CN107287291B - 一种基于g-C3N4与CdTe/CdS量子点相互作用的双标记核酸检测方法 - Google Patents

一种基于g-C3N4与CdTe/CdS量子点相互作用的双标记核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种基于g‑C3N4与CdTe/CdS量子点(CdTe/CdS QDs)相互作用的双标记核酸检测方法，采用具纳米片结构的g‑C3N4(CNNs)与CdTe/CdS QDs作为能量共振转移体系，利用荧光能量共振转移(FRET)作用，提供一种信号增强‑猝灭型双信号输出的对特定核酸序列进行定性及定量检测的方法，可以快速简便地检测某一特定的核酸序列，且线性范围广。本发明避免了仅利用PCR技术进行核酸检测的方法中存在的定量不准确问题；选用尺寸可控的半导体量子点CdTe/CdS QDs作为荧光基团修饰不同DNA探针，可以实现多靶标检测；利用类石墨烯氮化碳纳米片CNNs与DNA‑CdTe/CdS QDs相互作用后双信号输出，克服了不同荧光检测仪器和不同批次材料性能差异的限制，减少误差，提高了检测定量的准确性和检测方法的重现性。

Description

一种基于g-C3N4与CdTe/CdS量子点相互作用的双标记核酸检 测方法
技术领域
本发明属于生物化学检测领域与现代光学传感技术领域，特别涉及一种基于类石墨烯的单层碳氮化合物(g-C3N4)与CdTe/CdS量子点(CdTe/CdS QDs)探针相互作用的基因快速检测方法，适用于各类生物核酸分子的检测。
背景技术
核酸是生命体重要的遗传物质，针对特定的核酸序列进行准确、灵敏的检测对于遗传疾病、病原性疾病的早期诊断以及对食物、环境样品中病原菌检测都具有十分重要的意义。常见的核酸检测技术有核酸扩增法、基因测序、基因芯片、变性高效液相色谱技术和变性梯度凝胶电泳技术等，这些技术在实际应用中可能存在着假性结果、定量不准确、操作复杂、耗费时长、价格昂贵等问题，满足不了更高要求的检测。近年来，利用纳米材料制备的生物传感器对核酸进行检测的方法是核酸检测领域的研究热点。荧光标记的核酸探针设计灵活，针对不同用途可设计出荧光信号强的探针，利用核酸杂交反应运用至实际检测中，操作简便，实用性强，能有效改进现用核酸检测技术的部分不足。
基于荧光能量共振转移(FRET)的分析方法采用的仪器简单，具有灵敏度高、所需样品量少、分析速度快的优点，目前已成为一种有效的痕量分析技术。FRET对荧光的供-受体对之间距离具有敏感性，利用单、双链DNA与纳米材料之间因不同亲和性产生的距离不同，从而控制荧光的供体和受体距离产生FRET现象，能对特定的核酸序列进行检测。因此，基于这种原理的分析方法已被广泛地用在对生物核酸分子结构、性质以及定量分析等方面的研究，是基因工程中的一种新手段。
除了对距离有要求外，FRET还对供-受体对的吸收波长和发射波长有关，荧光供体的发射光谱需在受体的吸收光谱范围内，供体的能量才能转移至受体。目前，基于FRET的核酸分析方法通常在单链DNA上标记上荧光探针作为供体，利用荧光受体对单链DNA有吸附作用，当供-受体对距离足够小时发生荧光能量共振转移，使DNA荧光标记探针的荧光猝灭，从而对特定核酸序列进行定性和定量分析。现存荧光共振能量转移方法中有采用有机染料作为能量的供-受体对的，但有机染料普遍存在需要特定波长去激发、激发光谱较窄、发射光谱较宽且分布不对称和光学稳定性差的特点；有采用以氧化石墨烯(rGO)等片层材料材料作为受体、DNA荧光探针作为供体的，这种方法往往只有单信号输出，且供-受体设计缺陷会导致吸收和发射光谱的重叠率低，容易造成荧光共振转移效率低，导致传感体系灵敏度不高的情况出现。构建一种基于FRET的稳定、高效、准确的核酸检测方法是研究发展的趋势。
发明内容
