DE19948260A1 - Fluoreszenz-Multiplex-Sequenzierung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren, die in einer Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktion, insbesondere in einer enzymatischen Sequenzierungsreaktion, unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als Markierung erzeugt wurden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren, die in einer Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktion, insbesondere in einer enzymatischen Sequenzierungsreaktion, unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als Markierung erzeugt wurden.

Zur Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen können grundsätzlich zwei Methoden verwendet werden. Die chemische Abbaumethode (Maxam et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 560-564) und die Kettenabbruchmethode (Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). Bei der heute weit verbreiteten DNA-Sequenzierung durch die enzymatische Kettenabbruchmethode werden ausgehend von einer Nukleinsäurematrize viele verschieden lange markierte Nukleinsäurefragmente durch eine enzymatische Extensions- und Terminationsreaktion hergestellt, bei der ein synthetischer Oligonukleotidprimer mit Hilfe von Polymerase und einer Mischung von Deoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) und Kettenabbruchmolekülen, insbesondere Dideoxyribonukleosidtriphosphaten (ddNTPs) verlängert und terminiert wird.

Dabei wird üblicherweise in jeweils vier Ansätzen eine Mischung der dNTPs zusammen mit jeweils einem ddNTP eingesetzt. Auf diese Weise wird ein statistischer Einbau der Kettenabbruchmoleküle in die wachsenden Nukleinsäureketten erreicht, wobei nach dem Einbau eines Kettenabbruchmoleküls die DNA-Kette aufgrund des Fehlens einer freien 3'- OH-Gruppe nicht mehr weiter verlängert werden kann. Es entsteht daher eine Vielzahl von unterschiedlich langen DNA-Fragmenten, die statistisch gesehen an jeder möglichen Einbaustelle ein Kettenabbruchmolekül enthalten und dort enden. Diese vier Ansätze mit den jeweils aufgrund des Einbaus von Kettenabbruchmolekülen spezifisch an einer Base endenden Fragmenten werden nach ihrer Länge, z. B. durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese, üblicherweise in vier verschiedenen Spuren aufgetrennt und die Sequenz über die Markierung dieser Nukleinsäurefragmente ermittelt.

Heute wird die DNA-Sequenzierung mit automatisierten Systemen durchgeführt, bei denen im allgemeinen eine nichtradioaktive Markierung, insbesondere eine Fluoreszenzmarkierung verwendet wird (Smith et al., Nature 321 (1986), 674-679; Ansorge et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 13 (1986), 315-323). Bei diesen Systemen ist im Wesentlichen die Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, z. B. durch Gelelektrophorese, die Datenaquisition und die Datenauswertung automatisiert. Darüber hinaus ist in einigen Geräten ein automatisiertes Ladesystem verfügbar. Die Probenvorbereitung, insbesondere die eigentliche Sequenzierungsreaktion, wird außerhalb des Systems durchgeführt.

Bei den automatisierten Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren können nichtradioaktive Markierungsgruppen über markierte Primermoleküle, markierte Kettenabbruchmoleküle oder als innere Markierung über markierte dNTPs eingeführt werden. Bei Standardprotokollen werden die Sequenzierungsreaktionen jeweils einzeln in einem Reaktionsgefäß durchgeführt, sodass mit einer Sequenzierungsreaktion immer nur eine einzige Sequenz bestimmt werden kann.

Die simultane Bestimmung von zwei Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung zweier unterschiedlich markierter Primermoleküle für eine Sequenzierungsreaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß wurde von Wiemann et al. (Anal. Biochem. 224 (1995), 117-121) beschrieben. Weitere Verfahren, bei denen Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung zweier unterschiedlicher Fluoreszenzmarkierungen in einem einzigen Reaktionsgefäß, verbunden mit einer gemeinsamen Auftrennung dieser beiden unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen sind in WO 96/23213 und WO 96/34114 beschrieben. Dabei werden zur Auswertung der Sequenzierungsreaktion Nachweissysteme, die zwei verschiedene Laser enthalten, verwendet.

