DE69232773T3

DE69232773T3 - Vorrichtung zum Nachweis von Nukleinsäure-Amplifikations-Reaktionen

Info

Publication number: DE69232773T3
Application number: DE69232773T
Authority: DE
Inventors: Russel G. San Francisco Higuchi
Original assignee: Applied Biosystems LLC
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1991-05-02
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 2010-06-10
Anticipated expiration: 2012-04-25
Also published as: EP0512334B1; EP0872562A1; JPH10201464A; EP1256631A1; NO921731D0; AU1513892A; US6171785B1; EP0872562B2; NO921731L; ES2137164T3; EP0872562B1; EP0512334A2; DE1256631T1; DK0872562T3; DE69232773D1; JP3007477B2; CA2067909A1; EP0512334A3; DE69229929D1; JP3136129B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gerät zur Überwachung von Nucleinsäureamplifikationsreaktionen und insbesondere ein Gerät zur Durchführung von Verfahren zum Nachweisen einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe und zur Überwachung der Zunahme von doppelsträngiger DNA während der Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe.
Die neuen Verfahren zur/zum simultanen Nucleinsäureamplifikation und -nachweis erhöhen die Geschwindigkeit und Genauigkeit bekannter Nachweisverfahren und schließen das Erfordernis einer Probenverarbeitung nach der Amplifikation aus. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das Verfahren eine Modifizierung der Polymerasekettenreaktion bereit und in dem Verfahren werden Mittel verwendet, deren Fluoreszenz beim Binden doppelsträngiger DNA verstärkt wird. Die hier bereitgestellten Verfahren können vielfältig angewandt werden, insbesondere auf den Gebieten der Molekularbiologie, der medizinischen Diagnostik und der forensischen Wissenschaften.
Die beschriebenen Nucleinsäure-Nachweisverfahren bieten gegenüber Verfahren des Standes der Technik zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäuren den Vorteil der Geschwindigkeit und Einfachheit. Nucleinsäurenachweistechniken im Allgemeinen sind besonders bei medizinisch-diagnostischen Tests geeignet. Beispielsweise beschreibt die US-PS 4,358,535 ein Verfahren zum Nachweis von Pathogenen durch Auftüpfeln einer Probe (z. B. Blut, Zellen, Speichel, usw.) auf ein Filter, Lysieren der Zellen und Fixieren der DNA durch chemische Denaturierung und Erwärmen. Anschließend werden markierte DNA-Sonden zugesetzt und mit der fixierten Proben-DNA hybridisieren gelassen. Eine Hybridisierung zeigt die Gegenwart der DNA des Pathogens.
Der Nucleinsäurenachweis unter Verwendung von Oligonucleotidsonden ist zu einem Standardverfahren für den spezifischen Zielnachweis geworden. Es sind zahlreiche Modifizierungen dieses Verfahrens beschrieben worden, einschließlich der Kultivierung der Zielzellen oder Organismen in situ auf dem Filter, wodurch die Menge an Ziel-Nucleinsäure erhöht wird, die für den Nachweis zur Verfügung steht. Im Allgemeinen erfordern diese Verfahren, dass die DNA-Probe nicht-kovalent auf einem festen Träger, wie z. B. Nitrocellulose oder Nylon, gebunden und anschließend an eine markierte, Ziel-spezifische Sonde hybridisiert wird.
Die Empfindlichkeit und Spezifität von Nucleinsäurenachweisverfahren wurden durch die Erfindung der Polymerasekettenreaktion (PCR) stark verbessert. Die PCR ist ein Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren und umfasst die Verwendung von zwei Oligonucleotidprimern, eines Mittels für die Polymerisation, eines Ziel-Nucleinsäuretemplats und aufeinanderfolgender Zyklen der Nucleinsäuredenaturierung und des Hybridisierens und der Extension der Primer zur Erzeugung einer großen Zahl von Kopien eines bestimmten Nucleinsäuresegments. Mit diesem Verfahren können Segmente genomischer DNA-Einzelkopien mit sehr hoher Spezifität und Genauigkeit mehr als 10-Millionen-fach amplifiziert werden. PCR-Verfahren sind in der US-PS 4,683,202 beschrieben.
Verfahren zum Nachweis von PCR-Produkten sind insbesondere in der US-PS 4,683,195 beschrieben. Solche Verfahren erfordern eine Oligonucleotidsonde, die mit der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure hybridisieren kann. Auch die EP 237 362 beschreibt ein Nachweisverfahren auf PCR-Basis, das als ”Umkehr-Dot-Blot” bezeichnet wird, bei dem die Sonde anstelle der amplifizierten DNA an der Membran fixiert wird. Gemäß dem Verfahren wird anstelle der Sonde das Ziel zur Hybridisierung markiert. Diese Verfahren erfordern separate Schritte zur Amplifikation, zum Einfang und Nachweis und erfordern im Allgemeinen mehrere Stunden bis zum Abschluss. Bei dem Umkehr-Dot-Blot-Verfahren sind lagerstabile zielspezifische Reagenzien bevorzugt.
Alternative Verfahren zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäuren beschreiben die gleichzeitige Amplifizierung und Markierung eine Ziel-Nucleinsäure. Die Verfahren erfordern, dass mindestens ein Amplifikationsprimer markiert wird. Der Amplifikationsprimer kann z. B. mit einem Radioisotop für einen direkten Nachweis des amplifizierten Produkts oder mit einem Reagenz markiert werden, das zum Einfangen des Produkts auf einem Träger für einen anschließenden Nachweis geeignet ist.
Andere Nachweismittel umfassen die Verwendung der Fragmentlängen-Polymorphismushybridisierung, allelspezifische Oligonucleotidsonden (ASO-Sonden) (Saiki et al., Nature 324, 163, 1986) oder das direkte Sequenzieren mit dem Didesoxyverfahren unter Verwendung amplifzierter DNA anstelle von geklonter DNA. Bei dem Fragmentlängen-Polymorphismusverfahren werden Insertionen und Deletionen zwischen PCR-Primern nachgewiesen, die zu PCR-Produkten unterschiedlicher Länge führen, die durch Klassierung nachgewiesen werden können. ASO-Verfahren sind zum Nachweis allelischer Sequenzvariationen geeignet. Bei einem Beispiel der ASO-Hybridisierung wird die amplifizierte DNA z. B. durch UV-Bestrahlung in einer Reihe von ”Dot-Blots” an ein Nylonfilter fixiert und anschließend unter stringenten Bedingungen mit einer Oligonucleotidsonde hybridisieren gelassen. Die Sonde kann z. B. mit Meerrettichperoxidase (HRP) markiert und durch die Gegenwart eines blauen Niederschlags nach der Behandlung mit geeigneten Oxidationsreagenzien nachgewiesen werden.
Ferner ist ein alternatives Testverfahren zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäuren bekannt. Bei dem Verfahren wird die 5'-3'-Nucleaseaktivität einer Nucleinsäurepolymerase zur Spaltung hybridisierter markierter Oligonucleotide von hybridisierten Duplexen und zur Freisetzung markierter Oligonucleotidfragmente zum Nachweis verwendet. Das Verfahren ist zum Nachweis von PCR-Produkten geeignet und erfordert ein Primerpaar und eine markierte Oligonucleotidsonde mit einem blockierten 3'-OH-Ende zur Verhinderung einer Extension durch die Polymerase.
Aufgrund der enormen Amplifikation, die mit dem PCR-Verfahren möglich ist, können geringe Mengen verschleppter DNA von Proben mit hohen DNA-Mengen, von Positivkontrolltemplaten oder von vorhergehenden Amplifikationen selbst bei Abwesenheit absichtlich zugegebener Templat-DNA zu einem PCR-Produkt führen. Higuchi und Kwok, Nature 339, 237–238, 1989 und Kwok und Orrego, in Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990 beschreiben spezielle Verfahren und Vorkehrungen zur Durchführung von PCR mit einem Minimum an gegenseitigen Verunreinigungen. Da die Möglichkeit der Einführung kontaminierender DNA in eine Probe mit zunehmender Anzahl der Handhabungsschritte, die für die Probenvorbereitung, -verarbeitung und -analyse erforderlich sind, zunimmt, wäre es bevorzugt, die Probenhandhabung zu minimieren, insbesondere nach dem Abschluss der Amplifikationsreaktion.
Zur Markierung von Nucleinsäuren unabhängig davon, ob es sich um eine Sonde oder ein Ziel handelt, wurde eine Anzahl von Mitteln zur Erleichterung des Nachweises einer Ziel-Nucleinsäure beschrieben. Geeignete Marker können Signale liefern, die durch Fluoreszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Röntgenbeugung oder -absorption, Magnetismus oder enzymatische Aktivität nachgewiesen werden können und umfassen z. B. Fluorophore, Chromophore, radioaktive Isotope (insbesondere ³²P und ¹²⁵I), Reagenzien mit hoher Elektronendichte, Enzyme und Liganden mit spezifischen Bindungspartnern.
Die Markierung wird durch eine Anzahl von Mitteln erreicht, z. B. durch chemische Modifizierung eines Primers oder einer Sonde zum Einbringen eines Markers oder durch die Verwendung von Polymerisationsmitteln zum Einbringen eines modifizierten Nucleosidtriphosphats in ein Extensionsprodukt. Interkalierende Mittel binden die gestapelten Basen von Nucleinsäuren nicht-kovalent und als Folge davon nimmt die Fluoreszenz des Mittels entweder zu oder verschiebt sich zu einer anderen Wellenlänge. Beispielsweise beschreibt die US-PS 4,582,789 verschiedene interkalierende Reste, einschließlich Psoralene.
Fluoreszenzfarbstoffe sind zum Nachweis von Nucleinsäuren geeignet. Beispielsweise ist Ethidiumbromid ein interkalierendes Mittel, das im Gegensatz zum freien Vorliegen in Lösung eine erhöhte Fluoreszenz zeigt, wenn es an doppelsträngige DNA gebunden ist (Sharp et al., Biochemistry 12, 3055, 1973). Ethidiumbromid kann zum Nachweis sowohl einzel- als auch doppelsträngiger Nucleinsäuren verwendet werden, obwohl die Affinität von Ethidiumbromid für einzelsträngige Nucleinsäure relativ gering ist. Ethidiumbromid wird routinemäßig zum Nachweis von Nucleinsäuren nach der Gelelektrophorese verwendet. Nach der Größenfraktionierung auf einer geeigneten Gelmatrix, wie z. B. Agarose oder Acrylamid, wird das Gel in einer verdünnten Lösung von Ethidiumbromid eingetaucht. Die DNA wird dann durch Untersuchen des Gels unter UV-Licht sichtbar gemacht (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, Auflage 1982).
Alternative Verfahren auf Fluoreszenzbasis zum Nachweis von DNA wurden beschrieben. Beispielsweise beschreiben Morrison et al., Anal. Biochem. 183, 231–244, 1989 ein Zwei-Sonden-Verfahren zum Nachweis von Ziel-DNA. Eine Sonde wird mit Fluorescein markiert und die andere Sonde, die zu der ersten Sonde komplementär ist, wird mit einem Quencher für die Fluoresceinemission markiert. Die Sonden werden mit denaturierter DNA, welche die Zielsequenz enthält, hybridisieren gelassen und die Stärke der Fluoreszenz wird bestimmt. Die Fluoreszenz nimmt in dem Ausmaß zu, in dem die Fluoresceinsonde anstatt an die komplementäre Quencher-Sonde an unmarkierte komplementäre DNA bindet.
Mabuchi et al., Nucl. Acids Res. 18(24), 7461–7462, 1990 beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Fragmenten auf der Basis des AT-Gehalts des Nucleinsäuresegments. Zur Färbung größenfraktionierter DNA in einem Agarosegel werden zwei Fluorochrome verwendet. Die selektiven Bindungseigenschaften verschiedener Fluorochrome für AT-reiche Regionen werden zur Unterscheidung von DNA-Fragmenten verwendet, die einer Elektrophorese unterworfen worden sind.
Die US-PS 4,257,774 beschreibt das direkte Binden fluoreszierender Interkalatoren an DNA, z. B. von Ethidiumsalzen, Daunomycin, Mepacrin und Acridinorange, sowie von 4',6-Diamidino-2-phenylindol, zur Quantifizierung der DNA. Zur Charakterisierung nicht-fluoreszierender DNA-bindender Verbindungen, die mit den DNA-bindenden Farbstoffen konkurrieren, wird Fluoreszenzpolarisation eingesetzt.
Oser und Valet, Angew. Chem. Int. Engl. 29(10), 1167, 1990 beschreiben ein Nucleinsäure-Nachweisschema, das zwei Oligonucleotidsonden erfordert, die zu angrenzenden Stellen auf einem Ziel komplementär sind. Die Sonden werden differentiell unterschiedlich entweder mit einem Salicylat oder einem DTPA-Liganden markiert, der einen Fluoreszenzemitter, Tb^III, trägt. Die Hybridisierung beider Sonden an das Ziel führt zu einer räumlichen Nähe der beiden Marker, was zu einer messbaren Zunahme der Tb^III-Fluoreszenz führt. Die modifizierten Sonden werden spezifisch für jedes nachzuweisende Ziel hergestellt.
