DE69033387T2

DE69033387T2 - Verfahren und satz fur die detektion von ziel nuklein sauren unter verwendung einer fangsonde die uber ein zwischenprotein an eine polystyrene oberflache gekoppelt ist.

Info

Publication number: DE69033387T2
Application number: DE69033387T
Authority: DE
Inventors: Mathew Longiaru; Sheryl Beth Silver; Michael Anthony Sulzinski
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 2000-03-30
Anticipated expiration: 2010-09-28
Also published as: EP0875583A2; IL95800A; ES2275292T3; DK0420260T3; JP2719225B2; ATE345398T1; CA2026280C; DE69034232D1; AU7280494A; ATE187499T1; BR9004881A; DE69033387D1; US5232829A; EP0420260A2; EP0420260B1; EP0875583B1; NZ235463A; CA2026280A1; AU6329090A; EP0420260A3

Description

Die vorliegende Erfindung liefert eine Möglichkeit für das Einfangen durch Hybridisierung von durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifizierte DNA auf einem Polystyrolfestphasenträger mit einer verbesserten Proteinbindungskapazität. Bevorzugt ist ein solcher fester Träger eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen. Nach dem Markieren der amplifizierten Ziel-DNA (z. B. mit Biotin) während der Amplifikation in der PCR-Reaktion wird die markierte DNA spezifisch eingefangen durch Basenpaarhybridisierung an eine Ampliconspezifische Oligonucleotideinfangsonde, die passiv an den Mikrotiternapfgebunden ist. Wenn Biotin als Markierung verwendet wird, wird Avidin : HRP-Komplex zugegeben und entweder mit (a) Wasserstoffperoxidsubstrat und o-Phenylendiamin (OPD) als Chromogen oder (b) Wasserstoffperoxidsubstrat und Tetramethylbenzidin als Chromogen (TMB) umgesetzt. Es entwickelt sich ein kolorimetrisches Signal, das die quantitative Auswertung der mit PCR amplifizierten DNA zuläßt.
Es wurde gefunden, daß die Empfindlichkeit des Einfangs von biotinylierten PCR-Produkten auf der Platte vergleichbar ist der Empfindlichkeit unter Verwendung von radioaktiv markierten Sonden in Southern-Blot-Hybridisierungen und Oligonucleotidhybridisierungs-(OH)-Assays. Die Möglichkeit des Einfangs auf der Platte bietet jedoch verschiedene Vorteile: (a) eine schnellere Assayzeit; (b) weniger aufwendige intensive Tests, ohne Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde und (c) eine objektive, quantitative Auswertung der Hybridisierung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Diagnose spezifischer Krankheitszustände durch den Nachweis der Gegenwart von spezifischen DNA-Sequenzen, die die verursachenden Mikroorganismen kennzeichnen. Spezifische Sonden und Primer wurden für einen solchen Mikroorganismus gefunden, nämlich Chlamydia trachomatis.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung von Kits zum Nachweis einer DNA-Sequenz, wobei die Kits den Polystyrolfestphasenträger und Sätze von PCR-Reagenzien einschließlich der spezifischen Primer und Sonden umfassen, die für die Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenzen, die mit den Einfangsonden hybridisieren, vorausgewählt wurden. Solche Kits würden typischerweise das Enzym oder die Enzyme einschließen, die für die PCR-Reaktion notwendig sind, bevorzugt ein thermostabiles Enzym, wie Taq-(Thermus aquaticus)-Polymerase. Im Fall der Verwendung einer Mikrotiterplatte sind auch Mikrotiterplatten mit den Einfangsonden für die spezifische Zielsequenz, die bereits daran gebunden sind, enthalten.
Die U.S.-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202 offenbaren Methoden zum Amplifizieren von DNA-Sequenzen mit einer im Stand der Technik als "Polymerase-Kettenreaktion" (PCR) bekannten Technik. Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein Verfahren, bei dem DNA spezifisch mit mehrfachen Primerextensionssynthesen komplementärer Stränge amplifiziert wird (Saiki et al., Science, 230: 1350-1354 und 239: 487-491: 1985, 1988). Das PCR-Produkt, das bis auf das 10&sup6;- bis 10&sup7;-fache amplifiziert wurde, ist ein DNA-Fragment mit diskreter Größe (Amplicon), das mit Gelelektrophorese nachgewiesen werden kann oder mit einem anderen hier beschriebenen Mittel. Kurz gesagt beinhaltet die PCR die Herstellung kurzer Oligonucleotidprimer, die entgegengesetzten Enden einer bekannten "Ziel-Sequenz" entsprechen, die man amplifizieren und anschließend nachweisen möchte. Bei diesem Verfahren wird DNA oder RNA aus Zellen, Gewebe, Körperflüssigkeiten und dgl. extrahiert. Die Nucleinsäure wird denaturiert und die Oligonucleotidprimer werden in molarem Überschuß zugegeben zusammen mit dNTPs (Desoxyribonucleotidtriphosphaten) und einem DNA-Polymeraseenzym, z. B. bevorzugt wärmestabiler Taq-Polymerase. Bei der nachfolgenden Wärmedenaturierung, dem Abkühlen, um eine Hybridisierung oder Assoziierung mit den Primern zuzulassen, und der Primerextension durch DNA-Polymerase werden zwei "lange Produkte", die mit den jeweiligen Primern beginnen, erzeugt, die komplementär zu den zwei Originalsträngen sind. Dieses Verfahren wird wiederholt und nach einem zweiten Zyklus werden zwei Originalstränge, zwei lange Produkte aus dem Zyklus 1, zwei neue "lange Produkte" und zwei "kurze Produkte" erzeugt. Die Länge dieser kurzen Produkte (Amplicons) ist gleich der Anzahl der Nucleotide zwischen beiden Primern und schließt diese ein. Mit zusätzlichen Zyklen werden zusätzliche "lange Produkte" erzeugt, die in linearer Weise mit jedem Zyklus zunehmen. Jedoch erhöht sich die Erzeugung von Amplicons in exponentieller Rate mit jedem Zyklus und mit Hilfe dieser Amplifikation wird der Nachweis von extrem kleinen Mengen an DNA möglich.
Durch die Verwendung der PCR-Technologie ist der Nachweis von spezifischen DNA-Sequenzen, die in winzigen Mengen vorhanden sind, möglich. Verschiedene dieser Techniken beinhalten die Verwendung verschiedener hybridisierter Sonden, die an bestimmten Materialien fixiert sind.
Wie später beschrieben werden wird, verwendet die vorliegende Erfindung die Fixierung einer Einfang-DNA-Sequenz an Mikrotiternäpfen und den anschließenden Nachweis durch Hybridisierung mit markierten (z. B. biotinylierten) Amplicons. Sie beinhaltet auch die Verwendung von Guanidinthiocyanat in der Hybridisierungsstufe. Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur beschrieben, die hier relevant sind. Zwei solche Berichte beschreiben die Immobilisierung von großen Ziel-DNAs an Mikrotiternäpfen gefolgt von der Hybridisierung dieser Zielmoleküle mit biotinylierten Oligonucleotid- oder durch Nick-Translation erhaltenen DNA-Sonden.
Cook et al., Nucleic Acids Research, 16: 4077-4095 (1988) immobisilierten Ziel-DNA aus dem Bakteriophagen M13 auf Mikro titernäpfen auf Immulon®2-Platten, indem sie die Ziel-DNA in 1 M Ammoniumacetat 1,5 bis 2 Stunden lang bei 37ºC inkubierten. Die immobilisierte Ziel-DNA wurde nach der Hybridisierung mit endständig Biotin markierten oder innen Biotinmarkierten Oligonucleotidsonden nachgewiesen, woran sich die Zugabe von Streptavidin-HRP-Komplex und Wasserstoffperoxid/o-Phenylendiamin (OPD) zum kolorimetrischen Nachweis der Hybridisierung anschloß.
Nagata et al., FEBS Lett., 183: 379-382 (1985) immobilisierten Ziel-DNA aus Lambda in Mikrotiternäpfen mit PBS, die 0,1 M MgCl&sub2; enthielt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht und anschließender Entfernung der Lösung wurde die Platte mit Ultraviolettlicht bestrahlt. An die Hybridisierung mit einer biotinylierten (mit Nick-Translation behandelten) Lambda-DNA-Sonde schloß sich eine Komplexierung mit Avidinbeta-Galactosidase an. Die Fluoreszenz wurde gemessen nach Zugabe des Substrats, 4-Methylumbelliferyl-beta-D-galactosid.
Hevey et al., U.S.-Patent Nr. 4 228 237, beschrieben ein Verfahren, bei dem Biotin, das mit Avidin (kovalent an ein Enzym gebunden) reagiert, verwendet wurde, um einen Liganden in flüssigem Medium nachzuweisen. Das vorliegende Verfahren unterscheidet sich darin, daß der Ligand direkt mit Biotin markiert wird, nicht ein zwischenzeitlich gebundener mit Biotin markierter Anti-Ligand. Weiterhin beschreiben verschiedene andere frühere Offenbarungen spezifische Hybridisierungssonden und die diagnostische Verwendung davon, z. B. U.S.-Patent Nr. 4 358 535 (Falkow et al.) und die Europäische Patentanmeldung Nr. 82 301 804.9 (Veröffentlichungsnummer 63 879; Yale University). Letztere beschreibt die Verwendung von mit Biotin markierten DNA-Sonden, die mit Enzymen nachgewiesen werden, die an Avidin- oder Biotin-spezifische Antikörper gebunden sind.
