KR100502523B1

KR100502523B1 - 인간 기도 트립신형태 효소 유전자 다형에 의한 질병체질해석

Info

Publication number: KR100502523B1
Application number: KR10-2000-7006599A
Authority: KR
Inventors: 에구찌히로시; 야마오까가즈요시; 마스다겐이찌; 야스오까스스무
Original assignee: 데이진 가부시키가이샤
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2005-07-20
Also published as: CA2315218C; DE69834949T2; DE69834949D1; AU747991B2; EP1043406A1; CA2315218A1; ATE330029T1; CN1285002A; HK1032077A1; ES2263228T3; DE69834949T8; WO1999031271A1; CN1222615C; EP1043406B1; KR20010033207A; JP4031199B2; EP1043406A4; US6346385B1; AU1682399A

Abstract

인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석방법에 의해, 개개인의 특정한 질환, 예를 들면 만성 폐쇄성 폐질환, 부비강기관지 증후군, 폐기종, 비만성 범세기관지염, 기관지 확장증이라는 호흡기 질환이 발증되기 쉬운 체질, 또는 환자에 대한 치료의 효과, 또는 치료의 예후를 예측하는 방법.

Description

인간 기도 트립신형태 효소 유전자 다형에 의한 질병체질 해석{ANALYSIS OF PREDISPOSITION BASED ON HUMAN AIRWAY TRIPSIN PROTEAXE GENE POLYMORPHISM}

본 발명은 인간 기도(氣道) 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석에 의해 특정한 질환이 발증하기 쉬운 체질 및 그 질환환자의 치료방법에 대한 효과의 예측, 또는 치료의 예후(豫後)를 예측하는 방법에 관한 것이다.

최근, 단일 유전자의 결손 및 변이에 의한 유전자 질환 뿐 아니라, 몇몇의 유전자 소인과 환경 요인이 얽혀 발생되는 다인자 질환에 있어서도 관계하는 유전자의 연구가 진행되어 왔다. 그 결과, 그들 다인자 질환에 관계되는 유전자의 결손 및 점변이, 및 아이소폼, 나아가 실제로 번역되는 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 유전자 부분 (인트론, 프로모터) 의 변이가 질환의 위험인자로서 생각하게 되고 있다.

종래 기술로서는, 골질환 분야에 있어서는 골밀도와 비타민 D 리셉터의 인트론 유전자 다형과의 상관관계가 인정되는 것이 발표되고 있다 (Morrison, N. A. et al., nature, 367: 284-287, 1994). 순환기 분야에 있어서는 안지오텐신(angiotensin) 변환효소의 I 형 (삽입형) 과 D 형 (결손형) 의 유전자 다형이 심근경색의 발증 (Cambiem, F. et al., Nature, 359: 641-644, 1992) 에 관계한다는 보고 및 안지오텐시노겐의 M235T 의 아미노산 치환과 G-6A 의 프로모터 영역의 다형이 본능성 고혈압발증과 관련하고 있다는 보고 (Inoue, I. et al., J. Clin. Invest., 99: 1786-1797, 1997) 가 되고 있다. 또, 신경계의 분야에서는, 치매의 발증과 apoE 단백의 아이소폼과의 관련성이 보고되고 있다. 또한, 암관련에서는, 글루타티온 S 트랜스퍼라아제의 유전 다형과 암 발증의 관련성에 대해 많은 연구가 이루어지고 있다. 호흡기질환 분야로서는 천식의 발증 및 병태와, TNF (Moffatt, M. F. et al., Hum. Mol. Genet. 6 (4): 551-554, 1997) 및 안지오텐신 변환효소 (Benessiano, J. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 99 (1): 53-57, 1997) 의 유전자 다형의 관련성이 보고되고 있다.

또, 질환 치료에 사용되는 약제의 감수성이 환자에 의해 상이한 원인의 하나로서 유전적인 배경이 주목되고 있고, 유전자 다형 진단에 의해 개개인의 약제 감수성에 따른 치료방법이 선택된다는 방향성이 의료현장으로부터 요구되고 있다. 또, 임상시험에 있어서 약제의 효과가 기대되는 환자군을 유전자 다형에 의해 선정하여 약제 개발을 실시하는 것은 유효하다고 생각된다 (Kleyn K. W. et al.: Science, 281: 1820-1821, 1998). 약제 감수성과 유전자 다형에 관한 종래의 보고로서는, 안지오텐신 변환효소 (ACE (Angiotensin Converting Enzyme)) 의 인트론의 유전자 다형과 ACE 저해제의 효과에 관한 효과 (Yoshida, H. et al., J. Clin. Invest. 96: 2162-2169, 1995) 및 베타 2-아드레날린 수용체의 유전자 다형과 천식에 대한 베타-작동제의 효과에 관한 것 (Liggett, S. B., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (4 Pt 2): S156-162, 1997) 등을 들 수 있다.

한편, 본 발명에 관계되는 인간 기도 트립신형태 효소는, 만성 기도질환환자의 객담(喀痰) 중에서 정제되고 (일본 공개특허공보 평 7-067640 호 및 Yasuoka S. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16: 300-308, 1997), 그의 아미노산 서열 및 cDNA 서열이 이미 분명해져 있다 (일본 공개특허공보 평 8-89246 호 및 Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273 (19): 11895-11901, 1998). 이 효소가 갖는 활성에 대해서는 in vitro 에 있어서 어느 정도의 검토가 이루어지고 있다. 점액섬모운동에 대한 관여를 비롯하여, 인간 기관지 상피세포주로부터의 IL-8, GM-CSF 등의 사이토카인의 생성증강작용 (테라오 노리꼬 외, 1998 연도 일본호흡기학회) 을 갖는 것으로부터 기도 염증의 병태로의 관여 가능성이 생각된다. 또, 피브리노겐의 분해활성 및 플라스미노겐 활성제 (pro-urokinase) 활성화 작용 등의 효소활성 (요시나가 쥰꼬 외, 1998 연도 병태와 치료에 있어서의 프로테아제와 인히비터 연구회 (Conference on Proteases and Inhibitors in Pathophysiology and Therapeutics)) 을 갖고 있기 때문에 기도점막면에 있어서의 피브린형성을 통하여 항염증적으로 작용하거나, 만성 기도질환에서는 그 병태를 수식하고 있을 가능성이 예상되고, 또한 암전이 등에 관여하고 있을 가능성도 생각되고 있다. 그러나, 이 효소의 생체 내에서의 생리적인 기능 및 병태에 있어서의 관여에 대해서는 아직 충분히 해명되지 않고, 유전자에 관해서도 실제로 번역되는 아미노산 서열에 해당되지 않는 유전자 부분 (인트론, 프로모터) 에 대해서는 전혀 알려지지 않았다. 또한, 이 인간 기도 트립신형태 효소에 대한 유전자 다형의 유무 및 유전자 다형과 질환과의 관련성에 대해서는 지금까지 조사된 바가 없다.

