DE69034232T2

DE69034232T2 - Primer und Kit für den Nachweis von Chlamydia trachomatis

Info

Publication number: DE69034232T2
Application number: DE69034232T
Authority: DE
Inventors: Mathew West Orange Longiaru; Sheryl Beth Fort Lee Silver; Michael Anthony Spring Valley Sulzinski
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2010-09-28
Also published as: EP0875583A2; DE69033387T2; IL95800A; ES2275292T3; DK0420260T3; JP2719225B2; ATE345398T1; CA2026280C; DE69034232D1; AU7280494A; ATE187499T1; BR9004881A; DE69033387D1; US5232829A; EP0420260A2; EP0420260B1; EP0875583B1; NZ235463A; CA2026280A1; AU6329090A

Description

Ein Format zum Hybridisierungseinfang von mit Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifizierter DNA auf einem festen Polystyrolträger mit verbesserter Proteinbindungskapazität wird bereitgestellt. Bevorzugt ist ein solcher fester Träger eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen. Nach Markierung der amplifizierten Ziel-DNA (z.B. mit Biotin) während der Amplifikation in der PCR-Reaktion wird die markierte DNA spezifisch durch Basenpaarhybridisierung an einer Amplicon-spezifischen Oligonucleotideinfangsonde, die passiv in dem Mikrotiternapf gebunden ist, eingefangen. Wenn Biotin als Markierung verwendet wird, wird Avidin:HRP-Komplex zugefügt und entweder mit (a) Hydrogenperoxidsubstrat und o-Phenylendiamin (OPD) als Chromogen oder (b) Hydrogenperoxidsubstrat und Tetramethylbenzidinchromogen (TMB) umgesetzt. Ein kolorimetrisches Signal entwickelt sich, was den quantitativen Nachweis von mit PCR amplifizierter DNA zulässt.
Die Empfindlichkeit des Einfangs von biotinylierten PCR-Produkten auf der Platte hat sich als vergleichbar erwiesen mit der Empfindlichkeit von Southern-Blot-Hybridisierungen und von Oligonucleotidhybridisierungs-(OH)-Assays bei Verwendung radioaktiv markierter Sonden. Das Platteneinfangformat bietet jedoch verschiedene Vorteile: (a) schnellere Testzeit; (b) weniger laboraufwändiges Testformat, ohne die Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde und (c) eine objektive quantitative Auswertung der Hybridisierung.
Ein weiterer Aspekt ist die Diagnose spezifischer Krankheitszustände durch Nachweis der Gegenwart von spezifischen DNA-Sequenzen, die den verursachenden Mikroorganismus charakterisieren. Spezifische Sonden und Primer wurden für einen dieser Mikroorganismen gefunden, nämlich: Chlamydia trachomatis.
Ein weiterer Aspekt ist die Bereitstellung von Kits zum DNA-Sequenznachweis, wobei die Kits den festen Polystyrolträger und Sätze von PCR-Reagenzien umfassen einschließlich der spezifischen Primer und Sonden, die für die Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenzen, die mit den Einfangsonden hybridisieren sollen, vorausgewählt wurden. Solche Kits würden typischerweise auch das Enzym oder die Enzyme enthalten, die für die PCR-Reaktion notwendig sind, bevorzugt ein thermostabiles Enzym, wie Taq -(Thermus aquaticus)-Polymerase. Im Fall der Verwendung einer Mikrotiterplatte wären auch Mikrotiterplatten, an die bereits die Einfangsonden für die spezifische Zielsequenz gebunden sind, umfasst.
Im Gegensatz dazu offenbart Hatt et al. (Nucleic Acids Research, 16: 4053-4067, 1988) keine Oligonucleotide zur Amplifikation oder zum Nachweis des "kryptischen Plasmids" von Chlamydia-trachomatis-L1-Serovar. Außerdem offenbart EP 336412 keine synthetischen Oligonucleotide mit Sequenzen, die für Chlamydia trachomatis spezifisch sind, die an eine Mikrotiterplatte oder einen festen Polystyrolträger gebunden sind. EP 317077 offenbart andererseits weder synthetische Oligonucleotide, die als Amplifikatoren oder Einfangsonden, die aus dem "kryptischen Plasmid" abgeleitet sind, nützlich sind, die bei Hatt et al. (Nucleic Acids Research, 16: 4053-4067, 1988) erwähnt werden, noch offenbart es irgendwelche Primer und Sonden der Erfindung. Weiterhin umfasst der Hybridisierungstest zum Nachweis von Chlamydia trachomatis in EP 317077 nicht die Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenz über eine "Polymerase-Kettenreaktion" (PCR).
Die U.S.-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202 offenbarten Verfahren zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit einer Technik, die im Stand der Technik jetzt als "Polymerase-Kettenreaktion" (PCR) bekannt ist. Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Verfahrensweise, bei der DNA spezifisch in mehreren Primerverlängerungssynthesen komplementärer Stränge spezifisch amplifiziert wird (Saiki et al., Science, 230: 1350-1354 und 239: 487-491; 1985, 1988). Das PCR-Produkt, das bis zu 10⁶- bis 10⁷-fach amplifiziert ist, ist ein DNA-Fragment mit einer diskreten Größe (Amplicon), das durch Gelelektrophorese nachgewiesen werden kann oder mit anderen hier beschriebenen Mitteln. Kurz gesagt umfasst die PCR die Herstellung von kurzen Oligonucleotidprimern, die den entgegengesetzten Enden einer bekannten "Ziel"-Sequenz entsprechen, die amplifiziert und anschließend nachgewiesen werden soll. Bei dieser Vorgehensweise wird DNA oder RNA aus Zellen, Geweben, Körperflüssigkeiten und dgl. extrahiert. Die Nucleinsäure wird denaturiert und die Oligonucleotidprimer werden in molarem Überschuss zugefügt, zusammen mit dNTPs (Desoxyribonucleotidtriphosphaten) und einem DNA-Polymeraseenzym, z.B. bevorzugt eine wärmestabile Taq-Polymerase. Bei der nachfolgenden Hitzedenaturierung, Abkühlung, um ein Annealing bzw. eine Reassoziierung der Primer zuzulassen, und Primerextension durch DNA-Polymerase werden zwei "lange Produkte", die mit den jeweiligen Primern beginnen, erzeugt, die zu den zwei Originalsträngen komplementär sind. Diese Vorgehensweise wird wiederholt und nach einem zweiten Zyklus werden zwei Originalstränge, zwei lange Produkte aus Zyklus 1, zwei neue "lange Produkte" und zwei "kurze Produkte" erzeugt. Die Länge dieser kurzen Produkte (Amplicons) ist gleich der Anzahl der Nucleotide zwischen den beiden Primern unter Einschluss von diesen. Mit weiteren Zyklen werden zusätzliche "lange Produkte" erzeugt, die in linearer Weise mit jedem Zyklus zunehmen. Die Erzeugung von Amplicons steigert sich jedoch mit einer exponentiellen Rate bei jedem Zyklus und mithilfe dieser Amplifikation wird der Nachweis von extrem geringen Mengen von DNA ermöglicht.
Durch die Verwendung der PCR-Technologie wird der Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen, die in geringen Mengen vorhanden sind, möglich. Verschiedene dieser Techniken betreffen die Verwendung verschiedener hybridisierter Sonden, die an bestimmte Materialien fixiert sind.
Wie später genauer beschrieben wird, verwendet die vorliegende Erfindung die Fixierung einer Einfang-DNA-Sequenz an Mikrotiternäpfe und den anschließenden Nachweis durch Hybridisierung mit markierten (d.h. biotinylierten) Amplicons. Sie beinhaltet auch die Verwendung von Guanidinthiocyanat in der Hybridisicrungsstufe. Verschiedene Vorgehensweisen wurden in der Literatur beschrieben, die hier relevant sind. Zwei solche Berichte beschreiben die Immobilisierung großer Ziel-DNAs an Mikrotiternäpfen gefolgt von der Hybridisierung dieser Ziel-DNAs mit biotinylierten Oligonucleotid- oder Nick-translatierten DNA-Sonden.
Cook et al., Nucleic Acid Research, 16: 4077-4095 (1988), immobilisierten Bakteriophagen-M13-Ziel-DNA an Mikrotiternäpfen von Immulon^®-2-Platten, indem Ziel-DNA in 1 M Ammoniumacetat 1,5 bis 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert wurde. Die immobilisierte Ziel-DNA wurde nach Hybridisierung an endständig Biotinmarkierte oder innenständig Biotin-markierte Oligonucleotidsonden nachgewiesen und anschließend durch Zufügung eines Streptavidin-HRP-Komplexes und von Wasserstoffperoxid/o-Phenylendiamin (OPD) zum kolorimetrischen Nachweis der Hybridisierung.
Nagata et al., FEBS Lett., 183: 379-382 (1985) immobilisierten Lambda-Ziel-DNA in Mikrotiternäpfen in PBS, die 0,1 M MgCl₂ enthielt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht gefolgt von der Entfernung der Lösung wurde die Platte mit Ultraviolettlicht bestrahlt. An die Hybridisierung mit einer biotinylierten (Nick-translatierten) Lambda-DNA-Sonde schloss sich eine Komplexierung mit Avidin-β-Galactosidase an. Die Fluoreszenz wurde nach Zugabe des Substrats, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid gemessen.
Hevey et al. beschrieben in U.S.-Patent Nr. 4 228 237 eine Methode, die mit Avidin reagierendes Biotin (kovalent an ein Enzym gebunden) verwendet, um einen Liganden in flüssigem Medium nachzuweisen. Die der zeitige Methode unterscheidet sich darin, dass der Ligand direkt mit Biotin markiert ist, nicht ein als Zwischenprodukt gebildeter mit Biotin markierter Antiligand. Weiterhin beschreiben verschiedene andere Dokumente des Standes der Technik spezifische Hybridisierungssonden und die diagnostische Verwendung davon, z.B. U.S.-Patent Nr. 4 358 535 (Falkow et al.) und die Europäische Patentanmeldung Nr. 82301804.9 (Veröffentlichungsnummer 63 879; Yale University). Letztere beschreibt die Verwendung von Biotin-markierten DNA-Sonden, die durch Enzyme nachgewiesen werden, die mit Avidin- oder Biotin-spezifischen Antikörpern verbunden sind.