Ranki et al., U.S.-Patent Nr. 4 486 539, beschreiben die Verwendung von zwei sich nicht überlappenden Nucleinsäurereagenzien (eines an einen festen Träger gebunden und das andere markiert), um Mikroben durch DNA-Hybridisierung nachzuweisen und zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich darin, daß die Ziel-Nucleinsäure selbst markiert ist und nicht die Verwendung einer zusätzlichen markierten Nucleinsäuresonde zum Nachweis erfordert.
Stabinsky, U.S.-Patent Nr. 4 751 177, beschrieb eine DNA- Nachweismethode, bei der die Ziel-DNA in Lösung mit einem Mediatorpolynucleotid und mit einem markierten Sondenpolynucleotid hybridisiert wird. Das Mediatorpolynucleotid ist wiederum komplementär zu einem Polynucleotid, das an einem festen Träger immobilisiert ist. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich darin, daß (a) das Ziel während der Amplifikation markiert ist; keine markierte Reportergruppe zum Nachweis erforderlich ist und (b) die Einfangsonde direkt an einen festen Träger gebunden ist ohne die Verwendung eines Mediatorpolynucleotids.
Guanidinthiocyanat (GuSCH) wurde zur Zellextraktion und anschließenden Nucleinsäurehybridisierung verwendet. Z. B. erzeugten Thompson und Gillespie, Anal. Biochem., 163: 281-291 (1987) radioaktiv markierte RNA-Sonden, um Ziel-DNA oder -RNA nachzuweisen. In einem Dot-Blot-Versuch wurde die 32P-markierte Sonde in 5 M GuSCH/0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Dinatriumsalz, pH 8,0 hybridisiert. Pellegrino et al., BioTechniques, 5: 452-459 (1987) beschrieben eine Lösungshybridisierung zum Nachweis von HIV-RNA in Blutzellen. Die Blutzellen wurden in 5 M GuSCH/0,1 M EDTA gelöst und mit einer radioaktiv markierten RNA-Sonde in der gleichen Lösung bei Raumtemperatur hybridisiert. Mit TCA ausgefällte Hybride wurden auf Membranen gesammelt und die Radioaktivität durch Szintillationszählung bestimmt. Gillespie, Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US87/01023 (Internationale Veröffentli chung Nr. WO 87/06621) beschrieb die Verwendung von Guanidinthiocyanat zur Molekülhybridisierung unter Verwendung einer markierten Sonde, um Ziel-DNA, die an einen festen Träger gebunden ist, nachzuweisen. Das Patent beschreibt die Verwendung von GuSCH für die Molekülhybridisierung über einen Konzentrationsbereich von 3 M bis 6,5 M bei Umgebungstemperatur. Die Anweisung für eine solche Hybridisierung schließt die Bildung von Ziel-Nucleinsäure an Nitrocellulose oder eine Nylonmembran (Dot-Blot oder Southern-Blot), Prähybridisierung, Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde in GuSCH, Waschen und Nachweis mit Autoradiographie ein.
R. K. Saiki et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, Seiten 6230-6234 und die Europäische Patentschrift Nr. 237 362 offenbaren einen Test zum Nachweis von mit PCR amplifizierter DNA unter Verwendung einer Einfangssonde, die an eine Nylonmembran gebunden ist.
Das Britische Patent Nr. 2202328 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren unter Verwendung einer Einfangsonde, die an ein festes Material, z. B. Polystyrol, gebunden ist.
Kavai et al., 1982, J. Immunol. Meth., 48, Seiten 169-175, und R. Rubin et al., 1983, J. Immunol. Meth., 63, Seiten 359- 366 offenbaren Enzym-linked Immunosorbent-Assays (ELISAs) zum Messen von Antikörpern gegen native DNA, wobei DNA-Antigen an Polystyrol über methyliertes Rinderserumalbumin gebunden wird.
Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Hybridisierungseinfang von Ziel-DNA, dessen Merkmale in den beigefügten Ansprüchen spezifiziert sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 erläutert die Herstellung eines chemischen Linkers, der modifiziert wurde, um die Biotinylierung von Oligonucleotid-PCR-Primern zu ermöglichen.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Autoradiogramms von PCR- Produkten, die an Nytran®-Membran gebunden sind.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines Oligonucleotidhybridisierungs-(OH)-Assays unter Verwendung der PCR-Produkte von Beispiel 6.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Ausdrücke "Oligonucleotid" und "Primer", die hier verwendet werden, haben die in dem vorher erwähnten U.S.-Patent Nr. 4 683 202 definierte Bedeutung. Der Ausdruck "Einfangsonde", wie er hier verwendet wird, ist definiert als ein Oligonucleotid, das vollständig oder im wesentlichen vollständig zu den Sequenzen des Amplicons innerhalb der Grenzen oder Enden der Primer komplementär ist. Bei der vorliegenden bevorzugten Ausführungsform sind an die Einfangsonde keine Nucleotide angefügt (Tailing), aber es können Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide angefügt werden.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden die Primer und Sonden so ausgewählt, daß sie "im wesentlichen" zu den verschiedenen Strängen der zu amplifizierenden Zielsequenz komplementär sind.
Bei einer der spezifischen hier beschriebenen Ausführungsformen wurden zwei Sätze von PCR-Primern und Einfangsonden aus der Nucleotidsequenz des kryptischen Plasmids des Chlamydia trachomatis L1 Serovars (Hatt et al., Nucleic Acids Research, 16: 4053-4067, 1988) ausgewählt. Dies ermöglicht die spezifi sche Amplifikation und den Nachweis von C. trachomatis. Für andere allgemeine Zwecke erfolgt die Auswahl von Primer und Sonde für einzelne Ziele wie im vorher erwähnten U.S.-Patent Nr. 4 683 202 beschrieben.
Als Alternative zu bekannten Techniken zum Einfangen der amplifizierten Sequenz (Amplicon), die durch die Anwendung der PCR entsteht, wie vorher beschrieben, und als Verbesserung gegenüber bekannten Techniken verwendet die vorliegende Erfindung in ihrer bevorzugten Ausführungsform eine Oligonucleotideinfangsonde, die passiv an den Näpfen der Mikrotiterplatte gebunden ist, um (durch sequenzspezifische Hybridisierung) mit Biotin markierte Amplicons einzufangen. Avidin- Meerrettich-Peroxidase wird dann für die biotinylierten Amplicons angewendet und ihre Reaktion mit dem Substrat (Wasserstoffperoxid) und dem Chromogen (entweder OPD oder TMB) liefert ein quantitatives kolorimetrisches Signal.
Wiederum wie in dem vorher erwähnten U.S.-Patent Nr. 4 683 202 beschrieben, werden die Desoxyribonucleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und TTP der Synthesemischung auch in entsprechenden Mengen zugegeben und die entstehende Lösung wird auf etwa 90 bis 100ºC etwa 0, 5 bis 10 Minuten lang erhitzt, um die Matrizenstränge zu trennen. Nach diesem Erwärmungszeitraum wird die Lösung schnell auf die Temperatur abgekühlt, die für die Primer-Matrizen-Assoziierung bevorzugt ist. Zu dieser Mischung wird ein geeignetes Mittel zugegeben, um die Primerextensionsreaktion zu induzieren oder zu katalysieren und die Reaktion wird unter den im Stand der Technik bekannten Bedingungen fortschreiten gelassen. Das induzierende Mittel kann irgendeine Verbindung oder irgendein System sein, das dazu dient, die Synthese der Primerextensionsprodukte zu erreichen, einschließlich Enzyme. Geeignete Enzyme für diesen Zweck schließen z. B. DNA-Polymerase I aus Escherichia coli (E. coli), Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, andere verfügbare DNA-Polymera sen, reverse Transkriptase und andere Enzyme, einschließlich bevorzugt wärmestabile Enzyme (z. B. Taq-DNA-Polymerase) ein, die den Einbau der Nucleotide in der richtigen Art und Weise unter Bildung der Primerextensionsprodukte, die komplementär zu jedem Nucleinsäurestrang sind, zulassen.
Der neu synthetisierte Strang und der komplementäre Nucleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, dessen Stränge getrennt werden unter Verwendung irgendeines Denaturierungsverfahrens, um einzelsträngige Moleküle zu liefern, bevorzugt Wärme.
Neue Nucleinsäuren werden an den einzelsträngigen Matrizenmolekülen synthetisiert. Zusätzliches Enzym, zusätzliche Nucleotide und Primer können, falls dies notwendig ist, damit die Reaktion unter den vorher beschriebenen Bedingungen fortschreitet, zugegeben werden. Wiederum wird die Synthese an einem Ende der Oligonucleotidprimer iniitert und schreitet entlang der einzelnen Stränge der Matrize fort unter Erzeugung einer zusätzlichen komplementären Nucleinsäurese durch Primerextension.
Die Stufen der Strangtrennung und der Extensionsproduktsynthese können so oft, wie notwendig, wiederholt werden, um die gewünschte Menge an amplifizierter Nucleinsäuresequenz zu erzeugen.