Die EP 070 685 beschreibt die Verwendung fluoreszierend markierter Polynucleotidsonden in Polynucleotid-Hybridisierungstests. Gemäß dem Verfahren werden Sonden durch Binden spezieller Absorber-Emitter-Reste an die 3'- und 5'-Enden von Nucleinsäurefragmenten hergestellt. Die Fragmente können an angrenzende Positionen auf einer Ziel-DNA hybridisieren, so dass dann, wenn beide Fragmente hybridisiert sind, die Nähe der Absorber- und Emitterreste zu einer nachweisbaren Emitterfluoreszenz führt.
Gemäß diesen Verfahren wird der Fluoreszenzfarbstoff in die Ziel-DNA eingeführt, nachdem alle in vitro Nucleinsäurepolymerisationsreaktionen abgeschlossen worden sind. Die inhibitorischen Effekte interkalierender Mittel auf Nucleinsäurepolymerasen wurden in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben (z. B. Kornberg, DNA Synthesis, W. H. Freman and Co, San Francisco, 1974; Richardson, J. Mol. Biol. 78, 703–714, 1973).
DNA-bindende Farbstoffe sind aufgrund der inhibitorischen Effekte auf Nucleinsäurereplikationsprozesse, die sich aus der Bindung des Mittels an das Templat ergeben, als Antibiotika geeignet. Die EP 169 787 beschreibt die Verwendung interkalierender Mittel zur Blockierung der Replikation von Grippe- oder Herpesviren. Kornberg (vorstehend) beschreibt eine Anzahl DNA-bindender Mittel, und zwar sowohl Interkalatoren als auch nicht-Interkalatoren, und ferner, wie jede Verbindung die Nucleinsäurereplikation inhibiert. Auf Seite 227 beschreibt Kornberg spezifisch, dass Ethidiumbromid die DNA-Replikation inhibiert.
Eine Vorrichtung zum simultanen Amplifizieren und Nachweisen von Ziel-Nucleinsäuren würde Vorteile gegenüber bekannten Nachweisverfahren bieten. Eine derartige Vorrichtung würde die Probleme der Probenkontamination minimieren, die jedem Verfahren inhärent sind, das eine Reihe von Handhabungsschritten zur Erkennung eines positiven oder negativen Testergebnisses umfasst. Durch den Ausschluss von Probehandhabungs- und Verarbeitungsschritten würde eine Vorrichtung zum simultanen Amplifizieren und Nachweisen von Ziel-Nucleinsäuren die Geschwindigkeit und Genauigkeit gegenwärtiger diagnostischer Verfahren erhöhen. Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme und erfüllt diese Bedürfnisse.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Überwachung einer Nucleinsäureamplifikationsreaktion über mehrere thermische Zyklen bereit, umfassend:

(a) einen Thermocycler, der in einem Reaktionsgefäß ein Amplifikationsreaktionsgemisch, das eine Ziel-Nucleinsäure, Reagenzien für die Nucleinsäure-Amplifikation und ein nachweisbares Nucleinsäure-bindendes Mittel umfasst, abwechselnd aufheizen und kühlen kann; und
(b) ein optisches System, das einen Detektor umfasst, der ein optisches Signal, das der Menge an amplifizierter Nucleinsäure in dem Reaktionsgemisch entspricht, über einen Zeitraum von mehreren Zyklen nachweisen kann, und zwar ohne Öffnen des Reaktionsgefäßes, sobald die Amplifikationsreaktion gestartet worden ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Gerät kann ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe durchgeführt werden, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Amplifikationsreaktionsgemischs, das eine Probe, ein DNA-bindendes Mittel, wobei das Mittel dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein nachweisbares Signal liefert, wenn es an doppelsträngige Nucleinsäure gebunden ist, wobei das Signal von dem Signal unterscheidbar ist, das von dem Mittel geliefert wird, wenn es nicht gebunden ist, sowie Reagenzien für die Amplifikation umfasst; (b) Bestimmen der Größe des Signals, das von dem Gemisch von Schritt (a) erzeugt wird; (c) Behandeln des Gemischs unter Bedingungen zur Amplifikation der Ziel-Nucleinsäure; (d) Bestimmen der Größe des Signals, das von dem Gemisch von Schritt (c) erzeugt wird; und (e) Bestimmen, ob eine Amplifikation stattgefunden hat.
Die Erfindung ist besonders zur Durchführung in PCR-Amplifikationsverfahren geeignet, bei denen eine Netto-Zunahme der doppelsträngigen DNA zu einer Änderung der Signalstärke oder der Signalart führt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das DNA-bindende Mittel ein fluoreszierendes DNA-bindendes Mittel, wie z. B. Ethidiumbromid, und das Signal ist eine Fluoreszenz.
1 zeigt die erhöhte Fluoreszenz des PCR-Gemischs aufgrund der Amplifikation einer spezifischen Ziel-DNA in Gegenwart von Ethidiumbromid. Das Experiment wird detailliert in Beispiel II beschrieben.
2 zeigt die Zielspezifität des vorliegenden Nachweisverfahrens und veranschaulicht einige der quantitativen Aspekte der Erfindung. Die Details des Experiments sind in Beispiel IV angegeben.
3 zeigt die Verwendung der vorliegenden Erfindung für das genetische Screening. Das Experiment ist detailliert in Beispiel V beschrieben.
Die 4A und 4B betreffen den quantitativen homogenen Test, der in Beispiel VII beschrieben ist. 4A zeigt, dass die Zunahme der Fluoreszenz in den positiven Proben mehr als zwei Standardabweichungen vom Durchschnitt der negativen Proben entfernt ist. 4B beschreibt graphisch ein Hintergrundsubtraktionsverfahren zum Messen von Fluoreszenz.
Die 5A und 5B zeigen die Ergebnisse eines erfindungsgemäßen automatisierten homogenen Online-Amplifikations- und Nachweissystems, wie es in Beispiel VIII gezeigt ist. 5A zeigt einen Fluoreszenz-Ausdruck von einer PCR, die keine Ziel-DNA enthält und als Negativ-Kontrolle dient. 5B ist ein Fluoreszenz-Ausdruck von einer PCR, die das geeignete Ziel enthält und zeigt die kontinuierliche Überwachung der PCR und eine gleichzeitige Zunahme des PCR-Produkts.
Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren bereit und ist insbesondere zur Verwendung im Zusammenhang mit Amplifikationsverfahren geeignet. Die verbesserten Verfahren erfordern weder eine Oligonucleotidsonde noch einen markierten Amplifikationsprimer. Die Verfahren ermöglichen die Überwachung der Ansammlung von Produkt, während die Amplifikationsreaktion abläuft. Die Erfindung ermöglicht auch eine zielspezifische Quantifizierung. Diese Verfahren sind zur Verwendung in automatisierten Formaten geeignet.
Die beschriebenen Verfahren bieten sehr starke Verbesserungen gegenüber Verfahren des Standes der Technik zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäuren. Erfindungsgemäß werden amplifizierte Nucleinsäuren ohne Öffnen des Reaktionsgefäßes nachgewiesen, sobald die Amplifikationsreaktion gestartet worden ist und ohne zusätzliche Handhabungs- oder Manipulationsschritte nach der Reaktion. Vor der vorliegenden Erfindung erforderten Nucleinsäurenachweisverfahren ein drittes Oligonucleotidreagenz als Sonde oder eine Reihe von manipulativen und zeitintensiven Schritten zum Zielnachweis, wie z. B. das Einfangen des Produkts auf einem Träger, wobei diese Schritte nach der Amplifikation durchgeführt werden. In manchen Verfahren sind sowohl Einfangs- als auch Sondenhybridisierungsschritte erforderlich. Die vorliegende Erfindung schließt das Erfordernis der Verwendung eines Hybrisierungssondenreagenzes oder eines Einfangvorgangs zum Nachweis des amplifizierten Ziels aus. Im Bereich der Klinik bieten die erfindungsgemäßen Verfahren Geschwindigkeit, Einfachheit und weniger Gelegenheiten für eine gegenseitige Verunreinigung zwischen den Proben, insbesondere zwischen amplifizierten und nicht-amplifizierten Proben. Darüber hinaus bieten die vorliegenden Verfahren Mittel zum/zur automatisierten Nachweis, Überwachung und Quantifizierung der Amplifikationsprodukte während des Amplifikationsverfahrens und nachdem die Amplifikationsreaktion abgeschlossen ist.
Die vorliegenden Verfahren erfordern ein nachweisbares Mittel, das doppelsträngige DNA binden kann. Das nachweisbare bindende Mittel kann ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein anderes Chromophor, Enzym, oder Mittel sein, das direkt oder indirekt ein Signal erzeugen kann, wenn es an doppelsträngiger DNA gebunden ist. Das Mittel kann auch so charakterisiert werden, dass es an einzelsträngige DNA oder RNA bindet. Es ist lediglich notwendig, dass das Mittel ein nachweisbares Signal erzeugen kann, wenn es an eine doppelsträngige Nucleinsäure gebunden ist, das von dem Signal unterscheidbar ist, das erzeugt wird, wenn das gleiche Mittel in Lösung oder gebunden an eine einzelsträngige Nucleinsäure vorliegt.
In einer Ausführungsform ist das DNA-bindende Mittel ein interkalierendes Mittel. Wie hier verwendet, ist ein interkalierendes Mittel ein Mittel oder ein Rest, der nicht-kovalent zwischen gestapelten Basenpaaren in der Nucleinsäuredoppelhelix insertieren kann. Interkalierende Mittel, wie z. B. Ethidiumbromid, fluoreszieren mit größerer Intensität, wenn sie in doppelsträngige DNA interkaliert sind, als dann, wenn sie an einzelsträngige DNA oder RNA gebunden sind oder in Lösung vorliegen. Andere interkalierende Mittel zeigen eine Änderung des Fluoreszenzspektrums, wenn sie an doppelsträngiger DNA gebunden sind. Beispielsweise fluoresziert Actinomycin D rot, wenn es an einzelsträngige Nucleinsäuren gebunden ist, und grün, wenn es an ein doppelsträngiges Templat gebunden ist. Unabhängig davon, ob das nachweisbare Signal zunimmt, abnimmt oder verschoben wird, wie es bei Actinomycin D der Fall ist, ist jegliches interkalierende Mittel, das ein nachweisbares Signal liefert, welches unterscheidbar ist, wenn das Mittel an doppelsträngiger DNA gebunden oder ungebunden ist, zur Durchführung der beschriebenen Erfindung geeignet. Beispielsweise wurde die Wechselwirkung zwischen DNA und einem anderen photoreaktiven Psoralen, 4-Aminomethyl-4,5',8-Trimethylpsoralen (AMT) beschrieben (Johnson et al., Photochem. & Photobiol. 33, 785–791, 1981). Gemäß dieses Artikels nehmen sowohl die Absorption bei großen Wellenlängen als auch die Fluoreszenz bei einer Interkalation von AMT in die DNA-Helix ab.
Es sind auch nicht-interkalierende DNA-bindende Mittel geeignet. Beispielsweise zeigt Hoechst 33258 (Searle & Embrey, Nuc. Acids Res. 18(13), 3753–3762, 1990) mit zunehmender Menge an Ziel einer veränderte Fluoreszenz. Hoechst 33258 ist ein Mitglied einer Klasse DNA-bindender Verbindungen, die gewöhnlich als ”Furchen-Bindemittel” bezeichnet werden.
Diese Gruppe umfasst Arzneistoffe wie z. B. Distamycin, Netropsin und andere. Diese Verbindungen erkennen und binden an die kleine Furche von Duplex-DNA.
Erfindungsgemäß erzeugt ein DNA-bindendes Mittel ein nachweisbares Signal direkt oder indirekt. Das Signal ist direkt nachweisbar, wie z. B. durch Fluoreszenz oder Extinktion, oder indirekt über einen substituierten Markerrest oder einen bindenden Liganden, der an dem DNA-bindenden Mittel gebunden ist. Für einen indirekten Nachweis ist ein beliebiger Rest oder Ligand geeignet, der nachweisbar durch die Nähe zu doppelsträngiger DNA beeinflusst wird.
Erfindungsgemäß liegt das nachweisbare bindende Mittel während des Amplifikationsverfahrens in der Amplifikationsreaktion vor. Mit fortschreitender Amplifikation erzeugt das Mittel ein nachweisbares Signal. Weder das Mittel noch das Signal verhindert den Fortschritt der Amplifikation. Folglich kann das Mittel dem Reaktionsgemisch vor der Amplifikation zugesetzt werden, oder während die Reaktion abläuft. Beispielsweise ist das Mittel in einem Amplifikationspuffer enthalten, der geeignete Reagenzien, wie z. B. Salze und Puffermittel, umfasst. Auf diese Weise ist es nicht erforderlich, das bindende Mittel der Amplifikationsreaktion separat zuzusetzen. Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ist ein beliebiges DNA-bindendes Mittel geeignet, solange in Gegenwart dieses Mittels eine Nettozunahme der Menge an doppelsträngiger DNA durch die Änderung der Signalintensität wiedergespiegelt wird, die direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. In eine bevorzugten Ausführungsform ist das nachweisbare Signal eine Fluoreszenz.