Ranki et al., U.S.-Patent Nr. 4 486 539, beschreiben die Verwendung von zwei nicht überlappenden Nucleinsäurenreagenzien (eines an einen festen Träger gebunden und das andere markiert), um Mikroben durch DNA-Hybridisierung nachzuweisen und zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich darin, dass die Zielnucleinsäure selbst markiert ist und nicht die Verwendung einer weiteren markierten Nucleinsäuresonde zum Nachweis erfordert.
Stabinsky beschrieb in U.S.-Patent Nr. 4 751 177 eine DNA-Nachweismethode, bei der die Ziel-DNA in Lösung mit einem Mediatorpolynucleotid und mit einem markierten Sondenpolynucleotid hybridisiert wird. Das Mediatorpolynucleotid ist wiederum komplementär zu einem Polynucleotid, das an einem festen Träger immobilisiert ist. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich darin, dass (a) die Ziel-DNA während der Amplifikation markiert ist; es ist keine markierte Reportergruppe zum Nachweis notwendig und (b) die Einfangsonde direkt an einen festen Träger gebunden ist ohne die Verwendung eines Mediatorpolynucleotids.
GB 2202328 beschreibt weder Primer für die Amplifikation von Chlamydia-trachomatis-DNA noch Sonden, die an eine Mikrotiterplatte gebunden sind, zum Nachweis von amplifizierten Sequenzen aus Chlamydiatrachomatis-DNA.
Guanidinthiocyanat (GuSCN) wurde in der Zellextraktion und nachfolgenden Nucleinsäurehybridisierung verwendet. Z.B. stellten Thompson und Gillespie, Anal. Biochem., 163: 281-291 (1987) radioaktiv markierte RNA-Sonden her, um Ziel-DNA oder -RNA nachzuweisen. In Dot-Blot-Format wurde die mit ³²P markierte Sonde in 5 M GuSCN/0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure-(EDTA)-Dinatriumsalz, pH 8,0, hybridisiert. Pellegrino et al., BioTechniques, 5: 452-459 (1987) beschrieben eine Hybridisierung in Lösung, um HIV-RNA in Blutzellen nachzuweisen. Die Blutzellen wurden in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA gelöst und mit einer radioaktiv markierten RNA-Sonde in der gleichen Lösung bei Raumtemperatur hybridisiert. Mit TCA ausgefällte Hybride wurden auf Membranen gesammelt und die Radioaktivität durch Szintillationszählung bestimmt. Gillespie, Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/LJS87/01023 (Internationale Patentschrift Nr. WO 87/06621) beschrieben die Verwendung von Guanidinthiocyanat zur molekularen Hybridisierung unter Verwendung einer markierten Sonde, um Ziel-DNA, die an einen festen Träger gebunden ist, nachzuweisen. Das Patent beschreibt die Verwendung von GuSCN zur molekularen Hybridisierung über einen Konzentrationsbereich von 3 M bis 6,5 M bei Umgebungstemperatur. Das Format für eine solche Hybridisierung schließt die Bindung von Zielnucleinsäure an Nitrocellulose- oder Nylonmembran (Dot Blot oder Southern Blot), Vorhybridisierung, Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde in GuSCN, Waschen und Nachweis durch Autoradiographie ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 erläutert die Herstellung eines chemischen Linkerarms, der modifiziert wurde, um die Biotinylierung von Oligonucleotid-PCR-Primern zu ermöglichen.
2 erläutert die Ergebnisse eines Autoradiogramms von PCR-Produkten, die an Nytran^R-Membran gebunden sind.
3 erläutert die Ergebnisse eines Oligonucleotidhybridisierungs-(OH)-Tests unter Verwendung der PCR-Produkte von Beispiel 6.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Ausdrücke "Oligonucleotid" und "Primer", die hier verwendet werden, haben die in dem vorher erwähnten U.S.-Patent Nr. 4 683 202 definierte Bedeutung. Der Ausdruck "Einfangsonde", wie er hier verwendet wird, wird definiert als ein Oligonucleotid, das vollständig oder im Wesentlichen komplementär zu den Sequenzen des Amplicons innerhalb der Grenzen der Primer ist. In der vorliegenden bevorzugten Ausführungsform hat die Einfangsonde keinen Fortsatz, aber sie kann mit Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden verlängert sein.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden Primer und Sonden so ausgewählt, dass sie "im Wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen der zu amplifizierenden Zielsequenz sind.
Für eine der hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen wurden zwei Sätze von PCR-Primern und Einfangsonden aus der Nucleotidsequenz des kryptischen Plasmids von Chlamydia-trachomatis-L1-Serovar (Hatt et al., Nucleic Acids Research, 16: 4053-4067, 1988) ausgewählt. Dies ermöglicht die spezifische Amplifikation und den Nachweis von C. trachomatis. Für andere allgemeine Zwecke erfolgt die Auswahl von Primer und Sonde für die einzelnen Ziel-DNAs wie in dem vorher erwähnten U.S.-Patent Nr. 4 683 202 beschrieben.
Als Alternative zu bekannten Techniken zum Einfang der amplifizierten Sequenz (Amplicon), die bei Anwendung der PCR entsteht, wie vorher beschrieben, und als Verbesserung dazu verwendet die vorliegende Erfindung in ihrer bevorzugten Ausführungsform eine Oligonucleotideinfangsonde, die passiv an die Näpfe der Mikrotiterplatte gebunden ist, um (durch sequenzspezifische Hybridisierung) Biotin-markierte Amplicons einzufangen. Avidin-Meerrettichperoxidase wird dann für die biotinylierten Amplicons angewendet und die Reaktion mit dem Substrat (Wasserstoffperoxid) und dem Chromogen (entweder OPG oder TMP) liefert ein quantitatives kolorimetrisches Signal.
Wiederum wie in dem vorher erwähnten U.S.-Patent Nr. 4 683 202 beschrieben, werden auch Desoxyribonucleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und TTP der Synthesemischung in entsprechenden Mengen zugegeben, und die entstehende Lösung wird etwa 0,5 bis 10 Minuten lang auf etwa 90 bis 100°C erwärmt, um Matrizenstränge zu trennen. Nach diesem Erwärmungszeitraum wird die Lösung schnell auf die Temperatur gekühlt, die für das Primermatrizen-Annealing bevorzugt ist. Zu dieser Mischung wird ein geeignetes Mittel zugefügt, um die Primerverlängerungsreaktion zu induzieren oder zu katalysieren und die Reaktion wird unter im Stand der Technik bekannten Bedingungen fortschreiten gelassen. Das Induktionsmittel kann irgendeine Verbindung oder irgendein System sein, mit der/dem die Synthese von Primerverlängerungsprodukten erreicht werden kann, was Enzyme einschließt. Geeignete Enzyme für diesen Zweck schließen z.B. DNA-Polymerase I aus Escherichia coli (E. coli), das Klenow-Fragment von E.-coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, andere verfügbare DNA- Polymerasen, reverse Transkriptase und andere Enzyme, einschließlich bevorzugt wärmestabile Enzyme (z.B. Taq-DNA-Polymerase) ein, die den Einbau der Nucleotide in geeigneter Art und Weise zulassen, um die Primerverlängerungsprodukte zu bilden, die komplementär zu jedem Nucleinsäurestrang sind.
Der neu synthetisierte Strang und der komplementäre Nucleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, dessen Stränge getrennt werden unter Verwendung eines Denaturierungsverfahrens, um einzelsträngige Moleküle zu liefern, einschließlich der Anwendung von Wärme.
Die neue Nucleinsäure wird synthetisiert an den einzelsträngigen Matrizenmolekülen. Weiteres Enzym, weitere Nucleotide und weitere Primer können zugefügt werden, falls notwendig, damit die Reaktion unter den oben beschriebenen Bedingungen fortschreitet. Wiederum wird die Synthese an einem Ende des Oligonucleotidprimers gestartet und läuft entlang der einzelnen Stränge der Matrize, um weitere komplementäre Nucleinsäure durch Primerextension zu erzeugen.
Die Stufen der Strangtrennung und Extensionsproduktsynthese können so oft wie notwendig wiederholt werden, um die gewünschte Menge an amplifizierter Nucleinsäuresequenz herzustellen.
Allgemeine Markierungstechniken
Allgemein kann jedes Material (Molekül, Atom) für die vorliegende Erfindung verwendet werden, um einen Hinweis oder ein "Signal" zu liefern, das nachweisbar (und bevorzugt quantifizierbar) ist und an die Nucleinsäure gebunden oder in sie eingebaut werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwei Methoden angewendet, um Amplicons herzustellen, die Biotinmarkierungen beinhalten während der PCR-Amplifikation. Im ersten Fall ersetzt Biotin-11-dUTP (ein TTP-Analogon, das chemisch mit einer Biotinmarkierung modifiziert ist) teilweise das TTP in der PCR-Reaktion. Biotin-11-dUTP wird durch Taq-DNA-Polymerase während der Primerextension eingebaut und das entstehende DNA-Produkt ist "intern" bzw. "innenständig" mit Biotin markiert.
Im zweiten Fall wird ein chemischer "Linkerarm" an das 5'-Ende der Oligonucleotide, die an einen festen Träger gebunden sind, angefügt. In der bevorzugten Ausführungsform ist der "Linkerarm", wie er hier verwendet wird, ein Molekül, das chemisch an das 5'-Primerende gebunden ist (durch Phosphoramiditchemie) und kovalent eine Aminogruppe oder -Gruppen des Oligonucleotids binden kann. Die Aminogruppen wiederum sind mit Biotin-X-NHS biotinyliert. Diese 5'-Biotin-markierten Oligonucleotide erzeugen, wenn sie als Primer in der PCR-Reaktion verwendet werden, Amplicons, die an ihren 5'-Enden biotinyliert sind.
Der "Linkerarm" kann irgendein Molekül sein, das lang genug ist, um als Abstandshalter zu dienen, um die Markierung von der Oligonucleotidsequenz im Abstand zu halten und auch für die Bindung einer oder mehrerer geeigneter Markierungen für thermostabile Enzyme oder Liganden zur Verfügung steht.
Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann entweder eines der beiden Biotin markierenden Verfahren (Einbau von Biotin-11-dUTP und 5'-Biotin-markiertem Primer) verwendet werden, um die amplifizierten Produkte der PCR zu markieren, oder beide.
Außer Biotin können auch andere Markierungen in dieser Erfindung verwendet werden, einschließlich radioaktiv markierter Verbindungen, lumineszierender oder fluoreszierender Reagenzien, elektronendichter Reagenzien, thermostabiler Enzyme, Liganden, Antikörper-Hapten-Komplexe und Komplexierungssystemen. Die alternativen Markierungen müssen mit den Temperaturbedingungen der PCR-Amplifikation kompatibel sein ebenso wie mit den Bedingungen der Denaturierung und Einfanghybridisierung.