그런데, 유전자 해석에 의해 질병관련체질을 예측하는 것은, 특정 질환의 발증의 예측, 치료 예후의 예측, 적절한 치료법 및 투여약제의 선정 등에 많은 정보를 부여할 수 있다. 그렇기 때문에, 많은 의사 및 환자로부터 요망되고 있고, 또한 이러한 것들은 발병 예방, 조기 치료를 가능하게 하기 때문에, 고액의 의료비를 삭감하는 것으로 이어져 장래의 의료에는 없어서는 안될 것으로 생각된다.

그러나, 질환과 관련되는 유전자를 발견하고, 그 해석방법을 확립하는 것은 매우 곤란하고, 이미 서술한 바와 같이, 질환과의 관련성이 인정되고 있는 유전자 해석방법의 예는 적다. 따라서, 각종 질병 관련체질을 예측할 수 있는 유전자 해석방법의 개발은 강력히 요망되고 있다.

한편, 인간 기도 트립신형태 효소가 어떤 질환에 관련되는가는 현재로서는 아직 해명되고 있지 않다.

도 1 은, 유전자 증폭에 의해 얻어진 인간 기도 트립신형태 효소의 성숙 단백을 코딩하는 유전자의 인트론 영역을 포함하는 DNA 단편의 아가로오스겔 전기영동 패턴을 나타낸다. 레인 1, 5 는 마커 (위로부터 10 Kb, 7 Kb, 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2.5 Kb, 2 Kb, 1.5 Kb, 1 Kb), 레인 2 는 프라이머 A1 (서열번호 7) 과 A2 (서열번호 8) 에 의해 증폭된 약 6 Kb 의 DNA 프래그먼트(fragment), 레인 3 은 프라이머 B1 (서열번호 9) 과 B2 (서열번호 10) 에 의해 증폭된 약 1.5 Kb 의 DNA 프래그먼트, 레인 4 는 프라이머 C1 (서열번호 11) 과 C2 (서열번호 12) 에 의해 증폭된 약 3.4 Kb 의 DNA 프래그먼트가 관찰되었다.

도 2 는, 유전자 증폭에 의해 얻어진 인간 기도 트립신형태 효소의 프로펩티드를 코딩하는 유전자의 인트론 영역을 포함하는 DNA 단편의 아가로오스겔 전기영동 패턴을 나타낸다. 레인 1, 4 는 마커 (위로부터 10 Kb, 7 Kb, 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2.5 Kb, 2 Kb, 1.5 Kb, 1 Kb), 레인 2 는 프라이머 D1 (서열번호 13) 과 D2 (서열번호 14) 에 의해 증폭된 약 5.5 Kb 의 DNA 프래그먼트, 레인 3 은 프라이머 E1 (서열번호 15) 과 E2 (서열번호 16) 에 의해 증폭된 약 5 Kb 의 DNA 프래그먼트가 관찰되었다.

도 3 은, 인간 기도 트립신형태 효소 게놈상의 인트론 A, B, C 의 상대적 위치, 인트론 A 의 TaqI 및 인트론 C 의 MboI, BstUI 에 의해 검출되는 유전자 다형 (RFLP) 의 아가로오스겔 전기영동 패턴을 나타낸다.

여기서 본 발명자들은, 이러한 종래 기술의 문제를 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 인간의 기도에 있어서 특이하게 발현하고 있는 인간 기도 트립신형태 효소의 게놈상의 인트론 부분을 유전자 증폭시키기 위한 프라이머를 디자인하고, 증폭된 유전자 단편의 양단 및 엑손/인트론 경계 부분의 DNA 서열을 신규로 결정하고, 증폭된 유전자 단편 및 신규로 결정한 DNA 서열에 유전자 다형이 있음을 발견하였다. 또한, 그 유전자 다형 해석에 의해 개개인의 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자형과 질환과의 관계를 처음으로 발견하여 본 발명에 도달하였다.

즉 본 발명은 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석에 의해 개개인의 특정한 질환이 발증하기 쉬운 체질, 또는 환자에 대한 치료의 효과, 또는 치료의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.또한, 본 발명은 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석에 의해 점액섬모생체 방어계의 이상(異狀)을 진단하는 방법으로서, 개개인의 특정한 질환이 발증하기 쉬운 체질, 또는 환자에 대한 치료의 효과, 또는 치료의 예후를 예측하는 방법이다.

또한, 본 발명은 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론의 염기서열의 일부 혹은 전부를 포함하는 유전자 단편이다.

본 발명에 의하면, 개개인의 체질과 특정한 질병과의 관련을 예측하는 방법, 및 그 유전자 해석에 사용하는 유전자 단편 또는 DNA 서열을 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 발증되기 쉬운 체질이 판별되는 특정한 질환, 또는 그 치료의 효과 판정 및 치료의 예후가 예측되는 특정한 질환으로서는, 호흡기계의 질환, 폐암, 특히 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD) 에 속하는 폐기종 (PE), 부비강기관지 증후군, 비만성 범세기관지염 (DPB), 기관지 확장증 (BE), 또는 점액섬모생체 방어계의 이상이 예시된다.

본 발명의 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석방법은, 하나 또는 그 이상의 염기 변이를 검출함으로써 분류되는 유전자형의 해석, 하나 또는 그 이상의 염기 변이를 검출함으로써 분류되는 하프로타입(haplotype)의 해석이 예시된다.

기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석방법은, 예를 들면 제한효소 절단에 의한 제한효소절단단편길이다형 (Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP) 에 의한 해석방법에 의해 이루어진다. 본 발명에 있어서의 유전자 다형 해석방법은 인간 기도 트립신형태 효소의 cDNA 서열을 사용하여 서던하이브리다이제이션에 의해 검출할 수 있는 유전자 다형 해석방법도 포함하고 있다. 즉, 본발명에서 개시되고 있는 유전자 다형을 검출할 수 있는 제한효소로 게놈 DNA 를 절단한 후, 겔 전기영동을 실시하고, 니트로셀룰로오스 막 등으로 전사한 후, 인간 기도 트립신형태 효소 cDNA를 프로브로서 인간 기도 트립신형태 효소 게놈의 절단된 패턴을 서던하이브리다이제이션에 의해 해석한다는 방법이다. 또, 유전자 다형 부위를 포함하도록 DNA 단편을 PCR 로 증폭시키고, 그 후 1 본쇄로 하여 전기영동의 이동도의 상이함에 의해 해석하는 방법 (PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) 법) 등으로도 해석이 가능하다. 다형 부위를 검출할 수 있는 방법으로서 그 외에도 미스매치 PCR 법, 알릴 특이적 올리고누클레오티드를 사용하는 PCR-ASO (Allele Specific Oligo) 법, 올리고프로브를 사용하여 어닐링을 실시하여 판정하는 방법, 직접 유전자 다형 부위의 염기서열을 결정하는 핀포인트시퀀싱법 등 다수 들 수 있고, DNA 칩 등을 사용한 유전자 진단에도 응용할 수 있다.

유전자 다형 해석의 부위로서는, 인트론이어도 좋고, 구체적 유전자 다형 해석의 부위로서는, 다음의 유전자 단편이 예시된다.

