CN104726603B - 一种基于石墨烯量子点的分子信标传感器及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于石墨烯量子点的分子信标传感器及其制备与应用。所述基于石墨烯量子点的分子信标传感器，包括依次排布的石墨烯量子点、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和荧光基团，所述环状区为与待测目标分子特异结合的核苷酸片段，所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补。本发明首次将石墨烯量子点用于构建分子信标传感器，用于小分子核酸DNA、miRNA或mRNA的检测，成功地拓宽了石墨烯量子点的应用领域。

Description

一种基于石墨烯量子点的分子信标传感器及其制备与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于石墨烯量子点的多色分子信标传感器及其制备与应用。
背景技术
近年来，随着纳米科学的发展，纳米材料的合成以及在纳米尺度上的形貌控制等方面均取得了傲人的成绩。纳米技术的出现也给生物学检测带来新的发展机遇。纳米粒子作为信号放大的载体被广泛应用于生物学检测中。基于纳米材料的生物学传感器的主要优势包括以下几个方面：纳米材料本身的小尺寸使得设计成本低、并有可能开发微型化的即时检测工具；纳米材料直接与检测环境接触，加速了信号传递，使检测变得更为快速，同时也降低了检测限；纳米材料的引入衍生出一些新的检测手段，如仿生、无试剂传感及低毒、高稳定性体内检测等。许多纳米材料，如金纳米颗粒和碳纳米材料6(碳纳米管、石墨烯及其衍生物等)因其因其良好的稳定性和生物相容性，被广泛用作载体或示踪物、催化剂、导电基体、光发射器等，在生物学检测中起到信号放大及稳定识别探针的作用。
石墨烯量子点(graphene quantum dots，GQDs)是一种新兴的零维纳米材料，它同时具有石墨烯和碳量子点的特性，与传统的有机染料分子和半导体量子点相比，石墨烯量子点有更高的光学稳定性，抗光漂白性以及低毒及优异的生物相容性。和碳量子点相比，石墨烯量子点还保留着石墨烯的片层结构，这样就使得它具有和石墨烯及其氧化物类似的优异性质，如良好的导电性、机械性能及优异的水溶性等。
近年来，石墨烯量子点在检测领域得到广泛关注，由于它本身具有优异的电子学及光学性质，基于石墨烯量子点的传感器具有很好的检测性能。其中应用最广泛的就是基于石墨烯量子点的光学传感器，它主要是利用石墨烯量子点本身发光性质进行检测一种方法，这种方法主要采用的是石墨烯量子点的荧光被猝灭(signal-off)或者淬灭后又得到恢复(signal-on)的策略。Jinet等人于2012年首先开发了一种基于石墨烯量子点的光学传感器，他们发现Fe3+吸附到石墨烯量子点上后可以通过电荷转移作用淬灭其荧光，于是就开发了一种简便、绿色的检测铁离子的传感器。之后，又涌现出了很多基于此原理的传感器，用于检测银离子、氯气、葡萄糖等。生物传感器方面已有科学家研究了基于石墨烯量子点的电子存储器、生物传感器，开发它在生物及体内成像等方面的应用。然而，由于石墨烯量子点本身的小尺寸及电负性，使得核酸小分子DNA、miRNA等不易与其结合，进而限制了它在核酸检测方面的应用。
目前检测核酸小分子(如DNA，miRNA，mRNA等)的方法主要有Northern blotting,微芯片(microarray)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)等。Northern blotting方法通过聚丙烯酰胺变性凝胶电泳对RNA样品按大小与分子量进行分离，然后将RNA转移并固定在膜上，再与标记好的DNA探针杂交，再将非特异性结合的探针洗掉，最后经过显影获得信号。此方法虽然是经典方法，但其灵敏度、特异性不高，操作步骤多且复杂，样品需要量大、耗时长。microarray技术虽然有高通量的优势，但是会受到标志物家族类似序列交叉杂交的干扰，使得其灵敏度及特异性不高，并且测试范围较窄，需要昂贵的仪器设备；相比较而言，RT-PCR技术具有较高的灵敏度和实用性，但由于miRNA自身的限制对引物的设计要求很高且温度难以控制，这就限制了该方法的应用。