KR102523355B1 - 2-조각 매개체 프로브 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적어도 하나의 표적 분자의 검출을 위한 적어도 두 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 매개체 프로브에 관한 것이다. 본 발명에 따른 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드는 프로브 영역 및 매개체 결합 영역을 포함하며, 상기 프로브 영역은 표적 분자 및/또는 주형 분자에 대한 친화도를 가지며, 상기 매개체 결합 영역은 적어도 하나의 매개체에 대한 친화도를 갖는다. 매개체 프로브의 추가적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 매개체 결합 영역을 통해 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 결합되고 적어도 하나의 검출 분자에 대한 친화성을 갖는 매개체이며, 상기 매개체는 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드로부터 방출된 후 검출 분자와의 상호 작용에 의해 검출 가능한 신호를 유발한다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 표적 분자의 검출 방법뿐만 아니라 본 발명에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브 및 적어도 하나의 검출 분자를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
Description
본 발명은 적어도 하나의 표적 분자의 검출을 위한 적어도 두 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 매개체 프로브에 관한 것이다. 본 발명에 따른 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드는 프로브 영역 및 매개체 결합 영역을 포함하며, 상기 프로브 영역은 표적 분자 및/또는 주형 분자에 대한 친화도를 가지며, 상기 매개체 결합 영역은 적어도 하나의 매개체에 대한 친화도를 갖는다. 매개체 프로브의 추가적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 매개체 결합 영역을 통해 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 결합되고 적어도 하나의 검출 분자에 대한 친화성을 갖는 매개체이며, 상기 매개체는 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드로부터 방출된 후 검출 분자와의 상호 작용에 의해 검출 가능한 신호를 유발한다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 표적 분자의 검출 방법뿐만 아니라 본 발명에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브 및 적어도 하나의 검출 분자를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
질병의 조사를 위한 임상 진단에서 DNA 증폭이 사용된다. DNA 증폭은 초기에 소량의 DNA가 가시화될 수 있도록, 원하는 표적 서열의 많은 복사본을 만드는 단계를 포함한다.
DNA 증폭은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 약 60℃와 95℃ 사이의 열적 사이클링이 필요한 PCR 외에도 LAMP(62℃) 또는 RPA(39℃)와 같은 등온 증폭 방법도 사용된다. 다양한 방법이 DNA 증폭 및 증폭 산물의 실시간 추적을 위해 이용 가능하다. 생물 발광(bioluminescence), 화학 발광(chemoluminescence), 혼탁도(turbidity) 측정 및 형광을 기반으로 하는 검출 방법은 검사할 DNA의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 상기 대부분의 방법은 샘플에서 증폭된 DNA의 전체 양을 검출할 수 있으며, 상이한 표적 서열을 구별할 수 없다. 따라서 이러한 방법은 소위 singleplex 검증에만 적합하다. 형광 기반뿐만 아니라 발광, 전기 화학 및 기타 검출 방법은 응용 가능성을 열어준다. DNA 가닥과 비특이적으로 상호 작용하는 검출 분자를 인터칼레이팅하는 것 이외에, 변형된 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 후자는 표적 서열 특이적 분석을 위해 사용될 수 있지만, 삽입 분자 검출은 종종 비특이적 부산물의 오탐지(false-positive detection)를 유도한다.
임상 분석 및 체외 진단에서 여러 가지 질병의 원인이 될 수 있는 여러 박테리아 나 바이러스가 존재할 수 있기 때문에 반응 내에서 여러 대상 분자를 동시에 감지할 수 있어야 한다. 따라서, 다중 분석물(multi-analyte) 검증은 매우 중요하며, 아래에 몇 가지 예가 나와 있다: 예를 들어, AB0 유전자형 결정은 혈액형 결정뿐만 아니라 혈액 및 수혈을 위해 결정되어야 하는 인간 호중구 항원 프로파일(Human Neutrophil Antigen Profile, HNA)의 생성과 관련이 있다. HIV 변이종과 B형 간염 또는 C형 간염에 대한 헌혈자 샘플의 평행 검사(Parallel testing)도 면역 분석법이나 핵산 기반 기술을 사용하여 일상적으로 수행된다. 병원체의 특정 검출은 짧은 분석 시간 후에 파생된 진단을 허용하기 위해 여러 게놈 좌위(genomic loci)의 결정을 요구한다.
