EP0826067A1 - Simultane sequenzierung von nukleinsäuren - Google Patents

Simultane sequenzierung von nukleinsäuren

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EP0826067A1
EP0826067A1 EP96914138A EP96914138A EP0826067A1 EP 0826067 A1 EP0826067 A1 EP 0826067A1 EP 96914138 A EP96914138 A EP 96914138A EP 96914138 A EP96914138 A EP 96914138A EP 0826067 A1 EP0826067 A1 EP 0826067A1
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
labeled
primer
labeling
added
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96914138A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wilhelm Ansorge
Hartmut Voss
Josef Stegemann
Stefan Wiemann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Original Assignee
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL filed Critical Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Publication of EP0826067A1 publication Critical patent/EP0826067A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for sequence-specific labeling and simultaneous sequencing of nucleic acids, comprising the generation of labeled nucleic acid fragments by an enzymatic labeling reaction. in which a labeled deoxyribonucleoside triphosphate is added to a nucleic acid primer molecule and the determination of the nucleic acid sequence via the label.
  • DNA sequencing using the Sanger enzymatic chain termination method starting from a nucleic acid matrix, many differently long labeled nucleic acid fragments are produced by an enzymatic extension and termination reaction, in which a synthetic oligonucleotide primer using polymerase and a mixture of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) and chain termination molecules, in particular dideoxyribonucleoside triphosphates (ddNTP) is extended and terminated.
  • dNTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphates
  • a mixture of the deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) and one dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP) is usually used in four batches.
  • dNTPs deoxyribonucleoside triphosphates
  • ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate
  • DNA sequencing is carried out with automated systems in which a non-radioactive label, in particular a fluorescent label, is usually used (LM Smith et al., Nature 321 (1986), 674-679; W. Ansorge et al, J Biochem. Biophys. Meth. 13: 315-323 (1986).
  • LM Smith et al. Nature 321 (1986), 674-679; W. Ansorge et al, J Biochem. Biophys. Meth. 13: 315-323 (1986).
  • the nucleotide sequence is read directly during the separation of the labeled fragments and entered directly into a computer.
  • non-radioactive labeling groups can be introduced either via labeled primer molecules, labeled chain termination molecules or as internal labeling via labeled dNTP.
  • the sequencing reactions are each carried out individually in a reaction vessel, so that only a single sequence is obtained with a sequencing reaction.
  • the object of the present invention was therefore to provide a method for sequence-specific labeling and sequencing of nucleic acids, in which the disadvantages of the prior art are at least partially eliminated.
  • the method according to the invention is intended to enable two or more sequencing reactions to be carried out simultaneously in a single reaction vessel using at least two differently labeled dNTP and at least two, preferably unlabeled, primer molecules.
  • the object of the invention is achieved by a method for the sequence-specific labeling of nucleic acids, comprising the generation of labeled nucleic acid fragments by an enzymatic labeling reaction, in which a labeled deoxyribonucleoside triphosphate is added to a nucleic acid primer molecule and the determination of the nucleic acid sequence by means of the labeling, the method being characterized thereby that the labeling reaction molecules in a single reaction vessel in the presence of one or more nucleic acid primers and labeled at least two Deoxyribonucleoside triphosphates, each containing different labeling groups and different bases, and under conditions in which only a single type of labeled deoxyribonucleoside triphosphates is added to a nucleic acid primer molecule.
  • the nucleic acid primer molecule is a nucleic acid, preferably a DNA, which is sufficiently complementary to a nucleic acid in the reaction mixture to initiate a hybridization reaction under the respective reaction conditions.
  • the length of the primer molecule is preferably 10-100, more preferably 12-50 and most preferably 12-30 nucleotides.
  • the enzymatic labeling reaction is carried out in the process according to the invention in such a way that only one type of labeled dNTPs and preferably only one type of labeled dNTPs and preferably only one labeled dNTP are added to each nucleic acid primer molecule.
  • the labeled dNTP is preferably added directly to the 3 'end of the primer (position +1).
  • the base of the labeled dNTP is complementary to that base which is arranged on the nucleic acid hybridizing with the primer molecule directly on the 5 'side of the region complementary to the primer.
  • the marking can also be installed at a greater distance from the 3 'end of the primer (positions +2, +3, +4 etc.).
  • unlabeled dNTPs can also be present in the labeling reaction.
  • sequence of one or more primer molecules can also be chosen so that when a polymerase with 3'-exonuclease activity is used, the labeled dNTPs are inserted in an exchange reaction as the terminal base of the primer (s) when the 3'-terminal base of the Primers equal the base of the labeled dNTP used.
  • the conditions for carrying out the enzymatic labeling reaction are chosen such that statistically only a single type of labeled deoxyribonucleoside triphosphate can be added to the primer.
  • the reaction conditions such as the concentrations of polymerase enzyme or / and dNTP, temperature, concentration of other components, etc.
  • the specificity of the reaction can be increased by selecting the primer molecules as explained below.
  • the method according to the invention enables, for example, the simultaneous sequencing of DNA fragments with two or more primer molecules, preferably unlabeled primer molecules, and several labeled dNTP in one reaction vessel.
  • Several labeling reactions can be carried out simultaneously on different strands of the nucleic acid to be sequenced or at different locations on the same nucleic acid strand.
  • the specificity of the method according to the invention is surprisingly so high that statistically a single type of label, in particular only a single labeled dNTP, is added to a specific primer molecule, even if several other differently labeled dNTP, primer molecules and nucleic acid template molecules are in the same Reaction vessel are present.
  • the costs for carrying out the sequencing reactions can be reduced by 50-75%. Both chemical and labor costs are reduced. This is particularly important in large-scale sequencing projects, such as the "human genome” sequencing project or other genome projects.
  • the most important application form is the automated DNA sequencing with fluorescent labeling groups.
  • mini-sequencing in which the nucleic acid sequence is determined only within a limited range of up to three bases after the primer on the basis of a sequence-specific incorporation of the labeled dNTP.
  • Another possible application is the detection of point mutations in genes, especially in human genes.
  • the primer molecule is selected such that it lies immediately before a "hot spot" of the mutation. Only one primer is used together with two or more different labeled dNTPs and the labeling reaction is carried out. Only a single labeled dNTP is inserted which is complementary to the corresponding base on the nucleic acid template. The extended primer molecule can then be analyzed and the labeling group identified by its spectral characteristics. In this way, a conclusion can be drawn about the sequence of the gene in question.
  • the method according to the invention is preferably carried out by
  • a) binds at least one nucleic acid primer molecule to the nucleic acid to be sequenced
  • one or more nucleic acid sequences are determined via the sequence-specific incorporation of the labeled deoxyribonucleoside triphosphates.
  • At least two labeled deoxyribonucleoside triphosphates are used in a reaction batch, each containing different labeling groups and different bases, ie a maximum of four deoxyribonucleoside triphosphates (corresponding to bases A, T, C and G) can be used each with a different marker group.
  • the labeling groups can be radioactive or non-radioactive labels and should be detectable side by side.
  • Non-radioactive labeling groups, in particular fluorescent labeling groups, for example fluorescent dyes such as rhodamine, derivatives of rhodamine such as methylrhodamine, Texas red, phycoerythrin, fluorescein and derivatives thereof, CY3, CY5 are preferred.
  • Other suitable non-radioactive labeling groups are, for example, metals , magnetic marker groups which can be detected by nuclear magnetic resonance or by a superconducting quantum interferometric detector (SQID) or phosphorescent dyes. Suitable excitation and / or detection systems can be used to determine the respective markings.
  • fluorescence-labeled dNTP examples include fluorescein-dUTP, fluorescein-dATP (Boehringer Mannheim, Pharmacia); Texas red dCTP and dGTP (NEN-Dupont), CY5-dATP and dCTP and CY3-dATP (Pharmacia).
  • fluorescent labeling groups which can be verified side by side at the same time.
  • two or more different laser systems which are coupled to corresponding detection systems, can be used to excite the fluorescence groups.
  • Bandpass filters can largely suppress interference between the two laser systems. The data is recorded by two detector devices, one for each laser.
  • combinations of fluorescent dyes can also be used which can be excited by a single laser system and can be determined separately by different detection systems.
  • the concentration of the labeled dNTPs during the labeling reaction is preferably so low that, for a given polymerase concentration, essentially only a single labeled dNTP can be added to a primer molecule.
  • the labeled dNTPs are therefore preferably used in a concentration of 0.05-5 ⁇ mol / liter, particularly preferably in a concentration of 0.1-2.5 ⁇ mol / liter.
  • the polymerase present in the reaction mixture can statistically add only a single molecule -dNTP to a primer.
  • the polymerase concentration is preferably 1-20 U, particularly preferably 5-15 U per batch.
