DE69432225T2

DE69432225T2 - Molekulare diagnose von familiärer adenomatöser polyposis

Info

Publication number: DE69432225T2
Application number: DE69432225T
Authority: DE
Inventors: W. Kenneth KINZLER; Bert Vogelstein
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1993-12-15
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2014-12-14
Also published as: US5709998A; WO1995017523A3; US5760207A; CA2179012A1; CA2179012C; JPH09506775A; EP0734456B1; WO1995017523A2; DE69432225D1; ATE233824T1; EP0734456A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet der medizinischen Diagnostik. Insbesondere betrifft sie das Gebiet der diagnostischen Genetik, wo die Gegenwart von Mutationen in gewissen Genen bestimmte Krankheitsstadien ankündigen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) ist ein autosomales, dominant vererbtes Syndrom, gekennzeichnet durch die progressive Entwicklung von hunderten von adenomatösen colorektalen Polypen, von denen einige unvermeidbar zum Krebs fortschreiten werden.
Auch wenn die klinischen Manifestationen dieses Syndroms und dessen Varianten (z.B. Gardners Syndrom, Turcots Syndrom) seit vielen Jahren bekannt sind (Bussey, H.J.R. et al. (1990) Familial Adenomatous Polyposis, 1– 7), hängt die Diagnose immer noch von der Beobachtung von vielen colorektalen Polypen, die sich während der zweiten oder dritten Lebensdekade entwickeln, ab. Heute, wo an FAP unter achttausend Leuten fast einer leidet (Alm, T. et al. (1973) Clin. Gastroenterol, 2: 557–602) und doppelt so viele einem Risiko ausgesetzt sind, gibt es über 50.000 Individuen allein in den USA, deren Familien potentiell von genetischen Tests profitieren könnten.
Der erste Schritt zum genetischen Testen wurde erreicht, als das Ererben von FAP mit einer kleinen Region des Chromosoms 5(5q21) in Verbindung gebracht wurde (Herrera, L. et al. (1986) American Journal of Medical Genetics 25: 473–476; Bodmer, W.F. et al. (1987) Nature 328: 614–616; Leppert, M. et al. (1987) 238: 1411– 1413). Dies ergab die Grundlagenarbeit für die Verbindungsstudien, die naheliegende polymorphe DNA-Marker verwendet. Auch wenn die Verbindungsanalyse in einigen Situationen nützlich sein kann, kann sie nur einer Minderheit der von FAP Betroffenen in der Praxis helfen (Petersen, G.M. et al. (1991) Gastroenterology 100: 1658–1664; Cachon-Gonzalez, M.B. et al. (1991) Journal of Medical Genetics 28: 681–685; Spirio, L. et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52: 286–296). Direktes genetisches Testen wurde durchführbar, als herausgefunden wurde, daß das APC- Gen auf Chromosom 5q21 in der Keimbahn der FAP-Patienten mutiert ist (Grooden, J. et al. (1991) Cell 66: 589–600; Joslyn, G. et al. (1991) Cell 66: 601–613; Kinzler, K.W. et al. (1991) Science 253: 661– 665; Nishisho, I. et al. (1991) Science 253: 665–669). Interessanterweise ist das APC-Gen auch häufig und früh während der sporadischen colorektalen Tumorgenese mutiert (Nishisho, I. et al. (1991) Science 253: 665–669; Powell, S.M. et al. (1991) Nature 359: 235–237; Miyoshi, Y. et al. (1992) Human Molecular Genetics 1: 229–233).
Analysen der gesamten kodierenden Region des APC-Gens haben es erlaubt, inaktivierende Mutationen in 30 bis 60% der FAP-Patienten zu demonstrieren, abhängig von dem angewandten Screening-Verfahren, Miyoshi, Y. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4452–4456; Groden, J. et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52: 263–272; Nagase, H. et al. (1993) im Druck). Diese Analysen wurden durch die vielfältige Natur der Mutationen verkompliziert, welche über einen großen Teil des APC-Gens verteilt waren, umschlieflend über 8500 bp des offenen Leserahmens. Darüberhinaus waren diese Mutationen hauptsächlich Einzelbasenpaaraustausche, kleine Insertionen oder Deletionen. Gegenwärtige Verfahren zum Identifizieren solcher Mutationen sind häufig nicht empfindlich und immer arbeitsintensiv.
Es gibt einen klaren Bedarf in der Technik für ein schnelles und empfindliches Verfahren zum Detektieren von APC-Mutationen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Detektieren von Mutationen in einem APC-Gen zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, ein Primer-Paar zum Amplifizieren eines Segmentes der APC-Genkodierenden Sequenz zur Verfügung zu stellen, um Templates zu bilden, die für die In-vitro-Transkription und -Translation nützlich sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Primer-Set zum Amplifizieren aller Segmente der APC-Genkodierenden Sequenz zur Verfügung zu stellen, um Templates zu bilden, die für die In-vitro-Transkription und -Translation nützlich sind.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Detektieren von Mutationen in irgendeinem Gen zur Verfügung zu stellen.
Dieses und andere Gegenstände der Erfindung werden durch eine oder mehrere Ausführungsformen, die hierunter beschrieben sind, zur Verfügung gestellt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren von Mutationen in dem APC-Gen zur Verfügung gestellt. Das Verfahren (hierin benannt als eine Invitro-Synthese oder als ein IVS-Assay) umfaßt die Schritte: Bilden von APC-Templates durch Amplifizieren einiger oder aller Teile der APC-Gen-kodierenden Sequenz in einer DNA-Probe eines Menschen; Herstellen eines Polypeptidproduktes aus diesen APC-Templates in In-vitro-Transkriptionen und -Translationen; Analysieren dieser Polypeptidprodukte, um die Größe dieser Polypeptidprodukte zu bestimmen, wobei ein trunkiertes Polypeptidprodukt eine Mutation in einem APC-Gen in dieser DNA-Probe anzeigt.