Problematisch bei der gemeinsamen Analyse von mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Sequenzierprodukten in einer einzigen Bahn bzw. Gelspur ist jedoch, dass Fluoreszenzfarbstoffe über einen weiten Wellenlängenbereich hinweg anregbar sind und die Anregungsenergie ebenfalls über einen breiten Bereich wieder abgeben. Darüber hinaus unterliegen die Anregungs- und Emissionsspektren äußeren Bedingungen, die durch Parameter der chemischen Umgebung des Farbstoffs gegeben sind, unter anderem durch den pH-Wert, die Temperatur und die Elektrizitätszahl der Lösung. Aufgrund dieser Abhängigkeit von vielen Parametern wurde daher angenommen, dass eine gleichzeitige quantitative Erfassung von vier oder mehr Farbstoff-Spektren - wie sie für eine genaue Auswertung von Sequenzierungsreaktionen erforderlich ist - nicht durchführbar ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass eine gemeinsame Auswertung von vier oder mehr Sequenzierungsreaktionen, bei denen jeweils unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt wurden, möglich ist.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass mit mindestens vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Produkte von Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen zusammen in einer Bahn nach ihrer Größe aufgetrennt und voneinander unabhängig analysiert werden.

Die Analyse erfolgt durch Auftrennung der Nukleinsäure- Sequenzierungsprodukte nach ihrer Größe bzw. Länge und Auswertung der Markierung. Diese Auftrennung kann nach allen in der Technik bekannten Methoden, z. B. durch verschiedene elektrophoretische (z. B. Polyacrylamidelektrophorese) und chromatographische (z. B. HPLC) Verfahren erfolgen, wobei eine gelelektrophoretische Auftrennung, insbesondere in einem denaturierenden Gel bevorzugt ist. Besonders bevorzugt erfolgt die Auftrennung in ultradünnen Plattengelen von 20 bis 500 µm, vorzugsweise 100 bis 300 µm Dicke (siehe z. B. Stegemann et al., Meth. Mol. Cell. Biol. 2 (1991), 182-184) oder Kapillaren.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine parallele Auswertung von mehreren Sequenzieransätzen, die wiederum jeweils mindestens vier unterschiedlich markierte Sequenzierprodukte enthalten, möglich ist. Diese parallele Auswertung erfolgt vorzugsweise durch gleichzeitige Auftrennung mehrerer Sequenzieransätze in gleichen Bahnen, insbesondere in Gelbahnen, z. B. in Bahnen von Plattengelen. So konnte gezeigt werden, dass mindestens 20, vorzugsweise mindestens 40 und besonders bevorzugt mindestens 80, z. B. 120 oder sogar 192 oder 384 Bahnen parallel ausgewertet werden können. Auf diese Weise können unter Verwendung konventioneller Gele, die eine Auswertung von z. B. 1000-1200 Basen pro Sequenzierungsreaktion erlauben, und einer gleichzeitigen Auftrennung von vier Sequenzierungsreaktionen in einer Bahn, bei Verwendung eines Plattengels mit 192 Spuren, mehr als 100.000 Basen z. B. 155 000 Basen auf einem einzigen Gel bestimmt werden. Im Falle von Gelen mit größerer Spuranzahl, wie vorstehend erwähnt, lassen sich entsprechend mehr Basen bestimmen. So konnten auf Grundlage einer Verdoppelung der Spurdichte (384 Spuren auf einem einzigen Gel) mehr als 200.000 Basen, z. B. 300.000 bis 384.000 Basen, auf einem einzigen Gel bestimmt werden. Die Auswertung der Sequenzierungsreaktionen erfolgt vorzugsweise in einer automatisierten Sequenziervorrichtung, die für jeden Fluoreszenzfarbstoff eine separate Anregungslichtquelle und Detektionseinheit enthält. Vorzugsweise werden Laser als Anregungslichtquellen verwendet. Beispiele für geeignete Laser sind Neodym-YAG-Laser, Argon-Laser, Helium-Neon- Laser oder Halbleiter-Laser (Laser-Dioden).

