DE68915202T3

DE68915202T3 - Verfahren zur Vermehrung und zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen.

Info

Publication number: DE68915202T3
Application number: DE68915202T
Authority: DE
Inventors: Bruce R. South Pasadena Wallace
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 1988-04-06
Filing date: 1989-04-05
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2009-04-06
Also published as: AU3245789A; EP0336731A3; JP2954232B2; CA1341584C; DE68915202T2; JPH0223899A; EP0336731A2; EP0336731B1; DE68915202D1; AU630087B2; NZ228580A; EP0336731B2

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäuresequenzen.
Es sind Verfahren bekannt, um Teile von Nucleinsäuren enzymatisch miteinander zu verbinden. Weiss, B., et al., J. Biol. Chem. 245(17): 4543 (1986) beschreiben ein Verbinden von zwei Segmenten eines unterbrochenen Stranges in einem DNA-Doppelstrang unter Verwendung von T4-Polynucleotid-(DNA)-Ligase. Sgaramella, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 67(3): 1468 (1970) lehren die Verwendung von T4-Polynucleotid-(DNA)-Ligase, um glatte Enden von DNA-Doppelsträngen zu verbinden. Nath, K., et al., J. Biol. Chem. 249 12 : 3680 (1974) beschreiben die Verwendung von DNA-Ligase, um Polyribonucleotide an Polydeoxyribonucleotiden anzubringen. Higgins, N. P., et al., Methods in Enzymology 68: 50 (1979) bieten einen Überblick über Enzyme, die DNA verbinden. Harrison, B., et al., Nucleic Acids Research 12: 8235 (1984) lehren eine verstärkte Ligation von Oligonucleotiden und Polynucleotiden mit T4-RNA-Ligase in Polymerlösungen.
Hinsichtlich einer Vermehrung oder Amplifikation beschreiben Saiki, R. K., et al., Science 230: 1350 (1985) eine enzymatische Amplifikation von genomischen β-Globinsequenzen, bezeichnet als die Polymerasekettenreaktion, bei welcher zwei Oligonucleotidprimers, die den zu amplifizierenden Bereich flankieren, vorgesehen, die Primers an Stränge einer denaturierten genomischen DNA annealt und mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase 1 und Deoxyribonucleosidtriphosphaten verlängert werden. Das US-Patent 4,683,202 für Mullis beschreibt ferner das Verfahren der Polymerasekettenreaktion.
Das US-Patent 4,683,194 für Saiki et al. beschreibt ein Verfahren zum Detektieren einer spezifischen polymorphen Restriktionsstelle in einer Nucleinsäuresequenz durch Hybridisieren der Sequenz an eine Oligonucleotidsonde, die zur Sequenz komplementär ist und die Restriktionsstelle überspannt, welche an denjenigem Ende der Sonde, das der Restriktionsstelle näher ist, markiert ist. Die Nucleinsäuresequenz und die daran hybridisierte Sonde werden dann mit einer Restriktionsendonuclease verdaut, markierte und unmarkierte Oligomerfragmente werden getrennt, und markierte Oligonucleotide werden detektiert.
Das US-Patent 4,683,195 für Mullis et al. beschreibt ein Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung von Primers und Polymerisationsmitteln und ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit oder der Abwesenheit einer spezifischen Nucleinsäurefrequenz. Getrennte Stränge einer Nucleinsäureprobe werden mit einem Überschuß an zwei verschiedenen Oligonucleotidprimers behandelt, und die Primers werden verlängert, um komplementäre Verlängerungspro dukte zu bilden, welche als Matrizen zum Synthetisieren der gewünschten Nucleinsäurefrequenz dienen. Dann wird die amplifizierte Sequenz detektiert, indem eine markierte Sonde zugegeben wird, die an die zu detektierende Sequenz hybridisieren kann.
Die EP-A-0 246 864 offenbart ein Splitsonden-Hybridassay, bei dem eine Zielbasensequenz am terminalen Ende einer ersten Sonde liegt und dieses terminale Ende an eine zweite Sonde angrenzt, welche dann mittels eines Ligaseenzyms mit der ersten Sonde verbunden werden kann. Das so erhaltene Signal wird dann amplifiziert, im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, bei der die Zielbasensequenz selbst amplifiziert wird.
Die vorliegende Erfindung ist bei diagnostischen Anwendungen brauchbar, weil sie zuerst als ein Mittel zum Amplifizieren von vorgegebenen Nucleinsäuresequenzen aus Nucleinsäure-Matrizen verwendet werden kann, so daß die Matrizensequenzen leichter detektiert werden können. Um eine vorgegebene Aminsäuresequenz mit einer Zielsequenz zu amplifizieren, wird eine einzelsträngige Matrize bzw. Matrix mit der Zielsequenz erzeugt, und mindestens ein Oligonucleotidpaar wird an die angrenzenden Sequenzen der Matrize hybridisiert, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden. Die aneinander gelagerten Oligonucleotide werden ligiert, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, und das doppelsträngige Ligationsprodukt wird denaturiert, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsstrang herzustellen. Diese Schritte werden wiederholt, so daß sowohl der ursprüngliche Matrizenstrang, als auch der Oligonucleotid-Ligationsstrang als Matrizen für weitere Ligationsreaktionen fungieren.
Obgleich die Möglichkeit einer Ligation unter Fehlpaarungs- bzw. Fehlanpassungsbedingungen besteht, in welchen die Base, welche zu der Endbase eines der Oligonucleotide bei der Ligationsverbindung komplementär ist, in einer vorgegebenen Matrize nicht vorhanden ist, ist gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt worden, daß eine solche Ligation unterdrückt werden kann, so daß eine Basenfehlanpassung an jeder Seite der Ligationsverbindung den Ligationswirkungsgrad bzw. die Ligationseffizienz zwischen den zwei Oligonocleotidsträngen verringert und als theoretische Basis dient, Unterschiede in einzelnen Basen auf einer Nucleinsäure-Matrize zu erkennen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können daher auch als eine Diagnosetechnik angewendet werden, um Einzelbasen- oder Basenpaarmutationen in Nucleinsäuresequenzen zu detektieren. Dieser weitere Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher brauchbar, genetische Erbkrankheiten zu diagnostizieren, wie Sichelzellenanämie, Hämophilie und Farbblindheit, welche von einer Einzelpunktmutation auf einem kritischen Strukturgen stammen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz bereit, umfassend die Schritte:

(a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz,
(b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden,
(c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen,
(d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsproduktes, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonueleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und
(e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Schritte (b) bis (e) in einem Reaktionsgemisch, welches mindestens 200 mM NaCl enthält, durchgeführt werden.

Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz,
(b) Amplifikation der Matrize durch Polymerasekettenreaktion (PCR), um ein PCR-Amplifikationsprodukt herzustellen, welches vielfache Kopien der Matrize mit der Zielsequenz umfaßt,
(c) Hybridisierung von Oligonucleotidpaaren an angrenzende Sequenzen der Kopien der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrizenkopien zur Ligation aneinander gelagert werden,
(d) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um doppelsträngige Produkte herzustellen,
(e) Denaturierung des doppelsträngigen Produktes, um eine Vielzahl der ursprünglichen Matrizenstränge und eine Vielzahl der Oligonucleotid-Produktstränge herzustellen, und
(f) Wiederholung der Schritte (c) bis (e), so daß beide, die ursprünglichen Matrizenstränge und die Oligonucleotid-Ligationsstränge, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren.

Gemäß einem dritten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifikation einer Vielzahl von Nucleinsäuresequenzen bereit, die in einem oder mehreren Nucleinsäuremolekülen vorliegen, welche jede eine Zielsequenz umfassen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Erzeugung, wie angemessen, einer einzelsträngigen Matrize mit Zielsequenzen oder einer Vielzahl von einzelsträngigen Matrizen, welche jede eine Zielsequenz umfassen,
(b) Hybridisierung einer Vielzahl von Oligonucleotidpaaren an angrenzende Sequenzen der Matrize(n), wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenzen umfassen, so daß jedes der Oligonucleotidpaare an eine Matrize zur Ligation aneinander gelagert wird,
(c) Ligation der so aneinander gelagerten Oligonucleotidpaare, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen,
(d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um die ursprünglichen Matrizenstränge und Oligonucleotid-Ligationsproduktstränge herzustellen, und
(e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, die ursprünglichen Matrizenstränge und die Oligonucleotid-Ligationsproduktstränge, als Matrizen für weitere Ligationsreaktionen fungieren.