针对这些难点，研究人员提出了许多新的策略，类似于RT-PCR的滚环放大技术(RCA)作为一种等温扩增技术很好的解决了核酸温度难以控制的问题，提高了检测灵敏度但同时也存在操作繁琐批次间差异大等问题，限制了该方法的进一步发展。还有一些研究人员采用生物发光，表面增强拉曼，原位杂交，DNA纳米结构、纳米孔传感等技术来检测核酸分子，但是这些方法要么需要昂贵的仪器设备，要么成本比较高。总体来讲，核酸分子的检测仍然需要进一步发展，目前存在的方法在中要么需要很多步骤，要么需要昂贵的试剂，要么需要复杂的仪器。因此，发展简单、快速、廉价的肿瘤标志物核酸分子检测方法势在必行，同时又要提高检测的灵敏度和特异性。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于石墨烯量子点的分子信标传感器及其制备与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一方面提供了一种基于石墨烯量子点的分子信标传感器，包括依次排布的石墨烯量子点、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和荧光基团，所述环状区为与待测目标分子特异结合的核苷酸片段，所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补。
优选地，所述石墨烯量子点通过Pyrene与第一信标茎干区连接。
Pyrene，亦即，芘，其CAS登录号为129-00-0，分子式为C16H10。
优选地，所述环状区为含有15～30碱基的核苷酸片段。所述环状区能与待测目标分子特异结合，所述环状区可以根据待测目标分子的核苷酸序列来设计。
在本发明的优选实施方式中，所述环状区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。具体为：
5′-ACCCC TATCA CGATT AGCAT TAA-3′SEQ ID NO.1；
5′-CAGTG TGCGG TGGGC AGGGG CT-3′SEQ ID NO.2。
优选地，所述第一信标茎干区和第二信标茎干区均为含有5～8个碱基的核苷酸片段。
所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补。
更优选地，所述第一信标茎干区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5′-CGCTGC-3′。
优选地，所述荧光基团的激发波长与所述石墨烯量子点的发射波长有部分重叠。更优选地，所述荧光基团选自Cy5Cy3或FAM。
自由状态时，分子信标传感器的两个末端靠近，使荧光基团与石墨烯量子点靠近，此时发生荧光共振能量转移效应。当分子信标与序列完全互补的目标分子结合形成双链杂交体时，两个信标茎杆互补区被拉开，荧光基团和石墨烯量子点距离增大，荧光共振能量转移效应减弱甚至消失。从而根据荧光强度变化来检测目标分子的含量。
本发明的第二方面还提供了一种制备前述基于石墨烯量子点的分子信标传感器的方法，所述方法包括步骤：将由依次首尾连接的Pyrene、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和荧光基团组成的荧光探针与石墨烯量子点混合，即可获得基于石墨烯量子点的分子信标传感器。
优选地，所述石墨烯量子点的浓度为1.0μg/mL。
优选地，所述荧光探针的浓度为50～400μM。更优选为300μM。
所述石墨烯量子点为现有技术，既可以参考现有的文献制备，也可以通过商业途径购买。
本发明的第三方面公开了一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：先将待测目标分子和前述基于石墨烯的分子信标传感器混合，再进行荧光值检测。
优选地，所述目标分子包括DNA、miRNA、mRNA。
优选地，所述前述基于石墨烯量子点的分子信标传感器如上所述。
本发明第四方面还提供了前述基于石墨烯量子点的分子信标传感器在制备DNA、miRNA或mRNA检测试剂盒中的用途。
本发明第五方面，提供了一种试剂盒，包括前述基于石墨烯量子点的分子信标。
本发明检测原理如图1所示：