Um eine möglichst optimale spektrale Trennung und damit eine unabhängige Analyse der mindestens vier Fluoreszenzfarbstoffe auf einer Bahn zu gewährleisten, werden vorzugsweise zusätzliche optische Mittel, z. B. Filter oder/und Blenden verwendet. Auf diese Weise kann für einen Detektor ein "spektrales Restübersprechen", d. h. ein Intensitätsverhältnis des Lichts, das von dem mit dem jeweiligen Detektor nachzuweisenden Fluoreszenzfarbstoff stammt, zu dem Licht der anderen (auf den anderen Detektoren nachzuweisenden) Fluoreszenzfarbstoffe von 1 : ≦ 0,1, besonders bevorzugt 1 : ≦ 0,01 und am meisten bevorzugt 1 : ≦ 0,001 erreicht werden. Vorzugsweise verwendet man zur Erhöhung der Detektorselektivität geeignete Bandpass-Filter, z. B. Absorptions- oder/und Interferenzfilter. Dabei kann ein bezüglich der optischen Achse im wesentlichen senkrecht auf den Detektor einfallendes Licht, welches vorzugsweise eine maximale Abweichung von ± 20°C bezüglich der optischen Achse des Detektors aufweist, erzeugt werden. Dieser im wesentlichen senkrechte Lichteinfall kann jedoch auch durch andere optische Mittel, z. B. Blenden etc. erreicht werden.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Fluoreszenz­ farbstoffe werden so ausgewählt, dass eine voneinander unabhängige Analyse möglich ist. Vorzugsweise werden die Absorptions- oder/und Emissionsmaxima der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt, dass sie unter den Messbedingungen mindestens jeweils 30 nm, vorzugsweise mindestens 50 nm und besonders bevorzugt mindestens 70 nm voneinander entfernt sind.

Beispiele für bevorzugte Farbstoffe sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgelistet.

Tabelle 1

Besonders bevorzugt sind Farbstoffkombinationen, die mindestens vier Farbstoffe, ausgewählt aus Fluorescein, 5-Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed, CY2, CY 5, CY 5.5, IRD 700, IRD 800 und CY7 enthalten. Am meisten bevorzugt sind (a) eine Kombination der Fluoreszenzfarbstoffe Fluorescein, TexasRed, CY 5.5 und IRD 800, (b) eine Kombination von 5- Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed, CY5.5 und IRD 800 gegebenenfalls mit CY2 oder (c) eine Kombination von 5-Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed, CY5.5 und CY7 gegebenenfalls mit CY2 oder/und IRD 800. Die Strukturen dieser Verbindungen sind in Abb. 1 dargestellt.

Die Sequenzierungsreaktionen, die zur Erzeugung von mit mindestens vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Produkten führen, können auf konventionelle Weise, d. h. in separaten Ansätzen durchgeführt werden, wobei man die Ansätze erst kurz vor dem Aufbringen auf die Gelbahn vereinigt oder nacheinander ggf. in zeitlichen Abständen von z. B. 10 bis 20 min auf die Gelbahn aufträgt. Andererseits erlaubt die erfindungsgemäße simultane Auswertung von vier oder mehr Fluoreszenz- Markierungen in einer einzigen Bahn auch mindestens vier unabhängige Sequenzierungsreaktionen in einem einzigen Gefäß durchzuführen und die dabei entstehenden, mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Nukleinsäurefragmente anschließend in einer einzigen Bahn aufzutrennen. Die Markierungsgruppen werden bei dieser Ausführungsform des Verfahrens vorzugsweise über unterschiedlich markierte Primer in die Sequenzierprodukte eingeführt. Als Primer wird dabei eine Nukleinsäure, vorzugsweise eine DNA verwendet, die ausreichend komplementär zu einer im Reaktionsansatz befindlichen zu sequenzierenden Nukleinsäure (Matrize) ist, um mit dieser eine Hybridierungsreaktion unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen einzugehen. Die Länge des Primermoleküls ist vorzugsweise 10 bis 100, besonders bevorzugt 12 bis 50 und am meisten bevorzugt 12 bis 30 Nukleotide. Andererseits kann - bei Anwendung des in WO 96/34114 beschriebenen Verfahrens - auch ein unmarkierter Primer verwendet werden, wenn die Sequenzierungsreaktion unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass an ein Primermolekül jeweils nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonukleosidtriphosphaten angefügt wird.

