KR100809102B1 - 서비빈 유전자를 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 이를이용한 폐암 감수성 예측 및 판단 방법 - Google Patents

서비빈 유전자를 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 이를이용한 폐암 감수성 예측 및 판단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서비빈 유전자를 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 이를 이용한 폐암 감수성 예측 및 판단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서비빈(survivin) 유전자의 다형성에 근거한 폐암 감수성 진단용 마커, 이를 이용한 폐암 감수성 진단키트, 마이크로어레이 및 폐암 감수성을 예측 및 판단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 마커는 폐암에 대한 감수성을 종합적으로 판단할 수 있을 뿐만 아니라 선암 또는 소세포암 각각에 대한 감수성을 예측할 수 있는 효과가 있다.
서비빈, 다형성, SNP, 감수성, 폐암

Description

서비빈 유전자를 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 이를 이용한 폐암 감수성 예측 및 판단 방법{Makers for the diagnosis of susceptibility to lung cancer using survivin gene and method for predicting and analyzing susceptibility to lung cancer using the same}
도 1a는 서비빈 유전자내에서 서비빈 유전자의 다형성들의 위치를 나타낸 그림이다.
도 1b는 서비빈 유전자가 가지는 다형성들의 위치, 부위, SNP 번호 및 민족별로 나타나는 대립인자의 빈도수를 나타낸 것이다.
도 2는 서비빈 유전자의 프로모터 부분과 -31C 및 -31G 대립인자의 전사활성도를 A549, H1299, HeLa 및 CHO 세포에서 루시퍼라제 분석을 통하여 나타낸 것이다.
본 발명은 서비빈 유전자를 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 이를 이용한 폐암 감수성 예측 및 판단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서비빈(survivin) 유전자의 다형성에 근거한 폐암 감수성 진단용 마커, 이를 이용한 폐암 감수성 진단키트, 마이크로어레이 및 폐암 감수성을 예측 및 판단하는 방법에 관한 것이다.
폐암의 발생원인 중에서 흡연이 폐암의 주요한 원인으로 꼽히고 있지만, 소수의 흡연자들에게서만 상기 질환이 나타나는 점을 감안하면, 발암으로 진행하게 하는 개인적 감수성에 있어서 유전적인 인자가 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 이러한 유전적 감수성은 발암원의 대사, DNA 손상의 복구 및 세포사멸에 관련된 유전자의 유전적 다형성에 기인하는 것으로 보인다(Shields, P. G. et al., J. Clin . Oncol ., 18, 2309-2315, 2000)
개체간의 유전적 차이는 개체간의 DNA 염기서열의 차이에 의해 초래되고 이러한 염기서열의 차이는 변이(mutation)와 다형성(polymorphism)으로 구분되는데, 다형성은 미세한 표현형의 차이(phenotypic change)를 초래하며 그 빈도가 인구의 1% 이상인 경우 다형성 유전형으로 정의된다.
단일염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)은 유전체(genome) 상에서 A,T,C,G 로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. 이러한 SNP의 2/3는 염기서열 중 C 와 T 간의 변이인 것으로 알려져 있고, SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타난다고 알려져 있다. 또한, SNP는 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있을 것이다. 나아가 개체의 유전적 특성에 적합한 진단 및 치료전략을 구사하는 맞춤의학(personalized medicine)에 이용될 수 있고, SNP 패턴과 질병기록을 잘 통합할 수 있다면 여러 가지 질병의 치료를 위한 의료 통계를 구축할 수 있을 것이다.
폐암의 유전적 감수성은 특정 유전자의 특정한 다형성에 의해 결정되기 보다는 여러 유전자에 존재하는 여러 가지 다형성들에 의해 결정된다. 폐암은 발암물질에 의해 유전적(genetic)인 결함, 후생적인(epigenetic) 유전자의 손상(DNA damage)또는 자발적인 세포의 죽음인 세포사멸(apoptosis)의 속도가 줄어들고 세포주기가 변하여 발생하는 것이므로 발암전구물질의 활성화(activation)와 해독화(detoxification)에 관여하는 유전자와 유전적인 결함 및 후생적인 변화에 관여하는 유전자, 세포사멸(apoptosis), 세포주기조절(cell cycle control) 및 손상된 유전자의 복구(DNA repair)에 관여하는 유전자 등 폐암에 관련된 유전자의 다형성들에 의해 폐암 발생이 결정될 것으로 생각된다.
따라서 폐암을 진단 및 예측하기 위한 방법으로 폐암에 관련된 유전자의 다 형성을 이용한 방법들이 개발되고 있는데, 이와 관련된 종래 기술로는 손상된 유전자의 복구에 관여하는 XPA(Xeroderma Pigmentosum group A) 유전자의 23A/G 다형성 및 XRCC1(X-ray repair cross-complementing group 1) 유전자의 Arg399Gln 다형성이 한국인에서 폐암의 유전적 감수성을 결정하며 폐암의 유전적 감수성을 진단할 수 있는 마커로 사용될 수 있다는 내용이 개시된 바 있고(Jae-Yong Park et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 11(1):23-27, 2002), 대한민국 공개특허 제2004-0099418호에는 DNA 메틸전이효소-3B(DNA-methyltransferase-3B) 유전자의 -283C/T 다형성과 -579G/T 다형성 및 이들 두 다형성에 의해 결정되는 일배체형(haplotype)이 한국인에서 폐암의 유전적 감수성을 진단하는 마커로 사용될 수 있다는 내용이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2005-0092815호에는 뉴클레오티드 절제복구 작용을 하는 단백질의 일종인 XPG(xeroderma pigmentosum group G) 유전자의 3705C/G 다형성을 이용하여 폐암에 대한 위험성을 진단하는 방법이 개시되어 있다.
