Durch den Einsatz von spezifischen DNA-Proben,
RNA-Proben oder PNA-Proben, d.h. von Einzelstrangmolekülketten,
die entsprechende komplementäre
Targetsequenzen im Genom besitzen, ist es möglich, in Zellkernen und auf
Chromosomen kleine (Sub)strukturen (=Targets) zu markieren bzw.
DNA-Sequenzen auf DNA-Chips (Genchips) zu erkennen. Üblicherweise
werden in diese Proben Reportermoleküle eingebunden, die eine hohe
Affinität zu
entsprechenden Fluorochromkomplexen besitzen. Es können aber
auch bestimmte Fluorochromkomplexe direkt in die Marker eingebaut
werden, ggf. über
einen Linker geeigneter Länge.
Im folgenden werden beide erfindungsgemäßen Fluroreszenz-Markierungsverfahren
auch als Markierung bezeichnet. Das zur Verfügung stehende Farbspektrum der
Fluorochrome reicht über
das sichtbare Spektrum bis ins infrarote. Neben dem Emissions-Spektrum
kann auch die Lebensdauer der Fluoreszenzemission als Parameter
zur Detektion des Markers genutzt werden. Die Eigenschaften Absorptionsspektrum,
Emissionsspektrum und Fluoreszenzlebensdauer werden im folgenden
als spektrale Signatur bezeichnet. Die erfindungsgemäße Detektion
der durch solche Fluoreszenzmarker markierten Target-Regionen erfolgt
beispielsweise durch Fernfeld-Mikroskopie (z.B. Epifluoreszenzmikroskopie,
konfokale Laser-Scanning Mikroskopie, Wellenfeldmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsmikroskopie,
mit oder ohne axialtomographische Ergänzungstechniken). Insbesondere
zur Erfassung von 3D-Genom-Mikrostrukturen
können
höchstauflösende Präzisionsmikroskopietechniken
eingesetzt werden.
Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren durch
Hybridisierung mit komplementären
fluoreszenzmarkierten Nukleotidsequenzen werden in der Literatur
als Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) bezeichnet. Die meisten
bei FISH bisher eingesetzten Hybridisierungsprotokolle gehen davon aus,
daß als
Voraussetzung zu diesem Prozeß nicht nur
die Proben-DNA, sondern auch die Target-DNA, die üblicherweise
in Duplex Form vorliegt, in eine einzelsträngige Form überführt werden muß (Denaturierung).
Diese Denaturierung kann entweder chemisch (z.B. durch Verwendung
einer entsprechend hohen Konzentration des Lösungsmittels Formamid oder anderer
chaotroper Substanzen), enzymatisch und/oder thermisch (z.B. durch
Aufheizen auf Temperaturen über
70°C) erfolgen.
Die anschließende Renaturierung
führt dann
zur Bildung hybrider Doppelstränge
aus Proben- und Target-DNA (Standard-FISH).
Diese Betrachtung des Hybridisierungsmechanismus
geht davon aus, daß natürliche,
in der Target-DNA vorhandene einzelsträngige Abschnitte für die in
situ Hybridisierung nicht ausreichend sind. Dies kann für eine Reihe
von DNA-Proben als Ganzes zutreffen. So wurde z.B. festgestellt,
daß bestimmte
DNA-Proben nur dann an chromosomale Targets hybridisieren, wenn
eine Denaturierung des Targets und der Probe vorgenommen wurde.
Es ist jedoch bekannt, daß die Bindungsfähigkeit
einzelsträngiger
DNA-Proben stark von der DNA-Sequenz abhängt. Aufgrund von Untersuchungen
an synthetischen Nukleinsäuren
konnte festgestellt werden, daß einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen
mit doppelsträngigen
Duplex-Nukleinsäuresequenzen
eine dreisträngige
Tripel-Formation bilden können,
wobei im Falle von Polypyrimidin- bzw. Polypurinnukleinsäuresequenzen
sich die Basen in einer Triplex-Struktur binden können. Auch
gewisse gemischte Sequenzen aus Purinbasen oder Pyrimidinbasen sind
bei der Tripel-Bildung zulässig.
Ferner ist bekannt, daß einzelsträngige Proben,
in denen das Zucker-Phosphat-Rückgrat
durch eine Polyamidkette (PNA) ersetzt wurde, sich in einer sequenzspezifischen
Weise mit doppelsträngiger DNA
zu einer neuen dreisträngigen
Formation verbinden können
(PNA-DNA). Dies wurde jüngst
zur Visualisierung bestimmter repetitiver Sequenzen durch FISH experimentell
realisiert (PNA-FISH). Wegen der in diesem Falle erfolgten Elimination
der elektrostatischen Abstoßungskräfte zwischen
der Target-DNA und der Proben-PNA ist dieses Verfahren mit weitgehend
beliebigen Basensequenzen sowie sogar in Gegenwart hoher Konzentrationen
an Formamid durchführbar;
es hat jedoch den Nachteil eines erheblichen Aufwandes bei der Synthese
der PNA-Proben.
Auf der Basis nicht-enzymatischer
in situ Hybridisierungsverfahren, die zusätzlich auf denaturierende chemische
Agenzien verzichten (Fast-FISH), konnte gezeigt werden, daß für bestimmte
hochrepetitive DNA-Proben die thermisch denaturierte, einzelsträngige DNA-Probe
auch an das nicht denaturierte Target bei Temperaturen unter 40°C bindet;
dies kann so interpretiert werden, daß sich im Markierungsbereich
dreisträngige
Formationen aus einzelsträngiger
Proben-DNA und doppelsträngiger
Target-DNA bilden. Eine andere Möglichkeit
der Ausbildung von Tripelformationen aus Proben- und Target-DNA besteht in der
gehäuften
Bindung doppelsträngiger
Proben-DNA an einzelsträngige
Target-DNA in der Nachbarschaft natürlich vorkommender Tripel-Formationen
der chromosomalen DNA. Derartige Hybridisierungsbedingungen, insbesondere
die spezifische Anlagerung markierter, modifizierter, einzelsträngiger DNA-Sequenzen
unter physiologischen Temperatur- und Pufferbedingungen zur Visualisierung
der Anlagerungsorte, stellen die Voraussetzung für FISH mit Nukleinsäureproben
in vitalen Zellen bzw. von nicht denaturierten DNA-Sequenzen tragenden
Mikrotargets dar (Vital-FISH).