Der Begriff ”homogener Nachweistest” wird in der vorliegenden Beschreibung zur Beschreibung der beanspruchten Erfindung verwendet. Für ein einfaches Verständnis wird die nachstehende Definition angegeben. Ein homogener Nachweistest bezieht sich auf ein Verfahren zur Kopplung von Amplifikation und Nachweis, bei dem das Amplifikationsverfahren ein nachweisbares Signal erzeugt und das Erfordernis einer nachfolgenden Probenhandhabung und Manipulation zum Nachweis des amplifizierten Produkts minimiert oder eliminiert wird.
Der vorliegende homogene Test ist zur Verwendung in Verbindung mit Oligonucleotidsonden geeignet. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform die Verwendung einer Oligonucleotidsonde, die für den Nachweis einer speziellen Zielsequenz spezifisch ist, zusätzlich zu dem DNA-bindenden Mittel der vorliegenden Erfindung in die Amplifikationsreaktion eingebracht. Die Sonde, die mit einem Quencher und einem Fluorophor markiert ist, hybridisiert an die amplifizierte Ziel-Nucleinsäure. In der Gegenwart eines Polymerisationsmittels, das eine 5'-3'-nucleolytische Aktivität aufweisen kann, werden das Fluorophor und der Quencher, wenn sie an dem Ziel gebunden sind, durch den Abbau der Sonde durch die Polymerase getrennt. Die Fluoreszenz der ungebundenen Sonde ist nachweisbar verschieden von der Fluoreszenz der gebundenen Sonde und der anschließend hydrolysierten Sonde. Folglich ermöglicht die Fluoreszenz des DNA-bindenden Mittels den Nachweis, dass eine Amplifikation stattgefunden hat und die Fluoreszenz der hybridisierten Sonde zeigt eine zielspezifische Amplifikation. Solange die Amplifikation ohne Öffnen des Reaktionsgefäßes oder ohne weitere Verarbeitungsschritte, sobald die Amplifikation gestartet worden ist, nachweisbar ist, liegt das Verfahren innerhalb der vorliegenden Definition eines homogenen Tests.
Der Begriff ”Amplifikationsreaktionssystem” bezieht sich auf jegliches in vitro-Mittel zur Vervielfältigung der Kopien einer Nucleinsäure-Zielsequenz. Solche Verfahren umfassen unter anderem PCR, DNA-Ligasekettenreaktion (LCR), Q-DNA-Replicase und RNA-transkriptionsbasierte Amplifikationssysteme (TAS und 3SR).
Der Begriff ”Amplifizieren”, der sich typischerweise auf eine exponentielle Zunahme der Ziel-Nucleinsäure bezieht, wird hier verwendet, um sowohl eine lineare als auch eine exponentielle Zunahme der Anzahl einer ausgewählten Nucleinsäure-Zielsequenz zu beschreiben.
Der Begriff ”Amplifikationsreaktionsgemisch” bezieht sich auf eine wässrige Lösung, welche die verschiedenen Reagenzien umfasst, die zur Amplifizierung einer Ziel-Nucleinsäure verwendet werden. Diese umfassen Enzyme, wässrige Puffer, Salze, Amplifikationsprimer, Ziel-Nucleinsäure und Nucleosidtriphosphate. Abhängig vom Zusammenhang kann das Gemisch entweder ein vollständiges oder unvollständiges Amplifikationsreaktionsgemisch sein.
Die nachstehend beschriebenen Systeme werden vom einschlägigen Fachmann routinemäßig ausgeführt. Sie wurden von anderen detailliert beschrieben und sind nachstehend zusammengefasst. Diese Erfindung ist nicht auf ein bestimmtes Amplifikationssystem beschränkt. Mit der Entwicklung anderer Systeme können diese von der Durchführung dieser Erfindung profitieren. Eine neuere Übersicht über Amplifikationssysteme wurde in Bio/Technology 8, 290–293, April 1990 veröffentlicht. Die nachstehenden vier Systeme werden beschrieben, um ein Verständnis der Breite der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen.
Die Amplifikation von DNA durch PCR ist in den US-PSen 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben. Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis von Nucleinsäuren durch PCR unter Verwendung eines thermostabilen Enzyms sind in der US-PS 4,965,188 beschrieben.
Die PCR-Amplifikation von DNA umfasst wiederholte Zyklen einer Hitzedenaturierung der DNA, der Hybridisierung von zwei Oligonucleotidprimern zu Sequenzen, die das zu amplifizierende DNA-Segment flankieren, und der Verlängerung der hybridisierten Primer mit DNA-Polymerase. Die Primer hybridisieren an gegenüberliegende Stränge der Zielsequenz und sind so orientiert, dass die DNA-Synthese durch die Polymerase über den Bereich zwischen den Primern fortschreitet, wodurch die Menge des DNA-Segments effektiv verdoppelt wird. Darüber hinaus verdoppelt jeder folgende Zyklus im Wesentlichen die Menge an DNA, die in dem vorhergehenden Zyklus synthetisiert worden ist, da die Extensionsprodukte auch komplementär zu den Primern sind und diese binden können. Dies führt zu der exponentiellen Ansammlung der spezifischen Zielfragmente mit einer Geschwindigkeit von etwa 2n pro Zyklus, wobei n die Anzahl der Zyklen ist.
In der beschriebenen Ausführungsform ist Taq-DNA-Polymerase bevorzugt, obwohl dies kein essentieller Aspekt der Erfindung ist. Taq-Polymerase, eine thermostabile Polymerase, ist bei hohen Temperaturen aktiv. Verfahren zur Herstellung von Taq sind in der US-PS 4,889,818 beschrieben. In der PCR können jedoch auch andere thermostabile DNA-Polymerasen verwendet werden, die von anderen Thermus-Arten oder nicht-Thermus-Arten isoliert werden (z. B. Thermus thermophilus oder Thermotoga maritima), sowie nicht-thermostabile DNA-Polymerase, wie z. B. T4 DNA-Polymerase, T7 DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I oder das Klenow-Fragment von E. coli.
Wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff ”Primer” auf ein Oligonucleotid, das als Startpunkt der DNA-Synthese wirken kann, wenn es an ein Nucleinsäuretemplat unter Bedingungen hybridisiert wird, bei denen die Synthese eines Primerextensionsprodukts initiiert wird, d. h. in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleotidtriphosphaten und einer DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer (”Puffer” umfasst den pH-Wert, die Ionenstärke, Kofaktoren, usw.) und bei einer geeigneten Temperatur.
Die in dem Extensionsverfahren verwendeten Nucleosid-5'-triphosphate, typischerweise dATP, dCTP, dGTP und dTTP liegen in einer Gesamtkonzentration vor, die während der Extensionsreaktion typischerweise im Bereich von 400 μM bis 4,0 mM liegt. Die Konzentration liegt vorzugsweise zwischen 500 μM und 1,5 mM.
Die Auswahl der Primer zur Verwendung in der PCR bestimmt die Spezifität der Amplifikationsreaktion. In der vorliegenden Erfindung verwendete Primer sind Oligonucleotide, gewöhnlich Desoxyribonucleotide mit einer Länge von mehreren Nucleotiden, die durch die Polymerasekettenreaktion in einer Templat-spezifischen Weise verlängert werden können. Der Pri mer ist ausreichend lang, um die Synthese der Extensionsprodukte in Gegenwart des Polymerisationsmittels starten zu können und enthält typischerweise 10 bis 30 Nucleotide, obwohl die genaue Zahl für die erfolgreiche Anwendung des Verfahrens nicht kritisch ist. Kürzere Primermoleküle erfordern im Allgemeinen niedrigere Temperaturen zur Bildung ausreichend stabiler Hybridkomplexe mit dem Templat.
Synthetische Oligonucleotide können unter Verwendung des Triesterverfahrens von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185–3191, 1981, hergestellt werden. Alternativ kann eine automatische Synthese bevorzugt sein, wie z. B. auf einem Biosearch 8700 DNA-Synthesizer unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramiditchemie.
Um eine Primerextension stattfinden lassen zu können, muss dieser Primer an das Nucleinsäuretemplat hybridisieren. Nicht jedes Nucleotid des Primers muss an das Templat hybridisieren, um eine Extension stattfinden zu lassen. Die Primersequenz muss nicht die genaue Sequenz des Templats wiederspiegeln. Beispielsweise kann ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment an das 5'-Ende des Primers gebunden werden, wobei der Rest der Primersequenz zu dem Templat komplementär ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen in den Primer eingestreut sein, mit der Maßgabe, dass die Primersequenz eine ausreichende Komplementarität zu dem Templat aufweist, so dass eine Hybridisierung stattfinden kann und eine Synthese eines komplementären DNA-Stranges ermöglicht wird.
Amplifikationssysteme, wie z. B. eine PCR, erfordern eine Ziel-Nucleinsäure in einem Puffer, der mit den zur Amplifikation des Ziels verwendeten Enzyme verträglich ist. Die Zielnucleinsäure kann aus einer Vielzahl biologischer Materialien isoliert werden, einschließlich Geweben, Körperfluiden, Fäzes, Sputum, Speichel, Pflanzenzellen, Bakterienkulturen und dergleichen.
Im Allgemeinen wird die Nucleinsäure in der Probe eine DNA-Sequenz sein, am häufigsten genomische DNA. Die vorliegende Erfindung kann jedoch auch mit anderen Nucleinsäuren durchgeführt werden, wie z. B. Messenger-RNA, ribosomaler DNA, viraler DNA oder geklonter DNA. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Nucleinsäureproben umfassen einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA. Dem Fachmann ist klar, dass unabhängig von der Art der Nucleinsäure diese lediglich durch geeignete und anerkannte Modifizierungen des verwendeten Verfahrens amplifiziert werden kann.
Zur Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe muss die Sequenz gegenüber den Komponenten des Amplifikationssystems zugänglich sein. Im Allgemeinen wird diese Zugänglichkeit durch Isolieren der Nucleinsäuren aus einer rohen biologischen Probe sichergestellt. Es sind verschiedene Techniken zur Extraktion von Nucleinsäuren aus biologischen Proben bekannt, wie z. B. diejenigen, die in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Arrand, Preparation of Nucleic Acid Probes in Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Hrsg. Harnes und Higgins, IRL Press, 1985, Seiten 18–30; oder in PCR Protocols, Hrsg. Innis et al., Academic Press, 1990, Kapitel 18 bis 20 beschrieben sind.
Das PCR-Verfahren wird am gebräuchlichsten als automatisiertes Verfahren mit einem thermostabilen Enzym durchgeführt. Bei diesem Verfahren wird das Reaktionsgemisch durch einen denaturierenden Temperaturbereich, einen Primerhybridisierungstemperaturbereich und einen Extensionstemperaturbereich zykliert. Ein Gerät, das spezifisch für die Verwendung mit einem thermostabilen Enzym angepasst ist, ist genauer in der EP 236 069 beschrieben und kann käuflich erworben werden.
Die LCR ist in der PCT-Patentveröffentlichung WO 89/09835 beschrieben. Das Verfahren umfasst die Verwendung von Ligase zur Verbindung von Oligonucleotidsegmenten, die an die Ziel-Nucleinsäure hybridisieren. Die LCR führt zu einer Amplifikation eines ursprünglichen Zielmoleküls und kann Millionen von Kopien einer Produkt-DNA liefern. Folglich führt die LCR zu einer Netto-Zunahme an doppelsträngiger DNA. Die vorliegenden Nachweisverfahren sind sowohl auf die LCR als auch auf die PCR anwendbar. Die LCR erfordert eine Oligonucleotidsonde zum Nachweis der erzeugten Produkt-DNA. Wenn sie in Verbindung mit den beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Amplifikationsprodukten verwendet wird, ist ein Sondenschritt nicht erforderlich und das LCR-Ergebnis ist sofort nachweisbar.
Ein weiteres Amplifikationsschema nutzt die Verwendung der Replicase von der RNA-Bakteriophage Qβ. Bei diesem Amplifikationsschema wird zunächst ein modifiziertes rekombinantes Bakteriophagengenom mit einer Sequenz, die für die Ziel-Sequenz spezifisch ist, mit der zu testenden Nucleinsäure hybridisiert. Nach der Anreicherung der Duplexe, die zwischen der Bakteriophagensonde und der Nucleinsäure in einer Probe ausgebildet worden ist, wird Qβ-Replicase zugesetzt, die nach der Erkennung des zurückgehaltenen rekombinanten Genoms mit der Erzeugung einer großen Zahl von Kopien beginnt.
Das Qβ-System erfordert keine Primersequenzen und es gibt keinen Hitzedenaturierungsschritt wie bei den PCR- und LCR-Amplifikationssystemen. Die Reaktion findet bei einer Temperatur statt, typischerweise bei 37°C. Das bevorzugte Templat ist ein Substrat für die Qβ-Replicase, Midvariant-1 RNA. Durch die Verwendung dieses Systems wird eine sehr große Zunahme der Template erreicht. Ein Überblick über dieses Amplifikationssystem findet sich in der Internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 87/06270 und in Lizardi et al., Bio/Technology 6, 1197–1202, 1988.