Wenn keine Mutationen, die zu trunkierten Polypeptidprodukten führen, durch das in-vitrosynthetisierte Proteinverfahren gefunden werden, das oben beschrieben ist, können weitere Schritte unternommen werden, um zu bestimmen, ob eine cis-agierende Mutation vorhanden ist, welche die Menge an exprimierter APC mRNA reduziert. Das Verfahren (hierin genannt ein Allelspezifischer Expressions- oder ASE-Assay) umfaßt die weiteren Schritte: Bestimmen, ob der Patient heterozygot für einen Polymorphismus des APC-Gens ist, wobei ein Patient, der heterozygot ist, ein erstes und ein zweites polymorphes Allel eines APC-Gens hat; und Bestimmen der relativen mRNA-Menge, die an jedem der zwei polymorphen Allelen in einer DNA-Probe eines heterozygoten Patienten transkribiert wird, wobei ein mRNA-Verhältnis, das von dem ersten Allel transkribiert wird zu der mRNA, die von dem zweiten Allel exprimiert wird, welches größer als 1,2 oder kleiner als 0,8 ist, eine Mutation in einem der Allele in der DNA anzeigt.
Auch von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden ein Primer-Paar zum Amplifizieren aller Segmente oder eines Segmentes der APC-Gen-kodierenden Sequenz, um Templates zu bilden, die für In-vitro-Transkription und -Translation nützlich sind. Eines der Primer-Paare umfaßt einen transkriptionalen Promotor und einen translationalen Initiierungsort. Jeder der Primer umfaßt wenigstens etwa 20 kontinuierliche Nukleotide, welche komplementär zu den gegenüberliegenden Strängen der Gen-kodierenden Sequenz sind.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Primer-Set, zum Amplifizieren aller Segmente der APC-Gen-kodierenden Sequenz zur Verfügung gestellt, um Templates zu bilden, die für In-vitro-Transkription und – Translation nützlich sind. Ein Primer in jedem Paar des Primer-Sets umfaßt einen transkriptionalen Promotor und einen translationalen Initiierungsort. Jeder der Primer umfaßt wenigstens etwa 20 kontinuierliche Nukleotide, welche komplementär zu den gegenüberliegenden Strängen der Gen-kodierenden Sequenz sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren von Mutationen in einem Gen zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte: Bilden von Templates durch Amplifizieren einiger oder aller Teile der kodierenden Sequenz des Gens in einer DNA-Probe eines Patienten, der im Verdacht steht, an einer Krankheit zu leiden, oder ein Träger dieser Krankheit zu sein, die durch Mutation in einem Gen verursacht wird; Herstellen eines Polypeptidprodukts aus diesen Templates durch In-vitro-Transkription und – Translationsreaktionen; Analysieren dieser Polypeptidprodukte, um die Größe dieser Polypeptidprodukte zu bestimmen, wobei ein trunkiertes Polypeptidprodukt eine Mutation in dem Gen in dieser DNA-Probe anzeigt. Weitere Schritte werden ausgeführt, um zu bestimmen, ob eine cis-agierende Mutation vorhanden ist, welche die Menge der von dem Gen exprimierten mRNA reduziert. Die weiteren Schritte umfassen: Bestimmen, ob der Mensch heterozygot für einen Polymorphismus in dem Gen ist, wobei ein Mensch, der heterozygot ist, ein erstes und ein zweites polymorphes Allel des Gens hat; Bestimmen der relativen mRMA-Menge, die von jedem der zwei polymorphen Allelen in einer DNA-Probe des heterozygoten Patienten transkribiert wird, wobei ein Verhältnis der transkribierten mRNA des ersten Allels zu der mRNA, die von dem zweiten Allel transkribiert wird, das größer ist als 1,2 oder kleiner ist als 0,8, eine Mutation in einer dieser Allele in der DNA-Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt der Technik somit ein praktisches und empfindliches Screening-Verfahren zum Detektieren von Mutation in großen Genen, so wie APC, zur Verfügung, welche auf andere Weise ohne extrem arbeitsintensiven Aufwand schwer zu bestimmen sind. Die Erfindung erlaubt routinemäßiges vorklinisches Testen von Individuen, die einem Risiko ausgesetzt sind, ebenso wie genetische Bestätigung von de-novo-Fällen. Solche Verfahren werden das Management der Patienten verbessern und die Entwicklung von effektiven nicht-invasiven vorbeugenden Maßnahmen potenzieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt schematische Darstellungen der In-vitro-Synthese (IVS) und des Allel-spezifischen Expressions-(ASE)-Assays.
1A zeigt eine schematische Darstellung der Prinzipien des IVS-Assays. Das APC-Gen wird in fünf überlappende Segmente unterteilt, die die gesamte kodierende Region des APC-Gens einschließen. Diese Regionen werden unter Verwendung von speziell entworfenen PCR-Primern amplifiziert, welche die notwendigen transkriptionellen und translationalen Regulationssequenzen an dem 5' Ende des PCR-Produktes anordnen. Radioaktiv markiertes Polypeptid wird in vitro aus diesen Hilfsgenen in einer einfachen Ein-Schrittgekoppelten Transkription-Translationsreaktion (illustriert als zwei Schritte) synthetisiert. Trunkierende Mutationen können dann als kleinere Polypeptidprodukte nach der Gel-Elektrophorese und Autoradiographie identifiziert werden. Das Stop-Codon repräsentiert eine typische trunkierende APC-Mutation, beispielsweise, einen Einzelbasenpaar-Austausch, der ein frühes Translationsterminierungs-Codon entstehen läßt.
1B ist ein Schema, welches einen Allelspezifischen Expressions-Assay zeigt. Jede normale Zelle hat zwei Kopien des APC-Gens, die identisch sind, bis auf gelegentliche Polymorphismen eines einzelnen Basenpaares (Cytosin [C] oder Thymidin [T] in diesem Beispiel). Normalerweise sind beide Allele des APC-Gens im RNA-Anteil der Zelle gleichmäflig repräsentiert. Jedoch werden einige Fälle adenomatöser Polyposis durch Mutationen verursacht, die zu reduzierten Spiegeln normaler APC-Transkriptionsprodukte eines Allels führen. Dieses resultiert in einem Ungleichgewicht bei der Repräsentierung der Transkripte der zwei Allelen. Dieses geänderte Allel-Verhältnis der RNA kann mit dem Allelspezifischen Expressions-Assay detektiert werden (welcher unterhalb der gepunkteten Linie beschrieben ist). Zunächst wird RNA aus periphären mononuklearen Blut-Zellen isoliert. APC-Transkripte werden zu komplementärer DNA konvertiert und durch reverse Transkriptase-PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte werden dann mit einem gewöhnlichen 9-bp Oligomer und zwei Allel-spezifischen Oligomeren (8 und 10 bp) unterschiedlicher Größe aneinander gelagert. Nach der Ligation werden diese Oligomere 17-bp- und 19-bp-Produkte entsprechend der Allele A und B ergeben, die durch Gel-Elektrophorese unterschieden werden können. Das Kästchen zeigt die erwarteten Ergebnisse von einem normalen Subjekt und von einem Patienten mit familiärer adenomatöser Polyposis, der eine Mutation hat, die zu der reduzierten Expression des normalen Transkripts des Allels A führt.