Ein solches Beispiel für alternative Markierungen schließt Dioxigenin-11-dUTP ein, das wie Biotin-11-dUTP durch Taq-Polymerase in markierte amplifizierte DNA eingebaut wird. Digoxigenin-markierte Amplicons können dann mit einem Antikörper gegen Digoxigenin, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist und anschließenden kolorimetrischen Nachweis, wie hier beschrieben, nachgewiesen werden.
Ein weiteres Beispiel für eine alternative Markierung sind ³²P-markierte Desoxynucleotidtriphosphate, die auch verwendet werden können, um unmarkierte Desoxynucleotidtriphosphate in der PCR-Reaktionsmischung teilweise zu ersetzen. Das Ausmaß der Einfanghybridisierung könnte z.B. nach Einfanghybridisierung und Waschen durch Szintillationszählung in entnehmbaren Mikrotiternäpfen bestimmt werden (unten beschrieben, Stufe 2).
Fester Polystyrolträger
Die Einfangplatte oder der Träger, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, sind feste Polystyrolträger, die eine verbesserte Proteinbindungskapazität aufweisen. Verschiedene Behandlungen solcher Träger, um eine solche Verbesserung zu erzielen, sind im Stand der Technik bekannt (z.B. Bestrahlung mit ⁶⁰Co).
Der feste Polystyrolträger kann irgendeine von verschiedenen Formen annehmen; z.B. Mikrotiterplatte, mikromagnetische Teilchen (erhältlich von Advanced Magnetics, Inc.); Kügelchen, Streifen, Dipsticks etc.
Bevorzugt ist der für die vorliegende Erfindung verwendete Polystyrolträger eine Mikrotiterplatte mit verbesserter Proteinbindungskapazität und einer Vielzahl von Näpfen, wobei am meisten bevorzugt solche Mikrotiterplatten sind, die als "Dynatech Immulon^R 2" (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA, geliefert von Fisher Scientific) bekannt sind.
Allgemeine Hybridisierungstechniken
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Amplicon-spezifische Oligonucleotideinfangsonde passiv an Näpfe einer Immulon^R-2-Polystyrol-Mikrotiterplatte in einer Konzentration von 25 ng DNA/Napf in einer Lösung von 1 M Ammoniumacetat gebunden. Solche Mikrotiterplatten haben eine Vielzahl von Näpfen und liefern somit eine große Oberfläche und lassen eine hohe Anzahl gleichzeitiger Tests zu (z.B. 96).
Zusätzlich zu der passiven Bindung der Einfangsonde können alternative Methoden der Bindung verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein: kovalente Bindung; Bindung über ein intermediäres Protein (z.B. BSA) und Bindung mit irgendeinem alternativen chemischen Mittel.
Die Hybridisierungsstufe der vorliegenden Erfindung, genauer die "Einfanghybridisierung" wird bevorzugt in Gegenwart von 1 M Guanidinthiocyanat, 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure-(EDTA)-Dinatriumsalz, pH 8,0, durchgeführt. Der Konzentrationsbereich, um eine Mikrotiterplatteneinfanghybridisierung zu erzielen, ist bevorzugt 0,5 bis 2,0 molar GuSCN und am meisten bevorzugt 1,0 bis 2,0 M.
Weitere Reagenzien können auch verwendet werden, um die Einfanghybridisierung zu erzielen. Z.B. kann eine Lösung von Ammoniumthiocyanat (0,5 bis 5,0 M, am meisten bevorzugt 5,0 M) anstelle von Guanidinthiocyanat verwendet werden.
Ein weiterer möglicher Ersatz für Guanidinthiocyanat ist ein Reagenz, das aus 30% (V/V) deionisiertem Formamid; 3 × SSPE [1 × SSPE = 0,18 M NaCl; 10 mM NaPO₄, pH 7,7; 1 mM EDTA]; 5% (G/V) Dextransulfat; 0,1% Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) besteht.
Das Format für eine solche Hybridisierung schließt die folgenden Stufen ein:

1. Herstellung der Einfangsonde
2. Herstellung der Mikrotitereinfangplatte
3. Verdünnung und Denaturierung der amplifizierten markierten DNA
4. Einfanghybridisierung
5. Waschen
6. Blockieren
7. Zugabe von Avidin:Meerrettichperoxidase
8. Waschen
9. Zugabe von Substrat und Chromogen; Farbentwicklung
10. Lesen der Platte (quantitative Bestimmung)

Diese Stufen werden nun im Detail beschrieben.
1. Herstellung der Einfangsonde
Die Einfangsonden werden hier so ausgewählt, dass sie "im Wesentlichen" komplementär zu Sequenzen des Amplicons innerhalb der Grenzen der Primer sind. Daher müssen die Einfangsonden ausreichend komplementär sein, um spezifisch mit dem Amplicon unter Einfanghybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. In der derzeit bevorzugten Ausführungsform enthält die Einfangsonde typischerweise 20 bis 200 Nucleotide.
Weiterhin kann mehr als eine Einfangsonde verwendet werden und zusätzliche Einfangsonden können verwendet werden, um den gleichen oder den entgegengesetzten Strang des markierten Amplicons einzufangen.
Obwohl die Einfangsonde hier definiert ist als "Sequenz des Amplicons innerhalb der Grenzen der Primer" können auch die Primer selbst oder Oligonucleotide, die Primersequenzen enthalten, als Einfangsonden verwendet werden. Es ist jedoch anzumerken, dass dann, wenn solche Oligonucleotide als Einfangsonden verwendet werden, sie während der Hybridisierung mit PCR-Primern konkurrieren müssen, die nicht aus den Reaktionsprodukten entfernt worden sind.
Die Einfangsonden und PCR-Primer wurden an einem MilliGen 7500 DNA Syntheseautomaten (Milli-Gen/Biosearch Inc., Burlington, MA) mit Standard-β-Cyanoethylphosphoramiditchemie synthetisiert, andere Vorgehensweisen, die dem Fachmann auch bekannt sind, sind auch möglich. Vor der Verwendung wurden die Einfangsonden und PCR-Primer teilweise gereinigt entweder mit Elektrophorese über 15% (G/V) Polyacrylamidgele oder über Spin-Säulen (siehe Beispiel 3). Die fertigen teilweise gereinigten Einfangsonden und Primer wurden in Wasser suspendiert, ihre Konzentration spektrophotometrisch bestimmt und sie wurden bei 4°C aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
Obwohl die hier beschriebene Einfangsonde synthetisch hergestellt wurde, muss dies nicht sein. Sie kann auch erhalten werden als Untergruppe von natürlich vorkommender DNA, die mit Standardmitteln hergestellt wurde (z.B. Verdau mit Restriktionsendonucleasen).
2. Herstellung der Einfangplatte
Die Oligonucleotideinfangsonde wird bevorzugt an Näpfen einer Dynatech-Immulon^R-2-Polystyrol-Mikrotiterplatte (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA, geliefert von Fisher Scientific) fixiert. Die Immulon^R-2-Platte ist eine Anordnung von 96 Miniatur-Polystyrolteströhrchen (Näpfen) in einer einzelnen Kunststoffplatte, die für die allgemeine Verwendung in Festphasenimmunoassayverfahren mit Mikrovolumina ausgebildet ist. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Platten mit Näpfen mit flachem Boden (400 μl Volumenkapazität) verwendet, aber es wird angenommen, dass Näpfe mit "U"-Boden auch verwendet werden können (300 μl Volumenkapazität).
Als weitere bevorzugte Ausführungsform kann die Sonde auch an Immulon^R-2-Removawell^R-Streifen (Dynatech) fixiert werden, die entnehmbare Streifen von 12 Immulon^R-2-Polystyrolteströhrchen (Näpfen) sind, die in Removawell^R-Streifenhalter (Dynatech) im Mikrotiterplattenformat passen.
Die Oligonucleotideinfangsonde wird verdünnt, was 25 ng pro Mikrotiternapf in 50 μl 1 M Ammoniumacetat (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) liefert. "Leerwertnäpfe" werden auch vorbereitet, indem 1 M Ammoniumacetat (ohne Oligonucleotideinfangsonde) in bestimmte Näpfe gegeben wird (denen später markierte PCR-Produkte für eine Blindhybridisierung zugefügt werden). Diese Leerwertnäpfe sind ein Hinweis auf nicht spezifische Haftung von biotinylierter DNA an Näpfen der Mikrotiterplatten und werden verwendet, um das Plattenleseinstrument (Spektrophotometer) zu kalibrieren (siehe unten, Stufe 10).
Die Platte wird mit Mylar-Plattenversiegler (Dynatech) versiegelt und bei 37°C über Nacht zur passiven Fixierung der Oligonucleotideinfangsonde an der Polystyroloberfläche inkubiert. Wenn die Platten nicht sofort verwendet werden sollen, werden sie bei 4°C aufbewahrt, bis sie benötigt werden. Platten, die auf diese Art und Weise bis zu 6 Wochen lang aufbewahrt wurden, zeigten keinen signifikanten Unterschied in ihrer Fähigkeit, DNA einzufangen.
Direkt vor der Hybridisierung werden die Näpfe der Platten zweimal mit 200 μl 2 × SSC [1 × SSC = 0,15 M NaCl; 15 mM Natriumcitratpuffer, pH 7,0] und einmal mit 200 μl 2 × SSC, 0,1% (V/V) Triton X-100 gewaschen. Alle Plattenwaschstufen, die hier beschrieben werden, erfolgten unter Verwendung einer Mehrkanalpipettenvorrichtung (z.B. Titertek^R) oder können erfolgen unter Verwendung einer geeigneten automatischen Mikrotiterplattenwaschvorrichtung.
3. Verdünnung und Denaturierung amplifizierter markierter DNA
Die biotinylierten PCR-Produkte werden in 1 M GuSCN (ultrareine Qualität; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 20 mM EDTA (Sigma), pH 8,0 (hergestellt aus 5 × Vorratslösung) verdünnt (in einem Bereich von 1:10 bis 1:100 oder mehr), 5 Minuten lang auf 100°C erwärmt und schnell in einem Eiswas serbad abgekühlt. [Die Erwärmungsstufe führt zur Hitzedenaturierung der PCR-Produkte und das schnelle Abkühlen vermeidet ein erneutes Zusammenfügen der Amplicon-Stränge, favorisiert die Hybridisierung an die Oligonucleotideinfangsonde]. Aliquots von 100 μl werden in jeden Napf gegeben, einschließlich der Näpfe, die als "Leerwert" (keine Einfangsonde) vorgesehen sind, wie oben beschrieben (Stufe 2).
