KR100985984B1 - Ｃｏｌ4ａ3 유전자를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물 및 이를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법 - Google Patents

Ｃｏｌ4ａ3 유전자를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물 및 이를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 COL4A3 유전자를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물 및 이를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 COL4A3 유전자의 다형성에 근거한 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물, 이를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 진단키트, 마이크로어레이 및 만성 폐기능 장애 감수성을 예측 및 판단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물은 만성 폐기능 장애에 대한 감수성의 정도를 진단할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 조성물 및 이의 응용 방법은 만성 폐기능 장애에 대한 감수성을 예측하고 판단할 수 있는 목적으로 사용할 수 있다.
만성 폐기능 장애, COPD, COL4A3, 마커

Description

ＣＯＬ4Ａ3 유전자를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물 및 이를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법{Composition for the diagnosis of susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease using COL4A3 gene and method for predicting and analyzing susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease using the same}
본 발명은 COL4A3 유전자를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물 및 이를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 COL4A3 유전자의 다형성에 근거한 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물, 이를 이용한 만성 폐기능 장애 감수성 진단키트, 마이크로어레이 및 만성 폐기능 장애 감수성을 예측 및 판단하는 방법에 관한 것이다.
개체간의 유전적 차이는 개체간의 DNA 염기서열의 차이에 의해 초래되고 이러한 염기서열의 차이는 변이(mutation)와 다형성(polymorphism)으로 구분되는데, 다형성은 미세한 표현형의 차이(phenotypic change)를 초래하며 그 빈도가 인구의 1% 이상인 경우 다형성 유전형으로 정의된다.
그 중 단일염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)은 유전체(genome) 상에서 A,T,C,G 로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. 이러한 SNP의 2/3는 염기서열 중 C 와 T 간의 변이인 것으로 알려져 있고, SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타난다고 알려져 있다. 또한, SNP는 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있을 것으로 여겨지고 있다. 나아가 개체의 유전적 특성에 적합한 진단 및 치료전략을 구사하는 맞춤의학(personalized medicine)에 이용될 수 있고, SNP 패턴과 질병기록을 잘 통합할 수 있다면 여러 가지 질병의 치료를 위한 의료 통계를 구축할 수 있을 것으로 여겨지고 있다.
한편, 만성적인 폐기능 장애(COPD, chronic obstructive pulmonary disease)는 염증이 기로를 좁히거나 폐의 엘라스틴 섬유와 유연조직이 파괴되는 것과 같은 급진적이며 비가역적인 폐의 기공 장애가 일어나는 질병이다(Pauwel RA et al., Am J Respir Crit Care Med ., 2001, 163:1256-1276). 흡연의 경우 COPD의 발병에 매우 중요한 환경적 요소이지만, 오직 만성 흡연자의 10~15% 만이 COPD의 증상을 보인다. 이러한 사실과 COPD의 가족집단이 있다는 사실은 유전적인 요소가 COPD의 발병 에 작용함을 암시한다. COPD의 병리기전과 연관되었다고 알려지거나 연관된 것으로 추측된 프로테아제-안티프로테아제 가설, 산화-환원 가설, 염증반응, 세포사멸과 생체 이물 대사 등과 관련된 유전자들이 주로 연구되었지만, 결과는 연구에 따라 차이가 있었다.
현재, 만성 폐기능 장애의 감수성유전자에 대한 유전 연관 분석은 대부분 2q33.3-2q37.2 부위를 중심으로 이루어져 왔다. 보스턴의 COPD 조기발병에 관한 연구에서 이 부위가 노력성 폐흡기량 (Forced vital capacity, FVC)에 대한 노력성 호기량 (Forced expiratory volume, FEV1)의 비율이 2.0보다 큰 LOD점수를 보여준다는 사실을 밝혔다(Silverman EK et al., Am J Human Genet, 2002, 70:1229-1239). 2q 염색체의 유사부위가 FEV1/FVC 비율이 연관이 있음을 Utah Genetic Reference Project를 통해 밝혔다(Malhotra A et al., Am J Respir Crit Care Med, 2003, 168:556-561). 