本发明提出一种基于g-C3N4与CdTe/CdS QDs相互作用的双标记核酸检测方法，利用荧光能量共振转移(FRET)作用，提供一种“ON-OFF”型双信号输出的对特定核酸序列进行定性及定量检测的方法，可以快速简便地检测某一特定的核酸序列，且响应灵敏度高、重现性好。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于g-C3N4与CdTe/CdS QDs相互作用的双标记核酸检测方法，采用g-C3N4与CdTe/CdS QDs作为能量共振转移体系。化合物的发射光谱与CdTe/CdS QDs的吸收光谱范围高度重叠，利用块状g-C3N4剥离后的氮化碳纳米片CNNs与CdTe/CdS QDs相互作用后输出双信号，增强检测定量的准确性和检测方法的重现性。
进一步，将CdTe/CdS QDs与探针序列结合得到量子点荧光探针DNA-CdTe/CdSQDs，该探针具有吸收峰宽、响应灵敏度高和对待测DNA特异性好等特点，可以快速简便地检测某一特定的核酸序列。
进一步，制备一种基于类石墨烯的碳氮化合物(g-C3N4)并剥离出纳米片层结构(CNNs)，该化合物的发射光谱与CdTe/CdS QDs的吸收光谱范围高度重叠；CNNs对DNA-CdTe/CdS QDs上的单链DNA有吸附作用，当二者距离足够近时，在适合的波长激发下CNNs产生的荧光部分会被DNA-CdTe/CdS QDs吸收，CNNs荧光强度降低、DNA-CdTe/CdS QDs的荧光强度增加；经过孵育DNA荧光探针与待测单链DNA进行杂交，形成双链DNA结构后的DNA-CdTe/CdSQDs远离CNNs，CNNs荧光强度恢复，DNA-CdTe/CdS QDs荧光强度降低；通过识别目标核酸序列后产生的特异性荧光信号，对致病菌进行定性及定量检测。
进一步，更为具体的，所述基于g-C3N4与CdTe/CdS量子点相互作用的双标记核酸检测方法，包括以下步骤：
(1)根据靶核苷酸片段，设计能与靶核酸序列互补配对的探针序列，并在探针上修饰荧光标记物(CdTe/CdS QDs)，将其荧光信号作为靶核酸片段的检测信号，得到荧光探针DNA-CdTe/CdS QDs；
(2)制备碳氮化合物g-C3N4，将碳氮化合物进行处理后，配制成不同浓度的氮化碳纳米片CNNs溶液；
(3)将DNA-CdTe/CdS QDs中加入不同量的目标DNA片段进行杂交孵育；
(4)将与总体系相同浓度的(a)荧光探针、(b)CNNs溶液，与(c)CNNs和DNA-CdTe/CdS QDs混合溶液荧光强度进行检测，用于空白对照；
不同浓度的CNNs溶液与荧光探针DNA-CdTe/CdS QDs的吸附作用效果不同：对于批次不同、浓度不同、荧光信号不同的量子点，需探究出用于最适的CNNs溶液浓度。
(5)将孵育后的杂交溶液与CNNs溶液混合，进行荧光检测，获得加入不同量的目标DNA片段后CNNs和DNA-CdTe/CdS QDs的荧光信号，对目标DNA片段进行定性和定量。其中，通过荧光的变化即可以实现定性的检测；对不同浓度的目标DNA进行测定后绘制标准曲线得到回归方程后即可进行定量检测。
进一步，步骤(1)中，本发明关于DNA-CdTe量子点的制备方法，采用水热法合成巯基丙酸(MPA)稳定的水溶性核壳量子点CdTe/CdS QDs，再通过配体交换的形式制备出DNA-CdTe/CdS QDs。具体步骤分四部分：
a.量子点核部分CdTe QDs的合成；
b.CdS壳包裹CdTe QDs形成CdTe/CdS QDs；
c.处理合成后的DNA-CdTe/CdS QDs；
d.巯基化的DNA取代CdTe/CdS QDs上的MPA，得到DNA-CdTe量子点。
进一步，本发明中，采用高温煅烧法先制备出块状g-C3N4，再用超声剥离的方法制备出纳米片层氮化碳CNNs。具体步骤分三部分：
a.采用二氰二胺为原料，在马弗炉中高温制备，得到黄色块状的g-C3N4；