Allgemeine Markierungstechniken

Allgemein kann jedes Material (Molekül, Atom) in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um einen Hinweis oder "Signal" zu schaffen, der/das nachweisbar ist (und bevorzugt quantitativ auswertbar ist) und der/das an der Nucleinsäure gebunden werden kann oder in sie eingebaut werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwei Methoden angewendet, um Amplicons herzustellen, die während der PCR-Amplifikation Biotinmarkierungen enthalten. Im ersten Fall ersetzt Biotin-11-dUTP (ein TTP- Analogon, das chemisch mit einer Biotinmarkierung modifiziert wurde) teilweise TTP in der PCR-Reaktion. Das Biotin-11-dUTP wird mit Taq-DNA-Polymerase während der Primerextension eingebaut und das entstehende Produkt ist "innen" mit Biotin markiert.
Im zweiten Fall wird ein chemischer "Linker-Arm" an dem 5'- Ende der Oligonucleotide, die an den festen Träger gebunden sind, befestigt. In der bevorzugten Ausführungsform ist der hier verwendete "Linker-Arm" ein Molekül, das chemisch am 5'- Primerende (mit Phosphoramiditchemie) gebunden ist und kovalent eine Aminogruppe oder Gruppen des Oligonucleotids binden kann. Die Aminogruppen sind wiederum mit Biotin-X-NHS biotinyliert. Diese 5'-Biotin markierten Oligonucleotide erzeugen, wenn sie als Primer in der PCR-Reaktion verwendet werden, Amplicons, die an ihren 5'-Enden biotinyliert sind.
Der "Linker-Arm" kann irgendein Molekül sein, das lang genug ist, um als Abstandshalter zu dienen, um die Markierung von der Oligonucleotidsequenz entfernt zu halten und auch die Bindung einer oder mehrerer geeigneter Markierungen, thermostabiler Enzyme oder Liganden zulassen kann.
In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können entweder eines dieser beiden Biotin-markierenden Verfahren oder beide (Einbau von Biotin-11-dUTP und 5'-Biotinmarkierte Primer) verwendet werden, um die amplifizierten Produkte der PCR zu markieren.
Außer Biotin können andere Markierungen auch erfindungsgemäß verwendet werden, einschließlich radioaktiv markierter Verbindungen, luminiszenter oder fluoreszenter Reagenzien, elek tronendichter Reagenzien, thermostabiler Enzyme, Liganden, Antikörper-Haptenkomplexe und Komplexierungssysteme. Die alternativen Markierungen müssen unter den Temperaturbedingungen der PCR-Amplifikation kompatibel sein, ebenso wie unter den Bedingungen der Denaturierung und der Einfanghybridisierung.
Ein solches Beispiel für alternative Markierungen schließt Digoxigenin-11-dUTP ein, das ähnlich wie Biotin-11-dUTP von Taq-Polymerase in markierte, amplifizierte DNA eingebaut wird. Mit Digoxigenin markierte Amplicons können dann mit einem Antikörper gegen Digoxigenin, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, nachgewiesen werden gefolgt von einem kolorimetrischen Standardnachweis, wie hier beschrieben.
Ein weiteres Beispiel für eine alternative Markierung sind ³²P markierte Desoxynucleotidtriphosphate, die auch verwendet werden können, um teilweise nicht markierte Desoxynucleotidtriphosphate in der PCR-Reaktionsmischung zu ersetzen. Das Ausmaß der Einfanghybridisierung könnte z. B. durch Szintillationszählung der entfernbaren Mikrotiternäpfe (unten beschrieben, Stufe 2) nach der Einfanghybridisierung und dem Waschen bestimmt werden.

Polystyrolfestphasenträger

Die Einfangplatte oder der Einfangträger, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind feste Träger aus Polystyrol, die eine verbesserte Proteinbindungskapazität aufweisen. Verschiedene Behandlungen eines solchen Trägers, um eine solche Verbesserung zu erzielen, sind im Stand der Technik bekannt (z. B. Bestrahlung mit &sup6;&sup0;Co).
Der feste Polystyrolträger kann verschiedene Formen aufweisen, z. B. Mikrotiterplatten, mikromagnetische Teilchen (z. B. erhältlich von Advanced Magnetics, Inc.); Kügelchen, Streifen, Eintauchstreifen etc.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäß verwendete Polystyrolträger eine Mikrotiterplatte mit einer verbesserten Proteinbindungskapazität und einer Vielzahl von Näpfen, wobei am meisten bevorzugt solche Mikrotiterplatten sind, die als "Dynatech Immulon® 2" bekannt sind (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA, geliefert von Fisher Scientific).

Allgemeine Hybridisierungstechniken

Eine Amplicon-spezifische Oligonucleotideinfangsonde ist passiv an den Näpfen einer Immulon®-2-Polystyrol-Mikrotiterplatte in einer Konzentration von 25 ng DNA/Napfin einer Lösung mit 1 M Ammoniumacetat gebunden. Solche Mikrotiterplatten haben eine Vielzahl von Näpfen und liefern eine große Oberfläche und lassen eine hohe Anzahl gleichzeitig ablaufender Tests zu (z. B. 96). Als Alternative zu der oben beschriebenen passiven Bindung der Einfangsonde wird bei der Erfindung ein Verfahren zur Bindung an den festen Polystyrolträger über ein intermediäres Protein (z. B. BSA) verwendet.
Die Hybridisierungsstufe der vorliegenden Erfindung, genauer die "Einfanghybridisierung" wird bevorzugt in Gegenwart von 1 M Guanidinthiocyanat, 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure- (EDTA)-dinatriumsalz, pH 8,0, erreicht. Der Konzentrationsbereich, um die Mikrotiterplatteneinfanghybridisierung zu erreichen, ist bevorzugt 0,5 bis 2,0 Mol GuSCH und am meisten bevorzugt 1,0 bis 2,0 M.
Andere Reagenzien können auch verwendet werden, um die Einfanghybridisierung zu erreichen. Z. B. kann eine Lösung von Ammoniumthiocyanat (0,5 bis 5,0 M, am meisten bevorzugt 5,0 M) anstelle von Guanidinthiocyanat verwendet werden.
Ein anderer möglicher Ersatz für Guanidinthiocyanat ist ein Reagenz, das aus 30% (V/V) deionisiertem Formamid, 3 · SSPE (1 · SSPE = 0,18 M NaCl; 10 mM NaPO&sub4;, pH 7,7; 1 mM EDTA); 5% (G/V) Dextransulfat; 0,1% Triton-X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Eine solche Hybridisierung schließt die folgenden Stufen ein:
1. Herstellung der Einfangsonde
2. Herstellung der Mikrotitereinfangplatte
3. Verdünnung und Denaturierung von amplifizierter markierter DNA
4. Einfanghybridisierung
5. Waschen
6. Blockieren
7. Zugabe von Avidin: Meerrettichperoxidase
8. Waschen
9. Zugabe von Substrat und Chromogen; Farbentwicklung
10. Ablesen der Platte (quantitative Auswertung)
Diese Stufen werden nun im Detail beschrieben.

1. Herstellung der Einfangsonde

Die hier verwendeten Einfangsonden werden so ausgewählt, daß sie "im wesentlichen" den Sequenzen des Amplicons innerhalb der Ränder der Primer komplementär sind. Die Einfangsonden müssen daher ausreichend komplementär sein, um spezifisch mit dem Amplicon unter Einfanghybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Bei der derzeit bevorzugten Ausführungsform enthält die typische Einfangsonde 20 bis 200 Nucleotide.
Weiterhin kann mehr als eine Einfangsonde verwendet werden und zusätzliche Einfangsonden können verwendet werden, um den gleichen oder einen entgegengesetzten Strang des markierten Amplicons einzufangen.
Obwohl die Einfangsonde hier als "Sequenz des Amplicons innerhalb der Ränder des Primers" definiert wird, können auch die Primer selbst oder Oligonucleotide, die Primersequenzen enthalten, als Einfangsonden verwendet werden. Es ist jedoch anzumerken, daß dann, wenn solche Oligonucleotide als Einfangsonden verwendet werden, sie während der Hybridisierung mit PCR-Primern konkurrieren müssen, die nicht aus den Reaktionsprodukten entfernt wurden.
Die Einfangsonden und PCR-Primer wurden auf einem MilliGen 7500 DNA Syntheseautomaten (MilliGen/Biosearch Inc., Burlington, MA) mit Standard-beta-Cyanoethylphosphoramiditchemie synthetisiert, wobei andere Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, auch möglich sind. Vor der Verwendung werden die Einfangsonden und die PCR-Primer teilweise entweder durch Elektrophorese über 15% (G/V) Polyacrylamidgele oder über Spinsäulen (siehe Beispiel 3) teilweise gereinigt. Die fertigen teilweise gereinigten Einfangsonden und Primer wurden in Wasser suspendiert, ihre Konzentration spektrophotometrisch bestimmt und sie wurden bei 4ºC, bis sie verwendet wurden, aufbewahrt.
Obwohl die hier beschriebene Einfangsonde synthetisch hergestellt wurde, muß dies nicht so sein. Sie kann auch erhalten werden als unterabschnitt von natürlich vorkommender DNA, die mit Standardmitteln hergestellt wurde (z. B. Verdau mit Restriktionsendonucleasen).