뿐만 아니라 이 특정유전지역이 COPD 감수성과 관련된 유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 흡연의 영향으로 COPD의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려졌다. 이 부위는 많은 수의 COPD와 관련한 유전자를 가지고 있을 것으로 예상되며, 인터루킨 8 수용체 알파와 베타(IL8RA와 IL8RB), CYP27A1, 유형 4콜라겐 알파3 (COL4A3), 용해성 운반체 11(solute carrier family 11)을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 COPD에 대한 후보 유전자 중, COPD의 감수성에 대한 COL4A3의 잠재적인 역할에 대해 연구를 진행하던 중, 상기 COL4A3 유전자의 한 다형성 부위가 COPD에 대한 감수성과 밀접한 연관을 가지고 있다는 점을 알아내어 이를 이용하는 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 COL4A3 유전자의 다형성 부위를 포함하는 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 COL4A3 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 키트 및 만성 폐기능 장애 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
한편, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물을 이용하여 만성 폐기능 장애 감수성을 예측 및 판단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 COL4A3 유전자의 다형성 부위를 포함하는 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 COL4A3 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 키트 및 만성 폐기능 장애 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물을 이용하여 만성 폐기능 장애 감수성을 예측 및 판단하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 만성 폐기능 장애(COPD, chronic obstructive pulmonary disease) 감수성 진단용 조성물은 COL4A3 유전자의 다형성 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서의 조성물에서 상기 COL4A3 유전자의 다형성 부위는 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 253번째 염기 A가 G로 치환되고 상기 253번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용된 COL4A3는 유전적으로 독특한 유사 알파체인 (COL4 A1~A6)의 하나로, 폐포 기저막에서 많이 발현된다(Boutaud A. et al., J Biol Chem, 2000, 275:30716-30724). COL4A5는 삼중가닥의 콜라겐 분자를 형성해 세포의 분화, 고착, 분열, 이주의 조절중추로써 역할하는 것으로 추측된다. 뿐만 아니라 COL4A3는 호중성 백혈구의 활동을 저해할 수도 있다. COL4A3는 호중성 백혈구의 세포질 cAMP를 증가시켜 호중성 백혈구의 과산화물과 단백질분해효소 분비를 저해하는 결과를 초래한다(Monboisse JC et al., J Biol Chem, 1994, 269:25475-25482; Shahan TA et al., Cancer Res, 1999, 59:4584-4590). 또한, COL4A3가 내피세포의 분화와 세포의 사멸이나 분화를 저해할 수 있음이 알려 졌다(Maeshima Y et al., J Biol Chem, 2001, 276:31959-31968; Marneros AG et al., Matrix Biol, 2001, 20:337-345). 결론적으로 이런 발견은 COL4A3가 면역반응이나 세포의 사멸을 조절함으로써 COPD의 악화에 개입할 수 있음을 설명한다(Groneberg DA et al., Respir Res, 2004, 5:18).
본 발명에서 COL4A3 유전자의 다형성 부위는 서열번호 1의 253번째 염기 A가 G로 치환된 것으로 상기 염기는 진뱅크에 공지된 서열(accession No. NT_005403)의 78340385번째 염기에 해당한다. 본 발명의 서열번호 1은 진뱅크에 공지된 서열(accession No. NT_005403)의 78340333 내지 78340633번째 염기에 해당한다.
본 발명의 일 실시예에서는 범용 데이터베이스에서 COL4A3 유전자에 존재하여 아미노산, 3’-UTR, 스플라이싱 부위, 프로모터 등의 변화를 초래하는 모든 잠재적인 기능성 다형성마커를 검색하고, 이의 다형성 여부 및 빈도를 조사하였다. 그 결과, 각각의 다형성 빈도, haplotype, 연관성불균형 (LD)를 기초로 6가지의 다형성마커, 즉 -1162T>C (전사시작부위는 +1로 표기됨, rs12613226), IVS2+12C>A (rs1882435), G162E (exon 7, rs6436669), H451R (exon 22, rs11677877), P574L (exon 25, rs28381984), *315C>A (번역 종료 코돈은 *1로 표시됨, rs2070735)의 다형성 마커 후보를 선별하고 이를 COPD와의 연관성을 확인하는 데에 이용하였다(실시예 1 참조)
본 발명의 다른 실시예에서는 각각의 다형성 마커 후보를 대상으로 COPD 위험도와의 관계를 COPD로 진단받은 환자와 정상인을 대상으로 환자-대조군 연구(case control study)를 실시하여 환자군과 정상 대조군 간에 다형성의 대립형질 빈도를 조사하여 상관관계를 밝혔다. 그 결과, COL4A3 유전자에 존재하는 다형성 마커 후보들 중 H451R(rs11677877)이 전반적으로 COPD 환자군과 대조군에 있어서 상당한 차이가 있음을 확인할 수 있었다(실시예 2 및 3 참조).
