DE69834949T2 - Bestimmung der prädisposition für obstruktive lungenerkrankung basierend auf genpolymorphismen der humanen luftweg-trypsin-protease - Google Patents

Bestimmung der prädisposition für obstruktive lungenerkrankung basierend auf genpolymorphismen der humanen luftweg-trypsin-protease Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vorhersagen der Konstitution, die für den Ausbruch einer obstruktiven Lungenerkrankung anfällig ist, der Auswirkungen auf Verfahren zur Behandlung von Patienten, die an diesen Erkrankungen leiden, oder zum Vorhersagen der Prognose der Behandlung durch die Analyse genetischer Polymorphismen eines humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In letzter Zeit wurden nicht nur Forschungsarbeiten über zugehörige Gene bei Erbschäden aufgrund der Deletion oder Mutation einzelner Gene gefördert, sondern auch bei multifaktoriellen Erkrankungen, die durch Verschränkung verschiedener genetischer Prädispositionen und Umweltfaktoren verursacht sind. Daher werden Deletions- oder Punktmutation und Isoforme, die mit den multifaktoriellen Erkrankungen in Beziehung stehen, und ferner Mutation genetischer Teile (Introns oder Promotoren), ohne dass tatsächlich translatierte Aminosäuresequenzen beeinflusst werden, als Risikofaktoren für diese Erkrankungen eingestuft.
  • Effekt der Erfindung
  • Es wurde veröffentlicht, dass die Korrelation zwischen der Knochendichte und genetischen Polymorphismen eines Introns des Vitamin-D-Rezeptors im Bereich der Osteopathien als Stand der Technik anerkannt ist (Morrison, N. A. et al., Nature, 367: 284-287, 1994). Im Bereich der Kreislauforgane wurde berichtet, dass der I-Typ (Insertionstyp) und der D-Typ (Deletionstyp) genetischer Polymorphismen eines Angiotensin-konvertierenden Enzyms mit der Entstehung von Herzinfarkt assoziiert sind (Cambien, F. et al., Nature 359: 641-644, 1992), und die Aminosäuresubstitution von M235T von Angiotensinogen und die Polymorphismen einer Promotorregion von G-6A mit der Entstehung essentieller Hypertonie assoziiert sind (Inoue, I. et al., J. Clin. Invest., 99: 1786-1797, 1997). Ferner wurde im Bereich des Nervensystems über die Assoziation zwischen dem Ausbruch von Demenz und den Isoformen von ApoE-Protein berichtet. Es wurde sehr viel Forschungsarbeit hinsichtlich der Assoziation zwischen den genetischen Polymorphismen von Glutathion-S-Transferase und dem Ausbruch von Krebs im mit Krebs in Beziehung stehenden Bereich durchgeführt. Im Bereich der Atemwegserkrankungen wurde über die Assoziation zwischen dem Ausbruch oder dem Krankheitszustand von Asthma und TNF (Moffatt, M. F. et al., Hum. Mol. Genet. 6(4): 551-554, 1997) und die Assoziation zwischen dem Ausbruch oder dem Krankheitszustand von Asthma und den genetischen Polymorphismen eines Angiotensin-konvertierenden Enzyms (Benessiano, J. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 99 (1): 53-57, 1997) berichtet.
  • Ferner wurde dem genetischen Hintergrund als einer der Ursachen des Unterschiedes zwischen Patienten hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, die zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, Aufmerksamkeit geschenkt, und es war sogar von medizinischer Seite erwünscht, dass Direktionalität verfügbar sei, wie Auswahl von Behandlungsmethoden gemäß der Empfindlichkeit der Individuen gegenüber Medikamenten durch Diagnose der genetischen Polymorphismen. Es wird angenommen, dass die Entwicklung von Medikamenten durch Auswahl von Patientengruppen, bei denen Medikamentenwirkungen zu erwarten sind, nach den genetischen Polymorphismen in klinischen Versuchen wirksam ist (Kleyn K. W. et al., Science, 281: 1820-1821, 1998). Ein Bericht über die genetischen Polymorphismen eines Introns eines Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE, angiotensin converting enzyme) und Effekte eines ACE-Inhibitors (Yoshida, N. et al., J. Clin. Invest. 96: 2162-2169, 1995), ein Bericht über die genetischen Polymorphismen von Beta-2-adrenergem Rezeptor und Effekte des Beta-Agonisten auf Asthma (Liggett, S. B., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (4 Pt 2): S. 156-162, 1997) und dergleichen werden als übliche Berichte in Bezug auf Arzneimittelempfindlichkeit und genetische Polymorphismen zitiert.
  • Andererseits wurde das humane trypsinartige Enzym der Atemwege, das in Relation zur vorliegenden Erfindung ist, aus dem Sputum von Patienten gereinigt, die an chronischen Atemwegserkrankungen leiden (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 7-067640 und Yasuoka, S. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16: 300-308, 1997), und seine Aminosäuresequenz und cDNA-Sequenz wurden bereits geklärt (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 8-89246 und Yamaoka K. et. al., J. Biol. Chem., 273(19): 11895-11901, 1998). Es wurden verschiedene Untersuchungen zur Aktivität, die das Enzym in vitro hat, durchgeführt. Da das Enzym eine die Produktion erhöhende Wir kung auf Cytokine hat, wie IL-8 oder GM-CSF, die von einer humanen bronchialen Epithelzelllinie abgeleitet sind, einschließlich der Assoziation mit der mukoziliären Bewegung, wird die Möglichkeit der Assoziation mit dem Krankheitszustand von Entzündungen der Atemwege in Betracht gezogen (Terao, Noriko et al., The Japanese Respiratory Society, 1998). Da das Enzym Enzymaktivitäten hat, wie hydrolytische Aktivität für Fibrinogen und aktivierende Wirkungen auf Plasminogenaktivatoren (Pro-Urokinase) (Yoshinaga, Junko et al., Conference on Proteases and Inhibitors in Pathophysiology und Therapeutics, 1998), wird die Möglichkeit entzündungshemmender Wirkungen durch die Bildung von Fibrinen auf der Schleimhautoberfläche der Atemwege oder Modifikation des Krankheitszustands bei chronischen Atemwegserkrankungen in Betracht gezogen, und es wird auch die Möglichkeit einer Assoziation mit Krebsmetastasen oder dergleichen in Betracht gezogen. Die Assoziation des Enzyms mit physiologischen Funktionen oder dem Krankheitszustand in vivo ist noch nicht ausreichend aufgeklärt, und die genetischen Teile (Introns oder Promotoren) ohne Bezug zu tatsächlich translatierten Aminosäuresequenzen ist über Gene noch gar nicht bekannt. Ferner wurde bisher keine Forschung hinsichtlich der Assoziation des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der genetischen Polymorphismen für das humane trypsinartige Enzym der Atemwege oder der genetischen Polymorphismen mit Erkrankungen durchgeführt.
