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1. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Asthma
ist eine chronische Lungenerkrankung, die durch Husten, Engegefühl in der
Brust, Kurzatmigkeit und Keuchen aufgrund einer reversiblen Blockierung
des Luftstroms gekennzeichnet ist, die die Folge einer Entzündung und
Hyperreaktivität
der Atemwege ist. Bei sensibilisierten Individuen kann die Inhalation
von Allergenen eine Entzündung
der Auskleidung der Atemwege verursachen und ein Aufflammen von
Asthma herbeiführen.
Asthma kann auch als Folge anderer Entzündungsreize auftreten, wie
etwa Infektionen der Atemwege. Individuen, die eine Sensibilisierung
für spezifische
Nahrungsmittel entwickelt haben, können ernstliche und möglicherweise
lebensbedrohliche Reaktionen auf die Aufnahme dieser Substanzen
hin erfahren. Asthma, das einmal für eine "einfache" Überempfindlichkeitsreaktion
gehalten wurde, ist heutzutage als ein komplexer Zustand mit einem
möglichen
Spektrum von Ursachen und beitragenden Faktoren bekannt, von denen
eine Atemwegsentzündung
das zentrale Merkmal darstellt. Lungenforscher vergleichen es mit
Arteriosklerose insofern, als viele interaktive Aspekte vorliegen.
Viele der beitragenden Faktoren werden derzeit intensiv untersucht,
einschließlich
der chemischen Reaktionen, die im asthmatischen Prozess stattfinden;
der Natur der Zell-Zell-Kommunikation, des Weges, auf dem Information
von einer Zelle oder Typ von Zelle zu einer/m anderen übertragen
wird; und der Rolle, einer reaktiven oder anderen, des Epithels.
Allergien tragen sowohl zum Auftreten als auch dem Schweregrad der
asthmatischen Symptome bei. Eine Allergie (auch bekannt als unmittelbare Überempfindlichkeit)
ist als eine abnormale Empfindlichkeit gegenüber einer Substanz definiert,
die normalerweise toleriert und allgemein als harmlos erachtet wird,
und für
die das auslösende
Ereignis Dosis-unabhängig
ist, im Gegensatz zu einer Dosis-abhängigen idiosynkratischen Reaktion
auf eine Substanz. Zwar treten alle Immunreaktionen als eine Folge
der Exposition an Fremdsubstanzen hin auf, doch sind allergische
Reak tionen von der schützenden
oder erhöhten "Immunität" verschieden, die
durch Immunisierungen oder natürliche
Infektion verliehen wird. Lediglich etwa ein Viertel der Kinder
mit Asthma wachsen aus dem Zustand heraus, wenn ihre Atemwege eine
ausgewachsene Größe erreichen;
für den
Rest stellt der Zustand eine lebenslange Tortur dar. Der Zustand
besteht gemäß einem
Forschungsbericht, der von der American Lung Association veröffentlicht
wurde, bei 85 Prozent der Frauen und bei 72% der Männer fort
(Journal of Allergy and Clinical Immunology, Bd. 96:5 11/96).
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Im
Jahr 1993 wurden in den Vereinigten Staaten alleine 4.964 Todesfälle durch
Asthma verzeichnet. Das Vorkommen von Mortalität durch Asthma bei Kindern
verdoppelte sich von 1980 bis 1993. Unter den Personen im Alter
von 15 bis 24 Jahren nahm die Anzahl der Todesfälle von 2,5 Fällen pro
Million im Jahre 1980 auf 5,2 Fälle
pro Million im Jahre 1993 zu. Im Jahre 1993 war Asthma für 342 Todesfälle und
etwa 198.000 Krankenhausaufnahmen von Personen in einem Alter unter
25 Jahren verantwortlich.
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Auf
Afroamerikaner entfallen 21 Prozent der Todesfälle aufgrund von Asthma. Bei
afroamerikanischen Kindern ist die Wahrscheinlichkeit, an Asthma
zu sterben, viermal so hoch wie bei kaukasischen Kindern. Afroamerikanische
Männer
im Alter von 15 bis 24 unterliegen dem höchsten Risiko einer Mortalität.
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Eine
positive Familiengeschichte stellt tendenziell einen der höchsten Risikofaktoren
in Verbindung mit Asthma dar. Eine positive Identifizierung kann
jedoch schwierig sein. Asthma kann gemeinsam mit anderen Bedingungen,
wie etwa angeborenen Abnormalitäten,
infektiösen
Zuständen
und zystischer Fibrose vorliegen. Weitere Indikatoren werden in
Erwägung
gezogen, wenn die Geschichte atypisch ist oder das Ansprechen auf eine
gute medizinische Behandlung schlecht ist. Mediziner mit geringerer
Erfahrung in der Handhabung dieser Erkrankung behandeln diese Symptome
möglicherweise
als eine Infektion, ohne zu erkennen, dass die zugrundeliegende
Ursache Asthma ist.
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Die
Identifizierung von Asthma bei Kindern beruht stark auf den Beobachtungen
der Eltern von klinischen Hinweisen. Eine korrekte Identifizierung
erfordert einen Asth ma- und Allergiespezialisten, der die Einzigartigkeit
des Asthmas bei Kindern erkennt. Subtilere Anzeichen von Asthma,
wie etwa ein Engegefühl
in der Brust, können übersehen
werden, insbesondere bei Kindern. Wiederkehrende oder konstante
Hustenanfälle können die
einzigen häufig
anzutreffenden beobachtbaren Symptome von Asthma bei kleinen Kindern
sein. Dennoch kann der Nachweis einer günstigen klinischen Reaktion
auf eine Bronchospasmolytikum-Therapie darin hilfreich sein, das
Vorhandensein von Asthma zu bestätigen.
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Es
besteht ein enormer Bedarf nach einer frühen Identifizierung jener Personen,
die generell für
Asthma anfällig
sind. Da COAD im unbehandelten Zustand eine chronische und progressive
Erkrankung ist, würde eine
frühe Identifizierung
die Verabreichung einer entsprechenden Behandlung zu dem frühestmöglichen
Stadium erleichtern und somit die Wahrscheinlichkeit eines positiven
Ergebnisses erhöhen.
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2. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung Assays zum Bestimmen der Anfälligkeit
einer Person für
die Entwicklung von Asthma bereit. Bei einer anderen Ausführungsform
umfasst die Methode den Schritt des Genotypisierens einer Nukleinsäure-Probe,
die aus dem Blut, Speichel, Haut oder Haar der Person erhalten ist,
um zumindest ein Allel eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps
zu bestimmen, des Nachweisens zumindest des IL-1B-Alleis 2 (–511), enthaltend
ein T an der IL-1B-Base –511,
oder des IL-1B-Alleis 2 (+3954), enthaltend ein T an der IL-1B-Base
+3954, in der Probe, wobei der Nachweis des Allels anzeigt, dass
der Patient ein erhöhtes
Risiko einer Anfälligkeit
für die
Entwicklung von Asthma aufweist.