(a) 서열번호 7 과 서열번호 8 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편

(b) 서열번호 9 과 서열번호 10 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편

(c) 서열번호 11 과 서열번호 12 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편

(d) 서열번호 13 과 서열번호 14 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편

(e) 서열번호 15 과 서열번호 16 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편

(f) 서열번호 11 과 서열번호 12 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 C를 포함하는 유전자 단편

(g) 서열번호 7 과 서열번호 8 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 A 를 포함하는 유전자 단편

여기서, 유전자 다형 해석의 부위로서는, 인트론 C 에 있어서는 제한효소 BstUI, MboI, MseI, 또는 FbaI 에 의해 인식되는 서열 부분을 포함하는 유전자 단편, 인트론 A 에 있어서는 제한효소 MboI, TaqI, 또는 AfaI 에 의해 인식되는 서열 부분을 포함하는 부분, 서열번호 17 에 나타나는 유전자 다형 부위의 하나 또는 그 이상의 조합이 예시된다. 이들 부위의 해석에 의해, 유전자형 또는 하프로타입 분류가 판정된다.

또한, 본 발명은 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론의 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 유전자 단편이지만, 특히 다음의 유전자 단편이 예시된다.

(f) 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나에 나타난 염기서열로 이루어지는 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론의 유전자 단편, 또는 그들의 염기서열에 의해 사이에 끼워진 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편

(g) 서열번호 17 에 나타난 염기서열로 이루어지는 인간 기도 트립신형태 효소 인트론 C 의 유전자 단편

실시예

이하, 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 본 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석에 의한 질환 관련체질 예측법은 여기에 한정되는 것은 아니다.

표준적 조작법

이하, 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 표준적인 DNA 추출조작, 유전자 증폭조작, 제한효소 절단조작 및 전기영동 조작에 대해 설명한다.

(a) 표준적인 DNA 추출조작

본 발명의 유전자 증폭에 사용하는 생체시료에는 특별히 한정되지 않지만, 혈구 성분이 검체를 채취하기 쉽고, 또 DNA 를 추출하기 쉽기 때문에 적합하다.

1. 전혈 0.5 ㎖ (2Na-EDTA 항응고제 사용) 를 1.5 ㎖ 용의 마이크로 원심관에 넣는다.

2. 용해액을 0.5 ㎖ 첨가하여 튜브를 수회 가볍게 거꾸로 하여 액을 혼합한다.

(하기의 혼합조작은 이에 따른다)

용해액예: 1 ×SSC

이것은 1 ℓ중에 NaCl 175.3 g, 구연산 나트륨 88.2 g 을 포

함하는 10N NaOH 로 pH 7.0 으로 조정한 20 ×SSC 를 10 배로

희석한 것이다.

3. 원심 (10,000 g, 20 초, 4 ℃) 시킨 후, 검은 펠릿이 유출하지 않도록 상청을 제외한다.

4. 용해액을 1 ㎖ 첨가하여 교반한다.

5. 원심 (10,000 g, 20 초, 4 ℃) 시킨 후, 상청을 제외한다.

6. 스텝 4 ∼ 5 를 또 다시 1 회 반복한다.

7. 효소 반응액 200 ㎕ 과 단백 분해효소 10 ㎕ 를 첨가하여 혼합한다.

효소 반응액예: 0.04 M DTT (디티오트레이톨), 0.2 M NaOAc

(아세트산 나트륨) 및 0.4 % SDS 의 혼합액 단백질 분해 효소 예:

10 ㎎/㎖ 프로테이나아제 (Proteinase K)

8. 37 ℃ 에서 1 시간 보온한다. (도중 2 ∼ 3 회 흔들어 혼합한다.)

9. 요오드화 나트륨 용액을 300 ㎕ 첨가하여 혼합한다.

10. 이소프로필알코올을 0.5 ㎖ 첨가하고, 하얀 선형상의 DNA 가 완전히 보일 때까지 혼합한다.

11. 원심 (10,000 g, 10 분, 실온) 시킨 후, 상청을 천천히 제거한다. 용기를 여과지상에 거꾸로 두는 등의 방법으로 용기벽에 남은 용액을 충분히 제거한다.

12. 세정액 (A) 을 1 ㎖ 첨가하여 혼합한다. 침전이 용기벽으로부터 떨어질 정도로 충분히 혼합한다.

세정액 (A) 예: 70 % EtOH

13. 원심 (10,000 g, 5 분, 실온) 시킨 후, 상청을 제거한다.

14. 세정액 (B) 을 1 ㎖ 첨가하여 혼합한다. 침전이 용기벽으로부터 떨어질 정도로 충분히 혼합한다.

세정액 (B) 예: 80 % EtOH

15. 원심 (10,000 g, 5 분, 실온) 시킨 후, 상청을 제거한다.

16. DNA 침전을 가볍게 감압 건조한다. (너무 건조하면, DNA 가 용해되기 어렵기 때문에 건조시간은 3 분 이내로 한다.)

(b) 표준적인 유전자 증폭조작

유전자 증폭법에 대해서는 몇몇의 원리가 알려져 있지만, 여기서는 폴리머라아제ㆍ체인ㆍ리액션법 (PCR 법) 을 표준적인 것으로 기재한다.

반응액 조성: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0, 25 ℃), 0.1 % TritonX-100, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM dNTPs, 15 μM 포워드 프라이머 (Forward Primer), 15 μM 리버스 프라이머 (Riverse Primer), 1 ㎎/ℓ게놈 DNA, 1 유닛 TaqDNA 폴리머라아제, 전 용적 50 ㎕

반응 사이클: 94 ℃, 1 분; 64 ℃, 1 분; 72 ℃, 1 분을 1 사이클로 하고, 40 사이클 실시.

사용하는 프라이머는, 하기 C1 (35 염기) 와 C2 (35 염기) 를 사용한다.

C1: 5'-GGAGC CATCT TGTCT GGAAT GCTGT GTGCT GGAGT-3'

C2: 5'-CACAA TAAAC CAAAG CCGCC GTGAG TCTTC TTGTA-3'

(c) 표준적인 제한효소 절단조작

MboI 용 반응액 조성: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 1 mM DTT, 100 ㎍/㎖ BSA (소혈청 알부민)

MboI 를 10 유닛/20 ㎕ 반응액의 농도로 첨가하고, 37 ℃, 3 시간 인큐베이트한다.

(d) 표준적인 전기영동 조작

전기영동용 완충액은 0.5 ×TBE 이다. 단, 5 ×TBE 는 1 ℓ중 Tris 베이스 54 g, 붕산 27.5 g 및 EDTA 1 mM 을 함유하고, pH 를 8.0 으로 조정한다. 상기 완충액을 사용하여, 1 % 또는 3 % 아가로오스겔[Seakem GTA Agarose (FMC Bio Products) 사용] (0.5 ㎍/㎖ 의 에티듐 브로마이드 함유) 을 사용하여 전압 100 V 로 30 분간 영동한다. 그 후 UV 램프로 DNA 의 밴드를 관찰한다.