2 zeigt IVS -Polypeptid-Analyse zur Detektion von bekannten trunkierenden APC-Mutationen.
2A zeigt repräsentative IVS Polypeptid-Proben von sporadischen solorektalen Tumoren (T1–T8), von denen durch Sequenzanalyse, die auf SDS-PAGE gelaufen ist, bekannt ist, daß sie trunkierende Mutationen haben. Jedes zeigt das erwartete trunkierte APC-Polypeptid in Segment 3. Eine signifikante Menge normalen APC-Proteins voller Länge (angezeigt links durch N) wird von den verbleibenden normalen Allelen bemerkt. Eine normale Gewebeprobe (angezeigt durch ein N oben) ist ebenfalls gezeigt.
2B stellt grafisch die vorhergesagte Größe der trunkierten APC-Polypeptide in jedem der Tumore, basierend auf der Sequenzanalyse des APC-Gens, dar.
4 zeigt eine IVS-Protein-Analyse zur Detektion von APC-Mutationen in FAP-Patienten.
Repräsentative Proben von FAP-Subjekten zeigen trunkierte APC-Polypeptide (angezeigt durch ein + unten und durch ein * (Sternchen) neben der Bande) in Segment 1 (S1), Segment 2 (S2) und Segment 3 (S3). Das APC-Protein normaler Größe und vollständiger Länge (angezeigt links durch N) von dem verbleibenden, nicht veränderten APC-Allel wird ebenso als Hintergrundbande (ebenfalls markiert mit N) bemerkt, welche in allen Spuren auffindbar sind. Die Hintergrundbanden resultieren wahrscheinlich aus einer internen Initiierung der Protein-Translation. FAP-Subjekte ohne ein demonstrierbares trunkiertes APC-Protein in den Segmenten, die analysiert wurden, sind ebenso gezeigt (angezeigt durch ein – unten).
4 zeigt eine Allel-Mischungsanalyse des ASE-Assays.
Definierte RNA-Mengen, jeweils homozygot für ein Allel (A oder B) bei dem polymorphen Ort Exon 11, wurden als Templates für die Amplifizierung und anschließende Ligationsreaktionen verwendet. Das Input-Verhältnis für jedes Allel ist unter 4A gezeigt. Eine lineare Beziehung zwischen Input und dem beobachteten Ergebnis bei dem ASE-Assay ist offensichtlich aus 4A und dem Graph (4B). Der Korrelations-Koeffizient, r, war 0,997.
5 zeigt die Detektion von geänderten APC-Transkripten durch den ASE-Assay.
Signifikant reduzierte Mengen der Expression aus einem APC-Allel wurde in drei FAP-Patienten unter Verwendung der ASE-Analyse mit dem Exon 11 Polymorphismus detektiert. Der "Genomic" Balken zeigt das durchschnittliche Allel-Verhältnis an, das aus Assays von 28 genomischen DNA-Proben von 21 verschiedenen Individuen abgeleitet wurde. Der "Normal" Balken zeigt das durchschnittliche Allel-Verhältnis an, das in elf RNA-Proben von vier unterschiedlichen Individuen beobachtet wurde. Die "FAP #11", "FAP #38" und "FAP #62" Balken repräsentieren Analysen von RNA-Proben aus drei verschiedenen FAP-Patienten. Das Verhältnis für jeden Patienten wurde aus vier Assays abgeleitet. Mittelwerte und Standardabweichungen werden durch das Kästchen und die überlagernden Klammern jeweils angezeigt.
6 zeigt die APC-Segmente, die für die Analyse verwendet wurden, wie sie in den APC-Exons angeordnet sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung, daß inaktivierende Mutationen in großen Genen durch eine praktische molekulargenetische Herangehensweise direkt identifiziert werden können. Die Herangehensweise, die hier offenbart ist, hat verschiedene Varteile gegenüber gegenwärtig erhältlichen genetischen Verfahren. Auch wenn sie nützlich ist, kann die genetische Verbindungsanalyse nicht in Individuen angewendet werden, wo die Verwandtschaft klein ist, erforderliche Verwandtschaftsmitglieder nicht erhältlich sind, oder polymorphe Marker uninformativ sind. Weiterhin kann die Verbindungsanalyse nicht angewendet werden, wenn eine denovo-Mutation vermutet wird. Tatsächlich sind de-novo-Fälle für etwa ein Drittel der FAP-Fälle verantwortlich (Bulow, S. (1986) Dis. Colon Rectum 29: 102–7) und tragen für 14 der Fälle dieser Studie Rechnung, von denen 12 APC-Mutationen durch unsere Analyse aufzeigten. Zusätzlich, da Verbindungsanalyse indirekt ist, verbleibt eine gewisse Unsicherheit immer. Verschiedene Studien haben die direkte Detektion von APC-Mutationen in FAP-Patienten beschrieben, wobei die Detektionsraten von 10 bis 60% rangierten, abhängig vom angewendeten Verfahren (Groden, J. et al. (1991) Cell 66: 589–600; Miyoshi, Y. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4452–4456; Groden, J. et al., (1993) Am. J. Hum. Genet. 52: 263–272; Nagase, H. et al. (1993) Human Mutation (im Druck); Fodde, R. et al. (1992) Genomics 13: 1162–1168; Cottrell, S. et al. (1992) Lancet 340: 626–630; Ölschwang, S. et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52: 273–279; Varesco, L. et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52: 280–285). Die beschriebenen Screening-Verfahren waren im Allgemeinen sehr arbeitsintensiv und könnten einen wesentlichen Teil von subtilen Einzelbasenpaar-Austauschen verfehlen. In vielen Fällen wurde das gesamte APC-Gen nicht untersucht, vermutlich auf Grund von praktischen Erwägungen bezüglich dessen großer Größe. Western-blot-Analyse wurde verwendet, um trunkierte APC-Polypeptide zu detektieren und kann in einigen Fällen nützlich sein (Smith, K.J. et al. (1993). Natl. Acad. Sci. USA). Jedoch viele der trunkierten APC-Polypeptide in FAP sind in vivo instabil, was deren Demonstration durch Western-blot-Assays ausschließt ((Smith, K.J. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2846–2850). Beispielsweise trunkierte APC-Polypeptide konnten in drei von sieben FAP-Fällen, die mit Western-blot-Analyse untersucht wurden, nicht identifiziert werden, aber in allen sieben Fällen waren Mutationen leicht detektierbar durch die vorliegende Herangehensweise. Die Analyse der Polypeptide, die von Ersatz-APC-Genen synthetisiert wurden, kann schnell Mutationen identifizieren, welche in trunkiertem APC-Polypeptid resultiert, ob sie durch Splicemutationen, Punktmutationen oder Frameshifts verursacht sind. Ebenso identifiziert die ASE-Analyse cis-agierende Mutationen, welche APC-Expression verändern, beobachtet als ein Ungleichgewicht in der Repräsentierung von Allelen auf dem RNA-Transkript Level. Eine Vielzahl von Ereignissen, einschließlich Promotor-Mutationen, Splicemutationen, Mutationen, die die Transkript-Stabilität verändern und sogar Imprinting-Abnormalitäten haben das Potential, durch diese Analyse erkannt zu werden. Diese molekularen Herangehensweisen sind für die Identifizierung von Mutationen anwendbar, die zu gekürzten Polypeptiden oder reduzierter Expression in jedem Gen führen, aber sind insbesondere anwendbar bei der Analyse von großen Genen, wo konventionelle Verfahren zu arbeitsintensiv sind. Beispielsweise können die meisten Mutationen in den kürzlich isolierten Genen, die für Neurofibromatosis Typ 2 (Trofatter, J.A.,et al. (1993) Cell 72: 791; Rouleau, G.A. et al. (1993) Nature 363: 515) und für die von Hippel-Lindau Krankheit (Latif, F. et al. (1993) Science 260: 1317) verantwortlich sind, durch unsere Assays detektiert werden. Auf ähnliche Weise können die meisten Mutationen bei zystischer Fibrose durch diese Assays erkannt werden.
Die Detektion von APC-Veränderungen in 87% der FAP-Patienten illustriert die Nützlichkeit dieser Herangehensweise als einen genetischen Test für FAP. Darüberhinaus könnte die Fähigkeit, diesen Assay für die pränatale Diagnose einzusetzen, wichtig für FAP-Patienten sein, die eine Familie planen. Durch das zur Verfügung stellen eines Tests für routinemäßiges präsymptomatisches Testen stellen unsere Assays signifikante praktische Vorteile für FAP-Verwandte dar. Registrierungsaufzeichnungen für die 54 positiven Patienten zeigen, daß wenigstens 280 Verwandte ein Risiko für FAP tragen, die nun getestet werden können. 166 dieser Individuen sind unter einem Alter von 20 Jahren und sind in der Position, das meiste aus dieser Analyse zu gewinnen. Individuen, deren Tests positiv sind, kann wenigstens die Angst erspart werden, die mit dieser Unsicherheit verbunden ist, und sie können von verbessertem Management profitieren. Frühe Diagnose sollte sicherstellen, daß angemessene Vorbeugungsmaßnahmen getroffen werden, deutlich vor der unvermeidbaren Entwicklung von colorektalem Krebs. Die Wichtigkeit von präklinischem Testen wird weiter erhöht durch kürzliche Studien, die viel bei der pharmakologischen Behandlung von Polyposis versprechen (Waddell, W.R. et al. (1983) Journal of Surgical Oncology 24: 83–87; Waddell, W.R. et al. (1989) American Journal of Surgery 157: 175–179; Rigau, J. et al. (1991) Annals of Internal Medicine 115: 952–954; Labayle, D. et al. (1991) Gastroenterology 101: 635–639; Giardiello, F.M. et al. (1993) New England Journal of Medicine 328: 1313). Eine solche Behandlung von Individuen, die ein mutiertes APC-Gen erworben haben, sollte effizienter sein, wenn sie als präventive Maßnahme zur Verfügung gestellt wird, bevor Polypen oder andere klinische Manifestationen auftreten.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung, werden spezifische Gen-kodierende Sequenzen amplifiziert. Dies kann mit jeder Technik, die in der Technik bekannt ist, ausgeführt werden, einschließlich Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al., Science 329: 487–491, 1998) und Ligase-Kettenreaktion (Wu et al., Genomics, 4: 560– 569, 1989). Gen-kodierende Sequenzen können unter Verwendung von reverser Transkription der mRNA amplifiziert werden, um ein cDNA-Template zu bilden, oder es können Teile genomischer Sequenzen, welche frei von intervenierenden Sequenzen sind, verwendet werden.
DNA-Proben zum Testen können aus bestimmten betroffenen Geweben erhalten werden, so wie colorektale Tumore oder aus anderen Geweben, so wie aus periphärem Blut, chorionischem Villi und Blastomeren von Prä-Implantations-Embryos. DNA-Proben werden aus Personen erhalten, die im Verdacht stehen, an einer Krankheit, welche durch Mutation des Gens verursacht wird, das getestet wird, zu leiden, oder diese zu tragen. Beispielsweise würde eine DNA-Probe von einer Person erhalten werden bei der das Risiko besteht, familiäre adenomatöse Polyposis zu haben, um zu testen, ob Mutationen im APC-Gen vorliegen.
Templates, welche durch die Amplifizierung von Teilen des gewünschten Gens gebildet sind, werden vorzugsweise einen transkriptionalen Promotor und eine translationalen Initiierungsort enthalten. Diese werden bequemerweise an das Template während der Amplifizierung durch das Inkorporieren solcher Sequenzen in den Amplifikations-Primer, welcher komplementär zu dem Antisense-Strang des Gens ist, angehängt. Alternativ können diese durch eine separate Ligationsreaktion angehängt werden. Nach der Transkription und Translation der amplifizierten DNA (Templates) wird ein Polypeptid produziert, welches alle oder einen Teil der Aminosäurensequenz des Gens enthält, das getestet wird. In vitro-Transkription und – Translation (IVS) kann durch jedes in der Technik bekanntes System erreicht werden, einschließlich Kaninchen-Reticolozyten-Lysaten und Weizenkeim-Lysaten. WO 92-07949 offenbart ein Verfahren für die "in vitro" Produktion von Proteinen aus DNA-Sequenzen.
