DE19909878A1

DE19909878A1 - Neue Sequenzvarianten des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19909878A1
Application number: DE1999109878
Authority: DE
Inventors: Jens Plaschke; Christian Kruppa; Hans-Konrad Schackert
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Plaschke Jens Dr 01640 Coswig De
Priority date: 1999-03-06
Filing date: 1999-03-06
Publication date: 2000-09-07
Anticipated expiration: 2019-03-07
Also published as: DE19909878C2

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung von Neoplasie-Prädispositionen, zur Diagnose einer individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf Therapeutika und zur Therapeutika-Entwicklung auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien. DOLLAR A Die Erfindung hat das Ziel, Varianten, Polymorphismen, Mutationen und resultierende Haplotypen in der DNA-Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens zu ermitteln und deren Korrelationen mit Krankheitsprädispositionen festzustellen. Ausgehend von diesen Korrelationen soll ein Verfahren zur Diagnose dieser Krankheitsprädispositionen, zur Diagnose einer individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf Therapeutika sowie ein System zur Therapeutika-Entwicklung bereitgestellt werden. DOLLAR A Es wurde gefunden, daß in der genomischen Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens neben drei bekannten Varianten in der codierenden Region (an den Positionen 116, 186 und 276) weitere Varianten vorhanden sind. Es wurde ferner gefunden, daß diese genetischen Varianten mit der Prädisposition für verschiedene Krankheiten, z. B. Kolonkarzinom, korrelieren. DOLLAR A Gegenstand der Erfindung ist danach die Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens, die an den Positionen 116, 186, 276, 540, 642, 652, 1019, 1186, Intron 1 + 22, Intron 1 - 36, Intron 2 + 52, Intron 2 + 63, Intron 2 - 52, Intron 3 - 56, ...

Description

Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung von Neoplasie-Prädispositionen und zur Therapeutika-Entwicklung auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien.

Das menschliche MSH6-Gen gehört zur Gruppe der Mismatch Repair Gene und stellt eine wichtige Komponente des Komplexes zur Reparatur von Basenfalschpaarungen dar. Das Genprodukt bildet gemeinsam mit dem Genprodukt von hMSH2, einem weiteren Mismatch Repair Gen, den mutSα Proteinkomplex, der vor allem für die Reparatur von Basen- Substitutionen und Deletionen/Insertionen von einer bis weniger Basen verantwortlich ist. Für die Reparatur von Deletionen/Insertionen von zwei und mehr Basen besteht eine funktionelle Redundanz mit einem weiteren Mismatch Repair-Proteinkomplex, welcher ebenfalls das Genprodukt von hMSH2, sowie das Genprodukt von hMSH3 beinhaltet. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit eines funktionellen hMSH6-Gens für die Reparatur von Insertionen und Deletionen einzelner Basen und vor allem für die Reparatur von Basen-Substitutionen. Der durch vererbte und/oder erworbene Mutationen bedingte Funktionsverlust eines der beiden Gene hMSH6 und hMSH2 führt zu einer massiven Erhöhung von Mutationen in den entsprechenden Zellen, was durch Veränderungen (Instabilitäten) in der Anzahl von Wiederholungen innerhalb einfacher Nukleotidabfolgen (Mikrosatelliten) angezeigt wird. Entsprechend den oben aufgeführten Zusammenhängen sind Mutationen im hMSH6-Gen vor allem mit Instabilitäten in Mononukleotid-Wiederholungen verbunden. Weiterhin gibt es Hinweise, daß hMSH6- Mutationen auch zu einer erhöhten Rate von Basen-Substitutionen ohne erkennbare Mononukleotid-Instabilitäten führen können.

Mutationen im hMSH6-Gen können zur Entstehung von Neoplasien, vor allem Kolon- und Endometriumkarzinomen, führen. Keimbahnmutationen in einem Allel des hMSH6-Gens prädisponieren zur Entstehung von Karzinomen, und sind, wie auch Keimbahnmutationen anderer Mismatch Repair Gene, mit dem Syndrom für erblichen nicht-polypösen Darmkrebs (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer-HNPCC) assoziiert. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf die Prädisposition für weitere Erkrankungen aufgrund von hMSH6- Keimbahnmutationen, wie beispielsweise Leukämien. Etwa 15% aller kolorektalen Karzinome weisen Mikrosatelliten-Instabilitäten auf, welche auf Mismatch Repair-Gen-Defekte zurückzuführen sind. Solche Tumoren weisen Resistenzen gegen eine Reihe von Chemo- Therapeutika, wie Cisplatin, auf, woraus sich Konsequenzen für die Therapie entsprechender Tumoren ableiten lassen.