Die in vivo Fluoreszenz-Markierung
entsprechender Loci im Zellkern ist bisher gelungen für: Nukleoli
mithilfe einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung von RNA-Proben
(RNA-FISH); für Zentromerregionen
mit einem Zentromerspezifischen Protein, das mit Hilfe eines gekoppelten "Green Fluoresceing
Protein" (GFP) visualisiert
wurde; für
gewisse "Homogeneously
Staining Regions" (HSR)
mit einem Lac Operon-spezifischen GFP-gekoppelten Protein; und für ganze
Chromosomenterritorien unter Ausnutzung von Replikationsmechanismen.
Nachteil dieser Verfahren ist, daß sie relativ auffwendig sind
und damit für
Routineanwendungen nicht in Frage kommen.
Wesentlich einfachere und schnellere
Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Nukleinsäuresequenzen stellen die verschiedenen
Fluoreszenz-in-situ Hybridisierungsverfahren (FISH) dar. Keines
der bekannten FISH-Verfahren (Standard-FISH, Fast-FISH, PNA-FISH, RNA-FISH)
erlaubte jedoch, mithilfe von DNA-Proben außerhalb von chromosomalen Subregionen
mit hochrepetitiver-DNA vital, in vivo bzw. unter physiologischen
Bedingungen (= Verzicht auf Denaturierung) eine Fluoreszenzmarkierung
durchzuführen.
und gleichzeitig kleine und kleinste Genomabschnitte spezifisch
zu markieren.
Analog ist bisher in der Mikrosensorik
kein DNA-in situ Hybridisierungsverfahren bekannt, das auf eine
der Targetdenaturierung vergleichbare Prozedur verzichtet.
Die derzeit verfügbaren Techniken zur Visualisierung,
insbesondere durch Fluoreszenzmarker (FISH), von Target DNA Sequenzen
auf Chromosomen, in Zellkernen und auf DNA-Chips erfordern besonders
dann, wenn eine hohe Spezifität
(Stringenz) der Markierung gefordert ist, eine umfangreiche Behandlung
des Targets. Bei den meisten heute angewandten FISH-Techniken ist
dies insbesondere die Denaturierung und die daraus folgenden notwendigen
nachfolgenden präparativen
Schritte. So erfordert der Einsatz chaotroper chemischer Agenzien, wie
z.B. das üblicherweise
in den meisten in situ Hybridisierungsprotokollen verwendete Lösungsmittel Formamid,
meist relativ arbeitsaufwendige Waschprozeduren nach erfolgter in
situ Hybridisierung, um eine stringente Probenbindung zu gewährleisten. Aber
auch eine rein physikalische, d.h. thermische, Denaturierung des
Targets, bei der auf derartige extensive Waschprozeduren verzichtet
werden kann, erfordert immer noch mehrere Behandlungsschritte des
Targets. Die verwendeten Temperaturen führen aufgrund der Denaturierung
von chromosomalen Proteinen zu einer Veränderung der Tertiärstruktur des
Chromatins und beeinflussen die Konformation der chromosomalen DNA,
teilweise in erheblicher Weise. Bei hochempfindlichem Untersuchungsmaterial
für die
klinische Diagnostik in der Genompathologie und für die Erforschung
der dreidimensionalen (3D) Genomstruktur ist jedoch größte Materialschonung
erforderlich, um nicht etwa für
die Untersuchung relevante 3D-Strukturen zu verändern oder zu zerstören. Insgesamt
ist selbst bei Verwendung der mittlerweile kommerziell erhältlichen "Ready to use" Probenkits ein erheblicher
Arbeitsaufwand sowie eine, insbesondere in der klinischen Diagnostik,
lange Erfahrung mit FISH-Methoden erforderlich, um die korrekte
FISH-Markierung von Patientenmaterial zu ermöglichen.
Aus diesen Gründen ist es sowohl für die Grundlagenforschung
(= Erforschung nativer 3D-Strukturen des Genoms und ihrer funktionalen Bedeutung,
z.B. in der Genompathologie) als auch für die klinische Diagnostik
von großer
Bedeutung, daß das
Targetmaterial möglichst
ohne oder mit nur geringer Vorbehandlung markierbar und analysierbar ist.
Dies bedeutet, das Target in vivo oder in einem dein in vivo Zustand
nahe kommenden (vitalen) Zustand zu halten. Alle bisher bekannten
in situ Hybridisierungsverfahren, bei denen von einem vital konservierten
Target gesprochen werden kann, erlauben jedoch keine DNA-DNA FISH
beliebiger spezifischer, kleiner Genomabschnitte, wie z.B. einzelner
Gene oder tumorrelevanter Genomloci (genannt seien hier als ein
Beispiel die im Zusammenhang mit bestimmten Leukämien relevanten Loci abl-bcr
auf den Chromosomen 9 und 22).
Wie in der Mikroskopie ist auch in
der Sensorik die online Detektion von spezifischen doppelsträngigen DNA-Sequenzen
mithilfe von DNA-Proben bisher ohne eine Vorbehandlung, wie z.B.
einer Denaturierung, nicht möglich.
Der Einsatz entsprechender Chemikalien und/oder die thermischen
Behandlung können
jedoch den Sensor übermäßig belasten
und beispielsweise die Empfindlichkeit im Routinebetrieb negativ
beeinflussen. Auch bei denjenigen Anwendungen in der Sensorik, wo
eine Denaturierung keine negativen Auswirkungen auf Belastbarkeit
und Empfindlichkeit hat, ist der mit einer Denaturierung verbundene
Aufwand zu berücksichtigen.
Gleiches gilt auch für
Untersuchungen an FISH-markierten Zellpräparaten, in denen die DNA durch
spezielle Verfahren, wie z.B. Halopräparation oder Comet-Assay,
freigelegt wurde.