따라서, 이와 같은 결과를 종합하여, COL4A3 유전자 다형성과 COPD 발병위험도와의 잠재적인 연관성을 분석한 결과, H451R 다형성이 COPD 발병위험도 증가와 확실하게 연관되어 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 COL4A3 유전자가 COPD의 발병에 관련되었을 수 있으며 H451R다형성이 COPD 감수성에 대한 효과적인 표지로 사용 가능함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명은 COL4A3 유전자의 다형성 부위를 포함하는 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 상기 “진단”이라는 용어는 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다. 또한 본 발명에서 용어 “감수성(sensitivity)”은 만성 폐기능 장애에 대한 민감도, 즉 만성 폐기능 장애(COPD) 발생위험도의 증가 및 감소를 나타낸다. 그리고 본 발명에서 용어 “다형성(polymorphism)”이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대체적 대립형질의 발생을 의미한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두개의 대립형질을 가진다.
본 발명의 진단용 조성물을 이용하여 진단할 수 있는 만성 폐쇄성 폐질환은 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 및 세기관지염을 포함한다..
한편, 본 발명은 서열번호 1의 253번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.
상기 “증폭할 수 있는 프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로 서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응 (ligase chainreaction : LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 바람직하게 서열번호 8 및 서열번호 9인 프라이머 일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 만성 폐기능 장애 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 253번째 염기 A가 G로 치환되고 상기 253번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 만성 폐기능 장애 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science, 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명의 만성 폐기능 장애와 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
나아가 본 발명은 만성 폐기능 장애 감수성을 예측 및 판단하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로,
a) 검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 253번째 염기의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 만성 폐기능 장애 발생 위험도를 분석하는 단계를 포함하는 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법을 제공한다.
상기 방법 중 a)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법 에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 방법 중 c)단계의 염기 결정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있다.
이러한 염기 결정을 통하여 결정된 유전자형에 따라 만성 폐기능 장애 발생 위험도를 정할 수 있다. 본 발명의 H451R 다형성 부위에서 H451R의 다형성 대립유전자 빈도는 대조군 보다 환자에서 월등히 높았으며(0.17 vs 0.13, P = 0.02), 하나 이상의 451R 대립형질을 가진 개인은 451H/H 유전자형을 가진 사람에 비해 COPD의 위험성이 월등히 높았다(adjusted OR = 1.48, 95% CI = 1.03-2.14, P = 0.03)(실시예 3 및 표 2 참조).
따라서 상기 c) 단계에서 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 만성 폐기 능 장애 감수성을 예측 및 판단하고자 할 때, 상기 c)단계에서 결정된 서열번호 1의 253번째 염기의 유전자형이 AG 또는 GG인 경우에는 만성 폐기능 장애 발생 위험도가 증가되는 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 본 발명은 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법을 제공한다. 본 발명의 만성 폐기능 장애 감수성 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법은 만성 폐기능 장애의 발생 위험도를 분석할 수 있는 효율적인 도구로서 사용될 수 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
COL4A3 유전자의 다형성 동정과 선택
COL4A3 유전자에서 모든 잠재적인 기능성 다형성마커를 찾기 위해, 범용 데 이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)를 이용해 프로모터 지역, 모든 인트론-엑손 범위를 포함하는 엑손 및 유전자의 3’-UTR에서 다형성마커를 찾았다. 그 결과, 7개의 다형성마커를 선별하였으며, 이는 각각 -1162T>C(rs12613226), IVS2+12C>A(rs1882435), G162E (G>A)(rs6436669), H451R (A>G)(rs11677877), P574L (C>T)(rs28381984), *315C>A†(rs2070735) 및 P141L(exon 7, rs10178458)이었다.
상기 다형성마커를 대상으로 염기서열분석법으로 건강한 한국인 27명의 다형성과 다형성 빈도를 분석하였다. 샘플은 개인으로부터 정보동의 하에 수집되었고, 게놈 DNA를 건강한 한국인의 말초 혈액 림프구를 채취한 뒤, 이를 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리를 통해 수득하여 사용하였다. 샘플은 54염색체를 포함하며 5%이상의 빈도를 가진 대립유전자(allele)는 최소 95%이상의 신뢰도로 분석되었다. 염기서열분석에 사용한 프라이머는 Genbank 표준염기서열(accession no. NT_005403)을 기초로 디자인되었으며, 디자인된 프라이머의 서열은 다음과 같다: -1162T>C(rs12613226)에 대해서는 서열번호 2(ACAGAGCACAGTAGTATTGG) 및 서열번호 3(ATAGTAACTAACACAGGCGC), IVS2+12C>A(rs1882435)에 대해서는 서열번호 4(ATATTTCTATTGATATATTGCTACAAGGTC) 및 서열번호 5(GGATCTTTCTGCTACCGATGA), G162E (G>A)(rs6436669)에 대해서는 서열번호 6(CTGGGATTACAGGCATGTG) 및 서열번호 7(CTTCTCTGAAGTGCTGTACC), H451R (A>G)(rs11677877)에 대해서는 서열번호 8(AGCTTTCAAAGATCAACTACCTTA) 및 서열번호 9(CCATCAACTCCTGGGATTC), P574L (C>T)(rs28381984)에 대해서는 서열번호 10(GGGTGACCCAGGACTTA) 및 서열번호 11(GGTTGAAATCACTGAATGCTAC), P141L(exon 7, rs10178458)에 대해서는 서열번호 12(GGGTTACTTTGTCTAGATTTACCATT) 및 서열번호 13(GGCATGCAAACCTACCG), 및 *315C>A†(rs2070735)에 대해서는 서열번호 14(GTTTCAAAGTTCTCTGTGGC) 및 서열번호 15(CACAATGCTCCAGGATACCA)이었다.