Polypeptide, welche durch IVS produziert werden, sind typischerweise mit einer radioaktiven Substanz oder einer fluoreszenten Substanz markiert. Beispielsweise ³⁵S-Methionin kann als ein Substrat während des IVS verwendet werden, um radioaktiv markierte Produkte zu produzieren, welche auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel abgetrennt werden können und autoradiografiert werden können. Andere Mittel für die Größentrennung oder Detektion von Polypeptid-Produkten, wie sie in der Technik bekannt sind, können ebenso verwendet werden. Mutationen, welche durch die IVS-Technik detektierbar sind, sind diejenigen, die zu trunkierten Polypeptiden führen, welche Nonsense- und Frameshift-Mutationen enthalten.
Wenn keine trunkierten Polypeptid-Produkte durch den IVS-Assay detektiert werden, kann man für auf Mutationen testen, die eine reduzierte Expressionsmenge verursachen.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann dies ausgeführt werden, wenn bestimmt wurde, daß der Patient heterozygot für einen Polymorphismus des Gens, das untersucht wird, ist. Gewisse Polymorphismen sind bereits in der Technik bekannt und können zu diesem Zwecke verwendet werden, aber andere können verwendet werden, wie sie gefunden werden. Kodierungsändernde "silent" Polymorphismen (d.h. diejenigen ohne offensichtlichen Effekt auf die Genexpression oder Proteinfunktion) sind bekannt bei APC-Codon 486, 545, 1493, 1756, 1960, 1678 und 2568. Siehe Powell et al. Nature 359: 235–237, 1992, dessen Offenbarung hiermit ausdrücklich hierin mit einbezogen ist. Die Gegenwart solcher Polymorphismen im Patienten kann, inter alia, unter Verwendung der Ligasevermittelten Gen-Detektionstechnik abgeschätzt werden, im Allgemeinen wie gelehrt durch Landegren et al., Science 241: 1077–1080, 1988, dessen Offenbarung hiermit ausdrücklich hierin mit einbezogen ist. Das Template für solch eine Ligase-vermittelte Reaktion kann genomische DNA sein.
Wenn gefunden wird, daß der Patient heterozygot für eine oder mehrere der Polymorphismen ist, kann dann die mRNA des Patienten als ein Template in einem zweiten Ligase-vermittelten Assay verwendet werden. Die relative mRNA-Menge, die von jedem der zwei polymorphen Allelen in der DNA-Probe des Patienten transkribiert wird, kann bestimmt werden. Wenn das Verhältnis größer ist als 1,2 oder kleiner ist als 8,0 , dann ist eine Mutation in einem der zwei polymorphen Allelen angezeigt, welche die Expression des Gens beeinflußt. Solche Mutationen beinhalten solche cis-agierenden Mutationen wie Promotor-Mutationen und Splice-Site-Mutationen.
Ein Allel-spezifischer Ligations-Assay bindet zwei Oligonukleotide, die direkt aneinander auf einem komplementären Target-DNA-Molekül angrenzen. Zwei Versionen der angrenzenden Oligonukleotide sind kovalent durch die Aktion einer DNA-Ligase mit einander verbunden, vorausgesetzt, daß die Nukleotide an der Anschlußstelle korrekt Basen-gepaart sind. Einer der zwei Oligonukleotide, die ligiert werden sollen, ist markiert. Dieses Oligonukleotid ist komplementär zu der DNA, die direkt an den Polymorphismus angrenzt. Das zweite und ein drittes Oligonukleotid sind nicht markiert und jedes dieser Oligonkleotide enthält als sein terminales Nukleotid (angrenzend an das erste Oligonukleotid, wenn annealt wurde) eines der zwei polymorphen Varianten, die für den Patienten unter Evaluierung relevant sind. Die Längen dieser zwei Versionen des zweiten Oligonukleotids sind unterschiedlich voneinander. Daher sind die Produkte der Ligations-Reaktion, wenn sie zu den komplementären Target-cDNA-Molekülen hybridisiert und ligiert sind, voneinander auf der Basis ihrer Größe unterscheidbar. Die Menge der Ligations-Produkte wird proportional zu der Menge mRNA sein, welche in der Probe von jedem Allel exprimiert wurde. Die Ligations-Produkte können auf Sequenzierungsgels, beispielsweise getrennt werden, und die Menge jedes Produktes kann mit einem Phosphor-Imager bestimmt werden. Wenn das Verhältnis von mRNA, das von einem Allel gemacht ist, zur mRNA, das vom anderen Allel gemacht ist, außerhalb des Bereiches von 1 +/– 0,2 liegt, ist eine Mutation angezeigt.
Große Gene sind insbesondere geeignet für die vorliegende Analyse, auch wenn sie bei jedem Gen angewendet werden kann. Krankheiten, die durch Trunkierungs-artige Mutation verursacht werden, sind bevorzugt. Diese beinhalten, aber sind nicht limitiert auf zystische Fibrosis, Hippel-Lindau-Krankheit, familiäre adenomatöse Polyposis, erblicher nichtpolypöser Dickdarmkrebs (HNPCC) und Neurofibromatose Typ 2.
Primer für die Amplifizierung von bestimmten Teilen oder gesamten Genen werden zur Verfügung gestellt. Diese Primer sind gepaart und können verwendet werden als individuelle Paare oder als Sets, welche eine gesamte kodierende Sequenz amplifizieren werden. Jeder Primer besitzt typischerweise eine Länge von 10 oder mehr Basen. Die Sequenz des Primers ist primär komplementär zu einem Strang der Gen-kodierenden Sequenz, vorzugsweise etwa zu fünfzehn oder zwanzig kontinuierliche Basen der Gen- kodierenden Sequenz. Jeder Primer eines Paares hybridisiert und ist komplementär zu gegenüberliegenden Strängen der kodierenden Sequenz. Wünschenswerterweise wird ein Primer jedes Paares die Sequenz eines Promotors und einer Translationsinitiierungssequenz beinhalten. Dieser Primer ist komplementär zu dem Antisense-Strang des Gens, das amplifiziert werden soll. Jeder Promotor und jede Initiierungssequenz kann verwendet werden, die mit dem verwendeten IVS-System kompatibel ist. Ein bevorzugter Promotor und Initiierungssequenz ist die von T7. Andere, wie sie in der Technik bekannt sind, können verwendet werden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel demonstriert, daß der in vitro synthetisierte (IVS) Protein Assay ein stichhaltiger Weg ist, trunkierende Mutationen zu detektieren.