그러나 앞서 언급한 바와 같이, 개개인의 폐암에 대한 유전적인 감수성은 여러 유전자에 존재하는 다수의 다형성들에 의해 결정되기 때문에 보다 효율적으로 폐암의 유전적 감수성을 진단하기 위해서는 폐암과 관련된 더 많은 다형성 유전자들의 발굴이 필요하다.
이에 본 발명자들은 세포사멸을 억제하는 IAPs(inhibitor of apoptosis) 단백질 족의 한 요소인 서비빈(survivin) 유전자의 다형성이 한국인에서 폐암의 유전 적 감수성을 진단하는데 사용될 수 있고, 또한 상기 서비빈(survivin) 유전자의 다형성을 종합적으로 분석하여 폐암의 유전적 감수성을 진단하는데 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서비빈(survivin) 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암 감수성 진단용 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 서비빈 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 폐암 감수성 진단용 키트 및 폐암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 폐암 감수성 마커를 이용하여 폐암의 감수성을 예측 및 판단 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 서비빈(survivin) 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암 감수성 진단용 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 서비빈 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 폐암 감수성 진단용 키트 및 폐암 진단용 마이크로어레이를 제공한다..
또한, 본 발명은 상기 폐암 감수성 진단용 마커를 이용하여 폐암 감수성 예 측 및 판단 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서비빈(survivin) 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암 감수성 진단용 마커를 제공함에 특징이 있다. 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기) G가 C로 치환되고 상기 479번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기) G가 A로 치환되고 상기 343번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 폐암 감수성 진단용 마커를 제공한다. 상기에서 번역(translation)시작점이란 공지된 서비빈의 게놈 DNA서열(Accession No. NT_010641)에서 번역개시 코돈인 ATG의 A(10136670번째)를 1로 한 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 서비빈(survivin) 다형성 유전자는
1) 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기) G가 C로 치환된 것으로 진뱅크에 공지된 서열(accession No. NT_010614)로서, 상기 NT_010614 서열 중 10136161~10136760번 서열을 서열번호 1로 나타내었 다. 한편, 상기의 다형성 부위를 ‘-31C>G'로 표시한다.
2) 서열번호 2의 125번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 염기) G 가 C로 치환된 것으로 진뱅크에 공지된 서열(accession No. NT_010614)로서, 상기 NT_010614 서열 중 10135921~10136760번 서열을 서열번호 2로 나타내었다. 한편, 상기의 다형성 부위를‘-625G>C’로 표시한다.
3) 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기) G가 A로 치환된 것으로 진뱅크에 공지된 서열(accession No. NT_010614)로서, 상기 NT_010614 서열 중 10145521~10146120번 서열을 서열번호 3으로 나타내었다. 한편, 상기의 다형성 부위를‘9194A>G’로 표시한다.
4) 서열번호 4의 298번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 염기) T가 C로 치환된 것으로 진뱅크에 공지된 서열(accession No. NT_010614)로서, 상기 NT_010614 서열 중 10146181~10146720번 서열을 서열번호 4로 나타내었다. 한편, 상기의 다형성 부위를‘9809T>C’로 표시한다.
본 발명에서 사용된 상기 “진단”이라는 용어는 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다. 또한 본 발명에서 용어 감수성(sensitivity)은 폐암에 대한 민감도, 즉 폐암 발생위험도의 증가 및 감소를 나타낸다. 그리고 본 발명에서 용어 “다형성(polymorphism)”이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대체적 대립형질의 발생을 의미한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두개의 대 립형질을 가진다.
본 발명의 진단용 마커를 이용하여 진단할 수 있는 폐암으로는 전체 폐암 일 수 있으며, 바람직하게는 선암 또는 소세포암일 수 있다.
본 발명자들은 한국인의 폐암 감수성 진단용 마커를 개발하기 위하여 서비빈(survivin) 유전자의 다형성(polymorphism)을 이용하였다. 상기 서비빈 유전자는 세포사멸을 유도하는 단백질 분해효소(caspase)의 활성을 직접적으로 억제하거나 또는 관련된 전사인자인 NF-kB의 활성을 조절하여 세포사멸을 억제하는 작용이 있는 것으로 알려진 IAPs(inhibitor of apoptosis) 단백질 족의 한 요소이다. 따라서 IAP의 한 요소인 서비빈 유전자가 암과 관련되어 있음이 밝혀지게 되었고, 상기 서비빈 유전자가 암의 진단 및 치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Ambrosini G, et al., Nat. Med ., 3(8):917-921, 1997).
따라서 본 발명자들은 폐암 발생에 관여하는 여러 유전자들 가운데 폐암 위험도와 관련이 있는 서비빈 유전자의 다형성을 발굴하였고(실시예 1 참조), 폐암 발생에 관여하는 유전자의 다형성과 폐암 위험도와의 관계를 폐암으로 진단받은 환자와 정상인을 대상으로 환자-대조군 연구(case control study)를 실시하여 환자군과 정상 대조군 간에 다형성의 대립형질 빈도를 조사하여 상관관계를 밝혔다. 그 결과, 서비빈 유전자에 8개의 다형성이 존재함을 확인하였고, 이 중에서 4개의 다형성(-625G>C : 서열번호 2의 125번째 염기, -31C>G : 서열번호 1의 479번째 염기, 9194A>G : 서열번호 3의 343번째 염기 및 9809T>C : 서열번호 4의 298번째 염기)을 사용하여 폐암과의 관련성을 조사하였다. 상기 4개의 다형성 중에서 -31C>G 및 9194A>G 다형성 유전자형의 분포가 전반적으로 폐암 환자군과 대조군에 있어서 상당한 차이가 있음을 확인할 수 있었고, 특히 -31G 대립인자를 가지고 있는 -31CG 다형성 및 -31GG 다형성 유전자의 분포가 선암과 소세포암에서 대조군과 현저한 차이(각각 P=0.02)를 보이는 것으로 나타났다(표 4 참조). 즉, 서비빈 유전자의 -31G형은 -31CC형에 비해 선암과 소세포암의 위험도가 낮게 나타났다.