[ 실시예 1] 인간 기도 트립신형태 효소 게놈상의 인트론을 포함하는 DNA 단편의 유전자 증폭에 의한 취득 및 그 염기서열의 해석

성숙 인간 기도 트립신형태 효소의 게놈상의 인트론 부위를 탐색하기 위해, 몇몇의 트립타아제류 연효소의 게놈의 엑손, 인트론의 구성을 참고로하여 프라이머를 작성하고, 인간 게놈 DNA 를 증폭시킨 결과, 프라이머 A1 (서열번호 7) 과 A2 (서열번호 8) 에 의해 약 6 Kb 의 DNA 프래그멘트(fragment) (유전자 단편), 프라이머 B1 (서열번호 9) 과 B2 (서열번호 10) 에 의해 약 1.5 Kb, 프라이머 C1 (서열번호 11) 과 C2 (서열번호 12) 에 의해 약 3.4 Kb 의 DNA 프래그멘트가 증폭되었다 (도 1).

이들의 DNA 프래그멘트를 겔로부터 잘라내어 정제하고, TA 클로닝벡터 (인비트로젠사 제조) 에 각각의 프래그멘트를 삽입한다. 그 몇몇의 클론에 대해 인서트 DNA 의 양사이드 (5' 말단, 3' 말단) 의 염기서열을 결정한 결과, 프라이머의 서열에 이어서 인간 기도 트립신형태 효소의 cDNA 의 서열이 존재하고, 이어서 5' 말단, 3' 말단 모두 양사이드에 엑손-인트론의 경계영역에 있어서의 공통서열이 보이고, 증폭된 DNA 단편이 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론 영역을 포함한 DNA 단편임이 판명되었다.

본 발명에서 분명해진 인간 기도 트립신형태 효소의 성숙 단백질을 코딩하는 유전자 영역의 인트론의 서열은, 5' 측으로부터 각각 인트론 A, 인트론 B 및 인트론 C 라고 하기로 한다 (도 3). 분명해진 각각의 인트론의 5' 말단, 3' 말단의 염기서열은, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 으로 나타내는 바와 같다. 또한, 인트론 C 에 관해서는, 전 염기서열을 서열번호 17 에 나타낸다.

한편, 인간 기도 트립신형태 효소의 프로펩티드를 코딩하는 영역에 관해서는, 몇몇의 프라이머를 작성하고, 유전자 증폭을 실시한 결과, 프라이머 D1 (서열번호 13) 과 D2 (서열번호 14) 에 의해 약 5.5 Kb 의 DNA 프래그멘트, 프라이머 E1 (서열번호 15) 과 E2 (서열번호 16) 에 의해 약 5 Kb 의 DNA 프래그멘트가 증폭되는 것이 분명해졌다 (도 2). 이들 유전자 단편에는 인트론이 포함되어 있다고 생각된다.

[ 실시예 2] 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론에 있어서의 유전자 다형의 해석

인트론 A, B, C 에 있어서 유전자 다형이 존재하는지 어떤지를 조사하기 위해, 건강인 23 명의 게놈 DNA 를 전 혈에서 추출하고 (표준 조작법), 이것을 각각 인트론 A 증폭용 프라이머 A1, A2, 인트론 B 증폭용 프라이머 B1, B2, 인트론 C 증폭용 프라이머 C1, C2 에서 PCR 증폭시키고, 각종 제한효소에 의한 절단 패턴을 비교하였다. 그 결과, 인트론 A 에 있어서는, 제한효소 MboI, TaqI, AfaI 에 의해 유전자 다형이 관찰되는 것을 발견하였다.

반대로, 제한효소 Tsp509I, AluI, NlaIII, MspI, BstUI, BfaI, HinPI, HaeIII, HindIII, SspI, PstI, EcoRI, SalI, EcoRV 에 의해서는 유전자 다형은 관찰되지 않았다.

인트론 B 에 있어서는, 제한효소 Tsp509I, AluI, NlaIII, MspI, BstUI, BfaI, HinPI, HaeIII, MboI, AfaI, TaqI, MseI, ClaI, NsiI, EcoT14I, NdeI, PmlI, ApaLI, AatII, ApaI, KpnI, BsmI, HindIII, SspI, EcoRV 에 의해서는 유전자 다형은 관찰되지 않았다.

인트론 C 에 있어서는, 제한효소 MboI, BstUI, MseI, FbaI 에 의해서 유전자 다형이 관찰되는 것을 발견하였다. 반대로, 제한효소 AluI, NlaIII, MspI, BfaI, HinPI, HaeIII, AfaI, TaqI, HindIII, SspI, BglII, EcoT14I, PvuII, PvuI, EcoRI, BamHI, EcoRV, KpnI 에 의해서는 유전자 다형은 관찰되지 않았다.

C1-C2 의 프라이머의 조합을 사용하여 증폭시킨 인트론 C 를 포함하는 DNA 프래그멘트를 MboI 또는 BstUI 에 의해 절단한 경우, MboI 에 의한 절단에 대한 실험에서는, 전기영동에 의해 1.3 Kb 에 밴드가 나타나는 경우를 유전자형 MM, 1.05 Kb 에 밴드가 나타나는 경우를 유전자형 mm, 1.3 Kb 와 1.05 Kb 의 밴드가 2 개 함께 나타나는 경우를 유전자형 Mm 으로 판정할 수 있고, 한편 BstUI 의 경우, BB 는 3.4 Kb, bb 는 2.45 Kb 와 0.95 Kb 이고, Bb 는 3 개 모두 나타난다.

인트론 A 의 TaqI 및 인트론 C 의 MboI, BstUI 에 의해 검출되는 유전자 다형의 전기영동 패턴을 도 3 에 나타낸다. 또한, 인트론 C 에 대해서는 일례의 bbmm 형인 건강인의 게놈에서 PCR 에 의해 얻어진 DNA 프래그멘트에서 bm 형 하프로타입의 전 염기서열을 결정하였다 (서열번호 17). 인트론 C 의 염기서열 중에서, BstUI 및 MboI 에 의해 검출되는 유전자 다형 부위를 하얀 화살표로 나타내었다.

BBmm 형의 BE 인 환자의 게놈을 일례, 염기서열 결정을 한 결과, Bm 하프로타입의 BstUI 유전자 다형 부위의 염기서열은 CGCG 가 ACCG 가 되어 있기 때문에 BstUI 에 의해 절단되지 않음을 알았다.

[ 실시예 3] 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론 유전자 다형 해석에 의한 질환 관련체질의 해석

통계학적 해석에 관해서는, 통계해석 소프트 Stat View 4.02 (Abacus Concepts 사) 를 사용하여 카이 2 승(乘) (chi-square)검정에 의해 해석을 실시하였다.

실시예 3-1 유전자형 분류에 의한 질환관련 체질의 해석

실시예 2 에 개시되어 있는 유전자 다형 중, 인트론 C 에 있어서의 MboI, BstUI 에 의해 검출되는 유전자 다형에 대해, 인간 기도 트립신형태 효소가 관련하는 질환을 분류하는 것이 가능한지 어떤지를 검토하였다. 대상으로서 선택한 질환은, 호흡기 질환의 비만성 범세기관지염 (DPB), 기관지 확장증 (BE), 폐기종 (PE), 기관지 천식 (BA) 이다.