b.用浓硝酸处理黄色块状的g-C3N4并用水洗至中性，得到淡黄色块状g-C3N4；
c.将淡黄色块状g-C3N4连续超声得到悬浮液，通过离心去除大块状固体，对悬浮液重复超声，得到较稳定的高度水分散的单层纳米片CNNs。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明避免了仅利用PCR技术进行核酸检测的方法中存在的定量不准确问题；选用尺寸可控的半导体量子点CdTe/CdS QDs作为荧光基团修饰不同DNA探针，可以实现多靶标检测；利用类石墨烯氮化碳纳米片CNNs与DNA-CdTe/CdS QDs相互作用使DNA-CdTe/CdSQDs荧光先增强后猝灭，扩大待测物的检测范围；二者作用后输出双信号同时进行定量，克服了不同荧光检测仪器和不同批次材料性能差异的限制，提高了检测定量的准确性和检测方法的重现性。
此外，本发明的基于g-C3N4与CdTe/CdS量子点相互作用的双标记核酸检测方法具有荧光基团可调性广(CdTe/CdS QDs本身具有吸收峰宽、发射波长可控的特点)、响应灵敏度高(DNA检测，检测限比较低)和对待测DNA特异性好等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明方法原理示意图；
图2为是CNNs的荧光发射光谱与CdTe/CdS QDs紫外吸收光谱表征图，从图2可以看出：CNNs的发射波长和CdTe/CdS QDs的吸收波长重合，吸收峰宽，可以发生FRET效应；
图3是CdTe/CdS QDs修饰DNA前后的荧光和紫外表征图，从图3中可以看出：荧光表征中，QDs接上DNA形成DNA-CdTe/CdS QDs后荧光强度增加，发射波长向短波移动；紫外表征中，DNA-CdTe/CdS QDs在波长为260nm处有一个明显的吸收峰，说明DNA-CdTe/CdS QDs成功合成；
图4是加入目标核酸序列前后的荧光光谱图。从图4可以看出：CNNs和DNA-CdTe/CdS QDs混合前，具有自身荧光；在没加入目标DNA片段时将CNNs和DNA-CdTe/CdS QDs混合，CNNs的荧光强度降低，DNA-CdTe/CdS QDs荧光强度增强；加入不同浓度的目标DNA片段后，CNNs荧光增强，DNA-CdTe/CdS QDs荧光降低，二者荧光相应恢复。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
将上述方法应用于检测致病菌。
将本发明方法用于致病菌，以检测金黄色葡萄球菌为例，具体步骤如下。
1)提取金黄色葡萄球菌的基因组，并用通用引物对金黄色葡萄球菌的16s rDNA的核酸序列(约1500bp)进行PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定是否为16s rDNA片段。
2)针对金黄色葡萄球菌的16s rDNA核酸序列，用NCBI、Primer 5.0筛选出合适的目标核酸序列，并对靶目标核酸序列设计与之互补配对的探针。筛选出的目标核酸序列为：5’-CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAAGCAAGCTTCTCGTCCGTTCGCTCGACTTGCATGTA-3’，对应的探针序列为：5’-GCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGAAAAAAGGGGGGGGGGG-3’，对3’端进行延长并进行硫代修饰，与本发明中选用的荧光探针CdTe QDs连接，用于制备荧光探针DNA-CdTe/CdS QDs，辅助探针序列为：5’-TACATGCAAGTCGAGCGAACGGACGAGAA-3’；以CdTe/CdS QDs作为荧光标记物，用配体交换法制备探针DNA-CdTe/CdS QDs并对产物进行纯化。