Bei einer gemeinsamen Durchführung mehrerer Sequenzierungsreaktionen in einem einzigen Gefäß gibt es mehrere bevorzugte Ausführungsformen. Bei einer Quadruplex-Reaktion werden die zu analysierenden Nukleinsäurefragmente in einem einzigen Reaktionsgefäß unter Verwendung von vier unterschiedlichen markierten Primern und vier voneinander unabhängigen DNA-Matrizen erzeugt. Bei der Tandern-Duplex-Reaktion verwendet man ebenfalls vier unterschiedlich markierte Primer, von denen aber jeweils zwei an komplementäre Stränge einer DNA-Matrize binden, d. h. es sind insgesamt zwei DNA-Matrizen vorhanden. Bei der Sequenzlücken- Auffüllreaktion werden vier Primer und eine DNA-Matrize verwendet, wobei die Primer an jeweils an verschiedenen Bereichen auf einem Strang der DNA-Matrize binden. Bei der kompetierenden Tandern-Duplex-Reaktion werden vier Primer und eine DNA-Matrize verwendet, wobei zwei Primer an einen Strang und zwei andere Primer an den Gegenstrang der Matrize binden. Selbstverständlich können derartige Sequenzierprotokolle auch unter Verwendung von mehr als vier Fluoreszenzfarbstoffen in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden, z. B. unter Verwendung von fünf, sechs oder sieben Fluoreszenzfarbstoffen, d. h. mit einer entsprechenden. Anzahl von fluoreszenzmarkierten Primern oder Nukleotiden.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist aber auch eine Auswertung von Sequenzierungsreaktionen auf Grundlage einer basenspezifischen Fluoreszenzfarbstoff-Markierung möglich, bei der die zu einem Klon gehörigen vier spezifischen Sequenzierungsansätze (A, G, C, T) gemeinsam in einer Gel-Elektrophorese-Bahn (Gelspur) aufgetrennt und analysiert werden, wobei für jeden der 4 Sequenzierungsansätze eine unterschiedliche Markierung gewählt wird. Mobilitätsunterschiede, sogenannte "Mobility Shifts", aufgrund dieser unterschiedlichen Markierungen können auf an sich bekannte Weise, z. B. durch eine entsprechende Software kompensiert werden. Auch Unterschiede in den Separationsdistanzen für die einzelnen Ansätze, die durch die versetzte Anordnung der Detektoren bedingt sind, können ohne weiteres kompensiert werden. In der Regel reicht es hierzu aus, die Korrektur der Laufzeiten nach einem linearen Ansatz (Dreisatz in Bezug auf die Separationsdistanzen unter der Annahme konstanter Fragmentausbreitungsgeschwindigkeit längs der Gel-Elektrophorese-Bahnen) vorzunehmen.

Die Sequenzierungsreaktion wird vorzugsweise nach der enzymatischen Methode durchgeführt. Als Enzyme können beispielsweise das Klenow- Fragment der E. coli DNA-Polymerase I, unmodifizierte T7 DNA-Polymerase, modifizierte T7 DNA-Polymerase (Sequenase), T4 DNA-Polymerase oder thermostabile DNA-Polymerasen wie etwa die Taq DNA-Polymerase, die Bst DNA-Polymerase oder Modifikationen davon verwendet werden. Bei Verwendung thermostabiler DNA-Polymerasen kann die Sequenzierung als "Thermocycling"-Reaktion durchgeführt werden. Diese Reaktion entspricht einer normalen Sequenzierreaktion, wird allerdings - wie eine PCR - in mehreren Zyklen durchgeführt. Der Reaktionsansatz enthält die Nukleinsäurematrize, die Primermoleküle, die dNTPs und die jeweils entsprechenden Kettenabbruchmoleküle sowie die thermostabile Polymerase. Auf diese Weise wird pro Zyklus immer eine bestimmte Menge der markierten Nukleinsäurefragmente synthetisiert, wobei in mehreren Zyklen große Mengen an markierten Fragmenten erzeugt werden können.