  • Im Übrigen kann sehr viel Information über die Vorhersage des Ausbruchs spezieller Erkrankungen, die Prognose der Behandlung, die Auswahl geeigneter Behandlungsmethoden und verabreichter Medikamente oder dergleichen durch die Vorhersage der mit Erkrankungen assoziierten Konstitution durch genetische Analyse bereitgestellt werden. Folglich ist die Vorhersage von vielen Ärzten und Patienten erwünscht und macht außerdem die Prophylaxe des Ausbruchs sowie frühzeitige Therapie möglich. Daher wird angenommen, dass die Vorhersage mit einer Verminderung des Aufwands medizinischer Betreuung verbunden ist, die für die zukünftige medizinische Betreuung unerlässlich wird.
  • Es ist jedoch sehr schwierig, ein mit Erkrankungen assoziiertes Gen herauszufinden und eine Analysenmethode dafür zu etablieren, und es gibt nur wenige Beispiele für genetische Analysenmethoden, bei denen die Assoziation mit Erkrankungen wie oben beschrieben erkannt wird. Daher ist die Entwicklung der genetischen Analysentechnik zur Vorhersage verschiedener mit Erkrankungen assoziierter Konstitutionen äußerst wünschenswert.
  • Andererseits ist derzeit noch nicht aufgeklärt worden, mit welchen Erkrankungen das humane trypsinartige Enzym der Atemwege assoziiert wird.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Als Ergebnis der intensiven Forschungsarbeiten, die unter Berücksichtigung der Probleme des Standes der Technik durchgeführt wurden, haben die Erfinder et al. einen Primer für die genetische Amplifizierung eines Intron-Teils am Genom des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege konstruiert, das spezifisch in den menschlichen Atemwegen exprimiert, die DNA-Sequenz der Enden des amplifizierten genetischen Fragments und der neu bestimmten DNA-Sequenz in einem Exon/Intron-Grenzteil bestimmt, herausgefunden, dass es genetische Polymorphismen in dem amplifizierten genetischen Fragment und der neu bestimmten DNA-Sequenz gibt, und ferner zum ersten Mal die Assoziation der Genotypen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege mit einer obstruktiven Lungenerkrankung bei menschlichen Individuen durch Analyse der genetischen Polymorphismen gefunden und so die vorliegende Erfindung erzielt.
  • Das heißt, es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Vorhersagen der Konstitution menschlicher Individuen, die für den Ausbruch spezieller Erkrankungen anfällig ist, oder Auswirkungen der Behandlung bei Patienten oder Prognose der Behandlung durch Analyse der genetischen Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege bereitzustellen. Demgemäß gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 4 an.
  • Ferner ist die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäurefragment eines Introns eines Gens eines humanen trypsinartigen Enzyms, umfassend SEQ ID NO 5 oder SEQ ID NO 6. Es wird auch ein Nukleinsäurefragment eines Introns eines Gens eines humanen trypsinartigen Enzyms, umfassend die Nukleotide 75 bis 3308 von SEQ ID NO 17, angegeben.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 illustriert agarosegelelektrophoretische Muster von DNA-Fragmenten, die eine Intron-Region eines Gens aufweisen, das ein reifes Protein des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege codiert, erhalten durch genetisches Amplifizieren. Es wird beobachtet, dass die Bahnen 1 und 5 Marker (10 Kb, 7 Kb, 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2,5 Kb, 2 Kb, 1,5 Kb und 1 Kb von oben) sind, Bahn 2 ein DNA-Fragment von etwa 6 Kb, amplifiziert durch die Primer A1 (Sequenz Nr. 7) und A2 (Sequenz Nr. 8), Bahn 3 ein DNA-Fragment von etwa 1,5 Kb, amplifiziert durch die Primer B1 (Sequenz Nr. 9) und B2 (Sequenz Nr. 10), und Bahn 4 ein DNA-Fragment von etwa 3,4 Kb, amplifiziert durch die Primer C1 (Sequenz Nr. 11) und C2 (Sequenz Nr. 12), ist.
  • 2 illustriert agarosegelelektrophoretische Muster von DNA-Fragmenten, die eine Intron-Region eines Gens aufweisen, das ein Propeptid des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege codiert, erhalten durch genetisches Amplifizieren. Es wird beobachtet, dass die Bahnen 1 und 4 Marker (10 Kb, 7 Kb, 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2,5 Kb, 2 Kb, 1,5 Kb und 1 Kb von oben) sind, Bahn 2 ein DNA-Fragment von etwa 5,5 Kb, amplifiziert durch Primer D1 (Sequenz Nr. 13) und D2 (Sequenz Nr. 14), und Bahn 3 ein DNA-Fragment von etwa 5 Kb, amplifiziert durch Primer E1 (Sequenz Nr. 15) und E2 (Sequenz Nr. 16), ist.
  • 3 illustriert relative Positionen von Introns A, B und C am Genom des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege und agarosegelelektrophoretische Muster genetischer Polymorphismen (RFLP) des Introns A, detektiert durch TaqI, und des Introns C, detektiert durch MboI und BstUI.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein Verfahren zum Vorhersagen der Assoziation der Konstitution einzelner Menschen mit obstruktiven Lungenerkrankungen und ein genetisches Fragment oder eine DNA-Sequenz, die für die genetische Analyse davon verwendet werden, angegeben.
  • Atemwegserkrankungen, Lungenkrebs, insbesondere Lungenemphysem (pulmonary emphysema, PE), sinobronchiales Syndrom, diffuse Panbronchiolitis (DPB) und Bronchiektase (BE), die zu den chronischen obstruktiven Lungenerkrankungen (chronic obstructive pulmonary diseases, COPD) gehören, werden beispielhaft als spezifische Erkrankungen für die Beurteilung der Konstitution, die für den Ausbruch einer obstruktiven Lungenerkrankung anfällig ist, für die Vorhersage der Beurteilung der Effekte der Behandlung oder der Prognose der Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren angeführt. Die Analyse der Genotypen, die klassifiziert werden durch Detektion einer oder mehrerer Basenmutationen, und die Analyse der Haplotypen, die klassifiziert werden durch Detektion einer oder mehrerer der Basenmutationen, werden in der vorliegenden Erfindung als Analysenmethode für die genetischen Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege beispielhaft angeführt.