Gemäß einem vierten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Erbkrankheit bereit, welches das Analysieren des Genotyps eines Patienten durch ein Verfahren umfaßt, welches die Amplifikation einer Nucleinsäure umfaßt, die eine Zielsequenz umfaßt, wobei das Amplifikationsverfahren die Schritte umfaßt:

(a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize einer Zielsequenz,
(b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden,
(c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen,
(d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsproduktes, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und
(e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang, als Matrizen für eine weiter Ligationsreaktion fungieren.

Gemäß einem fünften Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz aus genomischer DNA bereit, wobei das Amplifikationsverfahren die Schritte umfaßt:

(a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz,
(b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden,
(c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen,
(d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und
(e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren.

Gemäß einem sechsten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz bereit, umfassend die Schritte:

(a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz,
(b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden,
(c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um einen doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen,
(d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und
(e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Matrizennucleinsäure aus Bakterien stammt.

Gemäß einem siebten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz bereit, umfassend die Schritte:

(a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz,
(b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden,
(c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen,
(d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und
(e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Matrizennucleinsäure aus Hefe stammt.

Gemäß einem achten Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz bereit, umfassend die Schritte:

(a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz,
(b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden, und
(c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen,
(d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsproduktes, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und
(e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Matrizennucleinsäure aus einem Virus stammt.

Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen ersichtlich.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht eine Matrix mit einer Länge von 35 Basenpaaren des normalen, menschlichen (β^a) Beta-Globin-Gens im Bereich des allelischen Basenpaar-DNA-Polymorphismus, der mit Sichelzellenanämie assoziiert ist, und vier Oligodeoxyribonucleotid-Substratstränge, die zum normalen Beta-Globinallel des Gens, das zur Ligationsamplifikation verwendet werden soll, komplementär ist.
2 veranschaulicht eine Matrix mit einer Länge von 35 Basenpaaren des menschlichen (β^s) Sichelzellen-Beta-Globin-Gens im Bereich des allelischen Basenpaar-DNA-Polymorphismus, der mit der Sichelzellenanämie assoziiert ist, und vier Oligodeoxyribonucleotid-Substratstränge, die zum Sichelzellenallel des Gens, das zur Ligationsamplifikation verwendet werden soll, komplementär ist.
3 ist ein schematisches Diagramm einer Matrix-gerichteten, exponentiellen Ligationsamplifikation.
4 ist eine Photographie eines Autoradiogramms eines Produktes einer linearen Amplifikationsligation von β^s flankierenden Oligonucleotidsubstraten auf Sichelzellen- (Streifen c und g) und normalen Beta-Globin-Oligonucleotidmatrizen (Streifen d und h).
5A ist eine Photographie von Autoradiogrammen von Reaktionsprodukten aus sechs Durchgängen einer exponentiellen Amplifikationsligation von flankierenden Oligonucleotidsubstraten, die zur Sequenz des Sichelzellengens unter Verwendung der Sichelzellen- (Hβ23S') und der normalen (Hβ 23A') Oligonucleotidmatrix komplementär gemacht wurden.
5B zeigt eine logarithmische Auftragung eines Amplifikationsvielfachen gegen die Anzahl von Durchgängen exponentieller Amplifikationsligationen, die durchgeführt wurden.
6 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das ein Ligationsamplifikationsprodukt von 10–14 exponentiellen Durchgängen einer Ligationsamplifikation unter Verwendung von Matrizen aus Plasmiden enthält, die ein normales (Streifen g–i) und ein Sichelzellen-(Streifen d–f)-Beta-Globin-Gen enthalten, wobei flankierende Oligonucleotidsubstrate verwendet wurden, die zur Sequenz des SichelzellenBeta-Globin-Gens (2) und zur Gensequenz des normalen Beta-Globins (1) komplementär gemacht wurden.
7A und 7B sind Photographien von Autoradiogrammen, die von einer Amplifikation von menschlicher genomischer DNA unter Verwendung von β-Thalassaemie- (Streifen a, b), Sichelzellen-(Streifen c, d) und normaler β-Globin-DNA-Matrix (Streifen e, f) erhalten wurden. 7A stammte von ligierenden, β^s flankierenden Oligonucleotiden; 7B stammte von ligierenden, β^a flankierenden Oligonucleotiden.
8 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das ein lineares Ligationsamplifikationsprodukt enthält, wobei ein Paar von β^s flankierenden Oligonucleotiden und einer menschlichen genomischen DNA-Matrix von β-Thalassaemie (Spalte a), Sichelzellen (Spalte b) und normalem β-Globin (Spalte c) verwendet wurde. Streifen d–f sind Kontrollen.
9A ist eine Photographie eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels, welches PCR-amplifizierte Fragmente mit 294 Basenpaaren von Allelen am menschlichen Beta-Globin-Gen enthält.
9B(a) und 9B(b) sind Photographien von Autoradiogrammen von PCR-Produkten aus der 9A, geltransferiert auf Nylonmembranen und hybridisiert mit radiomarkierten Hβ19S- (Streifen a) und radiomarkierten Hβ19A-Sonden (Streifen b)
9C ist eine Photographie eines Autoradiogramms von Ligationsamplifikationsprodukten, wobei mit PCR angereicherte Sequenzen als Matrizen verwendet wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann sowohl zum Amplifizieren jeder Nucleinsäuresequenz-Matrix als auch zur Erkennung und Detektierung von Unterschieden in einzelnen Basen auf Nucleinsäure-Matrizen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ist daher zum Diagnostizieren einer Reihe von Erbfehlern brauchbar, die von Punktmutationen resultieren, wie die Sichelzellenanämie. Bei anderen diagnostischen Anwendungen ist eine Signalamplifikation notwendig, um die beschränkte Anzahl von DNA-Matrixkopien in genomischer DNA zu detektieren. In 10 μg einer DNA sind zum Beispiel etwa 1 Million Kopien eines einzelnen Gens vorhanden. Ferner könnte, in Abhängigkeit von der im einzelnen vorgenommenen diagnostischen Methode, lediglich eine beschränkte DNA-Menge verfügbar sein.
Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung werden kurze Oligonucleotidstränge synthetisiert, die einer Nucleinsäure-Matrix komplementär sind.
Diese relativ kurzen Oligonucleotide werden in der Regel mit ON-1, ON-2, ON-3 und ON-4 bezeichnet, wie in 1 dargestellt. Die Oligonucleotide können gemäß Verfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Die Längen der Oligonucleotide müssen ausreichend groß sein, um genug eines einzigartigen Basenmusters zu enthalten, um zu bewirken, daß die Oligonucleotide lediglich an die Teile der Nucleinsäurematrix hybridisieren oder annealen, welche zur interessierenden Zielsequenz beitragen. Die genauen Längen der Oligonucleotide hängen von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Reaktionstemperatur, den pH-Bedingungen und der Komplexizität der Zielsequenz. Im allgemeinen bilden die Oligonucleotide mit etwa 4 bis etwa 100 Nucleotiden ausreichend stabile Hybridkomplexe bei höheren Reaktionstemperaturen. In den meisten Fällen umfassen die Oligonucleotide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorzugsweise etwa 8 bis 20 Nucleotide.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können mit einer Nucleinsäure-Matrix, welche entweder ein- oder doppelsträngig ist, ausgeführt werden. Falls die Nucleinsäure-Matrix zwei Stränge umfaßt, ist es notwendig, vor dem Beginnen der Ligationsamplifikation der vorliegenden Erfindung zuerst die Stränge zu trennen. Ein Verfahren zum Trennen von Nucleinsäuresträngen beinhaltet ein Erwärmen der Nucleinsäure bis zur vollständigen Denaturierung. Eine solche Denaturierung wird in der Regel bei Temperaturen ausgeführt, die von etwa 80° bis 105°C reichen für Zeitspannen von etwa 1 bis 10 Minuten. Eine Trennung der Nucleinsäurestränge kann auch durch Enzyme, wie die Helicaseenzyme und Rec A, induziert werden. Es ist auch möglich, einen der zwei Stränge durch Verdauen mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease, gefolgt von Exonuclease III (Exo III) oder Lambda-Exonuclease, zu entfernen, wie von Wallace, R. B., et al. in Science 209: 1396 (1980) beschrieben.
Die zu amplifizierende spezifische Nucleinsäuresequenz kann lediglich eine Fraktion eines größeren Moleküls oder ein ganzes Molekül sein. Die zu amplifizierende Sequenz kann auch ein Teil eines größeren Gemisches von Molekülen oder ihren Fraktionen sein. Die Ausgangsnucleinsäure kann auch mehr als eine erwünschte Sequenz, die die Zielbasen enthält, die gleich oder verschieden sein können, enthalten, so daß alle solche Sequenzen gleichzeitig amplifiziert werden können. Proben, die mehr als eine Nucleinsäure mit mehr als einer gewünschten Zielsequenz enthalten, können ebenso mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden.
Jede Quelle für Matrix-Nucleinsäure kann verwendet werden, um die vorliegende Erfindung auszuführen, solange sie die gewünschte spezifische Nucleinsäuresequenz enthält oder vermutlich enthält. Es können zum Beispiel Plasmide, natürliche DNA oder RNA von Bakterien, Hefe, Viren, Pflanzen oder Tieren, oder geklonte DNA oder RNA verwendet werden. Genomische DNA oder Gesamt-RNA kann auch aus menschlichem Blut und Gewebe mit einer Reihe von Techniken extrahiert werden. Es können auch synthetische Oligodeoxyribonucleotide verwendet werden. Wenn RNA als Ausgangsmatrix verwendet wird, kann sie zuerst mit einem Enzym, wie die Reverse Transkriptase, in ein DNA-Molekül kopiert werden.
Wie in 1 zu sehen ist, ist die Matrix das β^a normale Beta-Globinallel mit dem Zielbasenpaar *A-T*; in 2 ist die Matrix das β^s das Sichelzellenallel mit dem Zielbasenpaar *T-A*. Es sollte verstanden werden, daß die einzelnen Matrizen und die flankierenden Oligonucleotide, die in 1 und 2 gezeigt sind, die vorliegende Erfindung lediglich erläutern und keinesfalls die Erfindung auf die Detektierung oder Amplifikation von Allelen des menschlichen Beta-Globin-Gens beschränken.