Die zu sequenzierende Nukleinsäure kann sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form eingesetzt werden. Es werden gute Ergebnisse erhalten, wenn sich die zu sequenzierende Nukleinsäure auf einem doppelsträngigen DNA-Vektor, z. B. einem Plasmid, Cosmid, Bakteriophagen, einem viralen Vektor oder einem künstlichen Chromosom befindet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der neben anderen für die Sequenzierung erforderlichen Bestandteilen mindestens vier unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoff-Markierungen enthält, wobei jede Markierung für die Bestimmung einer unterschiedlichen Sequenz vorgesehen ist. Die Markierungen können in Form von Primern, dNTPs oder Kettenabbruchmolekülen, z. B. ddNTPs, vorliegen. Vorzugsweise werden unterschiedlich markierte Primer verwendet. Darüber hinaus kann der Reagenzienkit zusätzliche Reagenzien, z. B. Enzyme, Pufferlösungen, unmarkierte dNTPs, Primer, Terminatoren etc. enthalten.

Durch die Verwendung von vier oder mehr unterschiedlichen Markierungen in einer einzigen Sequenzierungsreaktion können die Kosten für die Durchführung der Sequenzierungsreaktionen wesentlich reduziert werden. Sowohl die Kosten für Chemikalien als auch für den Arbeitsaufwand werden verringert. Dies ist insbesondere bei Sequenzierungsprojekten im großen Maßstab bedeutend, wie etwa dem "Human Genome" Projekt oder anderen Genomprojekten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung in Verbindung mit den Abbildungen weiter verdeutlichen.

Abb. 1 zeigt die chemische Struktur der Fluoreszenzfarbstoffe FITC, CY 5.5, 5-Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed, IRD 800, CY 5, IRD 700 und CY 2.

Beispiele Beispiel 1 1.1 Material und Methoden Primerdesign und Synthese

Als Primer wurden entweder Standardprimer (UPO, UP-40, RPO, T7, T7term) oder die im folgenden angegebenen spezifischen Primer 1 bis 8 eingesetzt. Als Matrizen wurden für den jeweiligen Primer, passende Vektoren mit zu sequenzierenden Inserts verwendet. Als Markierungen wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Texas- Red (TR), CY 5.5 und IRD 800 verwendet.

Die Sequenzen und Markierungen der verwendeten Primer sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Sequenzierprotokolle

Alle Sequenzierungsreaktionen wurden als Thermocycling-Reaktionen (Murray et al., Nucleic Acids Res. 17 (19891, 8889) unter Verwendung eines Thermocycler (MJ Research, PTC-200) mit dem folgenden Profil durchgeführt: 25 oder 40 Zyklen bei 97°C für 15 sec, 55°C für 30 sec, 68°C für 60 sec bzw. 30 sec.

Die Protokolle für die Reaktionen (Anzahl Primer - Anzahl Matrizen - Anzahl Reaktionsgefäße) waren wie folgt:

Tandern-Duplex-Reaktion (4-2-1)

3 µl DNA-Matrize 1 (1 µg/µl) wurden mit 2 µl p DNA Matrize 2 (0,5 µg/µl) und jeweils 3 µl der Primer FITC-T7term (4 µM), TR-T7, CY 5.5-RPO und IRD 800-UPO (jeweils 2 µM), 2,1 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS (Applied Biosystems) und 1, 9 µl Wasser vermischt. Das Gemisch wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt. 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden in die einzelnen Aliquots gegeben. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 25 Zyklen wurden 1 µl Stopp-Lösung zu jeder Reaktion gegeben und das Volumen während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min um etwa die Hälfte verringert. Dann wurde der Ansatz auf Eis gestellt.

Quadruplex-Reaktion (4-4-1)

2 µl DNA Matrize 1 (0,5 µg/µl) wurden mit 3 µl DNA Matrize 2 (0,3 µg/µl), 5 µl DNA Matrize 3 (0,2 µg/µl), 3 µl DNA Matrize 4 (0,3 µg/µl) und jeweils 1 µl der Primer 1 bis 4 (jeweils 5 µM), 2,4 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS und 1,5 µl DMSO vermischt. Das Gemisch wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt und 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden in die einzelnen Aliquots pipettiert. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 25 Zyklen wurde 1 µl Stopp-Lösung zu jeder Reaktion zugegeben und das Volumen während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min um etwa die Hälfte verringert. Dann wurden die Ansätze auf Eis gestellt.