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Zum
Beispiel kann ein Allel eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps
nachgewiesen werden durch: 1) Vornehmen einer Hybridisationsreaktion
zwischen der Nukleinsäure-Probe
und einer Sonde oder Sonden, die zur Hybridisierung an ein Allel
eines IL-1-Haplotyps in der Person fähig ist/sind; 2) Sequenzieren
zumindest eines Abschnitts von zumindest einem Allel eines IL-1-Haplotyps;
oder 3) Bestimmen der elektrophoretischen Mobilität zumindest
eines Allels eines IL-1-Haplotyps oder einer Komponente davon. Bei
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
wird eine Komponente eines IL-1-Haplotyps einem Amplifikationsschritt
vor der Durchführung
des Nachweisschritts unterzogen. Bevorzugte Amplifikationsschritte
werden ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus: der Polymerase-Kettenreaktion (PCR),
der Ligase-Kettenreaktion (LCR), der Strangverdrängungsamplifikation (SDA),
der Klonierung und aus Variationen der obigen (z. B. RT-PCR und
Allel-spezifische Amplifikation). Bei einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
wird die Probe mit einem Satz von Primern hybridisiert, die 5' und 3' an eine Sense- oder
Antisense-Sequenz des Allels des IL-1-Haplotyps hybridisieren, und
wird einer PCR-Amplifikation unterzogen.
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Ebenfalls
beschrieben sind Kits zur Durchführung
der oben beschriebenen Assays. Der Kit kann eine DNA-Probennahme-Vorrichtung
und eine Vorrichtung zur Bestimmung zumindest eine Allels eines
IL-1-Haplotyps der Person enthalten. Der Kit kann außerdem Kontrollproben
oder Standards umfassen.
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Die
unter Anwendung der hierin beschriebenen Assays und Kits erhaltene
Information (alleine oder in Verbindung mit der Information zu einem
anderen genetischen Defekt oder Umweltfaktor, der zu der chronischen
obstruktiven Atemwegserkrankung beiträgt) ist zur Vorhersage dessen
nützlich,
ob eine Person wahrscheinlich eine chronische obstruktive Atemwegserkrankung
entwickeln wird. Außerdem
erlaubt die Information alleine oder in Verbindung mit der Information
zu einem anderen genetischen Defekt, der zu der chronischen obstruktiven
Atemwegserkrankung beiträgt
(das genetische Profil der chronischen obstruktiven Atemwegserkrankung)
eine Anpassung der Therapie an das genetische Profil des Individuums.
Diese Information kann beispielsweise einen Arzt dazu befähigen: 1)
effektiver ein Arzneimittel zu verschreiben, das sich auf die molekulare
Basis der Kaskade richtet, die zu der chronischen obstruktiven Atemwegserkrankung
führt;
und 2) die geeignete Dosierung eines bestimmten Arzneimittels für den jeweiligen
Patienten besser zu bestimmen. Die Möglichkeit, Patientenpopulationen
anzuzielen, die erwartungsgemäß den höchsten klinischen
Nutzen zeigen werden, kann ermöglichen:
1) die Repositionierung auf dem Markt befindlicher Arzneimittel
mit enttäuschenden
Marktergebnissen; 2) die Rettung von Arzneimittel-Kandidaten, deren
klinische Entwicklung als Folge von Sicherheits- oder Wirksamkeits-Einschränkungen,
die für
eine Untergruppe von Patien ten spezifisch sind, eingestellt worden
ist; und 3) eine beschleunigte und preiswertere Entwicklung von
Arzneimittel-Kandidaten und eine optimalere Arzneimittel-Kennzeichnung.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung und den Ansprüchen
offensichtlich werden.
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3. KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die DNA-Sequenz des humanen IL-1A-Gens (Gen Bank Zugriffs-Nr. X03833).
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2 zeigt
die DNA-Sequenz des humanen IL-1B-Gens (GenBank Zugriffs-Nr. X04500).
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3 zeigt
die DNA-Sequenz des humanen IL-1-RN-Gens (GenBank Zugriffs-Nr. X64532).
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4. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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4.1 Definitionen
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Der
Bequemlichkeit halber ist die Bedeutung bestimmter Begriffe und
Ausdrücke,
die in der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen im
Anhang verwendet werden, nachstehend angegeben.
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Der
Begriff "Allel" bezieht sich auf
alternative Formen eines Gens bei einem bestimmten Marker. Weist eine
Person zwei identische Allele auf, so wird die Person als homozygot
bezeichnet. Weist eine Person zwei verschiedene Allele auf, so wird
die Person als heterozygot bezeichnet.
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"Chronische obstruktive
Lungenerkrankung" oder "chronische obstruktive
Atemwegserkrankung" (COAD)
sind Begriffe, die zur Beschreibung eines Komplexes von Zuständen verwendet
werden, denen eine Einschränkung
oder Blockierung des Luftstroms gemeinsam sind. COAD umfasst Asthma,
Emphysem, chronische Bronchitis und chronische Bronchiolitis. Die
Stellen der Atemwegs-Blockade bei COADs variieren von den oberen
Atemwegen bis zu den periphersten Bronchiolen. Die exakte Ursache
der meisten Erkrankungen der Atemwege ist nicht gut verstanden.
Die Definitionen der Atemwegserkrankungen tragen zu der Verwirrung bei.
Die chronische Bronchitis ist durch das chronische Vorhandensein
von Husten und Auswurfproduktion klinisch definiert. Ein Emphysem
dagegen ist anatomisch auf der Grundlage des Abbaus von Lungengewebe
und der Vergrößerung der
Alveolensäcke
definiert. COADs weisen allesamt eine Atemwegsverengung als einen Krankheitsparameter
auf und teilen sich außerdem
eine Entzündung
als einer Komponente des Erkrankungsprozesses.
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"Genotypisieren" bezieht sich auf
die Analyse der genomischen DNA eines Individuums (oder einer dieser
entsprechenden Nukleinsäure),
um eine bestimmte Erkrankung zu identifizieren, die eine Mutation
oder Polymorphismus verursacht oder dazu beiträgt, direkt oder basierend auf
der Detektion einer Mutation oder eines Polymorphismus (eines Markers),
der in Verknüpfungs-Ungleichgewicht
mit dem die Erkrankung verursachenden oder dazu beitragenden Gen
ist.
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Der
Begriff "Haplotyp" bezieht sich auf
einen Satz von Allelen, die gemeinsam als eine Gruppe vererbt werden
(in Verknüpfungs-Ungleichgewicht
sind). Wie hierin verwendet, ist Haplotyp so definiert, dass jene
Haplotypen einbezogen sind, die in statistisch signifikanten Mengen
vorkommen (pkorr ≤ 0,05). Wie hierin verwendet,
bezieht sich der Ausdruck "ein
IL-1-Haplotyp" auf
einen Haplotyp in den IL-1-Loci, einschließlich der Allele der IL-1A-,
IL-1B- und IL-1RN-Gene und damit im Ungleichgewicht befindlichen
Marker. "Proinflammatorischer IL-1-Haplotyp" bezieht sich auf
einen Haplotyp, der mit einem Übermaß der proinflammatorischen
Freisetzung und/oder Aktivität
assoziiert ist (z. B. Heraufregulierung des funktionellen IL-1α und/oder
IL-1β und/oder
Herabregulierung eines funktionellen IL-1-Rezeptor-Antagonisten).
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"Verknüpfungs-Ungleichgewicht" bezieht sich auf
die gemeinsame Vererbung zweier Allele bei größeren Häufigkeiten, als aus den separaten
Häufigkeiten
des Auftretens jedes Allels in einer gegebenen Kontrollpopulation
zu erwarten wäre.