2. Herstellung der Einfangplatte

Die Oligonucleotideinfangsonde wird bevorzugt an den Näpfen einer Dynatech Immulon®-2-Polystyrol-Mikrotiterplatte (Dynatech Zaboratories Inc., Chantilly, VA, geliefert von Fisher Scientific) fixiert. Die Immulon®-2-Platte ist eine Anordnung von 96 Polystyrol-Miniteströhrchen (Näpfen) in einer einzigen Kunststoffplatte, die zur allgemeinen Verwendung für Festpha sen-Immunoassayverfahren mit Mikrovolumen gedacht ist. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Platten mit Näpfen mit flachem Boden (400 ul Volumenkapazität) verwendet, aber es wird angenommen, daß Näpfe mit "U"-Boden auch geeignet sind (300 ul Volumenkapazität).
Als weitere bevorzugte Ausführungsform kann die Sonde auch an Immulon®-2-Removawell®-Streifen (Dynatech) fixiert sein, die entfernbare Streifen von 12 Immulon®-2-Polystyrolteströhrchen (Näpfen) sind, die in Removawell®-Streifenhalter (Dynatech)· im Mikrotiterplattenformat passen.
Die Oligonucleotideinfangsonde wird verdünnt, um 25 ng pro Mikrotiternapfin 50 ul 1 M Ammoniumacetat (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) zu liefern. "Leerwertnäpfe" werden auch vorbereitet, indem 1 M Ammoniumacetat (ohne Oligonucleotideinfangsonde) in bestimmte Näpfe gegeben wird (in die markierte PCR-Produkte später für eine Scheinhybridisierung gegeben werden). Diese Leerwertnäpfe sind ein Hinweis auf die nicht spezifische Bindung von biotinylierter DNA an Näpfen von Mikrotiterplatten und werden verwendet, um das Plattenlesegerät (Spektrophotometer) zu kalibrieren (siehe unten, Stufe 10).
Die Platte wird mit Mylar-Plattenversiegler (Dynatech) versiegelt und bei 37ºC über Nacht für eine passive Fixierung der Oligonucleotideinfangsonde an der Polystyroloberfläche inkubiert. Wenn die Platten nicht sofort verwendet werden, werden sie bis zu ihrer Verwendung bei 4ºC aufbewahrt. Platten, die auf diese Weise bis zu 6 Wochen aufbewahrt wurden, zeigten keinen beträchtlichen Unterschied in ihrer Fähigkeit, DNA einzufangen.
Direkt vor der Hybridisierung werden die Näpfe der Platten zweimal mit 200 ul 2 · SSC (1 · SSC = 0,15 M NaCl; 15 mM Natriumcitratpuffer, pH 7,0) und einmal mit 200 ul 2 · SSC, 0,1% (V/V) Triton X-100 gewaschen. Jedes Waschen der Platte, das hier beschrieben wird, erfolgt unter Verwendung einer Mehrkanalpipettenvorrichtung (z. B. Titertek®) oder kann erfolgen unter Verwendung eines geeigneten automatischen Mikrotiterplattenwaschgerätes.

3. Verdünnung und Denaturierung von amplifizierter, markierter DNA

Die biotinylierten PCR-Produkte werden verdünnt (in einem Bereich von 1 : 10 bis 1 : 100 oder mehr) in 1 M GuSCH (ultrareine Qualität; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 20 mM EDTA (Sigma), pH 8,0 (hergestellt aus einem fünffachen Vorrat), 5 Minuten lang auf 100ºC erwärmt und schnell in einem Eiswasserbad abgekühlt. (Die Erwärmungsstufe führt zu einer Hitzedenaturierung der PCR-Produkte und das schnelle Abkühlen verhindert eine erneute Assoziierung der Ampliconstränge, was die Hybridisierung mit der Oligonucleotideinfangsonde begünstigt.) Aliquots von 100 ul werden in jeden Napf gegeben, einschließlich der als "Leerwert" (keine Einfangsonde) bezeichneten Näpfe (Stufe 2).

4. Einfanghybridisierung

Das spezifische Einfangen von amplifizierter, markierter DNA mit der Oligonucleotideinfangsonde wird erreicht durch 1- bis 3-stündige Inkubation bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit werden die PCR-Amplicons spezifisch mit der Oligonucleotideinfangsonde eingefangen auf Basis der komplementären Sequenz zwischen Einfangsonde und markiertem Amplicon.

5. Waschen der Platte

Nach der Hybridisierung wird der Inhalt aller Mikrotiternäpfe verworfen und die Näpfe werden zweimal mit 200 ul 2 · SSC, 0,1% (V/V) Triton X-100 und viermal mit 200 ul 0,2 · SSC, 0,1% (V/V) Triton X-100, das vorher auf 37ºC erwärmt wurde, gewaschen. Dieses Waschen wird durchgeführt, um nicht gebundene biotinylierte Produkte aus den Mikrotiternäpfen zu entfernen.

6. Blockieren

Nach dem Waschen der Platte werden die Näpfe der Platte dann mindestens 15 bis 30 Minuten lang mit 200 ul einer Lösung von PBS (PBS = 0, 13 M NaCl, 7 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 3 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0), 2% (G/V) Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma), 0,1% (V/V) Triton X-100 "blockiert". Diese "Blockierungs"-Stufe ist erforderlich, um die nichtspezifische Bindung von Avidin : HRP an Mikrotiternäpfe zu minimieren.

7. Avidin : Meerrettich-Peroxidase

Der Avidin : Meerrettich-Peroxidase-(HRP)-Komplex (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) wird 1 : 2000 in PBS, 0,1% (V/V) Triton X-100 auf eine endgültige Konzentration von 2,5 ug Avidin : HRP/ml verdünnt. 50 ul von verdünntem Avidin : HRP werden jedem Napf zugegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Stufe bindet der Avidin : HRP- Komplex fest an eingefangene biotinylierte Produkte in dem Napf. Während Avidin : HRP in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, könnte stattdessen auch ein Komplex von Streptavidin : HRP verwendet werden. In gleicher Weise können andere Verbindungen, die mit Avidin (oder Streptavidin) eine Komplexbindung eingehen, verwendet werden, einschließlich alkalischer Phosphatase, beta-Galactasidase, Luciferase, Fluorescein, Texas-Rot oder irgendein anderes Mittel, das ein kolorimetrisches, fluoreszierendes oder lumineszentes Signal erzeugen kann.

8. Waschen

Die Näpfe der Mikrotiterplatte werden dann viermal mit 200 ul PBS, 0,1% Triton X-100 und einmal mit 200 ul PBS, 1 mM EDTA gewaschen, die letzte Waschlösung bei Raumtemperatur 1 bis 10 Minuten lang inkubiert. Dieses Waschen wird durchgeführt, um nicht gebundenes Avidin : HRP aus den Mikrotiternäpfen vor Zugabe des Chromogens zu entfernen.

9. Farbentwicklung

Die Farbentwicklung wird in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erreicht entweder unter Verwendung von zwei chromogenen Systemen: (a) Wasserstoffperoxid/OPD und (b) Wasserstoffperoxid/TMB.

(a) Wasserstoffperoxid/OPD

Nachdem der Waschpuffer (beschrieben in Stufe 8) entfernt worden ist, werden 150 ul OPD-Reagenz (1,6 mg/ml o-Phenylendiamindinatriumsalz (Sigma), 0,0125% (V/V) Wasserstoffperoxid (Fisher Scientific) in 0,15 M Natriumphosphat/Citratpuffer, pH 6,0) zugegeben und die Farbe sich im Dunkeln 1 bis 30 Minuten lang entwickeln gelassen. Die Farbentwicklung wird gestoppt duch Zugabe von 50 ul 4 n H&sub2;SO&sub4;.

(b) Wasserstoffperoxid/TMB

Nachdem der letzte Waschpuffer (beschrieben in Stufe 8) entfernt worden ist, werden 100 ul TMB-Farbreagenz jedem Napf zugegeben (TMB-Farbreagenz besteht aus frisch vermischten gleichen Volumina von TMB-Peroxidasesubstrat (3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin in einer Konzentration von 0,4 g/l in einer organischen Base; im Handel erhältlich von Kirkegaard und Perry Inc., Gaithersburg, MD) und Wasserstoffperoxidlösung (0,02% (V/V) Wasserstoffperoxid in Citronensäurepuffer, im Handel erhältlich von Kirkegaard und Perry Inc.). Die Reaktion wird bei Raumtemperatur im Dunkeln 1 bis 30 Minuten lang fortschreiten gelassen, wonach die Farbentwicklung durch Zugabe von 100 ul 1 M Phosphorsäure (H&sub3;PO&sub4;) gestoppt wird.
Das TMB-Substrat erzeugt einen Niederschlag mit einer blauen Farbe. Nach Zugabe von Phosphorsäure tritt eine Farbänderung zu gelb auf, wobei die optische Dichte bei 450 nm gemessen wird (siehe unten, Stufe 10). Zusätzlich zu den HRP-Substraten OPD und TMB schließen andere lösliche Substrate ein: 2,2- Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS) und 5-Aminosalicylsäure (ASA). Unlösliche Substrate schließen 3-Amino- 9-ethylcarbazol (AEC) und 3,3-Diaminobenziden (DAB) ein.