이 때, 상기 분석은 독립적으로 실험을 수행한 두 명의 실험자에 의해 확인되었다. 모든 SNPs, SNP IDs와 대립빈도에 관한 정보는 NCBI 홈페이지로부터 얻었다.
그 결과, 7가지의 다형성마커에 대한 연구 중, P141L(exon 7, rs10178458)과 G162E은 완벽한 LD (|D’| = 1.00 and γ2 = 1.00)를 나타내었기 때문에, 총 6개의 다형성마커를 연관 연구에 적용하였다.
< 실시예 2>
연구대상의 선정
NHLBI/WHO Global Initiative에 의해 세워진 기준(GOLD)에 따라 COPD로 진단된 311명의 경북대병원 내진 남성 환자들로 질병군을 구성했다.
COPD에 대한 기준은 아래와 같다: 만성적 기침과 호흡곤란을 보이는 경우; 기관확장제 복용후 FEV1(노력성 호기량, Forced expiratory volume)이 80%이하, 기관확장제 복용전 FEV1/FVC(노력성 폐흡기량, Forced vital capacity)가 70%이하, 200μg의 살부타몰(salbutamol) 복용후 FEV1 회복력이 12% 이하. COPD의 경중은 GOLD의 기준에 따라, 예상되는 FEV1의 비율로 구분하였다: 경미함 (>80%), 보통 (50-80%), 심각함 (30-50%), 매우 심각함 (<30%).
대조군 (n=386)은 건강검진센터를 방문한 건강한 집단 중 다른 질병이나 질환기록이 없는 건강한 사람들로 선택하였다. 모든 실험군과 대조군은 대구 혹은 그 인근에 사는 한국인이며, 훈련된 전문 면접관이 비교상대에 대한 세부적인 질문들을 완성했다. 질문사항에는 하루 및 1년에 피우는 평균 담배수에 대한 내용이 포함되어 있었으며, 평생 동안 1년에 적어도 하루 이상 담배를 피운 사람을 흡연자로 정의하였다. 이전 흡연자(former smoker)는 진단(환자) 전에 또는 충분한 고지 후 동의한 날 이전에 적어도 1년 동안 담배를 끊었던 사람으로 정의되었다. 누적 담배량(팩-년수)은 다음의 식을 이용하여 계산하였다: 흡연량 = (하루당 흡연한 담배갑 수) × (흡연기간).
이 연구는 경북대학교 병원의 기관 위원회에 의해 승인 받았고 각 환자로부 터 정보동의를 얻었다.
그 대상이 되는 실험군 및 대조군의 기초적인 정보는 하기 표 1과 같다. 평균 연령 및 성별 분포에서 환자군과 대조군 간에 큰 차이가 나지 않았으며, 이를 통해 같은 분포를 가지는 두 그룹을 사용하여 차이를 비교하는 것이 가능함을 알 수 있었다. 한편, 환자군은 대조군에 비해서 흡연자의 비율이 더 높았고, 흡연자에서의 흡연량(팩-년수)도 환자군이 대조군에 비해 유의하게 높았다(P<0.001). 이러한 차이는 이후에 진행되는 다변량 분석(multivariate analyses)에 의해 조절되었다. FEV1과 FEV1/FVC 비는 대조군 보다 COPD군에서 확연하게 낮았다(P<0.001).
