DE69003477T2

DE69003477T2 - Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren.

Info

Publication number: DE69003477T2
Application number: DE90111912T
Authority: DE
Inventors: Harumi Iwashita; Kinya Kato; Masanori Sakuranaga; Nobuko Yamamoto
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1989-06-23
Filing date: 1990-06-22
Publication date: 1994-01-27
Anticipated expiration: 2010-06-23
Also published as: ATE94910T1; DK0407789T3; DE69003477D1; EP0407789B1; ES2059895T3; EP0407789A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren unter Nutzung der Hybrid-Bildungsreaktion zweier Arten Nucleinsäuren mit Komplementarität, und ein Verfahren zum Nachweis eines einer genetischen Krankheit inhärenten Gens unter Nutzung dieses Verfahrens.
Wenn einsträngige DNAs oder RNAs zueinander Komplementarität aufweisen, werden die Bereiche, die Komplementarität aufweisen unter Entstehung eines Doppelstrangs und Bildung eines hybriden Moleküls gebunden. Als die Verfahren zum Nachweis oder der Quantifizierung von Nucleinsäuren unter Nutzung der Hybridisierungsreaktion können verschiedene Verfahren eingeschlossen sein, wie die Southern-Verfahren und ähnliche, die zu einer Basistechnik in verschiedenen Gentechnik-Verfahren, wie dem Klonen von Genen, der Genrekombinierung, dem Screening der gewünschten Gene oder der Krankheitsdiagnose unter Verwendung von zu untersuchenden Genproben, wurden.
Als das analytische Verfahren unter Nutzung der Hybridisierung von Nucleinsäure wurde im allgemeinen das Verfahren angewandt, bei dem eine DNA oder RNA umfassende Sonde mit einer Markierung zum Nachweis eines hybriden Moleküls versehen wird, wobei die markierte Sonde mit einer Nucleinsäureprobe hybridisiert wird und das gebildete hybride Molekül unter Nutzung der Markierung, mit der die Sonde versehen wurde, nachgewiesen wird.
Als Verfahren zur Sondenmarkierung wurde das Verfahren angewandt, bei dem ein Radioisotop in die Sonde eingeführt wird, oder das Verfahren bei dem eine Verbindung in die Sonde eingeführt oder an ihr gebunden wird, wie sie für eine Lichtausstrahlungsreaktion, eine Farberzeugungsreaktion, eine Fluoreszenzreaktion und ähnliches benötigt wird.
Als Sonde wurden in Abhängigkeit vom Zweck und ähnlichem, zum Beispiel direkt aus Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und ähnlichem abgetrennte Nucleinsäurefragmente, nach vorgegebenen Standards geklonte Nucleinsäurefragmente, mittels einer Synthesier-Vorrichtung synthetisierte Oligonucleotide und ähnliches verwendet.
Mit der Entwicklung der Gentechnik vergrößerten sich auch die Nutzungshäufigkeit und der Anwendungsbereichs des analytischen Verfahrens unter Nutzung der Hybridisierung, und es wurde zunehmend gefordert, ein Verfahren, das geeignet ist, Analysen mit guter Empfindlichkeit mittels einfacherer Arbeitsweisen durchzuführen, zur Verfügung zu haben.
Zum Beispiel tritt im Falle der Markierung unter Verwendung eines Radioisotops der Vorteil einer guten Nachweisempfindlichkeit des hybriden Moleküls auf, während wegen der Handhabung mit einer radioaktiven Substanz teure Reagentien, Spezialinstrumente, Vorrichtungen und ähnliches dafür erforderlich und auch die Arbeitsweisen mit Gefahr verbunden sind.
Im Gegensatz dazu weist eine nichtradioaktive Markierung, wie sie durch eine Markierung mit einem Enzym unter Nutzung der Fluoreszenzreaktion eines fluorezierenden Farbstoff-Komplexes aus Biotin-Avidin-Anti-Avidin-Antikörper repräsentiert wird, den Nachteil auf, wenn sie zur Markierung einer Sonde verwendet wird, daß die Nachweisempfindlichkeit dazu neigt, geringer zu sein, obgleich sie den Vorteil aufweist, die Markierung und den Nachweis mittels sicherer und einfacher Arbeitsweisen durchzuführen.
In verschiedenen Analysen kann auch häufig ein Nucleinsäurefragment mit einer Nucleotidkettenlänge von 100 Basen oder mehr als die zu markierende Sonde verwendet werden. Obwohl solche längeren Nucleinsäurefragmente den Vorteil aufweisen, daß sie relativ leicht markiert werden können, erfolgt eine Synthese mittels einer Synthesier-Vorrichtung unter Schwierigkeiten, und deshalb tritt der Nachteil auf, daß umständliche Arbeiten, wie Trennoperationen aus dem lebenden Körper, Klonierung und ähnliches für seine Herstellung erforderlich sind.
Andererseits weist ein Nucleinsäurefragment mit einer Länge von weniger als 100 Basen den Vorteil auf, daß es leicht mittels einer Synthesier-Vorrichtung synthetisiert werden kann. Es weist jedoch den Nachteil auf, daß Markierung, insbesondere Markierung mittels einer Nick-Translation oder eines Enzyms nicht einfach ausgeführt werden kann.
Wenn es ferner gewünscht wird mehrere Arten von Nucleinsäuren unter Verwendung mehrerer Arten von Sonden gleichzeitig zu analysieren, ist es notwendig, um zu unterscheiden, welche Sonde in dem gebildeten hybriden Molekül enthalten ist, voneinander unterschiedliche Markierungen an die den jeweiligen Nucleinsäuren entsprechenden Sonden anzubringen. Solche Arbeitsweisen sind jedoch äußerst umständlich.
Andererseits wird momentan die Anwendung eines Analyseverfahrens unter Verwendung einer Hybridisierung als dem Nachweisverfahren für ein mit einer Krankheit in Zusammenhang stehendes Gen erforscht.
Es sind verschiedene genetische Krankheiten als auf genetischer Ebene durch Mutation und ähnliches ausgelöste Krankheiten bekannt, zum Beispiel anomale Hämoglobinerbkrankheiten wie Phenylketonurie, Thalassämie und ähnliches, OTC(Ornitintranscarbamylase)-Mangel, Muskelatrophie vom Duchenne-Aranschen Typ und ähnliches.
Es liegt auch ein Bericht vor, daß die Mutation eines Proteins mittels Genmutation zur Entstehung einer bestimmten Krebsart beiträgt.
Oder es wächst die Wahrscheinlichkeit, daß ernste Krankheiten, wie AIDS, ATL und ähnliches durch Retroviren verursacht werden.
Die Diagnose einer genetischen Krankheit wurde im allgemeinen durch Messung der für die genetische Krankheit charakteristischen Menge an Protein und der Enzymaktivität und durch Beurteilung dieser Resultate danach, wo ein Mangel oder eine Anomalität auftritt, durchgeführt, wobei aber in einigen Fällen das Enzym, das zum Indikator der Krankheit wurde, an lokalen Organstellen und ähnlichem auftrat, an denen eine Probenentnahme nur unter Schwierigkeiten möglich war, und wobei auch das zu messende Indexenzym manchmal nicht identifiziert werden konnte, weshalb diese Diagnoseverfahren nicht notwendigerweise zufriedenstellend sind.
Andererseits erfolgte die Diagnose infektiöser Viruserkrankungen ausschließlich mittels des ELISA-Verfahrens und des PA-Verfahrens, aber diese Verfahren sind nicht notwendigerweise richtig.
Wenn eine genetische Krankheit, Krebs, eine infektiöse Viruserkrankung in einem frühen Stadium mittels Diagnose auf genetischer Ebene gefunden werden kann, für das die Probenentnahme einer zu untersuchenden Probe vergleichsweise einfacher ist und eine richtige Untersuchung erwartet werden kann, dann kann in einem frühen Stadium eine Therapie erfolgen. Deshalb wurde verstärkt ein Diagnoseverfahren auf genetischer Ebene gefordert.
Als eine dieser wirksamen Verfahren gibt es zum Beispiel das RFLP (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphie).
