DE69004632T2

DE69004632T2 - Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren.

Info

Publication number: DE69004632T2
Application number: DE90111773T
Authority: DE
Inventors: Harumi Iwashita; Kinya Kato; Masanori Sakuranaga; Nobuko Yamamoto
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1989-06-23
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2010-06-22
Also published as: DK0408918T3; JPH03103199A; DE69004632D1; JP2802125B2; ES2059894T3; EP0408918A1; EP0408918B1; ATE97452T1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung der Hybridbildungsreaktion von zwei Nukleinsäurearten, die komplementär zueinander sind und auf ein Verfahren zum Nachweis eines mit einer genetischen Krankheit verbundenen Gens unter Verwendung des Verfahrens.
Wenn einzelsträngige DNAs oder RNAs komplementär zueinander sind, binden sich die komplementären Teile aneinander und werden ein Doppelstrang unter Bildung eines Hybrids. Der Nachweis oder die Mengenbestimmung von Nukleinsäuren unter Verwendung der Hybridisierungsreaktion kann verschiedene Verfahren wie das Southern-Verfahren, etc. beinhalten, die zu grundlegenden Verfahrensweisen in verschiedenen Verfahren der Gentechnik wie Genklonierung, Genrekombination, Screening von gewünschten Genen oder Krankheitsdiagnose unter Verwendung eines Gens einer Untersuchungsprobe geworden sind.
Als analytisches Verfahren unter Verwendung von Nukleinsäurehybridisierung wurde im allgemeinen das Verfahren verwendet, nach dem eine Sonde, umfassend DNA oder RNA mit einer Markierung zum Nachweis eines Hybrids versehen wird, die markierte Sonde mit einer Proben-Nukleinsäure hybridisiert wird und das gebildete Hybrid unter Verwendung der Markierung, mit der die Sonde ausgestattet wurde, nachgewiesen wird.
Als Verfahren zum Markieren der Sonde wurde das Verfahren verwendet, nach dem ein Radioisotop in eine Sonde eingebaut wird oder u.a. das Verfahren, nach dem eine Verbindung u.a., die für die Emissionsreaktion, Farbentwicklungsreaktion, Fluoreszenzreaktion, etc. benötigt wird, in die Sonde eingebaut wird oder an die Sonde gebunden wird.
Als Sonde wurde z.B. abhängig vom Zweck, etc. folgendes verwendet: Nukleinsäurefragmente, die direkt aus Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen, etc. abgetrennt wurden, klonierte Nukleinsäurefragmente, die gemäß vorbestimmten Standards kloniert wurden, Oligonukleotide, die mit einem Synthesegerät, etc. synthetisiert wurden.
Mit Entwicklung der Gentechnik vergrößerte sich auch die Verwendungshäufigkeit und der Anwendungsbereich des analytischen Nukleinsäureverfahrens, das Hybridisierung verwendet und es bestand steigender Bedarf an einem Verfahren, das die Analyse mit guter Empfindlichkeit bei einfacheren Arbeitsschritten ausführen kann.
Während beispielsweise die Markierung unter Verwendung eines Radioisotops den Vorteil guter Nachweisempfindlichkeit des Hybrids, etc. hat, erfordert sie aufgrund der Handhabung einer radioaktiven Substanz teure Reagenzien, spezielle Apparate, Vorrichtungen, etc. und die Arbeitsschritte sind auch gefährlich.
Nichtradioaktive Markierung wie Markierung mit einein Enzym unter Verwendung der Fluoreszenzreaktion eines Komplexes aus Biotin, Avidin, Anti-Avidin-Antikörper und einem Fluoreszenzfarbstoff hat im Gegensatz dazu den Nachteil, daß die Nachweisempfindlichkeit bei Verwendung zur Markierung einer Sonde wahrscheinlich geringer ist, wobei das Verfahren den Vorteil hat, daß die Markierung und der Nachweis mit sicheren und einfachen Arbeitsschritten durchgeführt werden.
Auch können Nukleinsäurefragmente mit Nukleotidkettenlängen von 100 Basen oder mehr bei verschiedenen Analysen häufig als Sonden zur Markierung verwendet werden. Obwohl derartige relativ langen Nukleinsäurefragmente den Vorteil haben, daß sie relativ leicht markiert werden können, ist die Synthese mit einem Synthesegerät schwierig und daher besteht der Nachteil, daß mühsame Arbeitsschritte wie Trennung von lebendem Material, Klonierung, etc. zu ihrer Herstellung erforderlich sind.
Im Gegensatz dazu hat ein Nukleinsäurefragment mit einer Länge von weniger als 100 Basen den Vorteil, daß es leicht mit einem Synthesegerät synthetisiert werden kann. Jedoch besteht der Nachteil, daß die Markierung, insbesonders Markierung durch "Nick-Translation" oder mit einem Enzym nicht leicht durchgeführt werden kann.
Wenn es ferner gewünscht wird, viele Nukleinsäurearten unter Verwendung vieler Sondenarten gleichzeitig zu analysieren, ist es zur Unterscheidung, welche Sonde in dem gebildeten Hybrid enthalten ist, notwendig, voneinander verschiedene Markierungen an den Sonden entsprechend den jeweiligen Nukleinsäuren anzubringen. Jedoch sind derartige Arbeitsschritte äußerst mühsam.
Andererseits macht jetzt die Anwendung des analytischen Nukleinsäureverfahrens unter Verwendung von Hybridisierung für das Nachweisverfahren eines Gens, das mit einer Krankheit verbunden ist auf sich aufmerksam.
Als Krankheiten, die durch Mutation, etc. auf Genebene ausgelöst werden, sind verschiedene Erbkrankheiten bekannt, z.B. Phenylketonurie, Erbkrankheiten mit Hämoglobin-Abnormität wie Thalassämie, etc., OTC-Mangel (ornithin-Transcarbamylase), Muskeldystrophie vom Duchenne-Typ, etc.
Es wurde auch berichtet, daß die Mutation eines Proteins durch Genmutation bei der Erzeugung einer bestimmten Krebsart eine Rolle spielt.
Auch nimmt die Wahrscheinlichkeit zu, daß das Auftreten schwerer Krankheiten wie AIDS, ATL, etc. durch Retroviren verursacht wird.
Die Diagnose von Erbkrankheiten wurde im allgemeinen durchgeführt durch Messung einer Enzymaktivität und Proteinmenge, wobei sowohl Enzym als auch Protein charakteristisch für die Erbkrankheit sind und durch Beurteilung der Ergebnisse, ob ein Mangel oder eine Abnormität besteht, aber in einigen Fällen kann das Enzym, das zum Kennzeichen der Krankheit wird, nur lokal in Organen, etc. vorkommen, wo Probennahme schwierig ist und daher kann eine untersuchungsprobe nur schwer erhältlich sein und das zu messende Kennenzym kann manchmal auch nicht identifiziert werden, so daß diese Diagnoseverfahren nicht zufriedenstellend genug sind.
Andererseits wurde die Diagnose viraler Infektionskrankheiten ausschließlich mit dem ELISA-Verfahren und dem PA-Verfahren durchgeführt, aber diese Verfahren sind nicht notwendigerweise richtig.
Wenn eine Erbkrankheit, Krebs oder eine virale Infektionskrankheit in einem frühen Stadium durch Diagnose auf Genebene gefunden werden kann, für die Probennahme einer Untersuchungsprobe relativ leicht ist und richtige Auswertung erwartet werden kann, kann eine angemessene Therapie in einem frühen Stadium durchgeführt werden. So bestand steigender Bedarf an einem Diagnoseverfahren auf Genebene.
Als ein solches leistungsfähiges Verfahren gibt es z.B. RFLP (Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus).
Nach diesem Verfahren werden die DNA-Fragmente, die durch Spaltung des gesamten Humangenoms mit Restriktionsenzymen gewonnen wurden auf Agarosegelen elektrophoretisch untersucht, die Elektrophorese-Fragmente werden mit einer mit einem Radioisotop, etc. markierten Sonden-DNA hybridisiert und die Elektrophorese des Hybrids, das unter Verwendung der Markierung nachgewiesen wurde, wird mit dem Elektrophorese-Muster verglichen, das auf ähnliche Weise mit dem normalen Gen gewonnen wurde, wobei das mit der Krankheit verbundene Gen nachgewiesen wird.
Das Diagnoseverfahren für Erbkrankheiten durch Genanalyse unter Verwendung von RFLP, etc. erregt Aufmerksamkeit als äußerst brauchbares Verfahren zur Durchführung von sichereren Diagnosen.
Jedoch muß zur Durchführung dieser Verfahren das technische Personal molekularbiologische Kenntnisse besitzen und mit der Arbeitsweise vertraut sein und weiter sind die Arbeitsschritte auch mühsam und daher kann Medizinfachpersonal wie Ärzte, Überwachungstechniker, etc. das Verfahren nicht leicht durchführen.
Auch erfordert dieses Verfahren eine Zeit von ungefähr einem Tag für jeden Schritt der DNA-Spaltung, des Southern- Blots und der Hybridisierung und es dauert lange bis das Endergebnis gewonnen wird, wodurch die Anzahl der Untersuchungsproben, die pro Untersuchung gehandhabt werden begrenzt ist und es ist deshalb sehr schwer DNAs vieler Patienten auf mehrere Fragestellungen hin zu untersuchen.
Die Verwendung des Nachweisverfahrens unter Verwendung von Hybridisierung von Nukleinsäuren für das taxonomische Verfahren bei Mikroorganismen wie Bakterien, etc. insbesonders für Untersuchungen von Pathogenen erregt auch Aufmerksamkeit.
Die taxonomische Identifizierung von Mikroorganismen wurde durchgeführt durch Erforschung der ökologischen und biochemischen Eigenschaften der Mikroorganismen durch Vergleich mit Standardmikroorganismen.
Jedoch ist die Beurteilung der Eigenschaften gemäß derartiger Verfahren in einigen Fällen, abhängig vom Untersuchungsverfahren, unterschiedlich oder die Ergebnisse der Identifizierung können unterschiedlich sein, abhängig davon, auf welche Eigenschaft Wert gelegt wird.
Wenn die Untersuchungspr6be aus Bakterien, u.ä. besteht, die von einem Patienten mit Infektionskrankheit gewonnen wurde, kann bei einem Fehler in den Ergebnissen der Identifizierung keine entsprechende Vergleichsbehandlung durchgeführt werden und daher ist sicherere Identifizierung besonders erforderlich.
Zur Lieferung eines sichereren Identifizierungsverfahrens wurde dementsprechend in den letzten Jahren versucht, das DNA- DNA-Hybridisierungsverfahren für Nachweis und Identifizierung von ursächlichen Bakterien von bakteriellen Infektionskrankheiten zu verwenden.
Nach diesem Verfahren wird eine charakteristische Basensequenz aus den DNAs des Bakteriums zur Standardsequenz gemacht und wenn eine Basensequenz mit hoher Homologie zu der Standardsequenz in der DNA existiert, die aus dem Bakterium der Untersuchungsprobe extrahiert wurde, wird diese gemäß des Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung einer Sonde untersucht, die die Standardsequenz nachweisen kann, wodurch die taxonomische Identifizierung des Bakteriums der Untersuchungsprobe durchgeführt wird.
Als Sonde in diesem Verfahren kann folgendes verwendet werden: das von dem Bakterienchromosom klonierte DNA-Fragment, das zu dem Bakterium gehörende Plasmid selbst, synthetische Oligonukleotide, etc.
Genauer können die folgenden Verfahren eingeschlossen sein, bei denen die verwendete Sonde folgendes ist:
1) ein kloniertes Zufallsfragment;
2) eine ribosomale RNA; und
3) ein synthetisches oligonukleotid mit einer Basensequenz, charakteristisch für die Art oder Gattung, ausgewählt aus der Basensequenz der ribosomalen RNA.