  • the specificity of the incorporation of labeled dNTPs by the choice of the labeling molecule (e.g. fluorescein, Texas red etc.), by the choice of the dNTP (dUTP, dTTP, dATP, dCTP, dGTP etc.) or / and by the way in which the dNTP and the labeling molecule are linked (e.g. length of the spacer arm) to be influenced.
  • the labeling molecule e.g. fluorescein, Texas red etc.
  • a polymerase is used in the process according to the invention, preferably the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, unmodified T7 DNA polymerase, modified T7 DNA polymerase (Sequenase), T. -DNA polymerase, Taq-DNA polymerase, Bst-DNA polymerase or reverse transcriptase.
  • Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I unmodified T7 DNA polymerase
  • modified T7 DNA polymerase modified T7 DNA polymerase (Sequenase)
  • T. -DNA polymerase T. -DNA polymerase
  • Taq-DNA polymerase Taq-DNA polymerase
  • Bst-DNA polymerase reverse transcriptase.
  • polymerases without 3 'exonuclease activity are preferred, e.g. modified T7 polymerase.
  • polymerases with 3 'exonuclease activity e.g. unmodified T7 polymerase may be preferred, for example if the labeled deoxyribonucleoside triphosphate is inserted as the last base of the primer molecule (position -1) by sequential exonuclease and polymerase activities in an exchange reaction.
  • An advantage of the method according to the invention is its simplicity, since no labeled primer molecules are required. This is particularly important for large scale sequencing projects such as sequencing the human genome or other genome projects.
  • labeled primers in order to obtain additional information about the nucleic acid sequence, if necessary.
  • the sequencing reaction can also be carried out using a combination of unlabeled and labeled (fluorescent dyes or otherwise, for example digoxigenin, biotin, metals, etc.) primers, the choice of the primers preferably being carried out in such a way that the inner labeling is only carried out on unlabeled primers is added.
  • the labeled primers preferably carry other labeling groups than the labeled dNTPs.
  • the choice of the primer molecules is important. For example, the primers must be followed by different nucleotides, which are incorporated as the next base when the primer is extended by the polymerase. In this way, only one type of marker group is added to each type of primer molecule in the labeling reaction. The choice of the reaction conditions in the labeling reaction prevents the incorporation of other labeling groups.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to a method in which at least two primer molecules are used which bind to different regions of the nucleic acid to be sequenced, the primer molecules being selected such that the base to be added next to their 3 'end in each case is different, and a labeled deoxyribonucleoside triphosphate with a corresponding base is used for each primer molecule, so that only a single different labeled deoxyribonucleoside triphosphate is added to each primer molecule.
  • the base at the 3 'end of a primer molecule is referred to as "position -1" in the present application.
  • the base to be added next to the 3 'end of the primer molecule by the polymerase is referred to as "position +1" and the base to be added as the next but one as "position +2".
  • primer molecules To increase the specificity of the labeling reaction, additional criteria should preferably be taken into account when designing the primer molecules. For example, only those primer molecules are used in one approach in which the base to be added next to the 3 'end of the primer (position +1) is not immediately the same as the base to be added to the 3' end of another primer as the next but one (Position +2). This reduces the likelihood that a primer molecule will be labeled with two different labeling groups.
  • primer molecules in which the base at the 3 'end of one primer molecule (position - 1) is not the same as the base to be added next to the 3' end of another primer molecule (position +1) is. In this way, possible double labeling due to a 3 'exonuclease activity of the polymerase enzyme used can be avoided.
  • this selection criterion does not necessarily have to be considered.
  • two or more nucleic acid sequences can be determined simultaneously by the method according to the invention.
  • the sequencing reaction of the method according to the invention is usually carried out in two steps.
  • a labeling reaction a single type of labeled dNTPs is added to the 3 'end of the primer.
  • a primer is preferably selected such that the labeled dNTP is added directly to its 3 'end (position +1). It is further preferred that only labeled dNTPs are present in the labeling reaction, since in this way the likelihood of the incorporation of labeled dNTPs is reduced in the event of an undesired binding of the primer to secondary binding sites on the template.
  • the next step is an extension reaction up to the incorporation of a chain termination molecule, through which the Polymerization is terminated.
  • This extension reaction is preferably carried out in separate batches in the presence of the oligonucleotide primers specifically labeled by the labeling reaction, the polymerase, the nucleic acid to be sequenced as a template, the four unlabeled deoxyribonucleoside triphosphates and in each case one chain termination molecule.
  • the extension of a primer produces a nucleic acid strand which bears a labeling group specific for the respective primer and is terminated by the incorporation of a chain termination molecule.
  • the nucleic acid sequence is therefore preferably determined by the method according to the invention by
  • the four unlabeled dNTP are in a large excess compared to the labeled dNTP used in the labeling reaction, so that no further incorporation of labeled dNTP takes place during the extension reaction.
  • the unlabeled deoxyribonucleoside triphosphates are preferably present in an at least 100-fold excess, particularly preferably in an at least 1000-fold excess with respect to the labeled deoxyribonucleoside triphosphates.
  • the concentration of the unlabelled dNTP is therefore preferably 0.05-5 mmol / liter and particularly preferred 0.1-2.5 mmol / liter in the extension batch.
  • Deoxyribonucleoside triphosphates which are modified at the 3 'position of the deoxyribose in such a way that they have no free OH group, but are nevertheless accepted as a substrate by the polymerase, are expediently used as chain termination molecules.
  • chain termination molecules are about 3'-fluoro, 3'-0-alkyl and 3 '-H-modified deoxyribonucleosides.
  • 3'-H-modified deoxyribonucleotides, i.e. Dideoxyribonucleoside triphosphates (ddNTP) are used.
  • the process according to the invention is preferably carried out with unlabelled chain termination molecules, but it is also possible to use labeled chain termination molecules as are known to the person skilled in the art.
  • the determination of the nucleic acid sequence via the label is usually carried out by separating the labeled nucleic acid fragments according to their length. This separation can be carried out by all methods known in the art, e.g. by various electrophoretic (e.g. polyacrylamide gel electrophoresis) or chromatographic (e.g. HPLC) methods, with gel electrophoretic separation being preferred. Furthermore, the separation of the labeled nucleic acids can be carried out in any way, i.e. manually, semi-automatically or automatically, but the use of an automated sequencer is generally preferred.
  • electrophoretic e.g. polyacrylamide gel electrophoresis
  • chromatographic e.g. HPLC
  • the labeled nucleic acids can be separated in ultra-thin plate gels of 20-500 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m thick (see, for example, Stegemann et al, Methods in Mol. And Cell. Biol. 2 (1991), 182-184) or capillaries become.
  • the sequence determination can also take place in non-automated devices, e.g. by a blotting process.
  • Nucleic acid is available, an amplification step can also be carried out.
  • One way of amplification is to carry out one or more cycles of a polymerase chain reaction (PCR) using two primers before the actual sequencing.
  • the PCR is usually carried out without labeled dNTP.
  • the nucleic acid to be sequenced can thus be amplified before the actual sequencing procedure is carried out.
  • the amplification step can also be carried out with the aid of a "thermocycling" reaction.
  • the thermocycling reaction corresponds to a "normal” sequencing reaction which, however, like a PCR, is carried out in several cycles.
  • the reaction mixture contains the nucleic acid template, the primer molecules, the dNTP and the corresponding chain termination molecules as well as the preferably thermostable polymerase. In this way, a certain amount of the labeled nucleic acid fragments is always synthesized per cycle, it being possible to generate large amounts of labeled fragments in several cycles.
  • the nucleic acid to be sequenced can be in both single-stranded and double-stranded form. Good results are obtained if the nucleic acid to be sequenced is located on a double-stranded DNA sector - e.g. a plasmid, cosmid, bacteriophage (lambda or PI), a viral vector or an artificial chromosome.
  • a double-stranded DNA sector e.g. a plasmid, cosmid, bacteriophage (lambda or PI), a viral vector or an artificial chromosome.
  • Another object of the invention is a reagent kit for the selective introduction of a single labeling group into a nucleic acid, which contains at least two labeled deoxyribonucleoside triphosphates in addition to other components required for labeling or sequencing, each containing different labeling groups and different bases.
  • the reagents can be present, for example, in the form of a solution, a suspension or a lyophilisate.
  • This reagent kit can be used in particular for the sequencing of Small acids are used and contain additional reagents (e.g. enzyme, primer, buffer solutions, unlabeled dNTPs, terminators).
  • FIG. 1 schematically shows the sequencing procedure according to the invention
  • FIG. 2 shows the result of plasmid sequencing using two unlabeled primers in the presence of fluorescein-15-dATP and Texas red-5-dCTP,
  • FIG. 3 shows the result of an investigation into the repeated incorporation of labeled dNTP
  • FIG. 4 shows the result of an investigation regarding the incorporation of a label into the primer itself.
  • cDNA molecules derived from a human keratinocyte cDNA library were cloned into a Bluescript vector (Stratagene, LaJolla, California, USA) using standard methods.