  • Die Analysenmethode hinsichtlich der genetischen Polymorphismen des trypsinartigen Enzyms der Atemwege erfolgt beispielsweise durch eine Analysenmethode durch Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP) gemäß der Spaltung mit einem Restriktionsenzym. Die Analysenmethode für die genetischen Polymorphismen in der vorliegenden Erfindung schließt sogar eine Analysenmethode für die genetischen Polymorphismen ein, die durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer cDNA-Sequenz des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege detektierbar sind. Das heißt, es ist ein Verfahren zum Spalten der genomischen DNA mit einem Restriktionsenzym, das in der Lage ist, die genetischen Polymorphismen zu detektieren, in der vorliegenden Erfindung offenbart, dann die Durchführung einer Gelelektrophorese, Ausführen der Transkription zu einer Nitrocellulosemembran oder dergleichen und anschließend Analysieren der Spaltungsmuster des Genoms des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege unter Verwendung der cDNA des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege als Sonde. Die Analyse kann sogar nach einer Methode zum Amplifizierens eines DNA-Fragments durch PCR durchgeführt werden, um Stellen für die genetischen Polymorphismen einzuschließen, dann Umwandlung des amplifizierten DNA-Fragments in einen Einzelstrang und Analysieren des resultierenden Einzelstrangs nach dem Unterschied in der Mobilität in der Elektrophorese [PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism)] oder dergleichen. Ferner sind viele Methoden, wie eine Mismatch-PCR-Methode, eine PCR-allelenspezifische Oligo-Methode (ASO) unter Verwendung eines allelenspezifischen Oligonucleotides, eine Methode zur Beurteilung durch Durchführung von Annealing unter Verwendung einer Oligo-Sonde oder eine PinPoint-Sequenzierung für direkte Bestimmung der Basensequenz der genetischen polymorphen Stellen als Methode zum Detektieren der polymorphen Stellen möglich, und die Analysenmethode für die genetischen Polymorphismen kann sogar auf genetische Diagnose unter Verwendung eines DNA-Chips angewendet werden.
  • Ein Intron kann als Stelle für die Analyse der genetischen Polymorphismen verwendet werden, und das folgende genetische Fragment wird als die Stelle für die Analyse der spezifischen genetischen Polymorphismen beispielhaft angeführt:
    (f) ein genetisches Fragment, Intron C enthaltend, das amplifizierbar ist unter Verwendung der durch die Sequenz Nr. 11 und die Sequenz Nr. 12 repräsentierten Primer.
  • In dem Intron C ist ein genetisches Fragment, das einen sequentiellen Teil enthält, der durch ein Restriktionsenzym BstUI, MboI, MseI oder FbaI erkannt wird, als Stellen für die Analyse der genetischen Polymorphismen exemplifiziert. Die genotypische oder haplotypische Klassifikation wird durch die Analyse der Stellen beurteilt.
  • Ferner ist die vorliegende Erfindung ein genetisches Fragment, das einen Teil oder alles von der Basensequenz von Intron C des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege aufweist, und die folgenden genetischen Fragmente werden speziell beispielhaft angeführt:
    (c) ein genetisches Fragment, eine Intron-Region aufweisend, amplifizierbar durch Verwendung der durch die Sequenz Nr. 11 und die Sequenz Nr. 12 repräsentierten Primer,
    und
    (g) ein genetisches Fragment des Intron C im humanen trypsinartigen Enzym der Atemwege, umfassend die Basensequenz, die durch die Nukleotide 75 bis 3308 der Sequenz Nr. 17 repräsentiert wird.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen detailliert erläutert, unter der Voraussetzung, dass die Beispiele nicht als Definition des Verfahrens zum Vorhersagen der mit Erkrankung assoziierten Konstitution durch die Analyse der genetischen Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege vorgesehen sind.
  • [Standardmethoden für Arbeitsgänge]
  • Standard-DNA-Extraktionsverfahren, genetische Amplifizierungsverfahren, Restriktionsenzymspaltungsverfahren und elektrophoretische Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, werden im Folgenden erläutert.
  • (a) Standard-DNA-Extraktionsverfahren
  • In für die genetische Amplifizierung der vorliegenden Erfindung verwendeten Bioproben ist nichts speziell eingeschränkt; Blutkörperchenkomponenten sind jedoch geeignet, da Proben leicht gesammelt werden und DNA leicht extrahiert wird.
    • 1. Vollblut in einem Volumen von 0,5 ml (unter Verwendung eines 2Na-EDTA-Anticoagulans) wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 ml gebracht.
    • 2. Ein Lösungsmittel wird in einem Volumen von 0,5 ml in das Röhrchen zugegeben, und das Röhrchen wird mehrmals leicht geklopft. Das Röhrchen wird dann umgedreht, und die Flüssigkeiten werden vermischt. (Die folgenden Mischungsvorgänge werden wie oben durchgeführt). Ein Beispiel für das Lösungsmittel: 1 × SSC Das wird hergestellt durch 10-faches Verdünnen von 20 × SSC, das mit 10N NaOH auf pH 7,0 eingestellt ist, 175,3 Gramm NaCl und 88,2 Gramm Natriumcitrat in 1 Liter enthaltend.
    • 3. Die Mischung wird zentrifugiert (20 s bei 4 °C und 10 000 g), und der Überstand wird dann entfernt, um dunkle Pellets nicht abzulassen.
    • 4. Das Lösungsmittel wird in einem Volumen von 1 ml zugesetzt, um die Mischung umzurühren.
    • 5. Die Mischung wird zentrifugiert (20 s bei 4 °C und 10 000 g), und der Überstand wird dann entfernt.
    • 6. Die Schritte 4 und 5 werden noch einmal wiederholt.
    • 7. Eine Enzymreaktionslösung in einem Volumen von 200 μl und ein proteolytisches Enzym in einem Volumen von 10 μl werden zugesetzt und damit vermischt. Ein Beispiel für eine Enzymreaktionslösung: Eine Mischflüssigkeit von 0,04 M DTT (Dithiothreit) mit 0,2 M NaOAc (Natriumacetat) und 0,4% SDS. Ein Beispiel für die proteolytischen Enzymflüssigkeit: 10 mg/ml Proteinase (Proteinase K)
    • 8. Die Mischung wird 1 Stunde bei 37 °C warm gehalten (die Mischung wird im Zuge dessen durch 2- bis 3-maliges leichtes Schütteln gemischt).
    • 9. Eine Natriumiodid-Lösung wird dann in einem Volumen von 300 μl zugesetzt und damit vermischt.
    • 10. Isopropylalkohol wird in einem Volumen von 0,5 ml zugesetzt und gemischt, bis eine weiße lineare DNA vollständig sichtbar ist.
    • 11. Die resultierende Mischung wird zentrifugiert (10 min bei Raumtemperatur und 10 000 g), und der Überstand wird dann langsam entfernt. Die an der Röhrchenwand verbleibende Lösung wird ausreichend entfernt, indem das Röhrchen umgedreht auf Filterpapier gebracht wird, oder dergleichen.