COPD (n = 311) 대조군(n = 386) P
연령 65.5 ± 8.1 60.4 ± 8.0 <0.001*
흡연상태 <0.001#
현재 171 (55.0) 205 (53.1)
이전 129 (41.5) 128 (33.2)
경험없음 11 (3.5) 53 (13.7)
흡연량(팩-연수)† 42.6 ± 20.0 30.8 ± 16.9 <0.001#
FEV1(예상%) 63.4 ± 26.3 104.9 ± 16.8 <0.001#
FEV1/FVC (%) 49.7 ± 13.1 80.7 ± 7.4 <0.001#
*t-test; #χ2 test; ¶괄호안의 숫자는 백분율; †현재와 이전의 흡연자
<실시예 3>
라이트사이클러를 이용한 유전자형 검사
<3-1> 유전자형 검사
상기 실험군 및 대조군 시료에 대해서 6개의 다형성 마커에 대한 유전자형을 PCR과 형광부착 혼성화표지를 이용한 FRET(fluorescent resonance energy transfer) 분석법(Parks, S. B. et al., Am. J. Clin. Pathol., 115, 439-447, 2001)으로 분석하였다. 이를 위하여 대조군 및 실험군으로부터 말초 혈액 림프구를 채취한 뒤, 이를 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리를 통해 게놈 DNA를 수득하여 이를 이용하였다. 상기 FRET 분석법에 의한 유전자형 분석에서 PCR 증폭 및 멜팅 커브(melting curve) 분석은 LightCycler 480(Roche Diagnostic, 독일)을 이용하여 수행하였고, 모든 PCR 반응은 각각의 프라이머 (5 pmol) 0.5㎕, 혼성화 프로브인 도너 프로브 (2 pmol) 0.5㎕, 앵커 프로브 (2 pmol) 1㎕, 게놈 DNA (5ng/㎕) 1㎕, LightCycler 480 제노타이핑 마스터 믹스(로체 진단 회사, 독일) 1㎕ 및 증류수 1㎕를 혼합하여 제조사의 지침에 따라 PCR을 수행하였다. 각각의 혼성화 프로브 쌍은 2개의 올리고뉴클레오티드, 즉, 억셉터 플르오포어(acceptor flourphore)인 LightCycler LC Red 640이 5‘말단에 표지된 앵커 프로브(anchor probe) 및 도너 플르오포어(donor flourphore)인 플루오레세인(fluorescein)이 3‘말단에 표지된 센서 프로브(sensor probe)로 구성되어 있다.
상기 PCR 증폭을 위해 사용한 각각의 프라이머 염기서열은 상기에서 기재한 바와 같다.
상기 FRET 방법에 의해 98%이상의 유전자형 분석을 성공할 수 있었고, FRET 방법에 의해 분석되지 못한 표본들은 PRISM 3700 genetic analyzer (Applied Biosystems, 미국)를 이용해 직접적으로 염기서열을 분석함으로써 유전자형을 확인하였다. 모든 유전자형 분석은 신뢰도를 유지하기 위해 실험군과 대조군 상태에서 비공개로 실험하였으며, 대상의 약 10%는 무작위로 다른 실험자에 의해 다시 분석되었고 결과는 100% 일치하였다(결과미도시).
<3-2> 통계적인 분석
상기 유전자형 검사결과를 이용하여 대조군 및 환자군에 대해서 통계 분석을 통해 비교하였다. 실험군과 대조군은 연속 변수에 대해서는 Student's t-test를 사용하여 비교하였고, 카테고리별 변수에 대해서는 χ2 test를 사용하여 비교하였다. 개체에서 관찰된 유전자형의 빈도와 예상되는 유전자형의 빈도를 적합도 검정 (goodness-of-fit) χ2 테스트를 사용하여 1 자유도 (one degree of freedom)로 하디-웨인버그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium)에 부합되는지 조사하였다.
유전자의 다형성 중 연관 비평형 (linkage disequilibrium, LD)계수는 SAS 유전학 소프트웨어 (SAS사, 미국)를 사용하여 계산하였다. 일배체형과 그 빈도수는 상 프로그램 (Phase program)을 사용하여 바예시안 알고리즘(Bayesian algorithm)에 바탕을 두고 측정하였다(Stephens, M., et al., Am. J. Hum. Genet., 68, 978-989, 2001). 상기 상 프로그램에 의한 예측된 일배체형을 다시 한번 확인하기 위하여 Schaid 등에 의해 개발된 하플로 통계 프로그램(Haplo. stats program)을 사용하였다.(Daniel J. et al., Am. J. Hum. Genet. 70:425-434, 2002) 유전자형 및 일배체형과 연관된 COPD 발생위험도는 비-조건적 로지스틱 회귀분석(logistic regression analysis)을 이용하여 대응비 (odds ratio, OR) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval, CI)으로 평가하였다. 추가적으로 관련된 분석은 COL4A3유전자형과 COPD의 위험성사이의 관계를 알기 위해 나이와 COPD의 심각성에 따라 단계적으로 분석을 수행하였다.
또한, 흡연과 유전자의 연관 분석을 i) 누적되는 흡연노출의 정도에 따른 분류, ii) 유전자형/haplotype형- 흡연과의 결합작용, iii) 흡연이 유전자에 영향을 미치는 기간이 포함된 로지스틱 회귀분석을 통해 수행하였으며, 이러한 분석을 위해, 대상자를 흡연노출 수준에 따라 3가지로 분류하였다. : 비흡연자, 경미한 흡연가 (일년에 33갑이하), 심한 흡연가(일년에 33갑이상).
