DE69937447T2

DE69937447T2 - Verfahren zur erkennung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69937447T2
Application number: DE69937447T
Authority: DE
Inventors: Knut Rudi; Kjetill Sigurd Jakobsen
Original assignee: MATFORSK AS
Current assignee: Genetic Analysis AS
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-04-01
Publication date: 2008-08-21
Anticipated expiration: 2019-04-02
Also published as: JP4481491B2; CN1308685A; CA2325052C; ATE377091T1; EP1068352B1; US20040197794A1; EP1068352A2; NO20004962D0; WO1999050448A3; WO1999050448A2; AU769566B2; AU3338999A; CA2325052A1; JP2003516710A; CN100381576C; GB9807045D0; NO326359B1; DE69937447D1; NO20004962L; US6617138B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäurenachweisverfahren, im Besonderen quantitative Nukleinsäurenachweisverfahren.
Der Nachweis, insbesondere der quantitative Nachweis einer speziellen Nukleinsäuresequenz als ein Hinweis auf das Vorliegen eines Organismus, z. B. eines Pathogens in einer klinischen Probe oder einer Verunreinigung in einem Nahrungsmittel oder einer Umweltprobe, wie etwa Toxin-produzierende Cyanobakterien in Wasserquellen, oder von mRNA, um eine Veränderung in Transkriptionsgraden zu zeigen, ist ein wertvolles mikrobiologisches Werkzeug. Zusätzlich kann bei der diagnostischen oder forensischen Anwendung von Nukleinsäureanalyse oder bei der Untersuchung von Polymorphismen Volllängensequenzieren der Targetnukleinsäure unnötig sein, wenn der Nachweis einer Einzelbasevariation oder einer Nichtübereinstimmung ausreichend ist, um eine positive Identifizierung zu ergeben. Eine solche einzelne Basevariation oder Nichtübereinstimmung kann sich aus allelischer Variation oder Polymorphismus, einer Punktmutation, oder einer Deletion oder Insertion von genetischem Material ergeben, wobei der Nachweis einer einzelnen anormalen oder Spezies-spezifischen Base zu der erforderlichen Information führen wird.
Durch unsere Arbeit an der Entwicklung von Verfahren zum Nachweis von Bakterien in Wasser entwickelten wir ein neues Nukleinsäurenachweisverfahren, das geeignet ist für eine große Vielzahl von Anwendungen in den Bereichen der Umwelt, Landwirtschaft, Nahrungsmittel, Veteriniärbereichen, Gesundheits- und medizinischen Bereichen und tatsächlich als ein allgemeines Werkzeug in der Molekularbiologie.
Es gibt eine Vielzahl von Techniken, die zur Analyse von Nukleinsäuren verfügbar sind, einschließlich die Herstellung von synthetischen Oligonukleotidsonden, insbesondere markierten Sonden, zum Hybridisieren an Targetsequenzen; in vitro-Amplifikation von Targetnukleinsäuresequenzen durch PCR und andere damit in Beziehung stehende Amplifikationsverfahren und (automatisiertes) direktes DNA-Sequenzieren. Dies führte zu der Entwicklung von neuen Ansätzen zum Nachweis und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren beim Umweltmonitoring (Bej, A.K. und Mahbubani, M.H. [1994] in PCR Technology: Current Innovations, S. 327-339 und Bowman, J.P. und Sayler, G.S. [1996] in Molecular approaches to environmental microbiology, S. 63-97). Siehe auch Rudi, K. et al., Applied and Environmental Microbiology, S. 2593-2599, worin die Anwendung von Gruppen-spezifischen Primern für Microcystis-, Nostoc- und Planktothrix-Kategorien in PCR-Amplifikationsreaktionen in einem Protokoll zur Identifizierung dieser Gruppen in Umweltproben offenbart wird. Weder findet eine selektive Markierung der Primer statt oder wird nahegelegt noch werden mehrere Targetsequenzen in einer einzelnen Probe nachgewiesen. Es gibt drei Hauptstrategien zum Quantifizieren von amplifizierter DNA; d. h. Größentrennung durch Elektrophorese, Hybridisierung an Einfangsonden und Echtzeitnachweis. Die Probleme bei dem Gelelektrophoreseverfahren sind der Nachweis von mehreren Targets in einer einzigen Reaktion und die Interpretation der Ergebnisse. Größentrennungsnachweis von Mehrfachamplifikationen bzw. Multiplexamplifikationen ist ebenfalls schwierig zu erreichen, da die Amplifikationsverhältnisse von Ampliconen mit verschiedenen Größen von der DNA-Qualität abhängig sind.
Der Einfangsondenassay basiert auf Hybridisierung der vollständigen amplifizierten Fragmente. Offensichtlich ist dieser Hybridisierungsassay nicht geeignet zur Trennung und Quantifizierung von homologen Ampliconen, z. B. Produkten von kompetitiven Amplifikationen. Die verschiedenen Amplicone werden Sandwich-Hybridisierungen an den homologen Steilen bilden, was zum Einfangen von sowohl Target- als auch Nicht-Target-Fragmenten führt, selbst wenn die Einfangstelle diskriminierend ist.
Das ABI PRISM^TM 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer, Foster City, Kalifornien) liefert quantitative PCR-Amplifikationen in Echtzeit. Jedoch sind Mehrfach-Assays bzw. Multiplex-Assays begrenzt durch die Anzahl von Fluorochromen, die verfügbar sind, und ihre überlappenden Fluoreszenzspektren.
Es ist immer ein Ziel in den Nukleinsäurenachweisverfahren ihre Spezifität zu erhöhen, d. h. um nicht-spezifisches Binden oder Nachweis eines nicht-spezifischen Hintergrundsignals zu verringern. Ein gesondertes, jedoch damit verbundenes Ziel ist die Erhöhung der Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens, d. h. die Messung von sehr kleinen Mengen an Targetnukleinsäure zu erlauben.
Ugozzoli, L. et al. [1992], Genetic Analysis Techniques and Applications, Band 19(4), S. 107-112, offenbart die Verwendung von spezifischen Primern und Verlängerungsreaktionen unter Verwendung markierter Oligonukleotide in einem Verfahren zum Nachweis von einzelnen Polymorphismen in Nukleinsäuresequenzen. Dieses Verfahren weist als Herzstück die Verwendung von zweiteiligen Primern auf, wobei ein Abschnitt entwickelt ist zum Hybridisieren an eine Probensequenz und ein zweiter Abschnitt entwickelt ist, um an eine Eingangsequenz zu hybridisieren. Sequenzen, die charakteristisch sind für einen speziellen Organismus oder eine Gruppe von Organismen werden nicht nachgewiesen. Es würde ebenfalls einen wesentlichen Vorteil darstellen, wenn das Verfahren den Nachweis und die Quantifizierung von mehreren, vorzugsweise einer großen Anzahl, wie etwa 10 oder mehr, polymorphen Stellen in einer einzelnen Reaktion erlauben würde, z. B. den Nachweis und die Quantifizierung von mehreren verschiedenen Targetorganismen in einem einzelnen Multiplexassay erlauben würde.
Wir haben ein geeignetes Nachweisverfahren entwickelt, das eine gute Empfindlichkeit und Spezifität und die Fähigkeit zum Nachweis und Quantifizieren einer großen Anzahl von polymorphen Stellen in einer einzigen Reaktion bereitstellt. Im Besonderen stellen die Verfahren signifikante Vorteile gegenüber der Verwendung von Agarosegelelektrophorese oder direktem Nachweis der amplifizierten DNA bei der Quantifizierung dar.
Die Erfindung liefert daher ein Verfahren zum Nachweis mehrerer verschiedener Targetnukleotidsequenzen in einer Einzelprobe, worin jede Targetsequenz charakteristisch für einen speziellen Organismus oder eine spezielle Gruppe von Organismen ist, wobei das Verfahren zum Nachweisen jeder Nukleotidsequenz in einem Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) Binden einer Oligonukleotidsonde an das Nukleinsäuremolekül;
(b) selektives Markieren der gebundenen Oligonukleotidsonde in der Gegenwart der Targetnukleotidsequenz;
(c) Abtrennen der markierten Oligonukleotidsonde von dem Nukleinsäuremolekül durch Denaturierung;
(d) Hybridisieren des markierten Oligonukleotids an eine komplementäre Sequenz in der Gegenwart von beliebigen nichtmarkierten Oligonukleotiden aus der Markierungsreaktion; und
(e) nachfolgenden Nachweis der Markierung.

Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden beim Nachweis aller Targetnukleotidsequenzen, wie etwa DNA-Sequenzen, insbesondere DNA, die aus PCR-Amplifikationszyklen resultiert. Die DNA kann nativ sein oder kann cDNA, die aus mRNA durch reverse Transkriptase gebildet wurde, sein. Die DNA kann einzel- oder doppelsträngig, linear oder zirkulär sein. Die Targetnukleinsäure kann RNA, z. B. mRNA oder insbesondere ribosomale RNA, die in einer Zelle in mehreren Kopien vorliegt, z. B. 3.000–20.000 Kopien pro Zelle, sein.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann der Ausdruck „Nukleotidsequenz" eine „Sequenz" mit einer Länge von nur einem Nukleotid bedeuten, worin die Nukleinsäure, die von Interesse ist, sich nur durch ein Nukleotid von anderen (Nicht-Target) Sequenzen, die man nicht nachweisen will, unterscheidet, wie etwa im Falle des Nachweises einer Punktmutation oder eines Polymorphismus. Die Nukleotidsequenz, die nachzuweisen ist, ist charakteristisch für eine spezielle Nukleinsäure oder Gruppe von Nukleinsäuren oder einen speziellen Organismus oder eine Gruppe von Organismen, z. B. eine Spezies, worin es gewünscht ist, das Vorliegen dieses Targets (z. B. die Nukleinsäure/oder der Organismus) in einer Probe nachzuweisen, die eine Anzahl von verschiedenen Molekülen oder Organismen enthält, wie etwa beim Nachweis von speziellen Bakterien in z. B. einer klinischen oder Umweltprobe.
Die Oligonukleotidsonde kann 5 bis 50, vorzugsweise 10 bis 40, mehr bevorzugt 20 bis 30 Nukleotide umfassen. Die Sonde wird ausgewählt, um an die Targetnukleinsäure, nämlich das Nukleinsäuremolekül, das die Targetnukleotidsequenz enthält, zu binden. Das Oligonukleotid ist herkömmlicherweise ausreichend groß, um geeignete Hybridisierung an die Targetnukleinsäure bereitzustellen, dennoch sinnvoll kurz, um unnötige chemische Synthese zu vermeiden. Verfahren zur Oligonukleotidherstellung sind Standard in der Technik.
Wie oben diskutiert, kann die Targetnukleinsäure DNA, cDNA oder RNA sein. Die Oligonukleotidsonde wird entwickelt, um an eine Targetregion in dem Nukleinsäuremolekül zu binden, das die Targetnukleotidsequenz enthält. „Targetregion" bzw. „Zielregion" wird hier verwendet, um die Nukleinsäuresequenz zu bezeichnen, die an die Oligonukleotidsonde bindet.