    • 12. Eine Waschflüssigkeit (A) wird dann in einem Volumen von 1 ml zugesetzt und damit vermischt. Die Mischung wird ausreichend vermischt, um das Präzipitat von der Röhrchenwand zu schälen. Ein Beispiel für die Waschflüssigkeit (A): 70% EtOH.
    • 13. Die resultierende Mischung wird zentrifugiert (5 min bei Raumtemperatur und 10 000 g), und der Überstand wird entfernt.
    • 14. Eine Waschflüssigkeit (B) wird in einem Volumen von 1 ml zugesetzt, und die bereitete Mischung wird ausreichend vermischt, so dass das Präzipitat von der Röhrchenwand geschält wird. Ein Beispiel für die Waschflüssigkeit (B): 80% EtOH.
    • 15. Die Mischung wird zentrifugiert (5 min bei Raumtemperatur und 10 000 g), und der Überstand wird dann entfernt.
    • 16. Das DNA-Präzipitat wird leicht vakuumgetrocknet (die Trockenzeit liegt innerhalb von 3 min, weil die DNA schwer gelöst wird, wenn das Präzipitat zu sehr getrocknet wird).
  • (a) Standardverfahren der genetischen Amplifizierung
  • Obwohl verschiedene Prinzipien über die genetische Amplifizierungsmethode bekannt sind, wird hier im Folgenden die Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Methode) als Standard beschrieben.
  • Zusammensetzung der Reaktionslösung: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0, 25 °C), 0,1% TritonX-100, 1,5 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, 15 μM Vorwärts-Primer, 15 μM Rückwärts-Primer, 1 mg/l einer genomischen DNA und 1 Einheit TagDNA-Polymerase, Gesamtvolumen 50 μl.
  • Reaktionszyklus: bei 94 °C für 1 min, 64 °C für 1 min und 72 °C für 1 min als ein Zyklus. Die Reaktion wird über 40 Zyklen ausgeführt.
  • Verwendete Primer sind die folgenden C1 (35 Basen) und C2 (35 Basen):
    C1: 5'-GGAGC CATCT TGTCT GGAAT GCTGT GTGCT GGAGT-3'
    C2: 5'-CACAA TAAAC CAAAG CCGCC GTGAG TCTTC TTGTA-3'
  • (c) Standardverfahren der Restriktionsenzymspaltung
  • Zusammensetzung der Reaktionslösung für Mbol: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 10mM KCl, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA (Rinderserumalbumin) Mbol wird in einer Konzentration von 10 Einheiten/20 μl Reaktionslösung zugesetzt, um Inkubation für 3 Stunden bei 37 °C durchzuführen.
  • (b) Elektrophoretische Standardverfahren
  • Die Pufferlösung für die Elektrophorese ist 0,5 × TBE, mit der Maßgabe, dass 5 × TBE 54 Gramm Tris-Base, 27,5 Gramm Borsäure und 1 mM EDTA in 1 Liter enthält und auf pH 8,0 eingestellt ist. Die obige Pufferlösung wird verwendet, um die Elektrophorese unter einer Spannung von 100 V für 30 min unter Verwendung von 1%igem oder 3%igem Agarosegel [unter Verwendung von Seakem GTA Agarose (FMC Bio Products)] (0,5 μl/ml Ethidiumbromid enthaltend) durchzuführen. Die Bande der DNA wird dann mit einer UV-Lampe betrachtet.
  • [Beispiel 1] Erhalt eines DNA-Fragments, welches ein Intron am Genom von humanem trypsinartigem Enzym der Atemwege enthält, und Analyse der Basensequenz davon
  • Um nach einer Intron-Stelle auf dem Genom von reifem humanem trypsinartigem Enzym der Atemwege zu suchen, wurden Primer hergestellt unter Bezugnahme auf die Konstitution von Exons und Introns des Genoms verschiedener Tryptase-analoger Enzyme, um eine humane genomische DNA zu amplifizieren. Ein DNA-Fragment (genetisches Fragment) von etwa 6 Kb wurde durch die Primer A1 (Sequenz Nr. 7) und A2 (Sequenz Nr. 8) amplifiziert, und ein DNA-Fragment von etwa 1,5 Kb wurde durch die Primer B1 (Sequenz Nr. 9) und B2 (Sequenz Nr. 10) amplifiziert. Ein DNA-Fragment von etwa 3,4 Kb wurde durch die Primer C1 (Sequenz Nr. 11) und C2 (Sequenz Nr. 12) amplifiziert. (1)
  • Die DNA-Fragments wurden aus Gelen ausgeschnitten und gereinigt, und die jeweiligen Fragmente wurden in TA-Klonierungsvektoren (hergestellt von Invitrogen Corporation) inseriert. Die Basensequenzen an beiden Seiten (5'-Ende und 3'-Ende) der Insert-DNA wurden für mehrere Klone davon bestimmt, um zu finden, dass die cDNA-Sequenz des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege benachbart zu den Primersequenzen vorhanden war, Konsensussequenzen wurden als dazu benachbart in Grenzregionen des Exon-Introns an beiden Seiten des 5'-Endes und des 3'-Endes erkannt, und das amplifizierte DNA-Fragment war ein DNA-Fragment, das die Intron-Region im humanen trypsinartigen Enzym der Atemwege enthielt.
  • Die Sequenzen der Introns, die in der vorliegenden Erfindung klar gemacht wurden, in einer genetischen Region, die das reife Protein des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege codiert, werden jeweils als Intron A, Intron B und Intron C von der 5'-Seite bezeichnet (3). Die Basensequenzen am 5'- und 3'-Ende des geklärten jeweiligen Introns sind wie durch die Sequenz Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 repräsentiert. In Bezug auf das Intron C ist die gesamte Basensequenz durch die Nukleotide 75 bis 3308 der Sequenz Nr. 17 repräsentiert.
  • Andererseits wurden mehrere Primer für die Region hergestellt, die ein Propeptid des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege codiert, um die genetische Amplifizierung durchzuführen. Damit war klar, dass ein DNA-Fragment von etwa 5,5 Kb durch die Primer D1 (Sequenz Nr. 13) und D2 (Sequenz Nr. 14) amplifiziert wurde, und ein DNA-Fragment von etwa 5 Kb durch die Primer E1 (Sequenz Nr. 15) und E2 (Sequenz Nr. 16) amplifiziert wurde (2). Die genetischen Fragmente werden als die Introns enthaltend betrachtet.