  • the plasmid DNAs were purified using Quiagen (Hilden, Germany) or Nucleobond AX ion exchange columns (Machery-Nagel, Düren, Germany).
  • primers were developed using the computer programs GeneSkipper (EMBL, Heidelberg, Germany) or Oligo TM, 4.1 (Medprobe, Norway). Primer pairs were selected which did not tend to form dimers and which had no further binding sites on the template or no tendency to form a hairpin structure. One of the primers was selected so that an "A” is added to the 3 'end as the next base. The second primer was chosen so that a "C” was added as the next base. The primers were synthesized on the EMBL multiple segment DNA synthesizer (Ansorge et al, Electrophoresis 13 (1992) 616-619).
  • extension buffer (304 mmol / liter sodium citrate, 40 mmol / liter MnCl 2 , 324 mmol / liter dithiothreitol) was added to the mixture and mixed.
  • the solution was then divided into aliquots and 4 separate extension / termination mixtures were added, which consist of 3 ⁇ l of the respective termination solutions (40 mmol / liter Tris / HCl pH 7.4, 50 mmol / liter NaCl, 5 ⁇ mol / liter of the respective ddNTP, in each case 1 mmol / liter dATP, dCTP, C 7 -dGTP and dTTP) and 1 ul DMSO passed.
  • the reaction was carried out for 5 min. incubated for a long time at 37 ° C. and stopped by adding 4 ⁇ l stop solution (6 mg / ml dextran blue and 20 mmol / liter EDTA, pH 7.3 in deionized formamide). Then the samples were 4 min. denatured at 85 ° C for a long time and placed on a sequence gel.
  • the structure of the modified DNA sequencing device is described in detail in Wiemann et al (Anal. Biochem. 224 (1995), 117-121.
  • a helium-neon laser was also used in the sequencing device
  • the Ar laser excites the fluorescein-labeled samples, while the HeNe laser is used to excite Texas red-labeled DNA fragments, both of which are guided into the gel using a single light coupling plate that is between two spacers
  • the spatial distance of 0.7 cm between the lasers and the combination of two different laser, detector and filter systems with corresponding fluorophores ensures that no cross-over detection of the sequence signals occurs.
  • FIG. 1 shows schematically the principle of simultaneous sequencing of nucleic acids. After denaturation, two primers bind to the complementary regions of the nucleic acid template to be sequenced.
  • the matrices can originate from the same strand of a single- or double-stranded DNA or from different strands of the same double-stranded DNA or from different DNA's.
  • Two differently labeled dNTP are used in the sequencing reaction. Only the two labeled nucleotides fluorescein-15-dATP and Texas red-5-dCTP are present in the labeling step of the sequencing reaction.
  • a selective labeling of specific products with only one dye is achieved by incorporating the respective nucleotide as the first base directly downstream of the primer molecule.
  • This response is comparable to Minise sequencing (Syvänen et al, Genomics 8 (1990), 684-692) of point mutations, where the base added directly to the primer is the distinguishing factor as to whether a labeled dNTP is incorporated or not .
  • the primers are selected such that the bases to be added directly to the primer are different, e.g. an "A”. and a "C”. In this labeling step, only the correct nucleotide is ever incorporated into each primer.
  • the polymerase After incorporation of the first labeled dNTP, the polymerase could take a break because the labeled dNTP is only present in a low concentration. The polymerase could also fall off the template and be available for the extension of further primer molecules up to the incorporation of the labeled dNTPs (e.g. in cycle sequencing).
  • FIG. 2 shows sequence data obtained in a simultaneous sequencing on both strands of a plasmid DNA. Two unlabeled walking primers were used.
  • FIG. 2a shows the sequence generated with fluorescein-15-dATP and
  • FIG. 2b shows the sequence generated with Texas red 5-dCTP.
  • FIG. 3 shows the result of a test for multiple incorporation of labeled dNTP. Sequencing primers were selected in which a "C” and then an "A” or first an "A” and then a “C” were inserted at positions +1 and +2. The sequencing reactions were carried out with native T7 DNA polymerase.
  • Figure 3a shows the Texas Red signals from a primer with a "C” at position +1 and an "A” at position +2.
  • Figure 3b shows the fluorescein signals from the same primer.
  • Figure 3c shows Texas Red signals from a primer with "A” at position +1 and “C” at position +2.
  • FIG. 3d shows fluorescein signals with the primer from FIG. 3c.
  • FIG. 3 shows that there was little incorporation of Texas red 5 dCTP at position +2. Since the marking in position +2 is significantly weaker than the marking in position +1, the sequence data obtained with the second primer are also clear.
  • Figure 4 shows the results of a test for the incorporation of a label within the primer.
  • Sequencing primers are selected which contain an "A" as the 3 '-terminal base (position -1) and which are to be incorporated with a "C” as the next base (position +1), and primers with the reverse base sequence.
  • the sequencing reactions were carried out with either native T7 DNA polymerase (n-T7) or Sequenase (Seq).
  • 4a shows Texas red signals from sequencing with Sequenase and one Primer with "A" as 3 'terminal base and a "C” at position +1.
  • FIG. 4b shows fluorescein signals from a sequencing with Sequenase and with the primer from FIG. 4a.
  • Figure 4c shows Texas Red signals from sequencing with native T7 polymerase and the primer of Figure 4a.
  • FIG. 4d shows fluorescein signals from sequencing with native T7 DNA polymerase and the primer from FIG. 4a.
  • 4e shows fluorescein signals from sequencing with Sequenase and a primer, with "C” as the 3 'terminal base and an "A" at position +1.
  • Figure 4f shows Texas Red signals from sequencing with Sequenase and the primer of Figure 4e.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung von Nukleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markierungsreaktion, bei der ein markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat an ein Nukleinsäure-Primermolekül angefügt wird, und die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung, wobei die Markierungsreaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß bei gleichzeitiger Anwesenheit von einem oder mehreren Nukleinsäure-Primermolekülen und mindestens zwei markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, und unter Bedingungen erfolgt, bei denen an ein Nukleinsäure-Primermolekül nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird.

Description

Simultane Sequenzierung von Nukleinsäuren
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung und simultanen Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markierungsreaktion. bei der ein markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat an einNukleinsäure-Primermolekül angefügt wird und die Bestimmung der Nukleinsequenz über die Markierung.
Bei der DNA-Sequenzierung durch die enzymatische Ketten¬ abbruchmethode nach Sanger werden, ausgehend von einer Nu- kleinsäure-Matritze, viele verschieden lange markierte Nukleinsäurefragmente durch eine enzymatische Extensions- und Terminationsreaktion hergestellt, bei der ein synthetischer Oligonukleotidprimer mit Hilfe von Polymerase und einer Mischung von Deoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTP) und Kettenabbruchmolekülen, insbesondere Dideoxyribonucleosid- triphosphaten (ddNTP) verlängert und terminiert wird.
Dabei wird üblicherweise jeweils in vier Ansätzen eine Mischung der Deoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs) und jeweils einem Dideoxyribonucleosidtriphosphat (ddNTP) eingesetzt. Auf diese Weise wird ein statistischer Einbau der Kettenabbruchmoleküle in die wachsenden Nukleinsäureketten erreicht, wobei nach dem Einbau eines Kettenabbruchmoleküls die DNA-Kette aufgrund des Fehlens einer freien 3'-0H-Gruppe nicht mehr weiter verlängert werden kann. Es entsteht daher eine Vielzahl von unterschied¬ lich langen DNA-Fragmenten, die statistisch gesehen an jeder möglichen Einbaustelle ein Kettenabbruchmolekul enthalten und dort enden. Diese vier Ansätze mit den jeweils aufgrund des Einbaus von Kettenabbruchmolekülen spezifisch an einer Base endenden Fragmenten werden nach ihrer Länge, z.B. durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese, üblicherweise in vier ver¬ schiedenen Spuren aufgetrennt und die Sequenz über die Markie¬ rung dieser Nukleinsäurefragmente ermittelt.
Heute wird die DNA-Sequenzierung mit automatisierten Systemen durchgeführt, bei denen üblicherweise eine nicht-radioaktive Markierung, insbesondere eine Fluoreszenz-Markierung verwendet wird (L.M. Smith et al, Nature 321 (1986), 674-679; W. Ansorge et al, J. Biochem. Biophys. Meth. 13 (1986), 315-323). Bei diesen automatisierten Systemen wird die Nukleotidsequenz direkt während der Auftrennung der markierten Fragmente gelesen und direkt in einen Computer eingegeben.
Bei den automatisierten Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren können nicht-radioaktive Markierungsgruppen entweder über markierte Primermoleküle, markierte Ketten¬ abbruchmoleküle oder als innere Markierung über markierte dNTP eingeführt werden. Bei all diesen bekannten Markierungsmethoden werden die Sequenzierungsreaktionen jeweils einzeln in einem Reaktionsgefäß durchgeführt, so daß mit einer Sequenzierungs- reaktion immer nur eine einzige Sequenz erhalten wird.