Als vorstehendes Verfahren 1) wird eines ausgewählt, nach dem zufallsfragmente, gewonnen durch Spaltung von aus Bakterien extrahierter DNA mit einem zweckmäßigen Restriktionsenzym als Sonde verwendet werden, wobei der Klon spezifisch nur mit der gewünschten taxonomischen Gruppe reagiert. Dieses Verfahren ist z.B. bekannt aus: Criale, M.S., Flowers, R.S. et al.: DNA probes, 143-148, 1986, etc.
Als vorstehendes Verfahren 2) ist eines bekannt und wurde offenbart von Edelstein, P.H.; J. Clin. Microbiol., 23:481-484, 1986. Dieses Verfahren beachtete die Tatsache, daß sich bakterielle, ribosomale RNAs innerhalb der gleichen taxonomischen Gruppe relativ ähnlich sind und der Vorteil besteht, daß die Nachweisempfindlichkeit durch Verwendung von ribosomaler RNA erhöht wird, weil in dem Bakterienchromosom eine große Zahl von Genkopien vorkommt.
Als vorstehendes Verfahren 3) wurden Beispiele berichtet, in denen Basensequenzen, spezifisch für die Gattung, die Art oder die Unterart, etc. als Sonde verwendet werden, die zur Gattung Proteus gehören und ausgewählt wurden aus der Basensequenz ribosomaler RNA der Gattung Proteus (Haun, G. u. Gobel, U.; FEMS Microbiol. Lett., 43:187-194, 1987).
Jedoch haben diese Verfahren auch üblicherweise Probleme bei den verschiedenen analytischen Verfahren unter Verwendung von Hybridisierung, wie vorstehend beschrieben.
EP-A-0 135 159, EP-A-0 146 815 und EP-A-0 144 914 beschreiben alle Hybridisierungsassays, bei denen das Hybrid, das sich zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure und der Sonde bildet, nach erfolgter Reaktion markiert wird. Die Markierung wird entweder über einen Antikörper an das Hybrid gebunden (EP-A-0 135 159), an zwei verschiedenen Reagenzien mit zwei verschiedenen Markierungen, die sich beide spezifisch an das Hybrid binden (EP-A-0 144 914) oder über einen Antikörper an ein interkalierendes Molekül (EP-A-0 146 815).
EP-A-0 235 726 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von bestimmten Nukleinsäureseguenzen in einer Proben-Nukleinsäure, wobei die Probe selbst markiert wird.
Die Erfindung wurde hinsichtlich der Probleme der verschiedenen Nachweisverfahren nach dem Stand der Technik mit Verwendung von vorstehend beschriebenen Hybridisierungsverfahren durchgeführt und es ist ihr Ziel, ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung des Hybridisierungsverfahrens zur Verfügung zu stellen, das einfach und richtig durchgeführt werden kann.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren zur Verfügung, einschließlich des Verfahrens der Reaktion einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden-Nukleinsäure und der Analyse der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Hybrids aus einer nachzuweisenden Nukleinsäure und einer Sonden-Nukleinsäure in der gewonnenen Reaktionsmischung, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
a) Reaktion einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden- Nukleinsäure;
b) Anbringen einer Markierung durch Primererweiterung nur an dem Hybrid, das sich in der nach dem Verfahren a) gewonnenen Reaktionsmischung gebildet hatte; und
c) Nachweis des im Verfahren b) markierten Hybrids unter Verwendung der Markierung.
Fig. 1 ist eine Karte, die die Anordnung der Flecken der Sonden-Nukleinsäure in Beispiel 2 zeigt;
Fig. 2 ist eine Karte, die die Anordnung der Flecken der Sonden-Nukleinsäure in Beispiel 3 zeigt;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das den Aufbau des Hybrids aus der nachzuweisenden Nukleinsäure und der Sonden-Nukleinsäure schematisch zeigt; und
Fig. 4A und 4B sind Diagramme zur Erläuterung von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 1.
Die Erfindung kann verwendet werden zum Nachweis und zur Mengenbestimmung verschiedener Nukleinsäuren wie DNA oder RNA, abgeleitet von lebendem Material aus Menschen, Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen wie Bakterien, etc., Pilzen, Protozoen, etc., klonierter DNA, rekombinanter DNA, synthetischer DNA, etc., wobei die Art der nachzuweisenden Nukleinsäure nicht eingeschränkt ist.
Als Sonden-Nukleinsäure kann jede Nukleinsäure mit einer Basensequenz verwendet werden, die wirksam mit der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren kann und es kann ein Oligonukleotid mit relativ kurzer Nukleotidkettenlänge, das geeigneterweise künstlich mit einem Synthesegerät synthetisiert werden kann, ohne weiteres verwendet werden.
Die Länge der Nukleotidkette der Sonden-Nukleinsäure sollte vorzugsweise 1/10 oder kleiner als die nachzuweisende Nukleinsäure sein.
Da gemäß der Erfindung ein Hybrid, umfassend eine Sonden- Nukleinsäure und eine nachzuweisende Nukleinsäure mit einer Markierung versehen wird, werden die notwendigen Anforderungen an die Markierung nicht für die Sonden-Nukleinsäure selbst verlangt.
Beim Markieren nach dem "Nick-Translations-Verfahren" oder einem Bindungsverfahren mit einem Markierungsenzym muß die Nukleinsäure mindestens eine gewisse Nukleotidkettenlänge besitzen, um markiert zu werden, aber die gemäß der Erfindung zu verwendende Sonden-Nukleinsäure muß keine derartige Anforderung erfüllen.
Daher wird es -wie vorstehend beschrieben- möglich, als Sonden-Nukleinsäure eine mit kleiner Nukleotidkettenlänge zu verwenden, die leicht erhältlich (herzustellen) ist und den Nachweis mit hoher Empfindlichkeit verwirklichen kann.
Da gemäß der Erfindung das gebildete Hybrid mit einer Markierung versehen wird, ist es jedoch wünschenswert, einen Aufbau und die Nukleotidkettenlänge der Sonden-Nukleinsäure so zu wählen, daß das Hybrid leicht markiert werden kann.
Gemäß des Markierungsverfahrens mit dem Verfahren, nach dem eine Nukleotidkette des Hybriddoppelstranges als Primer verwendet wird und die Nukleotidkette von ihrem Ende aus erweitert wird, wobei eine Markierungssubstanz in den erweiterten Teil eingebaut wird, muß beispielsweise, wie nachstehend beschrieben, das zu bildende Hybrid einen Aufbau haben, bei dem die mit der Sonden-Nukleinsäure hybridisierte Nukleotidkette der nachzuweisenden Nukleinsäure während der Erweiterung des Primerendes als Templat wirken kann, so daß nämlich die Nukleotidkette der nachzuweisenden Nukleinsäure als Einzelstrang am Ende der Sonden-Nukleinsäure in Ausdehnungsrichtung vorkommen kann.
Im Fall eines derartigen Markierungsverfahrens unter Verwendung einer Sonden-Nukleinsäure als Primer sollte daher der Aufbau und die Nukleotidlänge der Sonden-Nukleinsäure hinsichtlich der Struktur des zu bildenden Hybrids wie gewünscht bestimmt werden.
In einigen Fällen kann auch die Proben-Nukleinsäure als Primer verwendet werden.
Hybridisierung einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden- Nukleinsäure kann mit den folgenden herkömmlichen Verfahren ausgeführt werden.
Da die Bedingungen der Hybridbildungsreaktion von der Nukleotidkettenlänge und der Basensequenz der Sonden-Nukleinsäure abhängen, können die Arbeitsbedingungen der Hybridisierung zweckmäßigerweise entsprechend des gewünschten Zweckes optimal gewählt werden.
Die Hybridbildungsreaktion kann im allgemeinen in einer Hybridisierungslösung ausgeführt werden, die Formamid, eine zweckmäßige Salz- und Denhardt-Lösung enthält, wobei die Temperatur gesteuert wird.
Zur Hybridbildungsreaktion kann das Verfahren verwendet werden, nach dem eine Proben-Nukleinsäure und eine Sonden- Nukleinsäure in einer Hybridisierungslösung miteinander umgesetzt werden, das Verfahren, nach dem eine Proben-Nukleinsäure mit einer auf einem Träger immobilisierten Sonden-Nukleinsäure in einer Hybridisierungslösung umgesetzt wird, das Verfahren, nach dem eine Sonden-Nukleinsäure mit einer auf einem Träger immobilisierten Proben-Nukleinsäure umgesetzt wird, etc.
Zur Immobilisierung der Proben-Nukleinsäure oder der Sonden-Nukleinsäure auf einem Träger, ist es möglich, das Verfahren zu verwenden, nach dem die Nukleinsäure physikalisch oder chemisch auf einem Träger wie Nitrocellulose, Nylon-Film, verschiedenen Gelen, etc. gebunden wird.
Nach dem Verfahren der Erfindung wird das Hybrid, das als Ergebnis der Reaktion zwischen einer Proben-Nukleinsäure und einer Sonden-Nukleinsäure gebildet wird, selektiv mit einer Markierung versehen.
Als Markierungsverfahren ist z.B. die Verwendung des Verfahrens möglich, nach dem bei Verwendung einer der Ketten, aus der der Hybriddoppelstrang besteht, als Primer und bei Erweiterung ihres Endes unter Bildung eines Doppelstranges aus einem Einzelstrang, eine Markierungssubstanz in den erweiterten, neu synthetisierten Teil eingebaut wird.
Da nach diesem Verfahren kein Teil vorkommt, der als Primer zur Bildung eines neuen Doppelstranges wirkt und kein Teil, der zum Templat zur Bildung des erweiterten Teiles wird, tritt in der Nukleinsäure, die kein Hybrid bildet, keine Doppelstrang-Bildungsreaktion auf, die die vorstehend erwähnte Markierungssubstanz einbaut.
Selbst wenn die Markierungsreaktion durchgeführt werden kann, indem man die Nukleinsäuren, die keine Hybride bilden und die Hybride vermischt, können nur die Hybride selektiv mit der Markierung versehen werden.
Für eine solche Markierung können verschiedene Verfahren zur Synthese eines neuen Doppelstrangteiles verwendet werden.
Beispielsweise ist die Verwendung eines Verfahrens möglich, nach dem das zu markierende Hybrid mit Nukleotiden wie dATP, dCTP, dGTP, dTTP, etc. umgesetzt wird, die zur Erweiterung des Primerendes nötig sind und ein markiertes Nukleotid wird für ein, zwei oder mehrere der während der Reaktion verwendeten Nukleotide verwendet, so daß die Markierung in die neugebildete Nukleotidkette eingebaut wird.
Als markiertes Nukleotid ist die Verwendung derjenigen möglich, die im allgemeinen zur Sondenmarkierung verwendet werden, z.B. ein mit Radioisotopen (RI) markiertes, ein mit einer nichtradioaktiven Markierungssubstanz (nicht RI) markiertes, wie mit Enzymen oder Verbindungen, nötig zur Erzeugung von Fluoreszenz, Emission oder Farbentwicklung, z.B. Biotin, Dinitrophenylnukleotidderivate, etc.
Als Enzym zur Nukleotidkettenbildung können verschiedene DNA-Polymerasen wie E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, etc. und reverse Transkriptase, etc. verwendet werden.
Die Markierung kann gemäß der Erfindung bei Immobilisierung des Hybrids auf einem zweckmäßigen Träger oder unter Lösung oder Dispersion des Hybrids in einem zweckmäßigen Lösungsmittel durchgeführt werden.
Nach vollständiger Markierungsreaktion kann die Trennung des markierten Hybrids von nicht in das Hybrid eingebauter Markierungssubstanz gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