  • [Beispiel 2] Analyse genetischer Polymorphismen von Introns in humanem trypsinartigem Enzym der Atemwege
  • Um zu untersuchen, ob die genetischen Polymorphismen in den Introns A, B und C vorhanden sind oder nicht, wurde die genomische DNA von 23 normalen Menschen aus Vollblut extrahiert (Standardmethode) und jeweils durch die Primer A1 und A2 zum Amplifizieren von Intron A, die Primer B1 und B2 zum Amplifizieren von Intron B und die Primer C1 und C2 zum Amplifizieren von Intron C nach PCR amplifiziert, um die Spaltungsmuster mit verschiedenen Arten von Restriktionsenzymen zu vergleichen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die genetischen Polymorphismen mit den Restriktionsenzymen MboI, TaqI und AfaI im Intron A beobachtet wurden.
  • Umgekehrt wurden die genetischen Polymorphismen durch die Restriktionsenzyme Tsp509I, AluI, NlaIII, MspI, BstUI, BfaI, HinPI, HaeIII, HindIII, SspI, PstI, EcoRI, SalI und EcoRV nicht beobachtet.
  • Im Intron B wurden die genetischen Polymorphismen durch die Restriktionsenzyme Tsp509I, AluI, NlaIII, MspI, BstUI, BfaI, HinPI, HaeIII, MboI, AfaI, TaqI, MseI, ClaI, NsiI, EcoT14I, NdeI, PmlI, ApaLI, AatII, ApaI, KpnI, BsmI, HindIII, SspI und EcoRV nicht beobachtet.
  • Im Intron C wurde gefunden, dass die genetischen Polymorphismen durch die Restriktionsenzyme MboI, BstUI, MseI und FbaI beobachtet wurden. Umgekehrt wurden die genetischen Polymorphismen durch die Restriktionsenzyme AluI, NlaIII, MspI, BfaI, HinPI, HaeIII, AfaI, TaqI, HindIII, SspI, BglII, EcoT14I, PvuII, PvuI, EcoRI, BamHI, EcoRV und KpnI nicht beobachtet.
  • Wenn das DNA-Fragment, das das Intron C enthielt, durch Verwendung einer Kombination der Primer C1 und C2 amplifiziert, mit MboI oder BstUI gespaltet wurde, zeigten Versuche mit der Spaltung durch MboI, dass der Fall, wo eine Bande bei 1,3 Kb auftrat, als Genotyp MM bewertet werden konnte, der Fall, wo eine Bande bei 1,05 Kb auftrat, als Genotyp mm bewertet werden konnte, und der Fall, wo zwei Banden zusammen bei 1,3 Kb und 1,05 Kb auftraten, als Genotyp Mm bewertet werden konnte, gemäß Elektrophorese. Andererseits konnte im Fall von BstUI der Fall, wo eine Bande bei 3,4 Kb auftrat, als BB bewertet werden, der Fall, wo zwei Banden bei 2,45 Kb und 0,95 Kb auftraten, konnte als bb bewertet werden, und der Fall, wo drei Banden zusammen auftraten, konnte als Bb bewertet werden.
  • 3 zeigt elektrophoretische Muster der genetischen Polymorphismen von Intron A, detektiert durch TaqI, und von Intron C, detektiert durch MboI und BstUI. Ferner wurde die gesamte Basensequenz des Haplotyps bm-Typ für das Intron C aus dem DNA-Fragment bestimmt, das vom Genom eines Beispiels eines normalen Menschen des bbmm-Typs durch PCR erhalten wurde (Nukleotide 75 bis 3308 der Sequenz Nr. 17). Die genetischen polymorphen Stellen, die durch BstUI und MboI in the Basensequenz des Intron C detektiert wurden, sind durch Pfeile mit weißer Aussparung angezeigt.
  • Die Basensequenz eines Beispiels eines an BBmm-Typ BE leidenden Patienten wurde bestimmt, um festzustellen, dass die Basensequenz der Bm-Haplotyp BstUI genetischer polymorpher Stellen mit BstUI nicht gespaltet wurden, weil CGCG in ACCG umgewandelt wurde.
  • [Beispiel 3] Analyse der mit Erkrankung assoziierten Konstitution durch die Analyse der genetischen Intron-Polymorphismen von humanem trypsinartigem Enzym der Atemwege
  • Was die statistische Analyse betrifft, wurde diese Analyse nach dem Chi-Quadrat-Test unter Verwendung der Software Stat View4.02 (Abacus Concepts Co.) für statistische Analysen durchgeführt.
  • Beispiel 3-1 Analyse der mit Erkrankung assoziierten Konstitution durch genotypische Klassifikation
  • Unter den im Beispiel 2 offenbarten Genotypen wurde untersucht, ob die Klassifikation von Erkrankungen, die mit dem humanen trypsinartigen Enzym der Atemwege assoziiert sind, für die genetischen Polymorphismen durchgeführt werden kann, die mit MboI und BstUI im Intron C detektiert wurden, oder nicht. Die als Objekte ausgewählten Erkrankungen sind diffuse Panbronchiolitis (DPB), Bronchiektase (BE), Lungenemphysem (PE) und Asthma bronchiale (BA), die Atemwegserkrankungen sind.
  • Die Genotypen jedes Menschen wurden durch Auswählen von 106 normalen Menschen, 29 Patienten, die an diffuser Panbronchiolitis (DPB) litten, 38 Patienten, die an Bronchiektase (BE) litten, 22 Patienten, die an Lungenemphysem (PE) litten, und 32 Patienten, die an Asthma bronchiale (BA) litten, nach der Standardmethode bewertet. MboI und BstUI wurden als Restriktionsenzyme verwendet.
  • Die Anzahl der Menschen mit Vorkommen und Häufigkeit des Vorkommens jedes Genotyps und die Anzahl der Vorkommen und die Häufigkeit der Vorkommen jedes Alleltyps waren wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
  • Tabelle 1 BstUI-Genotyp
    Figure 00140001
  • Tabelle 2 MboI-Genotyp
    Figure 00140002
  • Die Tabellen 1 und 2 zeigen, dass die Häufigkeit des Vorkommens des BB-Typs eine stärkere Tendenz in DPB, BE und PE manifestiert, wenn man die obigen Genotypen bewertet. Das heißt, es kann die Bewertung gemacht werden, dass einzelne Menschen mit den Genotypen Konstitutionen haben, die anfällig für DPB, BE und PE sind. Wenn DPB, BE und PE in die Patientengruppen zusammengefasst werden, die an den drei Atemwegserkrankungen gemäß der Klassifikation der chronischen obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD) leiden, werden Ergebnisse wie folgt erhalten: Die Häufigkeit des Vorkommens des BB-Typs ist statistisch signifikant höher als bei normalen Menschen (Chi-Quadrat-p-Wert = 0,04 und Chi-Quadrat-Wert = 4,2).