In der internationalen Patentanmeldung WO 93/03180 wird ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren beschrieben, bei dem Nukleinsäurefragmente nach Einbau von mindestens einem nicht-radioaktiv markierten dNTP als innere Markierung bestimmt werden, wobei die Einführung der inneren Markierung in die Nukleinsäurefragmente in Abwesenheit von Kettenabbruchmolekülen stattfindet.
Die simultane Bestimmung von zwei Nukleinsäuresequenzen mit zwei unterschiedlich markierten Primermolekülen in einem einzigen Reaktionsgefäß wurde von Wiemann et al (Anal. Biochem. 224 (1995) 117-121) beschrieben. Ein Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, daß farbstoffmarkierte Oligonukleotid¬ primer eingesetzt werden müssen, deren Herstellung sehr kostspielig ist oder/und aufwendig ist. Dieser Nachteil tritt insbesondere bei der Sequenzierung längerer Genabschnitte unter Anwendung der "Walking primer"-Strategie zu Tage, bei der für jede Sequenzierungsreaktion unterschiedliche Primer verwendet werden müssen. Überdies wird durch die Verwendung markierter Primer manchmal die Hybridisierung des Primers mit der Nu- kleinsäurematrize behindert, was zu ungenauen Sequenzierungs¬ resultaten führen kann.
Um diesen Nachteil zu vermeiden, könnte man zwei Sequenzierungsreaktionen jeweils mit einem unmarkierten Primer und einem von zwei jeweils unterschiedlich markierten dNTP in zwei separaten Reaktionsgefäßen durchführen, die beiden Produkte vermischen, sie simultan auf ein Gel auftragen und die Sequenzen bestimmen. Der Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, daß Durchführung von zwei Sequenzierungsreaktionen in separaten Reaktionsgefäßen aufwendig und umständlich ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung und Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise beseitigt sind. Insbesondere soll das erfindungsgemäße Verfahren die gleichzei¬ tige Durchführung von zwei oder mehr Sequenzierungsreaktionen in einem einzigen Reaktionsgefäß unter Verwendung von minde¬ stens zwei unterschiedlich markierten dNTP und mindestens zwei, vorzugsweise unmarkierten Primermolekülen ermöglichen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung von Nukleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markierungsreaktion, bei der ein markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat aneinNukleinsäure-Primermolekül angefügt wird und die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Markierungsreaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß bei gleichzeitiger Anwesenheit von einem oder mehreren Nu- kleinsäure-Pri ermolekülen und mindestens zwei markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, und unter Bedingungen erfolgt, bei denen an ein Nukleinsäure- Primermolekül jeweils nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird.
Das Nukleinsäure-Primermolekül ist eine Nukleinsäure, vorzugs¬ weise eine DNA, die ausreichend komplementär zu einer im Reaktionsansatz befindlichen Nukleinsäure ist, um mit dieser eine Hybridisierungsreaktion unter den jeweiligen Reaktions¬ bedingungen einzugehen. Die Länge des Primermoleküls ist vorzugsweise 10 - 100, besonders bevorzugt 12-50 und am meisten bevorzugt 12-30 Nukleotide.
Die Durchführung der enzymatischen Markierungsreaktion erfolgt beim erfindungsgemäßen Verfahren derart, daß an ein Nuklein¬ säure-Primermolekül jeweils nur eine einzige Art von markierten dNTPs und vorzugsweise jeweils nur eine einzige Art von markierten dNTPs und vorzugsweise jeweils nur ein einziges markiertes dNTP angefügt wird. Vorzugsweise wird das markierte dNTP direkt an das 3'-Ende des Primers (Position +1) angefügt. In diesem Fall ist die Base des markierten dNTP komplementär zu derjenigen Base, die auf der mit dem Primermolekül hybridi¬ sierenden Nukleinsäure direkt 5'-seitig des zum Primer kom¬ plementären Bereich angeordnet ist. Sofern ein spezifischer Einbau von nur einer einzigen Art der Markierung hinter jedem Primer gewährleistet ist, kann die Markierung auch in größerem Abstand zum 3'-Ende des Primers eingebaut werden (Positionen +2, +3, +4 etc.). Hierzu können zusätzlich zu den mindestens zwei unterschiedlich markierten dNTPs auch noch unmarkierte dNTPs in der Markierungsreaktion vorhanden sein.
Die Sequenz eines oder mehrerer Pri ermoleküle kann jedoch auch so gewählt werden, daß bei Verwendung einer Polymerase mit 3'- Exonukleaseaktivität die markierten dNTPs in einer Austauschreaktion als terminale Base des oder der Primer(s) eingefügt werden, wenn die 3'terminale Base des Primers gleich der verwendeten Base des markierten dNTP ist.
Die Bedingungen bei der Durchführung der enzymatischen Markie¬ rungsreaktion werden so gewählt, daß statistisch nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten an den Primer angefügt werden kann. Um diese Reaktionsspezifität zu erreichen, werden vorzugsweise die Reaktionsbedingungen (wie etwa die Konzentrationen von Polymerase-Enzym oder/und dNTP, Temperatur, Konzentration von anderen Komponenten etc.) ent¬ sprechend gewählt. Außerdem kann die Spezifität der Reaktion durch Auswahl der Primermoleküle wie im folgenden erläutert, erhöht werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist beispielsweise die simultane Sequenzierung von DNA-Fragmenten mit zwei oder mehreren Primermolekülen, vorzugsweise unmarkierten Primermole- külen, und mehreren markierten dNTP in einem Reaktionsgefäß möglich. Es können mehrere Markierungsreaktionen gleichzeitig an verschiedenen Strängen der zu sequenzierenden Nukleinsäure oder an verschiedenen Stellen auf dem gleichen Nukleinsäure- sträng durchgeführt werden. Die Spezifität des erfindungs- gemäßen Verfahrens ist überraschenderweise derart hoch, daß statistisch eine einzige Art von Markierung, insbesondere nur ein einziges markiertes dNTP an ein bestimmtes Primermolekül angefügt wird, selbst wenn mehrere andere unterschiedlich markierte dNTP, Primermoleküle und Nukleinsäure-Matrize- Moleküle im gleichen Reaktionsgefäß anwesend sind.
Durch die Kombination von einer oder mehreren DNA-Matrizen und zwei oder mehreren Primermolekülen und markierten dNTPs in einer einzigen Sequenzierungsreaktion können die Kosten zur Durchführung der Sequenzierungsreaktionen um 50 - 75 % redu¬ ziert werden. Sowohl die Kosten für Chemikalien als auch für den Arbeitsaufwand werden verringert. Dies ist insbesondere bei Sequenzierungsprojekten im großen Maßstab bedeutend, wie etwa dem "Human Genome"-Sequenzierungsprojekt oder anderen Genom¬ projekten. Es gibt einen weiten Bereich von Anwendungsformen für das erfindungsgemäße Verfahren, z.B. die Sequenzierung, Kartierung und selektive Markierung von DNA-Fragmenten in der medizini¬ schen Diagnostik, Molekularbiologie, Biochemie und Chemie. Die bedeutendste Anwendungsform ist die automatisierte DNA- Sequenzierung mit Fluoreszenz-Markierungsgruppen.
Spezifische Anwendungsformen sind das sogenannte Minisequenzie¬ ren, bei dem die Nukleinsäuresequenz nur innerhalb eines begrenzten Bereichs von bis zu drei Basen nach dem Primer auf Basis eines sequenzspezifischen Einbaus des markierten dNTP bestimmt wird. Eine weitere mögliche Anwendung ist der Nachweis von Punktmutationen in Genen, insbesondere in humanen Genen. Hierbei wird das Primermolekül derart ausgewählt, daß es unmittelbar vor einem "Hot Spot" der Mutation liegt. Es wird nur ein Primer zusammen mit zwei oder mehreren verschiedenen markierten dNTP verwendet und die Markierungsreaktion durch¬ geführt. Es wird nur ein einziges markiertes dNTP eingebaut, das komplementär zur entsprechenden Base auf der Nukleinsäure- Matrize ist. Anschließend kann das verlängerte Primermolekül analysiert und die Markierungsgruppe durch ihre Spektralcharak¬ teristik identifiziert werden. Auf diese Weise ist ein Rück¬ schluß auf die Sequenz des betreffenden Gens möglich.