利用石墨烯量子点纳米材料本身优异的光学性质，以荧光染料标记的分子信标作为探针，通过荧光共振能量转移现象(FRET)对于距离的敏感性来检测DNA、mRNA或miRNA，并且可以设计标记不同荧光分子的分子信标传感器，实现多种目标分子的同时检测。具体来说，一端修饰荧光染料，另一端修饰Pyrene小分子的荧光探针可以和石墨烯量子点通过π-π作用相互吸附在一起。通过对荧光染料分子的合理选择，石墨烯量子点和荧光分子之间可以发生有效的FRET现象，石墨烯量子点的能量可以部分转移给荧光分子，使得荧光分子发出荧光。而当加入我们的待测靶标分子DNA、mRNA或miRNA后，靶标分子与分子信标的识别序列杂交，可以将分子信标探针的茎环结构打开，形成双链结构，导致荧光分子和石墨烯量子点的距离变远，FRET现象减弱甚至消失。根据FRET效率引发的荧光强度的变化，我们可以方便快捷的检测目标分子，并且通过选择不同发射波长的荧光染料，以及其分子信标的环状区域设计不同的识别序列，实现多种目标分子(DNA，mRNA或miRNA)的同时检测。
本发明的有益效果为：
(1)本发明首次将石墨烯量子点应用于构建分子信标传感器，用于小分子核酸DNA、miRNA或mRNA的检测，成功地拓宽了石墨烯量子点的应用领域。
(2)本发明首次采用Pyrene来连接石墨烯量子点和分子信标茎干区，由于现有技术中，石墨烯量子点与分子信标连接不上，也就是首次完成了二者之间的连接，通过π-π作用相互吸附连接比较牢固，确保了传感器的稳定性。
(3)采用本发明基于石墨烯量子点的分子信标传感器大大提高了光化学检测小分子核酸(DNA、miRNA或mRNA)的准确度和灵敏度，具有方便、廉价的良好优势。
(4)本发明的基于石墨烯量子点的分子信标，不止针对一种目标分子，可以设计成不同的分子信标检测不同的目标分子。还可同时进行多种目标分子的检测，操作简单、快速，成本低。
附图说明
图1：本发明检测原理图。
图2：表示由实施例1合成的石墨烯量子点的表征图，(A)原子力显微镜(AFM)下所示石墨烯量子点大小均一；(B)石墨烯量子点紫外吸收光谱(左),和荧光光谱(右)表明石墨烯量子点能够发光。
图3：该发明基于石墨烯量子点的双修饰分子信标探针荧光图谱：a线表示单独烯量子点；b线表示分子信标在无目标分子条件下，FRET效应使荧光染料Cy3的荧光增强；c线表示分子信标加入待测目标分子DNA155之后，FRET效应减弱甚至消失，荧光染料Cy3的荧光降低；d线表示单独分子信标。
图4：加入GQDs前后分子信标MB155的荧光差值比较。差值随分子信标MB155浓度升高而增加，至300nM时差值最大，随后差值减小。即实验组(1.0μg/mL GQDs,300nM MB155)为最佳实验条件。
图5：(A)检测DNA155荧光图。分子信标MB155的荧光染料Cy3在564nm处的荧光发射峰值，从上到下分别是有0nM，0.1nM,0.5nM,1nM,10nM,25nM,50nM,75nM,100nM,150nM,200nM,300nM目标DNA155时在400nm波长激发下检测的荧光强度值，依次减低。(B)根据荧光强度值绘制的模拟分析曲线，发现荧光值与目标DNA155浓度的曲线符合剂量响应曲线。
图6：(A)检测miR155荧光图。分子信标MB155的荧光染料Cy3在564nm处的荧光发射峰值，从上到下分别是有0nM，0.1nM,1nM,10nM,25nM,50nM,100nM,150nM,200nM目标miR155时在400nm波长激发下检测的荧光值，依次减低。(B)根据荧光强度值绘制的模拟分析曲线，发现荧光值与目标miR155浓度的曲线符合剂量响应曲线。
图7：基于石墨烯量子点分子信标探针检测目标分子miRNA荧光强度变化曲线。四条线分别为：不含目标分子(a线)，含200nM目标miRNA210(b线)，含200nM目标miRNA155(c线)，含200nM目标miRNA155和miRNA210(d线)。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
(1)材料及设备柠檬酸(无水)，NaOH，缓冲溶液(137mM NaCl,2.5mM Mg2+,10mMNa2HPO4,and 2.0mM KH2PO4,pH 7.4)等试剂购于国药集团化学试剂有限公司，所有溶液用Milli-Q水(18MΩcm电阻)配制；原子力显微镜(AFM),透射电子显微镜(TEM)，紫外分光光度计(Hitachi U-3010)，荧光分光光度计(F-4500,Hitachi)，PH计，磁力加热搅拌器，恒温混匀仪，冷冻高速离心机(Hitachi)；分子信标及靶标分子购于生工生物工程(上海)股份有限公司并使用高效液相色谱纯化。