Dieses Verfahren ist ein Verfahren bei dem das durch Spaltung des ganzen menschlichen Gens mit Restriktionsenzymen erhaltene Fragment mittels Agarose oder Elektrophorese aufgetrennt wird, wobei das elektrophoresierte Fragment mit einer Sonden-DNA, die mit Radioisotopen und ähnlichem markiert ist, hybridisiert wird und wobei das Muster des Elektropherogramms des unter Verwendung der Markierung nachgewiesenen hybriden Moleküls mit demjenigen eines Elektropherogramms, das auf ähnliche Weise für ein normales Gen erhalten wurde, verglichen wird, wodurch das Gen, das mit der Krankheit in Zusammenhang steht, nachgewiesen wird.
Das Diagnoseverfahren mittels Analyse des Gens unter Verwendung von RFLP und ähnlichem findet als ein äußerst nützliches Verfahren zur Praktizierung einer sichereren Diagnose Verwendung.
Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es jedoch erforderlich, daß das Testpersonal molekularbiologische Kenntnisse und eine qualifizierte Technik besitzt, wobei die Arbeitsweisen ebenfalls noch umständlich sind und deshalb Personen, die mit der Medizin zu tun haben, wie Physiker, Untersuchungsingineure und ähnliche, das Verfahren nicht ohne weiteres ausführen können.
Auch in diesen Verfahren benötigt jeder Schritt, die Spaltung der DNA, das Southern-Blot-Verfahren, die Hybridisierung, ungefähr einen Tag und es dauert lange Zeit bis das endgültige Ergebnis erhalten wird, wodurch die Anzahl zu untersuchender Proben, die für eine Untersuchung verwendet werden, begrenzt ist und weshalb es eine sehr schwierige Arbeit ist, die DNAs vieler Patienten in Bezug auf mehrere Punkte zu untersuchen.
Ebenso zieht die Anwendung des Nachweisverfahrens unter Verwendung der Hybridisierung von Nucleinsäuren auf das taxonomische Verfahren für Mikroorganismen, wie Bakterien und ähnliches, insbesondere zum Nachweis von Pathogenen, Aufmerksamkeit auf sich.
Taxonomische Identifizierung von Mikroorganismen wurde durch Untersuchung der ökologischen und biochemischen Eigenschaften der Mikroorganismen mittels Vergleichs mit den Standardmikroorganismen durchgeführt.
Es gibt entsprechend diesem Verfahren jedoch einige Fälle, in denen sich die Beurteilung der Eigenschaften in Abhängigkeit von dem Untersuchungsverfahren unterscheiden kann oder bei denen sich die Ergebnisse der Identifikation in Abhängigkeit von der Eigenschaft, die wichtig ist, unterscheiden können.
Für den Fall, daß die zu untersuchende Probe aus einem Patienten, bei dem sie eine Infektionskrankheit verursachen, erhaltene Bakterien sind, und es zu einem Irrtum bei der Identifizierung kommt, kann keine angemessene Behandlung erfolgen, weshalb eine sicherere Identifizierung besonders erforderlich ist.
Dementsprechend wurde in den letzten Jahren Versuche unternommen, um ein sichereres Identifikationsverfahren zur Verfügung zu stellen, das DNA-DNA-Hybridisierungsverfahren zum Nachweis und zur Identifikation von bakteriellen Infektionen verursachenden Bakterien zu verwenden.
Bei diesen Verfahren wird eine bestimmte Basensequenz in der DNA des Bakteriums zur Standardsequenz gemacht und es wird entsprechend dem Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer zur Entdeckung der Standardsequenz geeigneten Sonde untersucht, ob eine mit der Standardsequenz stark homologe Basensequenz in der aus der zu untersuchenden Bakterienprobe extrahierten DNA auftritt oder nicht, wodurch eine taxonomische Identifizierung der zu untersuchenden Bakterienprobe erfolgt.
Als Sonde können bei diesem Verfahren das aus dem Chromosom der Bakterien geklonte DNA-Fragment, das Plasmid der Bakterien, synthetische Oligonucleotide und ähnliches verwendet werden.
Insbesondere können die folgenden Verfahren eingeschlossen sein, bei denen die verwendete Sonde aus folgendem besteht:
1) einem geklonten Zufallsfragment;
2) einer Ribosom-RNA; und
3) einem synthetischen Oligonucleotid mit einer Basensequenz, wie sie für die Art oder die Gattung charakteristisch ist, ausgewählt aus der Basensequenz der Ribosom-RNA.
Als das vorstehende Verfahren 1) war zum Beispiel nach Criale, M.S., Flowers, R.S. et al.: DNA-Sonden, 143-148, 1986, etc. ein Verfahren bekannt, bei dem zufälllige Bruchstücke, erhalten durch Spaltung der aus einem Bakterium mittels eines geeigneten Restriktionsenzyms extrahierten DNA, geklont werden, und das Klon, das von ihnen eine nur spezifische Reaktivität für die gewünschte taxonomische Gruppe aufweist, wird ausgewählt und als Sonde verwendet.
Als das vorstehende - Verfahren 2) ist ein von Edelstein, P.H.; J. Clin. Microbiol., 23:481-484, 1986 beschriebenes Verfahren bekannt. Dies ist ein Verfahren, das aufgrund der Tatsache, daß die Ribosom-RNAs der Bakterien innerhalb der gleichen taxonomischen Gruppe relativ ähnlich sind, Beachtung findet, und es weist den Vorteil auf, daß die Nachweisempfindlichkeit wegen einer großen Zahl an Genkopien, die in dem Chromosom der Bakterien vorkommen, unter Verwendung von Ribosom-RNA größer wird.
Als das vorstehende Verfahren 3) wurden Beispiele genannt, bei denen die für die Gattung, die Spezies oder die Subspezies und ähnliches, die zu der Gattung Proteus gehören, spezifische Basensequenzen, ausgewählt aus der Basensequenz der Ribosom-RNA der Gattung Proteus, als Sonde verwendet werden (Haun, G. & Gobel, U.; FEMS Microbiol. Lett., 43: 187- 194, 1987).
Jedoch auch diesen Verfahren sind die Probleme gemein, wie sie vorstehend für die verschiedenen Analyseverfahren für Nucleinsäuren unter Anwendung der Hybridisierung beschrieben wurden.
EP-A-0 235 726 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis bestimmter Nucleinsäuresequenzen in einer Nucleinsäureprobe, in der die Probe selbst markiert wird. Sonden-Nucleotidlängen von mindestens 700 Basenpaaren sind beschrieben.
EP-A-0 237 833 beschreibt Lösungsphasen-Hybridisierungsnachweisverfahren zum Nachweis von Polynucloetidsequenzen, bei denen die nachzuweisende Sequenz eine reaktive Stelle enthält und die Sonde markiert ist, oder umgekehrt. Eine feste Phase, an die ein Reaktionspartner für die reaktive Stelle gebunden ist, wird dann zur Abtrennung des hybriden Moleküls von der verbleibenden Lösung verwendet und die Markierung wird entweder in der immobilisierten Fraktion oder in der Lösung gemessen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wurde angesichts der Probleme der verschiedenen Nachweisverfahren vom Stand der Technik unter Verwendung des wie vorstehend beschriebenen Hybridisierungsverfahrens vollbracht und es ist ihre Aufgabe ein Nucleinsäure-Nachweisverfahren unter Verwendung des Hybridisierungsverfahrens zur Verfügung zu stellen, das einfach und korrekt ausgeführt werden kann.
Hierbei stellt die Erfindung, um das Vorhandensein einer in einer Nucleinsäureprobe nachzuweisenden Nucleinsäure nachzuweisen, ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren zur Verfügung, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellung einer Nucleinsäure-Sonde, die ein Oligonucleotid mit einer Nucleotid-Kettenlänge aus 25 Basen oder weniger darstellt, geeignet zum Nachweis einer Punktmutation einer genetischen Krankheit, immobilisiert auf einem Träger;
(b) Markieren der Nucleinsäureprobe;
(c) Zugabe der markierten Nucleinsäureprobe zu der immobilisierten Nucleinsäure-Sonde;