4. Einfanghybridisierung
Der spezifische Einfang von amplifizierter markierter DNA durch Oligonucleotideinfangsonden wird erreicht durch ein- bis dreistündige Inkubation bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit werden PCR-Amplicons spezifisch mit der Oligonucleotideinfangsonde eingefangen auf Basis der Sequenzkomplementarität zwischen Einfangsonde und markiertem Amplicon.
5. Waschen der Platte
Nach der Hybridisierung wird der Inhalt aller Mikrotiternäpfe verworfen und die Näpfe werden zweimal mit 200 μl 2 × SSC, 0,1% (V/V) Triton X-100 und viermal mit 200 μl 0,2 × SSC, 0,1% (V/V) Triton X-100, das vorher auf 37°C erwärmt wurde, gewaschen. Diese Waschstufen werden durchgeführt, um ungebundene biotinylierte Produkte von den Mikrotiternäpfen zu entfernen.
6. Blockieren
Nach dem Waschen der Platten werden die Näpfe der Platte dann mindestens 15 bis 30 Minuten lang mit 200 μl einer Lösung von PBS (PBS = 0,13 M NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3 mM NaH₂PO₄, pH 7,0), 2% (G/V) Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma), 0,1% (V/V) Triton X-100 "blockiert". Diese "Blockierungs"-Stufe ist erforderlich, um die nicht spezifische Bindung von Avidin:HRP an Mikrotiternäpfe zu minimieren.
7. Avidin: Meerrettichperoxidase
Der Avidin: Meerrettichperoxidase-(HRP)-Komplex (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) wird 1:2000 in PBS, 0,1% (V/V) Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 2,5 μg Avidin:HRP/ml verdünnt. 50 μl verdünntes Avidin:HRP werden jedem Napf zugegeben und es wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Stufe bindet der Avidin:HRP-Komplex fest an eingefangene biotinylierte Produkte in dem Napf. Während Avidin:HRP für die vorliegende Erfindung verwendet wird, kann stattdessen auch ein Komplex aus Streptavidin:HRP verwendet werden. In gleicher Weise können andere Verbindungen, die mit Avidin (oder Streptavidin) einen Komplex bilden, verwendet werden, einschließlich alkalischer Phosphatase, β-Galactosidase, Luciferase, Fluorescein, Texas-Rot oder irgendeinem anderen Mittel, das ein kolorimetrisches, fluoreszierendes oder lumineszierendes Signal erzeugen kann.
8. Waschen
Die Näpfe der Mikrotiterplatten werden dann viermal mit 200 μl PBS, 0,1% Triton X-100 und einmal mit 200 μl PBS, 1 mM EDTA gewaschen, wobei für die letzte Waschstufe 1 bis 10 Minuten lang bei Raumtempera tur inkubiert wird. Diese Waschstufen werden durchgeführt, um ungebundenes Avidin:HRP aus Mikrotiternäpfen zu entfernen vor Zugabe des Chromogens.
9. Farbentwicklung
Die Farbentwicklung wird in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erreicht unter Verwendung eines der beiden Chromogensysteme: (a) Wasserstoffperoxid/OPD und (b) Wasserstoffperoxid/TMB.
(a) Wasserstoffperoxid/OPD.
Nachdem der Waschpuffer (beschrieben in Stufe 8) entfernt worden ist, werden 150 μl OPD-Reagenz [1,6 mg/ml o-Phenylendiamin-Dinatriumsalz (Sigma), 0,0125% (V/V) Wasserstoffperoxid (Fisher Scientific) in 0,15 M Natriumphosphat/Citratpuffer, pH 6,0] zugegeben und die Farbentwicklung im Dunkeln 1 bis 30 Minuten lang fortschreiten gelassen. Die Farbentwicklung wird gestoppt durch Zugabe von 50 μl 4 n H₂SO₄.
(b) Wasserstoffperoxid/TMB.
Nachdem der letzte Waschpuffer (beschrieben in Stufe 8) entfernt worden ist, werden 100 μl TMB-Farbreagenz jedem Napf zugefügt. [TMB-Farbreagenz besteht aus frisch gemischten gleichen Volumina von TMB-Peroxidasesubstrat (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in einer Konzentration von 0,4 g/l in einer organischen Base; im Handel erhältlich von Kirkegaard und Perry Inc., Gaithersburg, MD) und Wasserstoffperoxidlösung [0,02% (V/V) Wasserstoffperoxid in Citronensäurepuffer; im Handel erhältlich von Kirkegaard und Perry Inc.]. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur im Dunklen 1 bis 30 Minuten lang fortschreiten gelassen, und danach die Farbentwicklung durch Zugabe von 100 μl 1 M Phosphorsäure (H₃PO₄) gestoppt.
Das TMB-Substrat erzeugt einen Niederschlag mit einer blauen Farbe. Bei Zugabe von Phosphorsäure erfolgt eine Farbveränderung zu gelb mit einer optischen Dichte, die bei 450 nm gemessen wird (siehe unten, Stufe 10). Zusätzlich zu den HRP-Substraten OPD und TMB schließen weitere lösliche Substrate ein: 2,2-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS) und 5-Aminosalicylsäure (ASA). Unlösliche Substrate schließen 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) und 3,3-Diaminobenzidin (DAB) ein.
10. Ablesen der Platte (quantitative Auswertung)
Nachdem die Farbentwicklung gestoppt worden ist, wird die optische Dichte (OD) der Proben in jedem Napf bestimmt, indem in einem automatischen Mikrotiterplattenlesegerät, das geeignet ist für spektrophotometrische Bestimmung (z.B. InterMed Immunoreader^R NJ-2000) bei Wellenlängen, die für das verwendete Chromogen spezifisch sind (siehe unten), abgelesen wird.
Die OD der Leerwertnäpfe [biotinylierte PCR-Produkte wurden dem Napf zugegeben ohne Einfangsonde, wie in Stufe 2 beschrieben] wird auch bestimmt. Dieses Signal (gewöhnlich sehr niedrig) ist ein Hinweis auf die falsche "nicht spezifische" Haftung von biotinylierten Produkten an Probenäpfen statt einem Signal, das durch den echten Einfang der biotinylierten Amplicons durch Hybridisierung mit einer Einfangsonde entsteht. Daher wird die OD der Leerwertnäpfe von der OD der Probenäpfe abgezogen, um eine genaue quantitative Bestimmung der echten Einfanghybridisierung zu erreichen.
Die geeignete Wellenlängeneinstellung für das Spektrophotometer (Plattenlesegerät) ist abhängig von dem für die kolorimetrische Reaktion verwendeten spezifischen Chromogen. Wenn daher Wasserstoffperoxid/OPD verwendet wird, ist die korrekte Wellenlängeneinstellung 490 nm; wenn Wasserstoffperoxid/TMB verwendet wird, ist die korrekte Wellenlängeneinstellung 450 nm.
Durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung können verschiedene infektiöse Krankheiten diagnostiziert werden, indem die Gegenwart spezifischer DNA-Sequenzen nachgewiesen wird, die den verursachenden Mikroorganismus kennzeichnen. Wie vorher beschrieben und als zusätzliche Ausführungsform der Erfindung wurden neue Einfangsonden und Primer gefunden, die spezifisch für den Nachweis des Organismum Chlamydia trachomatis verwendet werden können. Solche neuen Sonden und Primer werden im Detail in den folgenden spezifischen Beispielen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung bietet auch spezielle Vorteile im Zusammenhang mit der klinischen Anwendung. Durch die Verwendung der Mikrotiterplatten wird ein geeignetes, schnelles, einfaches, ökonomisches und automatisierbares Testverfahren bereitgestellt. Der Test ist äußerst genau und empfindlich im Vergleich zu üblichen Mitteln und kann in einem Bruchteil der normalerweise benötigten Zeit durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele sollen nun der Erläuterung dienen und sollen nicht beschränkend sein.
Beispiel 1
Synthese von Biotin-11-dUTP
Biotin-11-dUTP wurde chemisch synthetisiert mit den Methoden von Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78: 6633-6637 (1981), und wurde in einer Konzentration von 0,4 mM in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,4 mM EDTA suspendiert. Das Verhältnis von Biotin-11-dUTP:TTP wurde optimiert und das höchste Signal wurde erhalten bei Verwendung eines Verhältnisses von 4:1 (Biotin-11-dUTP:TTP).
Beispiel 2
Herstellung von 5'-biotinylierten Primern
Alle als PCR-Primer verwendeten Oligonucleotide wurden an einem MilliGen-7500-DNA-Syntheseautomaten synthetisiert mit Standard-β-Cyanoethylphosphoramiditchemie unter Verwendung von dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Standardverfahren.
Die zur Verwendung als biotinylierte Primer hergestellten Oligonucleotide wurden modifiziert, wie in 1 gezeigt. Die synthetischen Oligonucleotide auf festem Träger wurden am 5'-Ende durch Reaktion mit geschütztem Hexylaminophosphoramidit [Strukturformel 1] derivatisiert und anschließend mit Standardverfahren oxidiert und die Schutzgruppen abgespalten (McBride und Caruthers, Tetrahedron Letters, 24: 245-248, 1983), was 5'-Amino-markierte Oligomere lieferte [Strukturformel 2]. Die Reaktion von [2] mit N-Hydroxysuccinimidylestern von Biotinderivaten ergab 5'-biotinylierte Oligonucleotide [Strukturformel 3] in guten Ausbeuten, die mit Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt wurden (siehe unten, Beispiel 3).
Beispiel 3
Reinigung er Oligonucleotide
Als PCR-Primer oder Einfangsonden verwendete Oligonucleotide wurden auf einem von zwei Wegen gereinigt: (a) Polyacrylamidgelelektrophorese oder (b) Spin-Säule.
(a) Polyacrylamidgelelektrophorese.