Wie in 1 gezeigt, ist der 5'-3'-(obere)-Strang der Matrix mit (+) bezeichnet; ist der 3'-5'-(untere)-Strang mit (–) bezeichnet. Die Oligonucleotide ON-2 und ON-4 sind 8 Nucleotid lange Oligonucleotide, und ON-1 und ON-3 sind 14 Nucleotid lange Oligonucleotide. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfordert eine Symmetrie ähnlich jener, die in 1 gezeigt ist, nämlich die 3'-Oligonucleotide ON-2 und ON-4 besitzen die gleiche Länge, und die 5'-Oligonucleotide ON-1 und ON-3 besitzen die gleiche Länge. Jedes der zwei 3'- oder der zwei 5'-Oligonucleotide kann länger sein oder alle vier i Oligonucleotide können die gleiche Länge besitzen. Die 5'-Enden der 3'-Oligonucleotide (ON-2 und ON-4) müssen jedoch phosphoryliert sein, und diese Enden können gegebenenfalls auch zum Beispiel mit radioaktivem Phosphor markiert sein. Die 5'-Oligonucleotide (ON-1 und ON-3) werden in der Regel nicht phosphoryliert, um eine Selbstligation und eine Matrixunabhängige Ligation zu verhindern.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht auf die oben beschriebenen Beispiele, die Unterschiede in einer einzigen Base oder in einem einzigen Basenpaar aufweisen, beschränkt. Der komplementäre Bereich der Oligonucleotide kann daher einen Unterschied von mehr als einer Base oder einem Basenpaar aufweisen, was ermöglicht, daß die Verfahren dieser Erfindung zur Erkennung und Defektion von Sequenzen, die Unterschiede in vielen Basen aufweisen, verwendet werden können.
Es ist nötig, daß im Fall von doppelsträngigen Nucleinsäurematrizen zwei Oligonucleotidsätze ein glattes Ende definieren, wie in 1 zu sehen ist, im Gegensatz zu einem überhängenden bzw. klebrigen Ende.
Die Oligonucleotidpaare sind zu einer Nucleinsäuresequenz komplementär, die die Position einer möglichen Mutation auf jedem Strang aufweist. Ferner muß bei doppelsträngigen Matrizen eine der terminalen Basen eines der zwei 3'-Oligonucleotide und eine der terminalen Basen eines der zwei 5'-Oligonucleotide, die zu legieren sind, zu einem Basenpaar in der Zielsequenz komplementär sein. Wie in 1 gezeigt, ist daher die Base am 5'-Ende eines der 3'-flankierenden Oligonucleotide (Base T, ON-2) zu der Base A des (+)-Matrizenstranges komplementär, und ist das Nucleotid am 3'-Ende eines der 5'-flankierenden Oligonucleotide (Base A, ON-3) zur Base T des (–)-Matrizenstranges komplementär.
Wie in 1 zu sehen ist, wird das 3'-Oligonucleotid ON-2 so synthetisiert, daß es zu dem (+)- oder oberen Strang der Matrize komplementär ist, und sein 5'-Ende die Base T enthält, welche zu der Base A des (+)-Stranges komplementär ist, und daß sich der Rest des Oligonucleotids über die 5'-Endbase hinaus erstreckt. Das 5'-Oligonucleotid ON-1 wird so synthetisiert, daß es zu dem (+)- oder oberen Strang der Matrix komplementär ist und ist so orientiert, daß die Base an seinem 3'-Ende C zur Base des (+)-Stranges an der 3'-Seite der Base A auf der Matrize komplementär ist. Der Rest des Oligonucleotids erstreckt sich nach außen in der 5'-Richtung.
Das 5'-Oligonucleotid ON-3 ist zu dem (–)- oder unterem Strang der Matrize so komplementär, daß die Base A an ihrem 3'-Ende zur Base T des (–)-Stranges komplementär ist, und daß sich der Rest von ON-3 von dieser Base nach außen erstreckt. Das 3'-Oligonucleotid ON-4 ist zum (–)- oder unteren Strang der Matrize komplementär und ist so orientiert, daß die Base G am 5'-Ende von ON-4 zur Base des (–)-Stranges, das auf der 5'-Seite der Base T ist, komplementär ist. Der Rest von ON-4 erstreckt sich in der 3'-Richtung nach außen. Die Basen am 5'-Ende von ON-2 und am 3'-Ende von ON-3 sind daher zu dem A-T-Basenpaar, das in der Zielsequenz gezeigt ist, komplementär.
Wenn eine doppelsträngige Nucleinsäure-Matrix verwendet wird, erfordert die Symmetrie, daß ON-2, mit Ausnahme von Unterschieden in der Länge, zu ON-3 komplementär ist. In gleicher Weise ist ON-1 komplementär zu ON-4, mit Ausnahme von Unterschieden in der Länge. Wie in 1 zu sehen ist, ist ON-1 zu ON-4 komplementär. In den Fällen, wo eine doppelsträngige Nucleinsäure-Matrix verwendet werden soll, können daher die Oligonucleotide doppelsträngig sein, zum Beispiel
Solche doppelsträngigen Oligonucleotide müssen so behandelt werden, wie oben beschrieben wird, um die Stränge vor jeder Amplifikationsreaktion zu trennen.
Bei einer geeigneten Temperatur und bei geeigneten Testbedingungen ligiert die Polynucleotidligase ON-1 und ON-2 und/oder ON-3 und ON-4, um signifikante Mengen von längeren ligierten Produkten zu bilden, lediglich dann, wenn die richtigen komplementären Zielbasen an der Stelle der Matrize vorhanden sind, die mit der Ligationsverbindung korrespondieren. Jede geeignete Polynucleotidligase kann in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden, z. B. die vom Bacteriophagen T4 induzierte DNA-Ligase und die DNA-Ligase von E. coli.
Es ist festgestellt worden, daß eine Aufnahme von mindestens 200 mM NaCl in Gemischen für die Amplifikationsreaktion die Fehlpaarungsligation beinahe vollständig unterdrückt. Mit Bezug auf 1 verhindert daher die Fehlpaarung von Nucleotiden, falls die Ligationsverbindungsstelle der DNA-Matrize ein Nucleotid enthält, welches zu dem 5'-Ende von ON-2 oder zum 3'-Ende von ON-3 nicht komplementär ist, jede signifikante Ligation, welche zur Bildung eines 22 Basen langen Produktes geführt haben würde. Die Abwesenheit eines solchen Ligationsproduktes zeigt dadurch an, daß die interessierenden Basen auf der jeweiligen Matrize nicht vorhanden sind. Falls die Matrize in 1 z. B. das Sichelzellen-(β^s)-Gen wäre, in welchem die Basen A und T an der Ligationsverbindungsstelle ausgetauscht sind, würde es weder eine Ligation von ON-2/ON-1, noch von ON-3/ON-4, wie in 1 dargestellt, geben. Ein erwartetes Amplifikationsligationsprodukt mit 22 Nucleotiden würde daher nicht gebildet werden.
Hinsichtlich der in 2 gezeigten spezifischen Oligonucleotide annealen die zwei Oligonucleotide in jedem Paar an die β-Globin-Matrize an angrenzenden Positionen derart, daß das 3'-Ende eines Oligonucleotids (ON-1 oder ON-s3) und das 5'-Ende des anderen (ON-s2 oder ON-4) eine ligierbare Verbindung bilden. Das Nucleotid T oder A auf der Matrize paart sich entweder mit dem Nucleotid am 3'-Ende oder dem Nucleotid am 5'-Ende des Substrats, abhängig davon welcher Strang (+) oder (–), als die Matrize für die Ligation dient.
Der Erfolg oder das Fehlschlagen einer vorgegebenen Ligationsamplifikationsarbeitsweise kann durch Markieren der Oligonucleotide mit radioaktiven oder fluoreszierenden Markern detektiert werden. ³²P, ³⁵S oder jedes andere geeignete Radionuclid sowie andere geeignete Verbindungen, wie Fluorescein oder Rhodamin oder ihre Derivate, können beispielsweise verwendet werden. Das Ligationsamplifikationsprodukt kann auch über jede nachfolgende Manipulation sichergestellt werden, welche eine Unterscheidung zwischen einem längeren Ligationsprodukt und den kürzeren Vorläufern gestattet, wie die Gelelektrophorese-Chromatographie oder die Hybridisierung. Es kann zum Beispiel die Polyacrylamid-Gelelektrophorese angewendet werden, um das ligierte (Produkt von den Reaktanten der flankierenden Oligonucleotide aufgrund ihrer Größen zu trennen. Einige dieser Techniken werden unten in den Beispielen im Detail beschrieben.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können die hier beschriebenen Ligationsamplifikationen auf lineare oder exponentielle Weise erzielt werden, wie in den folgenden Beispielen veranschaulicht wird. Die Schritte für die exponentielle Ligationsamplifikation sind in 3 gezeigt. Die DNA-Sequenzen von synthetischen Oligonucleotid-Substraten und -Matrizen, die in den Beispielen verwendet werden, sind unten in der Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1 DNA-Sequenzen von synthetischen Oligonucleotid-Substraten und -Matrizen
Hβ19S und Hβ19A sind einzigartige, 19 Nucleotide lange Oligonucleotide, die zum nicht-codierenden Strang des Beta-Globin-Gens komplementär sind und als Oligonucleotid-Matrizen für eine Ligation von ON-1/ΟN-2-Paaren dienen. Hβ23S' und Hβ23A', 23 Nucleotide lang, sind zum codierenden Strang des Beta-Globin-Gens komplementär. Diese zwei Nucleotide dienen als Matrizen für eine Ligation von ON-3/ON-4-Paaren.
Während sowohl das ON-1/ON-s2- und ON-1/ON-a2-Paar an dem codierenden (+)- Strang hybridisieren, unterscheiden sich ON-s2 und ON-a2 durch ein einziges Nucleotid an ihren 5'-Enden, wobei ON-s2 für das Sichelzellen-Allel spezifisch ist. Auf ähnliche Weise hybridisieren die ON-s3/ON-4- und ON-a3/ON-4-Paare an den nicht-codierenden Strang mit ON-s3 und ON-a3, die sich durch ein einziges Nucleotid an ihren 3'-Enden unterscheiden.
Für die Detektierung von entweder dem β^a- (normalen) oder β^s- (Sichelzellen)-Allel wird ein Satz, der mindestens eines der Paare Oligonucleotidsubstrate ON-1/ON-a2 und ON-a3/ON-4 enthält, für die normale Beta-Globinsequenz verwendet, und mindestens eines der Paare ON-1/ON-s2 und ON-s3/ON-4 wird zur Detektierung der Sichelzellen-Sequenz verwendet.