다양한 마커 및 컨트롤 유전자의 활성 측정을 통해 발현 프로파일을 생성할 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 세포 분열 및 세포 분화에 영향을 미치고 따라서 암과 밀접한 상관관계가 있는 종양 유전자를 확인하거나 환자의 유전자형(맞춤 의학)에 따라 특정 약물의 효능을 예측하는 데 사용할 수 있다. 또한 자주 나타나는 유전 질환은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 페닐 케톤뇨증(대사성 장애) 및 지중해빈혈증(적혈구 분해)와 같은 분자 생물학적(출산 전) 진단에서 확인할 수 있다. 또한 프로칼시토닌(procalcitonin)이나 사이토카인(cytokines)과 같은 염증 표지자의 공동 검출은 감염의 심각성에 대한 결론을 이끌어낼 수 있다.
위의 예에서처럼 진단 질문에 여러 표적 분자, 유전자 좌위 또는 기타 마커 및 내부 제어 또는 참조를 분석해야 하는 경우 분석 당 단일 매개 변수를 결정하는 방법은 일반적으로 중요하지 않다. 다른 한편으로 여러 가지 개별 분석이 여러 매개 변수를 기록하기 위해 동시에 수행된다면 이것은 비경제적입니다: 시료 용액은 다른 표적 분자가 검출되는 여러 반응 배치로 나누어져야 한다. 발생하는 문제는 다음과 같습니다 : 샘플 용액을 n개의 분취량으로 나누어서, 개별 반응에서의 물질의 양을 1/n의 인자로 감소시킴으로써 검출 반응의 감도가 그에 따라 감소된다.
이러한 단점을 피하기 위해, 균질(homogeneous) 또는 이질적인(heterogeneous) 반응 접근법이 여러 매개 변수를 포착하기 위하여 개발되었으며, 이는 다양한 표적 분자를 병행하여 검출한다. 검출하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 검출용으로 표지된 다양한 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 상기 기재된 올리고뉴클레오티드와 표적 분자 사이의 직접적인 의존성에서, 새로운 실험적 질문이 발생하면, 예를 들어 바이러스의 다른 유전자형이 탐지되면 새로운 프로브의 사용이 필요하다는 문제점이 발생한다. 이것은 각각의 새로운 실험적 질문을 탐지하기 위한 새로운 표지된 올리고뉴클레오티드를 개발할 필요가 있다. 이는 검출에 필요한 올리고뉴클레오티드의 변형으로 인해 시간 소모적이며 비용이 많이 든다.
균질 반응 접근법에서 상이한 표적 서열의 병행 검출에 대한 대안으로서, 올리고뉴클레오티드는 고체상에서의 검출을 위해 고정화될 수 있다(불균질 검출). 고정상(fixed phase)에서의 시그널링 위치에 따라, 특정 표적 서열의 존재가 유추될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드와 표적 분자 사이의 직접적인 의존성은 다시 고정화된 올리고뉴클레오티드가 실험적 문제에 적응되어야 한다는 문제점을 야기한다. 각각의 새로운 실험적 질문에 대해, 새로운 올리고뉴클레오티드는 고체상(solid phase)에 고정화되어야 한다. 이는 복잡한 제조 공정으로 인해 시간이 많이 소요된다.
검출을 위한 또는 고체상의 상이한 위치에서의 표지를 갖는 표적 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 사용의 단점은 서열 특이성 및 그럼에도 불구하고 비용 효과가 있는 보편적 검출 방법의 필요성을 유도한다. 보편적인 방법에서, 신호 발생 올리고뉴클레오티드(검출 분자)의 서열은 검출될 표적 서열과 독립적이다. 동일한 최적화된 신호 발생 올리고뉴클레오티드는 상이한 표적 서열에 사용될 수 있다. 결과적으로, 신호 생성 올리고뉴클레오티드는 각각의 검출 반응에 대해 재조정될 필요가 없으므로 작업 시간 및 노동 비용을 절약할 수 있다.