건강인 106 인, 비만성 범세기관지염 (DPB) 29 인, 기관지 확장증 (BE) 38 인, 폐기종 (PE) 22 인, 기관지 천식 (BA) 32 인을 선택하고, 표준적 조작법에 따라 각 사람의 유전자형을 판정하였다. 제한효소는 MboI 및 BstUI 를 사용하였다.

각 유전자형의 출현인수 및 출현빈도, 각 알릴 (allele) 형의 출현수 및 출현빈도는 표 1 및 표 2 와 같았다.

표 1 BstUI 유전자형

	출현인수 (인)				출현수 (알릴)
	BB	Bb	bb	합계	B	b	합계
정상DPBBEPE	168115	55121512	359125	106293822	87283722	125303922	212587644
BA	2	12	18	32	16	48	64

	출현빈도 (%)			출현빈도 (%)
	BB	Bb	bb	B	b
정상DPBBEPE	15.127.628.922.7	51.941.439.554.5	33.031.031.622.7	41.048.348.750.0	59.051.751.350.0
BA	6.3	37.5	56.3	25.0	75.0

표 2 MboI 유전자형

	출현인수 (인)				출현수 (알릴)
	MM	Mm	mm	합계	M	m	합계
정상DPBBEPE	10333	407156	56192013	106293822	60132112	152455532	212587644
BA	1	12	19	32	14	50	64

	출현빈도 (%)			출현빈도 (%)
	MM	Mm	mm	M	m
정상DPBBEPE	9.410.37.913.6	37.724.139.527.3	52.865.552.659.1	28.322.427.627.3	71.777.672.472.7
BA	3.1	37.5	59.4	21.9	78.1

표 1, 표 2 에 의해, 상기 유전자형에서의 판정으로, DPB, BE, PE 에 있어서 BB 형의 출현빈도가 높은 경향을 나타내고 있음을 알 수 있다. 즉, 이 유전자형을 갖는 개개인이 DPB, BE, PE 가 되기 쉬운 체질로 판정할 수 있음을 나타낸다. 또한 DPB, BE, PE 를 만성 폐쇄성 질환 (COPD) 이라는 분류에서 호흡기 3 질환 환자군으로서 정리하면, BB 형의 출현빈도가 건강인과 비교하여 통계학적으로 높은 의미가 있다는 결과를 얻었다 (카이 2 승 p 값 = 0.04, 카이 2 승값 = 4.2).

관측도수: 3 질환, BB/Not BB

	BB	Not BB	합계
정상	16	90	106
호흡기 3 질환	24	65	89
합계	40	155	195

퍼센트 (행): 3 질환, BB/Not BB

	BB	Not BB	합계
정상	15	85	100
호흡기 3 질환	27	73	100
합계	21	79	100

분할표 분석 통계량: 3 질환, BB/Not BB

결측값수	63
자유도	1
카이 2 승값	4.182
카이 2 승 p 값	.0409
G2 승값	4.177
G2 승 p 값	.0410
분할표 분석 계수	.145
파이 (직경)	.146
카이 2 승값 (Yates 보정)	3.489
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0618
Fisher 의 직접법 p 값	.0503

실시예 3-2 하프로타입분류에 의한 질환관련 체질의 해석

하프로타입의 출현빈도

건강인 106 인, 비만성 범세기관지염 (DPB) 29 인, 기관지 확장증 (BE) 38 인, 폐기종 (PE) 22 인, 기관지 천식 (BA) 32 인에 있어서의 BstUI, MboI 유전자형의 양자의 조합에 의한 하프로타입의 출현인수 및 출현빈도를 표에 나타낸다. 238 인 조사한 결과, Bb-MM, bb-MM, bb-Mm 의 유전자형은 한 명도 존재하지 않았던 것은, 일본인에게는 bM 하프로타입은 거의 존재하지 않는다는 것을 시사하고 있다.

출현인수 (인)
	BB-MM	BB-Nm	BB-mm	Bb-MM	Bb-Mm	Bb-mm	bb-MM	bb-Mm	bb-mm	합계
정상	10	6	0	0	34	21	0	0	35	106
DPBBEPE	333	270	312	000	586	776	000	000	9125	293822
BA	1	1	0	0	11	1	0	0	18	32

출현빈도 (%)
	BB-MM	BB-Nm	BB-mm	Bb-MM	Bb-Mm	Bb-mm	bb-MM	bb-Mm	bb-mm	합계
정상	9.4	5.7	0.0	0.0	32.1	19.8	0.0	0.0	33.0	100%
DPBBEPE	10.37.913.6	6.918.40.0	10.32.69.1	0.00.00.0	17.221.127.3	24.118.427.3	0.00.00.0	0.00.00.0	31.031.622.7	100%100%100%
BA	3.1	3.1	0.0	0.0	34.4	3.1	0.0	0.0	56.3	100%

이하의 해석에 관해서는, 일본인의 인간 기도 트립신형태 효소 유전자 하프로타입이 BM, Bm, bm 의 3 종류인 것을 전제로 호흡기 질환과의 관련을 통계학적 수법 (카이 2 승법) 을 사용하여 해석을 진행하였다. (이하의 p 값은, 출현수가 5 이상의 경우는 카이 2 승 p 값, 출현수가 4 이하의 프레임을 포함하는 2 ×2 표의 경우는 Fisher 의 직접법 p 값을 나타내었다.)

알릴 분류 (1)

일본인의 3 종의 하프로타입에 대해 각 알릴의 출현빈도를 조사한 결과, COPD 에 속하는 호흡기 3 질환군 (DPB, BE, PE) 과 건강인과의 사이의 출현빈도에 관해, 통계학적 유의차로 분포에 편중이 있었다 (p = 0.027). 특히, Bm 알릴은 건강인에 비해 COPD 에 속하는 호흡기 3 질환군 (DPB, BE, PE) 에 있어서의 출현빈도가 높았다.

질환별로 보아도 BE, DPB, PE 에 있어서의 Bm 알릴의 출현수가 높았다.

관측도수: 3 질환, 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
정상	27	60	125	212
호흡기 3 질환	41	46	91	178
합계	68	106	216	390

퍼센트 (행): 3 질환, 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
정상	13	28	59	100
호흡기 3 질환	23	26	51	100
합계	17	27	55	100

분할표 분석 통계량: 3 질환, 알릴

결측값수	107
자유도	2
카이 2 승값	7.174
카이 2 승 p 값	.0277
G2 승값	7.164
G2 승 p 값	.0278
분할표 분석 계수	.134
Cramer 의 V 값	.136

관측도수: DPB 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
정상	27	60	125	212
DPB	15	13	30	58
합계	42	73	155	270

퍼센트 (행): DPB 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
정상	13	28	59	100
DPB	26	22	52	100
합계	16	27	57	100

분할표 분석 통계량: DPB 알릴

결측값수	227
자유도	2
해 2 승값	6.044
해 2 승 p 값	.0487
G2 승값	5.488
G2 승 p 값	.0643
분할표 분석 계수	.148
Cramer 의 V 값	.150