한편 상기 4가지의 서비빈 다형성 중, 9194A>G 다형성의 경우, 9194GG 유전자형을 9194AA와 9194AG가 조합된 유전자형과 비교한 결과, 9194GG 유전자형이 전반적으로 폐암 발생 위험도가 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과들로부터 본 발명의 마커가 폐암 발생 위험도의 예측에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 하기 표의 일배체형을 갖는 것을 특징으로 하는 폐암 감수성 진단용 마커를 제공한다.
서비빈 유전자에서의 위치 서열번호에서의 위치 일배체형 1 일배체형 2 일배체형 3 일배체형 4 일배체형 5
번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G G G G C
번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 C C C G G
번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A A G A A
번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 T C T T C
상기 “일배체형(hyplotype)”은 개체로부터 단일 유전자에 대한 복수의 다형성 및 개체마다 상이한 다수의 다형성 부위에서 변이의 특정 조합을 말한다. 최 근 연구들에서는 질병과의 연관성을 예측하는데 있어서 단일 다형성 분석보다 일배체형 분석을 보다 상위에 두고 있다(Sun, T., et al., J. Natl . Cancer Inst ., 96, 1030-1036, 2004).
따라서 본 발명자들은 폐암 환자군에서 -625G>C, -31C>G, 9194A>G 및 9809T>C와 폐암 발생위험도 간의 상관관계를 밝힐 뿐 아니라. 상기 다형성들의 조합에 의한 일배체형과 폐암 발생 위험도 간의 상관관계를 알아보았다(실시예 4 참조). 그 결과, 서비빈 다형성의 일배체형 중, 상기 일배체형 1(GCAT) 및 일배체형 3(GCGT)은 폐암 발생 위험도가 증가된 것으로 나타났고, 반면 31G 대립유전자를 포함하고 있는 상기 일배체형 4(GGAT)는 대조군에 비해 모든 종류의 폐암에서 폐암 발생 위험도가 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 선암의 경우 폐암 발생 위험도가 매우 낮아졌음을 확인할 수 있었다(표 5 참조). 또한, 종양 조직학적인 분석에서 상기 일배체형 2(GCAC)는 소세포암의 발생 위험도가 증가된 것으로 나타났고, 상기 일배체형 5(CGAC)는 소세포암의 발생 위험도가 감소되는 것으로 나타났다. 따라서, 일배체형 1 또는 일배체형 3는 폐암 발생 위험도가 증가되는 것을 진단할 수 있는 마커로, 일배체형 4는 폐암 발생 위험도가 감소되는 것을 진단할 수 있는 마커로, 일배체형 2(GCAC)는 소세포암의 발생 위험도가 증가되는 것을 진단할 수 있는 마커로, 일배체형 5(CGAC)는 소세포암의 발생 위험도가 감소되는 것을 진단할 수 있는 마커로 유용하게 사용될 수 있다.
나아가 본 발명자들은 상기 서비빈의 일배체형들 중에서 31G 대립유전자를 포함한 상기 일배체형 4(GGAT)가 선암에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 상기 일배체형 4 이외의 다른 일배체형을 "기타(others)" 군으로 상기 일배체형과 선암과의 상관관계를 확인하였다. 그 결과, 선암 발생에 따른 일배체형의 효과는 적어도 하나 이상의 일배체형 4를 가지고 있는 군이 일배체형 4를 가지고 있지 않은 기타군 들에 비해 현저하게 선암 발생 위험도가 감소하는 것으로 나타났다(보정된 대응비=0.46, 95% CI=0.32-0.67, P<0.0001, 표 6 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 서비빈의 -31C>G 다형성이 서비빈(survivin) 유전자의 전사 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 -31C 및 -31G 대립유전자의 프로모터 활성을 폐암 세포인 A549 및 H1299 세포와 HeLa 및 CHO 세포에서 루시퍼라제 분석을 수행하여 조사하였다(실시예 6 참조). 그 결과, 폐암 세포인 A549 및 H1299 세포에서 -31G 대립유전자는 -31C 대립유전자에 비해 서비빈 프로모터의 활성이 현저하게 감소하는 것으로 나타났고(각각, P<0.05 및 P<0.01), HeLa 및 CHO 세포에서도 -31G 대립유전자가 -31C 대립유전자에 비해 서비빈 프로모터의 활성이 감소하는 것으로 나타났다(각각 P<0.001)(도 2 참조). 따라서 상기의 결과로, 서비빈 유전자의 다형성 중 -31G 대립유전자는 서비빈의 프로모터 활성을 억제하여 폐암 세포내에서 서비빈 유전자의 발현을 감소시킴으로써 폐암 발병 위험도를 감소시킴을 알 수 있었다.
본 발명은 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부 터 -31번째 염기) 또는 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기)를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 폐암 감수성 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.
상기 “증폭할 수 있는 프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응 (ligase chainreaction : LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 바람직하게 서 열번호 7 내지 8, 서열번호 15 내지 16 및 서열번호 23 내지 29로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폐암 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기) G가 C로 치환되고 상기 479번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기) G가 A로 치환되고 상기 343번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로를 포함하는 폐암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science, 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명의 폐암과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으 로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
나아가 본 발명은 폐암 감수성을 예측 및 판단하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로,
a) 검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기), 서열번호 2의 125번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 염기), 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기) 및 서열번호 4의 298번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 염기)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다형성 부위를 증폭하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 폐암 발생 위험도를 분석하는 단계를 포함하는 폐암 감수성 예측 및 판단 방법을 제공한다.