서열 특이적이고 보편적인 검출 방법은 이미 알려져 있지만 몇 가지 단점이 있다. 특히 특정 증폭 방법, 대부분 비-등온(non-isothermal) 증폭 방법에만 호환되는 효소가 사용된다. 여기에는 예를 들어, Faltin et al.(2012)에 따른 다중 분석물 리포터 시스템 및 Yang et al.(2008)에 따른 범용 이중 프로브의 사용이 포함된다. 언급된 방법에서, LAMP 또는 RPA에 사용된 중합효소가 이 핵산 분해 효소 활성을 가지지는 않지만, 뉴클레아제 활성(nuclease activity)을 갖는 효소, 예를 들어 중합효소(polymerase)가 절대적으로 필요하다. 소위 비치 치환 중합효소(beach displacement polymerase)는 서열 특이적, 보편적인 검출에 거의 사용되지 않는다. 또한, Yang et al. (2008)에 따른 절차는 가양성 신호(false-positive signal)가 발생할 위험이 있습니다.
WO 2013079307 A1은 매개체 프로브 및 보편적 리포터 분자를 포함하는 시스템을 사용하여 적어도 하나의 표적 분자의 보편적으로 적용 가능한 방법을 기술한다. 절단(cleavage)에 의한 매개체 방출은 뉴클레아제(nuclease) 활성을 갖는 효소를 필요로 한다. PCR에서 중합효소는 대부분의 형태에서 이 뉴클레아제 활성을 가지므로 이 증폭 방법에 추가 효소가 필요하지 않는다. 그러나 LAMP 또는 RPA와 같은 등온(isothermal) 증폭 방법 또는 PCDR에서, 사용된 중합효소는 이 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 결과적으로, 절단에 의한 매개체 방출은 뉴클레아제 활성을 나타내는 효소의 첨가를 통해서만 가능하다. 이것의 단점은 추가적인 효소가 반응 믹스에서 다른 성분들과 상호 작용하여 검출 반응의 효율에 영향을 줄 수 있다는 것이다. 또한, 추가적인 효소에 대한 필요성은 검출 반응을 위한 반응 믹스의 비용을 증가시킨다. 또한, 추가 효소의 사용은 변화된 조건하에서 검출 반응을 최적화하기 위한 추가적인 작업량을 초래한다.
US 2016/0312271 A1은 절단 가능한 프로브 및 보편적 검출 분자를 포함하는 시스템을 사용하여 적어도 하나의 표적 분자의 보편적으로 적용 가능한 방법을 기술한다. US 2016/0312271 A1에 따른 절차에서, 검출 반응은 올리고뉴클레오티드의 절단에 의해 WO 2013079307 A1과 유사하게 촉발된다. 따라서, 뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 필요하다는 동일한 단점이 발생한다.
헤어핀 형성 서열, 공유 결합된 형광단(fluorophore) 또는 결합된 형광-표지 프로브를 포함하는 프라이머가 사용되는 최신 기술 절차도 기술되어 있다. 또한, 엠플리콘(amplicon)에 바인딩하고 제1형광단과 상호 작용할 수 있는 제2형광 라벨 프로브가 사용된다. 표적 서열 특이적 헤어핀 형성 서열 및 표적 서열 특이적 제2프로브는 형광단이 보편적인 서열 섹션에 부착되지 않는다는 단점을 야기하고, 따라서 이 방법은 보편적으로 사용될 수 없다. 따라서 신호 생성은 새로운 검출 반응을 위해 개별적으로 최적화되어야 한다. 추가로, 제2프로브는 프라이머에 결합된 제1프로브가 연장되어 제2프로브를 대체할 수 있기 때문에, 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)가 사용될 때 위험을 야기한다.
이 점에서 Tanner et al.에 따라 LAMP에서 가닥 치환 중합효소를 이용한 증폭 산물의 서열 특이적 검출이 언급되어야 한다. 이 검출 방법을 사용하면 형광 공여체와 형광 수용체가 표적 서열 특이적 올리고뉴클레오티드에 결합되므로, 이 방법은 보편적이지 않으며, 따라서 새로운 검출 반응마다 검출이 최적화되어야 한다는 단점이 있다.