Das 3SR-System ist eine Variation eines in vitro-Transkriptions-basierten Amplifikationssystems. Ein Transkriptions-basiertes Amplifikationssystem (TAS) umfasst die Verwendung von Primern, die einen Promotor zur Erzeugung von DNA-Kopien eines Ziel-Strangs und zur Erzeugung von RNA-Kopien von den DNA-Kopien mit einer RNA-Polymerase kodieren, vgl. z. B. Beispiel 9B der US-PS 4,683,202 und EP 310 229 . Das 3SR-System ist ein System, bei dem drei Enzyme zur Durchführung einer isothermen Replikation von Ziel-Nucleinsäuren verwendet werden.
Das System beginnt mit einem Ziel aus einer einzelsträngigen RNA, an die ein T7 RNA-DNA-Primer gebunden wird. Durch Extension des Primers mit reverser Transkriptase wird eine cDNA gebildet und eine RNAseH-Behandlung setzt die cDNA aus dem Heteroduplex frei. Ein zweiter Primer wird an die cDNA gebunden und eine doppelsträngige cDNA wird durch eine DNA-Polymerasebehandlung (d. h. reverse Transkriptase-Behandlung) gebildet. Einer der Primer oder beide Primer kodieren einen Promotor, d. h. den Promotor für T7 RNA-Polymerase, so dass die doppelsträngige cDNA das Transkriptionstemplat für die T7-RNA-Polymerase ist.
Transkriptionskompetente cDNA's ergeben Antisense-RNA-Kopien des ursprünglichen Ziels. Die Transkripte werden dann durch die reverse Transkriptase zu Doppelstandard-cDNA umgewandelt, die doppelsträngige Promotoren enthält, und zwar gegebenenfalls an beiden Enden in einer invertierten Wiederholungsorientierung. Diese DNA's können RNA's ergeben, die wieder in den Zyklus eintreten können. Eine ausführlichere Beschreibung des 3SR-Systems findet sich in Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874–1878, 1990, und in der EP 329 822 . Das TAS-System ist auch in Gingeras et al., in Innis et al., Hrsg., PCR Protocols, Academic Press, San Diego, 1990 beschrieben.
Die hier beispielhaft dargestellten Ausführungsformen der Erfindung beschreiben das Verfahren zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäuren in Verbindung mit einer PCR. Entsprechend wird bei der Verwendung in einem Verfahren auf PCR-Basis das DNA-bindende Mittel als Mittel charakterisiert, das eine Primerhybridisierung, eine Primerextension entlang eines komplementären Templats oder eine Strangtrennung eines DNA-Duplexes nicht verhindern wird.
In dem hier beschriebenen Verfahren wird eine Probe bereitgestellt, die eine bestimmte interessierende Oligonucleotidsequenz enthält, die ”Ziel-Nucleinsäure”, oder von der vermutet wird, dass sie diese enthält. Das Ziel kann RNA oder DNA oder ein RNA/DNA-Hybrid sein. Das Ziel kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die Zielvorbereitung wird in einer Weise durchgeführt, die für das jeweilige, zu implementierende Amplifikationsverfahren geeignet ist. Beispielsweise kann in einem PCR-Verfahren, bei dem die Ziel-Nucleinsäure eine einzelsträngige DNA ist, wie z. B. mRNA, das Ziel vor der Amplifikation zunächst in cDNA revers transkribiert werden.
Verfahren zur reversen Transkription von RNA zu cDNA sind bekannt und in Maniatis et al., vorstehend, beschrieben. Alternativ werden in bevorzugten Verfahren zur reversen Transkription thermoaktive DNA-Polymerasen verwendet. Die vorliegende Beschreibung lehrt, dass interkalierende Mittel eine DNA-Polymeraseaktivität nicht verhindern. Folglich stellt das vorliegende Verfahren einen homogenen Nachweistest sowohl für RNA-Ziele als auch für DNA-Ziele bereit.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden ineinandergeschachtelte Primer verwendet (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symposium an Quantitative Biology 51, 263, 1986). Dieses Verfahren kann bevorzugt sein, wenn die Menge an Nucleinsäure in einer Probe extrem begrenzt ist, z. B. wenn archivierte, in Paraffin eingebettete Proben verwendet werden. Wenn ineinandergeschachtelte Primer verwendet werden, dann wird die Nucleinsäure zuerst mit einem äußeren Satz von Primern amplifiziert. Nach dieser Amplifikationsreaktion folgt ein zweiter Durchgang von Amplifikationszyklen unter Verwendung eines inneren Satzes von Primern. Die Beispiele VI und VII beschreiben Modifizierungen von Verfahren mit ineinandergeschachtelten Primern, die überlegene Ergebnisse liefern, ohne dass eine zusätzliche Probenhandhabung erforderlich wäre, und zwar durch die Verwendung von ineinandergeschachtelten Primern in aufeinanderfolgenden Durchgängen von Amplifikationszyklen.
Erfindungsgemäß kann die Erzeugung von Amplifikationsprodukten überwacht werden, während die Reaktion abläuft. Eine Vorrichtung zum Nachweis des Signals, das durch das bindende Mittel erzeugt worden ist, kann zum Nachweisen, Messen und Quantifizieren des Signals vor, während und nach der Amplifikation verwendet werden. Natürlich kann der spezielle Signaltyp die Auswahl eines Nachweisverfahrens vorschreiben. Beispielsweise werden in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe zur Markierung von PCR-Produkten zu verwenden. Die Farbstoffe interkalieren oder binden die doppelsträngigen PCR-Produkte und folglich nimmt die resultierende Fluo reszenz mit zunehmender Menge der doppelsträngigen DNA zu. Das Ausmaß der Fluoreszenz kann durch Messung unter Verwendung eines Spektralfluorometers mit oder ohne Öffnen des PCR-Gefäßes durchgeführt werden. Die Beispiele VII und VIII zeigen diesen Aspekt der Erfindung.
In Beispiel VIII lag die Fluoreszenz der Positivkontrollprobe gut oberhalb der Hintergrundmessungen. Da die Signalerzeugung gemessen wurde, ohne das Reaktionsröhrchen zu öffnen, ist dieses Nachweisverfahren leicht an ein automatisiertes Format anzupassen, bei dem das Signal während des Amplifikationsverfahrens überwacht wird. Beispiel VIII zeigt ein automatisiertes, Online-PCR-Nachweisverfahren: ein Faseroptikanschluss wurde zur direkten Einführung von Anregungslicht in ein PCR-Röhrchen in einem Heiz/Kühlblock verwendet. Die gleiche Faseroptik wurde zur Rückführung von Fluoreszenzemissionen zu dem Spektralfluorometer verwendet, wo der Wert ausgelesen wurde.
Bei bevorzugten Verfahren für die PCR wird die Amplifikationsreaktion als automatisiertes Verfahren durchgeführt. Bei einem gegenwärtig erhältlichen Thermocycler wird ein Heizblock verwendet, der bis zu 48 Reaktionsröhrchen halten kann. Folglich können 48 Amplifikationsreaktionen gleichzeitig durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht einen PCR-Produktnachweis in allen 48 Proben ohne Handhabung der Proben, Öffnen von Röhrchen oder Unterbrechen der Zyklierreaktion. Ein geeignetes optisches System führt das Anregungslicht von der Quelle zu dem Reaktionsröhrchen und misst das Emissionslicht von jedem Röhrchen. Beispielsweise lesen Mehrfach-Faseroptikanschlüsse gleichzeitig alle PCR-Röhrchen aus, die thermozykliert werden. Es wird jedoch nur ein einziges Fluorometer benötigt, um die Fluoreszenz von den Reaktionsröhrchen auszulesen, da jede Faseroptik schnell auf einmal z. B. während des Zeitrahmens einer PCR-Temperaturhaltephase ausgelesen werden kann. Alternativ ist es dem Fachmann klar, dass ein solches Nachweissystem nicht notwendigerweise auf ein bestimmtes Thermocyclergerät oder eine bestimmte Anzahl von Reaktionsgefäßen beschränkt ist. Die Beschreibung des 48-Well-Thermocyclers dient jedoch zur Darstellung dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung.
Solange die Reaktionwells oder -röhrchen vor Lichteinfall geschützt sind, um zu verhindern, dass externe Lichtquellen den Fluoreszenznachweis beeinflussen, ist jede Deckplatte, Röhrchenkappe oder Deckelvorrichtung geeignet, die einen Faseroptikanschluss umfasst oder an einem solchen befestigt werden kann. In der erfindungsgemäßen Ausführungsform von Beispiel VIII wurden die Deckel der Reaktionsröhrchen zur Aufnahme der Faseroptik entfernt. Die Verwendung eines Reaktionsgefäßes mit einer klaren oder durchsichtigen Kappe schließt jedoch das Erfordernis des Einsetzens des Kabels in das Röhrchen aus. Es ist of fensichtlich, dass Reaktionsröhrchen erwünscht sind, die ein Faseroptikkabel aufnehmen können, ohne dass das Kabel physisch mit den Komponenten der Amplifikationsreaktion in Kontakt kommt. In einem Spektralfluorometer, das eine Oberfläche oder ein Gefäß Heizen und Kühlen kann, ist keine optische Faser erforderlich. Die optische Faser ist nur notwendig, wenn ein Thermocycler und ein Spektralfluorometer unabhängig voneinander untergebracht sind.
Ein analoges Nachweisschema ist in einem 96-Well-Mikrotiterformat geeignet. Diese Art von Format ist häufig in klinischen Laboratorien zum Probenscreening in großem Maßstab gewünscht, z. B. für eine genetische Analyse, wie z. B. ein Screening bezüglich einer Sichelzellenanämie oder des AIDS-Virus in Blutbank-Screeningverfahren. Die vorliegende Erfindung ist für diese Art von Analyse geeignet und schließt das Erfordernis für zahlreiche Wasch- und Extraktionsverfahren aus, die bei bekannten „In-Well”-Testverfahren, wie z. B. Formaten des ELISA-Typs oder anderen Verfahren auf der Basis der optischen Dichte erforderlich sind (Kolber et al., J. of Immun. Meth. 108, 255–264, 1988; Huschtscha et al., In Vitro Cell and Dev. Biol. 25(1), 105–108, 1989; Voller et al., The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Labs, Alexandria, VA, 1979).
Die vorliegenden Nachweisverfahren ermöglichen auch eine direkte Fluoreszenzmessung unter Verwendung eines Geräts, das dem ELISA-Plattenlesegerät ähnlich, jedoch so gestaltet ist, dass es Fluoreszenz anregen und messen kann. Beispielsweise ist in einem solchen Verfahren das CytoFluor^TM 2300-Gerät geeignet, das von Millipore hergestellt wird. Zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz ist es angebracht, die Mikrotiterplatte vor und nach dem Thermozyklieren „auszulesen”. Alternativ ist eine Vorrichtung geeignet, die eine kontinuierliche Bestimmung der Fluoreszenz zur Überwachung der Zunahme an PCR-Produkt während der Amplifikationsreaktion bietet.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird nach der Amplifikation die Größe des amplifizierten Produkts ohne die Verwendung einer Sonde oder von Größenfraktionierungsverfahren wie z. B. HPLC oder Gelelektrophorese bestimmt. Die Erfindung ist besonders dafür geeignet, zu bestimmen, ob eine Amplifikation stattgefunden hat und um gleichzeitig das amplifizierte Ziel-Produkt von z. B. Primer-Dimer und hochmolekularer DNA zu unterscheiden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das nachweisbare bindende Mittel ein interkalierender Fluoreszenzfarbstoff. Das vorliegende Beispiel beschreibt, dass Ethidiumbromid in das Amplifikationsreaktionsgemisch eingebracht wird. Ethidiumbromid zeigt wie andere DNA-bindende Farbstoffe, wie z. B. Acridine, Proflavin, Acridin-Orange, Acriflavin, Fluorcumanin, Ellipticin, Daunomycin, Chloroquin, Distamycin D, Chromomycin, Homidium, Mithramycin, Rutheniumpolypyridyle und Anthramycin veränderte Fluoreszenzemissionen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind. Bei einer Amplifikationsreaktion wird aus einem Ausgangstemplat eine große Menge doppelsträngiger DNA erzeugt. Wenn dies in Gegenwart eines interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs stattfindet, dann ergibt sich folglich eine Netto-Zunahme der DNA-abhängigen Fluoreszenz. Die Zielspezifität der PCR und die Verwendung geeigneter Positiv- und Negativkontrollen stellen sicher, dass ein nachweisbarer Anstieg der Fluoreszenz aufgrund der Gegenwart der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure stattfindet.