Aus der
US 5,176,996 ist es bekannt, daß definierte
Oligonukleotide synthetisiert werden können, die spezifisch an ausgewählte Duplex-DNA-Abschnitte
binden, wobei dort eine Tripelhelix entsteht. Aufgrund der spezifischen
Bindung sind diese Oligonukleotide dazu vorgesehen, spezifische
Duplex-DNA-Abschnitte im Genom, insbesondere bestimmte Gene, zu
blockieren und damit die Proteinsynthese gezielt zu beeinflussen.
Für jeden
interessierenden Genomabschnitt wird immer nur ein einzelnes Oligonukleotid
synthetisiert. Zur Herstellung dieser Oligonukleotide wird der interessierende
Duplex-DNA-Abschnitt nach purinreichen oder pyrimidinreichen Teilsequenzen
(Gehalt an Purin- bzw. Pyrimidin-Nukleotide ≥ 65%) mit einer Länge von ≥ 20 Nukleotiden
abgesucht. Zu diesen Teilsequenzen werden komplementäre Oligonukleotide
aus den Nukleotiden G und T und eventuelle auch X und I sowie halogenierten
Derivaten davon synthetisiert.
Aus der Veröffentlichung von Hardenbol
und van Dyke, 1996, ist das Kombinationsverfahren "Restrictions Endonuclease
Protection Selection and Amplification" (REPSA) bekannt, das dazu geeignet ist,
1.) Tripelhelix-Formationen zwischen Duplex-DNA und purinreichen
G/T-reichen Oligonukleotiden
zu identifizieren, 2.) passende Target-Sequenzen in der Duplex-DNA
zu identifizieren, die mit purinreichen G/T-reichen Oligonukleotiden
eine Tripelhelix bilden, und 3.) passende Oligonukleotid-Sequenzen zu
identifizieren, die mit einer interessierenden Duplex-DNA eine Tripelhelix
bilden. Der Nachweis der Tipelhelix-Formation erfolgt anhand einer
Spaltungsreaktion mit Hilfe des Enzyms IIS-Restriktionsendonuklease.
Bei diesem Verfahren werden immer nur einzelne Oligonukleotide an
bestimmte Genomabschnitte angebunden.
Die WO 95/03428 beschreibt, daß spezielle, einzelsträngige fluoreszenzmarkierte
Oligonukleotide in lebende Zellen eingebracht und in vivo an RNA oder
DNA innerhalb dieser Zellen hybridisiert werden können. Die
Oligonukleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß ihre Nukleotidsequenz 10-50
Nukleotide umfaßt
und komplementär
zu einem Abschnitt der interessierenden DNA oder RNA innerhalb der
betreffenden lebenden Zellen ist. Anhand der anhybridisierten, fluoreszenzmarkierten
Oligonukleotide werden die Zellen, die die interessierende DNA oder RNA
bzw. die interessierenden DNA- oder RNA-Abschnitte (DNA- oder RNA-Targets)
enthalten, detektiert. Dieses Verfahren erlaubt jedoch nur die Feststellung,
ob bzw. daß eine
Hybridisierung stattgefunden hat und daß sich der interessierende
DNA- oder RNA-Abschnitt innerhalb der untersuchten Zelle befindet,
nicht dagegen die Lokalisierung bestimmter chromosomaler, doppelsträngiger DNA-Abschnite.
Die WO 92/11390 beschreibt ein Verfahren zur
quantitativen in-vitro-Detektion von vorbekannten distinkten Nukleotidsequenzen,
insbesondere PCR-Produkten, durch Tripelhelix-Bildung mit einem Oligonukleotid, das
wenigstens aus 15 überwiegend Purin-
oder überwiegend
Pyrimidin-Nukleotiden besteht. Das Oligonukleotid kann mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert sein, so daß die Detektion der gebildeten
Tripelhelizes anhand der emittierten Fluoreszenzsignale erfolgen
kann. Die Intensität
des fluoreszenzmikroskopisch detektierbaren Fluoreszenzsignals ist
ein direkt korrelierendes Maß für die Menge an
gebildeten Tripelhelizes und damit für die Menge der vorhandenen
vorbekannten, distinkten Nukleotidsequenzen.
Eine Lokalisierung der vorbekannten,
distinkten Nukleotidsequenz im chromosomalen Genom ist mit diesem
Verfahren nicht möglich,
denn es wird stets nur eine bestimmte Oligonukleotidsequenz für die Tripelhelixbildung
gewählt,
so daß sich
nur ein einziges Oligonukleotid-Molekül an die betreffende Nukleotidsequenz
im Genom anlagern und eine Tripelhelix bilden könnte. Das Fluoreszenzsignal
dieses einzige Oligonukleotid-Molekül wäre fluoreszenzmikroskopisch
nicht detektierbar.
Aus der WO 93/18187 ist ein spezifischer
in situ oder in vivo Nachweis von 10-20 bp langen Genomabschnitten
(Targetsequenzen) chromosomaler DNA durch Tripelhelix-Bildung mit
Oligonukleotiden bekannt. Die betreffenden Genomabschnitten sind dadurch
charakterisiert, daß der
DNA-Doppelstrang dort aus zwei Einzelsträngen aufgebaut ist, von denen
einer purinreich, idealerweise ein Homopurinstrang ist. Die Oligonukleotide
sind dadurch charakterisiert, daß sie zur parallelen oder antiparallelen
Bindung an einen purinreichen bzw. Homopurin-DNA-Einzelstrang geeignet
sind und das Purin-Nukleotid Nebularin enthalten, das an ein Cytosin (Pyrimidin-Nukleotid)
innerhalb des purinreichen bzw. Homopurin-DNA-Einzelstrangs binden kann. Mit Hilfe
des Nebularin werden CG-Basenpaar in dem zu analysierenden Genomabschnitt
nachgewiesen. Die Oligonukleotidanbindung (Tripel-Helix-Formation) ist dazu
vorgesehen, therapeutische oder diagnostische Hilfsmoleküle, die
an die Oligonukleotide gekoppelt wurden, an die betreffenden Genomabschnitte
anzubinden.