(1) Bei Verwendung einer immobilisierten Sonden-Nukleinsäure:

Eine Proben-Nukleinsäure wird mit einer immobilisierten Sonden-Nukleinsäure umgesetzt, die auf einem zweckmäßigen Träger immobilisiert wurde. Bei Bildung eines Hybrids während dieser Reaktion, wird dieses auch auf dem Träger immobilisiert. Wenn bei diesen Bedingungen ferner eine Markierungsbehandlung durchgeführt wird, wird der Träger gewaschen, indem man z.B. die Salzkonzentration und die Temperatur ändert, um die nicht in das Hybrid eingebaute Markierungssubstanz wegzuwaschen.

(2) Bei Verwendung einer immobilisierten Proben-Nukleinsäure:

Eine Sonden-Nukleinsäure wird mit einer auf einem zweckmäßigen Träger immobilisierten Proben-Nukleinsäure umgesetzt. Bei Bildung eines Hybrids während dieser Reaktion, wird dieses auch auf dem Träger immobilisiert. Bei anschließender Verfahrensweise wie in vorstehendem Verfahren (1) wird der Träger ähnlich gewaschen, um die nicht in das Hybrid eingebaute Markierungssubstanz wegzuwaschen.

(3) Bei Ausführung einer Reaktion zwischen einer Proben-Nukleinsäure und einer Sonden-Nukleinsäure ohne Immobilisierung:

Die Reaktion zwischen einer Sonden-Nukleinsäure und einer Proben-Nukleinsäure wird in einem zweckmäßigen Medium ausgeführt. Nach Markierungsbehandlung der Reaktionsmischung werden das Hybrid und die nicht in das Hybrid eingebaute Markierungssubstanz durch ein zweckmäßiges Trennverfahren getrennt.
Als derartiges Trennverfahren kann Trennung durch Ethanolfällung, durch eine Gelfiltrationssäule, etc. verwendet werden.
Wenn eine Sonden-Nukleinsäure als Primer für die vorstehend beschriebene Reaktion verwendet wird, ist die Verwendung einer derartigen Sonden-Nukleinsäure wünschenswert, die einen Aufbau oder eine Nukleotidkettenlänge, verwendbar als Primer besitzt, so daß sie nach Hybridbildung als Sonden- Nukleinsäure verwendet werden kann. In einigen Fällen kann auch die Proben-Nukleinsäure als Primer verwendet werden.
Gewöhnlich besitzt bei Verwendung der gleichen Markierungsmenge nicht-RI-Markierung im allgemeinen eine geringere Empfindlichkeit, verglichen mit RI-Markierung, aber nach dem Verfahren der Erfindung wird hochempfindlicher Nachweis ermöglicht, selbst wenn nicht-RI-Markierung verwendet wird.
Nach dem Verfahren nach dem Stand der Technik werden Sonden-Nukleinsäuren mit kleiner Nukleotidkettenlänge markiert und in den meisten Fällen verwendet, aber in einem derartigen Fall ist der Teil mit eingebauter Markierung und auch die Menge an eingebauter Markierung begrenzt.
Nach dem Verfahren der Erfindung, nach dem eine Kombination von Sonden-Nukleinsäure und Proben-Nukleinsäure verwendet wird und aufgrund der Berücksichtigung der Tatsache, daß der durch Erweiterung des Nukleinsäureendes neu synthetisierte Doppelstrangteil eine ausreichende Länge aufweist, wobei das Nukleinsäureende bei Durchführung der Markierung wie vorstehend beschrieben zum Primer wird, kann im Gegensatz dazu die durch Markierung eingebaute Markierungsmenge erhöht werden, wodurch auch die geringe Empfindlichkeit durch eine derartig hohe Menge an eingebauter Markierung ausgeglichen werden kann, selbst wenn eine nicht-RI-Markierung verwendet wird, so daß Nachweis mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht wird.
Nach vollständiger Markierung des Hybrids wird es unter Verwendung der Markierung nachgewiesen.
Durch quantitative Analyse der Markierungsmenge des gebildeten Hybrids kann auch die Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure bestimmt werden.
Durch Verwendung vieler Nukleinsäurearten als Sonden- Nukleinsäuren in den vorstehend beschriebenen Arbeitsschritten können viele Nukleinsäuren, die in einer Proben-Nukleinsäure enthalten sind, gleichzeitig nachgewiesen werden.
Repräsentative Beispiele - der Verfahren unter Verwendung vieler Sondenarten werden nachstehend gezeigt.

a) Verfahren mit Verwendung immobilisierter Sonden:

Zuerst werden die immobilisierten Sonden-Nukleinsäuren mit einer Proben-Nukleinsäure umgesetzt, indem viele Sonden-Nukleinsäurearten entsprechend den jeweiligen nachzuweisenden Nukleinsäurearten mit einer vorbestimmten Anordnung immobilisiert werden, so daß unterschieden werden kann, welche Sonden-Nukleinsäure sich an welcher Stelle befindet.
Nach vollständiger Reaktion wird die Behandlung zur Anbringung einer Markierung an das gebildete Hybrid durchgeführt und der Ort der Bildung des Hybrids wird unter Verwendung der Markierung nachgewiesen. Die Art der entsprechenden Sonden-Nukleinsäure wird durch den Ort mit positivem Signal identifiziert und aus dem Ergebnis kann die Art der nachzuweisenden Nukleinsäure beurteilt werden, die in der Proben- Nukleinsäure enthalten ist.
Nach diesem Verfahren kann aus den vorher festgesetzten, immobilisierten Stellen der Sonden-Nukleinsäuren leicht beurteilt werden, mit welcher Sonden-Nukleinsäure die Proben- Nukleinsäure hybridisiert hat, da die Sonden-Nukleinsäuren an vorher festgesetzten Stellen immobilisiert werden.
Daher ist es nicht nötig, verschiedene Markierungen für die entsprechenden Sonden-Nukleinsäuren zu verwenden, so daß die jeweiligen Arten der Sonden-Nukleinsäuren wie nach dem Verfahren nach dem Stand der Technik gewählt werden können, nach dem markierte Sonden mit einer immobilisierten Proben- Nukleinsäure umgesetzt werden.
Zur gleichzeitigen wirksamen Ausführung der Hybridbildungsreaktion mit vielen Sonden-Nukleinsäurearten durch die gleichen Arbeitsschritte sollte die Nukleotidkettenlänge der entsprechenden Sonden-Nukleinsäuren vorzugsweise so gesteuert werden, daß die einzelnen Hybridbildungsreaktionen der vielen Sonden-Nukleinsäurearten bei den gleichen Bedingungen ablaufen.
Im einzelnen kann z.B. die Dissoziationstemperatur (Tm: Temperatur der Einzelstrangbildung) der gebildeten Hybride in den einzelnen Hybridbildungsreaktionen vorzugsweise übereinstimmen.
Genauer wurden zur Berechnung des Tm-Wertes verschiedene Formeln verwendet, abhängig von der verwendeten Hybridisierungslösung. In 0,9 M NaCl wird die Tm eines Oligonukleotids mit 20 Basen oder weniger z.B. dargestellt durch:
Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C).
(A, T, G und C zeigen jeweils die Zahl der Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosinbasen). (s. R. Kinami, M. Nagahara: "Continued Biochemical Experimental Course 1, Gene Study Method II", Tokyo Kagaku Doujin, S. 236).
Entsprechend dieser Formel kann die Basensequenz der jeweiligen Sonden-Nukleinsäuren in dieser Formel zur Längenauswahl so ersetzt werden, daß die Tm-Werte der jeweiligen Sonden-Nukleinsäuren übereinstimmen.
Die Nukleotidkettenlänge der vielen Sonden-Nukleinsäurearten sollte vorzugsweise 1/10 oder kleiner als die mittlere Nukleotidkettenlänge der nachzuweisenden Nukleinsäuren sein.

