGCGCTGTTATCTCTTTCTTATAGCCAAGCTGTCTC
(SEQ ID NO: 19)
mit M = A oder C
-
Die
den T/G-Polymorphismus (K) in Position 32 (gemäß SEQ ID NO: 7) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 1–82 der
SEQ ID NO: 7).
TTGATGTCCTCCTTGTCTGCTTTTTAGTAGTKTCAATTATCTCCATGGTTTACTACA
TTTTAAAGGTTGTAAACTTTTAAAG
(SEQ ID NO: 20)
mit K = T oder G
-
Die
den A/T-Polymorphismus (W) in Position 94 (gemäß SEQ ID NO: 8) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 44–144 der
SEQ ID NO: 7).
CATGGTTTACTACATTTTAAAGGTTGTAAACTTTTAAAGACTCATTTTGTWTTCAA
GGAGTTTGTTTGTTCCTTTGCTTTTTTATAGACCAAAGGGGCACG
(SEQ ID NO: 21)
mit W = A oder T Neuer
Polymorphismus im 5'-UTR
des KDR-Gens
-
Die
den G/A-Polymorphismus (R) in Position 26 (gemäß SEQ ID NO: 24) flankierenden
Sequenzen sind nachfolgend dargestellt (= Positionen 193–243 der
SEQ ID NO: 22):
TCCCGGGACCCCGGGAGAGCGGTCARTGTGTGGTCGCTGCGTTTCCTCTGC
mit
R = G oder A
SEQ ID NO: 24 ist eine Teilsequenz der SEQ ID
NO: 23, welche eine Teilsequenz der SEQ ID NO: 22 ist.
-
BEISPIEL 2
-
Haplotypanalyse von KDR-Polymorphismen
-
Zwei
kodierende Polymorphismen (Valin 297 Isoleucin; Glutamin 472 Histidin)
im KDR-Gen wurden in Verbindung mit einem Intron-SNP (G/A-Position
339 gemäß SEQ ID
NO: 5) zur Vorhersage von Haplotyphäufigkeiten verwendet.
Polymorphismus | Allelhäufigkeit |
Codon
297 Val (GTA)/IIe (ATA) | G
89% A 11% |
Intronposition
339 in SEQ ID NO: | 5
G 74% A 26% |
Codon
472 GIn (CAA)/His (CAT) | A
73% T 27% |
-
Die
Polymorphismen decken eine Strecke von 6,5 kb ab; Genotypen in 73
Individuen wurden durch Sequenzierung und Haplotyphäufigkeiten
unter Verwendung einer Kombination aus Clarks Algorithmus und der
EH (End Haplotype)-Software bestimmt. In den 73 Individuen wurden
lediglich 5 Haplotypen beobachtet.
Haplotyp | Häufigkeit(%) |
GGA | 40 |
GGT | 24 |
GAA | 26 |
AGT | 6 |
AAA | 4 |
Anmerkungen
zum Sequenzprotokoll SEQ
ID NO: 1 (Entspricht Positionen 16–534 der EMBL Accession No
X89776) Positionen 1–519
(Promoterbereich)
Polymorphismus
T/C | 162 |
C/G | 423 |
T/C | 461 |
Vorwärtsprimer | 1–20; Rückwärtsprimer
500–519 |
SEQ
ID NO: 2 (Entspricht Positionen 150523–151026 der EMBL Accession
AC 021220)
Flankierendes
Intron | 1–178 |
Exon
2 | 178–272 |
Flankierendes
Intron | 273–503 |
Polymorphismus
G/A | 345 |
Vorwärtsprimer | 1–20; Rückwärtsprimer
484–503 |
SEQ
ID NO: 3 (Entspricht Positionen 143659–144055 der EMBL Accession
AC 021220)
Vorwärtsprimer | 1–20; Rückwärtsprimer
388–397 |
Flankierendes
Intron | 1–135 |
Exon
6 | 136–275 |
Flankierendes
Intron | 276–397 |
Polymorphismus
G/A | 112 |
Polymorphismus
G/A | 329 |
SEQ
ID NO: 4
Vorwärtsprimer | 1–20; Rückwärtsprimer
434–453 |
Flankierendes
Intron | 1–133 |
Exon
7 | 134–311 |
Flankierendes
Intron | 312–453 |
Polymorphismus
G/A | 224 |
-
Position
1–393
entspricht Positionen 143269–142877
der AC021220. Positionen 394–453
entsprechen neuer Sequenz, die durch Sequenzierung des BAC-Klons
81A1 bestimmt wurde. SEQ
ID NO: 5 (Entspricht Positionen 11289–113265 der EMBL Accession
Number AC021220)
Vorwärtsprimer | 1–20; Rückwärtsprimer
358–377 |
Flankierendes
Intron | 1–57 |
Exon
9 | 58–221 |
Flankierendes
Intron | 221–377 |
Polymorphismus
G/A | 339 |
SEQ
ID NO: 6 (Entspricht Positionen 109095–109593 der EMBL Accession
Number AC021220)
Vorwärtsprimer | 1–20; Rückwärtsprimer
480–499 |
Flankierendes
Intron | 1–141 |
Exon
11 | 142–275 |
Flankierendes
Intron | 276–499 |
Polymorphismus
G/A | 103 |
Polymorphismus
A/T | 145 |
SEQ
ID NO: 7 (Entspricht Positionen 79362–79718 der AC021220)
Vorwärtsprimer | 1–20; Rückwärtsprimer
338–357 |
Flankierendes
Intron | 1–130 |
Exon
21 | 131–284 |
Flankierendes
Intron | 285–357 |
Polymorphismus
T/G | 32 |
Polymorphismus
A/T | 94 |
SEQ
ID NO: 22 (von EMBL Accession AC021220 abgeleitete Intronsequenz.
Positionen 187–556
entsprechen Positionen 1–370
der EMBL Accession AF035121. Position 218 entspricht Position 32
in EMBL Accession AF035121).
Flankierendes
Intron | 1–186 |
Exon
1 | 187–556 |
Flankierendes
Intron | 557–628 |
Polymorphismus
G/A | 218 |
Vorwärtsprimer | 1–24; Rückwärtsprimer
605–628 |
SEQ
ID NO: 23 (von EMBL Accession AC021220 abgeleitete Intronsequenz.
Positionen 124–315
entsprechen Positionen 1–192
der EMBL Accession AF035121. Position 145 entspricht Position 32
in EMBL Accession AF035121).
Flankierendes
Intron | 1–123 |
Exon
1 | 124–315 |
Polymorphismus | G/A
145 |
Vorwärtsprimer | 1–24; Rückwärtsprimer
292–315 |
SEQUENZPROTOKOLL