序列如下表：
(2)石墨烯量子点的制备及表征
可参照下述文献中所记载的方法来制备石墨烯量子点，参考文献：
Dong Y,Shao J,Chen C,et al.Blue luminescent graphene quantum dots andgraphene oxide prep ared by tuning the carbonization degree of citric acid[J].Carbon,2012,50(12):4738-4743。
亦即，柠檬酸裂解法制备石墨烯量子点。具体步骤为：2g柠檬酸在烧杯中200℃加热，5分钟后溶解，约30分钟溶液由无色转为橘黄色。再将所得溶液逐滴加入到100ml的10mg/ml NaOH溶液中，快速搅拌。然后，NaOH中和至PH 7.0。最后用500d透析袋透析纯化，4℃冷藏保存备用。如图2表示由实施例1合成的石墨烯量子点的表征图，(A)原子力显微镜(AFM)下所示石墨烯量子点大小均一；(B)石墨烯量子点紫外吸收光谱(左),和荧光光谱(右)表明石墨烯量子点能够发光。
此外，也可通过商业途径购买石墨烯量子点。
实施例2
(1)分子信标探针的设计
本发明的分子信标探针是双修饰分子信标，其环状区为能够识别不同的靶标分子的识别序列，3’端修饰荧光染料分子，5’端则修饰了Pyrene和石墨烯量子点，Pyrene可以保证分子信标探针的茎干区与石墨烯量子点的有效吸附并稳定连接。荧光染料分子则根据石墨烯量子点的荧光发射光谱，选择激发波长与其石墨烯量子点的发射波长有部分重叠染料分子(如Cy3,Cy5)，这样才能保证FRET现象的有效发生，使得我们的检测体系得以实现。(4)基于石墨烯量子点的新型双修饰分子信标探针体系的建立
将仅标记了荧光染料和Pyrene的分子信标(MB155)与石墨烯量子点进行组装。首先，取一定量实施例1制备好的石墨烯量子点，超声处理10分钟，使其混匀悬浮。然后，加入一定量分子信标混匀，混合物放在孵育器中室温条件下孵化40分钟，即得Pyrene和石墨烯量子点双修饰分子信标。荧光分光光度计测试组装后的Pyrene和石墨烯量子点双修饰分子信标荧光图谱，选择石墨烯量子点的最适激发波长400nm，验证FRET效果，其荧光染料的荧光强度会增强，石墨烯量子点的荧光强度则减低。
(3)进行杂交反应
将待测目标分子与双修饰分子信标混合，置于37℃杂交2小时，荧光分光光度计测试荧光图谱，并且通过比较待测目标分子加入前后两峰值的变化，从而实现待测目标分子进行定量检测，即荧光染料的荧光强度会减低，石墨烯量子点的荧光强度则增强。如图3所示，该发明基于石墨烯量子点的双修饰分子信标探针荧光图谱：黑线表示单独烯量子点；b线表示分子信标在无目标分子条件下，FRET效应使荧光染料Cy3的荧光增强；c线表示分子信标加入待测目标分子DNA155之后，FRET效应减弱甚至消失，荧光染料Cy3的荧光降低。
实施例3
考察最优实验条件：
取制备好的GQDs并稀释，固定GQDs的量(1.0μg/mL)与不同浓度的分子信标MB155(50uM,100uM,200uM,300uM,400uM)混合，考察产生FRET效应最佳的浓度条件。如图4所示，加入GQDs前后分子信标MB155的荧光差值比较。差值随分子信标MB155浓度升高而增加，至300nM时差值最大，随后差值减小。即实验组(1.0μg/mL GQDs,300nM MB155)为最佳实验条件。
实施例4
采用本发明的Pyrene和石墨烯量子点双修饰分子信标检测DNA：
取建立好的双修饰分子信标探针体系(1.0μg/mL GQDs,300nM MB155)，加入不同浓度的靶标分子DNA155(0-300nM)，选择石墨烯量子点的最适激发波长400nm，荧光分光光度计记录荧光值变化，随目标分子DNA155浓度增加荧光染料Cy3的荧光强度递减，并绘制相关曲线方程(y＝-2.43333E-6x2+0.00235x+0.00798，R2＝0.99661)。如图5所示：(A)检测DNA155荧光图。分子信标MB155的荧光染料Cy3在564nm处的荧光发射峰值，从上到下分别是有0nM，0.1nM,0.5nM,1nM,10nM,25nM,50nM,75nM,100nM,150nM,200nM,300nM目标DNA155时在400nm波长激发下检测的荧光强度值，依次减低。(B)根据荧光强度值绘制的模拟分析曲线，发现荧光值与目标DNA155浓度的曲线符合剂量响应曲线。