In den unten beschriebenen Ligationsamplifikationsreaktionen bildet die matrixabhängige Ligation von entweder dem ON-1/ON-2- oder dem ON-3/ON-4-Paar ein Produkt mit 22 Basen mit einer Sequenz, die zu den anderen Substratpaaren komplementär ist. Das ON-1-ON-a2-Produkt würde zum Beispiel zu ON-a3/ON-4-Substraten komplementär sein, und das Produkt ON-s3-ON-4 würde zu ON-1/ON-s2- Substraten komplementär sein. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Ligationsprodukte dann als Matrix für die Ligation des anderen Paares Oligonucleotidsubstrate dienen, wodurch mehr Matrizen für eine weitere Ligation hergestellt werden. Falls der anfängliche Ligationsschritt als Ergebnis einer Fehlanpassung von Basenpaaren nicht stattfindet, ergeben die nachfolgenden Amplifikationsschritte kein detektierbares Ligationssignal.
Ist das 22 Nukleotid lange Ligationsprodukt einmal gebildet, bleibt es an seine Matrix hybridisiert. Eine Denaturierung trennt den Doppelstrang, um zwei neue Matrizen zu ergeben. Falls durch Kochen denaturiert wird, wird die Ligase im Reaktionsgemisch inaktiviert. Frisches Enzym muß daher zugegeben werden, um den nächsten Amplifikationsdurchgang zu initiieren.
Beispiel 1
Alle Oligodeoxyribonucleotid-Ligationsreaktionen an Oligonucleotidmatrizen wurden, sofern nicht anders angegeben, in 50 mMol Tris·HCl (pH 7,6), 10 mMol MgCl₂, 1 mMol DTT (Dithiotreitol), 1 mMol ATP, 200 mMol NaCl und 5% PEG (Polyethylenglycol) mit 5–10 μMol jedes Substratoligonucleotids, gemischt mit einer kleinen Menge an radioaktiv markiertem 3'-Oligonucleotid-Substrat (100 000–300000 cpm) und der angegebenen Matrixmenge, ausgeführt.
Reaktionen an plasmidischer und genomischer DNA-Matrix werden nach 5–10 Minuten Kochen, Kühlen auf Eis und Zugabe von Ligase (1 E; BRL) initiiert. Sofern nicht anders angegeben, werden alle Ligationsreaktionen elektrophoretisch untersucht und gegebenenfalls mit alkalischer Darm-Phosphatase vom Kalb (1–5 E) 1–2 Stunden behandelt.
Die lineare Amplifikationsligation von Nucleinsäuresequenzen wird ausgeführt, indem die ursprüngliche Nucleinsäurematrix (Oligo-, plasmidische oder genomische DNA) in jedem Amplifikationsdurchgang wiederholt verwendet wird. Es wird lediglich ein Satz Oligonucleotide verwendet, der zur geeigneten Oligonucleotidmatrix komplementär ist und einen Strang Doppelplasmid oder genomischer DNA-Matrix flankiert. Es wird zum Beispiel entweder der Satz ON-1 und ON-2 oder ON-3 und ON-4 in den Amplifikationsdurchgängen verwendet, aber nicht beide.
Um eine Sequenz des 5'-Stranges des menschlichen Sichelzellen-(β^s)-β-Globin-Gens, wie in 2 gezeigt, linear zu amplifizieren, wurde das obige Reaktionsgemisch hergestellt, das ferner 1 mMol ON-1, 1 mMol 5'-phosphoryliertes ON-a2 und 0,1 pMol β^s (Hβ19S) Matrix enthielt. Falls eine doppelsträngige Matrix verwendet wird, muß sie durch Kochen des Reaktionsgemisches bei etwa 90–100°C für 10 Minuten denaturiert werden.
Jeder Ligationsdurchgang wird durch Zugeben von 1 Einheit Ligase zum Reaktionsgemisch auf Eis initiiert. Das Gemisch wird für etwa 30 Minuten bei 30°C oder für eine längere Zeit inkubiert, falls die Matrixkonzentration gering ist.
Der erste Durchgang und alle nachfolgenden Durchgänge werden durch schnelles Erwärmen des Reaktionsgemisches auf 100°C für 5 Minuten beendet, um die Ligase zu inaktivieren und den ligierten Produktstrang (ON-1-ON-2) von der Matrix zu dissoziieren. Dies befreit die Matrix für nachfolgende Amplifikationsdurchgänge. Vor dem nächsten Durchgang wird das Reaktionsgemisch 10 Sekunden zentrifugiert und sofort auf etwa 0°C abgekühlt. An diesem Punkt ist etwa ein ON-1-ON-2-Ligationsprodukt für jede Kopie der Matrix vorhanden.
Eine weitere Enzymeinheit wird dem Reaktionsgemisch zugegeben, um einen zweiten Ligationsdurchgang zu initiieren. Da ein molarer Überschuß von Oligonucleotiden ON-1 und ON-2 zum anfänglichen Reaktionsgemisch zugegeben werden, werden mehr Oligonucleotidsubstrate nicht zugegeben. Dann wird das Reaktionsgemisch wie im ersten Durchgang inkubiert, gekocht, um die Matrix vom Ligationsprodukt zu dissoziieren, und abgekühlt. An diesem Punkt sind etwa 2 Kopien des ON-1-ON-2-Ligationsproduktes für jede Matrixkopie vorhanden.
Frisches Enzym wird zugegeben, um einen weiteren Durchgang zu initiieren. Die Schritte zum Inkubieren, zum Kochen, um die Matrix vom Produkt zu dissoziieren, um Abkühlen und zum Zugeben von frischem Enzym werden so oft wiederholt, wie Durchgänge nötig sind, um ein detektierbares Signal zu erzeugen.
Die Defektion des ON-1-ON-2-Ligationsproduktes kann auf verschiedene Weise erreicht werden. ON-1 und/oder ON-2 können mit einem radioaktiven oder nicht-radioaktiven Marker markiert und von Reaktanten durch Gelelektrophorese derart abgetrennt werden, daß Ligationsprodukt durch Detektieren der Anwesenheit des Markers in einer Position im Gel entsprechend der erwarteten Produktgröße bestimmt wird.
ON-a2, ON-s2 und ON-4 werden an ihren 5'-Enden entweder mit radioaktivem (γ[³²P] ATP 6000 Ci/mMol; New England Nuclear) oder nicht-radioaktivem ATP über eine Kinase-Reaktion phosphoryliert. Die unmarkierten 5'-phosphorylierten Phosphate werden nach Inkubation in einem kochenden Wasserbad für 20 Minuten, um die Kinase zu inaktivieren, verwendet. Im Inneren radioaktiv phosphorylierte Oligonucleotidprodukte werden von nicht umgesetztem ATP und anderen Reaktionsprodukten mit Anionenaustauschchromatographie (DE-52 Cellulose – Whatman^®) abgetrennt. Die radioaktive Phosphorylierungsreaktion ergibt Produkte mit einer spezifischen Aktivität von etwa 10⁸–10⁹ cpm/pMol.
Die Detektion und die Quantifizierung eines Ligationsproduktes durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird ausgeführt, indem Proben von Ligationsreaktionen mit Ficoll'schem Beladungspuffer gemischt und das Gemisch einer Elektrophorese in TBE (89 mMol Tris, 89 mMol Borat, 2 mMol EDTA) in 20% Polyacrylamid-(Bio-Rad)-Harnstoff-(7 Mol)-Gel bei 600 V für 1,5 Stunden unterworfen werden. Dann wird das Gel in Saran Wrap verpackt und zwischen zwei Lightning Plus-Verstärkungsschirmen (DuPont) über Nacht autoradiographiert. Die Quantifizierung eines Ligationsproduktes wird entweder aus densiometrischen Messungen des Autoradiographs oder direkt aus dem Gel über ein AMBIS Radioisotope Scanning System Π (Automated Microbiology System, Inc.) erhalten. Im letzteren Fall wird das Polyacrylamidgel zuerst in einer 5%igen Essigsäurelösung 10 Minuten lang fixiert.
Das ON-1-ON-2-Ligationsprodukt kann auch durch Hybridisieren der das Produkt enthaltenen Lösung an ein Substrat detektiert werden, das eine immobilisierte komplementäre DNA- oder RNA-Sequenz enthält, unter Bedingungen, wodurch das ON-1-ON-2-Ligationsprodukt an die komplementäre Sequenz hybridisiert, aber weder ON-1 noch ON-2. Ein gebundener Marker zeigt die Anwesenheit eines Ligationsproduktes an. Das ligierte Produkt kann auch in einem nachfolgenden Ligationsdurchgang detektiert werden, indem ein radiomarkierter Gegensubstratsatz (ON-3/ON-4) verwendet wird. In dem Fall, wo ligiertes ON-3/ON-4 detektiert werden soll, würde markiertes ON-1/ON-2 verwendet werden.
Der Produktpegel nach N Durchgängen einer linearen Amplifikation-Ligation ist gleich N × Q, wo Q der Wirkungsgrad der Ligation ist. Q reicht von 0 bis 1, wobei 1 einer 100%igen Ligation äquivalent ist.
Beispiel 2
ON-1/ON-s2* und ON-s3/ON-4* wurden an Oligonucleotidmatrizen unter Verwendung der obigen Verfahrenstechnik linear ligiert. ON-s2* und ON-s4* sind gleich wie ON-s2 und ON-4, außer daß sie nur 6 Nucleotide lang sind. 10 pMol ³²P-5' phosphoryliertes ON-s2* und unmarkiertes 5'-OH-ON-1 (Streifen a–d) oder ³²P-5' phosphoryliertes ON-4* und unmarkiertes 5'-OH-ON-s3 (Streifen e–h) wurden an eine 19 Basen lange bzw. 23 Basen lange Oligonucleotidmatrix bei 30°C 30 Minuten mit 1 E T4-DNA-Ligase in 10 μl Reaktionsvolumen ligiert. 4 zeigt die Ergebnisse der unten beschriebenen Ligationsamplifikationsreaktionen. Proben in den Streifen a und e, mit Enzym nicht behandelt, und Proben in den Streifen b und f ohne Matrix, dienen als negative Kontrollen. 1 pMol der folgenden Oligonucleotidmatrix wurde verwendet: Hβ19S (c); Hβ19A (d); Hβ23S' (g) und Hβ23A' (h).
Wie in 4 zu sehen ist, trat die erwartete Ligation mit der Sichelzellenmatrix und den Sichelzellensubstraten auf (Streifen c und g); eine Ligation von normalen (A) Beta-Globinsubstraten trat an der Sichelzellenmatrix nicht auf (Streifen d und h).
Beispiel 3
Da Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch angewendet werden, um Nucleinsäuresequenzen exponentiell zu amplifizieren. Der Hauptunterschied zwischen einer exponentiellen Amplifikationsligation und der oben beschriebenen linearen Amplifikationsligation besteht darin, daß alle vier Oligonucleotide (ON-1/ON-2 und ON-3/ON-4) als Substrate während jedes Reaktionsdurchganges vorhanden sind. Das Ligationsprodukt jedes Oligonucleotidsatzes dient in nachfolgenden Amplifikationsdurchgängen als die Matrix für den anderen Oligonucleotidsatz, wie in 3 gezeigt.
Ein radioaktiv markiertes Substrat kann zur Detektion in die Ausgangsmaterialien aufgenommen oder kann im letzten Durchgang zugegeben werden.