또한, 프라이머 서열을 함유하고 따라서 표적 서열 특이적 영역을 갖는 분자 비콘(molecular beacons)에 기초한 검출 방법이 기재되어 있다. 신호 생성 라벨이 표적 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 상에 위치하기 때문에 다른 단점은 표적 서열에 대한 의존성에 기인하며, 이는 이 검출 방법이 보편적으로 적용 가능하지 않은 이유이다. 또한, 형광 수율 및 분자 비콘의 폐쇄 및 개방 형태 사이의 균형은 프라이머 서열에 의존한다. 따라서 검출 반응은 각각의 새로운 검출 반응에 대해 개별적으로 최적화되어야 한다.
문헌에 기술된 보편적인 기술은 가닥 변이 중합효소를 사용하는데 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어, Li et al. (2006)의 문헌 또는 CN 101328498 A에 따라 프라이머에 혼성화된 분자 표지를 사용하면, 분자 비콘의 헤어핀 구조의 안정성으로 인해 표적 분자가 없을 때 위양성 신호(false-positive signal)가 생성될 위험이 있다(Li et al., 2007). 또한, 이 검출 방법은 PCR을 통한 증폭 반응에만 사용되어 왔다. 등온 증폭 방법의 기능은 입증되지 않았으며 낮은 온도(LAMP, RPA)에서 더욱 두드러진 헤어핀 구조의 안정성은 등온 증폭과 함께 이 방법의 사용에 반대한다. Nuovo et al. (1999)에 따른 범용 형광 표지된 프라이머의 사용은 범용 프라이머의 혼성화가 또한 비특이적 증폭 산물에서 가양성 신호 생성을 유도할 수 있는 위험이 따른다.
최신 기술 방법으로는 샘플의 결합된 DNA-RNA-단백질 프로파일을 생성할 수 있는 하나의 단계에서 단백질과 핵산과 같은 다양한 분자와 분자 종류를 병렬로 검출할 수 없다.
서로 다른 물질 군으로부터의 여러 다른 표적 분자의 분석을 필요로 하는 진단 문제의 경우, 단백질과 핵산과 같은 다른 물질 군을 나란히 감지할 수 있는 검출 방법이 유리하다. 여러 분자 종류의 동시 검출을 허용하는 문헌에 기술된 검출 방법은 보편적으로 적용 가능한 방법(Das et al. 2012)이 아니며, 검출 반응이 실행 중에 많은 시간과 노력을 수반하는 여러 단계에서 수행되어야 한다는 추가적인 단점이 있다(Linardy et al., 2016)..
이로 인해 여러 분석 물질을 동시에 검출할 수 있고 최신 기술의 단점을 피할 수 있은 서열 특이적 보편적인 검출 방법이 필요하다. 또한, 후자가 등온 또는 비등온인지 여부에 관계없이, 상이한 증폭 방법에 사용될 수 있는 검출 방법이 요구된다.
따라서, 본 발명은 전술한 최신 기술의 단점을 나타내지 않는 적어도 하나의 표적 분자의 검출을 위한 시스템 및 방법뿐만 아니라 매개체 프로브를 제공하는 과제에 기초한다. 따라서 상기 과제는 서로 다른 분자 종류의 여러 분석 물질을 동시에, 보편적으로 및/또는 서열 특이적으로 검출할 수 있는 매개체 프로브와 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제는 독립항에 의해 해결된다. 유리한 실시 형태는 종속항으로부터 생긴다.
본 발명에 따르면, 본 기술적 과제는 적어도 하나의 표적 분자의 검출을 위한 2부분 매개체 프로브를 제공함으로써 해결된다.
하나 이상의 표적 분자의 검출을 위한 본 발명의 매개체 프로브는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
a) 제1올리고뉴클레오티드는 프로브 영역 및 매개체 결합 영역을 포함하고, 여기서
- 상기 프로브 영역은 표적 분자 및/또는 주형 분자에 대해 친화도를 갖고,
- 상기 매개체 결합 영역은 적어도 하나의 매개체에 대한 친화도를 갖고,
b) 적어도 하나의 추가의 올리고뉴클레오티드는 매개체이고, 이는
- 상기 매개체 결합 영역을 통해 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 결합하고, 및
- 적어도 하나의 검출 분자에 대해 친화도를 가지며, 상기 매개체는 검출 분자와의 상호 작용에 의해 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드로부터 방출된 후 검출 가능한 신호를 트리거한다.