10. Ablesen der Platte (quantitative Auswertung)

Nachdem die Farbentwicklung gestoppt wurde, wird die optische Dichte (OD) der Proben in jedem Napf bestimmt durch Ablesen in einem automatischen Mikrotiterplattenlesegerät, das für eine spektrophotometrische Bestimmung bei Wellenlängen, die für das verwendete Chromogen spezifisch sind (siehe unten) geeignet ist (z. B. InterMed Immunoreader® NJ-2000).
Die OD der Leerwertnäpfe (biotinylierte PCR-Produkte wurden dem Napf ohne Einfangsonde zugegeben, wie in Stufe 2 beschrieben) wird auch bestimmt. Dieses Signal (gewöhnlich sehr niedrig) ist ein Hinweis auf eine spurenförmige "nichtspezifische" Bindung von biotinylierten Produkten an Probenäpfe statt dem Signal, das durch den tatsächlichen Einfang von biotinylierten Amplicons durch eine Hybridisierung mit einer Einfangsonde entsteht. Daher wird die OD der Leerwertnäpfe von der OD der Probenäpfe abgezogen, um eine genaue quantitative Auswertung der tatsächlichen Einfanghybridisierung zu ergeben.
Die geeignete Wellenlängeneinstellung für das Spektrophotometer (Plattenlesegerät) ist abhängig von dem für die kolorimetrische Reaktion verwendeten spezifischen Chromogen. So wird dann, wenn Wasserstoffperoxid/OPD verwendet wird, die korrekte Wellenlänge auf 490 nm eingestellt; wenn Wasserstoffperoxid/TMB verwendet wird, ist die korrekte Wellenlängeneinstellung 450 nm.
Durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung können verschiedene Infektionskrankheiten diagnostiziert werden, indem die Gegenwart der spezifischen DNA-Sequenzen nachgewiesen wird, die den verursachenden Mikroorganismus kennzeichnet; z. B. bei Bakterien (z. B. Chlamydia, Salmonella etc. ); Viren (z. B. Hepatitis-Virus); verschiedenen Parasiten (z. B. Malaria-auslösenden) etc. Insbesondere ist die Erfindung nützlich zum Nachweis der Immunschwächeviren 1 und 2 (HIV 1 und HIV 2), der Human-T-Lymphotropen-Viren I und II (HTLV-I und HTLV- II), Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV), Human- Papilloma-Virus (HPV) und Pneumocyctis carinii. Wie vorher beschrieben und als zusätzliche Ausführungsform der Erfindung wurden neue Einfangsonden und Primer gefunden, die spezifisch zum Nachweis des Organismus Chlamydia trachomatis verwendet werden können. Solche neue Sonden und Primer werden im Detail in den folgenden spezifischen Beispielen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung bietet auch spezielle Vorteile im Zusammenhang mit der klinischen Anwendung. Durch die Verwendung von Mikrotiterplatten wird ein geeignetes, schnelles, einfaches, ökonomisches und automatisierbares Testverfahren bereitgestellt. Der Assay ist äußerst genau und empfindlich verglichen mit üblichen Mitteln und kann in Bruchteilen der Zeit, die normalerweise erforderlich ist, durchgeführt werden.
Die folgenden Referenzbeispiele werden nun zur Erläuterung angegeben und sollen die Erfindung nicht beschränken.

Referenzbeispiel 1

Synthese von Biotin-11-dDTP

Biotin-11-dUTP wurde chemisch synthetisiert mit den Methoden von Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78: 6633- 6637 (1981) und wurde mit einer Konzentration von 0, 4 mM in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,4 mM EDTA suspendiert. Das Verhältnis von Biotin-11-dUTP : TTP wurde optimiert und das höchste Signal wurde erhalten unter Verwendung eines Verhältnisses von 4 : 1 (Biotin-11-dUTP : TTP).

Referenzbeispiel 2

Herstellung von 5'-biotinylierten Primern

Alle Oligonucleotide, die als PCR-Primer verwendet wurden, wurden an einem MilliGen 7500 DNA-Syntheseautomaten mit Standard-beta-Cyanoethylphosphoramiditchemie synthetisiert unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
Oligonucleotide, die zur Verwendung als biotinylierte Primer hergestellt wurden, wurden modifiziert, wie in Fig. 1 gezeigt. Die synthetischen Oligonucleotide auf festem Träger wurden am 5'-Ende durch Reaktion mit dem geschützten Hexylaminophosphoramidit (Strukturformel 1) derivatisiert, anschließend oxidiert und die Schutzgruppen mit Standardverfahren abgespalten (McBride and Caruthers, Tetrahedron Letters, 24: 245-248, 1983), was 5'-Amino-markierte Oligomere lieferte (Strukturformel 2). Die Reaktion von (2) mit N-Hydroxysuccinimidylestern von Biotinderivaten ergab 5'-biotinylierte Oligonucleotide (Strukturformel 3) in guter Ausbeute, die mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt wurden. (Siehe unten Referenzbeispiel 3).

Referenzbeispiel 3

Reinigung von Oligonucleotiden

Oligonucleotide, die als PCR-Primer oder Einfangsonden verwendet wurden, wurden auf einem von zwei Wegen gereinigt: (a) Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder (b) Spinsäule.

(a) Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Aliquots mit jeweils 100 bis 250 ug jeden Oligonucleotids wurden im Vakuum getrocknet, in einem minimalen Volumen Gelbeladungspuffer [TBE (89 mM Tris-Borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA); 90% (V/V) deionisiertes Formamid; 0,02% (G/V) Bromphenolblau] resuspendiert, 5 Minuten lang auf 100ºC erwärmt und schnell in einem Eiswasserbad gekühlt. Die Proben wurden auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel [15% (G/V) Acrylamid (Acrylamid : Bis-acrylamid, 29 : 1) (IBI, New Haven, CT), 7 M Harnstoff (IBI) in TBE] geladen und bei 650 Volt 4 Stunden lang elektrophoretisch behandelt. Die DNA wurde sichtbar gemacht durch UV-Schattenwurf über einer Dünnschichtchromatographieplatte (Eastman Rodak #13254-Cellulose), photographiert und die Gelbande mit dem Oligonucleotid voller Länge wurde ausgeschnitten. Das Gelstück wurde zerstoßen und die DNA wurde in Wasser über Nacht bei 37ºC eluiert. Die DNA wurde weiter gereinigt durch Passage über eine C&sub1;&sub8;-Sep-Pak®- Patrone (Waters Associates, Milford, MA) und in 40% (V/V) Acetonitril (Fisher) eluiert. Nach dem Eindampfen zur Trockene im Vakuum wurde die DNA in Wasser suspendiert und ihre Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. Vorratskonzentrationen wurden mit Wasser eingestellt und bei 4ºC aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.

(b) Spinsäule

Einige Oligonucleotideinfangsonden und Primer wurden teilweise gereinigt unter Verwendung von 6 Bio-SpinTM-Säulen (Bio-Rad Inc., Richmond, CA) in einem Schwingrotor mit niedriger zen trifugaler Kraft, nach den Anweisungen des Herstellers für die Spinsäule. Nach der Teilreinigung wurde die Konzentration der Oligonucleotide spektrophotometrisch bestimmt und Vorratslösungen wurden mit Wasser hergestellt und bei 4ºC aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.

Referenzbeispiel 4

PCR-Bedingungen

Die meisten Primerpaare wurden empirisch getestet, um ihre optimalen Temperaturbedingungen für die PCR-Amplifikation zu bestimmen, wobei besonders auf die Hybridisierungstemperatur geachtet wurde.
Zum Nachweis von HTLV-1-tax-Sequenzen wurde der Primersatz SK43 und SK44 (beschrieben von Kwok et al., J. Inf. Dis., 158: 1193-1197, 1988) verwendet. Unter Verwendung dieses Primerpaares bestanden 100 ul PCR-Reaktion aus: 1 · Reaktionspuffer (RB) [10 · RB = 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl, pH 8,5; 25 mM MgCl&sub2;]; jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP und TTP; jeweils 50 umol SK43 und SK44 und 2 Einheiten rekombinante Taq-DNA-Polymerase (RecombiTaq®, Cetus Perkin Elmer, Norwalk, CT).
Für Versuche, bei denen Biotin-11-dUTP eingebaut wurde, war der Reaktionsinhalt wie oben, außer daß 200 uM TTP durch 160 uM Biotin-11-dUTP, 40 uM TTP ersetzt wurden.
Für den Primersatz SK43 und SK44 begann der PCR-Temperaturplan mit einer anfänglichen ausgedehnten Denaturierung 5 Minuten bei 94ºC gefolgt von einer Hybridisierungsstufe 25 Sekunden lang bei 50ºC und einer Verlängerungsstufe 1 Minute bei 72ºC. Für die nächsten 28 Zyklen bestand der Temperaturplan aus: Denaturierung 25 Sekunden bei 94ºC, Hybridisierung 25 Sekunden lang bei 50ºC und Verlängerung 1 Minute lang bei 72ºC. Der letzte (dreißigste) Zyklus war: Denaturierung 25 Sekunden bei 94ºC, Hybridisierung 25 Sekunden bei 50ºC und eine ausgedehnte Verlängerung bei 72ºC 10 Minuten lang. Nach der PCR-Amplifikation wurden 90 ul des Reaktionsinhalts unter dem Mineralöl entnommen und bei 4ºC bis zur Analyse der PCR- Produkte aufbewahrt.