本发明关于DNA-CdTe量子点的制备方法，采用水热法合成巯基丙酸(MPA)稳定的水溶性核壳量子点CdTe/CdS QDs，再通过配体交换的形式制备出DNA-CdTe/CdS QDs。具体步骤分四部分：
a.量子点核部分CdTe QDs的合成；
b.CdS壳包裹CdTe QDs形成CdTe/CdS QDs；
c.处理合成后的DNA-CdTe/CdS QDs；
d.巯基化的DNA取代CdTe/CdS QDs上的MPA，得到DNA-CdTe量子点
3)制备基于类石墨烯的碳氮化合物(g-C3N4)及将其剥离至纳米片层氮化碳化合物(CNNs)。
本发明中，采用高温煅烧法先制备出块状g-C3N4，再用超声剥离的方法制备出纳米片层氮化碳CNNs。具体步骤分三部分：
a.采用二氰二胺为原料，在马弗炉中高温制备，得到黄色块状的g-C3N4；
b.用浓硝酸处理黄色块状的g-C3N4并用水洗至中性，得到淡黄色块状g-C3N4；
c.将淡黄色块状g-C3N4连续超声得到悬浮液，通过离心去除大块状固体，对悬浮液重复超声，得到较稳定的高度水分散的单层纳米片CNNs。
4)在PBS缓冲体系下配制不同浓度的CNNs溶液(5ug/mL，10ug/mL，15ug/mL……35ug/mL，40ug/mL)，与DNA-CdTe/CdS QDs(1x10-5M)体积比为1：1混合，在37℃下混合15分钟后检测荧光，根据二者荧光强度变化得出满足FRET效应的最适浓度CNNs溶液。
5)在加入目标DNA片段前，对与总体系相同浓度的
a.步骤4)获得的CNNs溶液，
b.步骤2)获得的DNA-CdTe/CdS QDs溶液及
c.CNNs和DNA-CdTe/CdS QDs混合溶液荧光强度进行检测。
6)在步骤2)所得的DNA-CdTe/CdS QDs中加入不同量的目标DNA片段，在PBS缓冲体系中，以65℃孵育30分钟。
7)将步骤6)所得的孵育后的溶液与步骤4)中获得的CNNs溶液在37℃下混合15分钟后进行荧光检测，获得加入不同量的目标DNA片段后CNNs和DNA-CdTe/CdS QDs的荧光信号，对目标DNA片段进行定性和定量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于g-C3N4与CdTe/CdS 量子点相互作用的双标记核酸检测方法，其特征在于：
采用g-C3N4与CdTe/CdS QDs作为能量共振转移体系，将CdTe/CdS与探针序列结合得到量子点荧光探针DNA-CdTe/CdS QDs，由g-C3N4剥离出纳米片层结构CNNs；
该双标记核酸检测方法包括步骤：
（1）设计探针序列，并在探针序列上修饰荧光标记物CdTe/CdS QDs，得到荧光探针DNA-CdTe /CdS QDs；
（2）制备碳氮化合物g-C3N4，并将其配置成梯度浓度的氮化碳纳米片CNNs溶液；
（3）将DNA-CdTe /CdS QDs中加入不同量的目标DNA片段进行杂交孵育；
（4）将与总体系相同浓度的（a）荧光探针、（b）CNNs溶液与（c）CNNs和DNA-CdTe /CdSQDs混合溶液荧光强度进行检测；
（5）将孵育后的杂交溶液与CNNs溶液混合，进行荧光检测，获得加入不同量的目标DNA片段后CNNs和DNA-CdTe /CdS QDs的荧光信号，对目标DNA片段进行定性和定量；
步骤（1）中，采用水热法合成巯基丙酸稳定的水溶性核壳量子点CdTe/CdS QDs，再通过配体交换的形式制备得到DNA-CdTe /CdS QDs。
2.如权利要求1中所述基于g-C3N4与CdTe/CdS 量子点相互作用的双标记核酸检测方法，其特征在于：步骤（2）中，采用高温煅烧法先制备出块状g-C3N4，再用超声剥离的方法制备出纳米片层氮化碳CNNs。
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