CN102864143A - 芘标记的单链dna荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光基团芘接枝的聚4-乙烯基吡啶阳离子聚电解质的合成,并由此制备单链DNA复合荧光探针的方法。芘接枝聚4-乙烯基吡啶阳离子聚电解质的合成步骤:(1)用芘甲醇和三溴化磷制备芘甲溴;(2)将芘甲溴按一定的单体摩尔比接枝到聚4-乙烯基吡啶上;(3)将步骤(2)的产物用溴代正丁烷季氨化得到水溶性阳离子聚电解质。该聚电解质与单链核酸在缓冲液中通过静电及疏水作用互相吸附形成复合探针,实验中通过荧光变化来检测目标单链DNA碱基与探针DNA是否互补。本发明的优点是合成路线简单,容易操作,成本低,且探针对DNA的特异性识别快速、灵敏。
Description
技术领域
本发明涉及一种水溶性荧光聚电解质的合成方法以及利用这种聚电解质制备检测寡核酸序列的荧光探针的方法,属于功能高分子技术、分析化学和生物分析化学领域。
技术背景
功能高分子是在其大分子链中结合了特定的功能基团,或大分子与具有特定功能的其他材料进行了复合,或者二者兼而有之而形成的具有某种特定功能的高分子材料,其在生物分析化学领域,尤其是在生物大分子检测方面的应用已经引起国内外学者的密切关注。核酸碱基序列的特异性识别是当前国际研究热点,而利用具有荧光特性的功能高分子作为荧光探针对核酸进行特异性识别已经取得了一些不错的效果。日本Saito教授将荧光基团芘标记到一个线性单链核酸上形成核酸探针,当与碱基互补配对的单链靶核酸杂化时表现出较强荧光光谱,当与碱基不互补配对的单链靶核酸杂化时表现出相对较弱的荧光光谱,由此来特异性识别核酸序列(J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 4820)。王国杰教授曾经报道过芘标记HNA和RNA的线性RNA探针,当与互补链杂化时,在荧光光谱上会出现芘单体峰的增强及激基缔合物峰的消失,根据这种明显的荧光变化来特异识别核酸序列(ChemBioChem., 2009, 10, 1175)。另外一种荧光基团标记的探针是非线性的探针称为分子信标,其核酸结构为发卡式且茎端两端分别接有荧光基团和淬灭基团,它可以提高错配目标的热识别及降低假阳性信号的风险,且在基因筛检、生物传感器的发展、生物芯片结构及单核苷酸多态性的检测方面都有很好的应用,所以受到很多学者的广泛关注(Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 856; Analyst. 2005, 130, 350; Langmuir. 2008, 24, 12138)。但是所有像以上说介绍的标记型荧光探针都是通过共价键将荧光基团连接到核酸分子链上,其合成操作比较复杂。近些年许多学者开始将目光转向用接有荧光基团的共轭聚电解质制备荧光探针来特异性检测核酸序列。He教授等人报道过用一种共轭聚电解质作为检测传感器来检测多链DNA的杂化(J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 3432)。Gaylord等报道了一种生物传感器,它是由含有一种共轭聚电解质和一种单链DNA的水溶液构成,当检测到特征波长的发射光线时标明含有特定序列的核酸链(J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 896)。
发明内容
本发明的目的在于合成一种水溶性的阳离子聚电解质芘功能化的聚4-乙烯基吡啶,并用该聚电解质和两种类型的单链寡聚核苷酸制备复合探针来检测目标DNA特定的碱基序列。
本发明特点在于共轭聚电解质聚4-乙烯基吡啶的合成方法容易操作,用其制备DNA复合探针的原理也很简单,且探针的检测原理与其他报道过的探针原理有所创新,是根据荧光基团芘嵌插到核酸双链结构与否的荧光变化来检测DNA的。
本发明是通过以下技术方案来实现的:本发明利用芘甲醇和三溴化磷的置换反应来制备芘甲溴,并将之按1:10的单体摩尔比接枝到聚4-乙烯基吡啶上,再用溴代正丁烷质子化,得到具有水溶性的阳离子聚电解质目标产物。该产物分别于直链和发卡式结构的单链DNA作用形成新型的复合DNA荧光探针。