Ein (fluoreszenz-)mikroskopischer
Nachweis ist mit diesen Oligonukleotiden in der Praxis nicht möglich, weil
an den betreffenden Genomabschnitten nur die Anbindung von einem
bestimmten Oligonukleotid vorgesehen ist, und selbst wenn dieses
Oligonukleotid mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert wären, würde die
Fluoreszenz diese einzigen Oligonukleotides kein distinktes (Fuoreszenz-)
mikroskopisch detektierbares Signal abgeben.
Die Aufgabe der Erfindung besteht
darin, spezielle DNA-Probengemische, die geeignet sind zu einer
in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen,
sowie ein Verfahren zur in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden
Bedingungen unter Verwendung der speziellen DNA-Probengemische zur
Verfügung
zu stellen. Weiterhin besteht die Aufgabe in der Etablierung eines
Verfahrens zur Herstellung von speziellen DNA-Probengemischen für die spezifische
in situ Hybridisierung.
Diese Aufgabe wird gelöst durch
Probengemische gemäß Anspruch
1, sowie durch Verfahren gemäß der Ansprüche 3 und
10.
Entsprechende Probengemische kann
man dadurch gewinnen, daß man
aus der DNA-Sequenz der
zu markierenden DNA-Targets mittels Computeranalyse oder experimentell
mithilfe geeignet hergestellter DNA-Chips Polypurin und/oder Polypyrimidin Subsequenzen
bestimmt, die jeweils eine Mindestzahl an Nukleotiden abdecken (Beispiel
für das
Zellkerngenom: 1). Von
diesen Subsequenzen wird ein DNA-Probengemisch hergestellt, das
bevorzugt, d.h. mit hohem Fluoreszenzsignal und/oder mit spektraler
Kolokalisation, im Bereich der zu markierenden Target-DNA Region
bindet (2) unter Bildung
von Tripelsträngen.
Eingesetzt werden kann dieses Verfahren beispielsweise zur Vital-Markierung
oder zur in vivo Markierung von Mikrogenomstrukturen in Zellkernen
für die
Analyse der 3D-Genomorganisation und 3D-Genompathologie mittels
multispektraler Präzisionsmikroskopie.
Aufgrund dessen, daß auf eine
Target-Denaturierung
sowie auf alle präparativen
Sekundärschritte
verzichtet werden kann, ist das Verfahren nicht nur für die Grundlagenforschung
in Biologie und Medizin, sondern insbesondere auch für vielfältige Aspekte
der klinischen Forschung und der Routinediagnostik von Bedeutung.
Das Verfahren eignet sich für
die Gewinnung spezifischer Oligonukleotide und besitzt über die
oben genannten Anwendungsbeispiele hinaus verschiedene weitere Einsatzgebiete,
insbesondere im Bereich der Mikrosensorik, um z.B. DNA-Lösungen auf
das Vorhandensein bestimmter doppelsträngiger DNA-Segenzen zu testen (3). Weiterhin sind diese DNA-Probengemische beispielsweise
anwendbar in der Fluoreszenzmikroskopie, in der Slit-Scan Flußfluorometrie,
sowie in der Sensorik einzelner Mikrotargets. Dabei kann auf die übliche Vorbehandlung
des Targets, d.h. insbesondere auf eine chemische, enzymatische
und/oder thermische Denaturierung, verzichtet werden. Das bedeutet,
daß erfindungsgemäß etablierte
DNA-Probengemische auch für
eine in vivo in situ Hybridisierung geeignet sein können. Insbesondere
sollen die erfindungsgemäß etablierten
DNA-Probengemische die spezifische Markierung natürlich vorkommender, doppelsträngiger DNA-Targetsequenzen
ermöglichen
und so auch einzelne kleine Abschnitte des Genoms einer optischen
Analyse, z.B. durch hoch- und höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie
oder mittels eines DNA-Chips, zugänglich machen.
Durch die Erforschung der DNA-Sequenz des
menschlichen Genoms stehen heute umfangreiche DNA-Sequenzbibliotheken
auf entsprechenden Computern zur Verfügung. Da sich solche Bibliotheken
auch für
andere Spezies im Aufbau befinden, ist eine grundsätzliche
Beschränkung
auf das Humangenom nicht erforderlich. Dies ist von erheblichem, auch
klinischem Interesse, z.B. für
die vereinfachte Mikrosensorik von DNA-Sequenzen von Krankheitserregern.
Eigene Untersuchungen haben gezeigt,
daß Homo-Purin
bzw. Homo-Pyrimidinsequenzen wesentlich häufiger auftreten als bisher
angenommen. Dies macht derartige Sequenzen für die Nukleinsäurediagnostik
interessant, zumal derartige Sequenzen besonders zur Bildung von
Triple Strukturen geeignet sind, das heißt, daß sich entsprechende einzelsträngige Proben-Nukleinsäuren an
doppelsträngige
Target-Nukleinsäuren
sequenzspezifisch anlagern. Allerdings sind einzelne Oligonukleotide
mit Längen zwischen
15 und 30 Basenpaaren für
die spezifische Markierung von Targetnukleinsäuren wenig geeignet, da sehr
ausgeprägte
Hintergrundsignale die Detektion erschweren. Erfindungsgemäß werden
daher für die
in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen Probengemische
verwendet, die mindestens zwei Homopurin- und/oder Homopyridin – Oligonukleotide
enthalten. Diese Proben-Oligonukleotide sind mit gleichen oder unterschiedlichen
Fluoreszenzmarkern versehen. Das in situ Hybridisierungsverfahren
mit diesen Probengemischen wird bevorzugt bei Temperaturen zwischen
0°C und
50°C, besonders
bevorzugt zwischen 20°C
und 37°C, durchgeführt. Um
mit zwei oder mehreren Proben-Oligonukleotiden ein einzelnes Signal
zu erhalten, dürfen
die zu den Proben komplementären
Sequenzen der Targetnukleinsäuren
bestimmte Abstände
nicht überschreiten,
die definiert sind durch das Auflösungsvermögen des verwendeten Detektionssystems.
Zur Herstellung erfindungsgemäßer Proben-Oligonukleotide
wird beispielsweise in einer DNA-Sequenzbibliothek eine zu markierende,
zusammenhängende
DNA-Sequenz der Gesamtlänge L
ausgewählt.