따라서 상기 c) 단계에서 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 폐암 감수성을 예측 및 판단하고자 할 때, 상기 c)단계에서 결정된 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째)의 유전자형이 CG 또는 GG인 경우에는 폐암 발생 위험도가 감소되는 것으로 판단할 수 있다.
또한, 상기 c)단계에서 결정된 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째)의 유전자형이 GG인 경우에는 폐암 발생 위험도가 증가되는 것으로 판단할 수 있다.
나아가, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 4인 경우에는 폐암 발생 위험도가 감소되는 것으로 판단할 수 있으며, 상기 폐암은 선암일 수 있다(표 5 참조).
위치 서열번호에서의 위치 일배체형 4
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 G
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 T
반면, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 1 또는 3인 경우에는 폐암 발생 위험도가 증가되는 것으로 판단할 수 있으며, 상기 폐암은 선암일 수 있다(표 5 참조).
위치 서열번호에서의 위치 일배체형 1 일배체형 3
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G G
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 C C
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A G
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 T T
또한, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 2인 경우에는 소세포암 발생 위험도가 증가하는 것으로 판단할 수 있으며, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 5인 경우에는 소세포암 발생 위험도가 감소하는 것으로 판단할 수 있다(표 5 참조).
위치 서열번호에서의 위치 일배체형 2 일배체형 5
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G C
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 C G
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A A
서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 C C
상기 방법 중 a)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 방법 중 c)단계의 염기 결정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 한정하지는 않는다.
< 실시예 1>
Survivin 유전자의 다형성 분석
서비빈(survivin) 유전자에 존재하는 유전학적인 차이(genetic variants)를 확인하기 위하여 실험에 동의한 27명의 건강한 한국인으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 게놈 DNA는 건강한 한국인의 말초 혈액 림프구를 채취한 뒤, 이를 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리를 통해 수득하였다. 상기 분리된 게놈 DNA 샘플은 5% 이상의 빈도를 가진 대립 유전자를 확인하기 위해 적어도 95%의 신뢰도에 의해 제공된 54개의 크로모좀을 포함하였다. 상기 서비빈 유전자 내의 유전학적 차이는 ABI PRISM 3700 유전학적 분석기(어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 이용하여 인트론-엑손의 경계부위(각각의 엑손의 양끝에서 100bp에 해당하는 인트론)를 포함하는 서비빈 유전자 내의 모든 엑손(엑손 1-4) 및 프로모터 부위(~ 1.0kb)를 시퀀싱 하였다. 상기 시퀀싱을 위한 프라이머 세트는 진뱅크에 공지된 서열(accession no. NT_010641)을 기초로 하여 디자인하였고, 사용된 프라이머의 염기서열을 하기 표 1에 기재하였다. 또한 서열간의 차이는 크로마토그램에 의해 분석하였다.
Figure 112006070985986-pat00001
그 결과, 서비빈의 3.4 kb 게놈 DNA 내에서 8개의 SNP를 확인할 수 있었고, 이 중 6개의 SNP는 공지된 것으로, 프로모터 부위에서 -644T>C(rs8073903), -625G>C(rs8073069) 및 -31C>G(rs17884799)이 확인되었고, 엑손 4에서 9194A>G(K129E, rs2071214), 3'-비번역부위에서 9386T>C(rs2239680) 및 9809T>C(rs1042489)이 확인되었으며, 3'-비번역부위에서 9974C>T 및 10347G>A의 신규한 SNP 2개를 확인할 수 있었다. 또한, 상기 27명을 대상으로 한 빈도 조사에서 서비빈의 8개의 SNP 중 -644T>C는 -625 G>C와 같은 패턴을 보였고, 신규한 2개의 SNP는 빈도가 낮게 나타났다. 따라서 본 발명자들은 상기 8개의 서비빈 SNP 중 4개의 SNP인 -625G>C, -31C>G, 9194A>G 및 9809T>C 만을 가지고 하기의 실험들을 수행하였다. 상기 서비빈 유전자에 존재하는 8개 SNP들의 위치는 도 1a에 나타내었고, 공지된 SNP 번호 및 대립인자들의 빈도수는 도 1b에 나타내었다.
< 실시예 2>
연구 대상의 선정 및 통계학적 분석
582명의 폐암 환자 및 582명의 건강한 성인을 대상으로 환자군-대조군 연구(case-control study)를 수행하였다. 세부적인 연구대상은 이전 논문에 기술된 바 있다(Lee, S. J., et al., Carcinogenesis, 26, 403-409, 2005; Lee, S. J., et al., Cancer Epidemiol. Biomark. Prev., 14, 571-575, 2005; Lee, G. Y., et al., Int. J. Cancer, 14, 571-575, 2005; 및 Jang, J. S., et al., Cancer Epidemiol. Biomark. Prev., 14, 2474-2480, 2005).
환자군은 경북대학교 병원(대한민국, 대구)에서 2001년 1월에서 2002년 6월 사이에 원발성 폐암으로 진단받은 모든 환자로 270명(46.4%)의 편평상피암(squamous cell carcinoma) 환자, 205명(35.2%)의 선암(adenocarcinoma) 환자, 97명(16.7%)의 소세포암(small cell carcinoma) 및 10명(1.7%)의 대세포암(large cell carcinoma) 환자로 구성되었다. 대조군은 동일한 기간 중에 경북대학교 병원 건강검진센터를 찾은 건강한 지원자로부터 임의로 선택되었고, 성별과 연령(± 5년)에 따라, 암환자와 프리퀀시 매치(frequency matched, 1:1) 되었다. 모든 환자군과 대조군은 한국인이었고 그들은 대구 광역시나 인근지역에 거주하고 있었다. 자세한 질문사항은 각 환자와 대조군을 대상으로 훈련된 면접자에 의해 완성되었고, 질문사항에는 하루 및 1년에 피우는 평균 담배수에 대한 내용이 포함되어 있었으며, 평생 동안 1년에 적어도 하루 이상 담배를 피운 사람을 흡연자로 정의하였다. 이전 흡연자(former smoker)는 폐암 진단(환자) 전에 또는 충분한 고지 후 동의한 날 이전에 적어도 1년 동안 담배를 끊었던 사람으로 정의되었다. 누적 담배량(팩-년수)은 다음의 식을 이용하여 계산하였고, 환자군-대조군의 연구 결과는 하기 표 2에 기재하였다.