Wie auch im Fall für eine lineare Amplifikation muß eine Abschätzung der Anzahl an Amplifikationsdurchgängen, die benötigt werden, um ein detektierbares Signal zu erzeugen, vorgenommen werden, bevor die exponentielle Amplifikation ausgeführt wird. Nach N Durchgängen ist die Produktbildung gleich (1 + Q)^N – 1, worin Q der Ligationswirkungsgrad ist. Die folgende Tabelle gibt die relativen Mengen an Ligationsprodukten an, die nach N Cyclen vorhanden sind, wobei bei jedem Cyclus ein Wirkungsgrad von 100% angenommen wird.

Durchgang	Amplifikationsfaches (2)ⁿ – 1
0	0
1	1
2	3
3	7
4	15
5	31
6	63
7	127
8	255
9	511
10	1023
.	.
.	.
.	.
.	.
15	32767
.	.
.	.
.	.
.	.
20	1048575
21	2097141
.	.
.	.
.	.
25	33554431

Falls zum Beispiel ein 10⁶-faches einer Produktamplifikation bei einer bestimmten spezifischen Radioaktivität erforderlich ist, werden unter der Annahme eines 100%igen Ligationswirkungsgrades etwa 20 Amplifikationsdurchgänge benötigt (2²⁰ ≈ 10⁶).
Ein beinahe perfekter Ligationswirkungsgrad ist bei späteren Durchgängen vorhanden, wo die primäre Matrixquelle ligierte, Oligonucleotidprodukte ist. Während früher Durchgänge kann der Ligationswirkungsgrad in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen, den Arten der verwendeten Ligase und der Matrixquelle niedriger sein.
Jeder Durchgang einer exponentiellen Ligation wird begonnen, indem eine Einheit Enzym dem Reaktionsgemisch, das sich auf Eis befindet, zugegeben wird. Im ersten und in jedem nachfolgenden Amplifikationsdurchgang wird das Reaktionsgemisch mit dem zugegebenen Enzym etwa 30 Minuten lang bei 30°C oder für eine längere Zeitspanne, falls die Matrixkonzentration gering ist, inkubiert. Am Ende jedes Durchgangs wird das Reaktionsgemisch schnell für 5 Minuten auf Kochtemperatur gebracht, um das Enzym zu inaktivieren und die Produktstränge von den Matrixsträngen zu dissoziieren. Dann wird das Reaktionsgemisch 10 Sekunden zentrifugiert und unmittelbar darauf auf etwa 0°C abgekühlt.
Dann wird eine weitere Einheit T4-Ligase zugegeben, um den zweiten Amplifikationsdurchgang zu initiieren. Dann wird das Gemisch inkubiert, gekocht und gekühlt, wie oben. An diesem Punkt sind 3 Matrixkopien für jede Kopie, die zu Beginn der Reaktion vorhanden ist, vorhanden. Alle nachfolgenden Amplifikationsdurchgänge werden mit der gleichen Schrittabfolge so viele Male durchgeführt, wie zum Herstellen eines detektierbaren Signals benötigt werden.
Das Fortschreiten der Amplifikation kann überwacht werden, indem ein Aliquot des Reaktionsgemisches von etwa 10 μl während vorbestimmter Durchgänge dem Reaktionsgemisch entnommen wird. Das entnommene Material wird hitzeinaktiviert und wird dann mit 2 bis 3 μl eines Beladungspuffers vereinigt. 2 μl dieses gepufferten Gemisches werden dann auf ein 20% Polyacrylamidgel geladen, und das Gel wird eine Stunde bei 600 V einer Elektrophorese unterzogen und dann über Nacht mit zwei Lightening-Plus Verstärkerschirmen von DuPont autoradiographiert.
Unter Anwendung dieser Verfahren und dem in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionsgemisch wurden 6,67 nMol Oligonucleotidmatrix, Hβ23S' und Hβ23A', mit T4-DNA-Ligase und 2,33 μMol von jedem flankierenden Oligonucleotidsubstrat amplifiziert: mit 32P-5' markiertes ON-s2 (10⁶ cpm); mit 32P-5' markiertes ON-4 (10⁶ cpm); 5' OH-ON-1 und 5' OH-ON-s3. 1 E T4-DNA-Ligase wurde verwen det, um jeden Durchgang zu initiieren. Es wurden sechs Durchgänge Ligationsamplifikation vorgenommen.
5A ist ein Autoradiogramm, das die Überwachungsergebnisse jedes Reaktionsdurchgangs für jede Matrix zeigt. In den Durchgängen 2–6 war die Ligationsreaktion für die Hβ23S'-Matrix, die die Sichelzellensequenz enthielt, spezifisch. Die Oligonucleotidsubstrate waren nicht in der Lage, in Gegenwart der Hβ23A'-Matrix zu ligieren.
Produkte des exponentiellen Ligationsverfahrens verdoppeln sich annähernd mit jedem Durchgang. 5B zeigt eine logarithmische Auftragung der Amplifikationsfachen als eine Funktion der Anzahl der Durchgänge an vorgenommener Ligationsamplifikation. Es wurde eine gerade Linie mit einem berechneten Wirkungsgrad von 0,98 erhalten. In jedem Durchgang dient somit das Ligationsprodukt des vorhergehenden Durchgangs wirksam als die Matrix für eine weitere Oligonucleotidligation.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch angewendet werden, um plasmidische und genomische DNA-Sequenzen zu detektieren, wie im folgenden Beispiel veranschaulicht wird.
Beispiel 4
Matrizen für eine Amplifikationsligation wurden von den Plasmiden pHβ^a und pHβ^s, welche annähernd 4,4 kBP normales (β^a) bzw. Sichelzellen-(β^s)-Beta-Globin-Gen-Insert aufweisen, erhalten. Alle DNA-Präparationen wurden gemäß einer modifizierten Arbeitsweise mit Triton^® X-100, gefolgt von einer Behandlung mit Proteinase K und RNAse, vorgenommen.
Die Plasmid-DNA wurde mit einem Restriktionsenzym (Bam HI und/oder Taq I) und Exonuclease III (Exo III) behandelt, bevor sie als Matrix in Ligationsreaktionen wie folgt diente: pHβ^a und pHβ^b wurden getrennt mit Bam HI (5 E/pMol) 2 Stunden bei 37° verdaut, wobei das Verdauen in einem kochenden Wasserbad für 5 Minuten beendet wurde. Dann wurde Exo III (100 E/pMol) dem Reaktionsgemisch mit DTT zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mMol einzustellen. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Für eine Endreinigung wurde eine Phenol/Chloroform-Extraktion vorgenommen.
1 nMol jeder der zwei erhaltenen Matrizen (pHβ^s und pHβ^a) wurde dann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase und den Reaktionsgemischen und Verfahren, die in den Beispielen 1 und 3 beschrieben sind, exponentiell amplifiziert, außer daß das Gesamtvolumen jeder Reaktion 100 μl betrug. 500 nMol jedes der folgenden Oligonucleotidsubstrate wurde verwendet: mit 32P-5' markiertes ON-s2 (106 cpm), mit 32P-5' markiertes ON-4 (106 cpm), 5' OH-ON-1 und 5' OH-ON-s3. Nach dem 10., 12. und 14. Amplifikationsdurchgang wurde dem Reaktionsgemisch ein Aliquot von 4 μl entnommen und mittels Elektrophorese und Autoradiographie analysiert.
6 zeigt die Ergebnisse der Ligationsamplifikation. Das Produkt in den Streifen A–C stammte von Reaktionen, die keine Matrix enthielten; das Produkt in den Streifen d–f stammte von Reaktionen, die die pHβ^s-Matrix enthielten; und das Produkt in den Streifen g–i stammte von Reaktionen, die die pHβ^a-Matrix enthielten. Reaktionsprodukte in den Streifen a, d und g wurden entnommen und nach 10 Durchgängen analysiert; die Produkte in den Streifen b, e und h wurden nach 12 Durchgängen analysiert; und die Produkte in den Streifen c, f und i wurden nach 14 Durchgängen analysiert.
Bei den Reaktionen, die pHβ^a enthielten, welches die normale Beta-Globinsequenz enthielt (g–i) oder in Streifen ohne jeglicher Matrix (a–e) ist kein detektierbares Ligationsprodukt zu sehen. Die pHβ^s-Sichelzellenmatrix wurde signifikant amplifiziert, wobei das detektierbare Signal merkbar zwischen 10 (Spalte d), 12 (Spalte e) und 14 (Spalte f) Amplifikationsdurchgängen zunahm.
Für die 1 nMol Plasmidmatrix, die in den Reaktionen verwendet wurde, waren etwa 10 Ligationsamplifikationsdurchgänge nötig, um ein detektierbares Signal zu erzeugen, entsprechend einer annähernd 50-fachen Amplifikation. Im Gegensatz dazu werden nur etwa 3–6 Amplifikationsdurchgänge benötigt, um eine Oligonucleotidmatrix der gleichen Konzentration zu amplifizieren, um das gleiche Amplifikationsfache zu erhalten.
Beispiel 5
Normale (β^a/β^a) genomische DNA-Proben und von Sichelzellenkrankheit (β^s/β^s) und mit dem Sichelzellenmerkmal (β^a/β^s) wurden aus Blutproben von geeigneten Spendern isoliert. Beta-Thalassaemia-Haupt-DNA wurde aus mit EBV transformierten Lymphozyten in Kultur (GM 2267-Zellen vom NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, N. J.) hergestellt. Thalassaemie-DNA wurde anschließend aus den kultivierten Zellen isoliert. Alle DNA-Präparationen wurden gemäß einer modifizierten Triton^®X-100-Arbeitsweise, gefolgt von einer Behandlung mit Proteinase K und RNAse erhalten.
Genomische DNA (5 μg) wurde mit Taq I Restriktionsenzym (10 E/μg) (Boehringer Mannheim) über Nacht bei 65°C verdaut, gefolgt von einer Verdauung mit Bam HI (10 E/μg) (Bethesda Research Laboratory) für 8 Stunden bei 37°C. Danach wurde Nuclease Exo III (100 E/pMol) dem Reaktionsgemisch zusammen mit DTT zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mMol einzustellen, und die Reaktion wurde 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Für die Endreinigung wurde eine Phenol/Chloroform-Extraktion ausgeführt.
Die Ligationsbedingungen für genomische DNA und für plasmidische DNA sind identisch, außer daß das Gesamtvolumen der Reaktion für die genomische DNA-Probe 200 μl ist.