本发明的芘标记的聚4-乙烯基吡啶聚电解质的合成及其在DNA探针制备中的应用的具体步骤包括:
(1)荧光基团芘甲溴分子的制备:
冰点温度下将芘甲醇溶于三氯甲烷中,将摩尔量是芘甲醇的1/2倍的三溴化磷加入该溶液,冰浴搅拌12个小时,然后加入饱和碳酸氢钠水溶液至中性,分层,取有机层进行蒸馏,重结晶,并干燥得到芘甲溴;
(2)将芘甲溴接枝到聚4-乙烯基吡啶上:
将聚4-乙烯基吡啶溶于三氯甲烷中,再加入适当摩尔量的芘甲溴,68℃下搅拌、回流24小时,然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀,过滤,洗涤,干燥后得到中间产物;
(3)用溴代正丁烷进一步接枝到中间产物:
将中间产物溶于乙醇,并加入5倍于聚4-乙烯基吡啶单体摩尔量的溴代正丁烷,85℃下搅拌、回流24个小时,然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀,过滤,洗涤,干燥得到产物阳离子聚电解质。
(4)DNA复合探针的制备:
用缓冲溶液PBS(10 mM, pH = 7.4)溶解适量步骤(3)中聚电解质,再用相同缓冲溶液分别溶解适量单链DNA1和单链DNA3溶液,将聚电解质溶液和两种DNA溶液分别混配成两种DNA探针,直链型和发卡型探针。
(5)DNA杂交样品的配制:
用缓冲溶液PBS(10 mM, pH = 7.4)溶解单链DNA2和DNAt,分别取一定量的DNA2和DNAt加入两种探针溶液中配成杂交样品,将样品先90℃热处理15min,再在40℃条件下保温30min。
所述步骤(3)所合成的聚电解质的结构式为:
其中m/n的值可以在1/100到1/10之间的任意数值。
所述步骤(4)和(5)中所用DNA序列分别为:DNA1:5′-GCA CAT ACA TTC TAC TTG-3′,DNA2:5′-CGT GTA TGT AAG ATG AAC-3′,DNA3:5'-GCACAAACAAGTAGAATGTATGTGC-3′,DNAt:5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3′。其中DNA3是发卡式结构,其余均为直链结构,且DNA2与DNA1完全互补,DNA2与DNA3部分互补,DNAt不与任何其他DNA互补。
所述步骤(4)和(5)中所有探针及杂交样品最终的聚电解质浓度均为2.0 × 10-7 M,所有DNA浓度均为1.0 × 10-6 M,而实际上DNA的浓度在1.0 × 10-7 M到1.0 × 10-5 M之间都可以实现对目标DNA的检测。
本发明的主要特点如下:
聚电解质芘标记的聚4-乙烯基吡啶的合成方法简单,其与直链或发卡式DNA通过亲疏水作用及静电作用结合形成复合探针,此时碱基对芘分子的荧光产生一定的淬灭作用。当加入互补的目标单链DNA时,会产生进一步的明显荧光淬灭;而当加入不互补的目标单链DNA时,荧光强度不会发生相当的降低,我们可以由此来检测相应的DNA碱基序列。
本发明的方法较之很多报道过的方法相对更简单,且不失灵敏性,且相对比较快速,准确度高,在功能高分子领域及生物传感方面都具有很好的参考价值。
附图说明
图1为芘标记的聚4-乙烯基吡啶聚电解质的合成路线。
图2为芘标记的聚4-乙烯基吡啶聚电解质的1H NMR。
图3为发明实例2所制备样品的荧光光谱。
a.直链探针系列荧光谱图。
b.直链探针系列在377nm处荧光强度柱状图。
c.发卡式探针系列荧光谱图。
d. 发卡式探针系列在377nm处荧光强度柱状图。
图4为DNA探针的制备及检测原理示意图。
a.直链探针原理图。
b.发卡式探针原理图。
图5为发明实例3所制备样品的圆二色谱图。
a.直链结构的圆二色谱图。
b.发卡式结构的圆二色谱图
图6为发明实例4所制备样品的KI荧光淬灭图。
a.直链探针系列荧光淬灭图。
b.直链探针系列在377nm处荧光强度柱状图。
c.发卡式探针系列荧光淬灭图。
d. 发卡式探针系列在377nm处荧光强度柱状图。
具体实施方式