(d) Nachweis der Punktmutation mittels Nachweises des Vorhandenseins der in der an die Nucleinsäure-Sonde gebundenen Nucleinsäureprobe nachzuweisenden Nucleinsäure.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Schaubild, das die Anordnung der Punkte der Nucleinsäure-Sonde auf einem Filter in Beispiel 2 zeigt; und
Fig. 2 ist ein Schaubild, das die Anordnung der Punkte der Nucleinsäure-Sonde auf einem Filter in Beispiel 3 zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis und der Quantifizierung verschiedener Nucleinsäuren, wie DNA oder RNA, die aus den Körpern lebender Menschen, Tiere, Pflanzen, Mikroorganismen, wie Bakterien und ähnlichem, Pilzen, Protozoen und ähnlichem gewonnen wurde, rekombinierter DNA, synthetisierter DNA und ähnlichem verwendet werden, wobei es für die Nucleinsäurearten, die den nachzuweisenden Gegenstand darstellen (nachzuweisende Nucleinsäure) keine Beschränkung gibt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst, falls notwendig, die Nucleotidkettenlänge der zu analysierenden Nucleinsäure reguliert und dann markiert.
Für diese Nucleinsäureproben können diejenigen verwendet werden, die aus natürlichen Produkten extrahiert wurden, und zur Markierung dieser Nucleinsäureproben können diejenigen Verfahren angewandt werden, die allgemein zur Markierung von Sonden verwendet werden, wie das Markierungsverfahren mittels Radioisotpe (RI), ein Verfahren, bei dem nicht radioaktive Markierungssubstanzen (Nicht-RI), wie Enzyme oder Verbindungen, notwendig zur Induzierung von Fluoreszenz, Lichtaussendung oder Farberzeugung, wie Biotin, Dinitrophenylnucleotid-Derivate und ähnliches, in die Nucleinsäureproben eingeführt oder an sie gebunden werden, und ähnliches.
Zur Markierung der Nucleinsäureproben kann das Markierungsverfahren des terminalen Endes, das Verfahren der Substitutions-Synthese, das Nick-Translationsverfahren und ähnliches verwendet werden.
Wenn das gleiche Ausmaß an Markierungsmenge verwendet wird, ist die Nicht-RI-Markierung im Vergleich zur RI-Markierung im allgemeinen weniger empfindlich, aber nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist sogar dann ein Nachweis mit großer Empfindlichkeit möglich, wenn eine Nicht-RI-Markierung angewandt wird.
Bei dem Verfahren vom Stand der Technik werden Nucleinsäure-Sonden mit einer kurzen Nucleotidkettenlänge markiert und in den meisten Fällen verwendet, aber in solchen Fällen ist der Bereich zur Einarbeitung der Markierung beschränkt und die Einarbeitungsmenge der Markierung begrenzt.
Im Gegensatz dazu weist, wenn die Nucleotidkettenlänge einer Nucleinsäureprobe lang ist, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Nucleinsäureprobe viele Bereiche zur Einarbeitung der Markierung auf, weshalb sogar im Falle der Markierung mit Nicht-IR die geringe Empfindlichkeit durch eine gestiegene Einarbeitungsmenge der Markierung kompensiert werden kann, wodurch ein Nachweis mit hoher Empfindlichkeit möglich gemacht wird.
Wenn die Nucleinsäureprobe doppelsträngig ist, wird sie auf geeigneter Stufe, vor der Durchführung der Hybridisierung, zum Beispiel nach der Markierung, zu einem Einzelstrang umgewandelt.
Bei der Verwendung einer Nucleinsäure-Sonde mit kurzer Kettenlänge treten die Vorteile auf, daß Synthese, Verfügbarkeit oder Herstellung der Nucleinsaure-Sonde selbst äußerst leicht ist, daß die Reaktionszeit für die Hybridisierung verkleinert werden kann, daß der Schritt der Markierung der Nucleinsäure-Sonde ausgelassen werden kann, daß ein Nachweis mit hoher Empfindlichkeit möglich ist, und ähnliches.
Die erfindungsgemäße Verwendung einer Nucleinsäure- Sonde mit kurzer Nucleotidkettenlänge wird insbesondere auch deshalb möglich, weil an die Nucleinsäure-Sonde keine Markierung angebracht wird, wodurch die Anforderungen für eine Markierung an die Nucleinsäure-Sonde entfallen.
Zum Beispiel ist es bei der Markierung nach dem Nick- Translationsverfahren oder einem Bindungsverfahren eines markierten Enzyms für die zu markierende Nucleinsäure erforderlich, eine Mindestausdehnung, oder sogar mehr, aufzuweisen, aber an die in der Erfindung verwendete Nucleinsäure- Sonde wird keine solche Anforderung gestellt. Deshalb ist sie rasch verfügbar (hergestellt) und es wird auch, wie vorstehend beschrieben, möglich, eine mit einer kurzen Nucleotidkettenlänge zu verwenden, die geeignet ist, als Nucleinsäure- Sonde einen Nachweis mit hoher Empfindlichkeit liefern.
Für die Reaktion zwischen der Nucleinsäure-Sonde und der Nucleinsäureprobe kann geeigneterweise das Verfahren der Kontaktierung einer immobilisierten Nucleinsäure-Sonde mit einer Nucleinsäureprobe angewandt werden.
Es ist möglich, zur Immobilisierung einer Nucleinsäure-Sonde verschiedene Verfahren anzuwenden, wie sie zur Immobilisierung von Nucleinsäuren angewandt wurden, wie das Verfahren, bei dem eine Nucleinsäure-Sonde auf einen geeigneten Träger zur Immobilisierung, wie Nitrocellulose, Nylonfilm und ähnlichem, unter Nutzbarmachung des physikalischen Adsorptionsverfahrens oder einer chemischen Reaktion immobilisiert wird.
Hybridisierung einer Nucleinsäure-Sonde mit einer markierten Nucleinsäureprobe kann mittels der nachstehenden, herkömmlichen Verfahren ausgeführt werden.
Die Bedingungen der Hybridbildungs-Reaktion hängen zum Beispiel von der Nucleotidkettenlänge und der Basensequenz, die die Nucleinsäure-Sonde besitzt, ab. Im allgemeinen wird sie in einer Hybridisierungslösung, die Formamid, ein geeignetes Salz und Denhardt-Lösung enthält, unter Überwachung der Temperatur ausgeführt.
Dann kann die DNA, die kein hybrides Molekül bildet, mittels Waschens des Trägers mit Lösungen unter verschiedenen Bedingungen, wie einer Lösung, deren Salzkonzentration erniedrigt ist, oder einer Lösung, deren Temperatur angehoben ist, von dem Träger weggewaschen werden.
Als die Bedingungen für die Hybridbildungsreaktion und als die Bedingungen für das Waschen, müssen die der gewünschten Aufgabe entsprechenden optimalen Bedingungen sorgfältig ausgewählt werden.
Der Nachweis des gebildeten hybriden Moleküls kann gemäß den der Art der verwendeten Markierung entsprechenden Arbeitsweisen ausgeführt werden.
Durch quantitative Analyse der Menge an Markierung, die das gebildete hybride Molekül aufweist, kann die nachzuweisende Nucleinsäure quantitativ bestimmt werden.
Bei den wie vorstehend beschriebenen Arbeitsweisen, können die nachzuweisenden Nucleinsäuren unter Verwendung einer Vielzahl von Nucleinsäuren als Nucleinsäure-Sonden, wenn eine Vielzahl nachzuweisender Nucleinsäuren in der Nucleinsäureprobe enthalten ist, gleichzeitig nachgewiesen werden.
Spezieller, eine Vielzahl an Nucleinsäure-Sonden, die einer Vielzahl an nachzuweisenden Nucleinsäuren entsprechen, werden in einer vorgegebenen Anordnung immobilisiert, wobei deutlich wird, welche Nucleinsäure-Sonde sich an welcher Position befindet, wobei anschließend die immobilisierten Nucleinsäure-Sonden mit einer markierten Nucleinsäureprobe umgesetzt werden. Nach Beendigung der Reaktion wird die Bildungsposition des hybriden Moleküls unter Anwendung der Markierung nachgewiesen, und die Identifizierung der Art der entsprechenden Nucleinsaure-Sonde erfolgt aus der Position, die eine positive Reaktion anzeigt, und aus dem Ergebnis kann die Art der in der Nucleinsäureprobe enthaltenen, nachzuweisenden Nucleinsäure beurteilt werden.