Diese Targetregion kann in der Form einer Signatursequenz sein, die eine spezielle Nukleinsäure oder Gruppe von Nukleinsäuren oder Organismen usw. umfasst, oder kann der Abschnitt der Nukleinsäure sein, unmittelbar nachfolgend auf eine einzelne Baseposition, die von Interesse ist, wenn ein Polymorphismus, eine Punktmutation, Insertion oder Deletion nachzuweisen ist.
Es ist natürlich wünschenswert, dass die Targetregion an Nicht-Targetmolekülen in der Probe nicht vorliegt, um Selektivität zwischen Target- und Nicht-Targetnukleotidsequenzen einzuführen. Diese Spezifität der Bindung kann erreicht werden durch Einbauen von Regionen in die Sonde mit Komplementarität oder wesentlicher Komplementarität zu der gewünschten Targetregion und/oder Nichtübereinstimmungen mit Nicht-Targetsequenzen. Die Region der Komplementarität kann an terminalen oder internen Segmenten der Sonde oder an beiden vorliegen.
Herkömmlicherweise umfassen Nukleinsäurenachweisverfahren eine Markierung der Oligonukleotidsonde vor Hybridisierung an die Targetnukleinsäuresequenz. In unserem Verfahren jedoch ist die Markierung der Sonde abhängig von der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls, an welches die Sonde gebunden wird. In anderen Worten ist die Markierung der Sonde Templatsequenz-abhängig (d. h. Sequenz-spezifisch) – Einbau der Markierung wird nur in der Gegenwart einer gewünschten oder ausgewählten „Sequenz" in dem Targetmolekül auftreten, die in der Targetregion oder in der Targetnukleotisequenz selbst sein kann, oder sie wird selektiv auftreten, d. h. der Schritt des Markierungseinbaus in die Oligonukleotidsonde kann diskriminierend sein (d. h. basierend auf einem „Minisequenzierungsprinzip"). Dies führt zu einer zusätzlichen Selektivitätsdimension (Spezifität) für das Verfahren; Oligonukleotidsondenbindung wird anfangs diskrimiert gegen Nicht-Targetnukleinsäure, jedoch etwas Bindung an Nicht-Targetsequenzen ist zu erwarten. Wenn Sonde selbst vor dem Binden markiert wird, dann wäre die weitere Diskriminierung nicht möglich.
Die vorliegende Erfindung fügt auf der anderen Seite einen Selektivitätsschritt (Sequenz-spezifisch) hinzu, durch Einbau einer Markierung, in der Gegenwart der Targetnukleotidsequenz, in die Oligonukleotidsonde. Diese Selektivität kann z. B. erreicht werden indem die Markierung nur eingebaut wird wenn die Targetnukleotidsequenz vorliegt oder durch Einbau der Markierung auf eine selektive oder diskriminierende Art, sodass die Targetnukleotidsequenz diskriminiert werden kann, oder beides.
Herkömmlicherweise kann selektive Markierung erreicht werden unter Verwendung markierter Nukleotide, d. h. durch Einbau (oder Nicht-Einbau) in die Oligonukleotidsonde eines Nukleotids, das eine Markierung trägt. In anderen Worten ausgedrückt, kann selektive Markierung auftreten durch Kettenverlängerung Oligonukleotidsonde, unter Verwendung eines Polymeraseenzyms, das ein markiertes Nukleotid einbaut. Im Falle eines RNA-Targets wird die Polymerase ein reverse Transkriptase-Enzym sein. Bedingungen für Kettenverlängerung bzw. Kettenextension (d. h. Baseeinbau) und geeignete Polymeraseenzyme sind in der Technik allgemein bekannt und in der Literatur viel beschrieben.
Selektive Markierung des Oligonukleotids wird vorzugsweise durch Einbau eines markierten Dideoxynukleotids erreicht.
Der Ausdruck Dideoxynukleotid, wie er hier verwendet wird, umfasst alle 2'-Deoxynukleotide, worin die 3'-Hydroxylgruppe nicht vorliegt oder modifiziert ist, und daher, während es an die Oligonukleotidsonde addiert werden kann in der Gegenwart einer Polymerase, es nicht in der Lage ist in eine nachfolgende Polymerisationsreaktion einzutreten. Dies bedeutet, dass nur eine Base an die Sonde addiert werden kann.
Kettentermination auf diese Art erlaubt es, dass die Reaktion gesteuert wird und gegebenenfalls der Assay quantifiziert wird (siehe später).
Vorteilhafterweise, wie oben beschrieben, umfasst die vorliegende Erfindung Kettenverlängerung der Oligonukleotidsonde, um eine Markierung einzubauen. Die vorliegende Erfindung erlaubt es, dass selektive Markierung erreicht wird, sowohl durch Einbau eines markierten Nukleotids auf eine selektive Art (d. h. Diskriminieren auf der Basis der Markierung, entweder Vorliegen oder Fehlen, oder durch selektiven Nachweis einer speziellen Markierung) oder durch Nukleotideinbau auf eine selektive Art, sodass Einbau eines Nukleotids (entweder markiert oder nichtmarkiert) nur in der Gegenwart der Targetnukleotidsequenz auftritt (oder genauer gesagt, dass die Effizienz des Einbaues stark verringert ist, wenn die Targetnukleotidsequenz nicht vorliegt) (d. h. Diskriminieren auf der Basis von Nukleotideinbau oder Nichteinbau) oder beides.
Als ein Beispiel eines solchen Verfahrens, wenn die Targetsequenz eine Schlüsseldifferenzierungsbase ist, z. B. wenn die Base in dem Nukleinsäuremolekül unmittelbar benachbart zu der Targetregion ist, an welche die Sonde bindet, ein Cytosinrest ist, dann würde markiertes Dideoxyguanidintriphosphat (ddGTP) an das Reaktionsgemisch zum Einbau addiert werden. Wenn die Sonde an die Nukleinsäure an einer Nicht-Targetsequenz gebunden hat, dann ist es unwahrscheinlich, dass das nächste Nukleotid das gleiche ist wie die Schlüsselbase und es ist unwahrscheinlich, dass das markierte ddGTP in das Oligonukieotid eingebaut wird, d. h. Einbau des Oligonukleotids findet nur statt (oder weitgehend oder im Wesentlichen nur) in der Gegenwart von Target. Das obige Verfahren der Differenzierung ist mutatis mutandis geeignet, wenn die Schlüsselbase Guanidin, Adenin, Thymin oder Uracil ist.
Um die Wahrscheinlichkeit von Falscheinbau des markierten Dideoxynukleotids weiter zu reduzieren, können nichtmarkierte Dideoxynukleotidtriphosphate auch zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden. Unter Verwendung des obigen Beispiels, worin markierte ddGTP addiert wird, würden nichtmarkierte ddCTP, ddATP und ddTTP addiert werden (worin das Targetnukleinsäuremolekül DNA ist). Wenn nur ein ddNTP vorliegt, dann kann trotz der Regeln der Basepaarung ein Risiko bestehen, dass es eingebaut wird wo die Schlüsselbase nicht sein natürliches Basepaar ist, wenngleich mit einer geringen Häufigkeit. Dies kann ein Hintergrund- oder Rauschsignal in dem Assay bewirken. Die Einbeziehung der anderen ddNTPs bedeutet, dass diese bevorzugt eingebaut werden, entsprechend den normalen Regeln der Basepaarung (C-G und A-T/U) und Falscheinbau des markierten ddNTP signifikant verringert ist. Die Verwendung von nicht-markierten ddNTPs umfasst daher eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Selektivität der Markierungsreaktion kann weiter erhöht werden durch Einbau von Nichtübereinstimmungen unmittelbar oberstromig der Schlüsselbase. So wird die Oligonukleotidsonde mit einer Nichtübereinstimmung oder Nichtübereinstimmungen am 3'-Ende an Nicht-Targetnukleotidsequenzen entwickelt und das Vorliegen des/der Nichtübereinstimmungen) wird die Wahrscheinlichkeit einer Oligonukleotidverlängerung verringern. Daher ist selbst wenn die nächste Base nach dem Ende des gebundenen Oligonukleotids zufällig die gleiche wie die Schlüsselbase ist, der Einbau von markiertem ddNTP in Nichttargetsequenzen verringert, wenn eine vorausgehende Nichtübereinstimmung zwischen der Sonde und der Nukleinsäure, an welche sie gebunden hat, vorliegt.
Eine große Anzahl geeigneter Markierungen und Markierungsverfahren ist in der Technik bekannt und in der Literatur beschrieben. Jede beliebige nachweisbare oder Signal-erzeugende Markierung oder jedes beliebige Reportermolekül kann verwendet werden. Geeignete Markierungen umfassen colorimetrische, chemilumineszente, chromogene, radioaktive und fluoreszente Markierungen, jedoch können enzymatische Markierungsverfahren oder Markierungsverfahren, die auf Antikörper basieren, oder Signal-erzeugende Systeme auch verwendet werden. So umfasst der Ausdruck „Markierung" wie er hier verwendet wird, nicht nur direkt nachweisbare signalgebende Reste, sondern auch jeden beliebigen Rest, der ein Signal erzeugt oder teilnimmt an einer Signalerzeugungsreaktion. Fluorescein oder andere fluoreszent markierte ddNTPs sind besonders geeignet, welche direkten Nachweis durch Fluoreszenz oder indirekt durch Antikörperwechselwirkungen erlauben. Diese sind kommerziell erhältlich von z. B. NEN/Dupont. ddNTPs können markiert sein z. B. durch [³⁵S], [³H] oder [³²P], wie in Syvänen, A.C., et al., Genomics 8, [1990], 684-692, beschrieben.
Zum Erhöhen der Empfindlichkeit kann mehr als ein Markierungsschritt durchgeführt werden. In anderen Worten ausgedrückt, kann der selektive Markierungsschritt ein oder mehrfach wiederholt werden, d. h. zyklisch durchgeführt werden. Eine Erhöhung der Anzahl von Zyklen erhöht die Empfindlichkeit und ebenfalls, wenn der Assay quantiativ durchgeführt wird (siehe unten), den quantitativen Bereich des Verfahrens, durch Verbessern der Markierungssättigung der Sonden. Zum Erleichtern von zyklischem Markieren kann ein thermostabiles Polymeraseenzym in dem Markierungs-Einbauschritt verwendet werden. Herkömmlicherweise kann die Anzahl von Zyklen des selektiven Markierungsschritts von 1 bis 50 sein, z. B. 1 bis 30, jedoch kann dies wahlweise variiert werden. Eine geeignete oder passende Anzahl von Zyklen für ein gegebenes System kann durch Routineversuche bestimmt werden.
Minisequenzierungsverfahren zum Nachweisen mehrerer einzelner Nukleotidpolymorphismen sind bekannt, welche Einzelnukleotidverlängerungsreaktionen mit fluoreszent markierten Dideoxynukleotiden umfassen (Pastinen, T. et al., Clinical Chemistry (1996), Band 42, 9, 1391-1397). In diesem Falle wurden die Miniequenzierungsreaktionsprodukte durch Gelelektrophorese analysiert. Im Gegensatz hierzu umfasst die vorliegende Erfindung eine Hybridisierungsreaktion zwischen dem markierten Oligonukleotid und seiner komplementären Nukleinsäuresequenz vor Nachweis und Analyse.