Die erwartete Häufigkeit
des Auftretens zweier Allele, die unabhängig ererbt sind, ist die Häufigkeit des
ersten Allels, multipliziert mit der Häufigkeit des zweiten Allels.
Allele, die bei erwarteten Häufigkeiten
gemeinsam auftreten, werden als im "Verknüpfungs-Gleichgewicht" bezeichnet.
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Zu
Beispielen für
polymorphe Marker im Verknüpfungs-Ungleichgewicht
zählen:
das IL-1B-Allel 2 (–511),
IL-1A-Allel 4 (222/223), IL-1A-Allel 1 (gz5/gz6), IL-1A-Allel 1
(–889),
das IL-1B-Allel 2 (+6912), IL-1B-Allel 1 (+3954), die IL-1B/IL-1RN
intergene Region (gaat.p33330) und (Y31), IL-1RN-Allel 2 (+2018),
IL-1RN-Allel 2 (VNTR) und drei Polymorphismen, die in Verknüpfungs-Ungleichgewicht
mit IL-1RN-Allel 2 (VNTR) sind (siehe Clay et al. (1996) Hum Genet
97: 723–726).
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Der
Begriff "Polymorphismus" bezieht sich auf
das gemeinsame Vorhandensein von mehr als einer Form eines Gens
oder Abschnitts (z. B. allele Variante) davon. Ein Abschnitt eines
Gens, von dem es mindestens zwei verschiedene Formen gibt, d. h.
zwei verschiedene Nukleotidsequenzen, wird als eine "polymorphe Region
eines Gens" bezeichnet.
Eine polymorphe Region kann ein einzelnes Nukleotid sein, dessen
Identität bei
verschiedenen Allelen abweicht. Eine polymorphe Region kann auch
mehrere Nukleotide lang sein.
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4.2 Prädiktive
Medizin
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4.2.1 Prognostische Assays und Kits
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Basierend
auf den in den folgenden Beispielen ausführlich beschriebenen Befunden
sind das IL-1B-Allel 2 (+3954) und IL-1B-Allel 2 (–511) signifikant
mit Asthma assoziiert. Die vorliegende Erfindung stellt Methoden
zur Bestimmung dessen bereit, ob eine Person Asthma hat oder wahrscheinlich
entwickelt und/oder zur Vorhersage des Umfangs oder des Verlaufs
von Asthma bei einer Person.
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Bei
einer Ausführungsform
umfasst die Methode das Genotypisieren einer Nukleinsäure-Probe,
die aus Blut, Speichel, Haut oder Haar der Person erhalten ist,
um zumindest ein Allel der proinflammatorischen IL-1-Haplotypen
IL-1B-Allel 2 (–511)
oder IL-1B-Allel 2 (+3954) nachzuweisen. Zum Beispiel kann ein Allel
eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps zum Beispiel durch Bestimmen
der Transkriptionsrate von mRNA und/oder der Proteinmenge eines
IL-1-Gens oder Proteins, zum Beispiel durch Northern Blot-Analyse,
reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), in situ-Hybridisation,
Immunpräzipitation,
Western Blot-Hybridisation oder Immunhistochemie, nachgewiesen werden.
Gemäß einer
Methode werden die Zellen von einer Person erhalten und wird die
IL-1-Protein- oder mRNA-Menge bestimmt und zu der Menge an IL-1-Protein
oder mRNA-Menge in einer gesunden Person verglichen.
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Bei
bevorzugten Ausführungsformen
ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass sie das Genotypisieren
einer Nukleinsäure-Probe
umfasst, die aus dem Blut, Speichel, Haut oder Haar der Person erhalten ist,
um zumindest ein Allel eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps
IL-1B-Allel 2 (–511)
oder IL-1B-Allel 2 (+3954) zu bestimmen. Bei einer beispielhaften
Ausführungsform
wird eine Nukeinsäure-Zusammensetzung bereitgestellt,
umfassend eine Nukleinsäure-Sonde
einschließlich
einer Region der Nukleotidsequenz, die zum Hybridisieren an eine
Sense- oder Antisense-Sequenz des zumindest einen Allels eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps IL-1B-Allel
2 (–511)
oder IL-1B-Allel 2 (+3954) fähig
ist. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure für die Hybridisation zugänglich gemacht
werden, die Sonde mit der Nukleinsäure der Probe kontaktiert werden und
die Hybridisation der Sonde an die Nukleinsäure-Probe nachgewiesen werden.
Eine derartige Technik kann zum Nachweis von Veränderungen oder allelen Varianten
entweder auf der genomischen oder der mRNA-Ebene als auch zur Bestimmung
der mRNA-Transkriptmengen angewendet werden.
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Eine
bevorzugte Nachweismethode ist die Allel-spezifische Hybridisation
unter Verwendung von Sonden, die eine Region von zumindest einem
Allel des proinflammatorischen IL-1-Haplotyps IL-1B-Allel 2 (–511) oder
IL-1B-Allel 2 (+3954) überlappen
und die etwa 5, 10, 20, 25 oder 30 Nukleotide um die Mutation oder
polymorphe Region herum aufweisen. Mehrere Sonden, die zur spezifischen
Hybridisierung an andere allele Varianten, die an einer chronischen
obstruktiven Atemwegserkrankung beteiligt sind, fähig sind,
können
an einen Festphasenträger,
z. B. einen "Chip" (der bis zu etwa
250.000 Oligonukleotide aufnehmen kann) gebunden sein. Oligonukleotide
können
an einen festen Träger
durch eine Vielfalt von Prozessen gebunden werden, einschließlich der
Lithographie. Die Detektionsanalyse einer Mutation unter Verwendung
dieser Chips, die Oligonukleotide umfassen, auch bezeichnet als "DNA-Sondenarrays", ist beschrieben
z. B. in Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244. Ein Chip kann
all die allelen Varianten wenigstens einer polymorphen Region eines Gens
umfassen. Der Festphasenträger
wird dann mit einer Test-Nukleinsäure kontaktiert, und die Hybridisation
an die spezifischen Sonden wird nachgewiesen. Entsprechend kann
die Identität
zahlreicher alleler Varianten eines oder mehrerer Gene in einem
einfachen Hybridisationsexperiment identifiziert werden.
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Diese
Techniken können
auch den Schritt des Amplifizierens der Nukleinsäure vor der Analyse umfassen.
Amplifikationstechniken sind den Fachleuten des Gebiets bekannt
und umfassen, ohne darauf beschränkt zu
sein, die Klonierung, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Polymerase-Kettenreaktion
spezifischer Allele (ASA), Ligase-Kettenreaktion (LCR), nested Polymerase-Kettenreaktion,
selbsterhaltende Sequenzreplikation (Guatelli, J.C. et al., 1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878), ein Transkriptionsamplifikationssystem (Kwoh,
D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177) und
Q-Beta-Replikase (Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:
1197).
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Zu
besonders bevorzugten Primern zur Verwendung bei einer PCR-Reaktion
zählen:
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Amplifikationsprodukte
können
in vielfältigen
Weisen untersucht werden, einschließlich einer Größenanalyse,
Restriktionsverdau, gefolgt von Größenanalyse, dem Nachweis spezifischer
getaggter Oligonukleotid-Primer in den Reaktionsprodukten, Allel-spezifischer
Oligonukleotid-(ASO)-Hybridisation, Allel-spezifischer 5' Exonuklease-Detektion,
Sequenzierung, Hybridisation und ähnlichem.