흡연량 = (하루당 흡연한 담배갑 수) × (흡연기간)
변수 환자군(n=582) 대조군(n=582)
연령(년) 61.3±9.4 60.2±9.6
성별
남성 467(80.2)a 467(80.2)
여성 115(19.8) 115(19.8)
흡연상태b
현재 387(66.5) 297(51.0)
이전 85(14.6) 147(25.3)
비흡연 110(18.9) 138(23.7)
팩-년수c 40.0±17.7 34.1±17.8.8
a괄호안의 숫자는 백분율임
bP<0.001
c현재 및 이전의 흡연자, P<0.001
그 결과, 상기 표 2에서 나타난 바와 같이 평균 연령 및 성별 분포에서 환자군과 대조군 간에 큰 차이가 나지 않았으며, 이를 통해 같은 분포를 가지는 두 그룹을 사용하여 차이를 비교하는 것이 가능함을 알 수 있었다. 한편, 환자군은 대조군에 비해서 현재 흡연자의 비율이 더 높았고(P<0.001), 흡연자에서의 흡연량(팩-년수)도 환자군이 대조군에 비해 유의하게 높았다(40.0 ± 17.7 대 34.1 ± 17.8 흡연기간; P<0.001). 이러한 차이는 이후에 진행되는 다변량 분석(multivariate analyses)에 의해 조절되었다.
< 실시예 3>
Survivin 다형성과 폐암과의 상관관계 분석
<3-1> FRET에 의한 유전자형 분석
상기 실시예 2에서 선정된 대조군 및 실험군으로부터 말초 혈액 림프구를 채취한 뒤, 이를 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리를 통해 게놈 DNA를 수득하였다. 수득한 게놈 DNA는 FRET(fluorescent resonance energy transfer) 분석법(Parks, S. B. et al., Am. J. Clin . Pathol ., 115, 439-447, 2001 참조)을 통해 유전자형을 분석하였다. 상기 유전자형의 분석은 상기 실시예 1에서 확인된 서비빈(survivin)의 8개 SNP 중 4개의 SNP인 -625G>C(rs8073069), -31C>G(rs17884799), 9194A>G(K129E, rs2071214) 및 9809T>C(rs1042489)에 대해 빈도, 연관 비평형 현상(LD) 및 일배체형 표지 현상을 비교하였다. 상기 FRET 분석법에 의한 유전자형 분석에서 PCR 증폭 및 멜팅 커브(melting curve) 분석은 LightCycler 480(로체 진단 회사, 독일)을 이용하여 수행하였고, 모든 PCR 반응은 각각의 프라이머 (5 pmol) 0.5㎕, 혼성화 프로브인 도너 프로브 (2 pmol) 0.5㎕, 앵커 프로브 (2 pmol) 1㎕, 게놈 DNA (5ng/㎕) 1㎕, LightCycler 480 제노타이핑 마스터 믹스(로체 진단 회사, 독일) 1㎕ 및 증류수 1㎕를 혼합하여 상기 회사에서 제공하는 실험방법에 따라 PCR을 수행하였다. 각각의 혼성화 프로브 쌍은 2개의 올리고뉴클레오티드, 즉, 억셉터 플르오포어(acceptor flourphore)인 LightCycler LC Red 640이 5‘말단에 표지된 앵커 프로브(anchor probe) 및 도너 플르오포어(donor flourphore)인 플루오레세인(fluorescein)이 3‘말단에 표지된 센서 프로브(sensor probe)로 구성되어 있다. 단, -31C>G 및 9194A>G의 앵커 프로브(서열번호 25, 26 및 29)는 정방향 프라이머의 역할도 하기 때문에 3‘말단에 인산화가 되어있지 않고, LC Red 640 표지도 3‘말단에 있는 ‘TTT’염기 앞에 위치하고 있다. 상기 PCR 증폭을 위해 사용한 각각의 프라이머 염기서열은 하기 표 3에 기재하였으며, LC Red 640 프로브로부터 억셉터 플르오포어의 방출된 형광의 크기를 기록하였다.
상기 FRET 방법에 의해 98% 성공률을 얻을 수 있었고, 이 이하의 점수를 보인 샘플들에 대해서는 ABI PRISM 3700 유전학적 분석기(어플라이드 바이오시스템사)를 이용하여 다시 genotyping을 수행하였다. 또한, 정확한 결과를 도출하기 위하여 시료의 약 10%는 임의로 다시 다른 사람에 의해 유전자형을 분석하게 한 결과, 원래의 검사자가 실시한 분석결과와 100% 일치하였다.
Figure 112006070985986-pat00002
a 3' 말단에 플루오레세인(fluorescein)이 표지된 센서 프라이머.
b 5' 말단에 LightCycler LC Red 640이 표지된 앵커 프라이머, 단 -31C>G 및 9194A>G의 앵커 프로브(서열번호 25, 26 및 29)는 3’말단의 TTT 염기 바로 앞에 LC Red 640이 표지되어 있음.