관측도수: BE 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
BE	16	21	39	76
정상	27	60	125	212
합계	43	81	164	288

퍼센트 (행): BE 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
BE	21	28	51	100
정상	13	28	59	100
합계	15	28	57	100

분할표 분석 통계량: BE 알릴

결측값수	209
자유도	2
카이 2 승값	3.175
카이 2 승 p 값	.2044
G2 승값	3.007
G2 승 p 값	.2224
분할표 분석 계수	.104
Cramer 의 V 값	.105

관측도수: PE 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
PE	10	12	22	44
정상	27	60	125	212
합계	37	72	147	256

퍼센트 (행): PE 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
PE	23	27	50	100
정상	13	28	59	100
합계	14	28	57	100

분할표 분석 통계량: PE 알릴

결측값수	241
자유도	2
카이 2 승값	3.040
카이 2 승 p 값	.2187
G2 승값	2.765
G2 승 p 값	.2510
분할표 분석 계수	.108
Cramer 의 V 값	.109

관측도수: BA 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
BA	2	14	48	64
정상	27	60	125	212
합계	29	74	173	276

퍼센트 (행): BA 알릴

	Bm.	BM	b.m.	합계
BA	3	22	75	100
정상	13	28	59	100
합계	11	27	63	100

분할표 분석 통계량: BA 알릴

결측값수	221
자유도	2
카이 2 승값	7.096
카이 2 승 p 값	.0288
G2 승값	8.264
G2 승 p 값	.0160
분할표 분석 계수	.158
Cramer 의 V 값	.160

알릴 분류 (2)

상기에서 Bm 알릴이 질환과 관계가 강하다고 생각되기 때문에, 특히 이 형에 주목하여 Bm 형의 알릴의 수와 Bm 이외의 알릴의 수로 질환과의 관계를 해석하였다.

COPD 에 속하는 호흡기 3 질환군 (DPB, BE, PE) 에서 보면, 건강인과 호흡기 3 질환 환자군을 비교한 경우, 호흡기 3 질환 환자군에 있어서의 Bm 알릴의 출현빈도는 확실히 높고, 분포의 편중에 관하여 통계학적으로 유의차가 보였다 (p = 0.0002). 이와 같은 비교에 의해 Bm 형의 알릴과 COPD 에 속하는 호흡기 3 질환군 (DPE, BE, PE) 의 발증과의 관계가 나타났다.

질환별로 보아도, COPD 에 속하는 호흡기 3 질환군 (DPB, BE, PE) 은 모두 정상인에 비해 Bm 형의 출현빈도가 높았다. (BE; p = 0.012, DPB; p = 0.0025, PE; p = 0.0052)

한편, BA 에 있어서는 Bm 형의 출현빈도가 건강인과 비해 현저히 낮았다. (p = 0.049)

관측도수: 3 질환, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
정상	27	185	212
호흡기 3 질환	49	129	178
합계	76	314	390

퍼센트 (행): 3 질환, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
정상	13	87	100
호흡기 3 질환	28	72	100
합계	19	81	100

분할표 분석 통계량: 3 질환, Bm/Not Bm

결측값수	107
자유도	1
카이 2 승값	13.494
카이 2 승 p 값	.0002
G2 승값	13.534
G2 승 p 값	.0002
분할표 분석 계수	.183
파이	.186
카이 2 승값 (Yates 보정)	12.568
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0004
Fisher 의 직접법 p 값	.0003

관측도수: DPB, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
정상	27	185	212
DPB	17	41	58
합계	44	226	270

퍼센트 (행): DPB, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
정상	13	87	100
DPB	29	71	100
합계	16	84	100

분할표 분석 통계량: DPB, Bm/Not Bm

결측값수	227
자유도	1
카이 2 승값	9.172
카이 2 승 p 값	.0025
G2 승값	8.202
G2 승 p 값	.0042
분할표 분석 계수	.181
파이	.184
카이 2 승값 (Yates 보정)	7.997
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0047
Fisher 의 직접법 p 값	.0045

관측도수: BE, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
BE	19	57	76
정상	27	185	212
합계	46	242	288

퍼센트 (행): BE, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
BE	25	75	100
정상	13	87	100
합계	16	84	100

분할표 분석 통계량: BE, Bm/Not Bm

결측값수	209
자유도	1
카이 2 승값	6.270
카이 2 승 p 값	.0123
G2 승값	5.824
G2 승 p 값	.0158
분할표 분석 계수	.146
파이	.148
카이 2 승값 (Yates 보정)	5.389
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0203
Fisher 의 직접법 p 값	.0172

관측도수: PE, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
PE	13	31	44
정상	27	185	212
합계	40	216	256

퍼센트 (행): PE, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
PE	30	70	100
정상	13	87	100
합계	16	84	100

분할표 분석 통계량: PE, Bm/Not Bm

결측값수	241
자유도	1
카이 2 승값	7.810
카이 2 승 p 값	.0052
G2 승값	6.802
G2 승 p 값	.0091
분할표 분석 계수	.172
파이	.175
카이 2 승값 (Yates 보정)	6.587
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0103
Fisher 의 직접법 p 값	.0104

관측도수: BA, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
BA	2	62	64
정상	27	185	212
합계	29	247	276

퍼센트 (행): BA, Bm/Not Bm

	Bm	Not Bm	합계
BA	3	97	100
정상	13	87	100
합계	11	89	100

분할표 분석 통계량: BA, Bm/Not Bm

결측값수	221
자유도	1
카이 2 승값	4.829
카이 2 승 p 값	.0280
G2 승값	6.035
G2 승 p 값	.0140
분할표 분석 계수	.131
파이	.132
카이 2 승값 (Yates 보정)	3.861
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0494
Fisher 의 직접법 p 값	.0340

개체분류 (1)

알릴 분류의 해석 결과로부터, 3 하프로타입 중 특히 Bm 형이 호흡기 질환과의 관련이 깊다고 생각되기 때문에, 이하 특히 이 형에 주목하여, 이것을 갖지 않는 개체, 1 개 갖는 개체 (헤테로), 2 개 갖는 개체 (호모) 를 분류하여 해석하였다.

COPD 에 속하는 속하는 호흡기 3 질환군 (DPB, BE, PE) 에서 보면, 건강인과 호흡기 3 질환 환자군을 비교한 경우, Bm 에 기초한 하프로타입 분류 Bm-0, 1, 2 의 출현빈도에 관해, 분포에 유의차가 보였다 (p = 0.0093).

질환별로 보아도, DPB 및 PE 를 발증시킨 환자로 분포의 편중에 유의차가 보이고 (DPB; p = 0.0024, PE; p = 0.0069), BE 에서도 그 경향이 있었다 (p = 0.089).

관측도수: 3 질환, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
정상	79	27	0	106
호흡기 3 질환	54	29	6	89
합계	133	56	6	195

퍼센트 (행): 3 질환, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
정상	75	25	0	100
호흡기 3 질환	61	33	7	100
합계	68	29	3	100

분할표 분석 통계량: 3 질환, Bm.