Wir haben 20 sporadische colorektale Tumoren analysiert, von denen vorher durch Sequenzanalyse gezeigt wurde, daß sie trunkierende APC Mutationen haben (Powell, S.M., et al. (1991) Nature 359: 235–237). In jedem Falle konnte ein spezifisches trunkiertes Polypeptid leicht identifiziert werden, was der Größe des vorausgesagten Mutantenproduktes entsprach (Beispiel in 2). Das Full-Length-Proteinprodukt von dem verbleibenden normalen Allel wurde ebenso in jedem Falle bemerkt.
In vitro synthetisierter (IVS) Protein Assay Zum Zwecke der PCR wurde das APC Gen in fünf überlappende Segmente (#1 bis 5) unterteilt, die die Codons 1 bis 804, 686 bis 1217, 1099 bis 1693, 1555 bis 2256 und 2131 bis 2843 des APC respektive enthielten (siehe 6). Die für die PCR Amplifizierung verwendeten Primer wurden entworfen, so daß sie eine T7 Promotorsequenz für die Initiierung der Transkription durch T7 RNA Polymerase ebenso wie eine übereinstimmende Sequenz zur Initiierung der Translation einführten (Kozak, M. (1987) Nucleic Acids Research 15: 8125–8133). Segment 1 wurde aus cDNA Template isoliert, die durch revers transkribierte mRNA hergestellt wurden. Segmente 2 bis 5 wurden direkt aus genomischer DNA isoliert. Für Segment 1 wurde zufällig geprimtes cDNA Template durch Inkubieren von 5 μg gesamt RNA, ein μg eines zufälligen Hexamers, ein μl des Amplifizierungsverstärkers (0,5 units/μl; USB) und 300 units von Superskript 2 reverser Transkriptase (BRL) in 20 μl eines Reaktionspuffers für eine Stunde bei 37°C hergestellt. Als eine Kontrolle für die Kontamination wurde eine Mock-reverse Transkriptase Reaktion alles außer dem Enzym enthaltend parallel ausgeführt, und als ein PCR Template verwendet. Zweischrittige, genestete PCR wurde unter Verwendung des USB Bind-Aid Amplifizierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Änderungen ausgeführt. Für den ersten Schritt wurden 4 μl cDNA Template, 35 ng jedes äußeren Primers (siehe unten) und 2,5 Units Taq-Polymerase (Cetus) in einer 20 μ1 PCR Reaktion für 10 Zyklen (95°C × 30 Min., 62,5°C × 2 Min., 70°C × 3 Min.) in einem Gesamtvolumen von 50 μl verwendet.
Für Segmente 2–5 wurden 100 ng genomische DNA, 350 ng jedes der entsprechenden Primer (siehe unten) und 5,0 Units Taq-Polymerase in einer 50 μl Bind-Aid Amplifizierungskit (USB) Reaktion verwendet. Amplifizierung wurde 35 Zyklen lang ausgeführt mit 30 Sek. Denaturierung (95°C), 90 Sek. Annealing (Segment 2,60°C; Segment 3, 65°C; Segment 4, 62,5°C. Segment 5, 60°C und 90 Sek Extension (70°C). Alle PCR-Reaktionen enthielten eine fünf Minuten lange Extensionsperiode.
PCR-Produkte wurden direkt (ohne Aufreinigung) als Templates in 25 μl gekoppelten Transkriptions/Translationsreaktionen (Promega) enthaltend 40 μCi S³⁵-Methionin Translabel (ICN) für eine Stunde bei 30°C verwendet. Die Proben wurden in einem Probenpuffer verdünnt, gekocht für 5 Minuten und ein Zehntel wurde auf einem 10%-20%-Gradienten SDS-Polyacrylamidgel analysiert. Die Polypeptide wurden durch Fluorographie nach dem Imprägnieren des Gels mit ENHANCE (NEN) visualisiert. Die Sequenz der Amplifizierungsprimer war wie folgt, wobei [T7-Trans] die Sequenz repräsentiert, die in 6 angegeben ist.
Beispiel 2
Dieses Beispiel demonstriert, daß der IVS Protein-Assay verwendet werden kann, um FAP aus periphren Blutproben zu diagnostizieren.
Die Analyse der gesamten kodierenden Region des APC mit dem IVS Protein-Assay identifiziert die trunkierenden Mutationen in 51 (82%) Patienten (Beispiele in 3). Die 51 Mutationen waren über die ersten vier Segmente verteilt, wobei 29, 10, 11 und 1 in Segmenten 1, 2, 3 und 4 respektive waren.
Studierte Gruppe
Die aktuellsten 62 unverwandten Patienten, die in dem Johns Hopkins FAP-Register aufgeführt waren, von denen Blutproben erhalten werden konnten, wurden für die Analyse in einer nicht ausgerichteten Art und Weise ausgewählt. Für alle diese Individuen war bestätigt, daß sie klassische adenomatöse Polyposis hatten, wie definiert durch die Gegenwart von mehr als 100 kolorektalen Polypen zum Zeitpunkt der diagnostischen Endoskopie, radiologischen Studie oder Überprüfung von operativ entfernten Dickdärmen. Die adenomatöse Natur der Polypen wurde durch histopathologische Analyse dokumentiert.
Blutproben wurden ebenfalls von neun gesunden Individuen gesammelt, Alter 22 bis 43, als normale Kontrollen, und von sieben Verwandten der drei FAP-Patienten. Informiertes Einverständnis gemäß den institutionellen Vorschriften wurde von jedem Subjekt vor der Entnahme der Blutproben erhalten.
Herstellung der Templates
Gesamtblutproben wurden von 45 FAP-Patienten erhalten und bestanden aus 20 cc EDTA antikoaguliertem Gesamtblut gesammelt und gelagert über Nacht bei Raumtemperatur. Genomische DNA wurde präpariert durch Chelex-Extraktion von 30 μl des Gesamtblutes, wie vorher beschrieben (Walsh, P.S., et al. (1991) Biotechniques 10: 507–513). RNA wurde isoliert durch das selbe Guanidinium Isothiocyanat-Phenolchloroform-Extraktionsverfahren (Chomczynsiki, P., et al. (1987) Analytical Biochemistry 162: 156–159) aus periphären mononuklearen Zellen, hergestellt aus 10 cc Gesamtblut unter Verwendung eines Histopaque-1077(Sigma)-Gradienten.