Die Erfindung hat das Ziel, Varianten, Polymorphismen, Mutationen und resultierende Haplotypen in der DNA-Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens zu ermitteln und deren Korrelationen mit Krankheitsprädispositionen und -dispositionen festzustellen. Ausgehend von diesen Korrelationen soll ein Verfahren zur Diagnose dieser Krankheitsprädispositionen und -dispositionen, sowie zur Prädiktion von Schweregrad, Verlauf und Überlebenszeit entsprechender Erkrankungen entwickelt werden.

Außerdem soll ein System zur Prädiktion der individuellen Ansprechbarkeit von Neoplasien auf verschiedene Chemo-Therapeutika und ein System zur Entwicklung individuell spezifischer Chemo-Therapeutika, sowie die Entwicklung von Testsystemen zur Erforschung pathophysiologischer Zusammenhänge und Entwicklung oben genannter Therapeutika, entwickelt werden. Zusammenfassend kann für jeden hMSH6-Genotyp ein individuelles Risiko an einer bestimmten Krankheit zu erkranken, vorhergesagt oder entwickelt werden. Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Es wurde gefunden, daß in der genomischen Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens neben drei bekannten Sequenzvarianten in der kodierenden Region (an den Positionen 116, 186 und 276) weitere Varianten vorhanden sind. Es wurde ferner gefunden, daß diese genetischen Varianten mit der Prädisposition für verschiedene Krankheiten, z. B. kolorektales Karzinom, korrelieren.

Gegenstand der Erfindung ist danach die Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens, die an den Positionen 116, 186, 276, 540, 642, 652, 1019, 1186, Intron 1 +22, Intron 1- 36, Intron 2 +52, Intron 2 +63, Intron 2 -52, Intron 3 -56, Intron 4 -101, Intron 5 +14, Intron 6 +146, Intron 6 +160, Intron 7 +35, Intron 7 +87, Intron 7 -51, Intron 8 -40, Intron 8 -42 und Intron 9 -7 ganz oder teilweise mutiert ist. Es handelt sich insbesondere um eine Sequenz, die ganz oder teilweise die Mutationen in Form von Basenaustauschen bzw. Insertionen und Deletionen A → G (Position 116), C → A (Position 186), A → G (Position 276), T → C (Position 540), C → T (Position 642), Insertion T (Position 652), T → C (Position 1019), C → G (Position 1186), C → G (Intron 1 Position +22), A → G (Intron 1 Position -36), T → A (Intron 2 Position +52), Deletion GA (Intron 2 Position +63), T → G (Intron 2 Position -52), C → T (Intron 3 Position -56), C → G (Intron 4 Position -101), A → T (Intron 5 Position +14), A → G (Intron 6 Position +146), T → C (Intron 6 Position +160), Insertion ATCT (Intron 7 Position +35), C → T (Intron 7 Position +87), Deletion 17 bp (Intron 7 Position -51), G → C (Intron 8 Position -40), Insertion T (Intron 8 Position -42), und Insertion 22 bp (Intron 9 Position -7) enthält (Abb. 1 und 2).

Besonders wichtig sind folgende Sequenzen (Haplotypen):

- Sequenz mit der Mutation 642 T,
- Sequenz mit der Mutation 1019 C,
- Sequenz mit der Mutation 1186 G,
- Sequenz mit der Mutation Intron 1 Position +22 G,
- Sequenz mit der Mutation Intron 7 Position -51 Deletion 17 bp,
- Sequenz mit der Mutation Intron 9 Position -7 Insertion 22 bp,
- Sequenz mit den Mutationen 116 A und 642 T
- Sequenz mit Intron 3 Position -56 C und der Mutation 642 T.
- Sequenz mit den Mutationen 186 A und 540 C,
- Sequenz mit den Mutationen 276 G und Intron 1 Position +22 G, sowie die
- Sequenz mit den Mutationen 642 T und Intron 7 Position -51 Deletion 17 bp.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsprädispositionen, wobei alle Sequenzen und Varianten des MSH6-Mismatch Repair Gens von der Einzelmutation bis zu allen möglichen Kombinationen aller Varianten (einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten, die mit einbezogen werden können) genotypisiert werden können und die entsprechende Aussagen über Krankheitsprädispositionen ermöglichen.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an einer der ausgetauschten/veränderten Positionen genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz von hMSH6 verglichen wird. Bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen mindestens die Position 642, 1019, 1186, 1633, Intron 1 +22, Intron 7 -51 oder Intron 9 -7, oder mindestens die beiden Positionen 116 und 642, 186 und 540 oder 276 und Intron 1 +22 genotypisiert werden.

Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Punktmutationen oder Insertionen/Deletionen von einer Größe bis zu ca. 30 Basenpaaren geeignet sind. Dazu gehören Polymerasekettenreaktion (PCR)-gestützte Genotypisierungsverfahren wie z. B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden (Beispiele wären 'dot blotting', oder 'Oligonucleotide Ligation Assays' (OLA)), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, und 'Single Nucleotide Polymorphism' (SNP) Analyse mittels 'Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI), sowie prinzipiell jedweden zukünftig zur Verfügung stehende Methoden zur Variantendetektion einschließlich der Chip-Technologie in all ihren technologischen Ausführungen. Die Insertions- und Deletionsvarianten können des weiteren durch Fragmentlängenbestimmung auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen oder anderen geeigneten Separationsmedien, manuell oder mittels Automaten, bestimmt werden.

Ausgehend davon ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines breiten Spektrums verschiedenster Neoplasieprädispositionen geeignet.

Eine Ausführungsvariante z. B. beinhaltet die Bestimmung einer Prädisposition für das Entstehen von kolorektalen Adenomen und deren Weiterentwicklung zum kolorektalem Karzinom.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsvariante gestattet z. B. die Bestimmung einer Prädisposition für die Entstehung von Endometrium- und Ovarialkarzinomen bei Frauen.

Das Verfahren eignet sich für den Nachweis von Krankheitsprädispositionen in Populationen, als auch in Familien.

Eine weitere Ausführungsvariante beinhaltet therapeutische Konsequenzen, wie der Prädiktion von Resistenzen auf bestimmte Chemo-Therapeutika bei Neoplasien, z. B.: Cysplatin bei kolorektalem Karzinom.

Des weiteren erlaubt das Verfahren auch die Bestimmung des Verlaufs und des Schweregrades von Erkrankungen, sowie die Prädikation der Überlebensdauer nach schweren medizinischen Erkrankungen, z. B. nach Kolon- oder Endometriumkarzinom.

Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der beanspruchten Sequenzvarianten zum Aufbau von Genen bzw. Vektoren, insbesondere zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten Substanzen sowie zur Entwicklung eines diagnostischen Kits oder jedweder diagnostischer Verfahren. Solche Kits oder Verfahren können vorteilhaft zur Vorhersage der individuellen Krankheitsprädisposition oder der individuellen Ansprechbarkeit von Neoplasien auf verschiedene Chemo-Therapeutika eingesetzt werden.

Kulturen von neoplastischen Zellen, welche die genannten individuellen hMSH6 Gen-Varianten oder unterschiedlichste Kombinationen davon aufweisen, können somit als Testmodelle für die Entwicklung individuell spezifischer Therapeutika (z. B.: Chemo-Therapeutika, die nicht zu einer Resistenz der neoplastischen Zellen führen) dienen. Das entspricht Testmodellen in vitro, aber auch in vivo Testmodelle sind eingeschlossen (transgene Tiere bzw. Hefe-Stämme, die diese individuellen hMSH6 Gen-Varianten tragen).

Als individuelle Testmodelle erlauben sie in vitro (= ex vivo) eine Vorhersage zum individuellen Funktionszustand von Chemo-Therapeutika bei der Behandlung von Neoplasien, deren Entstehung durch die Defizienz des hMSH6 Mismatch Repair-Gens vermittelt wird.