b) Verfahren bei Verwendung von unabhängigen Reaktionsorten wie Mikroplatten, etc.:

Zuerst werden Hybridisierungslösungen hergestellt, die Proben-Nukleinsäuren an den entsprechenden Reaktionsstellen eines Trägers mit unabhängigen Reaktionsstellen wie einer Mikroplatte, etc. enthalten.
Dann werden viele Sonden-Nukleinsäurearten einzeln auf die Reaktionsstellen gegeben, um die Hybridisierung zu bewirken. In diesem Fall sollte sichergestellt werden, welche Sonden-Nukleinsäure auf welche Reaktionsstelle gegeben wird.
Nach vollständiger Reaktion werden die Reaktionen durchgeführt, die zur Markierung der an den entsprechenden Reaktionsstellen gebildeten Hybride nötig sind und dann wird die Hybridbildung unter Verwendung der Markierung nachgewiesen, die Art der entsprechenden Sohden-Nukleinsäure wird aus der Reaktionsstelle mit positivem Signal identifiziert und aus dem Ergebnis wird die nachzuweisende Nukleinsäureart beurteilt, die in der Proben-Nukleinsäure enthalten ist.
Zur gleichzeitigen wirksamen Ausführung der Hybridbildungsreaktion mit vielen Sonden-Nukleinsäurearten mit den gleichen Arbeitsschritten sollte die Nukleotidkettenlänge der jeweiligen Sonden-Nukleinsäuren vorzugsweise so gesteuert werden, daß die einzelnen Hybridbildungsreaktionen der vielen Sonden-Nukleinsäurearten bei den gleichen Bedingungen ablaufen.
Beispielsweise sollten die entsprechenden Nukleotidkettenlängen wie vorstehend beschrieben vorzugsweise so gewählt werden, daß die Tm-Werte übereinstimmen.
Die Nukleotidkettenlänge der vielen Sonden-Nukleinsäurearten sollte vorzugsweise 1/10 oder kleiner als die Nukleotidkettenlänge der nachzuweisenden Nukleinsäuren sein.
Nach dem Verfahren der Erfindung mit Verwendung vieler Sonden-Nukleinsäurearten einschließlich der vorstehend beschriebenen Verfahren a und b ist es nicht nötig, die Markierung der entsprechenden Sonden-Nukleinsäuren mit verschiedenen Markierungen zur Auswahl der vielen Sonden-Nukleinsäurearten auszuführen, wie nach dem Verfahren nach dem Stand der Technik, nach dem markierte Sonden mit einer immobilisierten Proben- Nukleinsäure umgesetzt werden.
Andererseits ist es auch möglich, die gleichzeitige Überprüfung vieler Proben-Nukleinsäurearten durchzuführen, indem man eine Sonden-Nukleinsäureart für viele Proben-Nukleinsäurearten verwendet.
Die Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure in einer Probe kann z.B. entsprechend der Stelle mit positivem Signal bestätigt werden, indem man viele Proben-Nukleinsäurearten auf einem zweckmäßigen Träger immobilisiert, so daß die Stelle jeder Proben-Nukleinsäure unterschieden werden kann, dann die Reaktion mit einer Sonden-Nukleinsäureart ausführt, die gebildeten Hybride mit einer Markierung versieht und zum Nachweis der Markierung behandelt.
Ferner kann dieses Verfahren auch ohne Immobilisierung der Nukleinsäuren auf einem Träger durchgeführt werden, der unabhängige Reaktionsstellen wie Mikroplatten, etc. bilden kann.
Das vorstehend beschriebene Verfahren der Erfindung zum Nachweis von Nukleinsäuren ist brauchbar zum Nachweis von Genen, die mit Erbkrankheiten, Krebsarten und viralen Infektionskrankheiten verbunden sind.
Als Beispiel des Nachweises von Genen, die mit Erbkrankheiten, etc. verbunden sind, können gemäß des Verfahrens der Erfindung die folgenden nachstehend gezeigten Verfahren erwähnt werden:
a) Verfahren zur Immobilisierung einer Sonden-Nukleinsäure auf einem geeigneten Träger, die mit dem Gen verwandt ist, das die zu überprüfende Krankheit anzeigt;
b) Verfahren der Reaktion der immobilisierten Sonde, gewonnen mit Verfahren a) mit der chromosomalen DNA der Untersuchungsprobe (Proben-Nukleinsäure);
c) Verfahren der notwendigen Behandlung zur Markierung des nach dem Verfahren b) auf dem Träger gebildeten Hybrids:
d) Verfahren zum Nachweis des in Verfahren b) gebildeten Hybrids unter Verwendung der Markierung aus Verfahren c).
Als Nukleinsäuresonde, die nach dem vorstehenden Verfahren a) verwendet wird, kann eine mit einer Basensequenz verwendet werden, die zur Erkennung der in dem Gen der Erbkrankheit, etc. vorhandenen Basensequenz nötig ist und deren Nukleotidlänge ist nicht besonders beschränkt.
Wenn z.B. eine Krankheit auf Grundlage einer Punktmutation durch Substitution eines Basenpaares nachgewiesen werden soll, kann zur wirksamen und hochempfindlichen Beurteilung des Unterschiedes in einer Base ein Oligonukleotid, umfassend 100 Basen oder weniger, vorzugsweise 29 Basen oder weniger, am besten 17 bis 20 Basen als Nukleinsäuresonde verwendet werden.
Auch sollte die Stelle der Substitution, die der Punkt mutation entspricht vorzugsweise so angeordnet werden, daß sie sich im Zentrum des Oligonukleotids der Sonden-Nukleinsäure befindet, um genauere Beurteilung durchzuführen.
Gemäß Verfahren a) kann die Untersuchung vieler Fragestellungen gleichzeitig durchgeführt werden durch Immobilisierung vieler Sonden-Nukleinsäurearten entsprechend der vielen Fragestellungen mit vorbestimmter Anordnung auf dem gleichen Träger. Gemäß dieses Verfahrens können auch die Arbeitsschritte des Verfahrens a) unter Verwendung vieler Sonden-Nukleinsäurearten wie vorstehend beschrieben angewendet werden.
Als DNA der Untersuchungsprobe des Verfahrens b) kann chromosomale DNA selbst, mit einem zweckmäßigen Restriktionsenzym auf geeignete Länge geschnittene chromosomale DNA, etc. verwendet werden.
Wenn Untersuchungen mit vielen Fragestellungen gleichzeitig durchgeführt werden sollen, ist die Verwendung von Fragmenten wirksam, die mit einem Restriktionsenzym auf geeignete Länge geschnitten wurden.
Die Hybridbildungsreaktion kann auch gemäß des vorstehend beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.
Wenn eine Punktmutation mit diesem Verfahren nachgewiesen werden soll, kann manchmal nur der Unterschied eines Nukleotids die Anwesenheit oder Abwesenheit der Punktmutation aufgrund der Erzeugung einer Fehlbindung (mismatch) zwischen der Sonde und der Nukleinsäure nicht unterscheiden.
Da jedoch die Tm des Hybrids durch die Anzahl der Basenpaare, die in dem fehlgebundenen Hybrid nicht komplementär sind, durch den Gehalt an G (Guanin) und C (Cytosin) in der Sonden-Nukleinsäure, durch die Nukleotidkettenlänge der Sonden- Nukleinsäure, der Stelle der Punktmutation, der Art der Fehlbindung, etc. beeinflußt wird, ist es wichtig, die Temperaturbedingungen, etc. so zu wählen, daß kein fehlgebundenes Hybrid erzeugt wird, das den Nachweis der gewünschten Punktmutation entsprechend des Aufbaus der verwendeten Sonden-Nukleinsäure, etc. stört.
Die Tm fällt z.B. um 5 bis 100 pro nicht komplementärer Base in einem fehlgebundenen Hybrid.
Daher muß die Hybridisierungstemperatur hinsichtlich der Tm des gewünschten Hybrids und der Tm des fehlgebundenen Hybrids, das sich bilden kann, ausgewählt werden.
Wenn viele Sonden-Nukleinsäurearten immobilisiert auf dem gleichen Träger verwendet werden, sollte die Nukleotidkettenlänge, etc. zusätzlich zur Anforderung betreffend die vorstehend beschriebene Fehlbindung vorzugsweise so gesteuert werden, daß die Tm der gebildeten Hybride mit den entsprechenden Sonden-Nukleinsäuren übereinstimmt.
Zur Markierung gemäß Verfahren c) können die vorstehend erwähnten Verfahren, etc. verwendet werden.
Das Verfahren d) wird gemäß des Verfahrens entsprechend der verwendeten Markierung durchgeführt.
Gemäß des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden Sonden-Nukleinsäuren in immobilisierter Form verwendet, aber die Nukleinsäuren der Untersuchungsprobe können auch anstelle der Sonden-Nukleinsauren immobilisiert werden.
Genauer können viele Arten von Untersuchungsproben gleichzeitig auf eine Untersuchungsfragestellung hin überprüft werden, indem viele Arten von Untersuchungsproben immobilisiert werden, so daß die Stellen der Immobilisierung unterscheidbar sind und eine Sonden-Nukleinsäureart mit ihnen reagiert.
Ferner können die Nukleinsäuren der Untersuchungsprobe und die Sonden-Nukleinsäuren auch miteinander umgesetzt werden, ohne daß beide immobilisiert wurden.
Als Beispiel eines derartigen Verfahrens kann das Verfahren mit den folgenden Verfahrensschritten eingeschlossen sein:
1) Verfahren der Hybridisierung der Nukleinsäuren der Untersuchungsprobe mit einer Sonden-Nukleinsäure in einem zweckmäßigen Medium;
2) Verfahren der notwendigen Markierungsbehandlung des Hybrids, das in der mit Verfahren 1) gewonnen Reaktionsmischung gebildet wurde;
3) Verfahren des Nachweises des in Verfahren 1) gebildeten Hybrids unter Verwendung der mit Verfahren 2) angebrachten Markierung;
Die Arbeitsschritte der Hybridisierung, der Markierung des Hybrids, des Nachweises des markierten Hybrids gemäß dieser Verfahren kann nach den vorstehend beschriebenen Arbeitsschritten durchgeführt werden.
Durch die gleichzeitige Ausführung der Verfahren 1) bis 3) für viele Sonden-Nukleinsäurearten unter einzelner Verwendung vieler Sonden-Nukleinsäurearten gemäß den vorstehend in Punkt b des Verfahrens mit Verwendung vieler Sonden-Nukleinsäurearten beschriebenen Arbeitsschritten, können viele Untersuchungsfragestellungen gleichzeitig überprüft werden.
Nachdem jeweils viele Nukleinsäuren der Untersuchungsprobe auf die Reaktionsstellen des Trägers gegeben wurden, der unabhängige Reaktionsstellen wie Mikroplatten, etc. binden kann, so daß die auf jede Reaktionsstelle gegebene Untersuchungsprobe unterschieden werden kann, wird andererseits die gleiche Sonden-Nukleinsäureart in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von Hybridisierung, Markierung des Hybrids und Behandlung zum Nachweis der Markierung, so daß beürteilt werden kann, ob die der Vertiefung entsprechende Proben-Nukleinsäure mit positivem Signal bezüglich der Fragestellung der Untersuchung positiv ist oder nicht.
Gemäß des Verfahrens zum Nachweis eines Gens, das mit einer Erbkrankheit, etc. zusammenhängt, können Mikroorganismen taxonomisch identifiziert werden, indem -wie vorstehend beschrieben- eine Nukleinsäure mit einer Basensequenz, die zu einem Mikroorganismus wie ein Bakterium, Virus, etc. gehört als Sonde und eine aus einem Mikroorganismus abgetrennte Nukleinsäure als Probe verwendet wird.
Im Fall der Taxonomie von Bakterien kann als Sonde geeigneterweise eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidkettenlänge von ungefähr 20 verwendet werden, während im Fall der Taxonomie von Viren geeigneterweise eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidkettenlänge von ungefähr 20 verwendet werden kann.