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Zu
PCR-basierten Nachweismethoden können
die Multiplex-Amplifikation einer Vielzahl von Markern gleichzeitig
zählen.
Zum Beispiel ist es im Fachgebiet wohlbekannt, PCR-Primer zur Generierung
von PCR-Produkten auszuwählen,
die in der Größe nicht überlappen
und gleichzeitig analysiert werden können. Alternativ ist es möglich, verschiedene
Marker mit Primern zu amplifizieren, die unterschiedlich markiert
sind und somit jeweils differenziell nachgewiesen werden können. Natürlich erlauben
die auf Hybridisation basierenden Nachweismethoden den differenziellen
Nachweis vielfacher PCR-Produkte in einer Probe. Weitere Techniken
sind im Fachgebiet bekannt, die eine Multiplex-Analyse einer Vielzahl
von Markern ermöglichen.
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Bei
einer lediglich der Veranschaulichung dienenden Ausführungsform
umfasst die Methode die Schritte des (i) Entnehmens einer Probe
von Zellen aus einem Patienten, (ii) Isolierens von Nukleinsäure (z. B.
genomische, mRNA oder beides) aus den Zellen der Probe, (iii) Kontaktierens
der Nukleinsäure-Probe
mit ein oder mehreren Primern, die spezifisch 5' und 3' an mindestens ein Allel eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps
IL-1B-Allel 2 (–511)
oder IL-1B-Allel 2 (+3954) unter Bedingungen hybridisieren, so dass
die Hybridisation und Amplifikation des Allels erfolgt, und (iv)
Nachweisens des Amplifikationsprodukts. Diese Nachweisschemata sind
besonders nützlich
für den
Nachweis von Nukleinsäure-Molekülen, wenn
solche Moleküle in
sehr geringen Anzahlen vorhanden sind.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des vorliegenden Assays wird das Allel des proinflammatorischen
IL-1-Haplotyps IL-1B-Allel 2 (–511)
oder IL-1B-Allel 2 (+3954) durch Veränderungen in den Restriktionsenzym-Spaltmustern
identifiziert. Zum Beispiel wird Proben- und Kontroll-DNA isoliert,
(optional) amplifiziert, mit ein oder mehreren Restriktionsendonukleasen
verdaut, und werden die Größen der
Fragmentlängen
mittels Gelelektrophorese bestimmt.
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Bei
noch einer anderen Ausführungsform
kann jegliche aus einer Vielzahl von Sequenzierungsreaktionen, die
im Fachgebiet bekannt sind, zur direkten Sequenzierung des Allels
angewendet werden. Zu Beispielen der Sequenzierungsreaktionen zählen solche,
die auf Techniken basieren, wie entwickelt von Maxim und Gilbert
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 560) oder Sanger (Sanger
et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). Es wird ebenfalls
erwogen, dass irgendeines aus einer Vielfalt von automatisierten
Sequenzierungsverfahren bei der Durchführung der vorliegenden Assays
genützt
werden kann (Biotechniques (1995) 19: 448), einschließlich der
Sequenzierung mittels Massenspektrometrie (siehe zum Beispiel PCT-Veröffentlichung
WO 94/16101 ; Cohen et al.,
(1996) Adv Chromatogr 36: 127–162;
und Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38: 147–159). Es
wird für
einen Fachmann des Gebiets offensichtlich sein, dass für bestimmte
Ausführungsformen
das Vorkommen lediglich einer oder zwei der Nukleinsäure-Basen
in der Sequenzierungsreaktion bestimmt zu werden braucht. Wo z.
B. lediglich eine Nukleinsäure
nachgewiesen wird, kann zum Beispiel A-Track oder ähnliches
durchgeführt
werden.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
kann der Schutz vor Spaltagenzien (wie etwa eine Nuklease, Hydroxylamin
oder Osmiumtetroxid und mit Piperidin) zum Nachweis von fehlgepaarten
Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA- oder DNA/DNA-Heteroduplexen angewendet
werden (Myers, et al. (1985) Science 230: 1242). Im Allgemeinen
beginnt die Technik des Fachgebiets der "Fehlpaarungsspaltung" mit der Bereitstellung von Heteroduplexen,
die durch Hybridisieren von (markierter) RNA oder DNA, die das Wildtyp-Allel
enthalten, mit der Probe gebildet werden. Die doppelsträngigen Duplexe
werden mit einem Agens behandelt, welches einzelsträngige Regionen
des Duplex spaltet, wie sie etwa aufgrund von Basenpaar-Fehlpaarungen
zwischen den Kontroll- und Probensträngen vorliegen werden. Zum
Beispiel können
RNA/DNA-Duplexe
mit RNase behandelt werden und können
DNA/DNA-Hybride mit S1-Nuklease
behandelt werden, um die fehlgepaarten Regionen enzymatisch zu verdauen.
Bei anderen Ausführungsformen
können
entweder DNA/DNA- oder RNA/DNA-Duplexe mit Hydroxylamin oder Osmiumtetroxid
und mit Piperidin behandelt werden, um fehlgepaarte Regionen zu
verdauen. Nach dem Verdau der fehlgepaarten Regionen wird das resultierende
Material dann nach Größe auf denaturierenden
Polyacrylamidgelen zur Bestimmung der Stelle der Mutation aufgetrennt.
Siehe zum Beispiel Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA
85: 4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217: 286–295. Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Kontroll-DNA oder -RNA für den Nachweis markiert werden.
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Bei
noch einer anderen Ausführungsform
verwendet die Fehlpaarungs-Spaltreaktion ein oder mehrere Proteine,
die fehlgepaarte Basenpaare in doppelsträngiger DNA erkennen (sogenannte "DNA-Fehlpaarungsreparatur"-Enzyme). Zum Beispiel
spaltet das mutY-Enzym von E. coli A bei G/A-Fehlpaarungen, und
die Thymidin-DNA-Glykosylase
von HeLa-Zellen spaltet T bei G/T-Fehlpaarungen (Hsu et al. (1994)
Carcinogenesis 15: 1657–1662).
Entsprechend einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Sonde,
die auf einem Allel eines proinflammatorischen Haplotyps basiert,
an eine cDNA oder ein anderes DNA-Produkt von (einer) Testzelle(n)
hybridisiert. Der Duplex wird mit einem DNA-Fehlpaarungsreparatur-Enzym
behandelt, woraufhin die Spaltprodukte, sofern vorhanden, mit Elektrophorese-Protokollen
oder ähnlichem
nachgewiesen werden können.
Siehe zum Beispiel
US-Patent
Nr. 5.459.039 .
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Bei
anderen Ausführungsformen
werden Veränderungen
in der elektrophoretischen Mobilität zur Identifizierung des IL-1β-Allels 2
(–511)
verwendet. Zum Beispiel kann der einzelsträngige Konformationspolymorphismus
(SSCP) zum Nachweis von Unterschieden in der elektrophoretischen
Mobilität
zwischen mutierten und Wildtyp-Nukleinsäuren verwendet
werden (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766,
siehe auch Cotton (1993) Mutat Res 285: 125–144; und Hayashi (1992) Genet
Anal Tech Appl 9: 73–79).