Bei dem Verfahren unter Verwendung mehrerer Arten von Nucleinsäure-Sonden kann aus der immobilisierten Position, an die zuvor die Nucleinsäure-Sonden plaziert wurden, leicht beurteilt werden, mit welcher Nucleinsäure-Sonde die Nucleinsäureprobe hybridisiert wurde, da die Nucleinsäure-Sonden an der zuvor festgesetzten Position immobilisiert sind.
Deshalb ist es nicht notwendig für die entsprechenden Nucleinsäure-Sonden verschiedene Markierungen zu verwenden, so daß die entsprechenden mehreren Arten von Nucleinsäure-Sonden wie in dem Verfahren vom Stand der Technik ausgewählt werden können, in dem es markierten Sonden gestattet wird, mit einer Nucleinsäureprobe zu reagieren.
Wenn mehrere Arten Nucleinsäure-Sonden verwendet werden, können verschiedene Nucleinsäuren als Nucleinsäuresonden verwendet werden. Um die Hybridbildungsreaktion mit verschiedenen Arten von Nucleinsäure-Sonden gleichzeitig mittels der gleichen Arbeitsweise wirkungsvoll durchzuführen, wird es bevorzugt, daß die Nucleotidkettenlängen der entsprechenden Nucleinsäure-Sonden bei den mehreren Arten von Nucleinsäure- Sonden auf die für die individuellen Hybridbildungsreaktionen erforderliche Länge eingestellt werden sollten, um nach den gleichen Bedingungen vorzugehen.
Zum Beispiel kann insbesondere die Dissoziationstemperatur (Tm: Temperatur für eine Einzelstrangbildung) der in den individuellen Hybridbildungsreaktionen zu bildenden Hybride bevorzugt gleichmäßig gemacht werden.
Spezieller, es wurden zur Berechnung des Tm-Wertes, in Abhängigkeit von der Hybridisierungslösung verschiedene Formeln angewandt. Zum Beispiel wird in 0,9 M NaCl der Tm eines Oligonucleotids eines 20-mers oder weniger dargestellt durch:
Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C)
wobei A, T, G und C jeweils die Anzahl an Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin angeben (siehe Continued Biochemical Experimental Course 1, Gene Study Method II, S. 236).
Dementsprechend können, bei Befolgung dieser Formel, die Basensequenzen der entsprechenden Nucleinsäure-Sonden in diese Formel zur Wahl ihrer Länge eingesetzt werden, so daß die Tm-Werte der entsprechenden Nucleinsäure-Sonden gleichmäßig (regular) sein können.
Das wie vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren ist für den Nachweis von Genen, die genetischen Krankheiten, Krebs und Virusinfektionen inhärent sind, nützlich.
Als ein erfindungsgemäßes Beispiel eines Verfahrens zum Nachweis von Genen, die Genkrankheiten und ähnlichem inhärent sind, kann das die nachstehend gezeigten Prozesse einschließende Verfahren erwähnt werden:
a) der Prozeß zur Immobilisierung einer Nucleinsäure- Sonde, verwandt mit einem Gen, das ein Indikator der Krankheit ist, die Gegenstand der Untersuchung ist;
b) der Prozeß zur Markierung der Chromosom-DNA- Testprobe (Nucleinsäureprobe);
c) der Prozeß zur Umsetzung der immobilisierten Sonde aus dem Verfahren a) mit der aus dem Verfahren b) erhaltenen markierten DNA;
d) der Prozeß zum Nachweis des aus dem Verfahren c) gebildeten hybriden Moleküls unter Verwendung der Markierung.
Als die in dem vorstehenden Verfahren a) verwendete Nucleinsäure-Sonde kann eine verwendet werden, die eine Basensequenz aufweist, wie sie zur Erkennung der einem Gen einer genetischen Krankheit, und ähnlichem, inhärenten Basensequenz notwendig ist, wobei ihre Nucleotidlänge nicht besonders beschränkt ist.
Wenn zum Beispiel eine durch Substitution eines Basenpaares auf einer Punktmutation beruhende Krankheit nachzuweisen ist, wird, um den Unterschied eines Basenpaares wirkungsvoll und mit guter Empfindlichkeit zu beurteilen, ein Oligonucleotid, das 25 Basen oder weniger, bevorzugter 17 bis 20 Basen umfaßt, als Nucleinsäure-Sonde verwendet.
Auch die der Punktmutation entsprechende Substitutions-Stelle sollte bevorzugt so angeordnet werden, daß sie im Zentrum des als Nucleinsäure-Sonde fungierenden Oligonucleotids liegt, um eine genauere Beurteilung durchzuführen.
In dem Prozeß a) können gleichzeitig mittels Immobilisierung mehrerer, den verschiedenen Punkten der Untersuchung entsprechender Nucleinsäure-Sonden, in einer vorgegebenen Anordnung auf dem selben Träger, Untersuchungen zu mehreren Punkten ausgeführt werden.
Spezielle Verfahrensweisen können mittels des zuvor beschriebenen Verfahrens unter Verwendung mehrerer Sondenarten ausgeführt werden.
Als die DNA-Testprobe kann bei dem Prozeß b) eine Chromosomen-DNA alleine, eine mit einem geeigneten Restriktionsenzym zu einer geeigneten Länge gespaltene Chromosomen- DNA und ähnliches verwendet werden.
Wenn mehrere Untersuchungspunkte gleichzeitig aus zuführen sind, ist es wirkungsvoll, Fragmente zu verwenden, die mittels eines Restriktionsenzyms auf eine geeignete Länge gebracht wurden.
Auch zur Markierung können die wie vorstehend erwähnten Verfahren verwendet werden.
Die Hybridbildungsreaktion in dem Prozeß c) kann entsprechend den vorstehend beschriebenen Verfahren ausgeführt werden.
Wenn eine Punktmutation nachzuweisen ist, so kann es manchmal bei lediglich einem einzigen Unterschied des Nucleotids, wegen der Entstehung einer Nichtübereinstimmung (mismatch) zwischen der Sonde und der Nucleinsäure, zum Versagen bei der Unterscheidung zwischen der An- und Abwesenheit einer Punktmutation kommen.
Der Tm des hybriden Moleküls wird jedoch durch die Zahl der nichtkomplementären Basenpaare in dem nichtübereinstimmenden Hybrid beeinflußt, sowie dem Gehalt an G (Guanin) und C (Cytosin) in der Nucleinsäure-Sonde, der Nucleotidkettenlänge der Nucleinsäure-Sonde, der Position der Punktmutation, der Art der Nichtübereinstimmung und ähnlichem, und dann ist es wichtig, diejenigen Temperaturbedingungen und ähnliches, entsprechend dem Aufbau der verwendeten Nucleinsäure-Sonde, auszuwählen, bei denen kein nichtübereinstimmendes hybrides Molekül gebildet wird, das den Nachweis der gewünschten Punktmutation stört.
Zum Beispiel fällt Tm pro nicht komplementär in einem nichtübereinstimmenden hybriden Molekül enthaltenem Basenpaar um 5 bis 10ºC.
Deshalb ist es erforderlich die Temperatur der Hybridisierung in Hinblick auf den Tm des gewünschten hybriden Moleküls und in Hinblick auf den Tm des nichtübereinstimmenden hybriden Moleküls, das gebildet werden kann, zu wählen.
Auch wenn mehrere auf dem selben Träger immobilisierte Arten von Nucleinsäure-Sonden verwendet werden, sollte zusätzlich zu den wie vorstehend erwähnten, die Nichtübereinstimmung betreffenden Erfordernissen, die Nucleotidkettenlänge und ähnliches bevozugt gesteuert werden, so daß der Tm der mit den entsprechenden Nucleinsäure-Sonden gebildeten hybriden Moleküle gleichmäßig sein kann.
Der vorstehend erwähnte Prozeß d) kann gemäß dem der angewandten Markierung entsprechenden Verfahren ausgeführt werden.
In dem wie vorstehend beschriebenen Verfahren, unter Verwendung einer Nucleinsäure mit einer einem Mikroorganismus, wie Bakterien, Virus und ähnliches, inhärenten Basensequenz als der Sonde, und einer aus einem Mikroorganismus entnommenen Nucleinsäure als der Probe, können die Mikroorganismen taxonomisch identifiziert werden.
Im Falle der Taxonomie von Bakterien kann geeigneterweise eine Nucleinsäure-Sonde mit einer Nucleotidkettenlänge von ungefähr der eines 20-mers verwendet werden, obgleich im Falle der Taxonomie eines Virus geeigneterweise eine mit einer Nucleotidkettenlänge von ungefähr der eines 20-mers verwendet werden kann.