모든 분석은 Windows용 통계분석 프로그램 version 8.12 (SAS institute, 미국)를 이용해 수행되었다.
상기와 같은 분석을 통해 환자군과 대조군의 6개 COL4A3다형성을 분석한 대립유전자 빈도와 유전형의 결과는 하기 표 2와 같다. 대조군의 6개의 다형성 유전자의 분포는 하디-와인버그 평형에 적합하였다. H451R의 다형성 대립유전자 빈도는 대조군 보다 환자에서 월등히 높았다 (0.17 vs 0.13, P = 0.02). 하나 이상의 451R 대립형질을 가진 개인은 451H/H 유전자형을 가진 사람에 비해 COPD의 위험성이 월등히 높았다 (adjusted OR = 1.48, 95% CI = 1.03-2.14, P = 0.03). 다른 5개 다형성마커의 유전형분포는 환자군과 대조군에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.
COPD환자와 대조군에서 COL4A3 유전자형과 COPD위험성과의 연관
다형성
(rs no.)		 유전형 실험군 대조군 낮은 형질의 빈도 정의된 OR
n (%) n (%) P # 실험군 대조군 P # (95% CI) P
-1162T>C
(rs12613226)		 TT 154 (49.5) 191 (49.5) 0.91 0.30 0.30 0.85 1.00
TC 130 (41.8) 158 (40.9) 0.98 (0.69-1.38) 0.90
CC 27 (8.7) 37 (9.6) 0.99 (0.55-1.80) 0.98
IVS2+12C>A
(rs1882435)		 CC 101 (32.5) 135 (35.0) 0.79 0.42 0.41 0.54 1.00
CA 157 (50.5) 188 (48.7) 1.20 (0.83-1.73) 0.33
AA 53 (17.0) 63 (16.3) 1.18 (0.72-1.93) 0.51
G162E (G>A)
(rs6436669)		 GG 241 (77.5) 307 (79.5) 0.35 0.12 0.11 0.74 1.00
GE 68 (21.9) 73 (18.9) 1.11 (0.74-1.67) 0.62
EE 2 (0.6) 6 (1.6) 0.34 (0.06-1.91) 0.22
H451R (A>G)
(rs11677877)		 HH 213 (68.5) 294 (76.2) 0.07 0.17 0.13 0.02 1.00
HR 88 (28.3) 84 (21.8) 1.44 (1.00-2.11) 0.05
RR 10 (3.2) 8 (2.1) 1.99 (0.69-5.76) 0.20
HH 213 (68.5) 294 (76.2) 0.02 1.00
HR+RR 98 (31.5) 92 (23.8) 1.48 (1.03-2.14) 0.03
P574L (C>T)
(rs28381984)		 PP 86 (27.7) 123 (31.9) 0.32 0.46 0.44 0.60 1.00
PL 165 (53.1) 183 (47.4) 1.39 (0.95-2.04) 0.09
LL 60 (19.3) 80 (20.7) 1.25 (0.78-2.01) 0.98
*315C>A†
(rs2070735)		 CC 187 (60.1) 220 (57.0) 0.63 0.22 0.24 0.35 1.00
CA 112 (36.0) 147 (38.1) 0.88 (0.62-1.24) 0.46
AA 12 (3.9) 19 (4.9) 0.55 (0.24-1.26) 0.16
( # 실험군과 대조군사이에서 유전자형의 분포와 대립형질의 빈도에 대한 Two-sided χ2 test.
ORs (95% CIs) 와 P-values은 고려되지 않은 로지스틱 분석으로 계산, 연령과 일년동안의 흡연량.
† 전사종결코돈의 3‘부분으로부터 *1로 표기함.)
<실시예 4>
COPD 발병위험도와 H451R유전형질의 연관성 분석
<4-1> 나이와 흡연상태, COPD의 심각성에 따른 연관성 분석
상기 실시예 3의 결과를 바탕으로 실험군 및 대조군을 각각 나이와 흡연상태, COPD의 심각성에 따라 다시 분류한 다음 COPD 발병위험도와 H451R유전형질의 연관성을 실시예 3과 동일한 방법으로 다시 분석하였다.