<3-2> 통계학적 분석
상기 실시예 2에서 대조군 및 환자군으로부터 서비빈(survivin)의 4가지 SNP의 유전자형을 통계 분석을 통해 비교하였다. 환자군과 대조군은 연속변수에 대해서는 Student's t-테스트를 사용하여 비교하였고, 카테고리별 변수에 대해서는 χ2 테스트를 사용하여 비교하였다. 개체에서 관찰된 유전자형의 빈도와 예상되는 유전자형의 빈도를 적합도 검정(goodness-of-fit) χ2 테스트를 사용하여 1 자유도(one degree of freedom)로 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에 부합되는지 조사하였다. 서비빈(survivin) 유전자의 다형성 중 연관 비평형(linkage disequilibrium, LD)계수는 SAS 유전학 소프트웨어(SAS사, 미국)를 사용하여 계산하였다. 일배체형과 그 빈도수는 상 프로그램(Phase program)을 사용하여 바예시안 알고리즘(Bayesian algorithm)에 바탕을 두고 측정하였다(Stephens, M., et al., Am. J. Hum. Genet., 68, 978-989, 2001). 상기 상 프로그램에 의한 예측된 일배체형을 다시 한번 확인하기 위하여 Schaid 등에 의해 개발된 하플로 통계 프로그램(Haplo. stats program)을 사용하였다. 유전자형 및 일배체형과 연관된 폐암 발생위험도는 비-조건적 로지스틱 회귀분석(logistic regression analysis)을 이용하여 대응비(odds ratio, OR)및 95% 신뢰구간(confidence interval, CI)으로 평가하였고, 가능한 교란변수(confounders, 명목상 변수로는 성별; 연속변수로는 연령 및 흡연량)에 대해서는 본래의 OR과 조정된 OR로 계산하였다. 또한, 각 계층간에 있어서 폐암의 위험도 및 서비빈(survivin)의 유전자형/일배체형 사이의 관계를 더 조사하기 위하여 개체군의 나이, 성별, 흡연 상태 및 종양 조직학에 따라 통계학적 분석을 수행하였다. 두개의 다형성 중 어떠한 하나가 암 발병 원인과 연관되어 있는지 확인하기 위하여 3가지의 다른 로지스틱 회귀 모델(각각의 다형성 하나씩 및 두 다형성의 조합)을 사용하였다. 다중비교(multiple comparison)시, 교정된 P-값(Pc-값)은 본페로니의 부등식법(Bonferroni's inequality method)을 사용하여 계산하였다. 상기 모든 분석은 윈도우 프로그램을 위한 Statistical Analysis Software version 8.12(SAS사, 미국)를 사용하여 수행하였다.
그 결과, 상기와 같은 실험에 의해 대조군과 환자군에서 상기 4가지의 서비빈(survivin) 다형성들의 유전자형 및 다형성 대립인자들의 빈도를 하기 표 4에 나타내었고, 대조군에서 4가지 다형성의 유전자형 분포는 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에 부합되어 본 실험의 결과가 적절함을 확인하였다. 본 발명의 대조군인 582명의 건강한 한국인의 상기 4가지의 서비빈(survivin) 다형성, 즉, -625G>C, -31C>G, 9194A>G 및 9809T>C들의 상이한 대립유전자의 빈도는 SNP 데이타 베이스의 빈도와 차이(-625G>C : 0.285, -31C>G : 0.491, 9194A>G : 0.224 및 9809T>C : 0.424)를 보였고(도 1b 참조), 서비빈의 -31C>G 다형성 유전자형의 분포는 전반적으로 폐암 환자군의 경우와 대조군에서 현저한 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 종양 조직학에 따른 폐암의 경우를 분류했을 때, 특히, 선암 및 소세포암에서 -31C>G 다형성 유전자형의 분포가 대조군과 현저한 차이(각각 P=0.02)를 보이는 것으로 나타났다.
구체적으로 폐암의 위험도에 있어서 상기 4가지 다형성들의 영향을 확인한 결과, 적어도 하나의 -31G 대립 유전자를 가진 환자군이 -31CC형을 가진 환자군에 비해서 폐암 발생의 위험도가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(상이한 -31G 대립 유전자의 우성 모델; 보정된 대응비=0.74, 95% CI=0.57-0.96, P=0.02). 종양 조직학에 따른 폐암의 경우를 분류했을 때에도 상기 -31G 대립 유전자가 -31CC 유전자형에 비해 선암 및 소세포암의 발생 위험도가 현저하게 감소하는 것과 관련이 있는 것으로 나타났다(각각 보정대응비=0.59, 95% CI=0.41-0.84, P=0.03 및 보정대응비=0.61, 95% CI=0.38-0.98, P=0.04).
한편, 9194A>G 다형성의 경우, 9194GG 유전자형은 9194AA와 9194AG가 조합된 유전자형(상이한 9194G 대립 유전자의 열성 모델)과 비교했을 때, 전반적인 폐암 발생위험도가 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 종양 조직학에 따른 폐암의 경우를 분류했을 때 9194GG 유전자형의 암 발생 위험 효과는 단지 선암에서만 나타났다(보정된 대응비=2.00, 95% CI=1.05-3.82, P=0.04).
Figure 112006070985986-pat00003
< 실시예 4>
Survivin 다형성의 일배체형 분포와 폐암과의 상관관계
본 발명자들은 서비빈의 4가지 다형성인 -625G>C, -31C>G, 9194A>G 및 9809T>C와 폐암 발생위험도 간의 상관관계를 밝힐 뿐 아니라. 상기 다형성들의 일배체형과 폐암 발생 위험도 간의 상관관계를 알아보았다. 상기 다형성들로 이루어 질수 있는 16가지의 일배체형 중에서 1% 미만의 빈도를 보인 9개의 일배체형은 제외시킨 후, 나머지 5개의 일배체형에 대해서 분석을 진행하였고 상기 5개의 일배체형은 1164 개체(환자군의 96.7% 및 대조군의 97.2%)로부터 수득한 97%의 염색체에 대한 분석을 수행하였다. 각각의 일배체형에 있어서의 보정된 대응비(OR) 및 95% 신뢰구간(CI)은 다른 조합된 모든 일배체형과 비교함으로써 결정되었고 그 결과를 하기 표 5에 기재하였다.