Reiferenzbeispiel 5

Herstellung von positiven und negativen Kontrollplasmidmatrizen

Ein Plasmid (pTAX), das das gesamte tax-Gen von HTLV-1 enthielt, wurde als positive Kontrollmatrize verwendet. Die Konzentration der Plasmid-DNA wurde spektrophotometrisch bestimmt und Verdünnungen erfolgten mit Wasser, um bekannte Kopiezahlen der Ziel-DNA für die PCR-Reaktionen zu liefern. Auf diese Weise wurde eine positive Kontrollmatrize vorgesehen.
Ein heterologes Plasmid wurde auch mit dem HTLV-1-tax-Primerset als negative PCR-Kontrolle verwendet. Dieses Plasmid, pRT-POL, enthielt Sequenzen der HTLV-1-Polymerase-(pol)- Region. Die Konzentration der Plasmid-DNA wurde bestimmt und serienweise, wie oben für p-TAX beschrieben, bestimmt. Die Plasmidkonzentrationen wurden berechnet, um eine bekannte Kopienzahl in einem spezifischen Volumen, das der PCR-Reaktionsmischung zugegeben wurde (d. h. 2 ul Matrizen-DNA wurden zu 98 ul Reaktionsmischung zugegeben) zu liefern.

Referenzbeispiel 6

Amplifikation des HTLV-1-tax-Ziels, unmarkierte Amplicons

Um direkt die drei PCR-Detektionssysteme Seite an Seite zu vergleichen, wurden bekannte Kopienzahlen von Plasmid-pTAX (Referenzbeispiel 5) mit PCR amplifiziert. Die Plasmidkonzen tration wurde mit Wasser eingestellt, um 1300, 100, 50, 20 oder 10 Kopien der Matrize pro Reaktion bereitzustellen. Das HTLV-1-tax-Primerset SK43/SK44 (Kwok et al., J. Inf. Dis., 158: 1193-1197, 1988) wurde synthetisiert und mit 6 Bio- Spin®-Spinsäulen gereinigt (wie in Referenzbeispiel 3 beschrieben) und jeder Primer wurde zu der PCR-Reaktion in einer Konzentration von 50 umol zugegeben.
Unmarkierte amplifizierte DNA wurde erzeugt, indem jeweils die 4 dNTPs mit 200 uM für die PCR-Amplifikation verwendet wurden. Diese unmarkierten PCR-Produkte wurden verwendet, um die Detektionsempfindlichkeit der Southern-Blot-Hybridisierung (Referenzbeispiel 9) und Oligonucleotidhybridisierung (OH) (Referenzbeispiel 10) zu bestimmen. Die Amplifikation erfolgte 30 Zyklen lang unter Verwendung der in Referenzbeispiel 4 beschriebenen Reaktionsmischung und Temperaturbedingungen.

Referenzbeispiel 7

Amplifikation von HTLV-1-tax, Biotin-11-dUTP-Einbau

Die PCR-Amplifikation mit dem Primersatz SR43/SK44 erfolgte auch, um biotinylierte Amplicons herzustellen, durch den Einbau von Biotin-11-dUTP. Die Bedingungen für diese HTLV-1-tax- Amplifikation waren wie oben beschrieben (Referenzbeispiel 6), außer daß die Reaktionsmischung dATP, dCTP und dGTP mit jeweils 200 uM; Biotin-11-dUTP mit 160 uM; TTP mit 40 uM enthielt. Die mit Biotin markierten PCR-Produkte wurden verwendet, um die Nachweisempfindlichkeit der Platteneinfanghybridisierung (Referenzbeispiel 8) und Southern-Blot-Hybridisierung (Referenzbeispiel 9) zu bestimmen. Die Amplifikation erfolgt über 30 Zyklen unter Verwendung der in Referenzbeispiel 4 beschriebenen Reaktionsmischung und Temperaturbedingungen.

Referenzbeispiel 8

Platteneinfangtest

Eine Einfangplatte wurde hergestellt, indem 25 ng Oligonucleotid-"Einfangsonde"-SK45 (Kwok et al., J. Inf. Dis., 158: 1193-1197, 1988) in 1 M Ammoniumacetat an Näpfe einer Dynatech Immulon®-2-Platte gebunden wurden und über Nacht bei 37ºC inkubiert wurden. Die biotinylierten Produkte der PCR (Referenzbeispiel 7) wurden 1 : 25 und 1 : 100 mit 1 M Guanidinthiocyanat (GuSCH) verdünnt, hitzedenaturiert (5 Minuten, 100ºC) und schnell in einem Eiswasserbad gekühlt. Für jede Probe und jede Kontrolle wurden 100 ul jeweils zu 4 Mikrotiternäpfen zugegeben (3-fach SK45-Einfangsondennäpfe und 1 "Leerwert"-Napf) und für die Hybridisierung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Inhalt der Platten wurde verworfen und die Platten wurden gewaschen, blockiert und mit Avidin : Meerrettichperoxidase, wie oben in Stufe 9 beschrieben, behandelt. Nach Zugabe von H&sub2;O&sub2; und OPD wurde die Farbentwicklung bei 490 nm unter Verwendung eines Plattenlesegeräts bestimmt.
Die Ergebnisse der Platteneinfanghybridisierung sind unten angegeben. Bezugnehmend auf die Tabelle 1 unten wird der Einfang durch Hybridisierung von biotinylierten PCR-Produkten dargestellt unter Verwendung von HTLV-1-Primern SK43/SK44, die für HTLV-1-tax spezifisch sind, wobei die homologe Matrize (pTAX) und die heterologe Matrize (pRT-POL) amplifiziert wurden. Biotin-11-dUTP wurde als Vorläufer der PCR-Reaktion zugegeben (siehe Referenzbeispiel 7) und die PCR-Bedingungen waren wie für Referenzbeispiel 4 beschrieben. Der Platteneinfang-Assay erfolgte wie beschrieben. Die Proben wurden 1 : 25 und 1 : 100 in 1 M GuSCH für die Hybridisierung verdünnt, wonach die Platten gewaschen, blockiert und mit Avidin-HRP versetzt wurden. OD&sub4;&sub9;&sub0; wurde nach 35 Minuten Farbentwicklung mit H&sub2;O&sub2;/OPD bestimmt. Die unten angegebenen Zahlen sind der Durchschnitt von Dreifachproben. Tabelle 1
Die Nachweisgrenze für diesen Assay schienen 20 Kopien des reinen Zielplasmids zu sein (OD&sub4;&sub9;&sub0; bei einer Verdünnung von 1 : 25 war 0,123). Die negative Kontrolle "ohne Matrize" und die negative Kontrolle unter Verwendung einer heterologen Aniplifikationsmatrize ergaben OD-Werte von 0,007 bzw. 0,000 bei einer Verdünnung von 1 : 25, und 0,026 bzw. 0,042 bei einer Verdünnung von 1 : 100.

Referenzbeispiel 9

Agarose-Gelelektrophorese und Southern-Blot-Hybridisierung

Aliquots (25 ul) sowohl von unmarkierten (Referenzbeispiel 6) als auch Biotin-markierten (Referenzbeispiel 7) PCR-Produkten wurden im Vakuum getrocknet, in 5 ul Wasser und 2 ul Agarosegel-Beladungspuffer [0,25% (G/V) Bromphenolblau, 0,25% (G/V) Xylolcyanol, 30% (V/V) Glycerin] resuspendiert und auf ein 3% (G/V) NuSieve® GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME)/1% (G/V) SeaKem (FMC) Agarosegel in TBE geladen, das 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthielt. Das Gel wurde durch UV-Belichtung sichtbar gemacht und photographiert. Das Gel wurde dann 30 Minuten lang mit 0,5 n NaOH, 1 M NaCl und 30 Minuten lang mit 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 behandelt und über Nacht auf Nytran® (Schleicher und Schuell Inc., Keene, HN)-Nylonmembranen mit hohem Salzgehalt geblottet, woran sich Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, anschlossen. Der Blot ("Southern Blot") wurde dann 30 Minuten bei 75ºC gebacken und 1 bis 4 Stunden lang bei 37ºC in einem verschlossenen Sack vorhybridisiert, der 6 · SSPE [1 · SSPE = 0,18 M NaCl, 10 mM NaPO&sub4;, pH 7,7, 1 mM EDTA]; 1% (G/V) Natriumdodecylsulfat (SDS) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI); 10 · Denhardt's Reagenz [1% (G/V) jeweils Ficoll (Phannacia, Piscataway, NJ), Polyvinylpyrrolidon (Sigma) und BSA (Sigma)] und 50 ug/ml Lachssperrmien-DNA vorhybridisiert, hitzedenaturiert und schnell abgekühlt.
In Fig. 2 war die PCR-Amplifikation, wie in den Referenzbeispielen 6 und 7 beschrieben und die Bedingungen für die Agarose-Gelelektrophorese, das Blotten, die Vorhybridisierung und die Hybridisierung waren wie in diesem Referenzbeispiel beschrieben.
In der oberen Hälfte der Photographie sind Biotin-markierte PCR-Produkte von Referenzbeispiel 7 gezeigt: amplifizierte Produkte von 1300, 100, 50, 20 und 10 Kopien von pTAX (Bahnen 1 bis 5); PCR-negative Kontrolle "ohne Matrize" (Bahn 6).
In der unteren Hälfte der Photographie sind die unmarkierten PCR-Produkte von Referenzbeispiel 6 gezeigt: amplifizierte Produkte von 1300, 100, 50, 20 und 10 Kopien von pTAX (Bahnen 1 bis 5); PCR-negative Kontrolle "keine Matrize" (Bahn 6).
Eine Amplicon-spezifische Sonde, SK45, wurde mit ³²P-ATP markiert unter Verwendung von Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim Biochemicals) unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren. Zur Hybridisierung wurde diese radioaktiv markierte Sonde zu Hybridisierungspuffer (6 · SSPE, 1% (G/V) SDS) in einem Anteil von 4,1 · 10&sup6; cpm/Blot zugegeben. Nach der Hybridisierung 2 bis 3 Stunden lang bei 60ºC wurde der Blot mehrere Male mit hoher Stringenz gewaschen und über Nacht bei -80ºC mit einem intensivierenden Schirm unter einen Kodak-X-OMAT-AR-Film gelegt.
Nach der Belichtung über Nacht war die Nachweisgrenze für den Southern Blot 10 Kopien der Plasmid pTAX-Ziel-DNA für PCR- Produkte, die nicht biotinyliert waren (Referenzbeispiel 6) und 20 Kopien der Plasmid-Ziel-DNA für biotinylierte PCR- Produkte (Referenzbeispiel 7). (Siehe Photographie des Autoradiogramms, Fig. 2). Die PCR-negative Kontrolle "ohne Matrize" ergab kein nachweisbares Produkt bei der Autoradiographie.