Der Umfang der beanspruchten Erfindung wird im folgenden ausführlich dargestellt. Zur Erarbeitung der Erfindung wurde die genomische DNA-Sequenz des menschlichen MSH6 Mismatch Repair Gens, welche Teile der 5' und 3' nichttranslatierten Region, sowie alle zehn codierenden Exons und deren flankierende Intronbereiche beinhaltet, in Patienten mit vererbten oder sporadischen Neoplasien und nicht betroffenen Kontrollpersonen mittels der DNA- Sequenzierung nach Sanger (nach erfolgter Amplifikation der entsprechenden Gen-Abschnitte mittels Polymerasekettenreaktion und spezifischen Primern) untersucht, und zunächst eine Reihe von genetischen Varianten identifiziert. In den untersuchten Gen-Abschnitten wurden zum bestehenden Zeitpunkt 21 neue Varianten entdeckt, deren wichtigste der Austausch eines hochkonservierten Leucin zu Valin (C → G, Position 1186) zu sein scheint. Diese Mutation befindet sich in einer Bindungsdomäne für hMSH2.

Zusammenfassung der neu identifizierten Varianten

Als Referenz-Sequenz für die Varianten, deren Positionen und Konsequenzen für die Aminosäurecodierung dient die genomische hMSH6 Mismatch Repair Gen-Sequenz (Acharya S. et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 13629-13634 / GenBank Accession Nr.: U73732-7). Die Positionsangaben für die Sequenzvarianten in den Exons beziehen sich auf die erste Base des Translations-Start-Codons (Position 1). Die Positionsangaben für die Sequenzvarianten in den Introns (Intron 1 liegt zwischen Exon 1 und 2 u. s. w.) beziehen sich entweder auf die erste Base des jeweiligen Introns nach dem vorhergehenden Exon (Position +1), oder auf die letzte Base des jeweiligen Introns vor dem nächsten Exon (Position -1). Für Insertionen und Deletionen ist jeweils die in Leserichtung letzte Möglichkeit einer Mutation, die zur gefundenen Sequenz führt, angegeben.

Tabelle 1

Neu identifizierte Sequenzvarianten im Mismatch Repair Gen hMSH6

Diese Varianten sind in den Abb. 1 schematisch im Bezug auf die genomische Organisation und in Abb. 2 im Bezug auf die Basenabfolge der Referenz-Sequenz des hMSH6-Gens übersichtlich dargestellt. Abb. 3 zeigt für Insertionen und Deletionen die mutierte Sequenz im Vergleich zur Referenz-Sequenz.

Korrelationen mit Erkrankungen, Prädispositionen bzw. klinisch relevanten Phänotypen

Einen spezifischen Einfluß auf das Risiko an einem Karzinom zu erkranken, konnte z. B. für die Insertion T an Position 652 (Codon 218) nachgewiesen werden. Die Insertion führt bei der Translation zum Proteinsyntheseabbruch an dieser Stelle, womit dem Protein ca. 80% seiner Wildtypsequenz fehlen, und es damit große Teile seiner Funktion verliert. Ein Patient mit dieser Mutation erkrankte mit 34 Jahren an einem Kolonkarzinom. Seine Mutter und zwei Schwestern der Mutter erkrankten an Magen- bzw. Kolonkarzinomen. In Tumorzellen des Patienten ist das zweite Allel des hMSH6-Gens durch eine weitere, somatische Mutation inaktiviert, so daß diese Zellen ohne vollständiges hMSH6-Genprodukt bleiben. Übereinstimmend mit biochemischen Daten zur Funktion des hMSH6-Genprodukts (siehe oben) weisen die Tumorzellen massive Instabilitäten an Mononukleotid-Wiederholungen, aber nicht an Dinukleotid-Wiederholungen auf.

Weiterhin wurde eine Korrelation zwischen der Sequenzvariante C → T an Position 642 und einem erhöhten Risiko an Kolonkarzinom zu erkranken gefunden.

Die 17 bp Deletion beginnend 51 bp vor Exon 8 (Intron 7 Position -51) tritt bei bestimmten Gruppen von Patienten mit nach molekulargenetischen Merkmalen subklassifizierten kolorektalen Karzinomen häufiger auf, als in der Normalbevölkerung. Damit ergibt sich für diese Variante ein weiterer hier identifizierter Risikofaktor.