Figure 112006070985986-pat00004
a 상기 다형성의 순서는 다음과 같다: -625G>C, -31C>G, 9194A>G 및 9809T>C
b 1% 미만의 빈도수를 나타낸 9개의 일배체형은 분석에서 제외시켰다.
c 8개의 대세포암의 경우도 분석에서 제외시켰다.
d 모든 조합된 일배체형과 비교된 각 일배체형의 보정된 대응비(OR) 및 신뢰도(CI)를 나타내었다. 조정된 나이, 성별 및 흡연의 팩-년.
e P=0.04 및 본페로니의 P-value(Pc)=0.20.
f P=0.0004 및 Pc=0.002.
그 결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이 상기 5개의 서비빈 다형성의 일배체형 분포는 대조군과 차이를 보이고 있었으며, 특히, 31G 대립유전자를 포함한 GGAT 일배체형은 대조군에 비해 모든 종류의 폐암 발생 위험도가 22.0%에서 18.8%로 감소된 것을 확인할 수 있었고, 특히, 선암의 경우 13.7%로 폐암 발생 위험도가 매우 낮아졌음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 상기 실시예 3의 유전자형 분석 결과와 동일하게 다른 일배체형들과 비교하여 31G 대립유전자를 포함한 GGAT 일배체형(ht4)이 선암 및 소세포암의 발생 위험도를 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다(보정대응비=0.56, 95% CI=0.40-0.77, P=0.004 및 본페로니 정확한 P-value(Pc)=0.002). 반면, GCAT(ht1) 및 GCGT(ht3) 일배체형은 폐암 발생 위험도가 각각 15.0% 및 21.8%에서 17.1% 및 23.0%로 증가한 것을 확인할 수 있었고, 특히, 종양 조직학적 분석의 결과, GCAT 및 GCGT 일배체형이 선암에 있어서 발생 위험도가 매우 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, GCAC 일배체형(ht2)의 경우에는 소세포암 발생 위험도가 13.2%에서 16.8%로 증가하는 것으로 나타났으며, CGAC 일배체형(ht5)의 경우에는 소세포암의 발생 위험도가 27.9%에서 25.7%로 감소하는 것으로 나타났다.
< 실시예 5>
선암 발생에 따른 GGAT 일배체형의 효과
본 발명자들은 상기 서비빈의 일배체형 중 GGAT 일배체형(ht4)이 폐암의 종류 중 특히 선암에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여, ht4 이외의 다른 일배체형을 "기타(others)" 군으로 묶고 3개의 군으로 분류하였다[예) 기타/기타; ht4/기타; 및 ht4/ht4]. 통계적인 분석은 상기 실시예 4와 동일하게 수행하였으며 각각의 일배체형에 있어서의 보정된 대응비(OR) 및 95% 신뢰구간(CI)는 다른 조합된 모든 일배체형과 비교함으로써 결정되었다.
상기와 같이 분류한 일배체형들의 선암 발생에 따른 효과는 적어도 하나 이상의 ht4를 가지고 있는 일배체형이 기타/기타 군에 비해 현저하게 선암 발생 위험도가 감소하는 것으로 나타났다(보정된 대응비=0.46, 95% CI=0.32-0.67, P<0.0001, 표 6 참조).
선암의 위험도에 있어서 일배체형 GGATa의 효과
대조군(n=582) 선암 환자군(n=205)
GGAT(ht4) no.(%) no.(%) 조정된 대응비b(95% CI)
기타C/기타 360(61.9) 160(78.1) 1.00
ht4/기타 197(33.9) 40(19.5) 0.47(0.32-0.70)d
ht4/ht4 25(4.3) 5(2.4) 0.39(0.14-1.06)
P-value 0.0001
기타/기타 360(61.9) 160(78.1) 1.00
ht4/기타+ht4/ht4 222(38.1) 45(21.9) 0.46(0.32-0.67)e
P-value <0.0001
a 다형성의 순서:-625G>C, -31C>G, 9194A>G 및 9809T>C
b 조정된 나이, 성별 및 흡연의 팩-년.
C GGAT를 제외한 다른 일배체형.
d P=0.0002 및 본페로니의 P-value=0.0004.
e P<0.0001.
< 실시예 6>
전사활성 분석
본 발명자들은 -31C>G 다형성이 서비빈(survivin)의 전사 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 -31C 및 -31G 대립유전자의 프로모터 활성을 루시퍼라제 분석에 의해 하기와 같이 조사하였다.
먼저, 서비빈 프로모터 부위(-444부터 +77, 엑손1의 전사 시작점을 +1로 함)에서 -31C>G 다형성 부위에 해당하는 521bp의 절편을 합성하기 위하여 -31C 또는 -31G 대립유전자를 포함하는 공여자로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다.
상기 PCR은 KpnI 제한효소 사이트를 포함하는 하기에 기재된 서열번호 34의 정방향 프라이머 및 XhoI 제한효소 사이트를 포함하는 서열번호 35의 역방향 프라이머를 사용하였다. PCR 증폭 조건은 DNA 중합효소(Taq polymerase, Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초간 35회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장(extension)시켜 반응을 종결하였다. PCR 산물들은 KpnI 및 XhoI 로 처리하여 상기 동일한 제한효소로 처리한 pGL3-기본(basic) 플라스미드(Promega사)의 루시퍼라제(luciferase) 유전자 상류에 각각 삽입한 후, DNA 서열분석을 통하여 이로부터 수득한 클론들에 상기 PCR 산물이 정확하게 삽입되었는지를 확인하였다.