Beispiel 1

Ein Oligonukleotid mit 41 Basen und der folgenden DNA- Basensequenz, die einen Teil des Plasmids pUC 19 darstellt, wurde mit einem DNA-Synthesegerät (ABI, Modell 381 A) synthetisiert.
Unter Verwendung eines Teiles des synthetisieren Produktes wurde dessen Reinheit mit einer Gelelektrophorese mit 15% Polyacrylamid und 7 M Harnstoff überprüft. Als Ergebnis wurde die Reinheit des synthetisierten Produktes mit 90% oder höher beurteilt und daher wurde das synthetisierte Produkt direkt ohne Reinigung für die anschließenden Arbeitsschritte verwendet.
Eine Lösung (50 ul) mit 50 ug des synthetisierten Produktes wurde mit 100 ul einer vermischten Reagenzienlösung [0,12 M Tris, enthaltend 0,46 M Kaliumcacodylat (pH 6,9), 3,3 mM CoCl&sub2; und 0,33 mM Dithiothreitol], 40 ul 4,0 mM biotinyliertem UTP (hergestellt von BRL Co.), 1 ul 1,0 mM dTTP, 100 ul Wasser und 15 ul (ungefähr 90 Einheiten) TdT (terminale Deoxynukleotidyl- Transferase) vermischt und die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 30ºC ausgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 ul 0,2 M EDTA beendet.
Nach Ende der Reaktion wurde eine Phenolbehandlung und Ethanolfällung durchgeführt und die gewonnenen Fällungen wurden getrocknet und dann in 100 ul Wasser gelöst.
Agarose (Gel) wurde mit Cyanogenbromid aktiviert und Avidin wurde daran gebunden, wodurch eine immobilisierte Phase (Träger) gebildet wurde.
Die immobilisierte Phase wurde zu der wässrigen Lösung der Fällungen gegeben, die durch Behandlung des vorher gewonnenen 41-Basen-Oligonukleotids gewonnen wurden und diese wurden vermischt, wobei 20 Minuten lang langsam gerührt wurde, gefolgt von Zentrifugation bei sanften Bedingungen und der Überstand wurde entfernt, wodurch sich eine immobilisierte Sonden- Nukleinsäure ergab.
Andererseits wurde ein Plasmid pBR 322 (Probe A), ein Plasmid pUC 19 (Probe B) und eine Mischung aus dem Plasmid pBR 322 und dem Plasmid pUC 19 (Probe C, Mischgewichtsverhältnis 1:1) als Proben-Nukleinsäure hergestellt, diese Proben wurden auf herkömmliche Weise mit Eco RI (Toyobo) verdaut, dann wurden die verdauten Produkte unter Bildung von Einzelstrang-DNA aus Doppelstrang-DNA erhitzt und die folgenden Arbeitsschritte wurden unter Verwendung von Reaktionsprodukten durchgeführt, die einzeln die 3 Arten der aus den entsprechenden Proben gewonnenen Einzelstrang-DNA enthielten.
In ein Untersuchungsröhrchen wurden 20 ug des Reaktionsproduktes mit der Einzelstrang-DNA und der vorher hergestellten immobilisierten Sonden-Nukleinsäure eingefüllt und zu der Mischung wurden 10 ul einer 10 x Verschmelzungslösung (annealing) [1 x Verschmelzungslösung: 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 60 mM MgCl&sub2;, 60 mM β-Mercaptoethanol und 500 mM NaCl] und ferner destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 100 ul zugeben.
Die gewonnene, vermischte Lösung wurde 10 Minuten lang auf 65ºC erhitzt und dann wurde die Temperatur ungefähr eine Stunde lang auf Raumtemperatur abgesenkt.
Dann wurden nach Zugabe von 10 ul einer 10 x Verschmelzungslösung, 10 ul 1 mM dATP, 10 ul 1 mM dCTP und 10 ul 1 mM dGTP 100 Ci ³²P-TTP zugegeben und die Gesamtmenge wurde mit destilliertem Wasser auf 200 ul aufgefüllt, so daß eine Markierungslösung hergestellt wurde.
Zu der Markierungslösung wurden 5 Einheiten Klenow-Fragment (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) zugegeben und die Reaktion wurde 1 Stunde lang mit Eiskühlung ausgeführt.
Nach vollständiger Reaktion wurde die feste Phase aus der Reaktionsmischung entfernt, die zweimal mit TE-Puffer gewaschen wurde und deren Strahlung wurde mit einem Szintillationszähler gezählt.
Als Ergebnis wurde in der festen Phase, die schließlich im Arbeitsgang unter Verwendung von Probe B und im Arbeitsgang unter Verwendung der Probe C gewonnen wurde eine Strahlung von ungefähr 10&sup8; cpm (ungefähr 10&sup4;-fache Menge der Probe A) gezählt, wodurch die Anwesenheit von pUC 19 in den Proben B und C bestätigt wurde.

Beispiel 2

Ein Oligonukleotid mit 41 Basen und der folgenden DNA- Basensequenz, die einen Teil des Plasmids pUC 19 (Sonde A) darstellt und ein Oligonukleotid mit 41 Basen und der folgenden DNA-Basensequenz, die einen Teil des Plasmids pBR 322 (Sonde B) darstellt, wurden mit einem DNA-Synthesegerät (hergestellt von ABI, Modell 381 A) synthetisiert. Sonde A Sonde B
Bei Überprüfung der Reinheit der synthetisierten Produkte mit dem gleichen Arbeitsgang wie in Beispiel 1 wurde gefunden, daß beide eine Reinheit von 95% oder mehr besaßen. Die synthetisierten Produkte wurden direkt ohne Reinigung für die anschließenden Arbeitsschritte verwendet.
Lösungen zur Fleckenbildung (spotting) jeder der synthetisierten Produkte mit einer Konzentration von 200 ng/ul wurden hergestellt und jeweils 2 ul der Lösungen wurden auf einen Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schüll) getropft, so daß die Flecken der Sonden A und B, wie in Fig. 1 gezeigt, angeordnet wurden, getrocknet und dann 2 Stunden lang bei 80ºC gebacken.
Andererseits wurden die folgenden Proben als Proben- Nukleinsäuren hergestellt.