Referenzbeispiel 10

Oligonucleotid-Hybridisierungs-Assay

Bezugnehmend auf Fig. 3 waren die Bedingungen für den OH- Assay (Vorbereitung der markierten Sonde, Denaturierungs- und Hybridisierungsbedingungen und Bedingungen für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese) wie in diesem Referenzbeispiel beschrieben.
Die gezeigte Photographie ist eine Über-Nacht-Belichtung (-80ºC, mit verstärkendem Schirm auf Kodak X-OMAT-AR-Film) eines Autoradiogramms, das das erzeugte Signal von 1300, 100, 50, 20 oder 10 Kopien von pTAX (Bahnen 1 bis 5); der PCR- negativen Kontrolle "ohne Matrize" (Bahn 6); 104 extrahierten Jurkat-Zellen, die HTLV-1-Tax konstitutiv exprimieren, amplifiziert mit PCR (Bahn 7); 10&sup4; extrahierte Jurkat-Zellen, amplifiziert mit PCR (Bahn 8); OH-negative Kontrolle, der keine amplifizierte DNA zu ³²P-SK45 für den OH-Assay (Bahn 9) zugegeben wurde, zeigt.
Die unmarkierten PCR-Produkte des Primersatzes SK43/SK44 (Referenzbeispiel 6) wurden mit dem Oligonucleotid-Hybridisierungs-Assay (OH-Assay) analysiert, um die Nachweisgrenze für diese Art zu bestimmen. Das Verfahren war im wesentlichen, wie von Abbott et al., J. Inf. Dis. 158: 1158-1169 (1988) für die Flüssighybridisierung (LII) beschrieben. 30 ul mit PCR amplifiziertes Produkt wurden zu 10 ul einer Sondenmischung, die 250 000 bis 400 000 cpm ³²P-markierte SK45-Sonde, verdünnt in 44 mM EDTA, 66 mM NaCl, enthielt, zugegeben. Die DNA-Mischung wurde bei 95ºC 5 Minuten lang denaturiert und anschließend sofort mit der Sonde 15 Minuten lang bei 55ºC hybridisiert. 10 ul Agarosegel-Beladungspuffer (Referenzbeispiel 9) wurden zugegeben und das halbe Volumen wurde auf ein natives 10% (G/V) Polyacrylamidgel (Acrylamid : Bis-acrylamid 19 : 1) in TBE gegeben. Die Elektrophorese erfolgte bei 200 Volt, bis das Bromphenolblau die Bodengelfront erreichte. Die obere Hälfte des Gels wurde einem Kodak X-OMAT-AR-Film ausgesetzt für eine Belichtung von 3 Stunden und über Nacht bei -80ºC mit einem Verstärkungsschirm.
Entweder nach 3 Stunden (nicht gezeigt) oder Über-Nacht- Belichtung (Fig. 3) sind 10 Kopien der amplifizierten Plasmid-pTAX-Ziel-DNA klar als spezifische Bande zu sehen. Die negative Kontrolle "ohne Matrize" und andere negative Kontrollen erzeugten keine Banden.

Referenzbeispiel 11

Testvergleich und Diskussion der Ergebnisse

Der Platteneinfangassay (Referenzbeispiel 8) wurde mit üblicheren Assays, Southern-Blot-Hybridisierung (Referenzbeispiel 9) und Oligonucleotidhybridisierung-(OH)-Assays (Referenzbeispiel 10) bezüglich ihrer Fähigkeit, minimale Kopienzahlen der Ziel-HTLV-1-DNA nach 30 Zyklen der PCR-Amplifikation (Referenzbeispiele 6 und 7) nachzuweisen. Jedes der drei gete steten Nachweissysteme (Platteneinfangtest, Southern Blot und OH-Assay) waren im wesentlichen vergleichbar in Bezug auf ihre Fähigkeit, kleine Kopienzahlen des reinen Targetplasmids nach 30 Zyklen PCR-Amplifikation nachzuweisen. Es wurde gefunden, daß mit dem Platteneinfangassay 20 Kopien der reinen Ziel-DNA nachgewiesen werden konnten, mit Southern-Blot 10 und 20 Kopien und mit OH 10 Kopien. Von den drei Nachweissystemen ist der Plattenassay der schnellste, der ein definitives Ergebnis innerhalb von Stunden liefert. Außerdem liefert der Plattenassay numerische OD-Werte im Gegensatz zu subjektiven Autoradiogrammbanden mit Southern Blot und OH-Assays. Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung die objektive numerische Bestimmung, ob eine Probe "positiv" ist und die Berechnung eines objektiven Ausschlußwertes für die unteren Grenzen des positiven Ergebnisses. (Dieser Ausschlußwert ist ein OD-Wert, unterhalb dem die Proben als negativ angesehen werden mit einem berechneten Grad an statistischer Signifikanz.)
Die OD-Werte, die mit dem Plattenassay geliefert werden, lassen auch die quantitative Bestimmung eines Verhältnisses von "Signal-zu-Rauschen" zu, das wichtig ist bei der Validierung eines diagnostischen Tests. Für die Southern-Blot-Hybridisierung und die OH-Assays kann das Verhältnis "Signal-zu- Rauschen" nur durch visuelle Auswertung des Signals bei der Autoradiographie abgeschätzt werden.

Referenzbeispiel 12

Nachweis von Chlamydia trachomatis-Sequenzen

Zwei Sätze von Primern und Einfangsonden wurden synthetisiert, um Chlamydia trachomatis spezifisch nachzuweisen. Die Oligonucleotidsequenzen wurden aus dem kryptischen Plasmid des C. trachomatis L1-Serovars (Hatt et al., Nucleic Acids Research, 16: 4053-4067, 1988) ausgewählt.
Der Primersatz A erzeugte ein spezifisches Amplicon mit 208 bp unter Verwendung der folgenden Primer:
CP-24 (25-mer, +Polarität, Basen 195-219)
5' GGG ATT CCT GTA ACA ACA AGT CAG G 3'
d. h., der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder eine Verlängerung der folgenden Sequenz verursacht:
5' C CTG ACT TGT TGT TAC AGG AAT CCC 3'
CP-27 (26-mer, -Polarität, Basen 377-402)
5' CCT CTT CCC CAG AAC AAT AAG AAC AC 3'
d. h., der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder ihre Verlängerung verursacht:
5' GT GTT CTT ATT GTT CTG GGG AAG AGG 3'
Das spezifische Amplicon mit 208 bp des Primersatzes wurde durch die Einfangsonde CP-35 nachgewiesen:
CP-35 (26-mer, -Polarität, Basen 235-260)
5' CAT AGC ACT ATA GAA CTC TGC AAG CC 3'
d. h., die Sonde ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet:
5' GG CTT GCA GAG TTC TAT AGT GCT ATG 3'
Der Chlamydia-Primersatz B erzeugte ein spezifisches Amplicon mit 173 bp unter Verwendung der folgenden Primer:
CP-37 (23-mer, +Polarität, Basen 678-700)
5' GTC CTG CTT GAG AGA ACG TGC GG 3'
d. h., der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder ihre Verlängerung verursacht:
5' CC GCA CGT TCT CTC AAG CAG GAC 3'
CP-38 (24-mer, -Polarität, Basen 827-850):
5' CTC CCA GCT TAA GAA CCG TCA GAC 3'
d. h., der Primer ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet oder ihre Verlängerung verursacht:
5' GTC TGA CGG TTC TTA AGC TGG GAG 3'
Das Amplicon des Primersatzes B mit 173 bp wurde mit der Einfangsonde CP-39 nachgewiesen:
CP-39 (23-mer, -Polarität, 726-748):
5' TGT CTT CGT AAC TCG CTC CGG AA 3'
d. h., die Sonde ist irgendein Oligonucleotid, das an die folgende Sequenz bindet:
5' TT CCG GAG CGA GTT ACG AAG ACA 3'
Der Primersatz B wurde verwendet, um das Zielplasmid pCHL-1 zu amplifizieren. Unter Verwendung von 5'-biotinylierten Primern wurde das Ziel amplifiziert mit 30 Zyklen PCR und die biotinylierten Produkte wurden mit Einfanghybridisierung (Tabelle 2) untersucht. Nach 10 Minuten Farbentwicklung (TMB/H&sub2;O&sub2;) waren nur 20 Anfangskopien von pCHL-1 nachweisbar (Verdünnung 1 : 25, OD&sub4;&sub5;&sub0; = 0,140) mit einem vernachlässigbaren Hintergrundsignal (OD&sub4;&sub5;&sub0; = 0,009 für eine Verdünnung von 1 : 25). Tabelle 2