Einzelsträngige
DNA-Fragmente von Proben- und Kontroll-IL-1β-Allelen (–511) werden denaturiert und
dürfen
sich renaturieren. Die Sekundärstruktur
der einzelsträngigen
Nukleinsäuren
variiert entsprechend der Sequenz, wobei die resultierende Veränderung
in der elektrophoretischen Mobilität den Nachweis sogar eines
einzigen Basenaustauschs ermöglicht.
Die DNA-Fragmente können
markiert oder mit markierten Sonden nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit
des Assays kann unter Verwendung von RNA (anstelle von DNA) verstärkt werden, worin
die Sekundärstruktur
empfindlicher gegenüber
einer Sequenzveränderung
ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
wendet die vorliegende Methode eine Heteroduplex-Analyse zur Trennung
doppelsträngiger Heteroduplex-Moleküle auf der
Grundlage von Veränderungen
bei der elektrophoretischen Mobilität an (Keen et al. (1991) Trend
Genet 7: 5).
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Bei
noch einer weiteren Ausführungsform
wird die Bewegung von Allelen in Polyacrylamidgelen, die einen Gradienten
an Denaturierungsmittel enthalten, unter An wendung der denaturierenden
Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) untersucht (Myers et al. (1985)
Nature 313: 495). Wird DGGE als der Analysemethode angewendet, so
wird die DNA modifiziert, um sicherzugehen, dass sie nicht vollständig denaturiert
wird, zum Beispiel durch Addieren einer GC-Klammer von etwa 40 bp
einer hochschmelzenden GC-reichen DNA mittels PCR. Bei einer weiteren
Ausführungsform
wird ein Temperaturgradient anstelle eines Denaturierungsmittel-Gradienten verwendet,
um Unterschiede in der Mobilität
von Kontroll- und Proben-DNA
zu identifizieren (Rosenbaum und Reissner (1987) Biophys Chem 265:
12753).
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Beispiele
weiterer Techniken für
den Nachweis der Allele umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine
selektive Oligonukleotid-Hybridisation, selektive Amplifikation
oder selektive Primerextension. Zum Beispiel können Oligonukieotid-Primer
präpariert
werden, in denen die bekannte Mutation oder Nukleotid-Differenz
(z. B. bei allelen Varianten) zentral platziert wird und dann an
die Ziel-DNA unter Bedingungen hybridisiert wird, die die Hybridisation
lediglich dann zulassen, wenn eine perfekte Paarung vorgefunden
wird (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163; Saiki et al. (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230). Solche Allel-spezifischen Oligonukleotid-Hybridisationstechniken
können
zum Testen einer Mutation oder polymorphen Region pro Reaktion verwendet
werden, wenn die Oligonukleotide an PCR-amplifizierte Ziel-DNA hybridisiert
werden, oder einer Anzahl verschiedener Mutationen oder polymorpher
Regionen, wenn die Oligonukleotide an die hybridisierende Membran
gebunden und mit markierter Ziel-DNA hybridisiert werden.
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Alternativ
kann eine Allel-spezifische Amplifikationstechnologie, die von der
selektiven PCR-Amplifikation abhängt,
in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Als Primer für
die spezifische Amplifikation verwendete Oligonukleotide können die
Mutation oder polymorphe Region von Interesse im Zentrum des Moleküls tragen
(sodass die Amplifikation von einer differenziellen Hybridisation
abhängt)
(Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437–2488) oder am extremen 3'-Ende eines Primers,
wo, unter geeigneten Bedingungen, eine Fehlpaarung die Polymerase-Extension
verhindern oder vermindern kann (Prossner (1993) Tibtech 11: 238).
Außerdem
kann es erwünscht
sein, eine neue Restriktionsstelle in die Region der Mutation einzuführen, um
eine auf Spaltung basierende Detektion zu er möglichen (Gasparini et al. (1992)
Mol. Cell Probes 6: 1). Es wird davon ausgegangen, dass bei bestimmten
Ausführungsformen
die Amplifikation auch unter Verwendung von Taq-Ligase für die Amplifikation
durchgeführt
werden kann (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189). In
solchen Fällen
wird eine Ligation lediglich dann erfolgen, wenn eine perfekte Paarung
am 3'-Ende der 5'-Sequenz vorliegt,
was den Nachweis des Vorhandenseins einer bekannten Mutation an
einer spezifischen Stelle durch Feststellen des Vorhandenseins oder
der Abwesenheit der Amplifikation möglich macht.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
wird die Identifizierung der allelen Variante unter Anwendung eines
Oligonukleotid-Ligationsassays (OLA) vorgenommen, wie z. B. beschrieben
in
US-Pat. Nr. 4.998.617 und bei
Landegren, U. et al., Science 241: 1077–1080 (1988). Das OLA-Protokoll
verwendet zwei Oligonukleotide, die daraufhin entworfen sind, zur
Hybridisierung an angrenzende Sequenzen eines Einzelstrangs eines
Ziels fähig
zu sein. Eines der Oligonukleotide wird an einen Trennmarker geknüpft, z.
B. biotinyliert, und das andere wird detektierbar markiert. Wird
die präzise
komplementäre
Sequenz in einem Zielmolekül
gefunden, so werden die Oligonukleotide so hybridisieren, dass ihre
Termini angrenzen, und ein Ligationssubstrat schaffen. Die Ligation
erlaubt dann die Gewinnung des markierten Oligonukleotids unter
Verwendung von Avidin oder eines anderen Biotin-Liganden. Nickerson,
D.A. et al. haben einen Nukleinsäure-Nachweisassay
beschrieben, der Attribute von PCR und OLA kombiniert (Nickerson,
D. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8923–8927 (1990).
Bei dieser Methode wird die PCR zur Erzielung der exponentiellen
Amplifikation von Ziel-DNA verwendet, die dann unter Anwendung von
OLA nachgewiesen wird.
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Mehrere
Techniken, die auf dieser OLA-Methode basieren, sind entwickelt
worden und können
zum Nachweis der Allele eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps
verwendet werden. Zum Beispiel beschreibt
US-Patent Nr. 5.593.826 einen OLA
unter Verwendung eines Oligonukleotids mit einer 3'-Aminogruppe und eines
5'-phosphorylierten
Oligonukleotids zur Bildung eines Konjugats mit einer Phosphoramidat-Verknüpfung. Bei
einer anderen Variation von OLA, wie beschrieben bei Tobe et al.
((1996) Nucleic Acids Res 24: 3728), erlaubt der OLA, kombiniert
mit der PCR, die Typisierung zweier Allele in einem einzigen Mikrotiter-Well.
Durch Markieren jedes der Allel-spezifischen Primer mit einem uniquen
Hapten, d. h. Digoxigenin und Fluoreszein, kann jede OLA-Reaktion
unter Verwendung von Hapten-spezifischen Antikörpern, die mit unterschiedlichen Enzym-Reportern,
alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase, markiert sind,
nachgewiesen werden. Dieses System erlaubt die Detektion der beiden
Allele unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Formats, das zur Produktion
von zwei verschiedenen Farben führt.
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Mehrere
Methoden sind entwickelt worden, um die Analyse einzelner Nukleotid-Polymorphismen zu erleichtern.
Bei einer Ausführungsform
kann der Einzelbasen-Polymorphismus
unter Verwendung eines spezialisierten Exonuklease-resistenten Nukleotids
nachgewiesen werden, wie z. B. beschrieben bei Mundy, C. R. (
US Pat. Nr. 4.656.127 ).