So wird unter Befolgung des (der) selektiven Markierungsschrittes(-schritte) die markierte Oligonukleotidsonde hybridisiert an eine komplementäre Nukleotidsequenz in der Gegenwart von einem beliebigen nichtmarkierten Oligonukleotid der Markierungsreaktion. Im Allgemeinen umfasst dies die Abtrennung der markierten Oligonukleotidsonde von dem vorhergehenden Reaktionsgemisch. Markierungseinbau durch Einbau eines markierten Nukleotids führt zu der so markierten Oligonukleotidsonde, hybridisiert an das Targetnukleinsäuremolekül. Strangtrennung zum Abtrennen der Sonde kann erreicht werden unter Verwendung von Denaturierungsverfahren, die in der Technik üblich sind, z. B. Hochtemperaturerhitzen, Behandlung mit hohem pH-Wert (Alkali) usw. Schritt (d), Hybridisierung an eine Sequenz, die komplementär zu der Sonde ist, kann dann stattfinden. Diese „komplementäre Sequenz" gemäß der Erfindung kann jede beliebige Nukleotidsequenz sein, die eine Region mit absoluter oder wesentlicher Komplementarität zu der Sonde enthält oder umfasst, sodass Bindung der Sonde an die „komplementäre Sequenz" auftreten kann. Die komplementäre Sequenz kann DNA oder eine Modifikation davon sein, wie etwa PNA. Vorteilhafterweise kann die komplementäre Sequenz die Form des Komplements der Sonde annehmen (d. h. eine Sequenz, die vollständig komplementär zu der Sonde ist). Es versteht sich jedoch, dass dies nicht absolut essenziell ist, und dass das „Komplement" in einer längeren Sequenz enthalten sein kann, partiell oder verkürzt sein kann, und/oder eine Sequenzvariation (d. h. weniger als perfekte Komplementarität) enthalten kann, solange die Bindung der Sonde an die „komplementäre Sequenz" weiter auftreten kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die komplementäre Sequenz immobilisiert auf einem festen Träger. Geeignete immobilisierende Träger, an welche die Komplemente gebunden werden können, sind in der Technik bekannt und umfassen jeden beliebigen der allgemein bekannten Träger oder Matrizes, die derzeit allgemein verwendet oder vorgeschlagen werden zur Immobilisierung, Separierung usw. Diese können in der Form von Teilchen, Folien, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern, Kapillaren, Chips oder Mikrotiterstreifen, Rohren bzw. Schläuchen, Platten oder Vertiefungen usw. sein. Verfahren zum Immobilisieren oder Binden von Oligonukleotiden an feste Träger sind gleichermaßen in der Technik bekannt. Besonders bevorzugt sind Membranstreifen (kommerziell erhältlich von NEN und bekannt als GeneScreen), auf welche die komplementären Sequenzen punktförmig aufgetragen und dann durch UV quervernetzt werden können, oder DNA-Chips (Mikrochips, Glaschips), die derzeit üblich in den Molekularbiologieverfahren sind. Die Verwendung solcher fester Träger, insbesondere Chips, die ein Oligonukleotidarray bzw. eine Oligonukleotidanordnung, d. h. eine Anzahl z. B. bis zu 250, verschiedener Oligonukleotide tragen können, die komplementär zu den Oligonukleotidsonden sind, die in dem früheren Teil des Assays verwendet werden, stellen eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Der Hybridisierungsschritt (d) erlaubt die quantitative Abtrennung der markierten Sonden. Dies ist vorteilhaft im Zusammenhang mit einem quantitativen Assay.
Nachfolgend auf den Hybridisierungsschritt wird die Markierung auf der Oligonukleotidsonde nachgewiesen. Wie oben im Zusammenhang mit der Markierung angeführt, kann der Nachweis jedes beliebige Mittel sein, das in der Technik bekannt ist, abhängig von der ausgewählten Markierung. Signalamplifikation kann ebenfalls verwendet werden, falls dies gewünscht ist, wie in der Technik beschrieben (siehe z. B. P. Komminoth und M. Werner, Target and Signal Amplification, approaches to increase the sensitivity of in situ hybridisation, 1997, Histochem. Cell Biol. 108: 325-333). Der Nachweis kann auch qualitativ oder quantitativ oder halb-quantitativ sein. So kann z. B. ein visuelles, z. B. kolorimetrisch, chromogenes, fluoreszentes oder ein anderes nachweisbares Signal von der Markierung verwendet werden, um eine einfache Ja- oder Nein-Angabe des Vorliegens oder des Fehlens der Targetnukleotidsequenz bereitzustellen. Vorteilhafterweise jedoch ist der Nachweis so, um eine quantitative Beurteilung der Menge an Targetnukleotid, die in der Probe vorliegt, zu ergeben. Dies kann eine absolute Angabe der Menge an Target, die vorliegt oder eine andere quantitative oder semi-quantitative Angabe sein, z. B. ein Prozentanteil, Verhältnis oder eine ähnliche Angabe, z. B. relativ zu der gesamten Nukleinsäure in der Probe.
Quantifizierung der Targetnukleotidsequenz kann weiter korreliert werden mit einer Quantifizierung der Anzahl von Organismen oder Zellen, die das fragliche Target enthalten. So liefert die Erfindung in weiteren Hinsichten Verfahren zum Bestimmen der Menge einer Targetnukleotidsequenz oder der Anzahl von Zellen, die eine Targetnukleotidsequenz enthalten, unter Verwendung des Nukleinsäurenachweisassays, der hier zuvor beschrieben wurde.
Wie oben angeführt, kann die Targetnukleinsäure jedes beliebige DNA- oder RNA-Molekül sein. Es kann so direkt die Nukleinsäure einer Targetzelle oder eines Targetorganismus sein. Es kann jedoch wünschenswert sein, die Nukleinsäure vor einem Nachweis zu Amplifizieren, unter Verwendung des Assayverfahrens der Erfindung, und vorteilhafterweise kann so die Targetnukleinsäure ein Amplicon einer in vitro-Amplifikationsreaktion sein. Amplifikation kann jedoch auch durch andere Mittel erfolgen, einschließlich in vivo-Klonierungsverfahren. Jedes beliebige Verfahren einer in vitro-Amplifikation kann verwendet werden, einschließlich sowohl lineare als auch exponenzielle Verfahren. Beispielhafte Verfahren umfassen somit PCR, NASBA und Ligasekettenreaktion. Aufgrund ihrer Vorteilhaftigkeit werden allgemein PCR und ihre Varianten das Verfahren der Wahl sein.
Im Zusammenhang mit einem quantitativen Assay kann ein quantitatives in vitro-Amplifikationsverfahren kombiniert werden mit dem Nachweisverfahren der Erfindung. Im Speziellen geht in einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren der vorliegenden Erfindung dem Oligonukleotidsonde-Bindungsschritt eine kompetitive PCR-Reaktion voraus. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren der kompetitiven PCR und sie sind in der Literatur beschrieben. Jede der bekannten Techniken kann verwendet werden. (Für eine Übersicht siehe z. B. Strebert, P. D. und Larrick, J.W. [1992] Nature, 369, 557-558).
In solch einem Verfahren wird Nukleinsäure, die die Targetnukieotidsequenz enthält, coamplifiziert mit einem ausgewählten Kompetitormolekül, das die gleichen Primertemplatsequenzen enthält wie das Targetmolekül und so konkurriert der Kompetitor mit dem Target um PCR-Primerbindung und Amplifikation. Der Kompetitor umfasst ein Mittel zur Differenzierung von dem Target, vorteilhafterweise eine Erkennungssequenz zum Binden an eine Kompetitor-spezifische Oligonukleotidsonde, analog der „Target-spezifischen Oligonukleotidsonde", die im Zusammenhang mit dem Nachweisassay oben beschrieben ist (d. h. die Sonde von Schritt (a) oben). Die Erkennungssequenz ist somit analog zu der „Targetregion" der obigen Oligonukleotidsonde. Eine einzelne bekannte Menge Kompetitor kann zugegeben werden zum Vergleich mit einer Standardkurve, oder es kann eine Reihe von Amplifikationen durchgeführt werden, unter Verwendung variierender Mengen von Kompetitor, z. B. eine Verdünnungsreihe. Primer, die komplementär sind zu Sequenzen, die die Targetnukleotidsequenz in dem Nukleinsäuremolekül das von Interesse ist, flankieren (und zu den gleichen Sequenzen in dem Kompetitor) werden zugegeben und PCR-Amplifikation wird durchgeführt. Kompetitive PCR ermöglicht es, dass der Nachweis mit einer eingebauten Referenz durchgeführt wird, um eine genauere Analyse der Ergebnisse bereitzustellen. Eine Standardkurve kann konstruiert werden unter Verwendung von Standardtechniken, die in der Technik üblich sind.
In einem solchen kompetitiven PCR-Schritt werden Amplikone produziert, die von sowohl Target- als auch Kompetitor-DNA stammen. Das Kompetitor-Amplikon wird einem Nachweisassayverfahren auf eine analoge Art wie das Target-Amplikon, wie oben beschrieben, unterzogen. Die amplifizierte Kompetitor-Sequenz umfasst eine bekannte Erkennungssequenz, die sich beim Nachweis gleichartig verhält wie die Targetregion in dem Targetnukleinsäuremolekül. Zum Beispiel wird eine Oligonukleotidsonde, die selektiv an diese Erkennungsregion des Kompetitors bindet, zu dem Reaktionsgemisch zur gleichen Zeit gegeben wie die Sonde für die Targetregion des Targetmoleküls zugegeben wird, wobei beide Oligonukleotide entwickelt sind, um einzelne Basen zu sein, verlängert mit einer markierten ddNTP beim Binden an ihre jeweiligen Targetsequenzen. Eine komplementäre Sequenz zu der Kompetitoroligonukleotidsonde, die markiert worden ist nachfolgend auf Bindung an den Kompetitor, wird ebenfalls bereitgestellt, vorzugsweise immobilisiert, und die markierte Oligonukleotidsonde hybridisiert an diese komplementäre Sequenz vor dem Nachweis. Diese Markierungen der Target- und Kompetitoroligonukleotide können dann nachgewiesen werden und im Speziellen die relativen Stärken des gemessenen Signals verwendet werden, um die Menge an Targetnukleinsäure zu beurteilen, die in der ursprünglichen Probe vorlag, bei Kenntnis der bekannten Menge von zu dem System zugegebenen Kompetitor. Dieser Aspekt der Erfindung ist in 1 dargestellt. Es ist nicht erforderlich, dass die Markierung für den Kompetitor und die Targetsequenz verschieden sind, tatsächlich sind sie vorzugsweise gleich. Differenzierung zwischen Kompetitor und Target, wie zwischen mehreren verschiedenen Targetsequenzen, wird vorzugsweise räumlich erreicht; die Position der komplementären Sequenz zu jeder Oligonukleotidsonde auf z. B. dem Mikrochip-Array, ist bekannt und die Stärke des Signals an jeder Position wird gemessen.