따라서, 본 발명에 따른 매개체 프로브는 매개체 결합 영역(mediator binding region) 및 프로브 영역(probe region)을 포함하는 제1분자 또는 올리고뉴클레오티드, 및 제2분자 또는 올리고뉴클레오티드, 매개체를 포함한다. 제1분자의 프로브 영역은 표적 및/또는 주형 분자에 대한 친화도를 가지며, 상기 매개체 결합 영역은 매개체 또는 매개체들에 대한 친화도를 갖는다. 상기 프로브 영역이 상기 표적 분자와 직접 상호 작용할 수 없는 경우 주형 분자가 사용된다. 결과적으로, 주형 분자는 표적 분자와 프로브 영역 사이의 매개체 역할을 한다.
표적 분자 및/또는 주형 분자에 대해 프로브 영역의 결합 후, 상기 매개체는 분자, 바람직하게는 DNA 가닥 분리 효과를 갖는 효소 및 추가의 중합 효과를 갖는 특정 버전, 바람직하게는 비치 변이 중합효소에 의해 매개체 결합 영역으로부터 분리(displace)된다. 상기 매개체와 검출 분자의 상호 작용은 검출 가능한 신호를 유발한다. 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)는 가닥 치환 활성을 가지며, 증폭 동안 증폭된 가닥에 상보적인 가닥을 치환한다.
매개체 프로브의 보편적 적용 가능성을 이용함으로써, 그것을 다른 표적 분자의 검출에 사용할 수 있다는 것이 완전히 놀랍다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 다수의 매개체 프로브를 사용하여 하나의 샘플에서 다수의 표적 분자를 동시에 검출하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 매개체 프로브는 표적 분자 및/또는 주형 분자의 임의의 핵산 서열의 범용 서열 의존 검출을 가능하게 한다. 검출 분자는 매개체 프로브의 표적 서열 또는 프로브 영역과 독립적인 고정된 디자인을 갖는 것을 사용할 수 있다.
놀랍게도, 매개체의 방출 및 검출 분자와의 상호 작용에 의한 후속 신호 생성이 상이한 증폭 방법에 적용될 수 있고 특정 시스템에 국한되지 않는 것이 가능하다. 상이한 증폭 방법에서 각각의 조건을 엄밀히 이용함으로써, 상기 언급된 매개체 방출은 각각의 시스템에 쉽게 적응될 수 있다.
표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머에 기초한 표적 핵산 서열의 검출을 위한 다양한 최신 기술 시스템이 있다. 그러나 본 발명에 따른 시스템 및 본 발명에 따른 매개체 프로브에 기초한 본원에 기재된 본 발명에 따른 방법과는 대조적으로, 이들 방법은 표적 서열과는 독립적으로 상이한 표적 특이적 분자로 수행될 수 있는 보편적인 검출 방법이 아니다.
형광단(fluorophore) 및 소광제(quencher)와 같은 신호 생성 변형은 종종 표적 서열 특이적 올리고뉴클레오티드(프라이머)에 적용된다. 이러한 경우, 신호 생성 분자는 각각의 표적 분자에 대해 개별적으로 설계되고 최적화되어야 하기 때문에 상이한 검출 반응에 사용될 수 없다. 따라서, 최근 기술에 비해 본 발명의 큰 이점은 본 발명에 따른 매개체 프로브와 관련하여 불리는 신호 발생 보편적(signal-generating universal) 검출 분자의 보편적 적용이다. 이러한 보편적 리포터 분자는 신호 생성 분자를 포함 하나 표적 서열 특이적 세그먼트를 포함하지 않는다. 보편적 리포터 분자는 리포터 분자를 재설계하거나 최적화할 필요없이 다른 표적 분자를 검출하는데 사용될 수 있다. 두 부분으로된 매개체 프로브만 조정해야 한다. 본 발명에 따른 매개체 프로브는 또한 단순화된 프라이머 디자인을 특징으로 한다. 최근 기술 시스템과는 대조적으로, 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 형광 또는 링커 분자가 가능한 분자를 포함할 필요가 없으며 제2표적 서열 특이적 영역을 포함하지도 않는다.