Genomische DNA von β-Thalassaemie, Sichelzellen und normaler DNA wurden amplifiziert, wobei 200 nMol der folgenden Sätze Oligonucleotide verwendet wurden: mit ³²P-5' markiertes ON-s2 (10⁶ cpm)/mit ³²P-5' markiertes ON-4 (10⁶ cpm)/5' OH-ON-1/5' OH-ON-s3; und mit ³²P-5' markiertes ON-s2 (10⁶ cpm)/mit 32P-5' markiertes ON-4 (10⁶ cpm)/5' OH-ON-1/5' OH-ON-3.
5 μg genomischer DNA enthält annähernd 500000 Moleküle eines homocygoten Einzellcopiegens. Wenn sie als eine Matrix in einem 200 μl Reaktionsgemisch verwendet wird, ist 5 μg DNA äquivalent 2,5 × 10^–14 Mol hinsichtlich der Matrix. Diese Konzentration ist deutlich unterhalt der scheinbaren K_m der T4-DNA-Ligase für eine Ligationsmatrix. Es ist daher zu erwarten, daß die Enzymaktivität beträchtlich verlangsamt wird. Um diese kinetische Beschränkung zu überwinden, wurden frühe Ligationsdurchgänge für eine längere Zeitspanne inkubiert. Für Durchgänge zu Beginn war die Ligationszeit 5 Stunden. Bei nachfolgenden Durchgängen wurde die Inkubationszeit allmählich auf 30 Minuten verringert. (Durchgänge 1–5 = 5 Stunden; Durchgänge 6–10 = 4 Stunden; Durchgänge 11–15 = 3 Stunden; Durchgänge 16–20 = 2 Stunden; Durchgänge 20–30 = 1 Stunde; und Durchgänge 30+ = 30 Minuten) Es wurde jedoch nicht zugelassen, daß ein Durchgang 5 Stunden überschritt, um eine Akkumulierung von Produkten mit glatten Enden zu vermeiden.
Die 7A und 7B zeigen die Ergebnisse von 70–75 Durchgängen einer exponentiellen Amplifikation, wobei diese Matrizen und diese Oligonucleotide verwendet wurden. 7A enthält das Amplifikationsprodukt, das vom β^s-Oligonucleotidsatz stammt; 7B enthält das Amplifikationsprodukt, das vom β^a-Oligonucleotidsatz stammt. Die Streifen a und b jedes Autoradiogramms enthalten Reaktionsprodukt unter Verwendung von β-Thalassaemie-genomischer DNA-Matrix; die Streifen c und d enthalten Produkt von genomischer Sichelzellen-DNA-Matrix, und die Streifen e und f enthalten Produkt unter Verwendung von genomischer DNA-Matrix von normalem Beta-Globin. Die Matrix in den Streifen a, c und e wurde mit 70 Durchgängen amplifiziert; die Matrix in den Streifen b, d und f wurde mit 75 Durchgängen amplifiziert. Die Banden der erwarteten Produkte erscheinen in den Streifen c und d von 7A (Sichelzellenmatrix und Oligonucleotide) und in den Streifen e und f von 7B (Matrix von normalem Beta-Globin und Oligonucleotide). β-Thalassaemie-DNA (Streifen a und b) und eine fehlangepaßte genomische DNA und Substrate zeigten beide ein Fehlen eines Signales.
Dieses Beispiel zeigt daher, daß die Ligationsamplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung als eine diagnostische Methodik auf genomische DNA-Proben für Sichelzellenanämie verwendet werden können.
Beispiel 6
Jeweils 5 μg von β-Thalassaemie-, Sichelzellen- und normaler genomischer DNA wurden mit Bam HI/Taq Ι und Exo III Nuclease verdaut, wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben. Die lineare Amplifikation wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die verwendeten Oligonucleotide waren 100 fMol mit ³²P-5' markiertes ON-s2, das ohne weitere Reinigung direkt aus der Markierungsreaktion der T4-Kinase verwendet wurde, mit DE-52-Chromatographie und 100 fMol ON-1. Die Oligonucleotide wurden getrennt mit drei Matrizen in Gegenwart von 200 mMol NaCl und 0,5 E T4-DNA-Ligase in Gesamtreaktionsvolumina von 10 μl vereinigt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei 30°C inkubiert, und die Reaktion wurde durch Kochen beendet. Ein zweiter Amplifikationsdurchgang wurde initiiert, indem weitere 0,5 E Enzym zugegeben wurden. Das Gemisch wurde erneut 3 Stunden inkubiert. Es wurden drei Ligationsamplifikationsdurchgänge durchgeführt. Dann wurden die erhaltenen Produkte, wie oben beschrieben, elektrophoretisch behandelt und autoradiographiert.
8 zeigt das erhaltene Autoradiogramm. Der Streifen A enthält Reaktionsprodukt bei Verwendung von β-Thalassaemie-Matrix, der Streifen b enthält Reaktionsprodukt bei Verwendung von Sichelzellenmatrix, und der Streifen c enthält Reaktionsprodukt bei Verwendung normaler Beta-Globinmatrix. Positive Kontrollen wurden mit 0,01, 1 und 10 fMol Hβ19S-Matrix (bzw. Streifen d–f) durchgeführt. Der Streifen b zeigt das erwartete Produkt, wogegen die Streifen a und c das erwartete Fehlen des Produktes zeigen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch als Mittel verwendet werden, ein Amplifikationsprodukt von anderen Nucleiusäureamplifikationsverfahren, wie der Polymerasekettenreaktion, zu detektieren.
Beispiel 7
Es wurden Amplifikationsreaktionen mit Polymerase Chain Reaction Kit (Gene Amp Kit, Perkin-Elmer Cetus), enthaltend 2,5 E DNA-Polymerase von Thermus aquaticus und 2,5 μMol der Oligonucleotidprimer BGP1 und BGP2, 19 Basen lange synthetische Oligodeoxyribonucleotide, welche an das Beta-Globin-Gen bei Positionen annealen, die 256 Nucleotide auseinanderliegen. Das angereicherte 294 Basenpaarfragment enthält die interessierende β-Globinsequenz. 2 μg der folgenden genomischen DNA wurden als Matrizen verwendet, nachdem sie wie oben beschrieben behandelt worden waren: β-Thalassaemie, homozygote Sichelzelle (β^s/β^s), normales β-Globin (β^a/β^a) und heterozygotes Sichelzellenmerkmal (β^a/β^s). 30 Amplifikationsdurchgänge ergaben eine annähernd 5 × 10⁵-fache Amplifikation der Zielsequenz. Aliquote von 10 μl der PCR-angereicherten genomischen DNA-Sequenzen wurden in 1,5% Agarosegel bei 60 V 5 Stunden elektrophoretisch behandelt.
Die elektrophoretisch getrennten Produkte wurden dann auf Genetran Nylonmembranen mit 20 × SSC (1 × SSC = 150 mMol NaCl und 15 mMol Na-Zitrat) übertragen, gemäß dem Verfahren von Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98: 503–517 (1975).
Die Genetran-Membranen wurden direkt an mit 32P-5' markierte Oligonucleotidsonden HB19S oder HB19A in 5 × SSPE (1 × SSPE = 10 mMol Natriumphosphat, pH 7,0, 0,18 Mol NaCl und 1 mMol EDTA), 1% NaDodSO₄, 10 μg/ml Homomix RNA und 10⁶ cpm/ml) markiertem Oligonucleotid mit dem 10fachen Überschuß an unmarkiertem Kompetitor 2 Stunden bei 47°C hybridisiert. Die Membran wurde zuerst bei Raumtemperatur mit 6 × SSC dreimal 30 Minuten lang gewaschen. Eine nachfolgende Wäsche in TMACl-Lösung für 1 Stunde bei 59°C entfernte jede Fehlanpassungshybridisierung. (TMACl = 50 mMol Tris, pH 8,0, 3 Mol Tetramethylammoniumchlorid, 2 mMol EDTA, 0,25% SDS).
Dann wurde eine exponentielle Ligationsamplifikation an 20 μl-Proben der PCR-angereicherten Sequenzen für vier Durchgänge mit entweder 200 nmol β^s-Oligonucleotiden (ON-1/PN-s2 und ON-3/ON-4) oder 200 nmol von β^A-Oligonucleotiden (ON-1/ON-A2 und ON-A3/ON-4) in 100 μl Gesamtreaktionsvolumen, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase durchgeführt. 500 μl jeder Probe wurden mittels 20% Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
Das Ethidiumbromidfärben des 1,5% Agarosegels zeigt eine einzige 294 Basenpaar-Bande ( 9A, Streifen c–e). Die Streifen von 9A sind: (a) – Kontrolle; (b) β-Thalassaemie; (c) – homozygotes Sichelzellenmerkmal; (d) – normales β-Globin; und (e) – heterozygotes Sichelzellenmerkmal. Die PCR-Amplifikation von Thalassaemie-DNA (Panel A, Streifen b) amplifiziert etwas unspezifische DNAs, zeigt aber keine Bande mit 294 Basenpaaren.
Eine Oligonucleotid-Hybridisierungsanalyse der PCR-angereicherten Proben (Proben der Streifen b–e, 9A, entsprechen den Streifen 1–4, 9B), immobilisiert auf Genetran Nylonmembranfilter, bestätigt, daß die angereicherten DNAs tatsächlich die interessierende Beta-Globinsequenz enthalten ( 9B). Eine Konkurrenzhybridisierung des Filters, wie in Nozari, G., et al., Gene 43: 23 (1986) beschrieben, mit entweder radioaktiv markiertem Hβ19S und unmarkiertem Hβ19A (9B, Spalte a) oder markiertem Hβ19A und unmarkiertem Hβ19S (9B, Spalte b) identifiziert eine Sichelzellenkrankheit-DNA (β^s/β^s, 9B, Streifen 2, Panel a), eine normale DNA (β^a/β^a, 9B, Streifen 3, Panel 2) und DNA des Sichelzellenmerkmals (β^a/β^s, 9B, Streifen 4, Panels a und b) korrekt.
Die PCR-angereicherten Fragmente mit 256 Basenpaaren dienen Idealerweise als Matrix in der Ligationsanalyse, da sie relativ ubiquitär sind, was die kinetischen Beschränkungen der Ligase überwindet (d. h. hohe Km für die Matrix). Eine Ligationsamplifikation, die an diesen Matrizen mit 294 Basenpaaren (9C – Matrizen: a, e – β-Thalassaemie; b, f – homozygote Sichelzellenkrankheit; c, g – normales β-Globin; d, h – heterozygotes Sichelzellenmerkmal) mit β^s (9C, Streifen a–d) Oligonucleotidsubstraten durchgeführt wurde, zeigte eine positive Ligation für die Proben der Sichelzellenkrankheit und des Sichelzellenmerkmals (9C, Streifen b und d). Eine Ligationsamplifikation mit β^a (9C, Streifen e–h) Oligonucleotidsubstraten ist gleicherweise für normale und Sichelzellenmerkmal-Proben positiv (9C, Streifen g und h).
Dieses Beispiel zeigt, daß eine Ligationsamplifikation als eine Detektionsmethodik, gekoppelt mit anderen Sequenzamplifikationstechniken, verwendet werden kann.