Titrationsversuche können verwendet werden zum Bestimmen der optimalen Menge an Kompetitor, die in einem beliebigen speziellen Assay zu verwenden ist, wie in den folgenden Beispielen beschrieben. Die ausgewählte Menge Kompetitor erlaubt vorzugsweise einen Nachweis einer geringen Häufigkeit von Targetnukleinsäuremolekülen und reproduzierbaren Amplifikationen. Geeignete Konzentrationen können variieren von 6 × 10^–8 bis 6 × 10^–10 pmol, vorzugsweise von 4 × 10^–9 bis 8 × 10^–9 pmol.
Vorzugsweise werden ausreichend PCR-Zyklen durchgeführt, sodass ein Sättigungsgrad erreicht wird; auf diese Art weist die amplifizierte DNA im Wesentlichen das gleiche Verhältnis von Target-DNA bis zu Kompetitor-DNA auf, wie dasjenige, das vor PCR vorliegt.
Es ist vorteilhaft Bedingungen vorzusehen, sodass die Kompetitor- und Target-DNA gleich effizient durch PCR amplifiziert werden, und es ist daher wünschenswert, dass die Größe und der GC-Gehalt von jedem Fragment im Wesentlichen gleichgehalten wird. in einigen Fällen wird es ebenfalls erforderlich sein, die Effizienz der Zelllyse der Probe zu berücksichtigen, was einiges der genomischen DNA weniger verfügbar für die PCR machen kann. Zusätzlich kann die Target-DNA ein Teil der chromosomalen DNA in den Anfangszyklen sein, während die Kompetitor-DNA z. B. in der Form eines kleinen Plasmids sein kann. So kann es erforderlich sein, eine Einstellung hinsichtlich der relativen Amplifikationseffizienzen dieser frühen PCR-Zyklen vorzunehmen.
Alternative Amplifikationsstrategien können auch in dieser Hinsicht der Erfindung verwendet werden, z. B. NASBA und Ligasekettenreaktion.
Jede geeignete Polymerase kann verwendet werden, wenngleich es bevorzugt ist, ein thermophiles Enzym, wie etwa Taq-Polymerase, zu verwenden, um das wiederholte Temperaturzyklisieren zu erlauben, ohne weitere Polymerase, z. B. Klenow-Fragment, in jedem Zyklus zuzugeben.
Wie oben angeführt, kann die Targetnukleinsäure cDNA, synthetisiert aus mRNA in der Probe, sein, und das Verfahren dieser Erfindung ist daher anwendbar zur Diagnose auf der Basis von charakteristischer mRNA. Eine solche vorausgehende Synthese kann durchgeführt werden durch eine vorausgehende Behandlung mit einer reversen Transkriptase, vorteilhafterweise in dem gleichen System von Puffern und Basen, die in den nachfolgenden Amplifikations-(z. B. PCR)-Schritten zu verwenden sind. Da das PCR-Verfahren Erwärmen erfordert, um Strangtrennung zu bewirken, wird die reverse Transkriptase in dem ersten PCR-Zyklus inaktiviert. Wenn mRNA die Targetnukleinsäure ist, kann es vorteilhaft sein, die Ausgangsprobe einer Behandlung zu unterziehen mit einem immobilisierten PolydT-Oligonukleotid, um sämtliche mRNA zu gewinnen, über die terminalen PolyA-Sequenzen davon. Alternativ kann eine spezifische Oligonukleotidsequenz verwendet werden, um die RNA über eine spezifische RNA-Sequenz zu gewinnen. Das Oligonukleotid kann dann als ein Primer für cDNA-Synthese dienen, wie in der internationalen Patentanmeldung WO-A-90/11446 beschrieben.
Die PCR (oder andere in vitro)-Amplifikation von Target- und Kompetitor-Nukleinsäure liefert einen ersten Grad an Spezifität, jedoch ein geringer Grad von Nicht-Target/Nicht-Kompetitor-Molekülen kann in dieser Reaktion amplifiziert werden, daher basiert die selektive Markierung der Oligonukleotidsonden auf Signatursequenzen in den Target- und den Kompetitor-Amplikonen entsprechend der vorliegenden Erfindung. Die Quantifizierung basiert auf dem Signalverhältnis von Target zu Kompetitor alleine und wird nicht beeinflusst durch irgendwelche Nicht-Target/Nicht-Kompetitor-Moleküle, die in der ersten Reaktion amplifiziert worden sein können.
Wenn der Hauptnachweisassay auf einen PCR- oder einen anderen in vitro-Amplifikationsschritt, der auf Kettenverlängerung basiert, folgt, dann ist es notwendig, die dNTPs von den vorhergehenden Reaktionen abzutrennen, z. B. in dem PCR-Produkt, oder sie zu inaktivieren, um sicherzustellen, dass sie nicht involviert sein können in einer nachfolgenden Verlängerung bzw. Elongation der Oligonukleotide, die gebunden sind an Target/Kompetitor-Nukleinsäure anstelle der terminierenden ddNTPs. Physikalische Abtrennung der dNTPs von dem PCR-Produkt ist z. B. möglich durch Gelelektrophorese, Präzipitation, Affinitätsreinigung, Chromatographie oder Filtration. Jedoch ist es bevorzugt, die dNTPs durch Entfernen der reaktiven Phosphatgruppen durch eine Phosphatase zu inaktivieren, sodass die Nukleotide nicht länger verwendet werden können für signifikante Kettenverlängerungen.
Targetnukleinsäure zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung kann erhalten werden oder hergestellt werden durch jede beliebige zweckmäßige Technik aus dem Stand der Technik. Viele verschiedene Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren aus Zellen und Organismen sind in der Literatur beschrieben und jede von diesen könnte verwendet werden.
Zum Beispiel sind Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäure aus Umweltproben beschrieben von Bowman, J.P. und Sayler, G.S. in Molecular Approaches to Environmental Microbiology (1996), S. 63-97. Jedoch kombiniert eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein oben beschriebenes Nachweisverfahren mit dem Festphaseverfahren für kombinierte Zell- und Nukleinsäureisolierung, wie von uns in Rudi et al., Appl. Environ. Microbiol. (1998), 64(1), S. 34-77, beschrieben.
Das Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäure aus einer Probe von Zellen, das in dieser Veröffentlichung beschrieben ist, umfasst:

(a) Binden von Zellen in der Probe an einen festen Träger, um die Zellen von der Probe zu isolieren;
(b) Lysieren der isolierten Zellen; und
(c) Binden von Nukleinsäure, die von den lysierten Zellen freigesetzt wurde, an den festen Träger.

Die gebundene Nukleinsäure kann direkt in einem Nachweisassay der Erfindung verwendet werden oder sie kann von dem Träger freigesetzt werden.
Der Nachweisassay der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise Anwendung finden in jedem beliebigen Verfahren, worin es gewünscht ist, Nukleinsäuren nachzuweisen, z. B. in jedem beliebigen Verfahren, das auf DNA- oder RNA-Identifikation beruht, z. B. Diagnose, Nachweis von Infektionen oder verunreinigenden Organismen oder Pathogenen, klinisches Monitoring, Forensiken, Lebensmittel- und Umweltsicherheit und Monitoring, oder zum Unterscheiden zwischen verschiedenen Zellen oder Zelltypen, Mutationsnachweis, Analyse von Polymorphismen, z. B. beim Gewebetypisieren usw., und als allgemeines Molekularbiologiewerkzeug. Der komplette, auf Nukleinsäure basierende Assay, der Probenvorbereitung, DNA-Amplifikation, selektive Markierung und Nachweis umfasst, ist von besonderem Vorteil beim Quantifizieren der Menge von Toxin-produzierenden Cyanobakterien in Wasserquellen. Dieses kombinierte Isolierungs- und Nachweisverfahren umfasst eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Der Assay liefert eine geringere Nachweisgrenze von 200, vorzugsweise 100 Zellen/ml (von einem speziellen Cyanobakterium gegen einen Hintergrund von 10⁵ Zellen/ml anderer Cyanobakterien) und einen quantitativen Bereich von mehr als drei Größenordnungen. Die Verfahren, die im Prinzip oben und detaillierter unten beschrieben sind, sind geeignet zur Automatisierung, wobei die Mittel zur Entwicklung von Hochleistungssystemen für Routine-Umweltmonitoring bereitgestellt werden.
Zum Beispiel haben Wasserbluüten, die durch Cyanobakterien gebildet werden, eine relativ hohe Toxizitätshäufigkeit (zwischen 25 und 70%) und bilden ein potenzielles Gesundheitsrisiko für den Viehbestand und Menschen. Dies ist besonders der Fall für Blüten von Cyanobakterien, die zur Gattung Microcystis gehören. Spezien dieser Gattung können mehrere Toxine produzieren, wobei die hepatotoxischen Microsystine die am meisten potenten sind. Es wäre daher wünschenswert, wenn ein Verfahren entwickelt werden könnte, das einen verlässlichen, schnellen und vorteilhaften Weg zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Bakterien bereitstellen würde.
Die Verfahren der Erfindung sind in dieser Hinsicht besonders geeignet, da durch Selektion von Oligonukleotiden auf Signatursequenzen innerhalb des Genoms von verschiedenen interessierenden Bakterien, eine einzelne Probe analysiert werden kann in einem Verfahren auf mehrere verschiedene Mikroorganismen. Signatursequenzen für verschiedene Bakteriengruppen sind allgemein bekannt und in der Literatur veröffentlicht, wobei für Cyanobakterien ein Klassifizierungssystem verwendet werden kann, das auf einer 16S rDNA-Sequenzinformation basiert (siehe z. B. J.R. Marchesi, T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom und W.G. Wade, 1998, Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rNA, Appl. Environ. Microbiol. 64: 795-799; Turner, S. (1998) Origins of algae and their plastids, S. 13-53, Hrsg. Bhattacharya, D. NY: Springer-Verlag und Giovanni, S.J., Turner, S., Olsen, G.J., Barns, S., Lane, D.J. und Pace, N.R. (1988) J. Bacteriol 170 S. 3584-3592).
Die folgenden Beispiele beschreiben einen voll integrierten Assay zur Analyse komplexer Cyanobakteriengruppen. Die Verfahren der Erfindung sind gleichermaßen geeignet zur Verwendung bei der Untersuchung anderer mikrobieller Gruppen.
Komplementäre Sequenzen zu den verschiedenen markierten Oligonukleotiden können auf einem einzelnen Mikrochip auf eine vorbestimmte Art angeordnet werden, um Quantizifierung der Gehalte verschiedener Bakterien zu erlauben, vorzugsweise durch Vergleich des Verhältnisses von Kompetititorsignal zu dem Signal für jede Bakteriengruppe. Solche quantitativen Multiplexassays verwenden vorzugsweise hochdichte Oligonukleotidarrays, immobilisiert auf Glaschips, mit nachfolgendem direkten Nachweis der Fluoresceinmarkierung (siehe z. B. Schena, M. et al., Science, (1996) 270: 467-470; und R.J. Lipshutz, D.M. Morris, M. Chee, E. Hubbell, M.J. Kozal, N. Shah, N. Shen, R. Yang und S.P. A. Fodor. Using oligonucleotide probe arrays to access genetic diversity, Bio Techniques 19: 442-447).