L bedeutet hierbei eine lineare geometrische Länge eines DNA-Fadens der gesamten
Basensequenz (1 kbp läßt sich
zu ca. L = 350 nm abschätzen).
Diese Länge
L kann im unbehandelten (ggf. vitalen) Zellkern einer chromosomalen
Subregion entsprechen, deren mittlerer Durchmesser dT kleiner
oder gleich der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven
Punktbildfunktion (auflösungsäquivalente
Größe) des
für die
anschließende
Analyse der Markierungsregion bzw. Zelle verwendeten Optischen Systems
ist. DNA-Sequenzen aus DNA-Sequenzbibliotheken
enthalten häufiger
kleine Sequenzlücken
bis zu einer Länge
von etwa l kbp. Derartige Lücken
sind für
das erfindungsgemäße Verfahren
unschädlich
und können
außer
Betracht bleiben.
Die DNA-Sequenz der Länge L wird
nach zusammenhängenden
Homopurin und/oder Homopyrimidin Teilsequenzen von N ≥ 15 Nukleotiden
abgesucht. Diese Teilsequenzen werden synthetisiert und/oder amplifiziert.
Während
dieses Prozesses oder danach werden diese Teilsequenzen mit beliebigen
Fluoreszenzfarbstoffen geeigneter spektraler Signatur fluorochromiert.
Beim gegenwärtigen
Stand der Technik sind mindestens 10 Fluorochrome mit verschiedener
spektraler Signatur bekannt, die in erfindungsgemäßer Weise
an DNA-Sequenzen gekoppelt werden können. Es können alle Teilsequenzen mit
gleicher spektraler Signatur oder einzelne oder mehrere Teilsequenzen
mit unterschiedlicher spektraler Signatur markiert werden.
Aus allen oder einer geeigneten Teilmenge (z.B.
nur repetitive oder nur singuläre)
der so vorbereiteten Teilseqenzen der Gesamtmarkierungsregion T
der Länge
L stellt man ein Gemisch einzelsträngiger DNA-Proben her, wobei
alle darin vorkommenden Teilsequenzen in einem definierten Mischungsverhältnis vorliegen
können.
Die verschiedenen Teilsequenzen des Probengemisches können mit
derselben oder mit verschiedenen spektralen Signaturen versehen
sein. Anschließend
wird das Probengemisch mit dein zu markierenden Zelltarget bzw.
der zu analysierenden DNA-Sequenz zusammengebracht. Im Falle der
in vivo Markierung kann das Probengemisch mittels bekannter Verfahren,
z.B. durch Mikroinjektion oder durch membranpermeable Transportverfahren,
in die Zellen eingebracht werden. Schließlich läßt man das Probengemisch unter
definierten, beispielsweise physiologischen oder nahezu physiologischen
Reaktionsbedingungen an die zu markierenden DNA-Targetsequenz längs der
Länge L
binden (1). Da die Länge L oder
beliebige zusammenhängende
Teile von L, die beispielsweise mit DNA-Teilsequenzen abgedeckt
werden, die mit Farbstoffen verschiedener spektraler Signatur markiert sind,
in ihrem mittleren Durchmesser dT im Genom kleiner
als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der auflösungsäquivalenten
Punktbildfunktion des verwendeten optischen Analysesystems, z.B
eines Mikroskops (im Folgenden abgekürzt als FWHM) sind, führt die
Markierung mit dem oben beschriebenen Probengemisch zu einer scheinbar
optisch zusammenhängenden, „punktförmigen" Markierung (2); d.h. alle die von den
einzelnen, Fluorochrom-markierten Nukleotidsequenzen derselben spektralen
Signatur emittierten Einzelintensitäten addieren sich im Zentrum
des Beugungsbildes zu einer Gesamtintensität dieser spektralen Signatur.
Das Mischungsverhältnis der am Markierungsprobengemisch
beteiligten Teilsequenzen kann z.B. 1:1 betragen; andere Mischungsverhältnisse sind
ausdrücklich
zugelassen. Ferner können
die Teilsequenzen mit Fluorochromen derselben spektralen Signatur
oder mit Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur markiert
sein. Beispielsweise kann die Detektion einer bestimmten Targetsequenz T
der Länge
L dadurch erfolgen, daß a)
alle Teilsequenzen mit Fluorochromen derselben spektralen Signatur
S1 markiert werden; oder daß b) ein
Teil der Sequenzen mit einer spektralen Signatur S1 und
ein anderer Teil mit einer spektralen Signatur S2 bzw. weitere
Teile mit spektralen Signaturen Sn markiert werden;
oder daß c)
eine Kombination von a) und b) durchgeführt wird.
In Fall a) erfolgt die Diskriminierung
der Bindungsstelle an die Targetsequenz von nicht spezifisch gebundenen
Teilsequenzen durch die erhöhte Intensität des Fluoreszenzsignals:
Da laut Voraussetzung der Durchmesser dT der
Targetregion kleiner ist als die FWHM, addieren sich die Intensitätsbeiträge der Fluoreszenzemission
der spezifisch gebundenen Teilsequenzen, während die nicht spezifisch
gebundenen Teilsequenzen einer zufälligen räumlichen Verteilung im Objekt
unterliegen, deren mittlerer Abstand bei geeigneten Bedingungen
größer ist
als die FWHM. Als Konsequenz ist die Intensität dieser vereinzelten Fluoreszenzsignale
(„Hintergrund") erheblich geringer.
Sind beispielsweise 10 Teilsequenzen spezifisch an das Target gebunden
und die übrigen Teilsequenzen
im Präparat
zufällig
verteilt, dann kann der Ort des Targets aufgrund seines ca. 10mal so
großen
Fluoreszenzsignals identifiziert werden.