Gemäß der Methode
darf ein Primer, der zu der Allelsequenz unmittelbar 3' zu der polymorphen
Stelle komplementär
ist, an ein Zielmolekül
hybridisieren, das von einem bestimmten Tier oder Menschen erhalten
ist. Enthält
die polymorphe Stelle an dem Zielmolekül ein Nukleotid, das zu einem
bestimmten vorhandenen Exonuklease-resistenten Nukleotid-Derivat
komplementär
ist, so wird jenes Derivat an das Ende des hybridisierten Primers
eingebaut werden. Diese Inkorporation macht den Primer resistent
gegenüber Exonuklease
und erlaubt somit seine Detektion. Da die Identität des Exonuklease-resistenten
Derivats der Probe bekannt ist, zeigt der Befund, dass der Primer
resistent gegenüber
Exonukleasen geworden ist, an, dass das an der polymorphen Stelle
des Ziel-Moleküls
vorhandene Nukleotid komplementär
zu jenem Nukleotid-Derivat ist, das in der Reaktion verwendet wurde.
Diese Methode weist den Vorteil auf, dass sie keine Bestimmung großer Mengen
an nicht relevanten Sequenzdaten erforderlich macht.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird eine Lösungs-basierte
Methode zur Bestimmung der Identität des Nukleotids einer polymorphen
Stelle angewendet. Cohen, D. et al. (
Französisches
Patent 2.650.840 ; PCT-Anmeldung Nr.
WO91/02087 ). Wie bei der Methode
von Mundy des
US Pat. Nr. 4.656.127 wird
ein Primer verwendet, der zu den allelen Sequenzen unmittelbar 3' zu einer polymorphen
Stelle komplementär
ist. Die Methode bestimmt die Identität des Nukleotids an jener Stelle
unter Verwendung von markierten Didesoxynukleotid-Derivaten, die,
so fern komplementär
zu dem Nukleotid der polymorphen Stelle, an den Terminus des Primers
eingebaut werden.
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Eine
alternative Methode, bekannt als Genetic Bit Analysis oder GBA
TM, ist beschrieben bei Goelet, P. et al.
(PCT-Anmeldung Nr. 92/15712). Die Methode von Goelet, P. et al.
verwendet Gemische von markierten Terminatoren und einen Primer,
der komplementär
zu der Sequenz 3' einer
polymorphen Stelle ist. Der markierte Terminator, der eingebaut
wird, wird somit bestimmt durch, und ist komplementär zu, dem
Nukleotid, das in der polymorphen Stelle des auszuwertenden Zielmoleküls vorhanden
ist. Im Gegensatz zu der Methode von Cohen et al. (
Französisches
Patent 2.650.840 ; PCT-Anmeldungs Nr.
WO91/02087 ) besteht die Methode von Goelet,
P. et al. vorzugsweise in einem Assay in der heterogenen Phase,
bei dem der Primer oder das Zielmolekül an einer festen Phase immobilisiert
ist.
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Vor
kurzem sind mehrere Primer-gesteuerte Nukleotideinbau-Verfahren
zur Untersuchung polymorpher Stellen in DNA beschrieben worden (Komher,
J. S. et al. Nucl. Acids. Res. 17: 7779–7784 (1989); Sokolov, B. P.,
Nucl. Acids Res. 18: 3671 (1990); Syvanen, A.-C., et al., Genomics
8: 684–692
(1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
88: 1143–1147
(1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1: 159–164 (1992);
Ugozzoli, L. et al., GATA 9: 107–112 (1992); Nyren, P. et al.,
Anal. Biochem. 208: 171–175
(1993)). Diese Methoden weichen von GBATM darin
ab, dass sie alle auf dem Einbau markierter Desoxynukleotide zur
Unterscheidung zwischen Basen an einer polymorphen Stelle beruhen.
Bei diesem Format können,
da das Signal proportional zu der Anzahl der inkorporierten Desoxynukleotide
ist, Polymorphismen, die in Runs desselben Nukleotids vorkommen,
zu Signalen führen,
die proportional zu der Länge
des Runs sind (Syvanan, A.-C., et al., Amer, J. Hum. Genet. 52:
46–59
(1993)).
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Für Mutationen,
die eine verfrühte
Termination der Proteintranslation erzeugen, bietet der Proteinverkürzungstest
(Protein Truncation Test – PTT)
einen effizienten diagnostischen Ansatz (Roest, et a., (1993) Hum.
Mol. Genet. 2: 1719–21;
van der Luijt, et al. (1994) Genomics 20: 1–4). Für den PTT wird die RNA anfänglich aus
einem verfügbaren
Gewebe isoliert und revers transkribiert, und das Segment von Interesse wird mittels
PCR amplifiziert. Die Produkte der Reverse Transkriptions-PCR werden
dann als einer Matrize für
die nested PCR-Amplifikation mit einem Primer verwendet, der einen
RNA-Polymerase-Promotor und eine Sequenz zur Einleitung der eukaryotischen
Translation enthält.
Nach Amplifikation der Region von Interesse erlauben die uniquen
Motive, die in den Primer eingebaut sind, eine sequenzielle in vitro-Transkription und
Translation der PCR-Produkte. Auf die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
der Translationsprodukte hin signalisiert das Auftreten verkürzter Polypeptide
das Vorhandensein einer Mutation, die eine verfrühte Termination der Translation
bewirkt. Bei einer Variation dieser Technik wird DNA (im Gegensatz
zu RNA) als einer PCR-Matrize verwendet, wenn die Zielregion von
Interesse von einem einzelnen Exon abgeleitet ist.
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Jeglicher
Zelltyp oder Gewebe kann zum Erhalt von Nukleinsäure-Proben zur Verwendung bei
den hierin beschriebenen Diagnostika genützt werden. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
wird die DNA-Probe von einer Körperflüssigkeit,
z. B. Blut, erhalten, die mittels bekannter Techniken (z. B. Venipunktur)
oder aus Speichel erhalten ist. Alternativ können die Nukleinsäure-Tests
an Trockenproben (z. B. Haar oder Haut) vorgenommen werden. Wird
RNA oder Protein verwendet, so müssen
die Zellen oder Gewebe, die verwendet werden können, ein IL-1-Gen exprimieren.
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Diagnostische
Verfahrensweisen können
auch in situ direkt an Gewebesektionen (fixiert und/oder gefroren)
von Patientengewebe, das aus Biopsien oder Resektionen erhalten
ist, vorgenommen werden, sodass keine Nukleinsäure-Reinigung erforderlich
ist. Nukleinsäure-Reagenzien
können
als Sonden und/oder Primer für
solche in situ-Verfahren verwendet werden (siehe zum Beispiel Nuovo,
G.J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications,
Raven Press, NY).
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Über Methoden
hinaus, die sich primär
auf den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz
konzentrieren, können
auch Profile in solchen Detektionsschemata ausgewertet werden. Fingerprint-Profile
können
zum Beispiel unter Anwendung eines differenziellen Display-Verfahrens,
der Northern-Analyse und/oder der RT-PCR generiert werden.