Sequenzlücken-Auffüllreaktion (4-1-1)

1,5 µl DNA Matrize 1 (0,7 µg/µl) wurden mit jeweils 2 µl der Primer 5 bis 8 (jeweils 2 µM), 2,1 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS, 1,5 µl DMSO und 4,9 µl Wasser vermischt. Die Mischung wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt und 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden in die einzelnen Aliquots pipettiert. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 25 Zyklen wurde 1 µl Stopp-Lösung zu jeder Reaktion gegeben und das Volumen wurde während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min um etwa die Hälfte verringert. Dann wurden die Ansätze auf Eis gestellt.

Kompetierende Tandern-Duplex-Reaktion (4-1-1)

4 µl DNA Matrize 1 (1 µg/µl) wurden mit jeweils 2 µl Primern (FITC-RP, TR- 40, RPO-CY 5.5, IRD 800-40, jeweils 2 µM), 2,0 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS und 3 µl Wasser vermischt. Das Gemisch wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt und 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden jeweils in die einzelnen Aliquots pipettiert. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 40 Zyklen (Extension bei 68°C für 60 sec) wurde 1 µl Stopp-Lösung zu jedem Reaktionsansatz gegeben und das Volumen wurde während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min auf etwa die Hälfte verringert. Dann wurden die Ansätze auf Eis gestellt.

Entsprechende Ergebnisse wurden auch mit den Reagenzien des kommerziellen Cycle-Sequenzierkits der Fa. Applied Biosystems (TaqFS Dye Primer Cycle Sequencing Kit) erzielt.

1.2 Automatisierte DNA-Seauenziervorrichtung

Zur Anregung der vier Fluoreszenzfarbstoffe wurden vier Laser mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen verwendet, die entsprechend dem jeweiligen Absorptionsspektrum des Fluoreszenzfarbstoffs ausgewählt worden waren. Die Lasertypen und -leistungen sind in der folgenden Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3

Die Laser wurden in das Gel über eine einzige Kopplungsplatte an vier unterschiedlichen Positionen mit einem vertikalen Abstand von jeweils 10 mm zwischen den Strahlen eingekoppelt. Eine Feineinstellung der Strahlposition erfolgte individuell für alle vier Laser durch eine motorisierte optische Bühne.

Gemäß den Emissionsspektren der vier Fluoreszenzfarbstoffe wurden optische Bandpassfilter für die optimale Transmission der jeweiligen Emissionslichtspektren und die maximale Unterdrückung von gestreutem Anregungslaserlicht sowie von Infrarot-Hintergrund aufgrund von Glas- und Gelfluoreszenz ausgewählt. Die hohe Selektivität des Transmissionsprofils wurde durch eine Kombination von Absorptions- und Mehrschicht- Interferenzfiltern erreicht (Schott, Mainz, Deutschland).

Das Licht wurde gesammelt und durch ein optisches System, welches ein räumlich kontinuierliches und aufrechtes Bild, hohe Auflösung und eine hohe Numerische Apertur (d. h. minimalen Photonenverlust) ergibt, auf die Detektoren fokussiert. Zum Sammeln und Abbilden von Fluoreszenzlicht wurde ein Gradientenindex-Linsenarray (Nippon Sheet Glass Company, Japan) verwendet.

1.3 Gelelektrophorese

Die Auftrennung der Produkte der Sequenzierreaktionen erfolgte auf 5,0% oder 4,3% Hydrolink Long Ranger denaturierenden Gelen (AT Biochem, Malvern, PA, USA) mit 42% Harnstoff. Lauf- und Gelpuffer waren 1,2 × TBE. 100 ml Gellösung wurden durch Zugabe von 84,5 µl N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 650 µl 10% Ammoniumperoxo­ disulfat (APS) Lösung in Wasser polymerisiert. Die Gele waren 0,30 mm dick. Die Temperatur war 45°C. Die Auftrennung erfolgte über eine Strecke von etwa 50 cm unter Verwendung von 60 cm langen und 34 cm breiten Glasplatten. Die Elektrophorese wurde mit einer Leistung von 60 W und einer Anfangsspannung von etwa 1500 V durchgeführt.

Die Sequenzen aller vier unterschiedlich markierten Reaktionsprodukte mit einer einzigen Gelbahn wurden online detektiert und in einem Computer aufgezeichnet. Die Auswertung erfolgte automatisch nach Ende des Laufs unter Verwendung der Software-Pakete Lanetracker und Geneskipper (EMBL, Schwager et al., Genom Digest 2 (1995) 8-9).