그 결과, 하기 표 3에서와 같이 평균연령에 따라 분류했을 때, H/R 또는 R/R 유전자형을 가진 사람의 나이가 어릴수록 COPD의 위험성이 현격히 증가하는 것을 보였다 (보정 OR = 1.93, 95% CI = 1.10-3.39, P = 0.02). 하지만 고연령일 경우, 유전자형과 발병위험도의 상관성은 보이지 않았다. 흡연상태에 따른 분류에서는 H/R 또는 R/R 유전자형의 COPD 발병위험도 증가에 대한 효과는 흡연자들에게서는 두드러지지만 비흡연가들에서는 나타나지 않았다 (보정 OR = 1.57, 95% CI = 1.08-2.27, P = 0.02). 흡연경험이 있는 사람들을 연간흡연량에 따라 분류했을 때, H/R 또는 R/R유전자형의 COPD 발병위험도 증가에 대한 효과는 흡연량이 높을수록 확연히 높으나 (보정 OR = 1.84, 95% CI = 1.10-3.08, P < 0.02), 흡연율이 낮은 대상자와는 큰 연관성은 없었다. COPD의 경중에 의해 환자를 분류했을 때, 하나이상의 451R 대립형질이 COPD의 발병위험도 증가와 연관되어 있었다 (GOLD III-IV, adjusted OR = 1.62, 95% CI = 1.00-2.61, .P = 0.04). 그러나 H451R유전형과 경미한 COPD의 발병위험도와는 관련이 없었다. 연령과 COPD의 경중을 함께 고려할 때, H/R 또는 R/R유전자형의 효과는 심각한 COPD 증세를 보이는 젊은 환자에게서만 확연하게 나타났다 (GOLD III-IV, 보정 OR = 3.02, 95% CI = 1.37-6.67, P = 0.006; P = 0.001, test for homogeneity).
COL4A3 H451R (rs11677877A>G) 유전자형과 COPD간의 연관성
실험군 대조군 R (95% CI)

for HR + RR vs HH		 P P H *
HH HR + RR HH HR + RR
연령
≤ 60 51 (61.4) 32 (38.6) 155 (76.4) 48 (23.6) 1.93 (1.10-3.39) # 0.02 0.10
> 60 162 (71.1) 66 (28.9) 139 (76.0) 44 (24.0) 1.25 (0.78-2.01) # 0.35
흡연상태
비흡연 8 (72.7) 3 (27.3) 40 (75.5) 13 (24.5) 1.16 (0.27-5.01) 0.85
가끔† 205 (68.3) 95 (31.7) 254 (76.3) 79 (23.7) 1.57 (1.08-2.27) 0.02 0.29
연간흡연량†
≤33 69 (74.2) 24 (25.8) 151 (76.3) 47 (23.7) 1.15 (0.65-2.06) 0.63
> 33 136 (65.7) 71 (34.3) 103 (76.3) 32 (23.7) 1.84 (1.10-3.08) 0.02 0.09
COPD심각도
GOLD I + II 138 (69.7) 60 (30.3) 294 (76.2) 92 (23.8) 1.33 (0.88-2.01) ‡ 0.18
GOLD III + IV 75 (66.4) 38 (33.6) 294 (76.2) 92 (23.8) 1.62 (1.00-2.61) ‡ 0.04 0.38
나이 & COPD 경중
나이≤60, GOLD I+II 35 (67.3) 17 (32.7) 155 (76.4) 48 (23.6) 1.44 (0.73-2.84) # 0.30
GOLD III+IV 16 (51.6) 15 (48.4) 155 (76.4) 48 (23.6) 3.02 (1.37-6.67) # 0.006 0.001§
나이>60, GOLD I+II 103 (70.5) 43 (29.5) 139 (76.0) 44 (24.0) 1.25 (0.75-2.10) # 0.39
GOLD III+IV 59 (72.0) 23 (28.0) 139 (76.0) 44 (24.0) 1.31 (0.69-2.49) # 0.40
(*동종테스트
#연간흡연량 조정값 연령값 †현재와 이전의 흡연자 ‡나이와 연간흡연량으로 보정.
§다른 모든 그룹과 비교.)
<4-2> 흡연상태의 복합효과의 연관성 분석
분류에 따른 분석에 더해, H451R유전자형과 흡연상태의 복합효과가 COPD의 발병위험성에 미치는 영향을 실시예 3과 동일한 방법으로 조사하였다.
그 결과, 하기 표 4에서 보듯이, H/H 유전자형을 가진 비흡연자 그룹을 참고해서 비교했을 때, H/R 또는 R/R유전자형이며 흡연량이 많으면 COPD 발병위험도가 높아진다는 것이 발견되었다 (보정 OR=9.51, 95% CI=3.93-23.01, P<0.001). 하지만, H451R 유전형과 흡연상태와의 연관성을 다변형 로지스틱 회귀분석을 통해 분석하였으나 통계적으로 유의한 결과를 얻을 수는 없었다.