  • Häufigkeit der Beobachtung drei Erkrankungen, BB/NichtBB
    Figure 00150001
  • Prozent (Zeile): drei Erkrankungen, BB/NichtBB
    Figure 00150002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: drei Erkrankungen, BB/NichtBB
    Figure 00160001
  • Beispiel 3-2 Analyse der erkrankungsbezogenen Konstitution durch Haplotyp-Klassifikation
  • Häufigkeit des Vorkommens von Haplotypen
  • Die Anzahl der Menschen mit Vorkommen und die Häufigkeit des Vorkommens der Haplotypen gemäß einer Kombination genetischer Polymorphismen von BstUI und MboI bei 106 normalen Menschen, 29 Patienten, die an diffuser Panbronchiolitis (DPB) litten, 38 Patienten, die an Bronchiektase (BE) litten, 22 Patienten, die an Lungenemphysem (PE) litten, und 32 Patienten, die an Asthma bronchiale (BA) litten, sind in den Tabellen gezeigt. Als Ergebnis der Untersuchung an 238 Menschen legen die Tabellen nahe, dass der bM-Haplotyp bei Japanern fast nicht vorkommt, da niemand dabei war, der die Genotypen Bb-MM, bb-MM und bb-Mm hatte.
  • Anzahl der Menschen mit Vorkommen (Menschen)
    Figure 00170001
  • Häufigkeit des Vorkommens (%)
    Figure 00170002
  • Hinsichtlich der folgenden Analyse wurde die statistische Methode (Chi-Quadrat-Methode) verwendet, um die Analyse der Assoziation mit Atemwegserkrankungen voranzutreiben, unter der Annahme, dass die genetischen Haplotypen von humanem trypsinartigem Enzym der Atemwege der Japaner die drei Arten BM, Sm und bm waren (wenn die Anzahl der Vorkommen 5 oder mehr war, wurden die Chi-Quadrat-p-Werte als die folgenden p-Werte verwendet und die Fishersche Direktmethode p-Werte wurden angegeben als die folgenden p-Werte im Falle der 2×2-Tabelle einschließlich eines Rahmens der Anzahl der Vorkommen von 4 oder darunter).
  • Allelenklassifikation (1)
  • Untersucht wurde die Häufigkeit des Vorkommens für jedes Allel für drei Arten von Haplotypen von Japanern, um zu finden, dass es eine Abweichung in der Verteilung der Häufigkeit des Vorkommens zwischen den Gruppen der drei Erkrankungen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, und normalen Menschen gab, mit einem statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,027). Insbesondere die Häufigkeit des Vorkommens des Bm-Allels war bei der Gruppe mit den drei Atemwegserkrankungen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, höher als bei normalen Menschen.
  • Die Häufigkeit des Vorkommens des Bm-Allels in BE, DPB und PE war in Bezug auf jede Erkrankung hoch.
  • Umgekehrt war die Häufigkeit des Vorkommens des Bm-Allels für BA niedriger.
  • Häufigkeit der Beobachtung drei Erkrankungen, Allel
    Figure 00180001
  • Prozent (Zeile): drei Erkrankungen, Allel
    Figure 00180002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: drei Erkrankungen, Allel
    Figure 00180003
  • Häufigkeit der Beobachtung: DPB, Allel
    Figure 00190001
  • Prozent (Zeile): DPB, Allel
    Figure 00190002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: DPB, Allel
    Figure 00190003
  • Häufigkeit der Beobachtung: BE, Allel
    Figure 00190004
  • Prozent (Zeile): BE, Allel
    Figure 00190005
  • Kontingentafel Analytische Statistik: BE, Allel
    Figure 00200001
  • Häufigkeit der Beobachtung: PE, Allel
    Figure 00200002
  • Prozent (Zeile): PE, Allel
    Figure 00200003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: PE, Allel
    Figure 00200004
  • Häufigkeit der Beobachtung: BA, Allel
    Figure 00210001
  • Prozent (Zeile): BA, Allel
    Figure 00210002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: BA, Allel
    Figure 00210003
  • Allelenklassifikation (2)
  • Da sie Assoziation der Bm-Allele mit Erkrankungen aufgrund der obigen Beschreibung für stark gehalten wird, wurde die Relation der Anzahl des Bm-Typ-Allels mit der Anzahl anderer Allele als dem Bm-Typ analysiert, wobei dem Typ besondere Aufmerksamkeit geschenkt wurde.
  • Im Hinblick auf die Gruppen der drei Atemwegserkrankungen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, ist die Häufigkeit des Vorkommens des Bm-Allels definitv höher in den Patientengruppen, die an den drei Atemwegserkrankungen leiden, als bei normalen Menschen, wenn die Patientengruppen, die an den drei Atemwegserkrankungen litten, mit normalen Menschen verglichen werden, und ein statistisch signifikanter Unterschied wurde in der Anweichung der Verteilung (p = 0,0002) erkannt. Die Assoziation des Bm- Typ-Allels mit dem Ausbruch der Gruppe der drei Atemwegserkrankungen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, wurde durch den oben beschriebenen Vergleich gezeigt. Jede der 3-Atemwegserkrankung-Gruppen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, hatte eine höhere Häufigkeit des Vorkommens als normale Menschen im Hinblick auf jede Erkrankung (BE; p = 0,012, DPB; p = 0,0025 und PE; p = 0,0052).
  • Andererseits war die Häufigkeit des Vorkommens des Bm-Typs signifikant niedriger als die bei normalen Menschen (p = 0,049).
  • Häufigkeit der Beobachtung drei Erkrankungen, Bm/NichtBm
    Figure 00220001
  • Prozent (Zeile): drei Erkrankungen, Bm/NichtBm
    Figure 00220002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: drei Erkrankungen, Bm/NichtBm
    Figure 00230001
  • Häufigkeit der Beobachtung: DPB, Bm/NichtBm
    Figure 00230002
  • Prozent (Zeile): DPB, Bm/NichtBm
    Figure 00230003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: DPB, Bm/NichtBm
    Figure 00240001
  • Häufigkeit der Beobachtung: BE, Bm/NichtBm
    Figure 00240002
  • Prozent (Zeile): BE, Bm/NichtBm
    Figure 00240003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: BE, Bm/NichtBm
    Figure 00250001
  • Häufigkeit der Beobachtung: PE, Bm/NichtBm
    Figure 00250002
  • Prozent (Zeile): PE, Bm/NichtBm
    Figure 00250003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: PE, Bm/NichtBm
    Figure 00260001
  • Häufigkeit der Beobachtung: BA, Bm/NichtBm
    Figure 00260002
  • Prozent (Zeile): BA, Bm/NichtBm
    Figure 00260003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: BA, Bm/NichtBm
    Figure 00270001
  • Individualklassifikation (1)
  • Da die Assoziation des Bm-Typs unter den drei Haplotypen mit den Atemwegserkrankungen anhand der Analysenergebnisse der Allelenklassifikation für besonders stark gehalten wird, wurden die Klassifikation und die Analyse für Individuen ohne den Bm-Typ, Individuen mit einem Bm-Typ (hetero) und Individuen mit Bm-Typen (homo) durchgeführt, wobei insbesondere der Bm-Typ beachtet wurde.