实施例1:
冰点温度下将6mmol芘甲醇溶于150mL三氯甲烷中,将3mmol三溴化磷加入该溶液,冰浴搅拌12个小时,然后加入饱和碳酸氢钠水溶液至中性,分层,取有机层进行蒸馏,重结晶,并干燥得到芘甲溴。将12mmol聚4-乙烯基吡啶溶于10mL三氯甲烷中,再加入1.2mmol芘甲溴,68℃下搅拌、回流24小时,然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀,过滤,洗涤,干燥后得到中间产物。将5mmol中间产物溶于8mL乙醇中,并加入14mol溴代正丁烷,85℃下搅拌、回流24个小时,然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀,过滤,洗涤,干燥得到产物阳离子聚电解质(P4VP-Py-Bu)。
实施例2:
(1)配制样品:用PBS(10 mM, pH = 7.4)缓冲液去配制各个样品溶液,分别为如图3中所标注的1)P4VP-Py-Bu,2)P4VP-Py-Bu/ssDNA1,3)P4VP-Py-Bu/ssDNA2,4)P4VP-Py-Bu/ssDNA1+ssDNA2,5)P4VP-Py-Bu/ssDNA1+ssDNAt,6)P4VP-Py-Bu/ssDNA2+ssDNAt,3’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3,4’)P4VP-Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3,6’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3+ssDNAt共9个样品,每个样品溶液中的聚电解质最终浓度为2.0×10-7M,每种DNA浓度都为1.0×10-6M。
(2)热处理样品:将(1)中所配好的样品放入90℃烘干箱中热处理15分钟,然后迅速移至到40℃的烘干箱热处理30分钟。
(3)对样品做荧光检测:在344nm激发波长条件下,通过图3的曲线图及377nm处荧光强度柱状图可以明显看出,当DNA1或DNA3与聚电解质作用形成荧光探针时,荧光强度较聚电解质本身有所下降,而当荧光探针中加入互补的目标DNA单链时,荧光强度会进一步出现明显的下降,而加入不互补的DNA单链时,荧光强度变化相对较小,其原理如图4所示,当加入互补链时,目标DNA与探针DNA形成双螺旋结构,此时聚电解质P4VP-Py-Bu中的芘分子嵌插到双螺旋结构的碱基对中,使得碱基对芘荧光的淬灭进一步加剧,而加入不互补的DNA单链不会形成双螺旋结构,这样也就没有嵌插作用的产生,所以淬灭作用不会发生太大变化,由此,我们可以对目标单链DNA进行检测。
实施例3:
(1)配制样品:用PBS(10 mM, pH = 7.4)缓冲液去配制各个样品溶液,分别为如图5中所标注的1)DNA1/DNA2,2) P4VP-Py-Bu + DNA1/DNA2,1’)DNA1/DNA3,2) P4VP-Py-Bu + DNA1/DNA3共4个样品。每个样品溶液中的聚电解质最终浓度为2.0×10-5M,每种DNA浓度都为1.0×10-4M。
(2)热处理样品:将(1)中所配好的样品放入90℃烘干箱中热处理15分钟,然后迅速移至到40℃的烘干箱热处理30分钟。
(3)对样品做圆二色谱测试:做圆二色谱测试是为了证实芘分子确实嵌插到了DNA双螺旋结构中去。如图5所示的谱图,加入聚电解质P4VP-Py-Bu后的圆二色谱强度都明显下降,且正谱带出现蓝移,负谱带出现红移,导致这种结果的唯一可能就是嵌插作用,因为剩下的两种可能相互作用静电和沟壑作用都不会对双链结构产生如此大的作用使其圆二色谱有这样的变化。
实施例4:
(1)配制样品:用PBS缓冲液(10 mM, pH = 7.4)去配制各个样品溶液,分别为如图3中所标注的1)P4VP-Py-Bu,2)P4VP-Py-Bu/ssDNA1,3)P4VP-Py-Bu/ssDNA2,4)P4VP-Py-Bu/ssDNA1+ssDNA2,5)P4VP-Py-Bu/ssDNA1+ssDNAt,6)P4VP-Py-Bu/ssDNA2+ssDNAt,3’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3,4’)P4VP-Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3,6’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3+ssDNAt共9个样品,每个样品溶液中的聚电解质最终浓度为2.0×10-7M,每种DNA浓度都为1.0×10-6M。
(2)热处理样品:将(1)中所配好的样品放入90℃烘干箱中热处理15分钟,然后迅速移至到40℃的烘干箱热处理30分钟。
(3)KI淬灭实验:用PBS缓冲液(10 mM, pH = 7.4)配备KI溶液,浓度为0.2M,每次取10μL逐次加入每个样品中,分别测其荧光强度(如图6),并由此根据依据如下公式计算淬灭常数(KSV):
I0/I = 1 + KSV [I-]
样品1), 2), 3), 4), 5)和6)的淬灭常数分别为228, 169, 143, 93, 137和142 M-1,其中样品4)P4VP-Py-Bu/ssDNA1+ssDNA2的淬灭常数最小;样品1),2),3’),4’),5)和6’)的淬灭常数分别为228, 169, 122, 53, 137, 152 M-1,其中4’)P4VP-Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3的淬灭常数最小。以上结构都是由于芘分子嵌插到了DNA双螺旋结构中,I-对芘的淬灭作用因双螺旋结构的保护而降低,因此该结果进一步证明了芘分子嵌插到了DNA双螺旋结构中。
Claims (8)
1.一种芘标记的单链DNA荧光探针,其特征是:该探针具有水溶性,可与互补的目标DNA形成双螺旋结果,不可与不互补的DNA形成双螺旋结构。
2.如权利要求1所述的单链DNA荧光探针,其特征是:该探针由单链DNA与一种带有荧光基团的阳离子聚电解质通过静电作用和疏水作用互相吸附而得到,技术手段简单。
3.如权利要求2中所述的一种阳离子聚电解质,其特征是所述阳离子聚电解质接枝有荧光基团芘,具有水溶性,且是阳离子性的聚合物。
4.一种如权利要求3中所述的一种阳离子聚电解质的制备方法,其步骤包括:
(1)荧光基团芘甲溴分子的制备:
冰点温度下将芘甲醇溶于三氯甲烷中,将摩尔量是芘甲醇的1/2倍的三溴化磷加入该溶液,冰浴搅拌12个小时,然后加入饱和碳酸氢钠水溶液至中性,分层,取有机层进行蒸馏,重结晶,并干燥得到芘甲溴;
(2)将芘甲溴接枝到聚4-乙烯基吡啶上:
将聚4-乙烯基吡啶溶于三氯甲烷中,再加入1/10于聚4-乙烯基吡啶单体摩尔量的芘甲溴,68℃下搅拌、回流24小时,然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀,过滤,洗涤,干燥后得到中间产物;
(3)用溴代正丁烷进一步接枝到中间产物:
将中间产物溶于乙醇,并加入5倍于聚4-乙烯基吡啶单体摩尔量的溴代正丁烷,85℃下搅拌、回流24个小时,然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀,过滤,洗涤,干燥得到产物阳离子聚电解质。
5.如权利要求4所述的方法,其特征是:所述的步骤(2)是将芘按1:10的比例接枝于吡啶上,比例不能太大。
6.如权利要求4所述的方法,其特征是:所述的步骤(3)是用溴代正丁烷将中间产物季铵化,为了得到具有水溶性的聚阳离子产物。
7.一种如权利要求1或2所述的芘标记的单链DNA荧光探针的制备方法,其制备步骤是:将芘接枝聚4-乙烯基吡啶阳离子和一种DNA单链共同溶于缓冲液中,形成复合探针。
8.如权利要求7所述的方法,其特征是:阳离子浓度可以在2×10-8M到2×10-6M之间,单链DNA浓度在1.0×10-7M到1.0×10-5M之间,缓冲液为磷酸盐缓冲液,pH = 7.4。
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