Probe D:

Mischung von Plasmid pUC 19 und chromosomaler DNA, auf herkömmliche Weise hergestellt aus E. coli Stamm JM 109 (Mischgewichtsverhältnis 1 : 1).

Probe E:

Mischung von Plasmid pBR 322 und chromosomaler DNA, auf herkömmliche Weise hergestellt aus E. coli Stamm HB 101 (Mischgewichtsverhältnis 1 : 1).

Probe F:

Chromosomale DNA, auf herkömmliche Weise hergestellt aus E. coli Stamm HB 101.
Unter einzelner Verwendung der Proben D bis F wurden die folgenden Arbeitsschritte durchgeführt.
Zu 2 ul einer Lösung mit 1 ug der Probe wurden 2,0 ul 10 x TA-Puffer und 16,0 ul Wasser zugemischt, 10 Einheiten HindIII (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) wurden zu der gewonnenen Mischung zugegeben und diese ließ man 2 Stunden lang bei 37ºC zur Ausführung der Reaktion stehen.
Nach vollständiger Reaktion wurde die Reaktionsmischung 5 Minuten lang auf 95ºC erhitzt, um die doppelsträngige DNA in Einzelstränge umzuwandeln und dann wurde sie mit 9 ml 100% Formamid, 5 ml 20 x SSC, 0,4 ml 50 x Denhardt-Lösung, 0,4 ml 1 M Natriumphosphat (pH 6,5) und 0,1 ml modifizierter Heringssperma-DNA (hergestellt von Sigma) mit einer Konzentration von 50,0 mg/ml unter Herstellung einer Hybridisierungslösung vermischt.
Dann wurde die Hybridisierung ausgeführt, indem man Filter mit der vorher hergestellten Sonden-Nukleinsäure in jede Hybridisierungslösung tauchte.
Genauer wurde der Filter 30 Minuten lang bei 42ºC in 200 ml einer Lösung mit einer Endkonzentration von 3 x SSC und 1 x Denhardt getaucht, um die Vorhybridisierung durchzuführen, gefolgt von Versiegelung des Filters in einem Polyethylenbeutel, so daß der Filter in die Hybridisierungslösung getaucht werden kann und 12-stündiger Reaktion bei 42ºC.
Nach vollständiger Reaktion werde der aus dem Polyethylenbeutel entnommene Filter gewaschen, indem man ihn 25 Minuten lang bei Raumtemperatur in 500 ml 2 x SSC/0,1% SDS eintauchte und danach wurde er ähnlich 35 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 500 ml 0,2 x SSC/0,1% SDS gewaschen.
Dann wurde jeder Filter nach Waschen in eine Markierungslösung mit der nachstehend gezeigten Zusammensetzung eingetaucht, in einem Polyethylenbeutel versiegelt und 2 Stunden lang bei 37ºC zur Ausführung der Reaktion stehengelassen. Zusammensetzung der Markierungslösung: biotinyliertes UTP Verschmelzungslösung Klenow-Fragment dest. Wasser Rest gesamt
Nach vollständiger Reaktion wurde jeder entnommene Filter mit TE-Puffer gewaschen und dann wurde die Farbreaktion auf herkömmliche Weise ausgeführt (s. Bioindustry, Vol. 3, Nr. 6, 1989, S. 479-504, etc.).
Als Ergebnis entstand Farbentwicklung an der mit Sonde A benetzten Stelle des Filters, der mit der Hybridisierungslösung der Probe A umgesetzt worden war, und es entstand auch Farbentwicklung an der mit der Sonde B benetzten Stelle des Filters, der mit der Hybridisierungslösung der Probe B umgesetzt worden war. Im Gegensatz dazu wurde keine Farbentwicklung auf dem Filter erkannt, der mit der Hybridisierungslösung der Probe C umgesetzt worden war.

Beispiel 3

Von Mutationen des PAH-Gens in der Leukocyten-DNA eines Phenylalaninurie-Patienten waren folgende Mutationen mit hoher Häufigkeit (Stelle mit Stern) bekannt. Haplotyp 3 Normal: abnormal: (Sonde) Haplotyp 2 Normal: abnormal: (Sonde)
Dementsprechend wurden diese vier Oligonukleotidarten zur Verwendung als Sonden-Nukleinsäure mit einem DNA-Synthesegerät (ABI, Modell 381 A) synthetisiert.
Bei Überprüfung der Reinheit der synthetisierten Produkte mit dem gleichen Arbeitsgang wie in Beispiel 1 wurde gefunden, daß alle eine Reinheit von 95% oder mehr besaßen.
Unter direkter Verwendung der synthetisierten Produkte mit den gleichen Arbeitsschritten wie in Beispiel 2 wurden Flecken der entsprechenden Sonden mit der in Fig. 2 gezeigten Anordnung auf einem Nitrocellulosefilter gebildet.
Dann wurde aus den gezüchteten aminiotischen Fluidzellen von willkürlich ausgewählten Donoren von Untersuchungsproben eine doppelsträngige DNA auf herkömmliche Weise extrahiert und mit PvuII verdaut und dann durch 10 Minuten langes Erhitzen bei 100ºC in Einzelstränge umgewandelt.
Die Filter, die Flecken jeder Sonde gebildet hatten, wurden in ein Gefäß gegeben, 0,5 ml 10 x Verschmelzungslösung wurde zugegeben und ferner wurde unter Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 5 ml aufgefüllt, so daß die Filter in die Lösung eintauchten.
Dazu wurde die Mischung von Einzelstrang-DNA-Fragmenten als die vorher gewonnene Untersuchungsprobe zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 65ºC stehengelassen.
Nach einer vorbestimmten Zeit wurde die Reaktionsmischung ungefähr 1 Stunde lang schrittweise abgekühlt.
Bei Bildung eines Hybrids durch diese Reaktion sollte man berücksichtigen, daß ein partieller Doppelstrang der Sonde mit der DNA der Untersuchungsprobe gebildet wird, wie in Fig. 3 gezeigt wird.
Dann wurden zu der Reaktionsmischung, die auf Raumtemperatur abgekühlt war, 0,2 ml 1 mM dATP, 0,2 ml 1 mM dGTP, 0,2 ml 1 mM dCTP, 0,5 ml 0,4 mM biotinyliertes UTP, 0,5 ml 10 x Verschmelzungslösung und 3,4 ml destilliertes Wasser zugegeben und dann weiter 16 Einheiten Klenow-Fragment, wonach die Reaktion 1 Stunde lang bei 37ºC ausgeführt wurde.
Wenn ein Hybrid mit einem doppelsträngigen Teil, wie in Fig. 3 gezeigt, gebildet wird, wird gemäß der Reaktion DNA vom 3'-Ende einer der als Primer des doppelsträngigen Teils wirkenden Ketten aus synthetisiert, wobei das Kettenende in Richtung stromabwärts des 3'-Endes (in Pfeilrichtung) fortschreitet. Zu diesem Zeitpunkt wird die Markierung auf einer Seite der neu gebildeten Nukleotidkette eingebaut.
Dann wird der Filter zur Entfernung von unumgesetztem biotinylierten UTP mit 2 x SSC gewaschen.
Bei Durchführung der Farbentwicklungsreaktion auf herkömmliche Weise nach Waschen des Filters, trat Farbentwicklung am Fleck der Sonde 2 auf, wodurch der Donor der untersuchungsprobe mit Verdacht auf Phenylananinurie beurteilt wurde.

Beispiel 4

Unter einzelner Verwendung der gezüchteten amniotischen Fluidzellen von verschiedenen, willkürlich ausgewählten Donoren wurde die doppelsträngige DNA auf herkömmliche Weise extrahiert, mit PvuII verdaut und dann durch 10 Minuten langes Erhitzen auf 100ºC in Einzelstränge umgewandelt, wodurch Mischungen einzelsträngiger DNAs aus den entsprechenden Donor- Untersuchungsproben gewonnen wurden.
Dann wurde ein Nitrocellulosefilter, ähnlich wie in Beispiel 2 mit jeder DNA-Mischung (jeweils 2 ug) benetzt, so daß unterscheidbar war, welcher Fleck von welchem Donor der Untersuchungsprobe stammte.
Weiter wurde ein Filter in ein Gefäß gegeben, der die Flecken jeder darauf gebildeten DNA-Mischung der Untersuchungsproben besaß, 0,5 ml 10 x Verschmelzungslösung wurden zugegeben und unter Zugabe von destilliertem Wasser wurde zu einem Gesamtvolumen von 5 ml aufgefüllt, so daß der Filter in die Lösung eintauchte.
Dazu wurde 1 ug Sonde 1, gewonnen in Beispiel 3, zugegeben und man ließ die Mischung 10 Minuten lang bei 65ºC stehen.
Nach einer vorbestimmten Zeit ließ man die Reaktionsmischung schrittweise ungefähr 1 Stunde lang auf Raumtemperatur abkühlen und die Markierungsbehandlung, Waschen und die Färbungsbehandlung wurden ähnlich wie in Beispiel 3 durchgeführt.
Weiter wurden die vorstehend beschriebenen Arbeitsschritte für jede der Sonden 2 bis 4 durchgeführt.
Als Ergebnis färbte sich bei Verwendung von Sonde 2 der fünfte Fleck auf dem Filter und der Donor der Untersuchungsprobe auf diesem Fleck wurde mit Verdacht auf Phenylalaninurie beurteilt.