  • Für die Gruppen der drei Atemwegserkrankungen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, wurde ein signifikanter Unterschied bei der Verteilung im Verhältnis zur Häufigkeit des Vorkommens der Haplotyp-Klassifikationen Bm-0.1 und 2 basierend auf Bm im Vergleich der normalen Menschen mit den Patientengruppen, die an den drei Atemwegserkrankungen litten, beobachtet (p = 0,0093).
  • Ein signifikanter Unterschied wurde in der Anweichung der Verteilung bei Patienten, die DPB und PE entwickelten, in Bezug auf jede Erkrankung beobachtet (DPB: p = 0,0024 und PE: p = 0,0069). Die Tendenz gab es sogar bei BE (p = 0,089).
  • Häufigkeit der Beobachtung: drei Erkrankungen, Bm
    Figure 00280001
  • Prozent (Zeile): 3 Erkrankungen, Bm
    Figure 00280002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: 3 Erkrankungen, Bm
    Figure 00280003
  • Häufigkeit der Beobachtung: DPB, Bm
    Figure 00280004
  • Prozent (Zeile): DPB, Bm
    Figure 00290001
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: DPB, Bm
    Figure 00290002
  • Häufigkeit der Beobachtung: BE, Bm
    Figure 00290003
  • Prozent (Zeile): BE, Bm
    Figure 00290004
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: BE, Bm
    Figure 00300001
  • Häufigkeit der Beobachtung: PE, Bm
    Figure 00300002
  • Prozent (Zeile): PE, Bm
    Figure 00300003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: PE, Bm
    Figure 00300004
  • Individualklassifikation (2)
  • Es wurde analysiert, ob der Bm-Haplotyp besessen wurde (Bm-0 vs. Bm-1.2).
  • Für die Gruppen der drei Atemwegserkrankungen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, ist die Häufigkeit des Vorkommens von Individuen, die Bm haben, in den Gruppen der drei Atemwegserkrankungen höher als bei normalen Menschen beim Vergleich davon mit den normalen Menschen, und ein signifikanter Unterschied wurde in der Abweichung der Verteilung (p = 0,039) beobachtet. Andererseits gab es mehr Individuen ohne den Bm-Haplotyp in BA vice versa, und eine signifikante Anweichung wurde in der Verteilung im Vergleich zu der bei der Gruppe der normalen Menschen festgestellt (p = 0,037).
  • 3 Erkrankungen, Bm-O/Bm-1.2
    Figure 00310001
  • Prozent (Zeile): 3 Erkrankungen, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00310002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: 3 Erkrankungen, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00320001
  • Häufigkeit der Beobachtung: BA, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00320002
  • Prozent (Zeile): BA, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00320003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: BA, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00330001
  • Häufigkeit der Beobachtung: DPB, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00330002
  • Prozent (Zeile): DPB, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00330003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: DPB, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00340001
  • Häufigkeit der Beobachtung: BE, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00340002
  • Prozent (Zeile): BE, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00340003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: BE, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00350001
  • Häufigkeit der Beobachtung: PE, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00350002
  • Prozent (Zeile): PE, Bm-O/Bm-1.2
    Figure 00350003
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: PE, Bm-0/Bm-1.2
    Figure 00360001
  • Individualklassifikation (3)
  • Ferner wurde ein Vergleich der Häufigkeit des Vorkommens (Bm-0.1 vs. Bm-2) zwischen Individuen, die den Bm-Haplotyp als homo (BBmm; Bm-2) haben und Individuen ohne den Haplotyp (Bm-0.1) durchgeführt. In Bezug auf die Gruppen der drei Atemwegserkrankungen (DPB, BE und PE), die zu COPD gehören, wurde ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit des Vorkommens zwischen den Individuen, die den Bm-Haplotyp als homo (BBmm) haben, und Individuen ohne den Bm-Haplotyp im Vergleich der Gruppen der drei Atemwegserkrankungen mit den normalen Menschen beobachtet (p = 0,021), und alle sechs Individuen, die den Bm-homo-Typ (Bm-2) hatten, waren durch eine der drei Atemwegserkrankungen (DPE, BE und PE), die zu COPD gehören, betroffen. Drei Individuen waren von DPB betroffen, und einer davon war von BE betroffen. Kein Mensch, der den Bm-homo-Typ (Bm-2) hatte, wurde unter 106 normalen Menschen und 32 Patienten, die an BA litten, gefunden.
  • Hinsichtlich jeder Erkrankung wurde ein statistisch signifikanter Unterschied in der Abweichung der Verteilung der Patienten, die an DPB und PE litten, gefunden (DPB: p = 0,0082 und PE: p = 0,029).
  • Häufigkeit der Beobachtung: 3 Erkrankungen, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00370001
  • Prozent (Zeile): 3 Erkrankungen, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00370002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: 3 Erkrankungen, Bm-0.11/Bm-2
    Figure 00370003
  • Häufigkeit der Beobachtung: DPB, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00380001
  • Prozent (Zeile): DPB, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00380002
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: DPB, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00380003
  • Häufigkeit der Beobachtung: PE, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00380004
  • Prozent (Zeile): PE, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00390001
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: PE, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00390002
  • Häufigkeit der Beobachtung: BE, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00390003
  • Prozent (Zeile): BE, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00390004
  • Kontingenztafel Analytische Statistik: BE, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00400001
  • Häufigkeit der Beobachtung: BA, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00400002
  • Prozent (Zeile): BA, Bm-0.1/Bm-2
    Figure 00400003
  • Die obigen Ergebnisse zeigen definitiv, dass die Bm-Typ-Haplotypen mit chronischen Atemwegsentzündungen bei Atemwegserkrankungen nach einem bestimmten Mechanismus assoziiert sind, durch Analyse der genetischen Intron-Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege. Ferner wird auch gezeigt, dass die Assoziation des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege mit Erkrankungen zwischen den drei Erkrankungen DPB, BE und PE, die zu den chronischen obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD) gehören, und BA verschieden ist.
  • Da alle Individuen, die einen bestimmten genetischen Polymorphismus haben, einige Erkrankungen nicht entwickeln, sind die genetischen Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege kein bestimmender Faktor des Ausbruchs, wie die so genannte Erbkrankheit, und kann sicher als Faktor leichten Ausbruchs genarnt werden. Das heißt, wenn ein Umweltfaktor oder dergleichen bei Individuen, die die Bm-Haplotypen haben, dazukommt, sind die Individuen anfällig für den Ausbruch der Atemwegserkrankungen wie BE, PE und DPB.