Die Erfindung umfasst auch Kits zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Diese werden normalerweise mindestens die folgenden Komponenten enthalten:

(a) Oligonukleotidsonden, die in der Lage sind zum Binden an Targetnukleinsäuremoleküle, die Targetnukleotidsequenzen enthalten, worin jede Targetsequenz charakteristisch für einen speziellen Organismus oder eine spezielle Gruppe von Organismen ist,
(b) Mittel zum selektiven Markieren der Oligonukleotidsonden; und
(c) Nukleotidsequenzen, die komplementär zu den Oligonukleotidsonden sind. Vorzugsweise sind die Nukleotidsequenzen, die komplementär zu den Oligonukleotidsonden sind, immobilisiert auf einem festen Träger.

Die Mittel zum selektiven Markieren werden vorteilhafterweise ein Polymeraseenzym und mindestens ein markiertes Nukleotid umfassen, vorzugsweise ein markiertes ddNTP, worin optional entsprechende unmarkierte Nukleotide auch vorliegen.
Die oben beschriebene Erfindung wird nun durch die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele im Bereich des Cyanobakteriennachweises unter Bezugnahme auf die Zeichnungen veranschaulicht, worin:
1 eine schematische Darstellung des quantitativen Markierungsassays ist. Eine bekannte Konzentration von Kompetitor-DNA wurde zugegeben zu dem gereinigten Target und coamplifiziert mit dem gleichen Primerpaar (A). Zwei Oligonukleotide, eines komplementär zu einem internen Segment des Kompetitors und eines komplementär zu einem internen Segment des Targets, wurden Sequenz-spezifisch verlängert durch ein Fluorescein-markiertes Dideoxycytosin durch Thermozyklisieren (B). Die markierten Primer wurden dann an ihre immobilisierten Komplemente hybridisiert (C). Schließlich wurde ein chromogener Nachweis der Markierung durchgeführt (D) und die relativen Signalintensitäten bestimmt.
2(A) zeigt Gelergebnisse von einer kompetitiven PCR auf Verdünnungsreihen von DNA, isoliert von Microcystis aeruginosa NIVA-CYA 43 bp
(B) zeigt die Ergebnisse der Markierungsassays,
(C) ist ein Graph, der die Intensitäten der Targetsignale relativ zu den Gesamtsignalintensitäten zeigt.
Die Assays wurden an Verdünnungsreihen von gereinigter DNA durchgeführt. Die Menge an DNA ist angegeben als genomische Kopien (unter der Annahme eines Gewichtes der genomischen Kopie von 5 fg). In Abbildung A wurden 10 μl der Produkte von der kompetitiven PCR-Reaktion in jeder Bahn aufgebracht auf einem 1,5% Agarosegel (enthaltend 30 μg/ml Ethidiumbromid) und einer Elektrophorese unterzogen unter Verwendung von 1 × TBE bei 100 Volt für 1 Stunde. Die Produkte wurden sichtbar gemacht durch UV-Transillumination. Der Markierungsassay, der in Abbildung B gezeigt wird, wurde wie in den Beispielen beschrieben, durchgeführt. In Abbildung C wurden die Signalintensitäten (gemessen als der Unterschied in dem mittleren Pixelwert in einer 8 bit-Grauskala, zwischen dem Signal und dem Hintergrund) für das Target in Abbildung A gemessen relativ zu den Gesamtsignalintensitäten von sowohl dem Target als auch dem Kompetitor (•). Entsprechende Werte für den Markierungsassay in Abbildung B sind ebenfalls gezeigt (
). Die Bilder wurden aufgenommen mit einer Cohu High Performance CCD-Kamera (Cohu Hochleistungs CCD-Kamera) und auf einem Digitalfarbdrucker gedruckt (Mavigraph UP-D15000NE. Sony, Japan).
3 ist ein Graph, der den Prozentanteil der Signalintensitäten für die Target-Flecken relativ zu den Gesamtsignalintensitäten zeigt, mit einem Mittelwert für alle Versuche und Fehlerbalken für Standardabweichung (3 Freiheitsgrade). Kompletter Assay mit 6 × 10^–9 pmol Kompetitor auf Verdünnungsreihen von Microcystis aeruginosa NIVA-CYA 43 in verschiedenen wässrigen Umgebungen. Die Zellen wurden verdünnt in sterilem Wasser, Wasser, das Anabaena Lemmermannii NIVA-CYA 83/1 (10⁵ Zellen/ml) enhält, Wasser, das Planktothrix agardhii NIVA-CYA 29 (10⁵ Zellen/ml) enthält und in Wasser vom See Akersvatnet, Norwegen (entnommen am 30. Mai 1996). Der komplette Assay, einschließlich Festphasezelikonzentration und DNA-Reinigung, wurde durchgeführt wie in den Beispielen beschrieben.
4(A) zeigt die Ergebnisse des Markierungsassays nachfolgend auf Festphasezellkonzentration und DNA-Reinigung, wie in den Beispielen beschrieben. Der komplette Assay mit 6 × 10^–8 pmol Kompetitor an Verdünnungsreihen von Microcystis aeruginosa NIVA-CYA 43 im Wasser aus dem See Akersvatnet, Norwegen (entnommen am 30. Mai 1996).
(B) ist ein Graph, der den Prozentanteil der Signalintensitäten für die Target-Flecken relativ zu den Gesamtsignalintensitäten zeigt. Die Bilder wurden aufgenommen mit einer Cohu High Performance CCD-Kamera und auf einem Digitalfarbdrucker ausgedruckt (Mavigraph UP-D1500CNE).
5(A) zeigt Membranstreifen mit Sonden.
(B) zeigt Signalintensitäten für die entsprechenden Sonden.
(C) zeigt die phylogenetische Position für die verschiedenen Sonden.
Die Sonden wurden in der folgenden Reihenfolge auf der Membran punktförmig aufgetragen bzw. getüpfelt: erste Reihe – pKO, pAP und pMI3; zweite Reihe – pMI2, pDK und pPL2; dritte Reihe – pPL1, pAL und pNOS; vierte Reihe – pUN. Die getesteten Stämme sind für die Membranen a1; Aphanizomenon gracile NIVA-CYA 103, a2; Anabaena lemermannii NIVA-CYA 266/1, a3; Nostoc sp. NIV-CYA 123, b1; Phormidium sp. NIVA-CYA 203, b2; Planktothrix prolifica NICA-CYA 320, b3; Microcystis aeruginosa NIVA-CYA 143, c1; Microcystis flos-aquae NIVA-CYA 144, c2; Pseudanabaena limnetica NIVA-CYA 276/6 und c3; Chiorobium. Die Signalintensitäten für jeden Fleck wurden bestimmt. Die phylogenetische Position der verschiedenen Stämme und Sonden sind durch einen phylogenetischen Baum dargestellt. Der Baum wurde aufgebaut mit dem Nachbar-Verbindungs-Algorithmus, unter Verwendung von Kimura-Abständen. Jede Verzweigung in dem Baum hat einen Bootstrap-Träger über 65%.
6 zeigt eine Wasserprofilanalyse für 7 norwegische Seen. Die Seen liegen in einem Bereich von denjenigen mit einem relativ niedrigen Gehalt an Biomasse (mesotroph) bis zu Seen mit hohem Biomassegehalt (eutroph). Die Signalintenstitäten relativ zu der Universalsonde pUN wurden multipliziert mit einem Faktor, der erhalten wurde aus reinen Kulturen, um Unterschiede hinsichtlich der Sondenmarkierungseffizienzen zu korrigieren, um die relative Häufigkeit der verschiedenen Genotypen in den Proben zu erhalten.
BEISPIELE
Beispiel 1
Organismen und Probenvorbereitung
Die verwendeten Organismen sind von dem norwegischen Institut für Wasserforschung. Die Kultivierung wurde in Z8-Medium durchgeführt. Die Beleuchtung wurde bereitgestellt durch Fluoreszenzlampen, die die Stämme 30 μEm²s^–1 aussetzen. Zwei verschiedene Microcystis aeruginosa-Stämme (NIVA-CYA 228/1 und 43) wurden als Template bei der Entwicklung des Assays verwendet. Das System wurde ebenfalls getestet an experimentell modifizierten Wasserproben, die gesammelt wurden aus dem See Akersvatnet, Norwegen. Die Zellen wurden durch Mikroskopie in einer Fuchst-Rosenthal-Zählkammer (Carl Hecht, Sondheim, Deutschland) gezählt.
DNA wurde entweder gereinigt entsprechend eines Standard-Phenol/Chloroform-Protokolls von Zellpellets von unialgalen Kulturen oder durch Festphasezellkonzentration- und DNA-Reinigungsprotokoll (Rudi, K., Larsen F. und Jakobsen, K.J. in Applied and Environmental Microbiology, (1998), 64, Band 1, S. 34-37). In dem Festphaseprotokoll wurden Zellen von Cyanobakterien aus einer wässrigen 1 ml Lösung adsorbiert für 20 Minuten auf paramagnetischen Kügelchen (Endvolumen 2 ml), in einem Puffer, der 50% Isopropanol, 0,75 M Ammoniumacetat und 1 U (Kügelchen in 200 μl Lysepuffer) Dynabeads DNA DIRECT (Dynal A/S, Oslo, Norwegen) enthält. Die magnetischen Kügelchen und die adsorbierten Bakterien wurden angezogen auf die Seite eines 2 ml Mikrozentrifugenrohres durch einen MPC-Q-Magneten (Dynal A/S). Dann wurden 20 μl 4M Guanidinthiocyanat-1% Sarkosyl zugegeben und die Inkubation bei 65°C für 10 Minuten fortgesetzt. Die DNA wurde präzipitiert auf den Kügelchen durch Zugabe von 40 μl 96%-igem Ethanol, mit nachfolgender Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Schließlich wurde der DNA- und Kügelchen-Komplex zweimal gewaschen mit 500 μl 70%-igem Ethanol, unter Verwendung des Magneten zwischen jedem Waschen. Zum Entfernen von restlichem Ethanol wurde der Komplex bei 65°C für 5 Minuten getrocknet. Der komplette Kügelchen- und DNA-Komplex wurde dann in den Amplifikationsreaktionen verwendet.
Kompetitive PCR (schematisch in 1A gezeigt)
Zur selektiven Amplifikation von genomischer DNA von Microcystis verwendeten wir die 16S rDNA-Primer 5'-AGCCAAGTCTGCCGTCAAATCA-3' (CH) und 5'-ACCGCTACACTGGGAATTCCTG-3' (CI) (Rudi, K., et al., in Appl. Environ. Microbiol. 63, 2593-2599). Der Kompetitor 5'-AGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAAGCTGCCTCACTGCGGAGCTCGGACCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGT-3' ist ein Oligonukleotid mit Sequenzen, die komplementär sind zu den PCR-Primern CH-CI und dem Primer DK (siehe unten), der in der cyclischen Markierungsreaktion verwendet wird. Amplifikationsreaktionen unter Verwendung des GeneAmp 2400 PCR-Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, Conn.) enthielten 10 pmol Primer, 6 × 10^–9 pmol Kompetitor, 200 μM von jedem Deoxynukleotidtriphosphat, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8), 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1 U DynaZyme DNA-Polymerase (Finnzymes Oy, Espoo, Finnland) und gereinigte DNA, in einem Endvolumen von 50 μl. Vor Amplifikation wurde die DNA für 4 Minuten bei 94°C denaturiert und nach Amplifikation erfolgte ein Verlängerungsschritt für 7 Minuten bei 72°C. Das Zyklisieren wurde für 40 Zyklen unter Verwendung der Parameter durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden.