Die vorliegende Beschreibung umfasst mehrere Beispiele, die verschiedene Aspekte des homogenen Nachweistests zeigen. Die speziellen Ausführungsformen beschreiben, dass Ethidiumbromid in der PCR in einer Konzentration von 0,53 bis 1,27 μM vorliegt, obwohl auch eine Konzentration von 0,08 μM (0,03 μg/ml) bis 40,6 μM (16 μg/ml) geeignet ist. Eine Ethidiumbromidkonzentration in dem PCR-Gemisch im Bereich von 0,15 μM (0,06 μg/ml) bis 20,3 μM (8 μg/ml) ist jedoch bevorzugt. Für den Fachmann ist es jedoch offensichtlich, wie eine geeignete Konzentration alternativer DNA-bindender Mittel durch empirische Einstellung zu bestimmen ist. Eine geeignete Konzentration des Mittels ist eine Menge, die ein Signal bereitstellt, das unterscheidbar ist, wenn in einer Amplifikationsreaktion eine Nettozunahme von doppelsträngiger DNA stattgefunden hat. Folglich kann die bevorzugte Konzentration des Mittels in dem Amplifikationsreaktionsgemisch abhängig von der Menge der doppelsträngigen nicht-Ziel-DNA (d. h. der genomischen Hintergrund-DNA), der Kopienanzahl und der Menge des Ziels, der Menge und der Fluoreszenz der Amplifikationsprimer und des speziellen verwendeten Mittels variieren. Beispielsweise kann eine Standardkurve unter Verwendung einer gekannten Menge des Ziels und Variieren der Menge der bindenden Mittel geeignet sein. Der Fluoreszenzfarbstoff wird dem PCR-Gemisch vor dem Starten des Temperaturzyklierens zugesetzt. Ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff verhindert nicht das Stattfinden einer Amplifikation. Für den Fachmann ist die Bestimmung der Eignung eines beliebigen neuen Farbstoffs in dem Verfahren klar. Das Beispiel I zeigt, dass die PCR-Amplifikation in Gegenwart nachweisbarer Mengen an Ethidiumbromid stattfindet.
Das Emissionsspektrum von Ethidiumbromid hat eine Spitze bei 650 nm für ungebundenes Ethidiumbromid und bei 611 nm, wenn das Mittel an doppelsträngige DNA gebunden ist. Da jedoch die Emissionsspektren von gebundenem und ungebundenem Ethidiumbromid unterscheidbare Peaks aufweisen, wobei gebundenes Ethidiumbromid bei einer kleineren Wellenlänge emittiert, wird die Unterscheidung zwischen gebundenem und ungebundenem Ethidi umbromid durch den Nachweis der Emission bei einer nicht-Peak-Wellenlänge verstärkt, die kleiner ist, als der Peak für gebundenes Ethidiumbromid. In der beschriebenen Ausführungsform von Beispiel VII wurde die Fluoreszenzemission der Probe bei 570 nm nachgewiesen. In Beispiel VIII wurde die Anregungswellenlänge auf 500 nm und der Emissionsnachweis auf 570 nm eingestellt.
Es ist nicht essentiell, dass der Nachweis oder die Anregungswellenlänge für die Durchführung der Erfindung optimiert wird. Beispielsweise ist in Beispiel II eine UV-Lichtbox mit einer Anregungswellenlänge bei 300 nm und einem Nachweis durch Photographie durch einen Rotfilter geeignet. Ein Spektralfluorometer bietet abhängig von den Merkmalen des jeweils verwendeten Geräts die Möglichkeit, die Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie die Bandbreite einzustellen. Dem Fachmann ist klar, wie die Wellenlängen- und Bandbreiteneinstellungen für ein spezielles nachzuweisendes DNA-bindendes Mittel bestimmt werden können. Obwohl jedes Mittel ein diskretes Fluoreszenzspektrum aufweist, ist zur Durchführung der Erfindung folglich ein breiter Bereich von Nachweiswellenlängen geeignet, wie es hier beispielhaft dargestellt ist. Allgemeine Anweisungen finden sich z. B. in The Merck Index, Hrsg. Budavari et al., Merck Co., Inc., Rahway, NJ, 1989, worin bei jedem Eintrag Peakemissionswellenlängen für bestimmte Fluoreszenzmittel beschrieben sind, die an helikale DNA gebunden sind oder nicht. Entsprechend ist der Katalog von Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, 1990 von Haugland eine geeignete Literatur, die DNA-bindende Mittel beschreibt, welche in der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Im Allgemeinen ist es bevorzugt, jedoch nicht essentiell, dass die DNA-Polymerase dem PCR-Reaktionsgemisch zugesetzt wird, nachdem sowohl der Primer als auch das Templat zugegeben worden sind. Alternativ werden z. B. das Enzym und der Primer zuletzt zugegeben oder der PCR-Puffer oder das Templat plus Puffer werden zuletzt zugegeben. Es ist im Allgemeinen erwünscht, dass mindestens eine Komponente, die für die Polymerisation essentiell ist, bis zu dem Zeitpunkt, bei dem sowohl der Primer als auch das Enzym vorliegen, nicht vorliegt, und das Enzym kann an das Primer/Templat-Substrat binden und dieses verlängern.
Verfahren zur Verminderung der Effekte der gegenseitigen Verunreinigung von Amplifikationsreaktionen erfordern die Einführung unkonventioneller Basen in das amplifizierte Produkt und das Aussetzen des verschleppten Materials gegenüber einer enzymatischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung, die das Produkt als Templat für nachfolgende Amplifikationen ungeeignet macht. Der hier beschriebene homogene Nachweistest ist im Zusammenhang mit Sterilisationsverfahren geeignet. Diese Verfahren verbessern die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Amplifikationsergebnissen durch Elimination von Schritten und minimieren dadurch die Handhabung des Produkts, was ein Verschleppen vermindert. Das Sterilisationsverfahren bietet die zusätzliche Sicherheit, dass das verschleppte Templat eliminiert wird.
Vorzugsweise ist das DNA-bindende Mittel lagerstabil und kann als Komponente in einen PCR-Reagenzpuffer einbezogen werden. Folglich stellt die Erfindung neue Reagenzien bereit, die für die Kommerzialisierung in einem Kit-Format geeignet sind. Ein solches Reagenz kann eine Lösung des DNA-bindenden Mittels in einem Kit zum Nachweis von Nucleinsäuren durch PCR enthalten. Alternativ könnte das Reagenz ein DNA-bindendes Mittel sowie andere PCR-Pufferkomponenten wie z. B. Tris-HCl, KCl und MgCl₂ jeweils in geeigneten Konzentrationen zur Durchführung einer PCR enthalten. In einer Ausführungsform umfasst der Kit einen Puffer, der Ethidiumbromid in einer Konzentration enthält, die geeignet ist, in einer Amplifikationsreaktion eine Ethidiumbromid-Endkonzentration im Bereich von 0,15 μM bis 20,3 μM bereitzustellen. Der Puffer kann zusätzlich beliebige oder alle der nachstehenden Reagenzien enthalten: Tris-HCl, pH 8,0 bis 8,3; KCl und MgCl₂ jeweils in geeigneten Konzentrationen für die PCR-Amplifikation. Es ist vorgesehen, dass Kits zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäuren auch beliebige der folgenden Mittel umfassen: ein Polymerisationsmittel, dNTP's, geeignete Primer und ein Positivkontrolltemplat.
Die US-PS 4,683,202 beschreibt Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Primern für die PCR, die nicht-komplementäre Sequenzen aufweisen, die dem 5'-Ende hinzugefügt worden sind. Diese „Enden” sind zur Konstruktion spezieller Restriktionsstellen oder für andere Zwecke geeignet, da während der PCR die nicht-komplementäre Endsequenz in das doppelsträngige PCR-Produkt eingebaut wird. Spezielle Endsequenzen stellen bindende Ziele für spezifische Farbstoffe bereit. Beispielsweise bindet Hoechst 33258 (Searle und Embrey, Nuc. Acids Res. 18, 3753–3762, 1990) vorzugsweise A-T-Basenpaare. Ein PCR-Primer, der mit einem langen, A-T-reichen 5'-Ende synthetisiert worden ist, stellt im Vergleich zu genomischer DNA ein relativ A-T-reiches PCR-Produkt bereit. Unter Verwendung von Hoechst 33358 weist das A-T-reiche PCR-Produkt bezüglich der genomischen DNA eine erhöhte Fluoreszenz auf und folglich ist es für die Erhöhung der Signalstärke in Gegenwart genomischer DNA geeignet.
Entsprechend bildet DAPI einen fluoreszierenden Komplex mit A-T-reicher DNA (Kapuseinski & Szer, Nuc. Acids Res. 6(112), 3519, 1979). Im Gegensatz dazu bildet Actinomycin D einen fluoreszierenden Komplex mit G-C-reicher DNA (Jain und Sobell, J. Mol. Biol. 68, 21, 1972). Folglich ist die vorliegende Erfindung zur Überwachung der Menge zweier unter schiedlicher Ziel-Nucleinsäuren in einem Reaktionsgefäß geeignet, und zwar durch Einbringen von zwei Fluorochromen in das Reaktionsgemisch während der Amplifikation. Es ist lediglich erforderlich, dass ein Fluorochrom eine Sequenzspezifität aufweist und dass die Sequenz in dem Ende (d. h. dem 5'-Ende) eines Primers für eine der beiden Ziel-Nucleinsäuren enthalten ist. Die Emissionsspektren für jedes Fluorochrom werden während und/oder nach der Amplifikation durch ein Spektralfluorometer separat bestimmt. Folglich ist die Erfindung besonders für quantitative Vergleiche von zwei verschiedenen Nucleinsäurezielen in der gleichen Probe geeignet und sie kann als solche zur Bestimmung des Ausmaßes beispielsweise einer Infektion oder einer Krankheit geeignet sein, wenn eines der beiden Ziele eine Sequenz ist, die in allen Zellen vorliegt und das andere Ziel in einem Pathogen vorliegt.
Entsprechende Mittel mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften erlauben Multiplex-PCR-Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele in einer Probe ohne das Reaktionsgefäß jemals zu öffnen, sobald die Amplifikationsreaktion gestartet worden ist. Fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe können jeweils verschiedene Emissions- und Anregungsspektren aufweisen. Im klinischen Bereich sind unterschiedliche DNA-bindende Farbstoffe mit unterschiedlichen DNA-Sequenzspezifitäten zur Anzeige der Gegenwart unterschiedlicher Ziele geeignet.
Die vorliegende Erfindung ist in Verbindung mit Verfahren geeignet, bei denen ein interner Standard zur Bestimmung entweder der relativen Menge eines Ziels oder zur genauen Quantifizierung der Menge des Ziels verwendet wird, die vor der Amplifikation vorliegt.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Bestimmung der Intaktheit einer DNA-Probe bereit. Beispielsweise umfassen forensische Analysen häufig Proben, die ein teilweise abgebautes Ziel enthalten, wie z. B. eine archivierte Probe. Die Fähigkeit zur Überwachung der Erzeugung eines PCR-Produkts, die in Beispiel VIII gezeigt ist, ermöglicht einen Vergleich des Amplifikationsprofils einer DNA-Probe bezüglich eines kleinen PCR-Produkts und eines großen PCR-Produkts in getrennten Reaktionen. Wenn kein Abbau stattfindet, zeigt die Überwachung der Zunahme an doppelsträngiger DNA, dass beide Reaktionen ihren Höhepunkt etwa in dem gleichen Zyklus erreichen. Wenn ein Abbau stattfindet, würde das kleine Produkt aufgrund der Gegenwart von mehr intakten Zielmolekülen den Höhepunkt schneller erreichen als das große Fragment.
Dem Fachmann ist klar, dass der hier bereitgestellte homogene Nachweistest für viele verschiedene Anwendungen geeignet ist, einschließlich z. B. für das genetische Screening, die forensische Identifikation von Menschen, den Pathogennachweis und die Pathogenquantifi zierung, die Umweltüberwachung oder das Markieren und Verfolgen von Materialien mit Nucleinsäure.
In einer Ausführungsform ist das nachweisbare Signal eine Fluoreszenz. Eine Fluoreszenz ist zur Verwendung sowohl in qualitativen als auch quantitativen Verfahren geeignet. Ein qualitativer Nachweis kann einfach und schnell durch visuelle Prüfung der Reaktionsröhrchen durch Aussetzen gegenüber UV-Licht durchgeführt werden. Diese Art eines schnellen hochempfindlichen Tests ist als schnelles Screening bezüglich der Gegenwart eines Pathogens oder einer bestimmten Gensequenz erwünscht, die für einen Krankheitszustand ursächlich ist oder damit zusammenhängt. Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur Senkung von Kosten durch ein plus/minus-Vorscreening bezüglich der Gegenwart eines beliebigen Mitglieds einer Gruppe von Zielen bereit. Amplifikationen für viele verschiedene solcher Ziele würden dies ermöglichen, falls erwartet werden kann, dass die meisten Proben negativ sind, z. B. bei Nachweissystemen für die Umweltüberwachung hinsichtlich Pathogenen. Die Multiplex-PCR ist ein Verfahren zum Einbringen einer Anzahl unterschiedlicher Primerpaare in eine Amplifikationsreaktion (Gibbs et al., in PCR Technology, Hrsg. Ehrlich, Stockton Press, NY, 1989). Einem homogenen Nachweistest unter Verwendung von mehreren Primerpaaren zum Testen eines breiten Bereichs potentieller Ziele folgen dann komplexere Typisierungsverfahren nur bei positiven Proben. Dieses Vorscreening spart die Kosten für die Durchführung des komplexeren Typisierungsverfahrens bei negativen Proben und/oder für die Durchführung wiederholter Tests bei negativen Proben.