Beispiel 5

Die in Beispiel 3 synthetisierten Sonden 1 bis 4 (jeweils ungefähr 1 ug) wurden tropfenweise auf eine Mikroplatte gegeben, so daß unterscheidbar war, welche Sonde in welcher Vertiefung enthalten war.
Dann wurde die doppelsträngige DNA aus den gezüchteten, amniotischen Zellen der willkürlich ausgewählten Donoren der Untersuchungsproben auf herkömmliche Weise extrahiert, mit PvuII (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) verdaut und durch 10 Minuten langes Erhitzen bei 100ºC in ihre Einzelstränge dissoziiert, wodurch Mischungen mit den einzelsträngigen DNAs der Untersuchungsproben gewonnen wurden.
Jeweils 50 ng der DNA-Mischungen wurden in die entsprechenden Vertiefungen gegeben.
Nach Zugabe von 7 ul 10 x Verschmelzungslösung in jede Vertiefung wurde-ferner destilliertes Wasser zugegeben, um jede Vertiefung auf 70 ul aufzufüllen.
Die Mikroplatte wurde so 10 Minuten bei 65ºC stehengelassen und dann über 1 Stunde lang schrittweise auf Raumtemperatur abgekühlt.
Dann wurden in jede Vertiefung 5 ul 1 mM dATP, 5 ul 1 mM dGTP, 5 ul 1 mM dCTP, 8 ul 0,4 mM biotinyliertes UTP, 7 ul 10 x Verschmelzungslösung und 40 ul destilliertes Wasser und danach ferner 10 Einheiten Klenow-Fragment zugegeben und vermischt, um die Reaktion 1 Stunde lang bei 37ºC auszuführen, wobei die Markierung durchgeführt wurde.
Nach vollständiger Reaktion wurden 350 ul Ethanol in jede Vertiefung zugegeben und nach einstündiger Kühlung bei -70ºC wurde der Überstand jeder Vertiefung durch Absaugen verworfen, um unumgesetztes, biotinyliertes UTP zusammen mit dem Überstand zu entfernen.
Nach Trocknung der Mikroplatte wurde dann auf herkömmliche Weise mit Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma) blockiert und dann wurde eine Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Lösung (hergestellt von BRL) in jede Vertiefung gegeben, um die Reaktion bei 37ºC auszuführen.
Nach 30 Minuten wurde die Flüssigkeit durch Absaugen aus jeder Vertiefung verworfen und nach Waschen der Vertiefung mit einer Lösung aus 0,1 M Tris-HCl (pH 9,5), 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl&sub2; (Puffer A) wurden ferner 200 pl einer vermischten Lösung aus 30 ul BCIP-Lösung (BRL), 44 ul NBT-Lösung (hergestellt von BRL) und 10 ml Puffer A in jede Vertiefung gegeben, um die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auszuführen, gefolgt von der Beurteilung der Farbentwicklung mit einem Plattenlesegerät.
Als Ergebnis wurde starke Farbentwicklung in der Vertiefung mit Sonde 2 erkannt und der Donor dieser Untersuchungsprobe wurde mit Verdacht auf Phenylalaninurie beurteilt.

Beispiel 6

Es wurde ein Oligonukleotid mit 41 Basen und der nachstehend gezeigten Basensequenz, die einen Teil des Plasmids pUC 19 darstellt mit einem DNA-Synthesegerät (hergestellt von ABI, Modell 381 A) synthetisiert.
Bei Überprüfung der Reinheit unter Verwendung eines Teiles des synthetisierten Produktes mit einer Gelelektrophorese mit ls%-igen Polyacrylamid und 7 M Harnstoff wurde gefunden, daß es eine Reinheit von 90% oder mehr hatte und daher wurde es ohne Reinigung als Sonden-Nukleinsäure für die anschließenden Arbeitsschritte verwendet.
Andererseits wurden als Proben-Nukleinsäuren das Plasmid pBR 322 (Probe A), das Plasmid pUC 19 (Probe B) und eine Mischung des Plasmids pBR 322 und des Plasmids pUC 19 (Probe C, Mischgewichtsverhältnis 1 : 1) hergestellt und nach Verdauung dieser Proben mit EcoRI (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) auf herkömmliche Weise wurden die verdauten Produkte erhitzt, um die doppelsträngige DNA in Einzelstränge umzuwandeln und die folgenden Arbeitsschritte wurden durchgeführt, indem man die Reaktionsprodukte mit den 3 Arten der einzelsträngigen DNA, die aus den entsprechenden Proben gewonnen wurde einzeln verwendete.
In ein Reaktionsröhrchen wurden 20 ug des Reaktionsproduktes mit der Einzelstrang-DNA und 20 ul der vorher hergestellten Sonden-Nukleinsäure eingefüllt und zu der Mischung wurden 10 ul einer 10 x Verschmelzungslösung zugegeben [1 x Verschmelzungslösung: 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 60 inM MgCl&sub2;, 60 mM β-Mercaptoethanol und 500 mM NaCl] und ferner wurde durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul aufgefüllt.
Die vermischte Lösung wurde 10 Minuten lang auf 65ºC erhitzt und dann wurde die Temperatur ungefähr 1 Stunde lang schrittweise auf Raumtemperatur verringert.
Dann wurden zu der gewonnenen Reaktionsmischung 10 ul 10 x Verschmelzungslösung, 10 ul 1 mM dATP, 10 ul 1 mM dCTP, 10 ul 1 mM dGTP und dann 100 Ci ³²P-TTP zugegeben und das Gesamtvolumen wurde mit destilliertem Wasser auf 200 ul aufgefüllt, wodurch eine Markierungslösung hergestellt wurde.
Zu der Markierungslösung wurden 5 Einheiten Klenow-Fragment (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) zugegeben und die Reaktion wurde mit Eiskühlung 1 Stunde lang ausgeführt.
Nach vollständiger Reaktion wurde unter Verwendung von GENECLEAN (hergestellt von BIO 101) das unumgesetzte ³²P-TTP und das in der Reaktionsmischung gebildete Hybrid wie vorstehend beschrieben getrennt.
Die Silika-Matrix von GENECLEAN (5 ul) wurde zu 200 ul der Reaktionsmischung zugegeben und dann wurde die Mischung gut geschüttelt und 10 Minuten lang auf Eis gehalten, gefolgt von 5 Sekunden langer Zentrifugation, um den Überstand zu entfernen und es ergaben sich Pellets aus einem Produkt der Silika-Matrix und des gebundenen Hybrids.
Zu diesem Zeitpunkt wurde unumgesetztes ³²P-TTP zusammen mit dem Überstand von dem an die Silika-Matrix gebundenen Hybrid abgetrennt.
Die in der abgetrennten GENECLEAN-Flüssigkeit gewonnenen Pellets wurden dreimal gewaschen, 3 ul reines Wasser wurden dazu gegeben, die Inkubation wurde 2 Minuten lang bei 50ºC ausgeführt und das Hybrid wurde aus den Pellets eluiert, um den Überstand mit dem Hybrid durch Zentrifugation wiederzugewinnen.
Die Strahlung des wiedergewonnenen Überstandes wurde mit einem Szintillationszähler gezählt.
Als Ergebnis wurde eine Strahlung von ungefähr 10&sup7; cpm (ungefähr die 10³-fache Menge der Probe A) in den Lösungen gezählt, die schließlich mit den Arbeitschritten unter Verwendung von Probe B und den Arbeitschritten unter Verwendung von Probe C gewonnen wurden, wobei die Anwesenheit von pUC 19 in den Proben B und C bestätigt wurde.

Beispiel 7

Es wurde ein nachstehend gezeigtes Oligonukleotid synthetisiert, das eine Teil von pUC 19 darstellt und als solches als Sonde verwendet.
Jeweils 1 ug der Sonde (nachstehend als Sonde A bezeichnet) wurde in 10 Vertiefungen einer Mikroplatte als Gesamtmenge der Gruppe I: Nr. 1 - Nr. 10 und in 10 Vertiefungen einer Mikroplatte als Gesamtmenge der Gruppe II: Nr. 1 - Nr. 10 eingefüllt.
Dann wurde die in Einzelstränge dissoziierte pUC 19-Probe in die entsprechenden Mikroplattenvertiefungen der Gruppe I: Nr. 1 - Nr. 10 mit den nachstehend in Tabelle 1 gezeigten Verhältnissen gegeben und als Kontrolle wurde auch pBR 322, dissoziiert in Einzelstränge in die entsprechenden Mikroplattenvertiefungen der Gruppe II: Nr. 1 - Nr. 10 mit den nachstehend in Tabelle 1 gezeigten Verhältnissen gegeben (s. Fig. 4A). Tabelle 1 DNA-Menge (ng)
Ferner wurden in jede Vertiefung 7 ul 10 x Verschmelzungslösung gegeben, gefolgt von Zugabe von destilliertem Wasser, um jede Vertiefung auf ein Volumen von 70 ul aufzufüllen.
Die Mikroplatte wurde so 10 Minuten lang bei 65ºC stehengelassen und ungefähr 1 Stunde lang schrittweise auf Raumtemperatur abgekühlt.
Dann wurden in jede Vertiefung 5 ul 1 mM dATP, 5 ul 1 mM dGTP, 5 ul 1 mM dCTP, 8 ul 0,5 mM biotinyliertes UTP, 7 ul 10 x Verschmelzungslösung und 40 ul destilliertes Wasser und danach ferner 10 Einheiten Klenow-Fragment zugegeben und vermischt, um die Reaktion 1 Stunde lang bei 37ºC auszuführen, wobei die Markierung durchgeführt wurde.
Nach vollständiger Reaktion wurden 350 ul Ethanol in jede Vertiefung zugegeben und nach einstündiger Kühlung bei -70ºC wurde der Überstand jeder Vertiefung durch Absaugen verworfen, um unumgesetztes, biotinyliertes UTP zusammen mit dem Überstand zu entfernen.
Nach Trocknung der Mikroplatte wurde dann auf herkömmliche Weise mit Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma) blockiert und dann wurde eine Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Lösung (hergestellt von BRL) in jede Vertiefung gegeben, um die Reaktion bei 37ºC auszuführen.
Nach 30 Minuten wurde die Flüssigkeit durch Absaugen aus jeder Vertiefung verworfen und nach Waschen der Vertiefung mit einer Lösung aus 0,1 M Tris-HCl (pH 9,5), 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl&sub2; (Puffer A) wurden ferner 200 ul einer vermischten Lösung aus 30 ul BCIP-Lösung (hergestellt von BRL), 44 ul NBT-Lösung (hergestellt von BRL) und 10 ml Puffer A in jede Vertiefung gegeben, um die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auszuführen, gefolgt von der Beurteilung der Farbentwicklung mit einem Plattenlesegerät.
Als Ergebnis trat in Gruppe I bis zu 0,1 ng der Nr. 7 Farbentwicklung auf. Keine Farbentwicklung war bei der Kontrolle der Gruppe II zu sehen.