프로모터 활성은 Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega사)을 사용하여 폐암세포인 A549 및 H1299 세포와 HeLa 및 CHO 세포에서 측정하였다. 상기 H1299 세포와 A549 세포는 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)에서 배양하였고, HeLa 세포는 DMEM 배지에서 배양하였으며, CHO 세포는 MEM 배지를 이용하여 배양하였다. 상기 배지에는 10% 열-비활성화 우태아 혈청이 첨가되어 있었고, 상기 세포들은 형질도입 시 60% 정도가 되도록 형질도입 하루 전날에 6-웰(well) 플레이트에 1 × 105 의 양으로 세포를 접종하였다. 이후, pRL-SV40 플라스미드 및 서비빈 프로모터 부위에 해당하는 절편을 포함하는 pGL3-기본 플라스미드를 Lipofectine reagent(Invitrogen)를 이용하여 세포에 도입하였다. Renilla 루시퍼라제를 항상 발현(constitutive expression)하는 pRL-SV40 벡터는 형질전환의 차이를 교정하고 효율을 높이기 위하여 내부 대조군으로 사용하였다.
형질전환 48 시간 후에 세포를 회수하여 제조사의 지침에 따라 듀얼 루시퍼라제 리포터 머세이 시스템(Dual Luciferase Reporter Assay System, 프로메가사)로 세포 파쇄액을 준비하였다. 루시퍼라제 활성은 Lumat LB953 루미노미터(EG & G Berthhold)를 사용하여 측정하였고 그 결과는 Renilla 루시퍼라제의 활성을 사용하여 표준화시켰다. 독립적인 세번의 실험을 4회씩 수행하였고 그 결과는 평균 표준편차로 나타내었다.
서열번호 34 : 정방향 프라이머
5'-CGGGGTACCTAGTTGGGATTACAGGCATGC -3'
서열번호 35 : 역방향 프라이머
5'-CCGCTCGAGGGCCAGTTCTTGAATGTAGAGA-3
그 결과, A549 및 H1299 세포에서 -31G 대립유전자는 -31C 대립유전자에 비해 서비빈 프로모터의 활성이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(각각, P<0.05 및 P<0.01). 또한 HeLa 및 CHO 세포에서도 -31G 대립유전자가 -31C 대립유전자에 비해 서비빈 프로모터의 활성이 감소하는 것으로 나타났다(둘다 P<0.001)(도 2 참조). 따라서 상기의 결과로 서비빈 유전자의 다형성 중 -31G 대립유전자는 서비빈의 프로모터 활성을 억제하여 폐암 세포내에서 서비빈 유전자의 발현을 감소시킴으로써 폐암 발병 위험도를 감소시킴을 알 수 있었다.
본 발명의 서비빈(survivin) 유전자의 다형성에 근거하여 폐암 감수성을 종합적으로 판단하는 폐암 진단용 마커, 진단키트, 마이크로어레이 및 폐암 감수성을 예측 및 판단 방법은 폐암에 걸릴 유전적 소인을 가려내어 폐암에 걸릴 위험도를 알아냄으로써 폐암을 예측하고 판단하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
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Claims (15)

  1. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기) G가 C로 치환되고 상기 479번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기) G가 A로 치환되고 상기 343번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 폐암 감수성 진단용 마커.
  2. 하기 표의 일배체형 1 내지 일배체형 5로 이루어진 군에서 선택된 일배체형을 갖는 것을 특징으로 하는 폐암 감수성 진단용 마커.
    서비빈 유전자에서의 위치 서열번호에서의 위치 일배체형 1 일배체형 2 일배체형 3 일배체형 4 일배체형 5 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G G G G C 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 C C C G G 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A A G A A 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 T C T T C
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폐암은 선암 또는 소세포암인 것을 특징으로 하는 폐암 감수성 진단용 마커.
  4. 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기) 또는 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기)를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 폐암 감수성 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 7 내지 8, 서열번호 15 내지 16 및 서열번호 23 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
  6. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기) G가 C로 치환되고 상기 479번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기) G가 A로 치환되고 상기 343번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폐암 진단용 마이크로어레이.
  7. a) 검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;
    b) 상기 a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기), 서열번호 2의 125번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 염기), 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기) 및 서열번호 4의 298번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 염기)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다형성 부위를 증폭하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 폐암 발생 위험도를 분석하는 단계를 포함하는 폐암 감수성 예측 및 판단 방법.
  8. 제7항에 있어서, c)단계에서 결정된 서열번호 1의 479번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 염기)의 유전자형이 CG 또는 GG인 경우에는 폐암 발생 위험도가 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, c)단계에서 결정된 서열번호 3의 343번째 염기(survivin 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 염기)의 유전자형이 GG인 경우에는 폐암 발생 위험도가 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 4인 경우에는 폐암 발생 위험도가 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
    위치 서열번호에서의 위치 일배체형 4 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 G 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 T
  11. 제7항에 있어서, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 1 또는 3인 경우에는 폐암 발생 위험도가 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
    위치 서열번호에서의 위치 일배체형 1 일배체형 3 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G G 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 C C 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A G 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 T T
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 폐암이 선암인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 2인 경우에는 소세포암 발생 위험도가 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
    위치 서열번호에서의 위치 일배체형 2 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 G 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 C 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 C
  14. 제7항에 있어서, 상기 c)단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 5인 경우에는 소세포암 발생 위험도가 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
    위치 서열번호에서의 위치 일배체형 5 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -625번째 서열번호 2의 125번째 C 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 -31번째 서열번호 1의 479번째 G 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9194번째 서열번호 3의 343번째 A 서비빈 유전자의 번역시작점으로부터 9809번째 서열번호 4의 298번째 C
  15. 제7항에 있어서, 상기 c)단계의 염기 결정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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