Die vorliegenden Verfahren zum homogenen Nachweis von Zielnucleinsäuren sind auch zur Quantifizierung eines speziellen Ziels geeignet. Unabhängig davon, ob die Verfahren automatisiert oder manuell durchgeführt werden, kann die Quantifizierung mit einer Anzahl von Mitteln erreicht werden. Beispielsweise stellt eine Verdünnungsreihe der Probe parallel zu einer Verdünnungsreihe eines bekannten Standards eine Reihe von Templaten bereit, die nach der PCR und dem Signalnachweis zur Quantifizierung der Menge an Ausgangsmaterial in der bekannten Probe geeignet sind. Entsprechend können die exponentielle Phase der PCR und des Zyklus, bei dem die Produktkonzentration die Phase des Höhepunkts erreicht, einfach bestimmt werden, da die Fluoreszenz zwischen den Zyklen während des Ablaufs einer PCR bestimmt werden kann. Je mehr Ziel-DNA zu Beginn der PCR vorliegt, desto früher erreicht die Reaktion ihren Höhepunkt, d. h. den Punkt, bei dem sich die Geschwindigkeit der Produktansammlung zu vermindern beginnt. Da die Anzahl der Zyklen, die erforderlich ist, um den Höhepunkt zu erreichen, direkt mit der Menge des Ziels zusammenhängt, das in der Probe vorliegt, dient die Überwachung der Fluoreszenz während der ablaufenden PCR zur Quantifizierung kleiner DNA-Mengen.
Die Erfindung ist zum Nachweis amplifizierter Nucleinsäuren in Gegenwart von doppelsträngiger genomischer DNA geeignet. Hintergrundkonzentrationen von DNA in einer Höhe von 0,5 g oder mehr werden ein positives Testergebnis nicht unklar machen. Die Ziel-Nucleinsäure kann ein kloniertes Segment, eine Wiederholungssequenz, wie z. B. ein Gen mit hoher Kopienzahl oder eine Tandemwiederholung, ein Einzelkopiegen oder ein infektiöses Mittel sein, das in einer niedrigen Konzentration vorliegt, wie z. B. mit einer Kopie pro 70000 Zellen. Das Ausgangstemplat ist RNA oder DNA, da die PCR ausgehend von jeder Templatnucleinsäure eine Nettozunahme der doppelsträngigen Nucleinsäure bereitstellt.
Die Ziel-Nucleinsäure kann eine seltene Sequenz sein, wie z. B. eine Einzelkopie von AIDS-Virus-DNA in einem Hintergrund menschlicher genomischer DNA von mehr als 70000 Zellen. In einem solchen Fall dienen Verfahren zur Erhöhung der Spezifität dazu, sicherzustellen, dass die Amplifikation nur als Antwort auf die Gegenwart der Zielsequenz eine Nettozunahme an doppelsträngiger DNA liefert, und dass die Nettozunahme in Gegenwart eines starken Hintergrunds an genomischer DNA nachweisbar ist. Die US-PS 4,683,195 zeigt die Verwendung ineinandergeschachtelter Primer zur Verminderung des Hintergrunds bei der Amplifikation von Einzelkopiegenen.
Das Verfahren zur ineinandergeschachtelten Amplifikation in der US-PS 4,683,195 erfordert ein erstes Primerpaar zur Amplifikation einer Zielsequenz und ein zweites Primerpaar zur Amplifikation eines Untersegments des PCR-Produkts, das in der ersten Amplifikationsreaktion gebildet worden ist. Nach der ersten PCR wird das Reaktionsgemisch 10-fach verdünnt, um die Konzentration des ersten Primerpaars zu vermindern und das zweite Primerpaar wird in das Reaktionsgemisch eingebracht. Da jedoch ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung in dem Ausschluss von Schritten besteht, sind die zusätzlichen Schritte des Stoppens einer Amplifikationsreaktion zur Verdünnung der Probe und der Zugabe eines zweiten Primers nicht erwünscht.
Um dieses Problem zu lösen, werden modifizierte ineinandergeschachtelte Amplifikationsverfahren bereitgestellt. Die vorliegenden ineinandergeschachtelten Primerverfahren sind gegenüber bekannten ineinandergeschachtelten Primerverfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren sehr stark verbessert. Diese Verfahren bieten eine verstärkte Spezifität und sind in einem beliebigen Amplifikationsschema auf PCR-Basis anwendbar. In der vorliegenden Beschreibung werden diese Verfahren jedoch beschrieben, wie sie in einem homogenen Test verwendet werden.
In einem modifizierten ineinandergeschachtelten Primerverfahren wird ein dritter Primer, der innerhalb eines flankierenden Paars von PCR-Primern liegt, zur Amplifikation eines speziellen Zielsegments in eine PCR-Reaktion eingebracht. Der dritte Primer weist bei der Hybridisierung an seinen komplementären Ziel-Strang eine Hybridisierungs/Schmelztemperatur auf, die niedriger ist, als diejenige des flankierenden Primers. Diese Eigenschaft kann dem Primer durch eine geringere Länge und/oder einen niedrigeren G-C-Gehalt verliehen werden. Für die ersten 15 bis 20 PCR-Zyklen wird die Temperatur während der Extensionsphase jedes PCR-Zyklus ausreichend hoch gehalten, d. h. bei etwa 65°C, um zu verhindern, dass der kurze Primer spezifisch hybridisiert und eine Amplifikation startet. Die flankierenden Primer hybridisieren in ausreichender Weise, so dass die PCR bei der hohen Extensionstemperatur normal abläuft. Der Primer, der den dritten Primer flankiert, liegt jedoch in einer niedrigen Konzentration vor. Bei dem Verfahren wird vor dem Amplifikationshöhepunkt dann, wenn der Vorrat an begrenzendem Primer nahezu verbraucht ist, die Hybridisierungstemperatur auf etwa 42°C abgesenkt. Sei dieser Temperatur tritt der dritte Primer „in Aktion” und setzt die Hybridisierung des Ziels für die verbleibenden etwa 15 Zyklen fort.
In einem alternativen Verfahren für die ineinandergeschachtelte Primeramplifikation wird das Erfordernis einer niedrigen Konzentration eines Primers ausgeschlossen. Der flankierende Primer wird mit einem G-C-reichen Ende synthetisiert. Da die nicht-komplementäre Primerendsequenz nach zwei Amplifikationszyklen in das PCR-Produkt eingebracht wird, dient das G-C-Ende zur Erhöhung der Temperatur, die erforderlich ist, um das PCR-Produkt zu denaturieren, und zwar aufgrund der erhöhten Thermostabilität von G-C-Paaren gegenüber A-T-Paaren (Myers et al., in PCR Technology, Hrsg. Erlich, Stockton Press, New York, 1989). Der resultierende Unterschied bei der Denaturierungstemperatur zwischen dem ineinandergeschachtelten und dem flankierenden PCR-Produkt wird dann genutzt, um die Amplifikation von dem am Ende angeordneten flankierenden Primer zu beenden. Sobald ein PCR-Produkt von den flankierenden Primern hergestellt worden ist, wird die Denaturierungstemperatur abgesenkt, d. h. von 96°C auf 86°C, so dass die Temperatur für eine Amplifikation des flankierenden PCR-Produkts zu niedrig, jedoch zum Zulassen einer Amplifikation des ineinandergeschachtelten PCR-Produkts hoch genug ist. Die Hybridisierungstemperatur kann auch manipuliert werden, wie bei dem „in Aktion”-Verfahren, um gegebenenfalls die Synthese von dem ineinandergeschachtelten Primer zu starten.
Für den Fachmann ist es klar, wie die geeigneten Denaturierungs- und Hybridisierungstemperaturen bestimmt werden und wie ein Thermocycler entsprechend programmiert wird. Dieses „in Aktions-Primer”-Verfahren stellt ein Mittel zum Einbringen hoher Konzentrationen des flankierenden Primers zum Aufrechterhalten der PCR-Effizienz bereit und ermöglicht es, dass die Amplifikation, die durch diesen Primer gestartet worden ist, gegebenenfalls während der Reaktion beendet wird. Dieses spezielle Verfahren zur ineinandergeschachtelten Primeramplifikation ist in den Beispielen VI und VII gezeigt.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung verschiedener Aspekte der vorliegenden Erfindung. Die verwendeten Primersequenzen sind am Ende des Beispiels VIII angegeben.
Beispiel I
Dieses Beispiel zeigt das Vermögen einer PCR, in Gegenwart von Ethidiumbromid abzulaufen.
Zwei PCR's wurden folgendermaßen durchgeführt. Jeweils 100 μl PCR enthielten: 50 ng menschliche DNA, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, jeweils 250 μM dNTP, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus Instruments, Norwalk Conneticut), 20 pmol jedes Primers GH26 (SEQ ID NO: 1) und GH27 (SEQ ID NO: 2). Die menschliche DNA wurde aus einer menschlichen B-Zelllinie isoliert. Die DNA wurde gemäß dem von Maniatis (vorstehend) beschriebenen Verfahren hergestellt. Auf jede Reaktion wurde eine Öldeckschicht aufgebracht, um eine Verdampfung zu verhindern.
Die beiden PCR's wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, jedoch enthielt eine Reaktion 0,51 μM Ethidiumbromid (Sigma). Ein von Perkin-Elmer Cetus Instruments erworbener Thermocycler wurde mit den folgenden Zyklierungsparametern programmiert: Denaturieren bei 96°C, Halten für 1 min, Hybridisieren bei 55°C, Halten für 1 min, Verlängern bei 72°C, Halten für 1 min. Dieses Profil wurde für 32 Zyklen wiederholt. Nach der Amplifikation wurden 5 μl jeder PCR durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 3% NuSieve-Agarosegels (FMC) analysiert. Das Gel wurde durch Standardverfahren mit Ethidiumbromid gefärbt und die in den beiden Reaktionen hergestellte Menge an PCR-Produkt wurde verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Menge der amplifizierten DNA, die in Gegenwart von Ethidiumbromid erzeugt wurde, nicht von der Menge des PCR-Produkts unterscheidbar war, die in Abwesenheit des Farbstoffs erzeugt wurde. Darüber hinaus war die Spezifität der PCR, die durch das Vermögen zur Erzeugung von DNA-Fragmenten mit der erwarteten Größe gemessen wurde, unverändert.
Beispiel II
Dieses Beispiel zeigt, dass die Spezifität der PCR für den homogenen Nachweis von Ziel-Nucleinsäuren auf Fluoreszenzbasis ausreichend ist. Das in Beispiel I beschriebene Experiment wurde erweitert, um zu bestimmen, ob die Ziel-spezifische Ethidiumbromid-Fluoreszenz unter Verwendung von Standard-PCR-Bedingungen leicht sichtbar ist. Daher wurden fünf 100 μl-Reaktionsgemische hergestellt, die 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 1,27 μM Ethidiumbromid, jeweils 150 μM dNTP und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase enthielten. Primer und Ziel-DNA wurden zugesetzt, wie es nachstehend beschrieben ist. Das Primerpaar GH15 (SEQ ID NO: 3) und GH16 (SEQ ID NO: 4) sind für die Amplifikation von DQα spezifisch und amplifizieren die DRβ1-Ziel-DNA nicht. Die DQα-Ziel-DNA wurde durch Amplifikation des menschlichen DQα-Gens hergestellt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Nach der Amplifikation wurde das DQα-PCR-Produkt verdünnt, um etwa 2 × 10⁷ Kopien (5 pg) amplifizierter DNA pro Amplifikation bereitzustellen. Das DQα-Produkt wurde als Positivkontrolle verwendet. Die DRβ1-Ziel-DNA wurde unter Verwendung des Primerpaars GH46 (SEQ ID NO: 5) und GH50 (SEQ ID NO: 6) zur Amplifikation des DRβ1-Gens in einer PCR unter Verwendung menschlicher genomischer DNA hergestellt. Das PCR-Produkt wurde verdünnt, um etwa 2 × 10⁷ Kopien DRβ1-DNA bereitzustellen und wurde in der nachstehenden Reaktion 4 als Negativkontrolle eingesetzt. Die fünf Reaktionsgemische enthielten Primer und Ziel gemäß den nachstehenden Angaben:
Reaktion 1 – keine Primer + DQα-Ziel
Reaktion 2 – Primer + DQα-Ziel
Reaktion 3 – Primer + DQα-Ziel
Reaktion 4 – Primer + DRβ1-Ziel
Reaktion 5 – Primer + kein Ziel
Wenn Primer eingebracht wurden, dann wurden jeweils 10 pmol GH15 (SEQ ID NO: 3) und GH16 (SEQ ID NO: 4) zugesetzt. Die Reaktionsgemische 1 und 2 wurden keinen Amplifikationszyklen unterworfen. Die Reaktionen 3, 4 und 5 wurden 20 Amplifikationszyklen unterworfen. Die Zyklierungsparameter waren 94°C, Halten für 1 min, 45°C, Halten für 1 min und 72°C, Halten für 1 min.