결측값수	63
자유도	2
카이 2 승값	9.360
카이 2 승 p 값	.0093
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.214
Cramer 의 V 값	.219

관측도수: DPB, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
정상	79	27	0	106
DPB	17	9	3	29
합계	96	36	3	135

퍼센트 (행): DPB, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
정상	75	25	0	100
DPB	59	31	10	100
합계	71	27	2	100

분할표 분석 통계량: DPB, Bm.

결측값수	123
자유도	2
카이 2 승값	12.040
카이 2 승 p 값	.0024
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.286
Cramer 의 V 값	.299

관측도수: BE, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
BE	23	14	1	38
정상	79	27	0	106
합계	102	41	1	144

퍼센트 (행): BE, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
BE	61	37	3	100
정상	75	25	0	100
합계	71	28	1	100

분할표 분석 통계량: BE, Bm.

결측값수	114
자유도	2
카이 2 승값	4.834
카이 2 승 p 값	.0892
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.180
Cramer 의 V 값	.183

관측도수: PE, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
PE	14	6	2	22
정상	79	27	0	106
합계	93	33	2	128

퍼센트 (행): PE, Bm.

	Bm-0	Bm-1	Bm-2	합계
PE	64	27	9	100
정상	75	25	0	100
합계	73	26	2	100

분할표 분석 통계량: PE, Bm.

결측값수	130
자유도	2
카이 2 승값	9.957
카이 2 승 p 값	.0069
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.269
Cramer 의 V 값	.279

개체분류 (2)

Bm 하프로타입을 보유하고 있는지 어떤지로 분석하였다 (Bm-0 vs Bm-1, 2).

COPD 에 속하는 호흡기 3 질환군 (DPB, BE, PE) 에서 보면, 건강인과 비교한 경우, 호흡기 3 질환 환자군에 있어서의 Bm 을 보유하고 있는 개체의 출현빈도가 높고, 분포의 편중에 관하여 유의차가 보였다 (p = 0.039). 한편, BA 에 있어서는 반대로 Bm 하프로타입을 갖지 않는 개체가 많고, 건강인군과 비교하여 분포에 유의 편중이 보였다 (p = 0.037).

관측도수: 3 질환, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
정상	79	27	106
호흡기 3 질환	54	35	89
합계	133	62	195

퍼센트 (행): 3 질환, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
정상	75	25	100
호흡기 3 질환	61	39	100
합계	68	32	100

분할표 분석 통계량: 3 질환, Bm-0/Bm1.2

결측값수	63
자유도	1
카이 2 승값	4.282
카이 2 승 p 값	.0385
G2 승값	4.279
G2 승 p 값	.0386
분할표 분석 계수	.147
파이	.148
카이 2 승값 (Yates 보정)	3.670
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0554
Fisher 의 직접법 p 값	.0453

관측도수: BA, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
BA	30	2	32
정상	79	27	106
합계	109	29	138

퍼센트 (행): BA, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
BA	94	6	100
정상	75	25	100
합계	79	21	100

분할표 분석 통계량: BA, Bm-0/Bm1.2

결측값수	120
자유도	1
카이 2 승값	5.471
카이 2 승 p 값	.0193
G2 승값	6.641
G2 승 p 값	.0100
분할표 분석 계수	.195
파이	.199
카이 2 승값 (Yates 보정)	4.375
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0365
Fisher 의 직접법 p 값	.0241

관측도수: DPB, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
정상	79	27	106
DPB	17	12	29
합계	96	39	135

퍼센트 (행): DPB, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
정상	75	25	100
DPB	59	41	100
합계	71	29	100

분할표 분석 통계량: DPB, Bm-0/Bm1.2

결측값수	123
자유도	1
카이 2 승값	2.805
카이 2 승 p 값	.0940
G2 승값	2.674
G2 승 p 값	.1020
분할표 분석 계수	.143
파이	.144
카이 2 승값 (Yates 보정)	2.089
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.1484
Fisher 의 직접법 p 값	.1086

관측도수: BE, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
BE	23	15	38
정상	79	27	106
합계	102	42	144

퍼센트 (행): BE, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
BE	61	39	100
정상	75	25	100
합계	71	29	100

분할표 분석 통계량: BE, Bm-0/Bm1.2

결측값수	114
자유도	1
카이 2 승값	2.654
카이 2 승 p 값	.1033
G2 승값	2.564
G2 승 p 값	.1093
분할표 분석 계수	.135
파이	.136
카이 2 승값 (Yates 보정)	2.020
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.1552
Fisher 의 직접법 p 값	.1444

관측도수: PE, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
PE	14	8	22
정상	79	27	106
합계	93	35	128

퍼센트 (행): PE, Bm-0/Bm1.2

	Bm-0	Bm-1.2	합계
PE	64	36	100
정상	75	25	100
합계	73	27	100

분할표 분석 통계량: PE, Bm-0/Bm1.2

결측값수	130
자유도	1
카이 2 승값	1.088
카이 2 승 p 값	.2969
G2 승값	1.040
G2 승 p 값	.3079
분할표 분석 계수	.092
파이	.092
카이 2 승값 (Yates 보정)	.609
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.4353
Fisher 의 직접법 p 값	.3035

개체분류 (3)

또한 Bm 하프로타입을 호모로 갖는 개체 (BBmm; Bm-2) 와 그렇지 않는 개체 (Bm-0, 1) 로 출현빈도를 비교하였다 (Bm-0, 1 vs Bm-2).

COPD 에 속하는 호흡기 3 질환군 (DPB, BE, PE) 에서 보면, 건강인과 비교한 경우, Bm 하프로타입을 호모로 갖는 개체 (BBmm) 과 그렇지 않는 개체는 출현빈도에 관해, 분포의 편중에 통계학적 유의차가 보이고 (p = 0.021), Bm 호모형 (Bm-2) 의 6 인은 모두, COPD 에 속하는 호흡기 3 질환 (DPB, BE, PE) 중 어느 하나에 나환되어 있고, 3 인은 DPB, 2 인은 PE, 1 인은 BE 이었다. 건강인 106 인 중 및 BA 32 인 중에 Bm 호모형 (Bm-2) 은 한 명도 없었다.

질환별로 보면, DPB 및 PE 를 발증시킨 환자로 분포의 편중에 통계학적 유의차가 보였다 (DPB; p = 0.0082, PE; p = 0.0029).