  • Anhand der obigen Ergebnisse wird gezeigt, dass mit dem humanen trypsinartigen Enzym der Atemwege assoziierte obstruktive Lungenerkrankungen klassifiziert werden können, indem die genetischen Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege verwendet werden. Die Analysenmethode für die genetischen Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege ist ein Mittel, das anwendbar ist zum Vorhersagen der Konstitution für den Ausbruch obstruktiver Lungenerkrankungen, die mit dem humanen trypsinartigen Enzym der Atemwege assoziiert sind, bei einzelnen Menschen, zum Vorhersagen der Effekte der Behandlung der Erkrankungen, zum Vorhersagen der Rückfallsmöglichkeiten der Prognose und dergleichen.
  • Möglichkeit der gewerblichen Anwendung
  • Die vorliegende Erfindung bieten ein Verfahren zur Bestimmung der mit einer Erkrankung assoziierten Konstitution einzelner Menschen durch Analysieren der genetischen Polymorphismen des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege. Folglich kann, wenn die obstruktiven Lungenerkrankungen, die mit dem humanen trypsinartigen Enzym der Atemwege assoziiert sind, durch die Analyse identifiziert werden können, angenommen werden, dass Individuen, die den bestimmten Genotyp des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege haben, anfällig für einige obstruktive Lungenerkrankungen sind.
  • Das heißt, die Information über die Methoden der Behandlung für die einzelnen Menschen kann zu einem frühen Zeitpunkt bereitgestellt werden, indem die Konstitution für den Ausbruch der Erkrankung vorhergesagt wird (Individuen, die eine für obstruktive Lungenerkrankungen anfällige Konstitution haben), und mit früher Diagnose und früher Behandlung in Verbindung gebracht wird. Die Möglichkeiten des erneuten Auftretens der Erkrankungen können sogar nach der Behandlung abgeschätzt werden. Das heißt, die Ärzte können ihre Aufmerksamkeit auf Patienten richten und für entsprechende Lenkung sorgen, indem sie die Prognose der Behandlung vorhersagen (Heilungsverlauf nach der Behandlung von Patienten und Rückfallsrisiko).
  • Ferner hat die genetische polymorphe Analyse des humanen trypsinartigen Enzyms der Atemwege die Möglichkeit, ein Mittel bereitzustellen, um Wirkungen von zu verabreichenden Medikamenten zu bestimmen und die Patientengruppen, bei denen die verabreichten Medikamente wirksam sind, bei der Entwicklung der Medikamente einzuengen auf den Krankheitszustand, der mit dem humanen trypsinartigen Enzym der Atemwege assoziiert ist.
  • Wie oben beschrieben, sind die frühe Diagnose, die frühe Behandlung und die Lenkung der geeigneten Prophylaxe, geeignete Medikation und geeignete Nachbetreuung nach der Behandlung mit einer Reduktion der hohen medizinischen Kosten verbunden, die derzeit Probleme verursachen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
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  • Figure 00620001
  • Figure 00630001

Claims (10)

  1. Verfahren zum Vorhersagen der Anfälligkeit für den Ausbruch einer obstruktiven Lungenerkrankung bei einem Menschen, umfassend: (a) Amplifizieren von Intron C eines Gens eines humanen trypsinartigen Enzyms, um ein Intron C umfassendes, 3,4-kb-Amplifikationsprodukt herzustellen, wobei Intron C den Nukleotiden 75 bis 3.308 von SEQ ID Nr. 17 entspricht; (b) Verdauen des Amplifikationsproduktes aus Schritt (a) mit der Restriktionsendonuklease BstUI; und (c) Detektieren des Vorhandenseins eines unverdauten 3,4-kb-Amplifikationsproduktes als Indikator für einen BB-Genotyp, wobei das Vorliegen dieses Genotyps ein Indikator für die Anfälligkeit für den Ausbruch der obstruktiven Lungenerkrankung ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die obstruktive Lungenerkrankung diffuse Panbronchiolitis, Bronchiektase oder Lungenemphysem ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Amplifikationsschritt (a) ein Primer-Paar, umfassend SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12, verwendet wird.
  4. Verfahren zum Vorhersagen der Anfälligkeit für den Ausbruch einer obstruktiven Lungenerkrankung bei einem Menschen, umfassend: (a) Amplifizieren von Intron C eines Gens eines humanen trypsinartigen Enzyms, um ein Intron C umfassendes, 3,4-kb-Amplifikationsprodukt herzustellen, wobei Intron C den Nukleotiden 75 bis 3.308 von SEQ ID Nr. 17 entspricht; (b) Verdauen des Amplifikationsproduktes aus Schritt (a) mit der Restriktionsendonuklease BstUI und getrenntes Verdauen des Amplifikationsproduktes aus Schritt (a) mit der Restriktionsendonuklease Mbol; und (c) Detektieren des Vorhandenseins eines unverdauten 3.4-kb-Amplifikationsproduktes aus dem BstUI-Verdau und eines 1,05-kb-Restriktionsfragmentes aus dem Mbol-Verdau als Indikator für einen Bm-Haplotyp, wobei das Vorliegen dieses Haplotyps ein Indikator für die Anfälligkeit für den Ausbruch der obstruktiven Lungenerkrankung ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die obstruktive Lungenerkrankung diffuse Panbronchiolitis, Bronchiektase oder Lungenemphysem ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei im Amplifikationsschritt (a) ein Primer-Paar, umfassend SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12, verwendet wird.
  7. Nukleinsäurefragment eines Introns eines Gens eines humanen trypsinartigen Enzyms, umfassend SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6.
  8. Nukleinsäurefragment eines Introns eines Gens eines humanen trypsinartigen Enzyms, umfassend die Nukleotide 75 bis 3.308 von SEQ ID Nr. 17.
  9. Erstes Nukleinsäurefragment, umfassend das Nukleinsäurefragment nach Anspruch 8, wobei das erste Nukleinsäurefragment mittels eines Verfahrens hergestellt ist, welches im Wesentlichen aus dem Amplifizieren eines Introns eines Gens eines humanen trypsinartigen Enzyms mit einem Primer-Paar, umfassend SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12, besteht.
  10. PCR-Primer-Paar, geeignet zum Amplifizieren eines DNA-Fragments, welches die MboI-RFLP-Stelle oder die BstUI-RFLP-Stelle, die zwischen den Nukleotiden 75 bis 3.308 von SEQ ID Nr. 17 lokalisiert sind, umfasst, wobei der Vorwärts- und der Rückwärts-Primer, die eine geeignete Länge für ein PCR-Verfahren aufweisen, aus dem Plus- bzw. aus dem Minus-Strang von SEQ ID Nr. 17 ausgeschnitten sind.
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