COL4A3 H451R 유전자형의 관계와and COPD의 위험에 대한 흡연률
흡연상태 유전자형
H/H 정의값 OR (95% CI)* H/R + R/R 정의값OR (95% CI)*
비흡연자 8/40# 1.00 (reference) 3/13 1.23 (0.27-5.47)
흡연자
≤ 33 연간흡연량 69/151 2.40 (1.05-5.49) 24/47 2.79 (1.11-7.05)†
> 33 연간흡연량 136/103 5.36 (2.37-12.13)‡ 71/32 9.51 (3.93-23.01)‡
(*H/H 유전형의 비흡연가를 기준으로 나이를 보정해 로지스틱 회귀법으로 분석함.
#환자군수/대조군수.
P = 0.04.; †P = 0.03; ‡P < 0.001.
P = 0.32 변량에서 유전자형과 흡연사이의 관계.)
이와 같은 결과를 종합하면, COL4A3 유전자 다형성과 COPD 발병위험도와의 잠재적인 연관성을 분석한 결과, H451R 다형성이 COPD 발병위험도 증가와 확실하게 연관되어 있음을 알 수 있었다. 그리고, H451R 다형성과 COPD의 연관성은 나이가 젊을수록, COPD가 중할수록 더 명확하게 나타났다. 이러한 결과를 통해 COL4A3 유전자가 COPD의 발병에 관련되었을 수 있으며 H451R다형성이 COPD 감수성에 대한 효과적인 표지로 사용 가능함을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 만성 폐기능 장애 감수성 진단용 조성물은 만성 폐기능 장애에 대한 감수성의 정도를 진단할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 조성물 및 이의 응용 방법은 만성 폐기능 장애에 대한 감수성을 예측하고 판단할 수 있는 목적으로 사용할 수 있다.
<110> kyungpook national university industry-academic cooperation foundation <120> Marker for the diagnosis of susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease using COL4A3 gene and method for predicting and analyzing susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease using the same <130> NP07-0132 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 301 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agctttcaaa gatcaactac cttaaaaata ccacatctat gtaatatgaa gggaagagct 60 ggtcaccatg ctttctcagt tgcagataaa cttctaaaga ctaggcttcc aatacaaaga 120 tgagagagat gcattttaaa taatacatat attacaatac ttgctaattg aaaaaaacac 180 aaataaaaaa ttgtctttgg tgctgtattt ttataggtga catcgttttt cgcaagggtc 240 cacctggaga tcacggactg ccaggctatc tagggtctcc aggaatccca ggagttgatg 300 g 301 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -1162T>C_1 <400> 2 acagagcaca gtagtattgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -1162T>C_2 <400> 3 atagtaacta acacaggcgc 20 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVS2+12C>A_1 <400> 4 atatttctat tgatatattg ctacaaggtc 30 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVS2+12C>A_2 <400> 5 ggatctttct gctaccgatg a 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G162E_1 <400> 6 ctgggattac aggcatgtg 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G162E_2 <400> 7 cttctctgaa gtgctgtacc 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H451R_1 <400> 8 agctttcaaa gatcaactac ctta 24 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H451R_2 <400> 9 ccatcaactc ctgggattc 19 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P574L_1 <400> 10 gggtgaccca ggactta 17 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P574L_2 <400> 11 ggttgaaatc actgaatgct ac 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P141L_1 <400> 12 gggttacttt gtctagattt accatt 26 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P141L_2 <400> 13 ggcatgcaaa cctaccg 17 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 315C>A_1 <400> 14 gtttcaaagt tctctgtggc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 315C>A_2 <400> 15 cacaatgctc caggatacca 20

Claims (9)

  1. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 253번째 염기 A가 G로 치환되고, 상기 253번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 만성 폐기능 장애(COPD, chronic obstructive pulmonary disease) 감수성 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 만성 폐기능 장애는 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 및 세기관지염으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열을 가지는 프라이머를 포함하는 만성 폐기능 장애 진단용 키트.
  5. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 253번째 염기 A가 G로 치환되고, 상기 253번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 만성 폐기능 장애 진단용 마이크로어레이.
  6. a) 검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;
    b) 상기 a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 253번째 염기의 다형성 부위를 증폭하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 만성 폐기능 장애 발생 위험도를 분석하는 단계를 포함하는 만성 폐기능 장애 감수성 예측 및 판단 방법.
  7. 제6항에 있어서, c)단계에서 결정된 서열번호 1의 253번째 염기의 유전자형이 AG 또는 GG인 경우에는 만성 폐기능 장애 발생 위험도가 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 만성 폐기능 장애는 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 및 세기관지염으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징 으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 c) 단계의 염기 결정은 시퀀싱(sequencing), SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism), DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), DNA 마이크로어레이(microarray), PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), TDGS(Two-dimensional Gene Scanning), Taq-Man및 TOGATM로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Chin. Med. J., Vol. 118, No. 7, pp. 541~547 (2005)
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