Zyklisches Markieren (schematisch in 1B gezeigt)
Fünf μl der PCR-Produkte der kompetitiven Reaktion wurden verwendet in der zyklischen Markierungsreaktion. Die Deoxynukleotidtriphosphate wurden dephosphoryliert durch Zugabe von 100 nm Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 50 nm MgCl₂ und 1 U alkalische Phosphatase aus Garnelen (USB, Cleveland, OH), mit nachfolgender Inkubation bei 37°C für 1 Stunde. Schließlich wurde die Phosphatase inkubiert durch Erhitzen bei 96°C für 10 Minuten.
Die zyklischen Markierungsreaktionen wurden durchgeführt in 20 μl Volumina, enthaltend 3 pmol Primer 5'-GTCCGAGCTCCGCAGTGAGGCAG-3' (DK), komplementär zu dem Kompetitor. 3 pmol Primer 5'-TCTGCCAGTTTCCACCGCCTTTAGGT-3' (DB), komplementär zu dem Microcystis Amplikon, 10 pmol ddATP, 10 pmol ddGTP, 10 pmol ddTTP (Boehringer GmbH, Mannheim, Deutschland), 7 pmol Fluorescein-12-ddCTP (NEN, Boston, Mass.), 1,25 μl Thermo Sequenase-Reaktionspuffer, 1,1 μl Enzymverdünnungspuffer, 0,15 μl Thermo Sequenase (Amersham International pIc, Buckinghamshire, England) und 6 μl Phosphatase-behandeltes PCR-Produkt. Die Markierung wurde für 25 Zyklen durchgeführt, unter Verwendung der Parameter: 95°C für 30 Sekunden und 50°C für 4 Minuten.
Hybridisierung und chromogener Nachweis (schematisch gezeigt in 1C und D)
Ein μl (100 pmol/μl) von Primer 5'-ACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGA-3' (DA) und 5'-CTGCCTCACTGCGGAGCTCGGAC-3' (DJ) wurden auf punktförmig aufgetragen auf Membranstreifen (0,4 × 2 cm), GeneScreen (NEN), und dann UV-quervernetzt mit 5000 Joule/cm². Primer DA ist komplementär zu Primer DB, und Primer DJ ist komplementär zu Primer DK. Die Streifen wurden prähybridisiert für 2 Stunden bei 37°C in einer Prähybridisierungslösung, enthaltend 0,7 × SSC, 1 × SPEP, 5 × Denhardts und 100 μg/ml heterologe DNA. Die Produkte von den zyklischen Markierungsreaktionen wurden zugegeben zu 0,5 ml Hybridisierungslösung (0,7 × SSC, 1 × SPEP, 1 × Denhardts, 10% Dextransulfat und 100 μg/ml heterologe DNA) in einem 2 ml-Mikrozentifugenrohr und denaturiert bei 95°C für 5 Minuten. Die Streifen wurden zugegeben und die Inkubation unter milder Inversion für 2 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Die Membranstreifen wurden gewaschen in 50 ml (1 × SSC und 1% SDS), dann in 50 ml (0,1 × SSC und 0,1% SDS) und schließlich zweimal in 50 ml (0,10 M Tris-HCl [pH-Wert 7,5] und 0,15 M NaCl). Jedes Waschen wurde durch kurzes Vortexen bei Raumtemperatur durchgeführt.
Zum Antikörpernachweis wurden die Membranstreifen blockiert mit 20 ml (0,10 M Tris-HCl [pH-Wert 7,5], 0,15 M NaCl und 0,5% Magermilch) für 1 Stunde und inkubiert in 10 ml des gleichen Puffers, enthaltend 1/1000 von Antifluorescein-HRP-Konjugat (NEN) für zusätzlich 1 Stunde. Die Membranstreifen wurden dreimal gewaschen durch kurzes Vortexen in 50 ml (0,10 M Tris-HCl [pH-Wert 7,5] und 0,15 M NaCl). Die chromogene Reaktion wurde durchgeführt mit der RENAISSANCE 4CN Plus For Chromogenic Detection von HRP für 5 Minuten, entsprechend den Anleitungen des Herstellers (NEN).
Die relativen Signalstärken wurden gemessen unter Verwendung einer CCD-Videokamera (Cohu High Performance CCD-Kamera, Japan) und analysiert unter Verwendung der Gel-Pro ANALYZER Software (Media Cybernetics, Silver Spring, Md.).
Nachweisassay an definierten Proben, die gereinigte DNA enthalten
Durch Titrationsversuche wurde die optimale Menge von Kompetitor (sowohl zum Erhalten von geringen Nachweisgrenzen als auch hinsichtlich reproduzierbarer Amplifikationen) als 6 × 10^–9 pmol (d. h. 3600 Moleküle) pro Testprobe ermittelt. Dementsprechend wurden 6 × 10^–9 pmol Kompetitor verwendet beim Testen des Assays an gereinigter DNA von Microcystis aeruginosa NIVA-CYA 43. Verdünnungsreihen von Microcystis-DNA von ungefähr 10⁷ bis 10⁰ genomischen Kopien (unter der Annahme einer Genomgröße von 5 ± 3 Mb (9b)) wurden sowohl in dem kompetitiven PCR-Assay (2A) als auch in dem nachfolgenden Markierungsassay (2B) verwendet.
Messungen des Verhältnisses zwischen Target relativ zu Kompetitorprodukten, wie gemäß Agarosegelelektrophorese bestimmt, ergaben einen quantitativen Bereich von 10⁵ bis 10² genomischen Kopien (2C). Im Gegensatz hierzu, ergab der Markierungsassay entsprechend der vorliegenden Erfindung einen quantitativen Bereich von mehr als 10⁷ bis hinunter zu 10² genomischen Kopien. Dies ist ungefähr eine 100-fache Erhöhung des dynamischen Bereiches im Vergleich mit Agarosegelelektrophoresenachweisassays (2C). So wenig wie 10 Kopien könnten nachgewiesen werden für den Markierungsassay durch Erhöhung der Inkubationszeit der chromogenen Nachweisreaktion von 5 auf 30 Minuten. Live-Videoaufnahme der chromogenen Nachweisreaktion kann verwendet werden, um einen quantitativen Bereich bis hinunter zu diesem Niveau zu ergeben. Das heißt, Zeitkurven von 0 bis 30 Minuten für die Farbdichte der Target- und Kompetitors-Flecken können verwendet werden, um die relativen Signalintensitäten zu extrapolieren, wenngleich der Kompetititor-Fleck Farbdichte-gesättigt ist nach 30 Minuten.
Einfluss auf den quantitativen Bereich durch die Anzahl von Zyklen in der Markierungsreaktion.
Die zyklische Markierungsreaktion erhöhte den quantitativen Bereich des Assays im Vergleich mit direktem Nachweis der amplifizierten DNA. Für kompetitive PCR – unter Verwendung einer logarithmischen Skala für die Targetkonzentration – führte das Verhältnis von Kompetitor und Targetsignal zu einer sigmoidalen Kurve mit relativ engem quantitativem Bereich (siehe 2C). Eine sigmoidale Kurve wurde ebenfalls erhalten durch Durchführen des zyklischen Markierungsassays mit nur wenigen Markierungszyklen. Jedoch durch Erhöhen der Anzahl von Markierungszyklen wurden der Kompetitor oder die Targetoligonukleotide markierungsgesättigt (alle die Sonden wurden markiert) an jedem der Verdünnungsreihenendpunkte, bzw. es führte zu einer Kurve mit einem breiteren quantitativen Bereich (siehe 2C). Erhöhen der Zyklenanzahl führte weiterhin zu einer Kurve, die flacher in der Mitte war aufgrund der Markierungssättigung an beiden Oligonukleotiden an dieser Stelle.
Quantifizierung von Microcystis in Wasserproben.
Der komplette quantitative Assay, der das Festphasezellkonzentrations- und DNA-Reinigungsverfahren umfasst, wurde an Verdünnungsreihen (10⁵–10⁰ Zellen/ml) von Mikrocystis aeruginosa (Stämme NIVA-CYA 43 und 228/1) durchgeführt. Planktotrhix agardhii NIVA-CYA 29 (fadenförmig) und Anabaena lemmermannii NIVA-CYA 83/1 (fadenförmig und Heterocysteenthaltend) wurden als Kontrollen der Reaktionsspezifität verwendet. Microcystis-Kulturen wurden verdünnt in reinem Wasser, Wasser, das 10⁵ Zellen/ml Planktothrix agardhii NIVA-CYA 29 enthält, Wasser, das 10⁵ Zellen/ml Anabaena lemmermannii NiVA-CYA 83/1 enthält und Wasser, das aus dem See Akersvatnet, Norwegen, entnommen wurde.
Es bestanden keine signifikanten Unterschiede, weder in der Spezifität noch Empfindlichkeit des Assays für die verschiedenen getesteten Bedingungen. Mit 6 × 10^–9 pmol Kompetitor erhielten wir einen quantitativen Bereich, der sich von mehr als 10⁵ hinunter bis 10² Zellen/ml in allen Fällen erstreckte (Ergebnisse für Microcystis aeruginosa NIVA-CYA 43 sind in 3 gezeigt). Durch verlängern der Inkubationszeit für die chromogene Nachweisreaktion von 5 auf 30 Minuten konnten wir bis hinunter zu 10 Zellen/ml nachweisen.
Die Nachweiskurve für den kompletten Nachweisassay (einschließlich Festphasezellkonzentration und DNA-Reinigung) hat etwa die gleiche Steigung wie die Kurve, die erhalten wird für die Verdünnungsreihen von gereinigter DNA (Vergleiche 2C und 3), wodurch angezeigt wird, dass das Zellkonzentration- und DNA-Reinigung(Probevorbereitung)-Verfahren nicht beeinträchtigt werden durch die Probezusammensetzung. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse auch, dass das Festphasezellkonzentration- und DNA-Reinigungsverfahren verwendet werden kann für quantitative Analyse direkt aus Wasserproben.
Die Nachweisgrenze war abhängig von der Menge an verwendetem Kompetitor, mit einer unteren Grenze (6 × 10^–9 pmol) Kompetitor. Das Erhöhen der Menge an Kompetitor um das 10-fache (6 × 10^–8 pmol) führte ebenfalls zu einer etwa 10-fach erhöhten Nachweisgrenze (4). Jedoch ergab das Erniedrigen der Menge auf 6 × 10^–10 pmol nicht reproduzierbare Ergebnisse. So schließen wir, dass 6 × 10^–9 pmol ebenfalls die optimale Menge Kompetitor war, sowohl zum Erhalten von geringen Nachweisgrenzen als auch für reproduzierbare Nachweise für den vollständigen Assay an Wasserproben.
Vollständiger Assay zum Quantifizieren von Cyanobakterien in Wasser.