Lymphoblastoidzelllinien wurden aus 17 FAP-Patienten durch Epstein-Barr-Virus-Immortalisation von deren Lymphozyten erhalten. RNA und DNA wurden aus solchen Zellen wie beschrieben extrahiert (Chomczynsiki, P., et al. (1987) Analytical Biochemistry 162: 156–159; Goelz, S.E., et al. (1985) Biochemical and Biophysical Research Communications 130: 118–126).
Beispiel 3
Dieses Beispiel demonstriert die Genauigkeit des Allel-spezifischen Expressions-Assays (ASE).
Unter Beachtung der Tatsache, daß einige FAP-Fälle aus Promotor- oder Splicingmutationen resultieren könnten, die zur reduzierten Spiegeln von normalen APC-Transkripts führen, haben wir uns zusätzlich Wegen zugewandt, um solche Mutationen leicht zu identifizieren. Da diese cis-agierenden Mutationen höchstens in einem 50%igen abgesenkten Spiegel des Gesamttranskripts resultieren könnten, mußten wir einen empfindlichen Assay für die Expression jeder der zwei Allele individuell entwerfen. Daher nutzten wir den Vorteil von Einzelbasenpolymorphismen aus, um einen allelspezifischen Expressions-Assay (ASE) zu entwerfen, um diese Art der Veränderung zu detektieren (1B). Die Genauigkeit dieses Assays wurde in einem Allel-Mischungsexperiment demonstriert. Eine kontrollierte RNA-Menge aus zwei Patienten, jeder homozygot für unterschiedliche Allele bei dem polymorphen Ort in Exon 11 wurden miteinander in bestimmten Verhältnissen vermischt, amplifiziert und mit dem ASE-Assay analysiert. Relative Allelmengen, bestimmt durch ASE-Analyse dieser Proben, waren linear und quantitativ bezüglich der vorhergesagten Verhältnisse (r = 0,997, 4).
Allel-spezifischer Expressions-Assay (ASE)
Die Zweiortpolymorphismen, die in diesem Assay verwendet wurden, waren stille Einzelpaarbasenaustausche, einer in Exon 11 (Kodon 486, TAC/TAT) und einer in Exon 13 (Kodon 545, GCA/GCG) (Powell, S.M., et al. (1991) Nature 359: 235–237). Homozygote Fälle wurden zunächst durch Analysieren von amplifiziertem APC Exon 11 und 13 aus genomischer DNA gesucht.
Amplifizierung von Exon 11 und 13 wurde ausgeführt unter Verwendung von ungefähr 100 ng genomischer DNA, 350 ng jedes Primers und 2,5 units Taq Polymerase in einer 50 μ1 Bind-Aid-Amplifizierungskit(USB)-Reaktion mit 35 Zyklen [30' Denaturierung (95°C), 1' Annealing (Exon 11, 52,5° C; Exon 13, 55°C) und einer Minute Extension (70° C)]. Alle Reaktionen enthielten eine fünfminütige Extensionsperiode am Ende. Die Sequenzen der für die Amplifizierung verwendteten Primer waren wie folgt:
Das genomische PCR-Produkt wurde zu einem modifizierten allel-spezifischen Ligations-Assay (Landren, et al. supra, was hierin durch Referenz mit aufgenommen ist) hinzugefügt. Ein gewöhnlicher Neunbasenpaar-³²P-markierter Oligomer und zwei allelspezifische Oligomere unterschiedlicher Größe (8 und 10 Basenpaare) wurden in dem Ligations-Assay verwendet.
Spezifisch wurde ein μl genomisches PCR-Produkt zu 2 ng eines gewöhnlichen ³²P-markierten Oligomers (Exon 11, 5'-GGGCTTACT-3'; Exon 13, 5'-AGTGTTTTGA-3') und 2 ng allel-spezifischen Oligomers (Exon 11, 5'-TGAAATGTAC-3' und 5'-AAATGTAT-3'; Exon 13, 5'-GGTTATTGCA-3' und 5'-TTATTGCG-3') in eine modifizierte Ligase-vermittelte Reaktion hinzugefügt. Die Ligationsprodukte wurden durch Polyacrylamid/8M-Harnstoff-Sequenziergele getrennt und die Häufigkeit jedes Allels wurde bestimmt durch die relativen Mengen des allel-spezifischen Ligationsproduktes (17 bp für Allel A, 19 bp für Allel B, siehe 4). Quantifizierung wurde erreicht durch einen PhosphorImager^TM (Molecular Dynamics, Inc.). Segment 1 PCR-Produkte (abgeleitet von mRNA, wie für den IVS Protein-Assay) wurden dann in derselben quantitativen Ligationsreaktion analysiert, um die relative Häufigkeit des APC-Transkripts, das von jedem Allel exprimiert wird, zu bestimmen.
Beispiel 4
Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung des ASE-Assays, um Patienten- und Gesundenkontrollen ohne detektierbare Proteinabnormalitäten mit dem IVS-Assay zu evaluieren.
Wir verwendeten den ASE-Assay, um die elf FAP-Patienten ohne detektierbare APC-Proteinabnormalitäten ebenso wie neun gesunde nicht-FAP-Kontrollen zu evaluieren.
Sieben Patienten und sechs normale Individuen waren heterozygot für wenigstens einen der zwei Polymorphismen und konnten dadurch analysiert werden. Das relative Allelverhältnis war 1+/–0,15 für alle genomischen DNA-Proben (FAP oder normale Individuen) und für die RNA von Kontrollindividuen. Drei der FAP-Patienten hatten signifikant reduzierte Expressionen von einem Allel (5). In jedem dieser drei Fälle war das Verhältnis der Allelhäufigkeit von exprimiertem RNA-Template signifikant unterschiedlich von dem den normalen Individuen und von den Verhältnissen, die gefunden wurden unter Verwendung von genomischer DNA anstelle von RNA als Template (P < 0,001, zweiseitiger ungepaarter Studenten-t-Test). Wenigstens ein anderes betroffenes Familienmitglied von den Verwandten dieser drei Patienten wurde ebenso analysiert und es wurde gefunden, daß dieses ähnlich reduzierte Expression des selben Allels aufweist, was die erwartete Vererbung zeigt.
Zusammen identifizierten diese zwei Assays (IVS-Protein und ASE) erfolgreich APC-Mutationen in 87% der 62 unterschiedlichen getestenten FAP-Verwandten.
SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: MOLEKULARDIAGNOSE VON FAMILIÄRER ADENOMATÖSER POLYPOSIS
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 23
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: BANNER, BIRCH, MCKIE AND BECKETT
(B) STRASSE: 1001 G STREET; N.W.