Aliquots von jeweils 100 bis 250 μg Oligonucleotid wurden im Vakuum getrocknet, wieder in einem minimalen Volumen Gelbeladungspuffer [TBE (89 mM Tris-Borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA); 90% (V/V) deionisiertes Formamid; 0,02% (G/V) Bromphenolblau] suspendiert, 5 Minuten lang auf 100°C erwärmt und schnell in einem Eiswasserbad abgekühlt. Proben wurden auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel [15% (G/V) Acrylamid (Acrylamid:Bisacrylamid, 29:1) (IBI, New Haven, CT), 7 M Harnstoff (IBI) in TBE] geladen und bei 650 Volt 4 Stunden lang elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA wurde sichtbar gemacht durch UV-Schattenbildung über einer Dünnschichtchromatographieplatte (Eastman Kodak #13254 Cellulose), fotografiert und die Gelbande mit dem Oligonucleotid voller Länge ausgeschnitten. Das Gelstück wurde zerkleinert und die DNA über Nacht in Wasser mit 37°C eluiert. Die DNA wurde weiter gereinigt durch Passage über eine C₁₈-Sep-Pak^R-Patrone (Waters Associates, Milford, MA) und in 40% (V/V) Acetonitril (Fisher) eluiert. Nach Eindampfen im Vakuum bis zur Trockene wurde die DNA in Wasser suspendiert und die Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. Vorratskonzentrationen wurden mit Wasser eingestellt und bei 4°C aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
(b) Spin-Säule.
Einige Oligonucleotideinfangsonden und Primer wurden teilweise gereinigt unter Verwendung von Bio-Spin^TM-6-Säulen (Bio-Rad Inc., Richmond, CA) in einem Schwingbehälterrotor mit niedrigen Zentrifugalkräften nach der Anleitung des Herstellers für die Spin-Säule. Nach teilweiser Reinigung wurde die Konzentration der Oligonucleotide spektrophotometrisch bestimmt und Vorratslösungen wurden mit Wasser hergestellt und bei 4°C aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
Beispiel 4 (Referenzbeispiel)
PCR-Bedingungen
Die meisten Primerpaare wurden empirisch getestet, um die optimalen Temperaturbedingungen für die PCR-Amplifikation zu bestimmen, mit besonderer Beachtung der Annealingtemperatur.
Zum Nachweis von HTLV-1-tax-Sequenzen wurden die Primersätze SK43 und SK44 (beschrieben bei Kwok et al., J. Inf. Dis., 158: 1193-1197, 1988) verwendet. Unter Verwendung dieses Primerpaars bestanden 100 μl PCR-Reaktion aus: 1 × Reaktionspuffer (RB) [10 × RB = 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl, pH 8,5; 25 mM MgCl₂]; jeweils 200 μM dATP, dCTP, dGTP und TTP; jeweils 50 pmol SK43 und SK44 und zwei Einheiten rekombinante Taq-DNA-Polymerase (RecombiTag^R, Cetus Perkin Elmer, Norwalk, CT).
Für Versuche, bei denen Biotin-11-dUTP eingebaut wurde, waren die Reaktionsmengen wie oben, außer dass 200 μM TTP durch 160 μM Biotin-11-dUTP, 40 μM TTP ersetzt wurden.
Für den Primersatz SK43 und SK44 begann das PCR-Temperaturschema mit einer anfänglichen längeren Denaturierung 5 Minuten bei 94°C gefolgt von einer Annealingstufe mit 25 Sekunden bei 50°C und einer Verlängerungsstufe mit 1 Minute bei 72°C. Für die nächsten 28 Zyklen bestand das Temperaturschema aus: 25 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 25 Sekunden Annealing bei 50°C und 1 Minute Verlängerung bei 72°C. Der letzte (30.) Zyklus war: 25 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 25 Sekunden Annealing bei 50°C und eine ausgedehnte Verlängerung von 10 Minuten bei 72°C. Nach der PCR-Amplifikation wurden 90 μl Reaktionsinhalt unter dem Mineralöl entnommen und bis zur Analyse der PCR-Produkte bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 5 (Referenzbeispiel)
Herstellung vonpositiven und negativen Kontrollplasmidmatrizen
Ein Plasmid (pTAX), das das vollständige tax-Gen von HTLV-1 enthielt, wurde als positive Kontrollmatrize verwendet. Die Konzentration der Plasmid-DNA wurde spektrophotometrisch bestimmt und Verdünnungen erfolgten in Wasser, um eine bekannte Kopienzahl der Ziel-DNA für die PCR-Reaktionen zu liefern. Auf diese Art und Weise wurde eine positive Kontrollmatrize bereitgestellt.
Ein heterologes Plasmid wurde auch mit dem HTLV-1-tax-Primersatz verwendet als negative PCR-Kontrolle. Dieses Plasmid, pRT-POL, enthielt Sequenzen der HTLV-1-Polymerase-(pol)-Region. Die Plasmid-DNA-Konzentration wurde bestimmt und seriell verdünnt, wie oben für pTAX beschrieben. Die Plasmidkonzentrationen wurden berechnet, um eine bekannte Kopienzahl in einem spezifischen Volumen, das der PCR-Reaktionsmischung zugegeben wurde, abzugeben (d.h. 2 μl Matrizen-DNA zugefügt zu 98 μl Reaktionsmischung).
Beispiel 6 (Referenzbeispiel)
Amplifikation von HTLV-1-tax-Ziel, unmarkierte Amplicons
Um die drei PCR-Nachweissysteme direkt nebeneinander zu vergleichen, wurden bekannte Kopienzahlen des Plasmids pTAX (Beispiel 5) mit PCR amplifiziert. Die Plasmidkonzentration wurde mit Wasser so eingestellt, dass 1300, 100, 50, 20 oder 10 Kopien Matrize pro Reaktion abgegeben wurden. HTLV-1-tax-Primersatz SK43/SK44 (Kwok et al., J. Inf. Dis., 158: 1193-1197, 1988) wurde synthetisiert und mit Bio-Spinⁿ-6-Spin-Säulen gereinigt (beschrieben in Beispiel 3) und jeder Primer wurde der PCR-Reaktion in einer Konzentration von 50 pmol zugefügt.
Unmarkierte amplifizierte DNA wurde erzeugt, indem jedes der vier dNTPs mit 200 μM für die PCR-Amplifikation verwendet wurde. Diese unmarkierten PCR-Produkte wurden verwendet, um die Nachweisempfindlichkeit bei Southern-Blot-Hybridisierungs-(Beispiel 9)- und Oligonucleotidhybridisierungs-(OH)-(Beispiel 10)-Tests zu bestimmen. Die Amplifikation erfolgte über 30 Zyklen unter Verwendung der Reaktionsmischung und der Temperaturbedingungen, die in Beispiel 4 beschrieben wurden.
Beispiel 7 (Referenzbeispiel)
Amplifikation von HTLV-1-tax, Biotin-11-dUTP-Einbau
Die PCR-Amplifikation mit dem Primersatz SK43/SK44 erfolgte auch, um biotinylierte Amplicons zu erzeugen, durch Einbau von Biotin-11-dUTP. Die Bedingungen für diese HTLV-1-tax-Amplifikation waren wie oben beschrieben (Beispiel 6), außer dass die Reaktionsmischung dATP, dCTP und dGTP mit 200 μM; Biotin-11-dUTP mit 160 μM; TTP mit 40 μM enthielt. Die mit Biotin markierten PCR-Produkte wurden verwendet, um die Nachweisempfindlichkeit bei der Platteneinfanghybridisierung (Beispiel 8) und Southern-Blot-Hybridisierung (Beispiel 9) zu bestimmen. Die Amplifikation erfolgte über 30 Zyklen unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Reaktionsmischung und der dort beschriebenen Temperaturbedingungen.
Beispiel 8 (Referenzbeispiel)
Platteneinfangtest
Eine Einfangplatte wurde hergestellt, indem 25 ng Oligonucleotid-"Einfangsonde"-SK45 (Kwok et al., J. Inf. Dis., 158: 1193-1197, 1988) in 1 M Ammoniumacetat an Näpfe einer Dynatech-Immulon^R-2-Platte gebunden wurden und bei 37°C über Nacht inkubiert wurde. Die biotinylierten Produkte der PCR (Beispiel 7) wurden 1:25 und 1:100 in 1 M Guanidinthiocyanat (GuSCN) verdünnt, hitzedenaturiert (5 Minuten, 100°C) und schnell in einem Eiswasserbad abgekühlt. Für jede Probe und Kontrolle wurden jeweils 100 μl in jeden der 4 Mikrotiternäpfe gegeben (dreifach SK45-Einfangsondennäpfe und ein "Leerwert"-Napf) und zur Hybridisierung 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Inhalt der Platten wurde verworfen und die Platten wurden gewaschen, blockiert und mit Avidin:Meerrettichperoxidase behandelt, wie oben in Stufe 9 beschrieben. Nach Zugabe von H₂O₂ und OPD wurde die Farbentwicklung bei 490 nm unter Verwendung eines Plattenlesegeräts bestimmt.
Die Ergebnisse der Platteneinfanghybridisierung sind unten angegeben. Bezug nehmend auf die Tabelle 1 unten wird der Einfang durch Hybridisierung biotinylierter PCR-Produkte erläutert unter Verwendung von HTLV-1-Primern SK43/SK44, die spezifisch sind für HTLV-1-tax, durch Amplifizierung homologer Matrizen (pTAX) und heterologer Matrizen (pRT-POL). Biotin-11-dUTP wurde als Vorläufer der PCR-Reaktion zugegeben (siehe Beispiel 7) und die PCR-Bedingungen waren wie in Beispiel 4 beschrieben. Der Platteneinfangtest erfolgte wie beschrieben. Die Proben wurden 1:25 und 1:100 in 1 M GuSCN zur Hybridisierung verdünnt, wonach die Platten gewaschen, blockiert und mit Avidin-HRP behandelt wurden. Die OD₄₉₀ wurde nach 35 Minuten Farbentwicklung mit H₂O₂/OPD bestimmt. Die unten angegebenen Zahlen sind Durchschnittswerte von Dreifachproben.
Tabelle 1
Die Nachweisgrenze für diesen Test scheint 20 Kopien reines Zielplasmid zu sein (OD₄₉₀ der 1:25-Verdünnung war 0,123). Die negative Kontrolle "ohne Matrize" und die negative Kontrolle unter Verwendung einer heterologen Amplifikationsmatrize ergaben OD-Werte von 0,007 bzw. 0,000 bei einer Verdünnung von 1:25 und 0,026 bzw. 0,042 bei einer Verdünnung von 1:100.