1.4 Gelbeladung

Zur Handhabung der großen Anzahl von Proben und der gleichzeitigen Beladung der 120 Spuren eines Gels wurden Kämme aus porösem Filtermaterial und ein Robotsystem (Beckman Biomek 2000) eingesetzt. Dieses Verfahren ist im einzelnen bei Erfle et al. (Nucleic Acids Res. 25 (1997), 2229-2230) beschrieben und beinhaltet das Beladen der Vertiefungen eines Polyacryl (Plexiglas)-Blocks mit der Probensuspension durch einen Pipettierroboter. Durch Eintauchen der Zähne des Kamms in die Taschen des Plexiglasblocks absorbiert das poröse Material die Probenflüssigkeit durch Kapillarwirkung. Der die Proben enthaltende Kamm wird dann zwischen den Glasplatten direkt oberhalb des geraden Rands des polymerisierten Gels eingesetzt. Bei Anlegen des elektrischen Felds werden die Proben aus dem Kamm und in das Gel gezogen.

Jeweils 0,6 µl der Sequenzierproben wurden mit dieser Technik auf den Kamm geladen. Zusätzlich wurden als Kontrolle vier Standard- Sequenzierungsreaktionen (4-4-4) und zwei Duplex-Sequenzierungs­ reaktionen (4-2-2) in separaten Reaktionsgefäßen durchgeführt, vorgemischt und auf den Kamm geladen oder ohne Vormischen aller vier Reaktionen separat auf dieselben Zähne des Kamms geladen. Dabei wurden identische Ergebnisse wie bei den zuvor beschriebenen Protokollen erhalten.

1.5 Bestimmung der durch die Laser verursachten Zunahme des Fluoreszenzhintergrunds

Um den Einfluss des Laserlichts auf einen nicht zugehörigen Detektor zu bestimmen, wurden die vier Laser jeweils während eines Elektrophoreselaufs an- und abgeschaltet und die damit verbundene Veränderung des Hintergrunds quantitativ gemessen.

1.6 Ergebnisse

Das Fluoreszenz-Quadruplex-Sequenzierverfahren erlaubt die Anwendung unterschiedlicher Strategien. So wurden vier verschiedenen Matrizen in einem Reaktionsgefäß unter Verwendung vier unterschiedlich markierter Primer (4-4-1), zwei verschiedene Matrizen mit einer Tandern-Duplex- Sequenzreaktion in zwei Richtungen und vier verschieden markierten Primern in einem Gefäß (4-2-1) sowie Sequenzlücken-Auffüllungsreaktionen unter Verwendung von vier "Walking-Primern" zum gleichzeitigen Schließen von vier Lücken auf derselben Matrize in einem Gefäß (4-1-1) erfolgreich durchgeführt.

Bei einer Auflösung von 1000 Basen pro Strang, konnten durch die beschriebenen Techniken etwa 4000 Basen pro Sequenzierungsreaktion bestimmt werden. Dies bedeutet, dass 120 Sequenzierungsreaktionen auf einem einzigen Gel aufgetrennt werden können, wodurch 120 kb Information pro Gel erhalten werden.

Die Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe und das Sammeln von Emissions­ licht erfolgte dabei räumlich kontinuierlich über die Breite des Gels und zeitlich kontinuierlich über die gesamte Laufdauer. Die Genauigkeit und die lesbare Sequenzlänge zeigten keinen Unterschied gegenüber Standard- Sequenzierungsreaktionen.

Jeder Farbstoff konnte selektiv angeregt und selektiv detektiert werden. Eine quantitative Messung des Hintergrundlichts zeigte, dass der Einfluss der Laser auf die nicht zugehörigen Detektoren überraschenderweise extrem gering war. So wurde beim IRD 800 Detektor eine maximale Zunahme des Hintergrundsignals von 2,9% aufgrund des zur Anregung von CY 5.5 verwendeten Laserlichts gemessen. Alle anderen Laser/Detektor- Kombinationen zeigten geringere Werte. Diese unbedeutende Signalzunahme bleibt während des Elektrophoreselaufs konstant und wird automatisch vom Meßsignal abgezogen.