Die Reaktionsröhrchen wurden dann in einer UV-Lichtbox (300 nm) platziert und für zwei Sekunden und eine halbe Sekunde belichtet. Die in 1 angegebenen Ergebnisse zeigten die erhöhte Fluoreszenz in der Reaktion 3 aufgrund der Amplifikation der spezifischen Ziel- DNA. Die Reaktionen 1 und 2 zeigten das Ausmaß der Fluoreszenz, das vorlag, bevor eine Amplifikation stattfand. Die Reaktionen 4 und 5 zeigten, dass die Fluoreszenz in einer Reaktion nicht sichtbar zunahm, solange für das spezielle, in der Reaktion vorliegende Primerpaar kein geeignetes Templat vorlag. Die verschiedenen photographischen Belichtungen, wie sie in 1 gezeigt sind, zeigen die relativen Fluoreszenzunterschiede.
Beispiel III
Es wurde das Vermögen des vorliegenden homogenen Testverfahrens zum Nachweis eines spezifischen Ziels in Gegenwart einer nicht-Ziel-doppelsträngigen DNA getestet. Dieses Beispiel zeigt den Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz in einem Hintergrund von genomischer DNA. Zwanzig 100 μl-PCR-Gemische wurden folgendermaßen hergestellt: Jedes Gemisch enthielt 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2,9 Einheiten Taq-Polymerase, jeweils 180 μM dNTP, 1,27 μM Ethidiumbromid 15 pmol RH191 (SEQ ID NO: 7) und 15 pmol RH192 (SEQ ID NO: 8). Die Primer RH191 (SEQ ID NO: 7) und RH192 (SEQ ID NO: 8) sind von den Primern y1.1 und y1.2 abgeleitet, die in Kogan et al., N. Engl. J. Med. 317, 985–990, 1987 beschrieben sind. Diese Primer sind spezifisch für eine menschliche Männer-spezifische Sequenz, die pro menschlicher männlicher Zelle in mehreren tausend Kopien vorkommt. Es wurden fünfzehn PCR-Reaktionsgemische hergestellt, wie es nachstehend angegeben ist. Die Proben-DNA wurde aus menschlichem Blut hergestellt, das von einem Mann oder einer Frau entnommen wurde, wie es für jede Reaktion angegeben ist. Die DNA wurde gemäß Maniatis (vorstehend) hergestellt.
Reaktionen 1–5 enthielten 2 ng menschlicher männlicher DNA
Reaktionen 6–10 enthielten keine DNA
Reaktionen 11–15 enthielten 60 ng menschlicher weiblicher DNA
Reaktionen 16–20 enthielten 60 ng menschlicher männlicher DNA
Alle Reaktionen wurden in einen Perkin-Elmer Cetus Instruments Thermocycler eingebracht, der für eine Zyklierung bei 94°C für 1 min und bei 60°C für 1 min für die angegebene Anzahl von Zyklen programmiert wurde. Wie es nachstehend angegeben ist, wurden die Röhrchen bei verschiedenen Zyklen aus dem Thermocycler entfernt, um einen PCR-Zeitverlauf für jedes Templat bereitzustellen. Insbesondere wurden für jeden Satz von 5 Röhrchen 0, 17, 21, 25 und 29 Amplifikationszyklen durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde durch Aussetzen der Röhrchen gegenüber UV-Licht nachgewiesen, wie es vorstehend beschrieben worden ist.
Bei einer Photographie und einer visuellen Prüfung zeigten die Röhrchen 6–15 keine Zunahme der Fluoreszenz. Die Röhrchen 1 und 2, die männlichen DNA-Proben bei den Zyklen 0 und 17, zeigten bei einem visuellen Nachweis auch keine Zunahme der Fluoreszenz. Nur die Zyklen 21, 25 und 29 der männlichen DNA-Proben fluoreszierten unter UV-Licht und das Ausmaß der Fluoreszenz nahm mit zunehmender Zykluszahl zu. Die Ergebnisse bei den Röhrchen 16–20 waren ähnlich, jedoch wurde bei 17 Zyklen eine erhöhte Fluoreszenz festgestellt. Dies ist mit der Gegenwart von mehr Kopien der Ziel-DNA-Sequenz konsistent, die vor der Amplifikation in der Probe vorliegen.
Beispiel IV
Zur quantitativen Messung der Ziel-spezifischen Ethidiumbromid-Fluoreszenz wurden die Reaktionen von Beispiel III geöffnet und der jeweilige Inhalt wurde in ein Spektralfluorometer überführt (SPEX Fluorolog-2, erworben von SPEX, Edison, NJ), das zur Bestimmung eines quantitativen Fluoreszenzwerts für jede Reaktion verwendet wurde. Die in 2 gezeigten Ergebnisse zeigen nicht nur die Zielspezifität des Nachweisverfahrens, sondern veranschaulichen auch die quantitativen Aspekte der Erfindung. Der Effekt eines in erhöhter Konzentration in der Probe vorliegenden Ziels kann durch einen Vergleich des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenz zwischen den 2 ng und 60 ng männlichen Templaten beobachtet werden. Je mehr Ziel-DNA sich in der Probe befindet, desto früher erreicht die Reaktion eine messbare Zunahme der Fluoreszenz und erreicht schließlich einen Fluoreszenz-Höhepunkt. Genau dann, wenn die Fluoreszenz messbar abzunehmen beginnt, liegt ein quantitatives Maß dafür vor, wie viel des Ziels vor der Amplifikation vorhanden war.
Beispiel V
Dieses Beispiel zeigt die Eignung des homogenen Tests nicht nur zum Nachweis eines Einzelkopiegens in der gesamten menschlichen genomischen DNA, sondern auch zur Unterscheidung zwischen zwei Allelen dieses in der Probe vorliegenden Einzelkopiegens, die sich um ein einzelnes Nucleotid unterscheiden (Verfahren zum Allel-spezifischen Nachweis sind detailliert in der europäischen Patentveröffentlichung 237 362 beschrieben, die in diese Beschreibung einbezogen ist).
Das spezielle Gen, das nachgewiesen werden soll, ist das β-Globin-Gen. Eine einzige Basenpaaränderung mutiert ein Wildtyp-β-Globinallel zu einem Sichelzellenallel. In diesem Beispiel wurden die folgenden Primer verwendet: RH187 (SEQ ID NO: 9), RH188 (SEQ ID NO: 10) und RH189 (SEQ ID NO: 11). Das Primerpaar RH187/RH188 (SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10) amplifizierte spezifisch das Wildtyp-Allel. Das Primerpaar RH187/RH189 (SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 11) amplifizierte spezifisch das Sichelzellenallel (diese Primer leiten sich von BGP2, Hβ14A und Hβ14S ab, die in Wu et al., PNAS (USA) 86, 2757–2760, 1989, beschrieben sind). Sechs PCR's wurden folgendermaßen hergestellt: 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 748 μM Gesamt-dNTP's, 2,9 Einheiten Taq-Polymerase, 10 pmol jedes Primers, 1,5 μM MgCl₂, 1,27 μM Ethidiumbromid und 50 ng menschliches DNA-Templat wie folgt: Ein Paar von Reaktionen enthielt menschliche DNA, die für das Sichelallel homozygot war (SS); ein Paar von Reaktionen enthielt Wildtyp-DNA (AA) und ein Paar enthielt heterozygote DNA, d. h. ein Wildtyp- und ein Sichelzellenallel (AS).
Für jedes Paar von Reaktionen enthielt ein Röhrchen Primer, die für das Sichelglobinallel spezifisch waren, und ein Röhrchen enthielt Primer für die Wildtyp-Sequenz. Der einzige Unterschied zwischen den Primersätzen sind die 3'-Nucleotide eines der Primerpaare, die entweder mit der Sichelzellen-Zielsequenz oder der Wildtyp-Zielsequenz zusammenpassen. Die Primerhybridisierungstemperatur während der PCR wird so eingestellt, dass die Amplifikation nur dann stattfindet, wenn dieses 3'-Nucleotid mit dem Templat zusammenpasst. Die Zyklierungsparameter waren: 94°C für 60 Sekunden und 55°C für 60 Sekunden.
Die Reaktion wurde dreifach durchgeführt und nach 30 Zyklen der PCR wurden die Röhrchen auf einer UV-Lichtquelle platziert und photographiert. Die Photographien sind in 3 gezeigt. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Sichel-β-Globin-Primer Wildtyp-Primer

Homozygot AA – +

Heterozygot AS + +

Homozygot SS + –
Ein ”+” zeigt an, dass die Fluoreszenz unter dem UV-Licht leicht sichtbar war und dass dann, wenn die Röhrchen auf einem Spektralfluorometer gemessen wurden, die ”+”-Röhrchen eine etwa um das dreifache höhere Fluoreszenz aufwiesen als die ”–”-Reaktionen. Bei den mit markierten PCR's änderte sich die Fluoreszenz als Folge der Amplifikationsreaktion nicht signifikant.
Aliquots jeder Reaktion wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Jede ”+”-Reaktion zeigte ein spezifisches diskretes DNA-Fragment. Die ”–”-Reaktionen zeigten bei der Gelanalyse kein solches DNA-Fragment.
Beispiel VI
Es wurde ein Nachweistest entworfen, um die Eignung der vorliegenden Erfindung zum Nachweis einer seltenen Zielsequenz in einem Hintergrund von DNA von etwa 70000 menschlichen Zellen zu zeigen. Ein modifiziertes ineinandergeschachteltes Primerverfahren, das vorstehend kurz als Primer-„in Aktion”-Verfahren beschrieben worden ist, wurde entworfen, um die PCR-Spezifität zu erhöhen. Dieser Test wurde folgendermaßen durchgeführt: In PCR-Reaktionsgefäße 1 bis 8 wurden Aliquots von 50 μl Lösung, die jeweils 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl₂, 600 μM Gesamt-dNTP's, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (PECI), 1,27 μM Ethidiumbromid, 0,5 μg menschlischer Zelllinien-DNA, das Primerpaar RH171 (SEQ ID NO: 12) und RH176 (SEQ ID NO: 13) mit einer Konzentration jedes Primers von 0,2 μM und den ineinandergeschachtelten Primer RH182 (SEQ ID NO: 13) ebenfalls in einer Konzentration von 0,2 μM enthielt, eingebracht. Zur Abdeckung der acht Lösungen wurde ein Tropfen Mineralöl verwendet, um eine Verdampfung zu verhindern. Der Primer RH176 (SEQ ID NO: 13) trägt ein G-C-reiches, nicht-homologes (zu der Zielsequenz) 5'-Ende, das die Denaturierungstemperatur erhöht, die zur Amplifikation eines PCR-Produkts erforderlich ist, das unter Verwendung dieses Primers hergestellt wird.
Die Reaktionen 1 bis 4 wurden mit Lösungen durchgeführt, die sich bei Raumtemperatur befanden und die drei Primer enthielten, bevor mit dem Temperaturzyklieren begonnen wurde. Die Reaktionen 5 bis 8 wurden so durchgeführt, dass die Zugabe der drei Primer so lange verschoben wurde, bis diese Reaktionen bei einer Temperatur von 72°C äquilibriert waren, bevor mit dem Thermozyklieren begonnen wurde. Aus diesem Grund werden die Reaktionen 5 bis 8 so bezeichnet, dass sie einem „Heißstart” unterworfen wurden. Die Reaktionen 2 bis 4 und 6 bis 8 enthielten auch ein Ziel, eine Positivkontroll-DNA (von PECI erworben), die HIV-Sequenzen enthielt, zu denen RH171 (SEQ ID NO: 12), RH176 (SEQ ID NO: 13) und der 3'-Abschnitt von RH182 (SEQ ID NO: 14) homolog waren. Diese DNA wurde so verdünnt, dass jede Reaktion, die sie enthielt, durchschnittlich vier Kopien der HIV-Sequenz aufwies. Da diese durchschnittliche Anzahl von Kopien gering ist, kann die tatsächliche Anzahl von Kopien in einer gegebenen Reaktion beträchtlich variieren. Da den Reaktionen 1 und 5 kein HIV-DNA-Ziel zugesetzt worden ist, dienten diese Reaktionen als Negativkontrollen.