Beispiel 9 (Referenzbeispiel)
Agarosegelelektrophorese und Southern-Blot-Hybridisierung
Aliquots (25 μl) sowohl von unmarkierten (Beispiel 6) als auch mit Biotin markierten (Beispiel 7) PCR-Produkten wurden im Vakuum getrocknet, wieder in 5 μl Wasser und 2 μl Agarosegelbeladungspuffer [0,25% (G/V) Bromphenolblau, 0,25% (G/V) Xylolcyanol, 30% (V/V) Glycerol] suspendiert und auf ein 3% (G/V) Nu-Sieve^R GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME)/1% (G/V) Sea-Kem-(FMC)-Agarosegel in TBE, das 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthielt, geladen. Das Gel wurde mit einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht und fotografiert. Das Gel wurde dann 30 Minuten lang in 0,5 n NaOH, 1 M NaCl und 30 Minuten in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, behandelt und über Nacht auf Nytran^R-(Schleicher und Schuell Inc., Keene, HN)-Nylonmembranen mit hohem Salzgehalt geblottet gemäß im Stand der Technik bekannten Standardverfahren. Der Blot ("Southern Blot") wurde dann 30 Minuten bei 75°C gebacken und 1 bis 4 Stunden lang bei 37°C in einem abgeschlossenen Beutel, der 6 × SSPE [1 × SSPE = 0,18 M NaCl, 10 mM NaPO₄, pH 7,7, 1 mM EDTA]; 1 % (G/V) Natriumdodecylsulfat (SDS) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI); 10 × Denhardt's Reagenz [1% (G/V) jeweils Ficoll (Pharmacia, Piscataway, NJ), Polyvinylpyrrolidon (Sigma) und BSA (Sigma)] und 50 μg/ml Lachssperma-DNA enthielt, vorhybridisiert, hitzedenaturiert und schnell abgekühlt.
In 2 war die PCR-Amplifikation wie in den Beispielen 6 und 7 beschrieben und die Bedingungen für Agarosegelelektrophorese, Blotten, Prähybridisierung und Hybridisierung waren wie in diesem Beispiel beschrieben.
In der oberen Hälfte der Fotografie sind die mit Biotin markierten PCR-Produkte von Beispiel 7 gezeigt: amplifizierte Produkte von 1300, 100, 50, 20 und 10 Kopien von pTAX (Bahnen 1 bis 5); PCR "ohne Matrize" als negative Kontrolle (Bahn 6).
In der unteren Hälfte der Fotografie sind die unmarkierten PCR-Produkte von Beispiel 6 gezeigt: amplifizierte Produkte von 1300, 100, 50, 20 und 10 Kopien von pTAX (Bahnen 1 bis 5); PCR "ohne Matrize" als negative Kontrolle (Bahn 6).
Eine Amplicon-spezifische Sonde, SK45, wurde mit ³²P-ATP markiert unter Verwendung von Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim Biochemicals) unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik Standard sind. Zur Hybridisierung wurde diese radioaktiv markierte Sonde dem Hybridisierungspuffer (6 × SSPE, 1% (G/V) SDS) in einer Rate von 4,1 × 10⁶ cpm/Blot zugefügt. Nach 2- bis 3-stündiger Hybridisierung bei 60°C wurde der Blot mehrere Male mit Stringenz gewaschen und wurde über Nacht bei –80°C unter einen Kodak-X-OMAT-AR-Film mit einer Verstärkungsfolie gelegt.
Nach der Übernacht-Belichtung war die Nachweisgrenze für den Southern Blot 10 Kopien des Plasmid-pTAX-Ziels für PCR-Produkte, die nicht biotinyliert waren (Beispiel 6) und 20 Kopien des Zielplasmids für biotinylierte PCR-Produkte (Beispiel 7). (Siehe Fotografie des Autoradiogramms, 2). Die PCR "ohne Matrize" als negative Kontrolle ergab kein nachweisbares Produkt bei der Autoradiographie.
Beispiel 10 (Referenzbeispiel)
Oligonucleotidhybridisierungstest
Bezug nehmend auf 3 waren die Bedingungen des OH-Tests (Herstellung der markierten Sonde, Denaturierung und Annealingbedingungen und Bedingungen für die Polyacrylamidgelelektrophorese) wie in diesem Beispiel beschrieben.
Die gezeigte Fotografie ist eine Übernacht-Belichtung (–80°C mit einer Verstärkungsfolie auf Kodak-X-OMAT-AR-Film) des Autoradiogramms, das die Signale zeigt, die von 1300, 100, 50, 20 oder 10 Kopien von pTAX (Bahnen 1 bis 5); PCR "ohne Matrize" als negative Kontrolle (Bahn 6); 10⁴ extrahierten Jurkat-Zellen, die konstitutiv HTLV-1-tax exprimieren, die mit PCR amplifiziert wurden (Bahn 7); 10⁴ extrahierten Jurkat-Zellen, die mit PCR amplifiziert wurden (Bahn 8); OH-negativer Kontrolle, bei der keine amplifizierte DNA dem ³²P-SK45 für den OH-Test zugefügt wurde (Bahn 9) erzeugt wurden.
Die unmarkierten PCR-Produkte von dem Primersatz SK43/SK44 (Beispiel 6) wurden mit Oligonucleotidhybridisierungstest (OH-Test) analysiert, um die Nachweisgrenze für dieses Format zu bestimmen. Das Verfahren war im Wesentlichen, wie von Abbott et al. in J. Inf. Dis. 158: 1158-1169 (1988) für die flüssige Hybridisierung (LH) beschrieben. 30 μl PCR-amplifiziertes Produkt wurden 10 μl einer Sondenmischung zugefügt, die 250.000 bis 400.000 cpm ³²P-markierte SK45-Sonde, verdünnt in 44 mM EDTA, 66 mM NaCl enthielt. Die DNA-Mischung wurde bei 95°C 5 Minuten lang denaturiert und anschließend sofort mit der Sonde bei 55°C 15 Minuten lang reassoziieren gelassen. 10 μl Agarosegelbeladungspuffer (Beispiel 9) wurden zugegeben und die Hälfte des Volumens wurde auf ein natives 10% (G/V) Polyacrylamidgel (Acrylamid:Bisacrylamid 19:1) in TBE geladen. Die Elektrophorese erfolgte bei 200 V, bis das Bromphenolblau die untere Gelfront erreichte. Die obere Hälfte des Gels belichtete einen Kodak-X-OMAT-AR-Film mit Belichtung 3 Stunden und über Nacht bei –80°C mit einer Verstärkungsfolie.
Entweder nach 3-stündiger (nicht gezeigt) oder Übernacht-Belichtung (3) sind 10 Kopien des amplifizierten Plasmid-pTAX-Ziels deutlich als spezifische Bande zu sehen. Die Probe "ohne Matrize" als negative Kontrolle und andere negative Kontrollen erzeugten keine Banden.
Beispiel 11 (Referenzbeispiel)
Testvergleich und Diskussion der Ergebnisse
Der Platteneinfangtest (Beispiel 8) wurde mit üblicheren Tests, Southern-Blot-Hybridisierung (Beispiel 9) und Oligonucleotidhybridisierungs-(OH)-Test (Beispiel 10), bezüglich der Fähigkeit, minimale Kopienzahlen der Ziel-HTLV-1-DNA nach 30 Zyklen PCR-Amplifikation (Beispiele 6 und 7) nachzuweisen, verglichen.. Alle drei getesteten Nachweissysteme (Platteneinfangtest, Southern Blot und OH-Test) waren im Wesentlichen in ihrer Fähigkeit, geringe Kopienzahlen des reinen Zielplasmids nach 30 Zyklen PCR-Amplifikation nachzuweisen, vergleichbar. Es wurde gefunden, dass der Platteneinfang 20 Kopien nachweisen konnte, der Southern Blot zwischen 10 und 20 Kopien und OH 10 Kopien des reinen Ziels. Von den drei Nachweissystemen ist der Plattentest der schnellste, der ein definitives Ergebnis innerhalb von Stunden liefert. Außerdem liefert der Plattentest numerische OD-Werte im Gegensatz zu subjektiven Autoradiogrammbanden mit Souther Blot und OH-Tests. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher die objektive numerische Bestimmung der "Positivität" einer Probe und die Berechnung eines objektiven Ausschlusswerts für die untere Grenze der Positivität. (Dieser Ausschlusswert ist ein OD-Wert, unterhalb dem Proben als negativ angesehen werden mit einem berechneten Grad der statistischen Signifikanz).
Die von dem Plattentest gelieferten OD-Werte lassen auch die quantitative Bestimmung eines Verhältnisses von "Signal zu Hintergrund" zu, das wichtig ist bei der Validierung eines diagnostischen Tests. Für Southern-Blot-Hybridisierung und OH-Testformate kann "Signal zu Hintergrund" nur durch visuelle Auswertung des Signals aus der Autoradiographie abgeschätzt werden.
Beispiel 12
Nachweis von Chlamydia-trachomatis-Sequenzen
Zwei Sätze von Primern und Einfangsonden wurden synthetisiert, um spezifisch Chlamydia trachomatis nachzuweisen. Die Oligonucleotidsequenzen wurden aus dem kryptischen Plasmid von C.-trachomatis-L1-Serovar (Hatt et al., Nucleic Acids Research, 16: 4053-4067, 1988) ausgewählt.
Primersatz A erzeugte ein spezifisches Amplicon mit 208 bp unter Verwendung der folgenden Primer:
CP-24 (25-mer, +Polarität, Basen 195-219)
5' GGG ATT CCT GTA ACA ACA AGT CAG G 3'
d.h. der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder deren Verlängerung verursacht:
5' C CTG ACT TGT TGT TAC AGG AAT CCC 3'
CP-27 (26-mer, -Polarität, Basen 377-402)
5' CCT CTT CCC CAG AAC AAT AAG AAC AC 3'
d.h. der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder deren Verlängerung verursacht:
5' GT GTT CTT ATT GTT CTG GGG AAG AGG 3'.
Das für Primersatz A spezifische Amplicon mit 208 bp wurde mit der Einfangsonde CP-35 nachgewiesen:
CP-35 (26-mer, -Polarität, Basen 235-260)
5' CAT AGC ACT ATA GAA CTC TGC AAG CC 3'
d.h. die Sonde ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet:
5' GG CTT GCA GAG TTC TAT AGT GCT ATG 3'.
Chlamyida-Primersatz B erzeugte ein spezifisches Amplicon mit 173 bp unter Verwendung der folgenden Primer:
CP-37 (23-mer, +Polarität, Basen 678-700)
5' GTC CTG CTT GAG AGA ACG TGC GG 3'
d.h. der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder deren Verlängerung verursacht:
5' CC GCA CGT TCT CTC AAG CAG GAC 3'.
CP-38 (24-mer, -Polarität, Basen 827-850)
5' CTC CCA GCT TAA GAA CCG TCA GAC 3'
d.h. der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder deren Verlängerung verursacht:
5' GTC TGA CGG TTC TTA AGC TGG GAG 3'.