증폭 과정 동안, 프라이머의 형광단- 및 소광제-표지된 잔기(remainder)는 가닥-분산 중합효소(strand-dispersing polymerase)에 의해 표적 분자로부터 치환되어, 상기 신호를 원래의 상태로 복원하고 지속적인 신호 변화를 보장하지 못한다. 또한, 많은 최신 검출 방법은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 예를 들어 중합효소를 필요로 하지만, LAMP 또는 RPA의 경우, 본 발명에서 사용된 중합효소는 이 뉴클레아제 활성을 보유하지 않는다. 본 발명에 따르면, 뉴클레아제 활성은 바람직하게는 필요하지 않기 때문에, 등온 증폭 방법이 또한 사용되는 이유이다. 그러나 최신 검출 방법의 대부분은 LAMP와 같은 등온 증폭 방법과 함께 사용할 수 없다.
최신 기술 절차와 대조적으로, 본 발명에 따른 절차는 바람직하게는 상기 매개체 프로브가 분리되지 않는다. 설명된 시스템과는 달리, 상기 매개체 프로브는 두 부분으로 이루어져 있으며, 상기 매개체의 방출은 공유 결합을 분리하지 않고 치환에 의해 일어날 수 있다. 이것은 뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소가 사용되지 않는 등온 증폭 반응에서 표적 분자의 실시간 검출을 가능하게 한다. 또한, 매개체 프로브마다 다중 매개체를 사용함으로써 검출 신호가 증폭될 수 있고 프로브의 다른 매개체가 다른 검출 신호를 생성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 매개체 프로브마다 복수의 매개체가 사용되더라도 표적 분자에 대한 하나의 특이적 결합 부위만이 필요하다. 그러나 알려진 최신 기술 시스템이나 절차의 경우, 여러 매개체가 방출될 경우 여러 개의 완전한 매개체 프로브 시스템을 사용해야 한다.
표적 분자 특이적 서열을 갖는 프라이머를 포함하고 형광단-표지 프로브와 혼성화할 수 있는 최신 기술 시스템이 알려져 있다. 그러나 이들 방법과는 대조적으로, 바람직하게는 본 발명에 따른 2부분 매개체 프로브의 매개체는 신호 발생을 위한 임의의 마킹을 운반하지 않는다. 형광단이 별도의 프로브를 통한 하이브리드화에 의해 프라이머에 결합되면, 상기 형광단은 여전히 프라이머의 표적 서열-특이적 부분에 의해 영향을 받을 수 있다. 구아닌 염기가 프라이머 서열에 존재한다면, 상기 형광단의 형광 수율은 구아닌 염기에 의해 부정적으로 영향을 받을 수 있다. 따라서, 프라이머 서열에서 표적 서열-특이적 섹션에 의해 분리된 프로브 상의 형광단의 형광 수율의 영향/의존성이 발생한다. 또한, 대부분의 경우, 보편적인 서열을 갖는 검출 분자는 사용되지 않는다.
최신 기술 프라이머는 헤어핀 형성 서열 및 공유적으로 또는 혼성화된 프로브에 의해 결합된 corridorophore로 기술된다. 상기 헤어핀 형성 서열은 제2표적 서열-특이적 영역을 포함한다. 그러나 바람직하게는, 본 발명에 따른 매개체 프로브의 제1부분은 단 하나의 표적 서열-특이적 영역 또는 서열을 함유한다. 또한, 본 발명에 따른 매개체 프로브는 바람직하게는 헤어핀 형성 서열 및 오직 하나의 표적 서열-특이적 영역을 포함하지 않는다. 또한, 공지된 시스템은 프라이머 및 종종 2개의 추가적으로 표지된 프로브를 필요로 하여, 따라서 적어도 하나의 프로브가 표적 서열-특이적이다. 따라서, 이러한 프라이머/프로브 시스템은 표적 분자-특이적 서열을 갖는 2개 또는 3개의 분자로 구성된다. 반대로, 본 발명의 매개체 프로브는 바람직하게는 표적 분자-특이적 서열을 갖는 하나의 분자만을 갖는다. 또한 특정 버전의 조정자 프로브에는 마킹이 포함되어 있지 않는다. 매개체는 또한 바람직하게는 표적 분자-특이적 서열을 포함하지 않는다.