Cyanobakterien, die zu der Gattung Microcystis gehören, können mehrere verschiedene Typen von Toxinen produzieren, wobei die hepatotoxischen Microcystine die potentesten sind. Diese Toxine bewirken nicht nur eine akute Vergiftung durch Leberschädigung sondern können auch ein Promotor von kanzerogenem Tumor bei Langzeitaussetzen unter geringen Dosen sein. Daher ist ein kontinuierliches Monitoringsystem wichtig zum Untersuchen auf das Vorliegen der Organismen, die dieses Toxin produzieren.
Gesundheitsbehörden in Australien (New South Wales Blue-green Algae Task Force, 1992) haben bereits ein Dreistufenalarmsystem eingerichtet auf Basis von Caynobakterien-Zellzählungen in Wasser. Stufe 1 ist 500–2000 Zellen/ml, wobei bei dieser Stufe Wasserbehörden alarmiert werden und Wasserbeprobung zur Beobachtung bzw. zum Monitoring erhöht wird. Stufe 2 ist 2000–15.000 Zellen/ml, wobei an diesem Punkt Toxizitätstesten durchgeführt wird. Stufe 3 ist über 15.000 Zellen/ml, wobei wenn Aktivkohle nicht verfügbar ist, das Wasser als unsicher für den Verbrauch durch Menschen deklariert werden kann. Mit einer Nachweisgrenze für Microcystis von 100 Zellen/ml und einem quantitativen Bereich von mehr als drei Größenordnungen sind die Verfahren der Erfindung, die hier beschrieben werden, geeignet zum Monitoriering von sowohl geringen Microcystis-Konzentrationen als auch zum Nachweis von potenziellen toxischen Wasserblüten in Trinkwasser.
Entwicklung von Multiplexassays.
Die allgemeine Probenherstellung mit dem Festphasezellkonzentration- und DNA-Reinigungsverfahren, kombiniert mit der Spezifität in dem Nachweisverfahren, ermöglicht Multiplexbestimmungen bzw. Mehrfachbestimmungen. Unter Verwendung von kompetitiver PCR können mehrere Targets quantifiziert werden unter Verwendung von z. B. universellen 16S rDNA-Primern in der kompetitiven Reaktion. Dann können verschiedene Oligonukleotidsonden basierend auf Signatursequenzen für verschiedene bakterielle Gruppen markiert werden, und schließlich können die Verhältnisse des Kompetitorsignals verglichen werden mit Signalen für jede der bakteriellen Gruppen.
Beispiel 2
Im Gegensatz zu herkömmlicher Klassifizierung, die auf Morphologie/Cytologie basiert, reflektiert eine Klassifizierung, die auf Nukleinsäuresequenzen basiert, die Evolution und Phylogenie der Organismen. 16S rDNA-Targetsonden wurden konstruiert, um die Hauptcyanobakteriengruppen Microcystis, Planktrothrix, Anabaena und Aphanizomenon nachzuweisen. Sonden wurden ebenfalls konstruiert zum Differenzien von Gruppen mit verschiedener polygenetischer Tiefe. Eine Sonde wurde konstruiert zum Nachweisen der Nostoc-Gruppe (welche Anabaena und Aphanizomenon enthält) und eine Sonde wurde konstruiert zum Nachweisen aller Eubakterien (einschließlich Chloroplasten). Die Spezifität der konstruierten Sonden wurde auf unialgalen Kulturen getestet. Diese Information wurde nachfolgend verwendet zum Bestimmen der relativen Verteilung und Häufigkeit der Target-Organismen in 7 Seegruppen.
Organismen und Probenvorbereitung
Die folgenden unialgalen Kulturen von dem Norwegischen Institut für Wasserforschung wurden verwendet: Aphanizomenon gracile NIVA-CYA 103, Anabaena lemmermannii NIVA-CYA 266/1, Nostoc sp. NIVA-CYA 124, Phormidium sp. NIVA-CYA 203, Planktothrix prolifica NIVA-CYA 320, Microrystis aeruginosa NIVA-CYA 143, Microcystis flos-aquae NIVA-CYA 144, Pseudanabaena limnetica NIVA-CYA 276/6. Die Kultivierung wurde durchgeführt in Medium Z8 [Norwegisches Institut für Wasserforschung, Oslo (1990) Kultursammlung von Algen, Katalog von Stämmen]. Die Beleuchtung wurde bereitgestellt durch Fluoreszenzlampen, die die Stämme 30 μEm^–2s^–1 aussetzen. Aliquote von dichten Kulturen (1 ml, enthaltend ungefähr 10⁷ Zellen/ml) wurden pelletiert in einer Mikrozentrifuge bei 5.000 UpM für 10 min und unmittelbar bei –80°C gefroren. Die DNA wurde gereinigt aus den gefrorenen Pellets mit dem DNA Direct DNA-Isolierungskit, der auf magnetischen Kügelchen basiert (Dynal A/S, Oslo, Norwegen), unter Verwendung eines Protokolls, das im Hinblick auf die Reinigung von Cyanobakterien modifiziert wurde [Rudi K., Kroken, M., Dahlberg, O.J., Deggerdal, A., Jakobsen, K.S. und Larsen, F. (1997) Biotechniques 22, 506-511].
Die im Feld gesammelten Proben wurden unmittelbar in Isopropanol konserviert, wie für den Zell-Konzentrationsschritt unten beschrieben. Die Proben wurden dann zum Labor transportiert und weiter bearbeitet. Die DNA wurde gereinigt durch ein Festphasenzellkonzentration- und DNA-Reinigungsprotokoll, wie früher von Rudi et al., (1998) entwickelt. In dem Festphase-Protokoll wurden Zellen aus 0,8 ml wässriger Lösung adsorbiert für 20 min auf paramagnetischen Kügelchen (Endvolumen 2 ml), in einem Puffer, enthaltend 50% Isopropanol, 0,75 M Ammoniumacetat und 1 U (die Kügelchen in 200 μl Lysepuffer) Dynabeads DNA DIRECT (Dynal A/S, Oslo, Norwegen). Die magnetischen Kügelchen und die adsorbierten Bakterien wurden an die Seite eines 2 ml-Mikrozentrifugenrohres durch einen MPC-Q- Magnet (Dynal A/S) angezogen. Dann wurden 20 μl 4M Guanidinthiocyanat-1% Sarkosyl zugegeben und die Inkubation bei 65°C für 10 min fortgesetzt. Die DNA wurde auf den Kügelchen präzipitiert durch Zugabe von 40 μl 96%-igem Ethanol, mit nachfolgender Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Schließlich wurde der DNA- und Kügelchenkomplex zweimal gewaschen mit 500 μl 70%-igem Ethanol, unter Verwendung des Magneten zwischen jedem Waschen. Zum Entfernen von restlichem Ethanol wurde der Komplex bei 65°C für 5 min getrocknet. Der komplette Kügelchen- und DNA-Komplex wurde dann verwendet in den Amplifikationsreaktionen.
PCR-Amplifikation
Ribosomale DNA wurde amplifiziert unter Verwendung des Univesal-Primer-Sets CC-CD. Amplifikationsreaktionen unter Verwendung des GeneAmp 2400 PCR-Thermocycler (Perkin Elmer, Norway, Conn.) enthielten 10 pmol Primer, 200 μM von jedem Deoxynukleotidtriphosphat, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8), 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1 U DynaZyme DNA-Polymerase (Finnzymes Oy, Espoo, Finnland) und gereinigte DNA in einem Endvolumen von 50 μl. Vor Amplifikation wurde die DNA für 4 min bei 94°C denaturiert und nach Amplifikation wurde ein Extensionsschritt bzw. Verlängerungsschritt für 7 min bei 72°C vorgenommen. Das Zyklisieren wurde für 35 Zyklen durchgeführt, unter Verwendung der Parameter 96°C für 15 s, 70°C für 30 s und 72°C für 1 min.
Zyklisches Markieren
Zwanzig μl der PCR-Produkte von den Amplifikationsreaktionen wurden in der zyklischen Markierungsreaktion verwendet. Die Deoxynukleotidtriphosphate wurden dephosphoryliert durch Zugabe von 100 nm Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 50 nm MgCl₂ und 1 U alkalische Phosphatase aus Garnelen (USB, Cleveland, OH) mit nachfolgender Inkubation bei 37°C für 1 Stunde. Schließlich wurde die Phosphatase inaktiviert durch Erhitzen bei 96°C für 10 min.
Die zyklischen Markierungsreaktionen wurden durchgeführt in 80 μl-Volumina, enthaltend 3 pmol von jedem der Primer in unten stehender Tabelle 1, 10 pmol ddATP, 10 pmol ddGTP, 10 pmol ddTTP (Boehringer GmbH, Mannheim, Deutschland), 7 pmol Fluorescein-12-ddCTP (NEN, Boston, Mass.), 1,25 μl Thermo Sequenase-Reaktionspuffer, 1,1 μl Enzymverdünnungspuffer, 0,15 μl 32 U/μl Thermo Sequenase (Amersham Pharmacia pIc, Buckinghamshire, England) und 25 μl Phosphatase-behandeltes PCR-Produkt. Die Markierung wurde für 10 Zyklen durchgeführt, unter Verwendung der Parameter von 95°C für 30 sec und 50°C für 4 min. Tabelle 1 – Oligonukleotidsonden

¹Die Primer, die komplementär zu diesen Sondensequenzen sind, wurden auf den Membranen punktförmig aufgetragen.

Hybridisierung und chromogener Nachweis
Ein halber μl (100 pmol/μl) von Primern, die komplementär sind zu den Primern, die in der Markierungsreaktion verwendet werden, wurde punktförmig auf Membranstreifen (4 × 5 cm) Hybon (Amersham) aufgetragen und dann UV-quervernetzt mit 5.000 Joule/cm². Die Streifen wurden prähybridisiert für 2 Stunden bei 37°C in einer Prähybridisierungslösung, enthaltend 0,7 × SSC, 1 × SPEP, 5 × Denhardts und 100 μg/ml heterologe DNA. Die Produkte von den zyklischen Markierungsreaktionen wurden zugegeben zu 0,5 ml Hybridisierungslösung (0,7 × SSC, 1 × SPEP, 1 × Denhardts, 10% Dextransulfat und 100 μg/ml heterologe DNA) in einem 2 ml-Mikrozentrifugenrohr und denaturiert bei 95°C für 5 min. Die Streifen wurden zugegeben und die Inkubation fortgesetzt unter vorsichtiger Inversion für 2 Stunden bei 37°C. Die Membranstreifen wurden gewaschen in 50 ml (1 × SSC und 1% SDS), dann in 50 ml (0,1 × SSC und 0,1% SDS) und schließlich zweimal in 50 ml (0,10 M Tris-HCl [pH-Wert 7,5] und 0,15 M NaCl). Jedes Waschen wurde durchgeführt durch kurzes Vortexen bei Raumtemperatur.
Zum Antikörpernachweis wurden die Membranstreifen geblockt mit 20 ml (0,10 M Tris-HCl [pH-Wert 7,5], 0,15 M NaCl und 0,5% Magermilch) für 1 Stunde und inkubiert in 20 ml des gleichen Puffers, enthaltend 1/1000 Antifluorescein-HRP-Konjugat (NEN) für zusätzlich 1 Stunde. Die Membranstreifen wurden dreimal gewaschen durch kurzes Vortexen in 50 ml (0,10 M Tris-HCl [pH-Wert 7,5] und 0,15 M NaCl). Die chromogene Reaktion wurde durchgeführt mit dem RENAISSANCE 4CN Plus For Chromogenic Detection von HRP für 5 min, entsprechend den Anleitungen des Herstellers (NEN).