Claims

Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz, umfassend die Schritte: (a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz, (b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden, (c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, (d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsproduktes, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und (e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Schritte (b) bis (e) in einem Reaktionsgemisch, welche mindestens 200 mM NaCl enthält, durchgeführt werden.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz, (b) Amplifikation der Matrize durch Polymerasekettenreaktion (PCR), um ein PCR-Amplifikationsprodukt herzustellen, welches vielfache Kopien der Matrize mit der Zielsequenz umfaßt, (c) Hybridisierung von Oligonucleotidpaaren an angrenzende Sequenzen der Kopien der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Ziel sequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrizenkopien zur Ligation aneinander gelagert werden, (d) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um doppelsträngige Produkte herzustellen, (e) Denaturierung des doppelsträngigen Produktes, um eine Vielzahl der ursprünglichen Matrizenstränge und eine Vielzahl der Oligonucleotid-Produktstränge herzustellen, und (f) Wiederholung der Schritte (c) bis (e), so daß beide, die ursprünglichen Matrizenstränge und die Oligonucleotid-Ligationsstränge, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren.
Verfahren zur gleichzeitigen Amplifikation einer Vielzahl von Nucleinsäuresequenzen, die in einem oder mehreren Nucleinsäuremolekülen vorliegen, welche jede eine Zielsequenz umfassen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Erzeugung, wie angemessen, einer einzelsträngigen Matrize mit Zielsequenzen oder einer Vielzahl von einzelsträngigen Matrizen, welche jede eine Zielsequenz umfassen, (b) Hybridisierung einer Vielzahl von Oligonucleotidpaaren an angrenzende Sequenzen der Matrize(n), wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenzen umfassen, so daß jedes der Oligonucleotidpaare an eine Matrize zur Ligation aneinander gelagert wird, (c) Ligation der so aneinander gelagerten Oligonucleotidpaare, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, (d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um die ursprünglichen Matrizenstränge und Oligonucleotid-Ligationsproduktstränge herzustellen, und (e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, die ursprünglichen Matrizenstränge und die Oligonucleotid-Ligationsproduktstränge, als Matrizen für weitere Ligationsreaktionen fungieren.
Verfahren zur Diagnose einer Erbkrankheit, welches das Analysieren des Ge notyps eines Patienten durch ein Verfahren umfaßt, welches die Amplifikation einer Nucleinsäure umfaßt, die eine Zielsequenz umfaßt, wobei das Amplifikationsverfahren die Schritte umfaßt: (a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize einer Zielsequenz, (b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden, (c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, (d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsproduktes, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und (e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang, als Matrizen für eine weiter Ligationsreaktion fungieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Nucleinsäure DNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Nucleinsäure RNA ist.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz aus genomischer DNA, wobei das Amplifikationsverfahren die Schritte umfaßt: (a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz, (b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden, (c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, (d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid- Ligationsproduktstrang herzustellen, und (e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren.
Verfahren zur Diagnose von Erbkrankheiten, umfassend das Analysieren des Genotyps eines Patienten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Erkrankung Sichelzellanämie ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die einzelsträngige Matrize durch Dissoziierung der komplementären Stränge einer doppelsträngigen Nucleinsäure erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei beide komplementären Stränge als Matrizen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, ferner umfassend das Herstellen eines Amplifikationsproduktes durch Wiederholung des Schrittes (e) und anschließendem Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nucleinsäuresequenz, die komplementär oder identisch zu der Zielsequenz im Amplifikationsprodukt ist.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz, umfassend die Schritte: (a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz, (b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden, (c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um einen doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, (d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und (e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Matrizennucleinsäure aus Bakterien stammt.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz, umfassend die Schritte: (a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz, (b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz umfassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden, (c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, (d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsprodukts, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und (e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Matrizennucleinsäure aus Hefe stammt.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure mit einer Zielsequenz, umfassend die Schritte: (a) Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize mit der Zielsequenz, (b) Hybridisierung eines Oligonucleotidpaares an angrenzende Sequenzen der Matrize, wobei die angrenzenden Sequenzen die Zielsequenz um fassen, so daß die Oligonucleotide an die Matrize zur Ligation aneinander gelagert werden, und (c) Ligation der aneinander gelagerten Oligonucleotide, um ein doppelsträngiges Ligationsprodukt herzustellen, (d) Denaturierung des doppelsträngigen Ligationsproduktes, um einen ursprünglichen Matrizenstrang und einen Oligonucleotid-Ligationsproduktstrang herzustellen, und (e) Wiederholung der Schritte (b) bis (d), so daß beide, der ursprüngliche Matrizenstrang und der Oligonucleotid-Ligationsstrang, als Matrizen für eine weitere Ligationsreaktion fungieren, wobei die Matrizennucleinsäure aus einem Virus stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin die Nucleinsäure DNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin die Nucleinsäure RNA ist.