Beispiel 1

(N.B. Die Sonden und Verfahren, auf die in Beispiel 1,2, 4 und 5 Bezug genommen wird, fallen nicht unter die beanspruchte Erfindung).

1-1) Immobilisierung der Nucleinsäure-Sonde:

Ein 41-mer-Oligönucleotid mit der folgenden DNA- Basensequenz, die einen Teil eines pUC 19-Plasmids bildete, wurde mittels einer DNA-Synthesier-Vorrichtung (Ein Produkt von ABI, Modell 381 A) hergestellt:
Unter Verwendung eines Teils des synthetisierten Produkts wurde dessen Reinheit mittels einer 15% -Polyacrylamidgel-Elektrophorese,7 M Harnstoff enthaltend, untersucht. Als Ergebnis wurde eine Reinheit des synthetisierten Produkts von 90% oder mehr ermittelt und deshalb wurde das synthetisierte Produkt ohne Reinigung direkt in den darauffolgenden Arbeitsschritten verwendet.
Eine Spot-Lösung des synthetisierten Produkts mit einer Konzentration von 200 ng/l wurde hergestellt, und jeweils 2 ul der Lösung wurden in Form eines Spots (Fleckens) auf einen Nitrocellulosefilter (ein Produkt von Schleicher & Schanel) aufgebracht, getrocknet und dann 2 Stunden bei 80 ºC wärmebehandelt.

1-2) Markierung der Nucleinsäureprobe und Herstellung der Hybridisierungslösung:

Als Nucleinsäureproben wurden ein pBR 322-Plasmid (Probe A), ein pUC 19-Plasmid (Probe B) und eine Mischung des pBR 322-Plasmids und des pUC 19-Plasmids (Probe C, Gewichtsverhältnis der Mischung 1:1) hergestellt und die Markierung der Probe und die Herstellung der Hybridisierungslösung wurden gemäß den folgenden Arbeitsschritten unter individueller Verwendung dieser Proben ausgeführt.
2,0 ul eines 10 x TA-Puffers und 16,0 ul Wasser wurden mit 2 ul einer Lösung, die 1 ug der Proben A, B oder C enthielt, gemischt, und zu der erhaltenen Mischung wurden 10 Einheiten HindIII (ein Produkt von Toyobo) gegeben und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC unter Ausführung der Reaktion stehengelassen.
Danach wurden 2,0 Einheiten T4DNA-Polymerase (ein Produkt von TOYOBO) hinzugegeben, gefolgt von der Umsetzung bei 22 ºC.
Nach einer Stunde wurden 2,0 ul 2mM dATP, 2,0 ul 2mM dCTP und 2,0 ul 2 mM dGTP (Produkte von TOYOBO) zu der Reaktionsmischung hinzugefügt, sowie ferner 6,0 ul biotinyliertes UTP (ein Produkt von BRL), und die Mischung wurde bei 37 ºC stehengelassen.
Nach 40 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 100 mM EDTA zu der Reaktionsmischung gestoppt, und die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten lang einer Hitzebehandlung bei 95 ºC unterzogen, um das Produkt in einen Einzelstrang umzuwandeln.
Die der Wärmebehandlung unterzogene Reaktionsmischung wurde mit 9 ml 100%-igem Formamid, 5 ml 20xSSC, 0,4 ml 50 x Denhardt-Lösung, 0,4 ml 1M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) und 0,1 ml beschallter Lachssperma-DNA (Produkt von Sigmer) mit einer Konzentration von 50,0 mg/ml unter Erhalt einer Hybridisierungslösung gemischt.
Entsprechend den vorstehend beschriebenen Arbeitsweisen wurden drei aus den Proben A, B beziehungsweise C hergestellte Arten von Hybridisierungslösungen erhalten.

1-3) Hybridisierung:

Unter individueller Verwendung der drei in dem Arbeitsgang des vorstehenden Punktes 1-2) erhaltenen Arten von Hybridisierungslösungen wurde eine Hybridisierung gemäß der folgenden Arbeitsweisen durchgeführt.
Zunächst wurde, um eine Vor-Hybridisierung zu bewirken, ein Filter mit der zuvor in Form von Spots hergestellten, immobilisierten Nucleinsäure-Sonde bei 42 ºC 30 Minuten lang in eine Mischung aus 200 ml einer Mischung aus 3 x SSC und Denhardtlösung (Mischungsverhältnis 1:1) eingetaucht und danach wurde die Hybridisierungslösung (3 ml) der Probe A, B oder C dazugegeben und die Mischung wurde in einen Polyethylenbeutel eingebracht, verschlossen und bei 42 ºC stehengelassen.
Nach 12 Stunden wurde der Filter entnommen, gewaschen und auf übliche Weise die Farbanzeigereaktion (Bioindustry, Bd. 3, Nr. 6, 1989, S. 479 - 504, etc.) ausgeführt.
Als Ergebnis wurde, wenn die Hybridisierungslösung aus Probe B, und wenn die Hybridisierungslösung aus Probe C verwendet wurde, eine blau-violette Farbbildung an dem Spot der Nucleinsäuresonde auf dem Filter beobachtet, wodurch das Vorhandensein des pUC 19 in den Proben B und C bestätigt wurde.

Beispiel 2

2-1) Immobilisierung der Nucleinsäure-Sonde:

Ein 41-mer-Oligonucleotid mit der nachstehenden DNA- Basensequenz, die einen Teil eines pUC 19-Plasmids (Sonde A) bildete, und ein 41-mer-Oligonucleotid mit der nachstehenden DNA-Basensequenz, die einen Teil eines pBR 322-Plasmids (Sonde B) bildete, wurde mittels einer DNA-Synthesier-Vorrichtung (ein Produkt von ABI, Modell 381A) synthetisiert. Sonde A Sonde B
Wenn die Reinheit dieser nach den gleichen Arbeitsweisen des Punkts 1-1) in Beispiel 1 synthetisierten Produkte untersucht wurde, wurde gefunden, daß beide eine Reinheit von 95 % oder mehr aufwiesen. Diese synthetisierten Produkte wurden ohne Reinigung direkt bei den darauffolgenden Arbeitsweisen verwendet.
Eine Spot-Lösung mit einer Konzentration von 200 ng/ul wurde aus jedem der synthetisierten Produkte hergestellt, wobei jeweils 2 ul der Lösung auf ein Nitrocellulosefilter (ein Produkt von Schleicher & Schanel) in Form von Spots aufgebracht wurden, so daß die Spots der Sonden A und B wie in Fig. 1 gezeigt angeordnet waren, dann wurden sie getrocknet und bei 80 ºC 2 Stunden lang wärmebehandelt.

2-2) Markierung der Nucleinsäureprobe und Herstellung der Hybridisierungslösung:

Nucleinsäureproben wurden folgendermaßen hergestellt:

Probe D:

Mischung aus pUC 19-Plasmid und Chromosomen-DNA, auf herkömmliche Weise (Gewichtsverhältnis der Mischung: 1:1) aus einem E. coli JM109-Stamm (ein Produkt von TAKARA) hergestellt.

Probe E:

Mischung aus pBR 322-Plasmid und Chromosomen-DNA, auf herkömmliche Weise (Gewichtsverhältnis der Mischung: 1:1) aus einem E. coli HB101-Stamm (ein Produkt von TOYOBO) hergestellt.

Probe F:

Chromosomen-DNA, auf herkömmliche Weise aus einem E. coli HB101-Stamm hergestellt.
Unter individueller Verwendung dieser Proben wurde die Markierung und Herstellung der Hybridisierungslösung der jeweiligen Proben auf die gleiche Weise wie in dem Punkt 1-2) in Beispiel 1 unter Erhalt von drei Arten von Hybridisierungslösungen aus der Probe D, E und F ausgeführt.