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Ebenfalls
beschrieben sind Kits für
den Nachweis einer Prädisposition
für die
Entwicklung von Asthma. Dieser Kit kann ein oder mehrere Oligonukleotide
enthalten, einschließlich
5'- und 3'-Oligonukleotide,
die 5' und 3' an mindestens ein
Allel eines proinflammatorischen IL-1-Haplotyps hybridisieren. Oligonukleotide
der PCR-Amplifikation
sollten im Abstand von zwischen 25 und 2500 Basenpaaren, vorzugsweise
im Abstand von zwischen etwa 100 und etwa 500 Basenpaaren, hybridisieren,
um ein PCR-Produkt von bequemer Größe für die anschließende Analyse
zu erzeugen.
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Zur
Verwendung in einem Kit können
Oligonukleotide eine beliebige aus einer Vielfalt von natürlichen und/oder
synthetischen Zusammensetzungen sein, wie etwa synthetische Oligonukleotide,
Restriktionsfragmente, cCNAs, synthetische Peptid-Nukleinsäuren (PNAs)
und ähnliches.
Der Assay-Kit und die Methode können
auch markierte Oligonukleotide verwenden, um eine einfache Identifizierung
in den Assays zu ermöglichen.
Zu Beispielen der Markierungen, die verwendet werden können, zählen Radiomarkierungen,
Enzyme, fluoreszierende Verbindungen, Streptavidin, Avidin, Biotin,
magnetische Komponenten, metallbindende Komponenten, Antigene oder
Antikörper-Komponenten
und ähnliches.
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Der
Kit kann wahlweise auch Mittel zur DNA-Probennahme enthalten. Mittel
zur DNA-Probennahme sind einem Fachmann des Gebiets wohlbekannt
und können
umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein, Substrate, wie etwa Filterpapiere, die AmpliCardTM (University of Sheffield, Sheffield, England
S10 2JF; Tarlow, JW, et al., J. of Invest. Dermatol. 103: 387–389 (1994))
und ähnliches;
DNA-Reinigungsreagenzien, wie etwa NucleonTM-Kits,
Lysepuffer, Proteinaselösungen
und ähnliches;
PCR-Reagenzien,
wie etwa 10 × Reaktionspuffer, wärmestabile
Polymerase, dNTPs und ähnliches;
und Allel-Nachweismethoden, wie etwa das HinfI-Restriktionsenzym,
Allel-spezifische
Oligonukleotide, degenerative Oligonukleotid-Primer für die nested
PCR aus getrocknetem Blut.
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4.2.2. Pharmakogenomik
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Die
Kenntnis der speziellen IL-1-Polymorphismen, die für Sepsis
prädiktiv
sind, alleine oder in Verbindung mit der Information zu anderen
genetischen Defekten, die zu einer chronischen obstruktiven Atemwegserkrankung
beitragen (das genetische Profil der chronischen obstruktiven Atemwegserkrankung)
erlaubt eine Anpassung der Therapie für eine bestimmte Erkrankung
an das genetische Profil des Individuums, das Ziel der "Pharmakogenomik". Zum Beispiel sind
Personen mit dem IL-1B-Allel 2 (–511) und/oder IL-1B-Allel
2 (+3954) für
die Entwicklung einer chronischen obstruktiven Atemwegserkrankung
oder für
ein schnelleres oder ernstlicheres Fortschreiten hin zu einer chronischen
obstruktiven Atemwegserkrankung prädisponiert. Somit erlaubt der
Vergleich des proinflammatorischen IL-1-Profils eines Individuums
zu dem Populationsprofil für eine
chronische obstruktive Atemwegserkrankung die Auswahl oder das Design
von Arzneimitteln, die als sicher und wirksam für einen bestimmten Patienten
oder Patientenpopulation (d. h. eine Gruppe von Patienten mit derselben
genetischen Veränderung)
zu erwarten sind.
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Die
Fähigkeit,
Populationen anzuzielen, die erwartungsgemäß den höchsten klinischen Nutzen zeigen werden,
basierend auf dem IL-1B oder genetischen Erkrankungsprofil, kann
ermöglichen:
1) die Repositionierung vermarkteter Asthma-Arzneimittel mit enttäuschenden
Marktergebnissen; 2) die Rettung von Arzneimittel-Kandiaten für Asthma,
deren klinische Entwicklung als eine Folge von Sicherheits- oder Wirksamkeits-Einschränkungen,
die für
eine Untergruppe der Patienten spezifisch sind, abgebrochen worden
ist; und 3) eine beschleunigte und preiswertere Entwicklung von
Arzneimittel-Kandidaten für
Asthma und eine optimalere Arzneimittel-Kennzeichnung (da z. B. die Verwendung
der hierin beschriebenen Marker für die Optimierung der wirksamen
Dosis nützlich
ist).
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Die
Zellen einer Person können
auch vor oder nach Verabreichung eines Therapeutikums erhalten werden,
um die Höhe
der Expression von anderen Genen als IL-1 nachzuweisen, um somit
zu verifizieren, dass das Therapeutikum die Expression der Gene
nicht erhöht
oder vermindert, was schädlich
sein könnte. Dies
kann z. B. unter Anwendung der Methode des transkriptionellen Profiling
erfolgen. Somit könnte
mRNA von Zellen, die in vivo an ein Therapeutikum exponiert wurden,
und mRNA von demselben Typ von Zellen, die nicht an das Therapeutikum
exponiert wurden, revers transkribiert und an einen Chip hybridisiert
werden, der DNA von zahlreichen Genen enthält, um dabei die Expression
von Genen in Zellen zu vergleichen, die mit dem Therapeutikum behandelt
und nicht behandelt worden waren.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter
veranschaulicht, die in keiner Weise als Beschränkung betrachtet werden sollten.
Die Ausführung
der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben,
herkömmliche
Techniken anwenden, die innerhalb der Fähigkeiten des Fachgebiets liegen.
Diese Techniken sind in der Literatur umfassend erläutert. Siehe
zum Beispiel Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., herausgegeben
von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laborstory Press
1989); DNA Cloning, Bände
I und II (D. N. Glover Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.
M. Gait, Hrsg., 1984); Mullis et al.
US
Patent Nr. 4.683.195 ; Nucleic Acid Hybridization (B. D.
Hames & S. J.
Higgins, Hrsg., 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins,
Hrsg., 1984).
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BEISPIEL 1: Detektion von IL1B (+3954)
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Das
Screening des Einzelbasen-Variations-(C/T)-Polymorphismus an der
IL-1B-Base +3954 wurde mittels PCR-Amplifikation von genomischen
Matrizen vorgenommen. Eine Fehlpaarung wurde in einen Primer zur
Vervollständigung
einer TaqI-Stelle als einer positiven Kontrolle eingeführt. Die
polymorphe TaqI-Stelle ist nativ. Die folgenden Primer wurden in
einem ABI DNA-Synthesegerät,
basierend auf den genomischen Sequenzen, erzeugt (Clark et al.,
1986; GENBANK X04500):
5' CTC
AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A3' (SEQ
ID Nr. 1)
5' GCT
TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3' (SEQ
ID Nr. 2)
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Die
Bedingungen der PCR-Reaktion waren die folgenden:
[95°C (2 Minuten)]
1 Zyklus
[95°C
(1 Minute), 67,5°C
(1 Minute), 74°C
(1 Minute)] 38 Zyklen; und
[72°C (8 Minuten)] 1 Zyklus
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Der
Restriktionsenzym-Verdau wurde bei 60°C für 8 Stunden vorgenommen. Die
Größenbestimmung erfolgte
mittels 8% PAGE. Der Verdau des PCR-Produkts mit TaqI ergibt ein
Segment 12 bp (dessen Abwesenheit einen unvollständigen Verdau anzeigt) und
entweder zwei weitere Segmente von 85 und 97 bp (Allel 1) oder ein
einzelnes von 182 bp (Allel 2).