Das Amplicon des Primersatzes B mit 173 bp wurde mit der Einfangsonde CP-39 nachgewiesen:
CP-39 (23-mer, -Polarität, 726-748)
5' TGT CTT CGT AAC TCG CTC CGG AA 3'
d.h. die Sonde ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet:
5' TT CCG GAG CGA GTT ACG AAG ACA 3'.
Primersatz B wurde verwendet, um das Zielplasmid pCHL-1 zu amplifizieren. Unter Verwendung von 5'-biotinylierten Primern wurde das Ziel mit 30 Zyklen PCR amplifiziert und die biotinylierten Produkte wurden mit Einfanghybridisierung (Tabelle 2) untersucht. Nach 10 Minuten Farbentwicklung (TMB/H₂O₂) waren nur 20 Ausgangskopien von pCHL-1 nachweisbar (1:25-Verdünnung, OD₄₅₀ = 0,140) mit vernachlässigbarem Hintergrundsignal (OD₄₅₀ = 0,009 für eine Verdünnung von 1:25).
Tabelle 2
Beispiel 13
Nachweis von McCoy-Zellen und klinischen Isolaten, die mit Chlamydia trachomatis infiziert sind
McCoy-Zellen, entweder nicht geimpft oder infiziert mit C. trachomatis wurden in 2SP (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 2 M Saccharose), das 100 μg/ml Proteinase K, 1 % Tween-20 enthielt, lysiert und wurden 1 Stunde lang bei 55°C inkubiert und anschließend 10 Minuten bei 95°C. Der Primersatz A (Beispiel 12) wurde verwendet in einer PCR-Amplifikation mit 30 Zyklen und die Produkte wurden mit dem in Beispiel 8 beschriebenen Plattentest untersucht. Nach 10 Minuten Farbentwicklung ergaben sowohl 10 als auch 100 infizierte Mc-Coy-Zellen, wenn sie mit 10⁵ nicht infizierten McCoy-Zellen vermischt wurden, OD₄₅₀-Werte > 2000 (sowohl für 1:25- als auch 1:100-Verdünnungen des Produkts in GuSCN). Extrahierte und amplifizierte nicht infizierte Zellen allein (10⁵ Zellen) ergaben OD₄₅₀-Werte von < 0,050.
Klinische Proben, die vorher bezüglich des Ausmaßes der cytopathischen Wirkungen (CPE) bewertet worden waren [in einem Bereich von "negativ" (keine CPE) bis 4+ (sehr bemerkenswerte CPE)] wurden in glei cher Weise extrahiert und über 30 Zyklen mit PCR unter Verwendung des Primersatzes A amplifiziert. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 3 gezeigt: Tabelle 3
Zusammenfassend werden hier neue Wege der Markierung und des Nachweises von amplifizierten Produkten von PCR beschrieben. Diese Markierungs- und Einfangverfahren bieten mehrere Vorteile gegenüber konventionellen Nachweismethoden:

1. Die Biotinylierung und der Einfang der PCR-Produkte auf Mikrotiterplatten ist ein schnellerer Test. Der Plattentest der vorliegenden Erfindung kann in 2 Stunden durchgeführt werden, verglichen mit etwa 6 bis 24 Stunden für einen OH-Test und sogar 48 Stunden für Southern Blotting und Hybridisierung.
2. Das Plattentestformat ist weniger arbeitsintensiv und ist der Automatisierung zur Analyse einer großen Anzahl von Proben zugänglich.
3. Anders als die anderen beiden untersuchten Testformate erfordert das Plattentestformat nicht die Vorbereitung, Reinigung oder Handhabung gefährlicher radioaktiver Sonden mit hoher spezifischer Aktivität.
4. Der Einfang von biotinylierten Produkten über einen Plattentest liefert eine objektive quantitative Auswertung der Hybridisierung; die Berechnung eines statistischen Ausschlusspunkts zur Positivität der Proben und die quantitative Berechnung eines Testverhältnisses von "Signal zu Hintergrund".

Die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen werden nur als Beispiele angeboten und die Erfindung ist nur so weit beschränkt, wie es die beigefügten Ansprüche angeben.
Die folgenden Ausführungsformen werden hier beschrieben:
Ausführungsform 1 ist ein Verfahren zum Nachweis einer markierten Zielnucleinsäuresequenz, die aus einer biologischen Probe amplifiziert wurde, das beinhaltet, dass die Zielnucleinsäuresequenz mit mindestens einer Oligonucleotideinfangsonde mit einer Nucleinsäuresequenz, die im Wesentlichen komplementär zu der Zielsequenz ist, hybridisiert wird, wobei die Einfangsonde an einen festen Polystyrolträger gebunden ist und die Gegenwart der Markierung, die mit der Zielsequenz verbunden ist, bestimmt wird.
Ausführungsform 2 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei der feste Polystyrolträger eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen ist.
Ausführungsform 3 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei der feste Polystyrolträger eine verbesserte Proteinbindungskapazität hat.
Ausführungsform 4 ist das Verfahren von Ausführungsform 2, wobei die Mikrotiterplatte eine verbesserte Proteinbindungskapazität hat.
Ausführungsform 5 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei die Hybridisierung durch Verwendung mehrerer nicht überlappender Einfangsonden erreicht wird.
Ausführungsform 6 ist das Verfahren von Ausführungsform 2, wobei die Einfangsonde passiv an Polystyrolmikrotiterplattennäpfe gebunden ist.
Ausführungsform 7 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei an die Einfangsonden mit Homopolymeren von Desoxyribonucleotidtriphosphaten angehängt werden.
Ausführungsform 8 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei die Zielnucleinsäuresequenz DNA oder RNA ist.
Ausführungsform 9 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, das zusätzlich eine Hitzedenaturierung der doppelsträngigen DNA beinhaltet, um einzelsträngige DNA zu bilden, wobei die Denaturierung vor der Hybridisierungsstufe durchgeführt wird.
Ausführungsform 10 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei die Hybridisierung in Gegenwart von Guanidinthiocyanat durchgeführt wird.
Ausführungsform 11 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei das Markierungsmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus radioaktiv markierten Verbindungen, lumineszierenden Reagenzien, fluoreszierenden Reagenzien, elektronendichten Reagenzien, thermostabilen Enzymen, Liganden, Antikörper-Haptenkomplexen und komplexierenden Mitteln.
Ausführungsform 12 ist das Verfahren von Ausführungsform 1, wobei das Markierungsmaterial Biotin ist.
Ausführungsform 13 ist das Verfahren von Ausführungsform 12, wobei die Biotinmarkierung in die Nucleinsäurezielsequenz während der Amplifikation der Zielsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion eingearbeitet oder daran gebunden wird.
Ausführungsform 14 ist das Verfahren von Ausführungsform 13, wobei die Biotinmarkierung in die Nucleinsäurezielsequenz eingearbeitet wird durch Einbau von Biotin-11dUTP während der Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation.
Ausführungsform 15 ist das Verfahren von Ausführungsform 12, wobei die Reaktion in Gegenwart von Taq-Polymerase durchgeführt wird.
Ausführungsform 16 ist das Verfahren von Ausführungsform 14, wobei nicht eingebautes Biotin entfernt wird, indem nach der Hybridisierung und vor der Bestimmung der Markierung gewaschen wird.
Ausführungsform 17 ist das Verfahren von Ausführungsform 13, wobei die Biotinmarkierung in die Nucleinsäurezielsequenz eingearbeitet wird unter Verwendung von 5'-biotinylierten Primern während der Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation.
Ausführungsform 18 ist das Verfahren von Ausführungsform 12, wobei der Nachweis mit Biotinmarkierung erreicht wird durch Zufügung des Avidin-Meerrettichperoxidasekomplexes und Reaktion mit einem chromogenen Mittel und Substrat, um ein kolorimetrisches Signal zu entwickeln.
Ausführungsform 19 ist das Verfahren von Ausführungsform 12, wobei der Nachweis mit Biotinmarkierung erreicht wird durch Zufügung von Avidin oder Streptavidin, das mit einem Mitglied der Gruppe bestehend aus alkalischer Phosphatase, β-Galactosidase, Luciferase, Fluorescein und Texas-Rot, komplexiert ist.
Ausführungsform 20 ist das Verfahren von Ausführungsform 18, wobei eine Waschstufe durchgeführt wird, um nicht gebundene Avidin-Meerrettichperoxidase vor Zugabe des chromogenen Mittels und Substrats zu entfernen.
Ausführungsform 21 ist das Verfahren von Ausführungsform 18, wobei das chromogene Mittel 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin ist und das Substrat Hydrogenperoxidase ist, wobei die Reaktion auf solche Art und Weise durchgeführt wird, dass ein kolorimetrisches Signal erzeugt wird.
Ausführungsform 22 ist das Verfahren von Ausführungsform 18, wobei das chromogene Mittel o-Phenylendiamin ist und das Substrat Wasserstoffperoxid ist, wobei die Reaktion in solcher Art und Weise durchgeführt wird, dass ein kolorimetrisches Signal erzeugt wird.
Ausführungsform 23 ist das Verfahren von Ausführungsform 2, wobei die Näpfe entnehmbar sind und der Nachweis weiter umfasst, dass das Ausmaß der Einfanghybridisierung bestimmt wird mithilfe einer Szintillationszählung der entnehmbaren Näpfe.
Ausführungsform 24 ist das Verfahren von Ausführungsform 18, wobei die quantitative Auswertung der Einfanghybridisierung bestimmt wird mithilfe der Messung der optischen Dichte der Intensität der entwickelten Farbsignale.
Ausführungsform 25 ist das Verfahren von Ausführungsform 19, wobei die quantitative Auswertung der Einfanghybridisierung bestimmt wird mithilfe der Messung der optischen Dichte der Intensität der entwickelten Farbsignale.
Ausführungsform 26 ist ein Verfahren, um das Ausmaß der Hybridisierung einer Zielnucleinsäuresequenz in einem Einfangsondentest quantitativ zu bestimmen, wobei das Verfahren umfasst, dass Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl von Näpfen als Träger für passiv gebundene Einfangsonden verwendet werden, Platten mit einer biologischen Probe, die eine Zielnucleinsäuresequenz enthält, die markiert wurde, um ein Signal zu erzeugen, das nachweisbar ist, in Kontakt gebracht werden und in quantitativer Art und Weise die so erzeugten Signale gezählt oder in anderer Weise bestimmt werden.