Referenzbeispiel 13

Nachweis von McCoy-Zellen und klinischen Isolaten, die mit Chlamydia trachomatis infiziert sind

McCoy-Zellen, entweder unbeimpft oder mit C. trachomatis infiziert, wurden mit 2SP (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 2 M Saccharose), der 100 ug/ml Proteinase K, 1% Tween-20 enthielt, lysiert und bei 55ºC 1 Stunde lang inkubiert und anschließend 10 Minuten lang bei 95ºC inkubiert. Der Primersatz A (Referenzbeispiel 12) wurde verwendet für eine PCR- Amplifikation mit 30 Zyklen und die Produkte wurden mit dem in Referenzbeispiel 8 beschriebenen Plattenassay untersucht. Nach 10 Minuten Farbentwicklung ergaben sowohl 10 als auch 100 infizierte McCoy-Zellen, wenn sie mit 10&sup5; uninfizierten McCoy-Zellen vermischt wurden, OD&sub4;&sub5;&sub0;-Werte > 2,000 (sowohl für Verdünnungen 1/25 als auch 1/100 des Produktes in GuSCH). Extrahierte und amplifizierte nichtinfizierte Zellen allein (10&sup5; Zellen) ergaben OD&sub4;&sub5;&sub0;-Werte von < 0,050.
Klinische Proben, die vorher bezüglich des Ausmaßes der cytopathischen Effekte (CPE) beurteilt worden waren [in einem Bereich von "negativ" (kein CPE) bis 4+ (äußerst auffällige CPE)] wurden auf gleiche Weise extrahiert und mit 30 Zyklen PCR amplifiziert unter Verwendung des Primersatzes A. Die Ergebnisse dieses Assays sind in Tabelle 3 gezeigt: Tabelle 3
Zusammenfassend werden hier neue Wege der Markierung und des Nachweises von mit PCR amplifizierten Produkten beschrieben. Diese Markierung und die Einfangverfahren bieten verschiedene Vorteile gegenüber konventionellen Nachweismethoden:
1. Die Biotinylierung und das Einfangen der PCR-Produkte auf Mikrotiterplatten ist ein schneller Assay. Der Plattenassay der vorliegenden Erfindung kann in 2 Stunden durchgeführt werden, verglichen mit etwa 6 bis 24 Stunden für einen OH- Assay und bis zu 48 Stunden für Southern Blotting und Hybridisierung.
2. Der Plattenassay ist weniger arbeitsintensiv und kann für die Analyse einer großen Anzahl von Proben automatisiert werden.
3. Anders als die anderen beiden untersuchten Assays erfordert der Plattenassay keine Vorbereitung, Reinigung oder Handhabung gefährlicher radioaktiver Sonden mit hoher spezifischer Aktivität.
4. Das Einfangen der biotinylierten Produkte über einen Plattenassay liefert eine objektive, quantitative Auswertung der Hybridisierung; die Berechnung eines statistischen Ausschlußpunktes bezüglich der Positivität der Proben und die quantitative Berechnung eines Verhältnisses von "Signal-zu- Rauschen" bei einem Assay.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer markierten Ziel-Nucleinsäuresequenz, die aus einer biologischen Probe amplifiziert wurde, umfassend, daß man die Ziel-Nucleinsäuresequenz mit mindestens einer Oligonucleotideinfangsonde hybridisiert, die eine Nucleinsäuresequenz hat, die im wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist, wobei die Einfangsonde an einen festen Polystyrolträger gebunden ist, und die Gegenwart der mit der Zielsequenz verbundenen Markierung bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß die Einfangsonde an den festen Polystyrolträger über ein zwischengeschaltetes Protein gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das zwischengeschaltete Protein Rinderserumalbumin ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin der feste Polystyrolträger eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfen ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Einfangsonden mit homopolymeren Schwänzen von Desoxyribonucleotidtriphosphaten versehen werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Hybridisierung in Gegenwart von Guanidinthiocyanat durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Markierungsmaterial Biotin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Biotinmarkierung in die Nucleinsäure-Zielsequenz während der Amplifikation der Zielsequenz durch die Polymerase-Kettenreaktion eingebaut oder an diese gebunden wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Biotinmarkierung in die Nucleinsäure-Zielsequenz eingebaut wird unter Verwendung von 5'-biotinylierten Primern während der Amplifikation mit der Polymerase-Kettenreaktion.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin der Nachweis der Biotinmarkierung erreicht wird durch Zugabe von Avidin : Meerrettichperoxidasekomplex und Reaktion mit einem chromogenen Mittel und Substrat unter Entwicklung eines kolorimetrischen Signals.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die quantitative Auswertung der Einfanghybridisierung bestimmt wird mit Hilfe der Messung der optischen Dichte der Intensität der entwickelten Farbsignale.

11. Nucleinsäurehybridisierungsassay umfassend die Stufen, daß man:

(a) eine biologische Probe mit einer Ziel-Nucleinsäuresequenz bereitstellt;

(b) eine Polymerase-Kettenreaktion mit der Probe durchführt unter Verwendung von Primern, die so ausgewählt sind, daß die Amplifikation der Nucleinsäuren mit der Zielsequenz erreicht wird und während der Amplifikation ein markierendes Material, das für die nachfolgende Detektion geeignet ist, eingebaut wird;

(c) eine Oligonucleotideinfangsonde bereitstellt mit einer Nucleinsäuresequenz, die im wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist;

(d) die Einfangsonde an die Näpfe einer Polystyrol- Mikrotiterplatte über ein zwischengeschaltetes Protein bindet;

(e) die Mikrotiterplatte mit der gebundenen Einfangsonde mit dem amplifizierten Produkt von Stufe (b) in Gegenwart von Guanidinthiocyanat in Kontakt bringt und

(f) die Gegenwart der Zielsequenz durch Nachweis der Markierung bestimmt.

12. Hybridisierungsassay nach Anspruch 11, worin das zwischengeschaltete Protein Rinderserumalbumin ist.

13. Hybridisierungsassay nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin die Zielsequenz markiert ist für den nachfolgenden Nachweis mit Hilfe des Einbaus von 5'-biotinylierten Oligonucleotidprimern während der Amplifikation der Zielsequenzen mit Polymerase-Kettenreaktion.

14. Diagnosekit zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz umfassend mindestens eine Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit einer Vielzahl von Näpfen, an die über ein zwischengeschaltetes Protein mindestens eine Oligonucleotideinfangsonde mit einer Nucleinsäuresequenz, die im wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist, gebunden ist.

15. Diagnosekit nach Anspruch 14, der zusätzlich mindestens ein Reagenz umfaßt, um die Amplifikation der Ziel- Nucleinsäuresequenz durch Polymerase-Kettenreaktion und die Hybridisierung der Einfangsonde und der Zielsequenz durchzuführen.

16. Diagnosekit nach Anspruch 15, umfassend mindestens einen PCR-Primer, der über eine Linker-Arm-Modifizierung am 5'-Ende biotinyliert ist.

17. Diagnosekit nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin das zwischengeschaltete Protein Rinderserumalbumin ist.

18. Diagnosekit nach einem der Ansprüche 14 bis 17, der geeignet ist zum Nachweis von Chlamydia trachomatis umfassend Primer, die an die folgenden Sequenzen binden:

5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'

und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'

oder 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'

und 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'.

19. Diagnosekit nach einem der Ansprüche 14 bis 18 umfassend eine Sonde, die an die folgende Sequenz bindet:

5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'

oder

5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Nucleinsäurehybridisierungsassay nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin die biologische Probe Chlamydia trachomatis enthält und die Ziel-Nucleinsäuresequenz mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wurde unter Verwendung von Primern, die Oligonucleotide sind, die an die folgenden Sequenzen binden:

5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'

und 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Einfangsonde ein Oligonucleotid ist, das an die folgende Sequenz bindet:

5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Nucleinsäurehybridisierungsassay nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin die biologische Probe Chlamydia trachomatis ist und die Ziel-Nucleinsäuresequenz mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wurde unter Verwendung von Primern, die Oligonucleotide sind, die an die folgenden Sequenzen binden:

5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'

und 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die Einfangsonde ein Oligonucleotid ist, das an die folgende Sequenz bindet:

5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'

24. Mikrotiterplatte aus Polystyrol geeignet für einen Hybridisierungsassay einer amplifizierten Nucleinsäure- Zielsequenz mit einer Vielzahl von Näpfen und einer daran über ein zwischengeschaltetes Protein gebundenen Oligonucleotideinfangsonde, wobei die Einfangsonde eine Nucleinsäuresequenz hat, die im wesentlichen der Zielsequenz komplementär ist.

25. Mikrotiterplatte nach Anspruch 24, worin das zwischengeschaltete Protein Rinderserumalbumin ist.