2-3) Hybridisierung:

Unter individueller Verwendung der drei in dem Arbeitsgang des vorstehenden Punktes 2-2) erhaltenen Arten von Hybridisierungslösungen wurde eine Vor-Hybridisierung, eine Hybridisierung und eine Farbbildungsreaktion auf die gleiche Weise wie in Punkt 1-3) in Beispiel 1 durchgeführt.
Als Ergebnis trat in dem Spot-Bereich der Sonde A auf dem Filter, der mit der Hybridisierungslösung aus Probe D umgesetzt worden war, eine Färbung auf, während in dem Spot- Bereich der Sonde B auf dem Filter, der mit der Hybridisierungslösung aus Probe E umgesetzt worden war, eine Färbung auftrat. Im Gegensatz dazu war in dem Spotbereich auf dem Filter, der mit der Hybridisierungslösung aus Probe F umgesetzt worden war, keine Färbung zu erkennen.

Beispiel 3

Unter den in einem PAH-Gen in der Leukozyten-DNA eines Patienten mit Phenylalaninurie gefundenen Mutationen sind die nachstehenden als Mutationen mit großer Häufigkeit (* Bereich) bekannt.

Haplotyp 3

Normal:

Abnormal:

Halotyp 2

Normal:

Abnormal:

Dementsprechend wurden diese vier Arten von Oligonucleotiden zur Verwendung als Nucleinsäure-Sonden mittels einer DNA-Synthetisier-Vorrichtung (ein Produkt von ABI, Modell 381 A) synthetisiert.
Wenn die Reinheit dieser synthetisierten Produkte nach der gleichen Arbeitsweise wie in Punkt 1-1) des Beispiels 1 untersucht wurde, wurde gefunden, daß alle eine Reinheit von 95 % oder mehr aufwiesen.
Unter direkter Verwendung dieser synthetisierten Produkte wurde entsprechend den gleichen Arbeitsweisen wie in Punkt 2-2) in Beispiel 2, Spots der entsprechenden Sonden mit den in Fig. 2 gezeigten Anordnungen auf einem Nitrocellulosefilter gebildet.
Dann wurde aus den zufällig aus den Testproben-Donoren ausgewählten, kultivierten Zellen der amniotischen Flüssigkeit auf übliche Weise eine doppelsträngige DNA extrahiert und mit Pvu II digeriert. Das erhaltene, digerierte Produkt wurde mit Photobiotin (ein Produkt von Bresatec) unter Anbringen einer Biotinmarkierung auf herkömmliche Weise umgesetzt und die doppelsträngige DNA anschließend mittels einer 10-minütigen Wärmebehandlung bei 100 ºC in eine einsträngige DNA umgewandelt.
2 ug der markierten Probe wurden unter Erhalt einer Hybridisierungslösung zu einer Lösung gegeben, die 5 x SSPE [50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,9 M NaCl, 5 mM EDTA], 0,3 % SDS und beschallter E. coli-DNA (ein Produkt von Sigmer) mit einer Konzentration von 10 ug/ml enthielt.
Unter gemeinsamer Verwendung der Hybridisierungslösung und des zuvor hergestellten sonden-immobilisierten Filters wurde eine Vor-Hybridisierung und eine Hybridisierung nach den gleichen Arbeitsweisen wie in Punkt 1-3) in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß die Hybridisierungsbedingungen bei 50 ºC und 16 Stunden lagen.
Nach Beendigung der Reaktion wurde der Filter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur einem zweimaligen Waschen mit 2 x SSPE, das 0,1 % SDS enthielt, unterzogen und ferner einmal 10 Minuten lang mit 5 x SSPE, das 0,1 % SDS enthielt, bei 55 ºC gewaschen.
Wenn der Filter nach dem Waschen auf herkömmliche Weise einer Farbbildungsreaktion einer biotinylierten Nucleinsäure unterzogen wurde, kam es auf den Spots der Sonde 1 und der Sonde 3 zur Farbbildung und somit wurde bei der Auswertung angenommen, daß der Testprobendonor keine Phenylalaninurie zeigt.
Wenn die gleichen Arbeitsweisen wie vorstehend beschrieben unter Verwendung kultivierter Zellen der amniotischen Flüssigkeit aus einem anderen, zufällig ausgewählten Testprobendonor ausgeführt wurden, trat auf dem Spot der Sonde 4 eine Farbbildung auf und somit wurde bei der Auswertung angenommen, daß der Testprobendonor Phenylalaninurie zeigt.

Beispiel 4

Unter Verwendung des experimentellen Systems entsprechend dem erfindungsgemäßen Beispiel 1 wurde ein Vergleich mit einem Beispiel vom Stand der Technik durchgeführt. Die verwendete Sonde ist nachstehend gezeigt, sie ist die gleiche wie in Beispiel 1:
Als Proben wurden ebenfalls die gleichen drei Proben A, B und C, angepaßt an die vorgegebenen Konzentrationen, wie in Beispiel 1 verwendet.
Zur Empfindlichkeitsprüfung gemäß dem erfindungsgemäßen Beispiel wurde ähnlich wie in Beispiel 1 ein Nitrocellulosefilter mit Sondenspots hergestellt.
Als Probe wurde DNA verwendet, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 vorbehandelt und markiert wurde, und es wurden Hybridisierungslösungen hergestellt, die DNA-Mengen von 50 ng, 5 ng, 0,5 ng, 0,05 ng und 0,005 ng aufwiesen.
Unter gemeinsamer Verwendung der Hybridisierungslösung und des zuvor hergestellten sonden-immobilisierten Filters wurde unter Verwendung der Hybridisierungslösungen mit den entsprechenden Konzentrationen eine Vor-Hybridisierung und eine Hybridisierung nach den gleichen Arbeitsweisen wie in Punkt 1-3) aus Beispiel 1 durchgeführt, außer daß die Hybridisierungsbedingungen bei 50 ºC und 16 Stunden lagen.
Nach Beendigung der Reaktion wurde der Filter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur einem zweimaligen Waschen mit 2 x SSPE, das 0,1 % SDS enthielt, unterzogen und ferner einmal 10 Minuten lang mit 5 x SSPE, das 0,1 % SDS enthielt, bei 55 ºC gewaschen.
Wenn der Filter nach dem Waschen auf herkömmliche Weise einer Farbbildungsreaktion einer biotinylierten Nucleinsäure unterzogen wurde, wurden die nachstehenden Ergebnisse erhalten: Anmerkung: o .... Farbbildung x .... Keine Farbbildung
Wie ersichtlich ist, tritt die einen Nachweis ermöglichende Farbbildung bei ungefähr 0,05 bis 0,5 ng auf.
Andererseits wurde beim Beispiel nach dem Stand der Technik die Sonde zuerst markiert. Das Markierugsverfahren wurde unter Synthetisierung einer komplementären, der Sonde entsprechenden doppelsträngigen DNA, bei der mit der T4-DNA- Polymerase ein biotinyliertes dUTP am 3'-Ende eingefügt wurde, durchgeführt, wobei das markierte Produkt dann in einen Einzelstrang dissoziert wurde, der als Sonde Verwendung fand.
Die Nucleinsäureproben A, B und C wurden in den nachstehend in Tabelle angegebenen Mengen in Form von Spots auf einen Nitrocellulosefilter aufgebracht. Filter Nr. Probe
Die fünf Filterarten wurden getrocknet und dann bei 80 Cº 2 Stunden lang im Ofen getrocknet.
Die vorstehend hergestellte Sonde wurde bei 95 ºC 5 Minuten lang einer Wärmebehandlung unterzogen, um so eine Umwandlung in einen Einzelstrang zu erfahren.
Die der Wärmebehandlung unterzogene Reaktionsmischung wurde mit 9 ml 100%-igem Formamid, 5 ml 20xSSC, 0,4 ml 50xDerhardt-Lösung, 0,4 ml 1M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) und 0,1 ml beschallter Lachssperma-DNA (Produkt von Sigmer) mit einer Konzentration von 50,0 mg/ml unter Erhalt einer Hybridisierungslösung gemischt.
Dann wurden die fünf Filterarten mit der zuvor hergestellten, in Spots immobilisierten Nucleinsäure-Sonde bei 42 ºC 30 Minuten lang in eine Mischung aus 200 ml 3xSSD und Denhardtlösung (Mischungsverhältnis 1:1) eingetaucht, um eine Vor-Hybridisierung zu bewirken, und danach wurde die vorige Hybridisierungslösung (3 ml) dazugegeben und die Mischung wurde in einen Polyethylenbeutel eingebracht, verschlossen und bei 42 ºC stehengelassen.
Nach 12 Stunden wurde der Filter entnommen, gewaschen und auf übliche Weise die Farbanzeigereaktionen (Bioindustry, Bd. 3, Nr. 6, 1989, S. 479 - 504, etc.) ausgeführt.
Als Ergebnis war, was B und C betraf, ein Nachweis für den Filter Nr. 2, d.h bis zu 5 ng möglich. Für den Filter mit den A-Spots wurden nirgendwo, von Nr. 1 bis Nr. 6, Farbbildung beobachtet.