Die relativen Signalstärken wurden bestimmt durch Scannen der Membranen mit einem Agfa-Snapscanner 600 und analysiert unter Verwendung der Gel-Pro ANALYZER Software (Media Cybernetics, Silver Spring, Md.).
Validierung des Sondenmarkierungsassays auf reinen Kulturen.
Der Sondemarkierungsassay wurde durchgeführt an 8 verschiedenen Cyanobakterienstämmen, die die Hauptabstammungslinien darstellen. Die außerhalb liegende Gruppe Chlorobium sp. wurde aufgenommen als eine zusätzliche Kontrolle der Spezifität der Sonden. Ungefähr 5% der DNA- gereinigten Form der unialgalen Kulturen wurden amplifiziert mit dem Universalprimerpaar CC-CD in einem PCR-Reaktionsvolumen von 50 μl. Die Produkte wurden sichtbar gemacht auf einem 1,5% Ethidiumbromidgefärbten Agarosegel, vor der Markierung, um die Amplifikationsreaktion zu bestätigen. Alle Proben wurden einheitlich amplifiziert, was eine starke Bande bei ungefähr 600 bp ergab, ohne sichtbare zusätzliche Banden.
Bezogen auf den Sondenmarkierungsassay wurde die universelle Sonde pUN relativ einheitlich markiert (mit einer Ausnahme bezüglich Pseudanabaena limnetica NIVA-CYA 276/6) für die getesteten Stämme (5A). Diese Sonde wurde ebenfalls markiert für die außerhalb liegende Gruppe Chlorobium sp. Ausgenommen die Sonde pPL2 ergaben die verschiedenen Cyanobakterien-spezifischen Sonden Signale, wie es aus ihrer phylogenetischen Position erwartet wird (5B und C). Die geringe Spezifität von pPL2 kann zurückzuführen sein auf die Tatsache, dass die verwendete Hybridisierungstemperatur nicht optimal für diese Sonde war. Im Allgemeinen jedoch lag in dem Assay ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis vor. Zum Beispiel gibt es nur einen Basepaar-Unterschied zwischen M. aeruginosa-Stämmen NIVA-CYA 143 und 144. Die Sonde pMI2 unterschied NIVA-CYA 143 und 144 mit einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis von 80.
Die Einbaueffizienz von Fluoreszenz-markierten Dideoxynukleotiden ist sequenzabhängig. Es gibt ebenfalls Unterschiede in der Sondenmarkierung aufgrund von Sonden-Target-Hybridisierungseffizienzen. Die Basezusammensetzung und der Schmelzpunkt, zusätzlich zu den Sequenzen, die die Sondenregion flankieren, beeinflussen die Sondenhybridisierung. Die unterschiedlichen Markierungseffizienzien lagen im Bereich von 1,0 bis 5, gemäß Bestimmung, relativ zu der Markierung der Universalsonde pUN, für die in dieser Arbeit entwickelten Sonden. Für die jeweiligen Sonden waren die Effizienzen wie folgt; pKO – 1,7, pMI3 – 2,2, pM12 – 1,4, pDK – 1,9, pPL1 – 4,0, pAL – 1,6, pAP – 3,3, pNOS – 4,3 und pPL2 – 4,9.
Verteilung von Cyanobakterien von 7 ausgewählten Orten
Die Universalität der Probenvorbereitung und Sondenmarkierungsstrategien wurde getestet an Wasserproben von 7 verschiedenen Orten, im Bereich von Wasser mit einem moderaten Gehalt an Pflanzenbiomasse (mesotroph) bis zu Wasser mit einem hohen Biomassegehalt (eutroph).
Drei Proben wurden gesammelt vor jeder Beprobungsstelle. Die Zellkonzentration und DNA-Reinigung wurden durchgeführt wie oben beschrieben, für alle drei Proben parallel. Ribosomale DNA wurde amplifiziert von 90,9 und 1% des gereinigten Materials. Amplifikationsreaktionen wurden erhalten für Østensjøvatnet v Oslo, Gjærsjøen und Årungen für 90% der gereinigten DNA. Für 9% des Materials wurden alle Proben amplifiziert, ausgenommen die Proben von Langen, während 1%-Amplifikationsreaktionen erhalten wurden für alle Proben.
Die mittlere Signalstärke und Standardabweichung für die Sondenmarkierung wurden berechnet für jeden untersuchten Ort (basierend auf den drei gesammelten Proben). Da die verschiedenen Sonden nicht mit gleicher Effizienz markiert werden, erfolgte Einstellung basierend auf den relativen Markierungseffizienzen, die erhalten werden aus den Analysen von Reinkulturen (6). Die Balken in dieser Figur zeigen die ungefähre relative Zusammensetzung der bestimmten Genotypen in der Probe. Da es eine unbekannte Komponente von heterotrophen Bakterien in einigen der zur Korrelation verwendeten Kulturen gibt, kann die Quantifizierung der entsprechenden Organismen eine Überschätzung ergeben.
Als eine weitere Verifizierung des Sondenmarkierungsassays wurden die Proben auch untersucht durch Mikroskopie. Hier wurden die dominanten Spezies für jeden Ort bestimmt, basierend auf morphologischen und cytologischen Charakteristika, entsprechend den Kriterien, die von Skulberg et al. angeben sind [Skulberg, O.M., Carmichael, W.W., Codd, G.A. und Skulberg R. (1993) Algal toxins in seafood and drinking water S. 145-164, Hrsg. Falconer I.R., London Academic Press Ltd.]. Es bestand allgemein gute Korrelation zwischen den Gruppen von Organismen in der Probe, wie durch die genetischen und die mikroskopischen Analysen bestimmt. Das 16S rDNA-Gen, das in den genetischen Analysen verwendet wurde, hat jedoch nicht genug Sequenzvariation zum Diskriminieren auf das Speziesniveau. Zusätzlich konnten wir nicht unterscheiden zwischen den morphologisch definierten Gattungen Anabaena und Aphanizomenon mit dem Sondenmarkierungsassay. Der Grund für dies ist, dass die beiden für die Unterscheidung bzw. Diskriminierung verwendeten Positionen nicht der Speziesbezeichnung folgen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass mehrere unabhängige Substitionen der entsprechenden Positionen erfolgt sind, dass Rekombinationsereignisse in der 16S rDNA zwischen den beiden Sonden aufgetreten sind oder, dass die Speziesdefinition nicht phyletisch relevant ist. Die hierarchische Sonde pNOS scheinet auf der andere Seite spezifisch zu sein für die Nostoc-Gruppe – einschließlich Anabaena und Aphanizomenon.
Die Planktothrix-spezifische Sonde pPL1 ergab ein relativ starkes Signal mit dem Sonde-Markierungsassay für den See Gjersøen, während dieser Organismus nicht nachgewiesen wurde durch die mikroskopischen Untersuchungen von Wasser aus diesem See. Dieser Unterschied kann erklärt werden durch die Tatsache, dass Proben für mikroskopische Analyse konzentriert wurden durch 2 μm Planktonnetz vor der Analyse, während für die genetische Analyse die Probe direkt analysiert wurde. Weiterhin kann es sein, dass die Cyanobakterien nicht gleichmäßig im See verteilt sind, was auch die Unterschiede zwischen den Sondenmarkierungs- und den mikroskopischen Untersuchungen erklären kann. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweisen mehrerer verschiedener Targetnukleotidsequenzen in einer Einzelprobe, worin jede Targetsequenz charakteristisch für einen speziellen Organismus oder eine spezielle Gruppe von Organismen ist, wobei das Verfahren zum Nachweisen jeder Nukleotidsequenz in einem Nukleinsäuremolekül umfasst: (a) Binden einer Oligonukleotidsonde an das Nukleinsäuremolekül; (b) selektives Markieren der gebundenen Oligonukleotidsonde in der Gegenwart der Targetnukleotidsequenz; (c) Abtrennen der markierten Oligonukleotidsonde von dem Nukleinsäuremolekül durch Denaturierung; (d) Hybridisieren des markierten Oligonukleotids an eine komplementäre Sequenz in der Gegenwart von beliebigen nichtmarkierten Oligonukleotiden aus der Markierungsreaktion; und (e) nachfolgenden Nachweis der Markierung.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die komplementäre Sequenz von (d) die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche ist wie die Targetregion innerhalb des Nukleinsäuremoleküls, an welches die Oligonukleotidsonde in Schritt (a) bindet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die komplementäre Sequenz von (d) vollständig komplementär zur Oligonukleotidsonde ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oligonukleotidsonde 20 bis 30 Nukleotide in der Länge aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oligonukleotidsonde durch Einbau eines markierten Nukleotids markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das markierte Nukleotid ein markiertes Dideoxynukleotid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, worin selektive Markierung in der Gegenwart eines markierten oder mehrerer markierter Dideoxynukleotide und eines nichtmarkierten oder mehrerer nichtmarkierter Dideoxynukleotide stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 7, worin selektive Markierung in der Gegenwart eines markierten Dideoxynukleotids und drei nichtmarkierter Dideoxynukleotide stattfindet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mehrere Markierungsschritte nacheinander durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Sequenz, die komplementär zu dem markierten Oligonukleotid ist, auf einem festen Träger immobilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der feste Träger ein Membranstreifen oder ein Nukleinsäurechip ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin den Schritten (a) bis (e) Amplifikation des Nukleinsäuremoleküls, das die Targetsequenz enthält, vorausgeht.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Nukleinsäuremolekül, das die Targetsequenz enthält, mit einem Konkurrenznukleinsäuremolekül coamplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Konkurrenzmolekül eine Erkennungssequenz umfasst, die komplementär zu einer Konkurrenzoligonukleotidsonde ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Konkurrenzoligonukleotidsonde selektiv markiert wird nach Hybridisierung an das Konkurrenzmolekül.
Verfahren nach Anspruch 15, das zusätzlich Hybridisierung des markierten Konkurrenzoligonukleotids an eine komplementäre Sequenz und nachfolgenden Nachweis der Markierung umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Sequenzen, die komplementär zu den Oligonukleotidsonden sind, auf einem festen Träger in diskreten, vorbestimmten Positionen immobilisiert werden.
Verfahren zum Bestimmen der Menge einer Targetnukleotidsequenz oder der Anzahl von Zellen, die eine Targetnukleotidsequenz enthalten, umfassend ein Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17.
Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Bakterien in einer Probe, umfassend ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Bakterien Cyanobakterien sind.
Kit zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend: (a) Oligonukleotidsonden, die in der Lage sind zum Binden an Targetnukleinsäuremoleküle, die Targetnukleotidsequenzen enthalten, worin jede Targetsequenz charakteristisch für einen speziellen Organismus oder eine spezielle Gruppe von Organismen ist; (b) Mittel zum selektiven Markieren der Oligonukleotidsonden; und Nukleotidsequenzen, die komplementär zu den Oligonukleotidsonden sind.
Kit nach Anspruch 21, worin die Nukleotidsequenzen auf einem festen Träger immobilisiert sind.