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BEISPIEL 2: Detektion von IL-1B (–511)
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Der
Einzelbasen-Polymorphismus (C/T) an Position –511 im IL-1B-Gen wurde mittels
PCR-Amplifikation der genomischen Matrizen gescreent, gefolgt von
der RFLP-(Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus)-Analyse.
Die Genvariation vervollständigt
eine AvaI-Restriktionsstelle in dem häufigsten Allel und eine Bsu
36/-Stelle in dem selteneren Allel. Folglich bietet der Verdau des
PCR-Produkts mit diesen Enzymen eine effiziente Analyse des IL-1B
(–511)-Locus.
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Die
folgenden Primer wurden einem ABI-Synthesegerät, basierend auf der genomischen
Sequenz, produziert (Clark et al., 1986; GENBANK X04500):
5' TGG CAT TGA TCT
GGT TCA TC-3' (SEQ
ID Nr. 3)
5' GTT
TAG GAA TCT TCC CAC TT-3' (SEQ
ID Nr. 4)
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Die
Bedingungen der PCR-Reaktion waren die folgenden:
[95°C (2 Minuten)]
1 Zyklus
[95°C
(1 Minute), 53°C
(1 Minute), 72°C
(1 Minute)] 35 Zyklen; und
[72°C (5 Minuten)] 1 Zyklus
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Jede
PCR-Reaktion wurde in zwei Aliquots von 25 μl aufgeteilt; einer wurde zu
3 Einheiten Ava I gegeben, der andere zu 3,7 Einheiten Bsu 36 I,
zusätzlich
zu 3 μl
des spezifischen 10× Restriktionspuffers.
Der Verdau erfolgte bei 37°C über Nacht,
die Größenbestimmung
erfolgte mittels 9% PAGE. Der Ava I-Verdau produzierte 190 + 114
bp-Segmente mit Allel 1, wohingegen Allel 2 ungeschnitten blieb
(304 bp). Der Bsu 36 I-Verdau produzierte 190 + 114 bp-Fragmente
mit Allel 2, wohingegen Allel 1 ungeschnitten war (304 bp). Das
erhaltene Restriktionsmuster war in den beiden Aliquots invertiert
(was Homozygoten identifizierte) oder identisch (was Heterozygoten
identifizierte). Dieses Protokoll lieferte eine effiziente Analyse
des IL-1B (–511)-Locus.
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BEISPIEL 3: Assoziierung des IL-1B-Allels
2 (+3954) und IL-1B-Allels 2 (–511)
mit dem Vorhandensein von Asthma bei einer Person
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Die
folgende Studie wurde zur Auswertung dessen durchgeführt, ob
es eine Beziehung zwischen Asthma und den in den relevanten Regionen
des IL-1B-Gens gefundenen Allelen gibt. Einhundertsechs (106) Asthmapatienten
wurden für
die Studie rekrutiert. 251 nordbritische, weiße, kaukasische, nicht-asthmatische Personen
wurden als Kontrollen rekrutiert. Alle Asthmapatienten erfüllten die
ATS-Kriterien für
die Definition von Asthma (Amer Rev Respir Dis 1985, 132: 180–182) und
wiesen, wo relevant, eine PC20 von Methacholin von weniger als 4
mg/ml auf. Die Asthmapatienten wurden klinisch als entweder leichtes
oder schweres Asthma aufweisend kategorisiert. Schweres Asthma war
definiert als bei jenen Patienten vorhanden, die mehr als 800 mg/Tag
an inhalierten Steroiden benötigen.
Asthmapatienten auf Beta-2-Agonist
alleine wurden als mit leichtem Asthma erkrankt kategorisiert. Von
der Gesamtzahl der Asthmapatienten waren 50 leichte Asthmatiker
auf Beta 2-Agonist alleine (FEV1 92,5 ± 1, 5% pred) und wiesen ein
durchschnittliches Alter von 26,5 ± 0,9 auf, und waren 56 schwere
Asthmatiker auf einem Regime von mindestens 800 mg pro Tag an inhalierten
Steroiden (FEV1 58,4 ± 3,4%
pred) mit einem durchschnittlichen Alter von 47,2 ± 2,3.
Nach Erhalt der Einverständniserklärung wurden
10 ml venöses
Blut entnommen und in EDTA-enthaltenden Röhrchen für jeden Patienten gesammelt.
Die gesamte genomische DNA wurde extrahiert, und die Allelhäufigkeiten
wurden in DNA, die aus den 106 Patienten extrahiert war, ausgewertet.
Für IL-1B
(+3954) konnten 105 Patienten genotypisiert werden. 104 Patienten
wurden für
IL-1B (–511)
genotypisiert. Für
jede DNA wurde ein einzelnes PCR-Produkt, das die relevanten Regionen
des IL-1B-Gens durchspannte, produziert und wie in Beispiel 1 beschrieben
analysiert. Die Daten wurden unter Anwendung des Chi Quadrat-Tests
zum Vergleich der Trägerschaft
des seltenen Allels (Genotypen, die mindestens eine Kopie von Allel
2 innerhalb der Kohorten tragen) analysiert. Die Ergeb nisse für IL-1B
(+3954) sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben, und die Ergebnisse
für IL-1B
(–511)
sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. TABELLE 1 IL-1B (+3954)
| Schweregrad
der Erkrankung | 1,1 | 1,2 | 2,2 |
| LEICHT
(N = 50) | 28 | 17 | 5 |
| SCHWER
(N = 55) | 26 | 24 | 5 |
| KONTROLLEN
(N = 251) | 165 | 81 | 5 |
| Leicht
gg. Schwer | Chi2 = 0,497 | p
= 0,48 | (N.S.) |
| "Alle" gg. Kontrolle | Chi2 = 6,402 | p
= 0,01 | O.R.
= 1,81 (95%
C.I. = 1,14–2,88) |
| Schwer
gg. Kontrolle | Chi2 = 6,557 | p
= 0,01 | O.R.
= 2,14 (95%
C.I. = 1,19–3,86) |
TABELLE 2 IL-1B (–511)
| Schweregrad
der Erkrankung | 1,1 | 1,2 | 2,2 |
| LEICHT
(N = 50) | 2 | 19 | 3 |
| SCHWER
(N = 55) | 19 | 31 | 4 |
| KONTROLLEN
(N = 251) | 89 | 129 | 33 |
| Schwer
gg. Leicht | Chi2 = 4,541 | p
= 0,033 | O.R.
= 2,34 (95%)
C.I. = 1,06–5,16) |
| „Alle" gg. Kontrolle | Chi2 = 2,948 | p
= 0,086 | (N.S.) |
-
Wie
durch Tabellen 1 und 2 nachgewiesen, ist das Vorhandensein des IL-1B-Allels
2 (+3954) und IL-1B-Allels 2 (–511)
signifikant mit klinischem Asthma assoziiert. Weiterhin wurde das
Vorhandensein mindestens einer Kopie des Allels 2 an dem IL-1B (–511)-Locus
als mit einer schwereren Erkrankung assoziiert festgestellt.