Die Erfindung wird anschließend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Material und Methoden

Für die Erhebung des gesamten polymorphen Spektrums des hMSH6-Mismatch Repair Gens wurden die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die DNA-Sequenzierung nach Sanger verwendet. Hierzu wurde die gesamte codierende Sequenz inklusive der flankierenden Intronbereiche und Teile der 5'- und 3' nichttranslatierten Regionen in acht Fragmente unterteilt und mittels PCR amplifiziert (siehe Abb. 2). Die hierfür erstellten und genutzten Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die PCR wurde in 25 µl Reaktionsvolumen mit 30-50 ng genomische DNA, 1,7 mM MgCl, 200 nM jedes der vier Dinukleotide, 200 nM jeder der beiden Primer, 1 Unit Taq-Polymerase (AmpliTaq von PE Applied Biosystems, Weiterstadt) und 10% des zur Taq-Polymerase mitgelieferten 10× PCR-Puffers durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren 5 min 94°C gefolgt von 35 Zyklen mit 1 min 94°C, 1 min 58°C und 2 min 72°C und abschließend 7 min 72°C. Das erste Fragment, welches Exon 1 enthält, wurde abweichend zu den oben genannten Bedingungen mit einer Denaturations-Temperatur von 96°C und einer Annealing-Temperatur von 60°C amplifiziert, wobei als DNA-Polymerase und PCR-Puffer der Expand High Fidelity Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim) genutzt wurde.

Die fertigen Reaktionen wurden auf Agarosegelen (1% Agarose, 1× TAE-Puffer) im elektrischen Feld aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Anschließend wurden die amplifizierten Fragmente unter UV-Licht aus den Agarose-Gelen ausgeschnitten und mit sterilem, deionisiertem Wasser durch Inkubieren für 3 h bei 75°C oder für 10 h bei 30°C oder durch Filterzentrifugation für 2 min bei 800 g eluiert.

Die so gewonnenen Eluate wurden mittels des Thermo Sequenase™ Fluorescent Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) und Primer, die auch zur Fragmentamplifikation genutzt wurden, sowie weitere, fragmentinterne Primer (wie in Tabelle 2 aufgeführt) sequenziert. Für jede zu generierende Sequenz wurden vier Reaktionen durchgeführt, welche 5 µl Eluat, 1 µl eines 1 mM Sequenzier-Primers und 2 µl Sequenzierreagent-Mix (Thermo Sequenase, dNTPs und jeweils ddATPs, ddCTPs, ddGTPs oder ddTTPs) in einem Gesamtvolumen von 8 µl enthielten. Die Reaktionsbedingungen waren 2 min 94°C, gefolgt von 20 Zyklen 30 sec 94°C und 30 sec 60°C und abschließend 2 min 72°C. Alle für die Sequenzierung genutzten Primer waren Cy5-Farbstoff markiert, was die Detektion der Produkte der Sequenzierreaktionen auf Automated Laser Fluorescent (ALF) express Sequenzierautomaten (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) ermöglicht. Entsprechend erfolgte die Bestimmung der Sequenzen mittels ALFexpress Sequenzierautomaten. Die Elektrophorese wurde mit Standardplatten mit 0,3 mm starken Long Ranger™- (FMC BioProducts, Rockland, Maine, USA) oder Polyacrylamid (PAA)-Gelen (6,5% Long Ranger oder PAA, 7 M Urea, 1× TBE- Puffer) bei 950 V, 38 mA und 42 W für 10 Stunden durchgeführt.

Sämtliche PCR- und Sequenzierungsreaktionen wurden mittels GeneAmp® PCR Systemen 9700 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt.

Tabelle 2

Primer für die hMSH6-Mismatch Repair Gen Amplifikation und Sequenzierung

Literatur

Acharya S, Wilson T, Gradia S, Kane MF, Guerrette S, Marsischky GT, Kolodner R, Fishel R (1996) hMSH₂

forms specific mispair-binding complexes with hMSH₃

and hMSH6. Proc Natl Acad Sci 93 : 13 629-13 634.
Nicolaides NC, Palombo F, Kinzler KW, Vogelstein B, Jiricny J (1996) Molecular cloning of N- terminus of GTBP. Genomics 31 : 395-397.
Miyaki M, Konishi M, Tanaka K, Kikuchi-Yanoshita R, Muraoka M, Yasuno M, Igari T, Koike M, Chiba M, Mori T (1997) Germline mutation of MSH6 as the cause of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet 17 : 271-272.