In Fall b) erfolgt die Identifizierung
der spezifischen Bindungsstelle an das Target T aufgrund der Kolokalisation
von Fluoreszenzsignalen unterschiedlicher spektraler Signatur. Beispielsweise
enthalte das Target lediglich 3 Bindungsstellen für Teilsequenzen
t1, t2, t3, die jeweils mit den spektralen Signaturen S1, S2 und S3 markiert wurden. In diesem Falle wird sich
die Intensität
der einzelnen von t1, t2 und
t3 detektierten Fluoreszenzsignale am Ort
des Targets nicht von der Intensität der „Hintergrundssignale" nichtgebundener
Probenmoleküle
unterscheiden. Der Ort des Targets ist jedoch bestimmt durch das
gleichzeitige Auftreten von Fluoreszenzsignalen mit den spektralen
Signaturen S1, S2 und
S3 an dem Targetort nach Korrektur der ggf.
auftretenden chromatischen Verschiebungen ( „spektrale Kolokalisation").
Fall c) ist eine Kombination der
beiden Verfahrensbeispiele a) und b): Die Detektion des Ortes von
T aufgrund erhöhten
Fluoreszenzsignals von Fluorochromen einer bestimmten spektralen
Signatur und aufgrund von spektraler Kolokalisation von zwei oder
mehr spektralen Signaturen ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
In diesem Falle wird die Sicherheit der eindeutigen Detektion des
gewünschten
Targetortes besonders groß.
Eine derartige erhöhte
Sicherheit der Zuordung kann beispielsweise bei der Detektion von
tumorrelevanten Targetsequenzen in der klinischen Pathologie von
großer
Bedeutung sein.
Zwei verschiedene Targetsequenzen
T1, T2 mit den jeweiligen
Längen
L1, L2 können beispielsweise
wie folgt unterschieden werden:
- a) Die für
das Target T1 spezifischen DNA-Probensequenzen
werden alle mit derselben spektralen Signatur S1 markiert;
die für
das Target T2 spezifischen Probensequenzen
werden alle mit einer spektralen Signatur S2 markiert.
Der Ort von T1 wird aufgrund des erhöhten Fluoreszenzsignals der
spektralen Signatur S1 detektiert; der Ort
von T2 wird aufgrund des erhöhten Fluoreszenzsignals
der spektralen Signatur S2 detektiert.
- b) Die fur das Target T1 spezifischen
DNA-Probensequenzen werden mit Fluorochromen der spektralen Signaturen
S1, S2, S3 markiert; die für das Target T2 spezifischen
DNA-Probensequenzen
werden mit Fluorochromen der spektralen Signaturen S4,
S5, S6 markiert.
Der Ort von T1 wird in diesem Falle durch
die spektrale Kolokalisation von S1, S2, S3 detektiert;
der Ort von T1 wird durch die spektrale
Kolokalisation von S4, S5,
S6 detektiert.
Erfindungsgemäß ist auch eine geeignete Kombination
der Verfahren a) und b), wobei auch die Anzahl und Kombination der
spektralen Signaturen geeignet variiert werden kann. Ebenso ist
eine Erweiterung auf mehr als 2 Targets mithilfe einer entsprechenden
Erweiterung der Anzahl der spektralen Signaturen erfindungsgemäß.
Ist der Abstand der Schwerpunkte
der Targets T1, T2,
T3... voneinander kleiner als die FWHM, so
können
die Targets auch in diesem Falle mithilfe einer spezifischen spektralen
Signaturkombination unabhängig
von der Gegenwart der anderen Targets detektiert werden. Beispielsweise
wird T1 durch spektrale Kolokalisation von
S1, S2, S3; T2 durch spektrale Kolokalisation
von S4, S5, S6; T3 durch spektrale
Kolokalisation von S7, S8,
S9 usw. detektiert (s.o.). Im Falle der
höchstauflösenden Präzisionsmikroskopie, bei
der es auch möglich
ist, Distanzen unterhalb der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der
effektiven Punktbildfunktion des verwendeten optischen Systems zu
messen, kann es, abhängig
vom jeweils verwendeten Fluorochrom und seiner Inkorporationshäufigkeit
in die jeweiligen Teilsequenzen, notwendig sein, auch andere Mischungsverhältnisse
als 1:1 einzusetzen.
Ist der Abstand der Schwerpunkte
der Targets T1, T2,
T3... voneinander jeweils größer als
die FWHM, so können
zusätzliche
Kombinationen verwendet werden. Beispielsweise kann in diesem Falle Target
T1 durch die Kombination S1,
S2, S3; Target T2 durch die Kombination S1,
S3, S4; Target T3 durch S1, S3, S5; Target T4 durch S1, S3, S6; Target T5 durch S2, S3, S4, usw. charakterisiert
werden.
Lösung
mit experimentell ermittelten Oligonukleotidsequenzen Für das vorliegende
in vivo-FISH bzw. vital-FISH Verfahren von DNA-enthaltenden Targets
mit einem Durchmesser kleiner als die Halbweitsbreite der Punktbildfunktion
des zur Detektion verwendeten optischen Systems ist die Bestimmung
von geeigneten Oligonukleotidsequenzen erforderlich, aus denen geeignete
Mischungen von DNA-Proben hergestellt werden können. Eine oben beschriebene
Möglichkeit
besteht in der Auswahl passender Oligonukleotidsequenzen aus Sequenzdatenbanken
der zu analysierenden Targetregionen.
Zusätzlich oder an Stelle dieser
Lösung
kann das folgende Verfahren herangezogen werden. Die Zahl theoretisch
möglicher
Oligonukleotide mit einer bestimmten Länge, die mit der Target-DNA
Tripel-Strukturen bilden können,
ist begrenzt. Bei einer Länge
von 15 bp beispielsweise gibt es 215 Möglichkeiten;
bei einer Länge
von 20 bp beispielsweise gibt es 220 Möglichkeiten
fur eine Oligonukleotidsequenz, die nur aus Purinen bzw. nur aus
Pyrimidinen besteht; insgesamt ergibt dies also rund 32000 bzw.