Bei einer Anwendung zur Sequenzbestimmung von Nukleinsäuren erfolgt die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise dadurch, daß man
a) mindestens ein Nukleinsäure-Primermolekül an die zu sequenzierende Nukleinsäure bindet,
b) eine Polymerase und mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosidtriphosphate zugibt, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten,
c) das Reaktionsgemisch in einem einzigen Reaktionsgefäß unter solchen Bedingungen inkubiert, daß an ein Primermo¬ lekül jeweils nur eine einzige Art von markierten Deoxy- ribonucleosidtriphosphaten angefügt wird, und
d) eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen über den sequenz- spezifischen Einbau der markierten Deoxyribonucleosidtri- phosphate bestimmt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden in einem Reaktions¬ ansatz jeweils mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosid- triphosphate verwendet, die jeweils unterschiedliche Markie¬ rungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, d.h. es können maximal vier Deoxyribonucleosidtriphosphate (entspre¬ chend den Basen A, T, C und G) verwendet werden, von denen jede eine unterschiedliche Markierungsgruppe trägt. Die Markierungs¬ gruppen können radioaktive oder nicht-radioaktive Markierungen sein und sollten nebeneinander nachweisbar sein. Bevorzugt sind nicht-radioaktive Markierungsgruppen, insbesondere Fluoreszenz- Markierungsgruppen, z.B. Fluoreszenzfarbstoffe wie etwa Rhodamin, Derivate des Rhodamins wie etwa Methylrhodamin, Texasrot, Phycoerythrin, Fluorescein und Derivate davon, CY3, CY5. CY2, CY7, Coumarin, Infrarot 40, MR 200, Bodipy-Farbstoffe (Molecular Probes) , 1, N6-etheno-Modifizierungsgruppen für dNTPs (Molecular Probes) , IRD 40 etc. Andere geeignete nicht-radio¬ aktive Markierungsgruppen sind beispielsweise Metalle, magne¬ tische Markierungsgruppen, die durch Kernresonanz oder durch einen supraleitenden quanteninterferometrischen Detektor (SQID) nachweisbar sind oder Phosphoreszenzfarbstoffe. Zur Bestimmung der jeweiligen Markierungen können geeignete Anregungs- oder/und Detektionssysteme eingesetzt werden.
Beispiele für kommerziell erhältliche fluoreszenzmarkierte dNTP sind etwa Fluorescein-dUTP, Fluorescein-dATP (Boehringer Mannheim, Pharmacia) ; Texasrot-dCTP und dGTP (NEN-Dupont) , CY5- dATP und dCTP sowie CY3-dATP (Pharmacia) .
Zweckmäßigerweise verwendet man Fluoreszenzmarkierungsgruppen, die sich gleichzeitig nebeneinander nachweisen lassen. So kann man beispielsweise zur Anregung der Fluoreszenzgruppen zwei oder mehrere unterschiedliche Lasersysteme verwenden, die mit entsprechenden Detektionssystemen gekoppelt sind. So können z.B. mit einem Argonlaser (Emissionswellenlänge = 488 nm) und entsprechenden Detektoren Fluorescein-Markierungsgruppen in den automatisiertenDNA-Sequenzierungssystemennachgewiesenwerden. Als zweiten Laser kann man beispielsweise einen Helium-Neon- Laser (Emissionswellenlänge = 594 nm) mit entsprechenden Detektoren zum Nachweis von Texasrot-markierten Nukleinsäuren verwenden. Durch Bandpassfilter können Interferenzen zwischen beiden Lasersystemen weitgehend unterdrückt werden. Die Daten werden durch zwei Detektorgeräte aufgezeichnet, eines für jeden Laser. Andererseits können auch Kombinationen von Fluoreszenz¬ farbstoffen verwendet werden, die durch ein einziges Lasersy¬ stem angeregt und durch jeweils unterschiedliche Detektions- systeme getrennt bestimmt werden können.
Die Konzentration der markierten dNTPs während der Markierungsreaktion ist vorzugsweise derart gering, daß bei einer gegebenen Polymerase-Konzentration im wesentlichen nur ein einziges markiertes dNTP an ein Primermolekül angefügt werden kann. Vorzugsweise werden daher die markierten dNTPs in einer Konzentration von 0,05 - 5 μmol/Liter, besonders bevor¬ zugt in einer Konzentration von 0,1 - 2,5 μmol/Liter verwendet. Bei einer derartigen dNTP-Konzentration kann die im Reaktions- gemisch vorliegende Polymerase statistisch nur ein einziges Molekül -dNTP an einen Primer anfügen. Die Polymerasekonzen- tration beträgt vorzugsweise 1-20 U, besonders bevorzugt 5-15 U pro Ansatz. Insbesondere bei gleichzeitiger Verwendung von mehreren Primermolekülen kann die Einhaltung der oben genannten Konzentrationsbereiche kritisch sein, da bei einer zu hohen dNTP- oder/und Enzymkonzentration das Anfügen mehrerer unter¬ schiedlich markierter dNTP an einen einzigen Primer möglich ist.
Weiterhin kann die Spezifität des Einbaus von markierten dNTPs durch die Wahl des Markierungsmoleküls (z.B. Fluorescein, Texasrot etc.), durch die Wahl des dNTP (dUTP, dTTP, dATP, dCTP, dGTP etc.) oder/und durch die Art der Verknüpfung von dNTP und Markierungsmolekül (z.B. Länge des Spacerarms) beeinflußt werden.
Zur enzymatischen Anfügung eines dNTP an das Primermolekül verwendet man im erfindungsgemäßen Verfahren eine Polymerase, vorzugsweise das Klenow-Fragment der E.coli-DNA-Polymerase I, unmodifizierte T7 DNA-Polymerase, modifizierte T7-DNA-Polyme¬ rase (Sequenase) , T -DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase, Bst- DNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase. Von diesen Enzymen sind Polymerasen ohne 3' -Exonucleaseaktivität bevorzugt, z.B. modifizierte T7-Polymerase.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können jedoch auch Polymerasen mit 3' -Exonucleaseaktivität, z.B. unmodifi- zierte T7 Polymerase, bevorzugt sein, beispielsweise wenn das markierte Deoxyribonucleosidtriphosphat durch sequenziell erfolgende Exonuclease- und Polymeraseaktivitäten in einer Austauschreaktion als letzte Base des Primermoleküls (Position -1) eingefügt wird.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist seine Einfachheit, da keine markierten Primermoleküle benötigt werden. Dies ist insbesondere für Sequenzierungsprojekte in großem Maßstab, wie die Sequenzierung des menschlichen Genoms oder anderer Genomprojekte bedeutsam. Andererseits können, sofern gewünscht, natürlich auch markierte Primer verwendet werden, um ggf. zusätzlich Informationen über die Nukleinsäure- sequenz zu erhalten. Die Sequenzierungsreaktion kann außerdem mit einer Kombination von unmarkierten und markierten (Fluo¬ reszenzfarbstoffe oder andersartig, z.B. Digoxigenin, Biotin, Metalle etc.) Primern durchgeführt werden, wobei die Auswahl der Primer vorzugsweise derart erfolgen soll, daß die innere Markierung jeweils nur an unmarkierte Primer angefügt wird. Die markierten Primer tragen vorzugsweise andere Markierungsgruppen als die markierten dNTPs.
Bei der simultanen Sequenzierung von Nucleinsäuren unter Verwendung von zwei oder mehr Primermolekülen ist die Auswahl der Primermoleküle bedeutsam. So müssen die Primer von ver¬ schiedenen Nukleotiden gefolgt werden, die bei einer Ver¬ längerung des Primers durch die Polymerase als nächste Base eingebaut werden. Auf diese Weise wird bei der Markierungs- reaktion nur jeweils eine Art von Markierungsgruppe an eine Art von Primermolekül angefügt. Durch die Wahl der Reaktions¬ bedingungen bei der Markierungsreaktion kann der Einbau anderer Markierungsgruppen ausgeschlossen werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem man mindestens zwei Primermole¬ küle verwendet, die an unterschiedliche Bereiche der zu sequenzierenden Nukleinsäure binden, wobei die Primermoleküle derart ausgewählt werden, daß die an ihr 3' -Ende als nächste anzufügende Base jeweils unterschiedlich ist, und wobei für jedes Primermolekül ein markiertes Deoxyribonucleosidtri¬ phosphat mit einer entsprechenden Base verwendet wird, so daß an jedes Primermolekül jeweils nur ein einziges unterschiedli¬ ches markiertes Deoxyribonukleosidtriphosphat angefügt wird. Zum besseren Verständnis wird in der vorliegenden Anmeldung die Base am 3' -Ende eines Primermoleküls jeweils als "Position -1" bezeichnet. Die durch die Polymerase an das 3'-Ende des Primermoleküls als nächste anzufügende Base wird mit "Position +1" und die als übernächste anzufügende Base mit "Position +2" bezeichnet.
Zur Erhöhung der Spezifität der Markierungsreaktion sollten vorzugsweise bei der Konstruktion der Primermoleküle noch weitere Kriterien beachtet werden. So verwendet man vorzugs¬ weise in einem Ansatz nur solche Primermoleküle, bei denen die an das 3' -Ende des Primers als nächste anzufügende Base (Position +1) nicht gleich mit der an das 3' -Ende eine anderen Primers als übernächste anzufügenden Base (Position +2) ist. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit verringert, daß ein Primermolekül mit zwei verschiedenen Markierungsgruppen markiert wird.