Alle acht Reaktionen wurden wie folgt thermozykliert: Denaturieren bei 96°C, Halten für 1 min, Hybridisieren bei 64°C, Halten für 1 min. Dieses Profil wurde für 29 Zyklen wiederholt, währenddessen das flankierende Primerpaar, RH171 (SEQ ID NO: 12) und RH176 (SEQ ID NO: 13) effizient hybridisierte und bei der Amplifikation eingesetzt wurde, während der ineinandergeschachtelte Primer RH182 (SEQ ID NO: 14), der bei 64°C nicht effizient hybridisiert, nicht bei der effizienten Amplifikation eingesetzt wurde. Darauf wurde bei 96°C denaturiert, 1 min gehalten, bei 52°C hybridisiert und 1 min gehalten. Dieses Profil wurde für 2 Zyklen wiederholt, währenddessen alle drei Primer effizient hybridisierten und bei der Amplifikation verlängert wurden, so dass Produkte entweder unter Verwendung von RH171 (SEQ ID NO:12) und RH176 (SEQ ID NO:13) oder RH171 (SEQ ID NO:12) und RH182 (SEQ ID NO: 14) hergestellt wurden. Da die Verwendung eines dritten, ineinandergeschachtelten Primers die Produktspezifität erhöht, war es wahrscheinlicher, dass Produkte, die unter Verwendung von RH171 (SEQ ID NO: 12) und RH182 (SEQ ID NO: 14) hergestellt worden sind, HIV-spezifisch sind. Nach diesen Zyklen wurde bei 86°C denaturiert, 1 min gehalten, bei 52°C hybridisiert und 1 min gehalten. Dieses Profil wurde 18 mal wiederholt, währenddessen Produkte, die den GC-reichen Primer RH176 (SEQ ID NO: 13) enthielten, und zwar sowohl HIV-spezifisch als auch unspezifisch, bei 86°C nicht effizient denaturierten und daher nicht effizient amplifizierten, während die amplifizierten HIV-Sequenzen, die unter Verwendung des ineinandergeschachtelten Primers RH182 (SEQ ID NO: 14) und RH171 (SEQ ID NO: 12) hergestellt worden sind, effizient denaturierten und amplifizierten.
Alle acht Reaktionen wurden nach ihrem Abschluss durch Gelelektrophorese analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Reaktionen 2–4 und 5–8 ein Produkt mit der erwarteten Größe (etwa 200 bp) als vorherrschende Bande auf dem Gel enthielten. Die Reaktionen 1 und 5, die Negativkontrollen, enthielten kein derartiges Produkt. Es war jedoch ersichtlich, dass die Reaktionen 2–4, die keinen „Heißstart” erhielten, DNA-Fragmente enthielten, die nicht die erwartete Größe aufwiesen. Diese anderen DNA-Fragmente waren auch in der Reaktion 1 sichtbar, was zeigt, dass sie nicht von HIV-Sequenzen abgeleitet waren. Diese anderen DNA-Fragmente waren in den Reaktionen 5–8 nicht sichtbar, was zeigt, dass die Verwendung des „Heißstarts” die Spezifität dieser Reaktionen erhöht hatte.
Acht zusätzliche Reaktionen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt, jedoch erhielten alle einen „Heißstart”, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Die Positivkontroll-DNA wurde in diesen acht Reaktionen, die mit 1 bis 8 nummeriert worden sind, so verdünnt, dass jede Reaktion ein halbes HIV-Zielmolekül enthielt. Da ein Molekül nicht geteilt werden kann, bedeutet dies, dass einige Reaktionen ein Ziel-Molekül enthalten sollten und einige nicht. Wenn dieses Experiment viele Male wiederholt werden würde, dann würden die Fraktionen der Reaktionen, die ein Ziel enthalten, beträchtlich variieren, sollten jedoch bei etwa der Hälfte liegen. Von denen, die ein Ziel-Molekül enthalten, ist es am wahrscheinlichsten, dass sie ein einzelnes Ziel-Molekül enthalten. Nach dem Abschluss der Reaktionen wurden alle acht Reaktionen durch Gelelektrophorese analysiert. Als Ergebnis zeigte sich, dass zwei der acht Reaktionen, nämlich die Nummern 1 und 8, ein DNA-Fragment mit der erwarteten Grö ße (etwa 200 bp) als vorherrschende Bande auf dem Gel aufwiesen, wobei keine anderen Banden, die in das Gel gewandert waren, sichtbar waren, mit der Ausnahme einer Bande, die den Primern entsprach. Die Reaktionen 2 bis 6 zeigten keine derartigen Banden noch irgendwelche anderen DNA-Fragmentbanden.
Beispiel VII
Für den quantitativen Nachweis des PCR-Produkts wurde ein Spektralfluorometer Spex-Fluorolog-2 (Spex, Edison, NJ) zur Quantifizierung der Nettozunahme der Fluoreszenz verwendet, die als Antwort auf dasjenige erzeugt worden ist, von dem erwartet wird, dass es sich um ein einzelnes HIV-Ziel in Gegenwart genomischer DNA handelt. Das Spektralfluorometer wurde gemäß den Angaben des Herstellers verwendet, die in Beispiel VIII beschrieben sind. Die in Beispiel VI beschriebenen PCR-Reaktionen, bei denen die Positivkontroll-DNA unter acht Reaktionen verdünnt worden ist, so dass sie ein halbes HIV-Zielmolekül pro Reaktion enthielten, wurden bezüglich ihrer Fluoreszenz analysiert. 20 μl jeder abgeschlossenen Reaktion wurden 100 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8, 0,1 mM EDTA und 1,27 μM Ethidiumbromid zugesetzt. Die Fluoreszenz dieser Lösungen wurde bei 570 nm gemessen. 4A zeigt graphisch die signifikante Zunahme der Fluoreszenz der beiden positiven Proben im Vergleich zu den beiden negativen Proben. In der Figur bezeichnen die gestrichelten Linien die Fluoreszenzwerte, die zwei Standardabweichungen entfernt von den beiden negativen Proben liegen. Die PCR-Positivproben liegen beide über dieser Linie.
Die Ergebnisse sind unter Verwendung eines Hintergrund-Subtraktionsverfahrens auch in 4B gezeigt. Die Fluoreszenz bis zur zweiten Standardabweichung unterhalb des Mittelwerts wurde von dem nachgewiesenen Werten substrahiert. Die Hintergrund-Substraktion wird vorzugsweise durch Messen der Fluoreszenz in jeder Probe zu Beginn des PCR-Zyklierens (vorzugsweise nach der anfänglichen Denaturierung, was den Anteil doppelsträngiger genomischer DNA vermindert) und Substrahieren dieses Werts von der Fluoreszenz in der Probe am Ende des PCR-Zyklierens durchgeführt.
Beispiel VIII
Das nachstehende Experiment zeigt die Eignung des vorliegenden Verfahrens zur Überwachung einer PCR-Reaktion und zum Nachweis der Nettozunahme doppelsträngiger DNA aufgrund der Amplifikation. Die Vorrichtung ermöglicht einen Online-Nachweis des PCR-Produkts.
Die Vorrichtung wurde wie folgt aufgebaut: Ein Spex-Fluorolog-2-Fluorometer mit Faseroptik-Zubehör (Spex-Katalog Nr. 1950) wurde so eingestellt, dass es Anregungslicht bei 500 nm mit einer Bandbreite von etwa 3,4 nm abgab. Ein GG 435 nm Sperrfilter (von Melles Grist Inc. erworben) wurde verwendet, um Licht zweiter Ordnung auszuschließen. Das Emissionslicht wurde bei 570 nm mit einer Bandbreite von etwa 13,6 nm detektiert. Ein OG530 Filter (sperrt bei 530 nm) wurde verwendet, um Anregungslicht zu entfernen.
Zwei PCR-Reaktionen wurden so angesetzt, wie es in Beispiel III beschrieben ist, wobei die Primer RH191 (SEQ ID NO: 7) und RH192 (SEQ ID NO: 8) verwendet wurden. Ein Reaktionsröhrchen enthielt 60 ng menschliche männliche DNA und das andere Röhrchen enthielt keine Ziel-DNA. Die Reaktionen wurden in 0,5 ml Polypropylenröhrchen eingebracht. Die Spitze der Röhrchen wurde jedoch abgeschnitten, um das Faseroptikkabel zu befestigen. Die Faseroptik wurde mit Epoxykleber an die Spitze des Reaktionsröhrchens geklebt. Das diese Vorrichtung nur eine Faseroptik aufwies, wurde nur eine PCR auf einmal laufengelassen. Das Emissionslicht wurde durch die Öldeckschicht in dem Röhrchen gesammelt. Um das Röhrchen wurde eine schwarze „Ummantelung” angebracht und die Reaktion wurde in einen Thermocycler eingebracht. Der Thermocycler wurde so programmiert, dass er zwischen 94°C und 50°C für jeweils eine Minute und 30 Zyklen zyklierte, worauf kontinuierlich bei 25°C inkubiert wurde. Das Fluorometer und der Thermocycler wurden gleichzeitig gestartet. Die Parameter des Fluorometers waren: Scan auf Zeitbasis mit 5 s Integrationszeit; das Emissionsignal wurde im Verhältnis dem Signal des Anregungslichts angepasst, um Änderungen in der Quellenintensität zu steuern.
5A zeigt die Ergebnisse der PCR-Reaktion, die keine DNA enthielt. 5A zeigt, dass der Thermocycler bei 25°C startete, dass die Fluoreszenz bei einer Erhöhung der Temperatur auf 94°C abfiel und das die Fluoreszenz erneut zunahm, wenn die Temperatur auf 50°C fiel. Dieses Muster wurde für die restlichen Zyklen wiederholt, bis der Thermocycler erneut 25°C erreichte und die Fluoreszenz kehrte etwa zu ihrem Ausgangswert zurück.
5B zeigt das Fluoreszenzprofil einer PCR-Reaktion, welche die geeignete Ziel-DNA enthielt. Die Fluoreszenzintensität bei 50°C zeigt einen zyklusabhängigen Anstieg, der eine Zunahme der Menge doppelsträngiger DNA wiederspiegelt. Als der Thermocycler nach dem Abschluss von 30 Zyklen auf 25°C zurückkehrte, nahm die Fluoreszenz auf einen Endwert zu, der mehr als dreimal so groß war wie der ursprüngliche Fluoreszenzwert bei 25°C.
Nach der Amplifikation wurde ein Aliquot jedes Reaktionsgemischs durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Gelanalyse zeigte, dass in der Spur, die eine Probe von der Negativkontrolle enthielt, kein PCR-Produkt sichtbar war. Die der Elektrophorese unterworfene Probe der Positivkontroll-PCR zeigte eine klare und einzige Bande bei etwa 150 Basenpaaren. Die vorhergesagte Größe des PCR-Produkts betrug 154 bp.
Folglich lieferte das Online-Verfahren eine schnelle Analyse bezüglich der Gegenwart oder Abwesenheit einer Ziel-DNA ohne das Erfordernis von Sonden oder weiterer Verarbeitungsschritte. Darüber hinaus liefert der kontinuierliche Nachweis der Fluoreszenz während der Amplifikation ein Amplifikationsprofil, das die Menge des zu Beginn vorhandenen Ziels wiederspiegelt. Wenn die Ziel-Sequenz z. B. eine menschliche Wiederholungssequenz ist, die in Millionen von Kopien pro Zelle vorliegt (z. B. „Alu”-Sequenzen; Nelson und Caskey in PCR Technology, Hrsg. Erlich, Stockton Press, NY, 1989), könnte dieses Quantifizierungsverfahren zur schnellen und einfachen Messung subzellulärer DNA-Mengen verwendet werden, was gegenwärtig ohne die Verwendung von Radioisotopen schwierig ist.
Primersequenzen für die Beispiele I bis VIII
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine Vorrichtung zur Überwachung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Nukleinsäure-Amplifikation über mehrere thermische Zyklen, umfassend: (a) einen Thermocycler zur Durchführung eines automatisierten PCR-Prozesses, wobei der Thermocycler in einem Reaktiongefäß ein PCR-Amplifikationsreaktionsgemisch, das eine Ziel-DNA, Reagenzien für die Nukleinsäure-Amplifikation und ein nachweisbares Nukleinsäure-bindendes Mittel umfasst, abwechselnd aufheizen und kühlen kann; und (b) ein optisches System, das einen Detektor umfasst, der ein optisches Signal, das der Menge an amplifizierter Nukleinsäure in dem Reaktionsgemisch entspricht, über einen Zeitraum von mehreren Zyklen nachweisen kann, und zwar ohne Öffnen des Reaktionsgefäßes, sobald die Amplifikationsreaktion gestartet worden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher der Thermocycler eine Mehrzahl von Reaktionsgefäßen, die jeweils ein Amplifikationsreaktionsgemisch enthalten, abwechselnd aufheizen und kühlen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher der Detektor beim Nachweis des optischen Signals optische Signalwerte über mehrere thermische Zyklen abtasten kann.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welcher der Detektor ein optisches Fluoreszenzsignal nachweisen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 4, bei welcher der Detektor ein optisches Fluoreszenzsignal bei einer Wellenlänge von 570 nm oder von etwa 570 nm nachweisen kann.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das optische System ein faseroptisches Kabel umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, die ferner ein Reaktionsgefäß umfasst, das derart angepasst ist, dass es ein Amplifikationsreaktionsgemisch enthält, das eine Ziel-DNA, Reagenzien für die Nukleinsäure-Amplifikation und ein nachweisbares Nukleinsäure-bindendes Mittel umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 7, die eine Mehrzahl von Reaktionsgefäßen umfasst, die jeweils derart angepasst sind, dass sie ein Amplifikationsreaktionsgemisch enthalten.
Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, bei der das/die Reaktionsgefäß(e) eine durchsichtige oder lichtdurchlässige Kappe aufweist/aufweisen, die optisch an den Detektor gekoppelt ist.
Verwendung einer Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Überwachung einer Polymerase-Kettenreaktion zur Nukleinsäure-Amplifikation über mehrere thermische Zyklen.