1 Million Möglichkeiten.
Diese 15mers bzw. 20mers können
nach bekannten Verfahren (z.B GeneChip Probe Array der Firma Affymetrix)
auf einem DNA-Chip synthetisiert werden. Beim gegenwärtigen Stand
der Technik wurden bereits mehrere hunderttausend Sequenzen auf
einem Chip untergebracht. Geht man entsprechend dem genannten Beispiel
von einem feature Durchmesser von 1 μm × 1 μm aus, so kam bei einem Abstand
der einzelnen features von ebenfalls 1 μm die Gesamtmenge von einer
Million features auf einem Gen-Chip Areal von wenigen Quadratmilimetern
untergebracht werden. Für
die Realisierung der hier beschiebenen Erfindung mithilfe von 15mer
Homopurin bzw. Homopyrimidinsequenzen ist bereits der erreichte
Stand ausreichend. Jeder Platz auf dem Chip („feature") wird mit einer großen Zahl identischer Oligonukleotide
einer bestimmten Sequenz, entweder nur aus Purinbasen (Homopurinsequenz),
oder nur aus Pyrimidinbasen (Homopyrimidinsequenz) besetzt. Beispielsweise kannt
ein Chip mit 32000 bzw. 1 Million verschiedener features so gestaltet
werden, daß er
alle in der Natur natürlicherweise
vorkommenden DNA-15mers bzw. DNA-20mers enthält, die durch Verbindung mit doppelsträngigen DNA-Sequenzen
Tripelstrukturen bilden können.
Hybridisiert man anschließend
gesamtgenoinische DNA einer Spezies bzw. Teilfraktionen dieser DNA,
z.B. die DNA eines individuellen Chromosoms, eines individuellen
Chromosomenarms, einer Chromosomenbande oder eines Gens auf diesen
DNA-Chip, dann ist es möglich,
alle Abschnitte mit einer Länge
von (z.B.) 15 oder von 20 Basenpaaren in diesen genomischen DNA
Proben zu identifizieren, die tripelhelikale Strukturen bilden können. Diese
Hybridisierung kann sowohl unter denaturierenden Bedingungen als
auch nicht denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden.
Dieser Ansatz erlaubt es, die für die Bildung von
Tripel-Strukturen (und damit die in vivo bzw. vital Markierung chromosomaler
DNA-Targets) benötigten Oligonukleotide
als Pool für
die optische Detektion eines ausgewählten genomischen Abschnittes
bereitzustellen. Durch vergleichende Hybridisierung von DNA-Chips
der beschriebenen Konfiguration mit genomischen DNA Fraktionen,
die die DNA des interessierenden Abschnitts repräsentieren, und von DNA Fraktionen,
die die übrige
genomische DNA repräsentieren,
kann festgestellt werden, welche der beispielsweise 20mers mit tripel-bildenden
Eigenschaften ausschließlich
in einem interessierenden genomischen DNA Abschnitt (z.B. einem
bestimmten Chromosom, Chromosomenabschnitt, oder einem bestimmten
Gen) vorkommen.
Anschließend erfolgt die weitere Synthese bzw.
Amplikation der interessierenden DNA Sequenzen wie oben beschrieben.
Ebenso wie die aus den Computerdaten ermittelten Sequenzen sind
die hier per Chip gefundenen Sequenzen für die in vivo oder vital Markierung
geeignet und beispielsweise in der Präzionsmikroskopie einsetzbar.
Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung
besteht in der systematischen Konstruktion von DNA-Probengemischen,
die eine oder mehrere gegebene Markierungsregionen im Genom abdecken. Ein
besonderer Vorzug dieser Verfahrensweise besteht darin, daß, sofern
keine geeigneten Computer-DNA-Sequenzbibliotheken vorliegen, die
interessierenden Oligonukleotide mit Tripel-bildenden Eigenschaften
mit einem Chip der oben beschriebenen Art in genomischer DNA jeder
beliebigen Spezies identifiziert werden können, ohne daß DNA Sequenzinformation
bereits vorliegen muß.
Dies ist insbesondere von Interesse für die rasche Identifizierung
relevanter Oligonukleotidsequenzen mit Tripel-bildenden Eigenschaften
in noch nicht sequenzierten Genomen, wie z.B. der meisten Erreger
von Infektionskrankheiten.
Der mittlere Durchmesser dT der Markierungsregion ist voraussetzungsgemäß geringer
als die FWHM. Dies bedeutet, daß die
Fluoreszenzsignale der einzelnen, kurzen dreisträngigen Markierungsorte und
der einzelsträngigen
Abschnitte in der nächsten
Umgebung (Abstand der einzelsträngigen Abschnitte ≤ 100 Basenpaare
von dem nächstgelegenen
Basentripel einer Dreifachstrangkonfiguration) in der Target-Region
sich konstruktiv überlagern und/oder
für eine
spektrale Kolokalisation herangezogen werden können; so kann eine wesentliche
Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses bzw. der Target-Identifikation
erreicht werden, die eine Fluoreszenzdetektion so markierter Targets
unter in vivo, physiologischen oder nahezu physiologischen Bedingungen
ermöglicht.
Eine automatische Computeranalyse vorhandener DNA-Sequenzbibliotheken bzw.
der erfindungsgemäße Einsatz
eines DNA-Chips zur Oligonukleotid-Gewinnung ermöglicht die Suche nach generalisierten
Homopurin- oder Homopyrimidinsequenzen mit 15 oder mehr Nukleotiden
aus einer spezifischen längeren
DNA-Sequenz. Diese natürlichen,
für die
Ausbildung von Tripelformationen geeigneten Teilsequenzen können bei
der natürlichen
Chromatinfaltung, wie sie im Zellkern vorliegt, eine Gesamtsequenz
mit einem Targetdurchmesser dT ≤ FWHM so mit
einem Fluorochrom einer bestimmten spektralen Signatur abdecken,
daß es möglich ist,
diese in einem Bildsegment („Bildpunkt") so stark zu akkumulieren;
daß der
Ort des Targets von eventueller Hintergrundsfluoreszenz diskriminierbar
wird. Diese Hintergrundfluoreszenz kann dadurch z.B. entstehen,
daß einzelne
Teilsequenzen aus dein gesamten Gemisch aller Teilsequenzen auch
unspezifisch binden. Bei Verwendung geeigneter Fluorochrome und
Bildaufnahme- und -verarbeitungstechniken läßt sich mit einem erfindungsgemäß konstruierten
Probengemisch das spezifische Markierungssignal im Vergleich zu
dein unspezifischem Hintergrundsignal so entscheidend verbessern,
daß eine
eindeutige Identifizierung einer gesuchten chromosomalen DNA-Region
oder DNA-Sequenz möglich
wird.