관측도수: 3 질환, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
정상	106	0	106
호흡기 3 질환	83	6	89
합계	189	6	195

퍼센트 (행): 3 질환, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
정상	100	0	100
호흡기 3 질환	93	7	100
합계	97	3	100

분할표 분석 통계량: 3 질환, Bm-0.1/Bm-2

결측값수	63
자유도	1
카이 2 승값	7.373
카이 2 승 p 값	.0066
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.191
파이	.194
카이 2 승값 (Yates 보정)	5.295
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0214
Fisher 의 직접법 p 값	.0082

관측도수: DPB, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
정상	106	0	106
DPB	26	3	29
합계	132	3	135

퍼센트 (행): DPB, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
정상	100	0	100
DPB	90	10	100
합계	98	2	100

분할표 분석 통계량: DPB, Bm-0.1/Bm-2

결측값수	123
자유도	1
카이 2 승값	11.215
카이 2 승 p 값	.0008
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.277
파이	.288
카이 2 승값 (Yates 보정)	6.987
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0082
Fisher 의 직접법 p 값	.0091

관측도수: PE, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
PE	20	2	22
정상	106	0	106
합계	126	2	128

퍼센트 (행): PE, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
PE	91	9	100
정상	100	0	100
합계	98	2	100

분할표 분석 통계량: PE, Bm-0.1/Bm-2

결측값수	130
자유도	1
카이 2 승값	9.789
카이 2 승 p 값	.0018
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.267
파이	.277
카이 2 승값 (Yates 보정)	4.771
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.0289
Fisher 의 직접법 p 값	.0284

관측도수: BE, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
BE	37	1	38
정상	106	0	106
합계	143	1	144

퍼센트 (행): BE, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
BE	97	3	100
정상	100	0	100
합계	99	1	100

분할표 분석 통계량: BE, Bm-0.1/Bm-2

결측값수	114
자유도	1
카이 2 승값	2.809
카이 2 승 p 값	.0937
G2 승값	.
G2 승 p 값	.
분할표 분석 계수	.138
파이	.140
카이 2 승값 (Yates 보정)	.289
카이 2 승 p 값 (Yates 보정)	.5909
Fisher 의 직접법 p 값	.2639

관측도수: BA, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
BA	32	0	32
정상	106	0	106
합계	138	0	138

퍼센트 (행): BA, Bm-0.1/Bm-2

	Bm-0.1	Bm-2	합계
BA	100	0	100
정상	100	0	100
합계	100	0	100

이상, 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론 유전자 다형 해석에 의해, Bm 형의 하프로타입이 어떠한 메카니즘으로 호흡기 질환에 있어서의 만성 기도염증에 관련하고 있는 것이 나타났다. 또한, 인간 기도 트립신형태 효소의 질환에 대한 관여가 만성 폐쇄성 질환 (COPD) 에 속하는 DPB, BE, PE 의 3 질환과 BA 에서는 상이한 것도 나타났다.

단지, 어떤 유전자 다형을 갖는 개체 모두가 어떤 질환을 발증시킨다는 것은 아니기 때문에, 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형은 소위 유전병과 같은 결정적인 발증인자가 아니고, 이발증성인자 정도로 말할 수 있는 것이다. 즉, Bm 하프로타입을 보유하는 체에 더욱 환경인자 등이 첨가되었을 때 BE, PE, DPB 등의 호흡기 질환을 발증시키기 쉬워지는 것이다.

이러한 결과로부터, 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형을 사용함으로써, 인간 기도 트립신형태 효소 관련 질환을 분류할 수 있는 것이 나타났다.

또, 이 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석방법은, 개개인에 있어서의 인간 기도 트립신형태 효소 관련 질환의 발병 체질의 예측 및, 그 질환의 치료에 대한 효과 및, 그 예후의 재발 가능성의 예측 등으로 응용할 수 있는 수단이다.

본 발명은, 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석방법에 의해, 개개인의 질환 관련체질을 측정하는 방법을 제공한다. 따라서, 이 해석에 의해 인간 기도 트립신형태 효소와 관련하는 질환을 동정할 수 있으면, 그 인간 기도 트립신형태 효소가 있는 유전자형을 갖는 개인이 어떤 질환에 걸리기 쉽다는 것을 추정할 수 있다.

즉, 질환 발병 체질 (개인이 어떤 질병에 나환되기 쉬운체질을 갖고 있는 것) 을 예측함으로써, 상기 개인의 치료법에 대한 정보를 조기에 부여하는 것이 가능해지고, 조기진단, 조기치료로 연결된다. 또, 치료 후에 있어서도 그 질환이 재발하는 가능성도 추정할 수 있다. 즉, 치료의 예후 (환자의 치료 후의 치유의 경과 및 재발의 위험성) 를 예측함으로써, 의사는 환자에 대해 충분한 주의를 기울일 수 있고, 또 적절한 지도를 실시할 수 있다.

또한, 인간 기도 트립신형태 효소가 관여하는 병태에 있어서, 인간 기도 트립신형태 효소의 유전자 다형 해석이 투여하는 약제의 효과 판정 및 약제 개발에 있어서의 투여 약제의 유효한 환자군을 추리는 수단이 될 가능성이 있다.

이상, 서술한 바와 같이, 조기진단, 조기치료 및 적절한 예방법의 지도, 적절한 투약, 치료 후의 나중 관리에 의해 현재 문제가 되고 있는 고액의 의료비를 삭감하는 것으로 연결된다.

서열표

서열번호: 1

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 2 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (게놈 서열)

서열의 특징: 인트론 A 5' 말단

서열:

서열번호: 2

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 2 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (게놈 서열)

서열의 특징: 인트론 A 3' 말단

서열:

서열번호: 3

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 2 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (게놈 서열)

서열의 특징: 인트론 B 5' 말단

서열:

서열번호: 4

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 2 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (게놈 서열)

서열의 특징: 인트론 B 3' 말단

서열:

서열번호: 5

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 2 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (게놈 서열)

서열의 특징: 인트론 C 5' 말단

서열:

서열번호: 6

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 2 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (게놈 서열)

서열의 특징: 인트론 C 3' 말단

서열:

서열번호: 7

서열의 길이: 35

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: A1

서열:

서열번호: 8

서열의 길이: 35

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: A2

서열:

서열번호: 9

서열의 길이: 35

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: B1

서열:

서열번호: 10

서열의 길이: 35

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: B2

서열:

서열번호: 11

서열의 길이: 35

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: C1

서열:

서열번호: 12

서열의 길이: 35

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: C2

서열:

서열번호: 13

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: D1

서열:

서열번호: 14

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: D2

서열:

서열번호: 15

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: E1

서열:

서열번호: 16

서열의 길이:

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 1 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (프라이머)

서열의 특징: E2

서열:

서열번호: 17

서열의 길이: 3234

서열의 형: 핵산

사슬의 수: 2 본쇄

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 핵산 (게놈 서열)

서열의 특징: 인트론 C

서열:

Claims

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다음 중 어느 하나인 유전자 단편:

(a) 서열번호 7 과 서열번호 8 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편,

(b) 서열번호 9 과 서열번호 10 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편,

(c) 서열번호 11 과 서열번호 12 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편,

(d) 서열번호 13 과 서열번호 14 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편,

(e) 서열번호 15 과 서열번호 16 에 나타난 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 인트론 영역을 포함하는 유전자 단편.
삭제
서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나에 나타난 염기서열로 이루어지는 인간 기도 트립신형태 효소의 인트론의 유전자 단편.
서열번호 17 에 나타난 염기서열로 이루어지는 인간 기도 트립신형태 효소 인트론 C 의 유전자 단편.
인간 기도 트립신형태 효소 유전자의 인트론 C에서 MboI 제한효소절단단편길이다형(RFLP) 또는 BstUI RFLP를 검출하기 위한 유전자 증폭에 사용될 수 있는 서열번호 11과 서열번호 12에 나타난 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍(pair).