Erläuterungen zu den Abb. 2 und 3

1. Die partiell dargestellte Referenzsequenz ist die von Acharya et al. (1996) publizierte hMSH6- Mismatch Repair Gen-Sequenz (GenBank Accession-Nr.: U73732-7).
2. Die Positionen der Sequenzänderungen beziehen sich immer auf die Positionen der Referenzsequenz.
3. Basen des codierenden Bereichs (der Exons) und der 5'- und der 3' nichttranslatierten Regionen (UTR) sind mit Großbuchstaben dargestellt.
4. Basen der Introns sind mit Kleinbuchstaben dargestellt.
5. Markierung über der Sequenz: I = Intron, E = Exon.
6. Unterstrichene Basen kennzeichnen verwendete Primersequenzen.
7. Kursiv geschriebene Basen kennzeichnen das Translations-Start-Codon in Exon 1 und das Translations-Stop-Codon in Exon 10.
8. Zahlen vor den Zeilen mit Großbuchstaben geben die Position der ersten Base in der jeweiligen Zeile an, wobei die erste Base (A) des Translations-Start-Codons in Exon 1 Position 1 ist. Die Positionsangaben der Sequenzvarianten im codierenden Bereich beziehen sich ebenfalls auf den Translations-Start.
9. Fettgedruckte Basen der Referenz-Sequenz kennzeichnen Basen, die durch die dargestellten Sequenzvarianten ausgetauscht oder deletiert werden.
10. Die Positionen für Sequenzvarianten in Introns werden ermittelt, indem ab der ersten Base eines Introns mit +1, bzw. ab der letzten Base eines Introns mit -1 gezählt wird.
11. Für Insertionen und Deletionen gibt es in der Regel eine Reihe verschiedener Möglichkeiten die zu der gleichen veränderten Sequenz führen. z. B.: würde eine 17 bp Deletion in Intron 7 Position -68 (Deletion der Basen -68 bis -52) zur selben veränderten Sequenz wie die dargestellte 17 bp Deletion in Intron 7 Position -51 (Deletion der Basen -51 bis -35) führen. Hier wurde immer die in Leserichtung letztmögliche Variante für die gefundene Sequenzveränderung angegeben.
12. Insertionen erfolgten vor der mit Pfeil gekennzeichneten Base, so daß in der veränderten Sequenz diese Position durch die erste Base der Insertion eingenommen wird.
13. Die drei Varianten an den Positionen 116, 186 und 276 wurden bereits von Nicolaides et al. (1996) beschrieben.
14. Es sind nur Bereiche dargestellt, in denen Sequenzvarianten identifiziert wurden.
15. Führen Sequenzvarianten zum Aminosäureaustausch, so ist dieser mittels des genetischen Codes für Aminosäuren angegeben, alle Sequenzvarianten im codierenden Bereich ohne Aminosäurebenennung ändern die Aminosäurecodierung nicht.

Claims

1. Sequenz des menschlichen MSH6-Mismatch Repair Gens, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen an den Positionen 116, 186, 276, 540, 642, 652, 1019, 1186, Intron 1 +22, Intron 1 -36, Intron 2 +52, Intron 2 +63, Intron 2 -52, Intron 3 -56, Intron 4 -101, Intron 5 +14, Intron 6 +146, Intron 6 +160, Intron 7 +35, Intron 7 +87, Intron 7 -51, Intron 8 -40, Intron 8 -42, Intron 9 -7 ganz oder teilweise ausgetauscht sind, bzw. durch Insertion oder Deletion deren Abfolge verändert ist.

2. Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teilweise die Basenaustausche bzw. Insertionen und Deletionen A → G (Position 116), C → A (Position 186), A → G (Position 276), T → C (Position 540), C → T (Position 642), Insertion T (Position 652), T →C (Position 1019), C → G (Position 1186), C → G (Intron 1 Position +22), A → G (Intron 1 Position -36), T → A (Intron 2 Position +52), Deletion GA (Intron 2 Position +63), T → G (Intron 2 Position -52), C → T (Intron 3 Position -56), C → G (Intron 4 Position -101), A → T (Intron 5 Position +14), A → G (Intron 6 Position +146), T → C (Intron 6 Position +160), Insertion ATCT (Intron 7 Position +35), C → T (Intron 7 Position +87), Deletion 17 bp (TTTGTTTTAATTCCTTT/Intron 7 Position -51), G → C (Intron 8 Position -40), Insertion T (Intron 8 Position -42), und Insertion 22 bp (AAAACTTTTTTTTTTTTTTTTT/Intron 9 Position -7) enthält.

3. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation 642 T.

4. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation 1019 C.

5. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation 1186 G.

6. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation Intron 1 +22 G.

7. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation Intron 7 -51 Deletion 17 bp.

8. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutation Intron 9 -7 Insertion 22 bp.

9. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 116 G und Intron 2 -52 G.

10. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 186 A und 540 C.

11. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Mutationen 276 G und Intron 1 +22 G.

12. Sequenz nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Intron 3 -56 C und die Mutationen 642 T.

13. Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsprädispositionen, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an einer der ausgetauschten Positionen genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird, wobei ggf. alle möglichen Kombinationen von Varianten von der Einzelmutation bis zu allen möglichen Kombinationen aller Varianten einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten einbezogen werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an der Position 642 genotypisiert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an der Position 1186 genotypisiert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an Intron 1 Position +22 genotypisiert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an Intron 7 Position -51 für die Deletion 17 bp genotypisiert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den zwei Positionen 642 und 1186 genotypisiert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den vier Positionen 642, 1186, Intron 1 +22 und Intron 7 -51 genotypisiert wird.

20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an den sieben Positionen 116, 186, 642, 1186, Intron 1 +22, Intron 7 +35 und Intron 7 -51 genotypisiert wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Genotypisierung durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für den Nachweis von Varianten geeignet sind, erfolgt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer Prädisposition für Neoplasien.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer Prädisposition für kolorektales Karzinom.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer Prädisposition für Endometrium- und Ovarialkarzinom bei Frauen.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer Prädisposition für Leukämie.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer erhöhten Mutationsrate in eukaryotischen Zellen.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer erhöhten Frequenz von Basensubstitutionen in eukaryotischen Zellen.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer erhöhten Frequenz von Insertionen und/oder Deletionen in eukaryotischen Zellen.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Bestimmung einer erhöhten Frequenz von Basensubstitutionen und Insertionen und/oder Deletionen in eukaryotischen Zellen.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Prädikation des Verlaufs und des Schweregrades von, und der Überlebensdauer bei Erkrankungen, im besonderen Neoplasien.

31. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 12 zur Entwicklung von Therapeutika und/oder 'lifestyle-drugs'.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Prädiktion der individuell unterschiedlichen Ansprechbarkeit auf bisher bekannte Chemo-Therapeutika, wie Cisplatin, sowie zukünftig, auch unter Anspruch 31 entwickelten Chemo-Therapeutika.

33. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Kontrolle von Mutationsraten in eukaryotischen Zellen in vivo und in vitro.

34. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21 zur Optimierung der individuellen, gegen Neoplasien gerichteten Therapie bzw. Intervention.

35. Verwendung der Sequenzvarianten nach Anspruch 1 bis 12 zum Aufbau von Genen bzw. Vektoren, insbesondere zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten Substanzen.

36. Verwendung nach Anspruch 13 bis 34 zur Entwicklung eines diagnostischen Kits, oder jedweden Verfahrens zur Genotypisierung.

37. Verwendung nach Anspruch 13 bis 34 für die Entwicklung eines diagnostischen Kits zur Vorhersage der individuellen Ansprechbarkeit auf verschiedene Chemo-Therapeutika bei der Behandlung von Neoplasien.

38. Verwendung nach Anspruch 1 bis 12 sowie 13 bis 37 zur Entwicklung von in vitro (z. B. Zellkulturen) und in vivo (z. B. transgene Tiere) Testsystemen, die individuelle Formen des MSH6-Mismatch Repair Gens exprimieren, wobei die Testsysteme zur Untersuchung der Pathophysiologie von Erkrankungen von generell medizinisch wichtigen Merkmalen mit Beteiligung des MSH6-Mismatch Repair Gens dienen, sowie zur Entwicklung und Testung individuell spezifischer Therapeutika und 'lifestyle- drugs' und von MSH6-gerichteten Substanzen im allgemeinen.