(C) STADT: WASHINGTON
(D) STAAT: D.C.
(E) LAND: U.S.A.
(F) ZIP: 20001
(v) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUMART: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG: DEZ-13-1994
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWALT/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: KAGAN, SARAH A.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 32,141
(C) REFERENZ/DOCKET NUMMER: 1107.47545
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 202.508.9100
(B) TELEFAX: 202.508.9299
(C) TELEX: 197430 BBMB UT
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR: 1:
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(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 23:

Claims

Ein Verfahren zum Erfassen von Mutationen in einem APC-Gen, welches folgende Schritte umfaßt: Bilden von APC-Templates durch Amplifizieren einiger oder sämtlicher Teile der codierenden Sequenzen des APC-Gens in einer menschlichen DNA-Probe; Herstellen von Polypeptidprodukten dieser APC-Templates in in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen; Analysieren dieser Polypeptidprodukte, um die Größe dieser Polypeptidprodukte zu bestimmen, wobei ein trunkiertes Polypeptidprodukt eine Mutation in einem APC-Gen in der DNA-Probe anzeigt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das weiterhin die folgenden Schritte umfaßt: Bestimmen, ob der Mensch heterozygot für einen Polymorphismus in dem APC-Gen ist, wobei ein Mensch, der heterzygot ist, eine erste und ein zweites polymorphes Allel eines APC-Gens besitzt; Bestimmen der relativen Menge an transkribierter mRNA von jeder der zwei polymorphen Allele in einer DNA-Probe eines heterozygoten Menschen, wobei ein Verhältnis der mRNA, die von dem ersten Allel transkribiert worden ist zu der mRNA, die von dem zweiten Allel transkribiert worden ist, welches größer als 1,2 oder kleiner als 0,8 ist, eine Mutation in einem der Allele in der DNA-Probe anzeigt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Probe von einem kolorektalen Tumor stammt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Probe aus Periphärblut stammt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Probe aus pränatalen oder embryonalen Zellen stammt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Bildens von Templates Primer verwendet, welche eine Promotorsequenz zur Initiierung der Transkription und eine Sequenz für die Initiierung der Translation einführen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Bildens der Templates Primer verwendet, welche eine T7-Promotersequenz zur Initiierung der Transkription durch T7 RNA-Polymerase einführen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Bildens der Templates Primer verwendet, welche die Sequenzen besitzen, die in SEQ ID NOS: 1–10 gezeigt sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Bildens der Templates cDNA-Templates zum Amplifizieren der Exons 1–14 und genomische DNA zum Amplifizieren von Exon 15 verwendet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Analysierens SDS-Polyacrylamidgele verwendet, um die Polypeptidprodukte auf der Basis ihrer Größe zu trennen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Polymorphismus ein stummer Einzelbasenpaaraustausch ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Polymorphismus in einem Codon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Codons 486, 545, 1493, 1756, 1960, 1678 und 2568, vorhanden ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Gegenwart des Polymorphismus mittels eines Allel-spezifischen Ligationsassays bestimmt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die relative Menge mRNA, transkribiert von jedem polymorphen Allel, mittels eines Allel-spezifischen Ligationsassays bestimmt wird.
Ein Primerpaar zum Amplifizieren eines Segmentes der codierenden Sequenz des APC-Gens, um Templates zu bilden, die für in vitro Transkription und Translation nützlich sind, wobei einer der Primer einen transkriptionalen Promoter und eine translationale Initiierungssite enthält, wobei jeder der Primer wenigstens etwa zwanzig kontinuierliche Nukleotide umfaßt, die komplementär zu den gegenüberliegenden Strängen der codierenden Sequenzen des Gens liegen und wobei der Primer, welcher den transkriptionalen Promoter und die translationale Initiierungssite enthält, komplementär zu dem Antisense-Strang des Gens ist, und die Primer haben Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe derer, die in SEQ ID NOS: 1 und 2, SEQ ID NOS: 3 und 4, SEQ ID NOS: 5 und 6, SEQ ID NR: 7 und 8 und SEQ ID NOS: 9 und 10 gezeigt sind.
Ein Satz Primerpaare zum Amplifizieren aller Segmente der codierenden Sequenz des APC-Gens, um Templates zu bilden, die bei der in vitro Transkription und Translation nützlich sind, wobei ein Primer in jedem Primerpaar einen transkriptionalen Promoter und eine translationale Initiierungssite enthält und wobei jeder der Primer wenigstens zwanzig kontinuierliche Nukleotide umfaßt, die komplementär zu den gegenüberliegenden Strängen der codierenden Sequenzen des Gens sind und wobei die Primer, die einen transkriptionalen Promoter und eine translationale Initiierungssite enthalten, komplementär zu dem antisense-Strang des Gens sind, und der Primerpaarsatz zehn Primer umfaßt, die Sequenzen haben, wie sie in SEQ ID NOS: 1–10 gezeigt sind.
Ein Verfahren zum Erfassen von Mutationen in einem Gen eines Menschen, der in Verdacht steht, ein Träger einer Krankheit zu sein, die durch eine Mutation eines Gens verursacht ist, oder durch eine Krankheit, die durch eine Mutation eines Gens verursacht ist, betroffen zu sein, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Bilden von Templates durch Amplifieren einiger oder sämtlicher Teile der codierenden Sequenzen des Gens in einer DNA-Probe eines Menschen; Herstellen von Polypeptidprodukten aus diesen Templates durch in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen; Analysieren dieser Polypeptidprodukte, um die Größe der Polypeptidprodukte zu bestimmen, wobei ein trunkiertes Polypeptidprodukt eine Mutation in dem Gen in der DNA-Probe anzeigt; wobei das Verfahren weiterhin die Bestimmung umfaßt, ob der Mensch heterozygot für einen Polymorphismus in dem Gen ist, wobei ein Mensch, der heterozygot ist, ein erstes und ein zweites polymorphes Allel des Gens besitzt; und Bestimmen der relativen Menge an transkribierter mRNA von jedem der beiden polymorphen Allele in der DNA-Probe eines heterozygoten Menschen, wobei ein Verhältnis der mRNA, die von dem ersten Allel transkribiert worden ist zu der mRNA, die von dem zweiten Allel transkribiert worden ist welches größer ist als 1,2 oder kleiner ist als 0,8, eine Mutation in einem der Allele in der DNA anzeigt.