Erfindungemäße DNA-Probengemische enthalten
in wässriger
Lösung
mindestens zwei markierte Oligonukleotide, von denen jedes entweder
eine Homopurin- oder Homopyrimidinsequenz aufweist. Vorzugsweise
enthält
die wässrige
Lösung
zusätzlich Salze
wie Natrium- und/oder Magnesiumchlorid in Konzentrationen zwischen
0,1 und 100 mM. Weiterhin kann die wässrige Lösung Puffersubstanzen, bevorzugt
Phosphatpuffer enthalten.
Da die erfindungsgemäßen Probengemische durch
Synthese und/oder Amplifikation gewonnen werden können, läßt sich
somit ein Markierungskit herstellen, der es ermöglicht, ohne umfangreichere Targetbehandlung,
d.h. insbesondere ohne chemische, enzymatische und/oder thermische
Targtdenaturierung, eine spezifische FISH durchzuführen. Dies vereinfacht
in der klinischen Diagnostik den Umgang mit Patientenmaterial als
Target ganz erheblich. Insbesondere brauchen physiologisch relevante
Bedingungen, wie sie bei der Gewinnung des Patientenmaterials im
allgemeinen vorliegen, nicht mehr geändert werden. Dies ist ein
entscheidender Vorteil auch in Anbetracht einer schonenden Behandlung
des zu analysierenden Zellmaterials, um relevante Strukturinformationen
zu konservieren.
Zur Durchführung des Hybridisierungsverfahrens
mit den erfindungsgemäßen Probengemischen
wird zu fixiertem oder unfixiertem Untersuchungsmaterial, z.B. menschliche
Zellen oder Chromosomenpräparationen,
bei Temperaturen zwischen 0°C
und 50°C,
bevorzugt zwischen 20°C
und 37°C, erfindungsgemäßes Probengemisch
zugegeben. Vorzugsweise wird das Probengemisch unmittelbar vor der
ISH erhitzt auf eine Temperatur zwischen 65°C und 95°C und anschließend auf
die Hybridisierungstemperatur abgekühlt. Enthält das Untersuchungsmaterial
DNA-Sequenzen, die
komplementär zu
Oligonukleotid-Sequenzen des Probengemisches sind, so hybridisieren
die Oligonukleotide des Probengemisches mit den komplementären doppelsträngigen DNA-Sequenzen
des Untersuchungsmaterials, wobei Triplex-Stränge gebildet werden. Nach einer
Inkubationszeit zwischen 1 Minute und 1 Stunde, bevorzugt zwischen
2 und 10 Minuten, kann einmal oder zweimal gewaschen werden. Anschließend eefolgt
die Detektion mittels gängiger
Techniken, beispielsweise digitaler Fluoreszenzmikroskopie.
Für
die allgemeine und klinische Genomforschung bzw. Genompathologie
eröffnen
solche erfindungsgemäß hergestellten
Probengemische den Vorteil einer spezifischen in vivo Markierung
von Genomstrukturen im Zellkern für eine multispektrale Analyse
der Genomorganisation und ihrer funktionalen Bedeutung.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil
besteht auch bei beliebig fixiertem Untersuchungsmaterial darin,
daß der
Denaturierungsschritt entfällt:
Das DNA-Probengemisch kann mit derselben Einfachheit gehandhabt
werden wie z.B. etablierte DNA-Färbungen
der klinischen Cytogenetik: Das Probengemisch wird auf das Präparat gegeben;
nach geeigneter Einwirkungszeit z.B. bei Zimmertemperatur und einem evtl.
erfolgenden kurzen Waschschritt, ebenfalls bei Zimmertemperatur,
kann die fluoreszenzmikroskopische Auswertung beginnen.
Ein weiterer Vorteil gegenüber bekannten FISH-Verfahren
bei Raumtemperatur besteht auch bei beliebig fixiertem zellulärem Untersuchungsmaterial
darin, daß das
Probengemisch keine toxisch wirkenden chaotropen chemischen Agenzien
enthält. Hier
können
z.B. die bei längerem
Umgang mit chaotropen Substanzen möglichen Allergiereaktionen
eliminiert werden.
Ebenso können in der Sensorik entsprechende
DNA-Chips konstruiert werden, die DNA-Sequenzen bei Anlagerung an gegebene
Proben erkennen, ohne daß der
Chip oder das Untersuchungsmaterial zusätzlich eine chemische und/oder
thermische Behandlung benötigen.
Ferner können
die Anforderungen an das zur Detektion verwendete optische System
erheblich reduziert werden. Zum Beispiel ist es möglich, Mikroskopoptiken
von geringerer numerischer Apertur (d.h. geringerer FWHM) einzusetzen, wenn
die Dimensionen des Chips entsprechend angepaßt werden (3). Da heute zur optischen Analyse von
DNA-Chips sehr komplexe Systeme, z.B. konfokale Laserscanning-Mikroskope, eingesetzt werden,
kann hierdurch das Verfahren wesentlich ökonomischer gestaltet werden.
Die 1–3 erläutern die Erfindung näher. Es
zeigen:
1:
Identifizierung von DNA-Abschnitten 3 bis 8 innerhalb
des chromosomalen DNA-Targets
T mit einer Basenabfolge (Pu....Pu)N oder
(Py....Py)N, N ≥ N0;
N0 ≥ 15
1:
Zu markierendes chromosomales DNA-Target T; 2: Zellkern; dT: Durchmesser des Targets.
2a:
Amplifikation der identifizierten (Pu ... Pu)/(Py ... Py) Sequenzen
an das Target
T: Markierung mit geeigneten Fluorochromen (Label F)
2b:
Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung mit einem Gemisch aus t1 ... tM oder einigen
von diesen Sequenzen.
3:
DNA-Chip geeigneter Dimension mit 2n features
1.1, 1.2,..., 1.n, 2.1, 2.2,..., n.n. Jedes feature hat vorn Detektionssystem
abhängige
Dimensionen und Abstände
zu den Nachbarfeatures. 1: Abstand zwischen den features > 2 Halbwertsbreiten;
2: feature; dT: Durchmesser des Targets.