Ausführungsform 27 ist ein Nucleinsäurehybridisierungstest, der die folgenden Stufen umfasst:

(a) dass eine biologische Probe bereitgestellt wird, die eine Zielnucleinsäuresequenz enthält;
(b) eine Polymerase-Kettenreaktion mit der Probe durchgeführt wird unter Verwendung von Primern, die so ausgewählt werden, dass die Amplifikation von Nucleinsäuren mit der Zielsequenz erfolgt und bei der Amplifikation ein markierendes Material eingearbeitet wird, das nachfolgend nachgewiesen werden kann;
(c) eine Oligonucleotideinfangsonde bereitgestellt wird mit einer Nucleinsäuresequenz, die im Wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist;
(d) die Einfangsonde an die Näpfe einer Polystyrolmikrotiterplatte gebunden wird;
(e) die Mikrotiterplatte mit der gebundenen Einfangsonde mit dem amplifizierten Produkt von Stufe (b) in Gegenwart von Guanidinthiocyanat in Kontakt gebracht wird und
(f) die Gegenwart der Zielsequenz durch Nachweis der Markierung bestimmt wird.

Ausführungsform 28 ist der Hybridisierungstest von Ausführungsform 27, wobei die Zielsequenz für den nachfolgenden Nachweis markiert wird mithilfe des Einbaus von Biotin-11-dUTP durch Taq-Polymerase während der Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation der Zielsequenzen.
Ausführungsform 29 ist der Hybridisierungstest von Ausführungsform 27, wobei die Zielsequenz für den nachfolgenden Nachweis markiert wird durch Einbau von 5'-biotinylierten Oligonucleotidprimern während der Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation der Zielsequenzen.
Ausführungsform 30 ist ein Diagnosekit zum Nachweis einer Zielnucleinsäuresequenz, wobei der Kit PCR-Primer, die so ausgewählt sind, dass sie Nucleinsäuren mit der Zielsequenz amplifizieren, und eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen, an die Oligonucleotideinfangsonden mit einer Nucleinsäuresequenz gebunden sind, die im Wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist, enthält.
Ausführungsform 31 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 30, der zusätzlich Reagenzien enthält, um die PCR-Amplifikation und Hybridisierung der Einfangsonde und der Zielsequenz durchzuführen.
Ausführungsform 32 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 31, der zusätzlich Taq-Polymerase und dNTP's enthält.
Ausführungsform 33 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 32, wobei ein oder mehrere der dNTP's ein Markierungsmittel enthalten.
Ausführungsform 34 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 30, wobei mindestens einer der PCR-Primer über eine Linkerarm-Modifizierung am 5'-Ende biotinyliert ist.
Ausführungsform 35 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 30, wobei die Mikrotiterplatte Polystyrol mit verbesserter Proteinbindungskapazität aufweist.
Ausführungsform 36 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 30, der zum Nachweis von Chlamydia trachomatis geeignet ist und wobei die Primer Oligonucleotide sind, die an die folgenden Sequenzen binden oder deren Verlängerung verursachen:
5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'
und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'.
Ausführungsform 37 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 36, wobei die Sonde ein Oligonucleotid ist, das an die folgende Sequenz bindet:
5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'.
Ausführungsform 38 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 30, der geeignet ist zum Nachweis von Chlamydia trachomatis, wobei die Primer Oligonucleotide sind, die an die folgenden Sequenzen binden oder deren Verlängerung verursachen:
5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'
und 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'.
Ausführungsform 39 ist der Diagnosekit von Ausführungsform 38, wobei die Sonde ein Oligonucleotid ist, das an die folgende Sequenz bindet:
5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
Ausführungsform 40 sind Primer zur Verwendung in der PCR-Amplifikation von Chlamydia-trachomatis-Nucleinsäurezielsequenzen, wobei die Primer Oligonucleotide, sind, die an die folgenden Sequenzen binden oder deren Verlängerung verursachen:
5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'
und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'.
Ausführungsform 41 sind Sonden, die nützlich sind in Hybridisierungstests für DNA-Sequenzen, die mit den Primern von Ausführungsform 40 amplifiziert werden, wobei die Sonden Oligonucleotide sind, die an die folgende Sequenz binden:
5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'.
Ausführungsform 42 sind Primer zur Verwendung in der PCR-Amplifikation von Chlamydia-trachomatis-Nucleinsäurezielsequenzen, wobei die Primer Oligonucleotide sind, die an die folgenden Sequenzen binden oder deren Verlängerung verursachen:
5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'
und 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'
Ausführungsform 43 sind Sonden, die nützlich sind in Hybridisierungstests von DNA-Sequenzen, die mit den Primern von Ausführungsform 42 amplifiziert werden, wobei die Sonde ein Oligonucleotid ist, das an die folgende Sequenz bindet:
5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
Ausführungsform 44 ist ein Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis mit PCR-Amplifikation und Hybridisierungstest, das umfasst, dass in der PCR-Amplifikation Primer verwendet werden, die Oligonucleotide sind, die an die folgenden Sequenzen binden oder deren Verlängerung verursachen:
5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'
und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'.
Ausführungsform 45 ist das Verfahren von Ausführungsform 44, wobei der Hybridisierungstest weiterhin eine Einfangsonde verwendet und wobei die Einfangsonde ein Oligonucleotid ist, das an die folgende Sequenz bindet:
5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3' .
Ausführungsform 46 ist ein Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis mit PCR-Amplifikation und Hybridisierungstest, das umfasst, dass in der PCR-Amplifikation Primer verwendet werden, die Oligonucleotide sind, die an die folgenden Sequenzen binden oder deren Verlängerung verursachen:
5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'
und 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'.
Ausführungsform 47 ist das Verfahren von Ausführungsform 46, wobei der Hybridisierungstest weiterhin eine Einfangsonde verwendet und die Einfangsonde ein Oligonucleotid ist, das an die folgende Sequenz bindet:
5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
Ausführungsform 48 ist eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen, die in einem Hybridisierungstest einer amplifizierten Nucleinsäurezielsequenz nützlich ist, an die irgendeine Oligonucleotideinfangsonde gebunden ist, wobei die Einfangsonde eine Nucleinsäuresequenz hat, die im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist.
Ausführungsform 49 ist die Mikrotiterplatte von Ausführungsform 48, die aus Polystyrol aufgebaut ist und eine verbesserte Proteinbindungskapazität hat.
Ausführungsform 50 sind Primer, die eine Sequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5' GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG 3'
5' CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC 3'
5' GTCCTGCTTGAGAGAACGTGCGG 3'
und 5' CTCCCAGCTTAAGAACCGTCAGAC 3'.
Ausführungsform 51 sind Sonden, die eine Sequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5' CATAGCACTATAGAACTCTGCAAGCC 3'
und 5' TGTCTTCGTAACTCGCTCCGGAA 3'.
Ausführungsform 52 sind Primer gemäß Ausführungsform 50 mit einer Markierung am 5'-Ende.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Diagnosekit zum Nachweis einer Zielnucleinsäuresequenz von Chlamydia trachomatis, wobei der Kit PCR-Primer enthält, wobei die Primer Oligonucleotide sind, die spezifisch an die folgenden Sequenzen: 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3' und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3' binden oder durch diese Sequenzen eine Verlängerung verursachen, und eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen, an die Oligonucleotideinfangsonden gebunden sind mit einer Nucleinsäuresequenz, die im Wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist.
Diagnosekit zum Nachweis einer Zielnucleinsäuresequenz von Chlamydia trachomatis, wobei der Kit PCR-Primer enthält, wobei die Primer Oligonucleotide sind, die spezifisch an die folgenden Sequenzen: 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3' und 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3' binden oder durch diese Sequenzen eine Verlängerung verursachen, und eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen und daran gebunden Oligonucleotideinfangsonden mit einer Nucleinsäuresequenz, die im Wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist.
Diagnosekit nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der zusätzlich Reagenzien enthält, um die PCR-Amplifikation und Hybridisierung der Einfangsonde und der Zielsequenz durchzuführen.
Diagnosekit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der zusätzlich Taq-Polymerase und dNTP's enthält.
Diagnosekit nach Anspruch 4, wobei ein oder mehrere der dNTP's ein Markierungsmittel aufweisen.
Diagnosekit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens einer der PCR-Primer über eine Linker-Arm-Modifikation am 5'-Ende biotinyliert ist.
Diagnosekit nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Mikrotiterplatte Polystyrol aufweist, das behandelt wurde, um die Proteinbindungskapazität zu verbessern.
Diagnosekit nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 6, wenn sie von Anspruch 1 abhängig sind, wobei die Sonde ein Oligonucleotid ist, das vollständig oder im Wesentlichen vollständig zu der folgenden Sequenz: 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3' komplementär ist.
Diagnosekit nach einem der Ansprüche 2 und 3 bis 6, wenn sie von Anspruch 2 abhängig sind, wobei die Sonde ein Oligonucleotid ist, das vollständig oder im Wesentlichen vollständig zu der folgenden Sequenz 5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3' komplementär ist.
Primer zur Verwendung in der PCR-Amplifikation einer Nucleinsäurezielsequenz von Chlamydia trachomatis, wobei die Primer Oligonucleotide sind, die spezifisch an die folgenden Sequenzen: 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3' und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'; oder 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3' und 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'. binden oder durch diese Sequenzen eine Verlängerung verursachen.
Sonden gebunden an eine Mikrotiterplatte, die geeignet sind für Hybridisierungsassays von DNA-Sequenzen, die mit den Primern von Anspruch 10 amplifiziert werden, wobei die Sonden Oligonucleotide sind, die vollständig oder im Wesentlichen vollständig zu der folgenden Sequenz 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'; oder 5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3' komplementär sind.
Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis durch PCR-Amplifikation und Hybridisierungsassay, das beinhaltet, dass in der PCR-Amplifikation Primer verwendet werden, die Oligonucleotide sind, die spezifisch an die folgenden Sequenzen binden oder durch diese Sequenzen eine Verlängerung verursachen: 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3' und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Hybridisierungsassay weiterhin eine Einfangsonde verwendet und wobei die Einfangsonde ein Oligonucleotid ist, das vollständig oder im Wesentlichen vollständig zu der folgenden Sequenz 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3' komplementär ist.
Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis durch PCR-Amplifikation und Hybridisierungsassay, das beinhaltet, dass bei der PCR-Amplifikation Primer verwendet werden, die Oligonucleotide sind, die spezifisch an die folgenden Sequenzen binden oder oder durch diese Sequenzen eine Verlängerung verursachen: 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3' und 5'GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'.