实施例5
采用本发明的Pyrene和石墨烯量子点双修饰分子信标检测miRNA：
同实施例4，取建立好的双修饰分子信标探针体系(1.0μg/mL GQDs,300nM MB155)，加入不同浓度的靶标分子miR155(0-300nM)，荧光分光光度计记录荧光值变化，随目标分子miR155浓度增加荧光染料Cy3的荧光强度递减，并绘制相关曲线方程(y＝-2.9108E-6x2+0.00205x+0.03092，R2＝0.99088)。如图6所示：(A)检测miR155荧光图。分子信标MB155的荧光染料Cy3在564nm处的荧光发射峰值，从上到下分别是有0nM，0.1nM,1nM,10nM,25nM,50nM,100nM,150nM,200nM目标miR155时在400nm波长激发下检测的荧光值，依次减低。(B)根据荧光强度值绘制的模拟分析曲线，发现荧光值与目标miR155浓度的曲线符合剂量响应曲线。
实施例6
采用本发明的Pyrene和石墨烯量子点双修饰分子信标检测，构建多色分子信标体系后应用于检测多个靶标。
取建立好的双色分子信标探针体系(1.0μg/mL GQD,300nM MB155，300nM MB210),分别加入200nM等量的靶miRNA210,miRNA155及miRNA155和miRNA210的混合物，进行比较荧光值变化。无目标分子存在时，分子信标探针所对应的荧光染料Cy5与Cy3的荧光值都很高；目标miRNA210加入时所对应的Cy5荧光值减低；目标miRNA155加入时所对应的Cy3荧光值减低，由于Cy3在FRET体系中既是石墨烯量子点的受体也是Cy5的能量供体，所以Cy5的荧光值也相对减低；目标miRNA210与miRNA155同时加入时所对应的荧光值都减低，如图7：基于石墨烯量子点分子信标探针检测目标分子miRNA荧光强度变化曲线。四条线分别为：不含目标分子(a线)，含200nM目标miRNA210(b线)，含200nM目标miRNA155(c线)，含200nM目标miRNA155和miRNA210(d线)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种基于石墨烯量子点的分子信标传感器，包括依次排布的石墨烯量子点、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和荧光基团，所述环状区为与待测目标分子特异结合的核苷酸片段，所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补；所述石墨烯量子点通过Pyrene与第一信标茎干区连接；所述荧光基团的激发波长与所述石墨烯量子点的发射波长有部分重叠；所述环状区为含有15～30碱基的核苷酸片段；所述第一信标茎干区和第二信标茎干区均为含有5～8个碱基的核苷酸片段。
2.一种制备如权利要求1所述分子信标传感器的方法，所述方法包括步骤：将由依次首尾连接的Pyrene、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和荧光基团组成的荧光探针与石墨烯量子点混合，即可获得基于石墨烯量子点的分子信标传感器。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述石墨烯量子点的浓度为1.0μg/mL，所述荧光探针的浓度为50～400μM。
4.一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：先将待测目标分子和如权利要求1所述基于石墨烯的分子信标传感器混合，再进行荧光值检测。
5.如权利要求1所述的基于石墨烯量子点的分子信标传感器在制备DNA、miRNA或mRNA检测试剂盒中的用途。
6.一种试剂盒，包括如权利要求1所述的基于石墨烯量子点的分子信标传感器。
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