Beispiel 5

Unter Verwendung des experimentellen Systems gemäß des erfindungsgemäßen Beispiels 2 wurde ein Vergleich mit einem Beispiel vom Stand der Technik durchgeführt.
Als Untersuchung gemäß dem erfindungsgemäßen Beispiel wurde ähnlich wie in Beispiel 2 ein 41-mer-Oligonucleotid mit der nachstehenden DNA-Basensequenz, die einen Teil eines pUC 19-Plasmids (Sonde A) bildete, und eines 41-mer-Oligonucleotid mit der nachstehenden DNA-Basensequenz, die einen Teil eines pBR 322-Plasmids (Sonde B) bildete, mittels eines DNA- Synthetisier-Vorrichtung (ein Produkt von ABI, Modell 381A) synthetisiert. Sonde A Sonde B
Wenn die Reinheit dieser synthetisierten Produkte nach den gleichen Arbeitsweisen wie in Beispiel 1 untersucht wurde, wurde gefunden, daß beide eine Reinheit von 95 % oder mehr aufwiesen. Diese synthetisierten Produkte wurden ohne Reinigung direkt bei den darauffolgenden Arbeitsschritten verwendet.
Eine Spot-Lösung mit einer Konzentration von 200 ng/ul wurde aus jedem der synthetisierten Produkte hergestellt, wobei jeweils 2 ul der Lösung auf ein Nitrocellulosefilter (ein Produkt von Schleicher & Schanel) in Form von Spots aufgebracht wurden, so daß die Spots der Sonden A und B wie in Fig. 1 gezeigt angeordnet waren, dann wurden sie getrocknet und bei 80 ºC 2 Stunden lang wärmebehandelt.
Fünf solcher Filterbögen wurden hergestellt und mit Nr.1 bis Nr.5 bezeichnet.
Andererseits wurde ein pUC 19-Plasmid entsprechend den nachstehenden Arbeitsweisen als Sonde markiert.
Die Markierung wurde gemäß dem Nick-Translationsverfahren von Rigby et al ausgeführt.
10 ul Nick-Translationspuffer, 1 ul 2,5 mM dGTP, 1 ul 2,5 mM dATP, 1 ul 2,5 mM dTTP, 7 ul biotinyliertes UTP (BRL), 1 ul DNase (0,05 ug/ml) und 4,0 ul einer DNA-Probe (pUC19) (0,4 ug/4ul) wurden unter Herstellung einer 100 ul ddH&sub2;O- Reaktionsmischung in ein Eppendorf-Rohr eingebracht. Nach einer 10-minütigen Reaktion bei 12 ºC wurde 1 ul DNA-Polymerase (5 bis 10 Einheiten) hinzugefügt. Nachdem die Reaktion 75 Minuten bei 12 ºC ausgeführt wurde, wurde die Reaktion durch Zugabe einer Stopp-Lösung gestoppt. Die markierte DNA wurde mittels Phenol-Extraktion, Ethanolfällung gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde 5 Minuten einer Wärmebehandlung bei 95 ºC unterzogen und dann mit einer Reaktionsmischung zur Hybridisierung auf Mengen von 50 ng, 5 ng, 0,5 ng, 0,05 ng und 0,005 ng verdünnt. Die verwendete Reaktionsmischung zur Hybridisierung bestand aus einer Mischung aus 9 ml 100%-igem Formamid, 5 ml 20 x SSC, 0,4 ml 50 x Denhardt-Lösung, 0,4 ml 1 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5), 0,1 ml beschallter Lachssperma-DNA (Produkt von Sigmer) (50,0 mg/ml).
Unter Verwendung der Hybridisierungs-Reaktionsmischungen der vorstehend erwähnten fünf verschiedenen Arten von Konzentrationen wurde für die zuvor vorbereiteten 5 Filterbogen eine Hybridisierung durchgeführt.
Für den Filter Nr. 1 wurde die Reaktionsmischung mit 50 ng verwendet, für den Filter Nr. 2 wurde die Reaktionsmischung mit 5 ng verwendet, für den Filter Nr. 3 wurde die Reaktionsmischung mit 0,5 ng verwendet, für den Filter Nr.4 Wurde die Reaktionsmischung mit 0,05 ng verwendet und für den Filter Nr. 5 wurde die Reaktionsmischung mit 0,005 ng verwendet.
Zunächst wurde, um eine Vorhybridisierung zu bewirken, der zuvor hergestellte Filter mit den in Spots immobilisierten Nucleinsäure-Sonden bei 42 ºC 30 Minuten lang in 200 ml einer Mischung von 3 x SSC und Denhardtlösung getaucht, und die Hybridisierungslösungen der entsprechenden Konzentrationen wurden wie vorstehend gezeigt hinzugefügt und jede Mischung wurde in einen Polyethylenbeutel eingebracht, verschlossen und bei 42 ºC stehen gelassen.
Nach 12 Stunden wurden die Filter herausgenommen, gewaschen und die Farbanzeigereaktionen auf herkömmliche Weise ausgeführt (Bioindustry, Band 3, Nr. 6, 1989, S. 479-504, etc.).
Als Ergebnis wurde bei den Filter Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4 an der Position des Spots der Sonde A eine blauviolette Farbbildung beobachtet. Das heißt, es trat bis zu 0,05 ng von Nr.4 Farbbildung auf. An der Stelle des Spots der Sonde B war keine Farbbildung zu erkennen.
Andererseits wurde als Beispiel nach dem Stand der Technik eine doppelsträngige DNA, die wie nachstehend gezeigt einen Teil eines pUC 19 bildete, synthetisiert, wobei mit der T4-DNA-Polymerase biotinyliertes dUTP am 3'-Ende eingeführt und das markierte Produkt in einen Einzelstrang dissoziert wurde, der als Sonde zum Nachweis gemäß dem Stand der Technik Verwendung fand.
Als Nucleinsäureproben wurden pBR 322-Plasmid und pUC 19-Plasmid jeweils als Spots auf einen Nitrocellulosefilter (ein Produkt von Schleicher & Schanel) in den nachstehend angezeigten Mengen aufgebracht. Filter Nr. Probe
Die fünf Filterarten wurden getrocknet und dann bei 80 Cº 2 Stunden lang im Ofen getrocknet.
Die vorstehend hergestellte Sonde wurde bei 95 ºC 5 Minuten lang einer Wärmebehandlung unterzogen, um so eine Umwandlung in einen Einzelstrang zu erfahren.
Die der Wärmebehandlung unterzogene Reaktionsmischung wurde mit 9 ml 100%-igem Formamid, 5 ml 20xSSC, 0,4 ml 50xDenhardt-Lösung, 0,4 ml 1M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) und 0,1 ml beschallter Lachssperma-DNA (Produkt von Sigmer) mit einer Konzentration von 50,0 mg/ml unter Erhalt einer Hybridisierungslösung gemischt.
Dann wurden die fünf Filterarten mit den zuvor hergestellten, in Spots immobilisierten Nucleinsäureproben bei 42 ºC 30 Minuten lang in eine Mischung aus 200 ml 3xSSC und Denhardtlösung (Mischungsverhältnis 1:1) eingetaucht, um eine Vor-Hybridisierung zu bewirken, und danach wurde die vorige Hybridisierungslösung (3 ml) dazugegeben und die Mischung wurde in einen Polyethylenbeutel eingebracht, verschlossen und bei 42 ºC stehengelassen.
Nach 12 Stunden wurde der Filter entnommen, gewaschen und auf übliche Weise die Farbanzeigereaktionen (Bioindustry, Bd. 3, Nr. 6, 1989, S. 479 - 504, und ähnliches) ausgeführt.
Als Ergebnis war, was die Filter 1 und 2 betraf, an der Position an der der Spot aus Probe pUC 19 aufgebracht wurde, eine blau-violette Farbbildung zu beobachten. Das heißt, es trat bei bis zu 5 ng der Nr. 2 eine Farbbildung auf.