Weiterhin ist es bevorzugt, daß man Primermoleküle verwendet, bei denen die Base am 3'-Ende eines Primermoleküls (Position - 1) nicht gleich mit der an das 3'-Ende eines anderen Primermo- leküls als nächste anzufügenden Base (Position +1) ist. Auf diese Weise lassen sich mögliche Doppelmarkierungen aufgrund einer 3' -Exonucleaseaktivität des verwendeten Polymeraseenzyms vermeiden. Bei Verwendung einer Polymerase ohne 3' -Exonuclease¬ aktivität, z.B. modifizierte T7-Polymerase, muß dieses Auswahl¬ kriterium nicht unbedingt beachtet werden.
Bei Verwendung von zwei oder mehreren Primermolekülen können durch das erfindungsgemäße Verfahren zwei oder mehrere Nuk- leinsäuresequenzen gleichzeitig bestimmt werden.
Die Sequenzierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens wird üblicherweise in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wird in einer Markierungsreaktion jeweils eine einzige Art von markierten dNTPs an das 3'-Ende des Primers angefügt. Besonders bevorzugt wird jeweils nur ein einziges markiertes dNTP an einen Primer angefügt. Der Primer wird vorzugsweise so ausge¬ wählt, daß das markierte dNTP direkt an sein 3' -Ende (Position +1) angefügt wird. Weiterhin ist es bevorzugt, daß bei der Markierungsreaktion nur markierte dNTP vorhanden sind, da auf diese Weise bei einer unerwünschten Bindung des Primers an sekundäre Bindungsstellen auf der Matrize die Wahrscheinlich¬ keit des Einbaus von markierten dNTPs verringert wird. Schlie߬ lich ist auch die Verwendung einer DNA Polymerase ohne 3'- Exonukleaseaktivität , z.B. Sequenase® bevorzugt, insbesondere wenn ein Primer mit einem Nukleotid endet, das als markiertes dNTP im Ansatz der Markierungsreaktion vorliegt.
Als nächster Schritt findet eine Extensionsreaktion bis zum Einbau eines Kettenabbruchmoleküls statt, durch den die Polymerisation terminiert wird. Diese Extensionsreaktion wird vorzugsweise in separaten Ansätzen in Gegenwart der durch die Markierungsreaktion spezifischmarkierten Oligonucleotidprimer, der Polymerase, der zu sequenzierenden Nukleinsäure als Matrize, der vier unmarkierten Deoxyribonucleosidtriphosphate und jeweils einem Kettenabbruchmolekul durchgeführt. Dabei entsteht durch Verlängerung eines Primers ein Nukleinsäure- sträng, der eine für den jeweiligen Primer spezifische Markie¬ rungsgruppe trägt und durch den Einbau eines Kettenabbruchmole¬ küls terminiert ist.
Die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz durch das erfindungs¬ gemäße Verfahren erfolgt daher vorzugsweise dadurch, daß man
(dl) das Reaktionsgemisch nach Anfügung des markierten Deoxyribonucleosidtriphosphats in mehrere Ansätze auf¬ teilt, jedem Ansatz ein Extensionsreagenz zusetzt, das vier unmarkierte Deoxyribonucleosidtriphosphate und jeweils ein unterschiedliches Kettenabbruchmolekul enthält, und die Ansätze inkubiert,
(d2) die aus (dl) resultierenden Nukleinsäurefragmente nach ihrer Größe auftrennt und
(d3) die Nukleinsäuresequenz über die Markierung der einzelnen Fragmente bestimmt.
Bei der Extensionsreaktion liegen die vier unmarkierten dNTP in einem großen Überschuß gegenüber dem bei der Markierungs- reaktion verwendeten markierten dNTP vor, so daß kein weiterer Einbau von markierten dNTP während der Extensionsreaktion stattfindet. Vorzugsweise liegen die unmarkierten Deoxyribonucleosidtriphosphate in einem mindestens 100-fachen Überschuß, besonders bevorzugt in einem mindestens 1000-fachen Überschuß bezüglich der markierten Deoxyribonucleosidtri¬ phosphate vor. Die Konzentration der unmarkierten dNTP beträgt daher vorzugsweise 0,05-5 mmol/Liter und besonders bevorzugt 0,1-2,5 mmol/Liter im Extensionsansatz.
Als Kettenabbruchmoleküle werden zweckmäßigerweise Deoxyribonucleosidtriphosphate verwendet, die an der 3'- Position der Deoxyribose so modifiziert sind, daß sie keine freie OH-Gruppe aufweisen, aber dennoch von der Polymerase als Substrat akzeptiert werden. Beispiele für solche Kettenabbruch¬ moleküle sind etwa 3'-Fluor-, 3'-0-Alkyl- und 3' -H-modifizierte Deoxyribonucleoside. Vorzugsweise werden als Kettenabbruchmole¬ küle 3' -H-modifizierte Deoxyribonukleotide, d.h. Dideoxyribonu- cleosidtriphosphate (ddNTP) verwendet. Vorzugsweise arbeitet man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit unmarkierten Kettenabbruchmolekülen, es ist jedoch auch möglich, markierte Kettenabbruchmoleküle, wie sie dem Fachmann bekannt sind, zu verwenden.
Die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung erfolgt üblicherweise durch Auftrennung der markierten Nukleinsäurefragmente nach ihrer Länge. Diese Auftrennung kann nach allen in der Technik bekannten Methoden, z.B. durch verschiedene elektrophoretische ( z . B . Polyacrylamidgelelektrophorese) oder chromatographische (z.B HPLC) Verfahren erfolgen, wobei eine gelelektrophoretische Auftrennung bevorzugt ist. Ferner kann die Auftrennung der markierten Nukleinsäuren auf an sich beliebige Weise, d.h. manuell, halbautomatisch oder automatisch erfolgen, wobei jedoch die Verwendung eines automatisierten Sequenziergeräts im allgemeinen bevorzugt ist. In diesem Fall kann die Auftrennung der markierten Nukleinsäuren in ultradünnen Plattengelen von 20-500 μm, vorzugsweise 100 μm Dicke (siehe z.B. Stegemann et al, Methods in Mol. and Cell. Biol. 2 (1991), 182-184) oder Kapillaren durchgeführt werden. Die Sequenzbestimmung kann jedoch auch in nicht-automatisierten Vorrichtungen erfolgen, z.B. durch ein Blotting-Verfahren.
Steht für eine Sequenzbestimmung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nur eine sehr geringe Menge der zu sequenzierenden Nukleinsäure zur Verfügung, so kann auch ein Amplifizierungsschritt durchgeführt werden. Eine Möglichkeit der Amplifizierung besteht darin, einen oder mehrere Zyklen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von zwei Primern vor der eigentlichen Sequenzierung durchzuführen. Die PCR erfolgt üblicherweise ohne markierte dNTP. So kann die zu sequenzierende Nukleinsäure vor Durchführung der eigentlichen Sequenzierungsprozedur amplifiziert werden.
Andererseits kann der Amplifizierungsschritt auch mit Hilfe einer "Thermocycling"-Reaktion erfolgen. Die Thermocycling- Reaktion entspricht einer "normalen" Sequenzierungsreaktion, die allerdings - wie eine PCR - in mehreren Zyklen durchgeführt wird. Der Reaktionsansatz enthält die Nukleinsäure-Matrize, die Primermoleküle, die dNTP und die jeweils entsprechenden Kettenabbruchmoleküle sowie die vorzugsweise thermostabile Polymerase. Auf diese Weise wird pro Zyklus immer eine be¬ stimmte Menge der markierten Nukleinsäurefragmente syntheti¬ siert, wobei in mehreren Zyklen große Mengen an markierten Fragmenten erzeugt werden können.
Die zu sequenzierende Nukleinsäure kann sowohl in einzel- strängiger als auch in doppelsträngiger Form vorliegen. Es werden gute Ergebnisse erhalten, wenn sich die zu sequenzie¬ rende Nukleinsäure auf einem doppelsträngigen DNA-Sektor - z.B. einem Plasmid, Cosmid, Bakteriophagen (Lambda oder Pl) , einem viralen Vektor oder einem künstlichen Chromosom befindet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zur selektiven Einführung einer einzigen Markierungsgruppe in eine Nukleinsäure, der neben anderen für die Markierung oder Sequenzierung erforderlichen Bestandteilen mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosidtriphosphate enthält, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten. Die Reagenzien können z.B. in Form einer Lösung, einer Suspension oder eines Lyophilisats vorliegen. Dieser Reagenzienkit kann insbesondere zur Sequenzierung von Nu- kleinsäuren verwendet werden und zusätzliche Reagenzien (z.B. Enzym, Primer, Pufferlösungen, unmarkierte dNTPs, Terminatoren) enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung in Verbindung mit den Figuren 1-4 weiter verdeutlichen.