Vergleichsbeispiel 1

Es wurde die nachstehend gezeigte doppelsträngige DNA synthetisiert, die einen Teil von pUC 19 darstellt, mit T4 Polymerase wurde biotinyliertes UTP am 3'-Ende eingebaut, gefolgt von Markierung und das markierte Produkt wurde in Einzelstränge dissoziiert, die als Sonde zum Nachweis mit dem Vefahren nach dem Stand der Technik verwendet wurden.
Jeweils 1 ug der Sonde (nachstehend als Sonde B bezeichnet) wurde in 10 Mikroplattenvertiefungen als Gesamtmenge der Gruppe III: Nr. 1 - Nr. 10 und in 10 Mikroplattenvertiefungen als Gesamtmenge der Gruppe IV: Nr. 1 - Nr. 10 gegeben.
Dann wurde die in Einzelstränge dissoziierte pUC 19-Probe in die entsprechenden Mikroplattenvertiefungen der Gruppe III: Nr. 1 - Nr. 10 mit den gleichen Verhältnissen wie in Tabelle 1 aus Beispiel 7 gegeben und als Kontrolle wurde auch pBR 322, dissoziiert in Einzelstränge in die entsprechenden Mikroplattenvertiefungen der Gruppe IV: Nr. 1 - Nr. 10 mit den gleichen Verhältnissen wie in Tabelle 1 aus Beispiel 7 gegeben (s. Fig. 4B).
Ferner wurden in jede Vertiefung 7 ul 10 x Verschmelzungslösung gegeben, gefolgt von Zugabe von destilliertem Wasser, um jede Vertiefung auf ein Volumen von 70 ul aufzufüllen.
Die Mikroplatte wurde so 10 Minuten lang bei 65ºC stehengelassen und ungefähr 1 Stunde lang schrittweise auf Raumtemperatur abgekühlt.
Nach vollständiger Reaktion wurden 350 ul Ethanol in jede Vertiefung zugegeben und nach einstündiger Kühlung bei -70ºC wurde der Überstand jeder Vertiefung durch Absaugen verworfen, um die unumgesetzte Sonde zusammen mit dem Überstand zu entfernen.
Nach Trocknung der Mikroplatte wurde dann auf herkömmliche Weise mit Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma) blockiert und dann wurde eine Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Lösung (hergestellt von BRL) in jede Vertiefung gegeben, um die Reaktion bei 37ºC auszuführen.
Nach 30 Minuten wurde die Flüssigkeit durch Absaugen aus jeder Vertiefung verworfen und nach Waschen der Vertiefung mit einer Lösung aus 0,1 M Tris-HCl (pH 9,5), 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl&sub2; (Puffer A) wurden ferner 200 ul einer vermischten Lösung aus 30 ul BCIP-Lösung (hergestellt von BRL), 44 ul NBT-Lösung (hergestellt von BRL) und 10 ml Puffer A in jede Vertiefung gegeben, um die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auszuführen, gefolgt von der Beurteilung der Farbentwicklung mit einem Plattenlesegerät.
Als Ergebnis trat bei Gruppe III Farbentwicklung bis zu 5 ng auf. Bei der Kontrolle der Gruppe IV war keine Farnentwicklung zu sehen.
Durch Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 1 konnte bestätigt werden, daß die Nachweisempfindlichkeit gemäß des Verfahrens der Erfindung ungefähr 50-fach verbessert wurde, verglichen mit dem Beispiel nach dem Stand der Technik. Es kann angenommen werden, daß dies daran liegt, daß das biotinylierte UTP in der Erweiterungsreaktion nach Verschmelzen in einer mehr als ungefähr 50-fachen Menge eingebaut wird.
Gemäß der Erfindung ist keine Markierung der Sonden- Nukleinsäure erforderlich, da keine markierte Sonden- Nukleinsäure verwendet wird. Als Ergebnis kann eine mit kleiner Nukleotidkettenlänge verwendet werden, die leicht erhältlich ist und von der auch erwartet werden kann, den Nachweis mit hoher Empfindlichkeit auszuführen, so daß der Nachweis mit guter Empfindlichkeit geführt werden kann.
Da das gebildete Hybrid mit einer Markierung versehen wird, wird nach der Erfindung auch die Durchführung einer wirksamen Markierung ermöglicht, selbst wenn eine nicht-radioaktive Markierung verwendet wird, wodurch die Arbeitsschritte der Markierung und des Nachweises sicherer und einfacher werden.
Daneben werden gemäß des Verfahrens der Erfindung nur die gebildeten Hybride markiert, so daß Markierungssubstanz gespart werden kann, während nach dem Verfahren nach dem Stand der Technik alle Sonden-Nukleinsäuren mit einer Markierung versehen, selbst diejenigen, die nicht an der Bildung von Hybriden beteiligt sind.
Bei gleichzeitigem Nachweis von vielen Nukleinsäuren unter Verwendung von vielen Sonden-Nukleinsäurearten waren ferner nach dem Verfahren nach dem Stand der Technik zur Markierung der Sonden-Nukleinsäuren mühsame Arbeitsschritte zur Unterscheidung der vielen Sonden-Nukleinsäuren unter Verwendung vieler verschiedener Markierungsarten erforderlich, aber gemäß der Erfindung kann die Markierung des gebildeten Hybrids mit einer Markierungsart durchgeführt werden, wodurch die Markierungsschritte vereinfacht werden können und der Nachweis vieler Nukleinsäurearten äußerst einfach und wirksam erfolgen kann.
Ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren einschließlich des Verfahrens der Reaktion einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden-Nukleinsäure und der Analyse der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Hybrids aus einer nachzuweisenden Nukleinsäure und einer Sonden-Nukleinsäure in der gewonnenen Reaktionsmischung umfasst folgende Verfahrensschritte: a) die Reaktion einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden- Nukleinsäure; b) die Anbringung einer Markierung nur an den Hybriden, die in der im Verfahren a) gewonnenen Reaktionsmischung gebildet wurden; und c) der Nachweis des im Verfahren b) markierten Hybrids unter Verwendung der Markierung. Eine immobilisierte Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuren, die nach Anspruch 2 für das Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden soll, umfasst eine auf einem Träger immobilisierte Sonden-Nukleinsäure, wobei die Sonden-Nukleinsäure mit einer nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren kann.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren einschließlich des Verfahrens der Reaktion einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden-Nukleinsäure und der Analyse der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Hybrids aus einer nachzuweisenden Nukleinsäure und einer Sonden-Nukleinsäure in der gewonnenen Reaktionsmischung, umfassend folgende Verfahrensschritte:

a) die Reaktion einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden-Nukleinsäure;

b) die Anbringung einer Markierung durch Primererweiterung nur an den Hybriden, die in der im Verfahren a) gewonnenen Reaktionsmischung gebildet wurden; und

c) der Nachweis des im Verfahren b) markierten Hybrids unter Verwendung der Markierung.

2. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden-Nukleinsäure oder die Proben-Nukleinsäure auf einem Träger immobilisiert wird.

3. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidkettenlänge der Sonden-Nukleinsäure 1/10 oder kleiner als die Nukleotidkettenlänge der nachzuweisenden Nukleinsäure ist.

4. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß viele Sonden-Nukleinsäurearten mit vorbestimmter Anordnung auf einem Träger immobilisiert werden.

5. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß viele Proben-Nukleinsäurearten mit vorbestimmter Anordnung auf einem Träger immobilisiert werden und nach Verfahrensschritt a) mit einer Sonden- Nukleinsäureart umgesetzt werden.

6. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die entsprechenden Sonden-Nukleinsäuren eine Nukleotidkettenlänge besitzen, die benötigt wird, damit die Hybridbildungsreaktionen mit den entsprechenden Sonden-Nukleinsäuren bei den gleichen Bedingungen ablaufen.

7. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 4 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidkettenlänge der Sonden-Nukleinsäure 1/10 oder kleiner als die Nukleotidkettenlänge der nachzuweisenden Nukleinsäure ist.

8. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure Sequenzen besitzt, die mit einer Erbkrankheit verbunden sind.

9. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidkettenlänge der Sonden-Nukleinsäure 100 Basen oder weniger ist.

10. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden-Nukleinsäure ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidkettenlänge von 25 Basen oder weniger ist, das die Punktmutation einer Erbkrankheit nachweisen kann.

11. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß vier voneinander verschiedene Nukleotidarten im Verfahrensschritt b) verwendet werden, wobei mindestens eine Art markiert wurde.

12. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß die vier Nukleotidarten aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP bestehen.

13. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Nukleotide mit mindestens einer Markierungssubstanz, ausgewählt aus Radioisotopen, Biotin und einer Dinitrophenylgruppe markiert wurde.

14. Nukleinsäure-Nachweisset für die Reaktion einer Proben-Nukleinsäure mit einer Sonden-Nukleinsäure und für die Analyse der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Hybrids aus einer nachzuweisenden Nukleinsäure und einer Sonden-Nukleinsäure in der gewonnenen Reaktionsmischung, umfassend:

e) eine als Primer wirkende Sonden-Nukleinsäure, wenn das Hybrid aus einer Sonden-Nukleinsäure und einer nachzuweisenden Nukleinsäure gebildet wird;

f) eine Vielzahl von Nukleosidtriphosphaten, wobei mindestens eines der Nukleosidtriphosphate unter Einbau einer nachweisbaren Markierung modifiziert wurde; und

g) eine primerabhängige Nukleinsäure-Polymerase.