Beispiel 6

Unter Verwendung des experimentellen Systems gemäß des erfindungsgemäßen Beispiels 3 wurde ein Vergleich mit einem Beispiel vom Stand der Technik durchgeführt.
Die verwendeten Sonden sind die gleichen Sonden 1 bis 4 wie in Beispiel 3 und als Proben wurden die in Beispiel 3 beurteilte Probe A, von der vermutet wird, daß sie kein Phenylalaninurie aufweist und die Probe B, von der vermutet wird, daß sie Phenylalaninurie aufweist, eingestellt auf vorgegebene Konzentrationen, verwendet.
Zur Prüfung gemäß dem erfindungsgemäßen Beispiel wurde ähnlich wie in Beispiel 3 ein Nitrocellulosefilter mit Spots der entsprechenden Sonden mit der in Fig. 2 gezeigten Anordnung hergestellt.
Hybridisierungslösungen mit Mengen von 500 ng, 50 ng, 5 ng, 0,5 ng, 0,05 ng und 0,005 ng einer DNA, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 3 vorbehandelt und markiert wurde, wurden als Proben hergestellt.
Unter gemeinsamer Verwendung der Hybridisierungslösung und des zuvor hergestellten sonden-immobilisierten Filters wurde unter Verwendung der Hybridisierungslösungen mit den entsprechenden Konzentrationen eine Vor-Hybridisierung und eine Hybridisierung nach den gleichen Arbeitsweisen wie in Punkt 1-3) in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß die Hybridisierungsbedingungen bei 50 ºC und 16 Stunden lagen.
Nach Beendigung der Reaktion wurde der Filter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur einem zweimaligen Waschen mit 2 x SSPE, das 0,1 % SDS enthielt, unterzogen und ferner einmal 10 Minuten lang bei 55 ºC mit 5 x SSPE, das 0,1 % SDS enthielt, gewaschen.
Wenn der Filter nach dem Waschen auf herkömmliche Weise einer Farbbildungsreaktion einer biotinylierten Nucleinsäure unterzogen wurde, wurden die nachstehenden Ergebnisse erhalten: Probe A Sonde Probe B Sonde Anmerkung: o .... Farbbildung x .... Keine Farbbildung
Andererseits wurden beim Beispiel nach dem Stand der Technik die Sonden 1 bis 4 zuerst markiert. Das Markierungsverfahren wurde unter Synthetisierung einer komplementären, den Sonden 1 bis 4 entsprechenden doppelsträngigen DNA, bei der mit der T4-DNA-Polymerase ein biotinyliertes dUTP am 3'- Ende eingefügt wurde, ausgeführt, wobei das markierte Produkt dann in einen Einzelstrang dissoziert wurde, der als Sonde Verwendung fand.
Die Nucleinsäureproben A und B wurden in den nachstehend in Tabelle 1 angegebenen Mengen in Form von Spots auf einen Nitrocellulosefilter aufgebracht. Filter Nr. Probe
Die sechs Filterarten wurden getrocknet und dann bei 80 Cº 2 Stunden lang im Ofen getrocknet.
Die vorstehend hergestellten Sonden 1 bis 4 wurde bei 95 ºC 5 Minuten lang einer Wärmebehandlung unterzogen, um so eine Umwandlung in einen Einzelstrang zu erfahren.
Die der Wärmebehandlung unterzogene Reaktionsmischung wurde mit 9 ml 100%-igem Formamid, 5 ml 20xSSC, 0,4 ml 50xDenhardt-Lösung, 0,4 ml 1M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) und 0,1 ml beschallter Lachssperma-DNA (Produkt von Sigmer) mit einer Konzentration von 50,0 mg/ml unter Erhalt von vier Arten von Hybridisierungslösungen gemischt.
Dann wurden die sechs Filterarten mit den zuvor hergestellten, in Spots immobilisierten Nucleinsäure-Sonden bei 42 ºC 30 Minuten lang in eine Mischung aus 200 ml 3xSSC und Denhardtlösung (Mischungsverhältnis 1:1) eingetaucht, um eine Vor-Hybridisierung zu bewirken, und danach wurde jede der vorigen Hybridisierungslösungen (3 ml) dazugegeben und die Mischung wurde in einen Polyethylenbeutel eingebracht, verschlossen und bei 42 ºC stehengelassen.
Nach 12 Stunden wurden die Filter entnommen, gewaschen und auf übliche Weise die Farbanzeigereaktionen (Bioindustry, Bd. 3, Nr. 6, 1989, S. 479 - 504, etc.) ausgeführt.
Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen gezeigt. Probe Sonde Anmerkung: o ... Farbbildung x ... keine Farbbildung
Für die vorliegende Erfindung ist eine Markierung der Nucleinsäure-Sonde nicht erforderlich, da die Nucleinsäureprobe markiert und die Nucleinsäure-Sonde nicht markiert wird. Als Ergebnis kann ein Nucleotid mit kurzer Kettenlänge, das leicht verfügbar ist und mit großer Genauigkeit hergestellt werden kann, verwendet werden und der Nachweis kann sogar bei geringer Konzentration mittels einer einfachen Arbeitsweise ausgeführt werden. Da die Nucleinsäureprobe im allgemeinen eine mit einer großen Nucleotidkettenlänge ist, wird es durch Anbringen einer Markierung an die Nucleinsäureprobe auch möglich, mittels einer nichtradioaktiven Markierung eine wirksame Markierung zu erreichen, wodurch die Markierungs- und Nachweisverfahren sicherer und einfacher werden.
Ferner, wenn der Nachweis mehrerer Nucleinsäuren gleichzeitig unter Verwendung mehrerer Arten von Nucleinsäure- Sonden erfolgt, so waren nach dem Verfahren zur Markierung von Nucleinsäure-Sonden gemäß dem Stand der Technik mühselige Arbeitsweisen, wie die Unterscheidung mehrerer Nucleinsäure- Sonden mittels Verwendung mehrerer Markierungsarten erforderlich, wohingegen erfindungsgemäß die Markierung der Nucleinsäureproben aber mit einer Markierungsart ausgeführt werden kann, wodurch Markierungsverfahren vereinfacht werden können und der Nachweis verschiedener Nucleinsäurearten einfach und wirksam ausgeführt werden kann.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer in einer Nucleinsäureprobe nachzuweisenden Nucleinsäure, mittels des Nachweises der Bildung eines hybriden Moleküls aus einer nachzuweisenden Nucleinsäure und einer Nucleinsäure-Sonde, entstanden durch Umsetzung zwischen der Nucleinsäureprobe und der Nucleinsäure-Sonde, wobei an die Nucleinsäureprobe eine für den Nachweis des Hybrids geeignete Markierung angebracht wird.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Nucleinsäure, nachzuweisen in einer Nucleinsäureprobe, folgende Schritte umfassend:

(a) Bereitstellung einer Nucleinsäure-Sonde, die ein Oligonucleotid mit einer Nucleotid-Kettenlänge aus 25 Basen oder weniger darstellt, geeignet zum Nachweis einer Punktmutation einer genetischen Krankheit, immobilisiert auf einem Träger;

(b) Markieren der Nucleinsäureprobe;

(c) Zugabe der markierten Nucleinsäureprobe zu der immobilisierten Nucleinsäure-Sonde;

(d) Nachweis der Punktmutation mittels Nachweises des Vorhandenseins der in der an die Nucleinsäure-Sonde gebundenen Nucleinsäureprobe nachzuweisenden Nucleinsäure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nachzuweisende Nucleinsäure einer Krankheit inhärente Sequenzen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus genetischer Krankheit, Krebs und Virusinfektionen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (a) ferner die Immobilisierung multipler Typen von Sonden an festgelegten Stellen auf dem Träger umfaßt.