Das Fluoreszenz-Quadruplex-Sequenzierverfahren ist auch für innere Markierungen oder Farbstoff-markierte Terminatoren geeignet.

Beispiel 2

Mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll wurden gleichzeitig 192 Sequenzierungsreaktionen (d. h. 48 Sequenzierungsreaktionen an jeweils unabhängigen Klonen) auf einem einzigen Gel aufgetrennt. Dabei konnten 155 kb oder mehr Information pro Gel erhalten werden.

Beispiel 3

Der in Beispiel 1 verwendete Farbstoff FITC wurde durch 5-Carboxy- Rhodamin 6G ersetzt. Statt des Argon-Lasers wurde ein Neodym-YAG-Laser mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm und einer Leistung von 5 bis 10 mW eingesetzt. Auch hier war eine selektive Anregung und selektive Detektion von vier Farbstoffen auf einer Gelbahn möglich.

Beispiel 4

Zusätzlich zu der in Beispiel 3 beschriebenen Farbstoffkombination wurde der Farbstoff CY2 verwendet. Als Anregungslichtquelle diente ein Neodym YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 473 nm und einer Leistung von 5 bis 10 mW.

Es wurde gefunden, daß eine selektive Anregung und selektive Detektion auch bei gleichzeitiger Verwendung von fünf Fluoreszenzfarbstoffen auf einer Gelbahn möglich ist.

Claims (19)

1. Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass mit mindestens vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Produkte von Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen zusammen in einer Bahn nach ihrer Größe aufgetrennt und voneinander unabhängig analysiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennung durch Elektrophorese in einem denaturierenden Gel erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine parallele Auftrennung in mehreren Bahnen, die jeweils mindestens vier unterschiedlich markierte Produkte enthalten, erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse in einer automatisierten Sequenziervorrichtung erfolgt, die für jeden Fluoreszenzfarbstoff eine separate Anregungslichtquelle und Detektionseinheit enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Anregungslichtquellen Laser verwendet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass optische Mittel umfassend Blenden oder/und Filter zur Erhöhung der Trennschärfe eingesetzt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß für eine Detektionseinheit das Intensitätsverhältnis des von dem zur jeweiligen Detektionseinheit zugehörigen Fluoreszenzfarbstoff stammenden Lichts zu dem von einem anderen Fluoreszenzfarbstoff stammenden Licht 1 : 0,2 oder größer ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das auf eine Detektionseinheit auffallende Licht eine Abweichung von maximal ±20° von der optischen Achse der Detektionseinheit aufweist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzfarbstoffe so ausgewählt werden, dass die Absorptionsmaxima unter den Messbedingungen mindestens jeweils 30 nm voneinander entfernt sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsmaxima jeweils mindestens 50 nm voneinander entfernt sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzfarbstoffe so ausgewählt werden, dass die Emissionsmaxima unter den Messbedingungen mindestens jeweils 30 nm voneinander entfernt sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Emissionsmaxima jeweils mindestens 50 nm voneinander entfernt sind.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Fluoreszenzfarbstoff-Kombination

• a) Fluorescein, TexasRed, CY 5.5 und IRD 800
• b) 5-Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed, CY5.5, IRD 800 und gegebenenfalls CY2 oder
• c) 5-Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed, CY5.5, CY7 und gegebenenfalls CY2 oder/und IRD 800 verwendet werden.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zusammen in einer Bahn aufgetrennten Sequenzierprodukte aus einer in einem einzigen Gefäß durchgeführten Sequenzierungsreaktion stammen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens vier unterschiedlich markierte Primer für die Sequenzierungsreaktion verwendet werden.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzierungsreaktion als Quadruplex-Reaktion, als Tandern-Duplex-Reaktion, als Sequenzlücken-Auffüllreaktion oder als kompetierende Tandern-Duplex-Reaktion durchgeführt wird.

17. Reagenzienkit zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens vier unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoff- Markierungen enthält, wobei jede Markierung für die Bestimmung einer unterschiedlichen Sequenz vorgesehen ist.

18. Reagenzienkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens vier verschiedene Primer enthält, die jeweils eine unterschiedliche Markierung tragen.

19. Verwendung des Reagenzienkits nach Anspruch 17 und 18 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.