Figur 1 zeigt schematisch die erfindungsgemäße Sequenzierungsprozedur,
Figur 2 zeigt das Ergebnis einer Plasmidsequenzierung unter gleichzeitiger Verwendung von zwei unmarkierten Primern in Gegenwart von Fluorescein-15-dATP und Texasrot-5-dCTP,
Figur 3 zeigt das Ergebnis einer Untersuchung zum mehrfachen Einbau markierter dNTP und
Figur 4 zeigt das Ergebnis einer Untersuchung bezüglich des Einbaus einer Markierung in den Primer selbst.
Beispiel 1
Simultane DNA-Sequenzierung mit zwei Primern
cDNA-Moleküle, die aus einer humanen Keratinocyten-cDNA-Bank stammen, wurden nach Standardmethoden in einen Bluescript- Vektor (Stratagene, LaJolla, Californien, USA) cloniert. Die Plasmid-DNA' s wurden unter Verwendung von Quiagen (Hilden, Deutschland) oder Nucleobond AX Ionenaustauschersäulen (Mache- rey-Nagel, Düren, Deutschland) gereinigt.
Alle Primer wurden unter Verwendung der Computerprogramme Gene- Skipper (EMBL, Heidelberg, Deutschland) oder Oligo™, 4.1 (Medprobe, Oslo, Norwegen) entwickelt. Es wurden Primerpaare ausgewählt, die nicht zu Dimerbildung neigten und die keine weiteren Bindungsstellen auf der Matrize oder keine Neigung zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur hatten. Einer der Primer wurde so ausgewählt, daß als nächste Base an das 3 '-Ende ein "A" angefügt wird. Der zweite Primer wurde so ausgewählt, daß als nächste Base ein "C" angefügt wird. Die Primer wurden auf dem multiplen Segment-DNA-Synthesizer von EMBL synthetisiert (Ansorge et al, Electrophoresis 13 (1992) 616 - 619) .
Zur Sequenzierung wurde folgendes Reaktionsprotokoll verwendet:
1. Denaturierung und Annealing
5-10 μg doppelsträngige DNA (5-8 kb) wurden mit 2 unmarkierten Primermolekülen (jeweils 2 pmol in einem Gesamtvolumen von 12 μl) vermischt und durch Zugabe von 1 μl 1 mol/Liter NaOH-Lösung und Erhitzen auf 65°C für 3 Minuten denaturiert. Nach einminütigem Abkühlen auf 37°C und kurzer Zentrifugation wurden 1 μl 1 mol/Liter HCl und 2 μl Annealingpuffer (1 mol/Liter Tris/HCl pH 8, 0,1 mol/Liter MgCl2) zugegeben.
2. Markierungsreaktion
Zu dem obigen Ansatz wurden jeweils 1 μl 10 μmol/Liter Fluorescein-15-dATP, 10 μmol/Liter Texasrot-5-dCTP und entweder native T7 DNA-Polymerase (8 U/μl) oder Sequenase (13 U/μl) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min. lang bei 37°C inkubiert.
3. Extension und Termination
Zum Ansatz wurde 1 μl Extensionspuffer (304 mmol/Liter Natriumeitrat, 40 mmol/Liter MnCl2, 324 mmol/Liter Dithiothreitol) gegeben und vermischt. Dann wurde die Lösung in Aliquots aufgeteilt und 4 separaten Extensions/Terminationsmischungen zugesetzt, die aus 3 μl der jeweiligen Terminationslösungen (40 mmol/Liter Tris/HCl pH 7,4, 50 mmol/Liter NaCl, 5 μmol/Liter des jeweiligen ddNTP, jeweils 1 mmol/Liter dATP, dCTP, C7-dGTP und dTTP) und 1 μl DMSO bestanden. Die Reaktion wurde 5 min. lang bei 37°C inkubiert und durch Zugabe von 4 μl Stoplösung (6 mg/ml Dextranblau und 20 mmol/Liter EDTA, pH 7,3 in entionisiertem Formamid) gestoppt. Dann wurden die Proben 4 min. lang bei 85°C denaturiert und auf ein Sequenzgel gegeben.
4. DNA-Sequenzierungsgerät
Der Aufbau des modifizierten DNA-Sequenziergeräts ist ausführlich bei Wiemann et al (Anal. Biochem. 224 (1995), 117-121 beschrieben. Zusätzlich zu dem üblichen Argon- Laser-Detektorsystem wurde in der Sequenzierungsvor¬ richtung ein Helium-Neon-Laser mit einem entsprechenden Detektor angebracht. Der Ar-Laser regt die Fluorescein- markierten Proben an, während der HeNe-Laser zur Anregung von Texasrot markierten DNA-Fragmenten verwendet wird. Beide Laserstrahlen werden mit Hilfe einer einzigen Lichtkopplungsplatte in das Gel geleitet, die zwischen zwei Spacern auf einer Seite des Gels angeordnet ist. Die räumliche Entfernung von 0,7 cm zwischen den Lasern und die Kombination von zwei unterschiedlichen Laser, Detektor- und Filtersystemen mit entsprechenden Fluorophoren stellt sicher, daß kein Überkreuznachweis der Sequenzsignale eintritt.
5. Gelelektrophorese
Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte auf denaturierenden 6,5 % Duracyl (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA) Sequenziergelen. Die Auftrennung erfolgte über eine Distanz von 18,5 cm bei den Texasrot- markierten Fragmenten und 19,2 cm bei den Fluorescein- markierten Fragmenten unter Verwendung von Standard A.L.F. (Pharmacia, Uppsala, Schweden) Glasplatten. Die Sequenzen beider Reaktionen wurden on-line nachgewiesen und in einem Computer gespeichert. Figur 1 zeigt schematisch das Prinzip der simultanen Sequenzierung von Nukleinsäuren. Nach Denaturierung binden zwei Primer an die jeweils komplementären Bereiche der zu sequenzierenden Nukleinsäure-Matrize. Die Matrizen können vom gleichen Strang einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder von verschiedenen Strängen der gleichen doppel¬ strängigen DNA oder von verschiedenen DNA's stammen. Bei der Sequenzierungsreaktion werden zwei unterschiedlich markierte dNTP verwendet. Beim Markierungsschritt der Sequenzierungsreaktion sind nur die beiden markierten Nukleotide Fluorescein-15-dATP und Texasrot-5-dCTP anwesend.
Eine selektive Markierung spezifischer Produkte mit nur einem Farbstoff wird durch Einbau des jeweiligen Nukleo- tids als erste Base direkt stromabwärts des Primermoleküls erreicht. Diese Reaktion ist vergleichbar mit der Minise- -quenzierung (Syvänen et al, Genomics 8 (1990) , 684-692) von Punktmutationen, wo die direkt an den Primer angefügte Base der unterscheidende Faktor ist, ob ein markiertes dNTP eingebaut oder nicht eingebaut wird. Die Auswahl der Primer erfolgt derart, daß die an den Primer direkt anzufügenden Basen unterschiedlich sind, z.B. ein "A" . und ein "C" . Bei diesem Markierungsschritt wird in jeden Primer immer nur das korrekte Nukleotid eingebaut. Nach Einbau des ersten markierten dNTP könnte die Polymerase eine Pause einlegen, da die markierten dNTP nur in einer geringen Konzentration vorliegen. Auch könnte die Polyme¬ rase von der Matrize abfallen und für die Extendierung weiterer Primermoleküle bis zum Einbau der markierten dNTPs zur Verfügung stehen (z.B. bei der Cycle Sequenzie¬ rung) .
Bei der Extensions- und der Terminationsreaktion werden aufgrund eines hohen Überschusses an unmarkierten dNTP keine markierten dNTP mehr eingebaut. Fig. 2 zeigt Sequenzdaten, die bei einer simultanen Sequenzierung an beiden Strängen einer Plasmid-DNA erhalten wurden. Es wurden zwei unmarkierte Walking-Primer verwendet. Fig. 2a zeigt die mit Fluorescein-15-dATP erzeugte Sequenz und Figur 2b die mit Texasrot-5-dCTP erzeugte Sequenz.
Fig. 3 zeigt das Ergebnis eines Tests auf Mehrfacheinbau von markierten dNTP. Es wurden Sequenzierungsprimer ausgewählt, bei denen an den Positionen +1 und +2 zunächst ein "C" und dann ein "A" bzw. zunächst ein "A" und dann ein "C" eingebaut werden. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit nativer T7-DNA-Polymerase durchgeführt. Fig. 3a zeigt die Texasrot-Signale von einem Primer mit einem "C" an Pos. +1 und einem "A" an Pos. +2. Fig. 3b zeigt die Fluorescein-Signale des gleichen Primers. Fig. 3c zeigt Texasrot-Signale von einem Primer mit "A" an Pos. +1 und "C" an Pos. +2. Fig. 3d zeigt Fluorescein-Signale mit dem Primer aus Fig. 3c.
Aus Fig. 3 ist zu erkennen, daß kein Einbau von Fluores- cein-15-dATP an Pos. +2 erfolgte (Fig. 3b) . Fig. 3c zeigt hingegen, daß ein geringer Einbau von Texasrot 5 dCTP an Position +2 stattfand. Da die Markierung in Pos. +2 deutlich schwächer als die Markierung in Pos. +1 ist, sind aber auch die mit dem zweiten Primer erhaltenen Sequenzda¬ ten eindeutig.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf den Einbau einer Markierung innerhalb des Primers. Es werden Sequen- zierprimer ausgewählt, die ein "A" als 3' -terminale Base (Position -1) enthielten und die ein "C" als nächste Base (Position +1) eingebaut werden soll, sowie Primer mit umgekehrter Basenfolge. Die Sequenzierungsreaktionen wurden entweder mit nativer T7-DNA-Polymerase (n-T7) oder Sequenase (Seq) durchgeführt. Fig. 4a zeigt Texasrotsi¬ gnale aus einer Sequenzierung mit Sequenase und einem Primer mit "A" als 3' -terminaler Base und einem "C" an Position +1. Fig. 4b zeigt Fluoresceinsignale aus einer Seqenzierung mit Sequenase und mit dem Primer von Fig. 4a. Fig. 4c zeigt Texasrot-Signale von einer Sequenzierung mit nativer T7-Polymerase und dem Primer von Fig. 4a. Fig. 4d zeigt Fluorescein-Signale aus einer Sequenzierung mit nativer T7-DNA-Polymerase und dem Primer von Fig. 4a. Fig. 4e zeigt Fluoresceinsignale von einer Sequenzierung mit Sequenase und einem Primer, mit "C" als 3' -terminaler Base und einem "A" an Pos. +1. Fig. 4f zeigt Texasrot-Signale aus einer Sequenzierung mit Sequenase und dem Primer von Fig. 4e.
Bei Durchführung der Reaktion mit Sequenase (Version 2.0) und dem Primer mit 3' -terminalem "A" , wurde nur Texasrot- dCTP an Position +1 eingebaut (Fig. 4a) während Fluores- cein dATP an Position -1 nicht in den Primer eingebaut wurde (Fig. 4b) . Mit nativer T7 DNA-Polymerase war hingegen ein geringer Einbau von Fluorescein-dATP inner¬ halb des Primers (Position -1) zu erkennen (Fig. 4d) .
Mit einem "C" als letzter Base des Primers und einem "A" als nachfolgender Base wurde gefunden, daß auch bei Verwendung von Sequenase ein Einbau von Texasrot-dCTP an Position -1 stattfand (Fig. 4f) . Aufgrund der geringen Signalstärke tritt jedoch keine signifikante Störung der Sequenzierungsreaktion ein.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung von Nu¬ kleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markie¬ rungsreaktion, bei der ein markiertes Deoxyribonucleosid¬ triphosphat an ein Nukleinsäure-Primermolekül angefügt wird, und die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungsreaktion in einem einzigen Reaktions¬ gefäß bei gleichzeitiger Anwesenheit von einem oder mehreren Nucleinsäure-Primermolekülen und mindestens zwei markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, und unter Bedingungen erfolgt, bei denen an ein Nukleinsäure-Primermolekül nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird.
Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) mindestens ein Nukleinsäure-Primermolekül an eine zu sequenzierende Nukleinsäure bindet,
b) eine Polymerase und mindestens zwei markierte De¬ oxyribonucleosidtriphosphate zugibt, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschied¬ liche Basen enthalten,
c) das Reaktionsgemisch in einem einzigen Reaktionsgefäß unter solchen Bedingungen inkubiert, daß an ein Primermolekül jeweils nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird, und d) eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen über den sequenzspezifischen Einbau der markierten Deoxyribo¬ nucleosidtriphosphate bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß an ein Nukleinsäure-Primermolekül jeweils nur ein einziges markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat angefügt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Deoxyribonucleosidtriphosphat direkt an das 3'-Ende des Primermoleküls (Position +1) angefügt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichent, daß man zur Anfügung des markierten Deoxyribonucleosid- triphospats an das Primermolekül eine DNA-Polymerase ohne 3' -Exonukleaseaktivität verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine modifizierte T7 DNA-Polymerase verwendet.
7. Verfahren nach einer der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anfügung des markierten Deoxyribonucleosidtriphosphats an das Primermolekül eine DNA-Polymerase mit 3' -Exonucleaseaktivität verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Deoxyribonucleosidtriphosphat durch die sequenziell erfolgenden Exonuclease- und Polymeraseaktivitäten der DNA-Polymerase in einer Austauschreaktion als letzte Base des Primermolekuls (Position -1) eingefügt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Nukleinsäure-Primermoleküle verwendet, die keine Markierungsgruppe tragen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man markierte Nukleinsäure-Primermoleküle verwendet, die eine andere Markierung als die markierten Deoxyribonu¬ cleosidtriphosphate tragen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungsgruppe der Primermoleküle ausgewählt wird aus Fluoreszenzfarbstoffen, Metallen, Biotin und Digoxigenin.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß man die markierten Deoxyribonucleosidtriphosphate in einer Konzentration von 0,05-5 μmol/Liter verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die markierten Deoxyribonuclosidtriphosphate in einer Konzentration von 0,1-2,5 μmol/Liter verwendet.
14. Verfahren zur simultanen Sequenzierung von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Primermoleküle verwendet, die an unterschiedliche Bereiche der zu sequenzierenden Nu¬ kleinsäure binden, wobei die Primermoleküle derart ausgewählt werden, daß die an ihr 3'-Ende als nächste anzufügende Base (Position +1) jeweils unterschiedlich ist und daß für jedes Primermolekül ein markiertes Deoxy¬ ribonucleosidtriphosphat mit einer entsprechenden Base verwendet wird, so daß an jedes Primermolekül jeweils nur ein unterschiedliches markiertes De¬ oxyribonucleosidtriphosphat angefügt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Primermoleküle verwendet, bei denen die an das 3'- Ende eines Primermolekuls als nächste anzufügenden Base (Position +1) nicht gleich mit der an das 3' -Ende eines anderen Primermolekuls als übernächste anzufügenden Base (Position +2) ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Primermoleküle verwendet, bei denen die Base am 3' -Ende eines Primermolekuls (Position -1) nicht gleich mit der an das 3'-Ende eines anderen Primermolekuls als nächste anzufügenden Base (Position +1) ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung der Nukleinsäuresequenz
(dl) das Reaktionsgemisch nach Anfügung des markierten Deoxyribonucleosidtriphosphats aufteilt, jedemAnsatz ein Extensionsreagenz zusetzt, das vier unmarkierte Deoxyribonucleosidtriphosphate und jeweils ein unter¬ schiedliches Kettenabbruchmolekul enthält, und die Ansätze inkubiert,
(d2) die aus (dl) resultierenden Nukleinsäurefragmente nach ihrer Größe auftrennt und
(d3) die Nukleinsäuresequenz über die Markierung der ein- zelnen Fragmente bestimmt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei oder mehrere Nukleinsäuresequenzen gleichzei¬ tig bestimmt.
19. Verfahren nach einer der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sequenzbestimmung in einer automatisierten Sequenziervorrichtung durchführt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Deoxyribonucleosidtriphosphate verwendet, die jeweils unterschiedliche Fluoreszenzmarkie¬ rungsgruppen tragen.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzmarkierungsgruppen ausgewählt werden aus Fluorescein oder Derivaten davon, Texasrot, Rhodamin oder Derivaten davon, Phycoerythrin, CY3 , CY5, CY2, CY7, Coumarin, Infrarot 40, MR 200, Bodipy-Farbstoffen, IRD 40 und 1,N6-etheno-Modifizierungsgruppen.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß man Fluoreszenzmarkierungsgruppen verwendet, die sich gleichzeitig nebeneinander nachweisen lassen.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis zwei oder mehrere unterschiedliche Lasersysteme verwendet.
24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis ein einziges Lasersystem verwendet.
25. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Deoxyribonucleosidtriphosphate in einer Konzen¬ tration von 0,05-5 mmol/Liter eingesetzt werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Deoxyribonucleosidtriphosphate in einer Konzen¬ tration von 0,1-2,5 mmol/Liter eingesetzt werden.
27. Reagenzienkit zur Durchführung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1-26, dadurch gekennzeichnet, daß er neben anderen für die Markierung oder Sequenzierung erforderlichen Bestandteilen mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosidtriphosphate enthält, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten.
28. Verwendung eines Reagenzienkits nach Anspruch 27 zur Se¬ quenzierung von Nukleinsäuren.
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