본 발명은 공지된 최신 기술에 비추어 완전히 새롭고 놀라운 발전이다. 최신 기술은 효소의 가닥 분산 활성(strand-dispersing activity)과 유사한 검출 시스템을 나타내지 못한다. 오히려, 그것은 가닥 치환 활성이 없는 중합효소로 PCR 조건하에서 수행될 수 있은 검출 방법을 기술한다.
가닥 분산 효과를 갖는 효소에 의한 매개체의 활성 치환을 이용하는 본 발명에 따라 매개체 프로브, 시스템 및 절차가 개발되었다는 것은 완전히 놀랍다. 많은 최신 기술 공정은 사용된 중합효소의 핵산 분해 효소 활성(nuclease activity)에 기반을 두고 있으며 이는 절대적으로 필요하다. 분열(fission)과 치환(displacement) 반응 사이에는 명백한 연관성이 없다. 또한 많은 수의 반응 조건이 여러 가지 방법으로 변형되거나 재조합되어야 하기 때문에, 전문가가 치환 효소와 함께 작용하는 방식으로 중합효소의 핵산 분해 효소 활성을 이용하는 공지된 방법을 적용시키는 것은 명백하거나 사소하지 않다.
전문가는 널리 알려진 검출 원리를 적용하지 않고 알려진 범용 검출 방법을 혼성화된 표적 서열-특이적 프라이머 및 표적 서열-특이적 프로브를 사용하여 공지된 방법과 조합하는 것도 명백하지 않다.
본원에 기술된 본 발명에 따른 매개체 프로브의 장점은 특히 매개체 프로브, 본 발명에 따른 시스템 및 본 발명에 따른 절차의 바람직한 실행 버전에 적용된다.
본 발명의 문맥에서 표적 분자의 검출은 조사될 샘플에서 표적 분자의 존재를 정량적으로 또는 정성적으로 검출된다는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 표적 분자는 샘플에서 그 존재가 검출되어야 하는 분자이다. 그것은 핵산 분자, 단백질, 펩타이드, 당 분자, 지질, 또는 글라이코실화된 단백질 또는 다른 글라이코실화된 생체 분자와 같은 이들 분자의 조합물과 같은 생체 분자이지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 의미에서 용어 핵산은 DNA, RNA, PNA, ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA, tRNA, lncRNA, ncRNA, microRNA, siRNA, rRNA, sgRNA, piRNA, rmRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, gRNA, viral RNA, 또는 LNA와 같은 변형된 RNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 의미에서 올리고뉴클레오티드는 대략 200개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 비교적 짧은 길이의 핵산 분자이다.
올리고뉴클레오티드는 형광 공여체 및/또는 형광 수용체 및 블록 그룹과 같은 다른 분자 또는 화학 그룹에 공유 결합 및 비공유 결합될 수 있다.
본 발명의 의미에서 용어 당(sugar) 분자는 특히 탄수화물 또는 당류이며, 모노-, 디-, 올리고- 및 폴리사카라이드를 포함한다. 글라이코실화(Glycosylation)는 탄수화물이 단백질, 지질 또는 다른 아글리콘(aglycone)에 결합되어 있는 일련의 효소 반응 또는 화학 반응을 나타냅니다. 단백질의 경우 글리코프로테인 또는 펩티도글리칸, 지질의 경우 글리코리피드와 같이 생성된 반응 생성물은 글리코시드라 불린다.
본 발명의 의미에서 용어 "지질"은 극성이 낮기 때문에 소수성(또는 친유성) 용매에서 매우 잘 용해되는, 완전히 또는 적어도 대부분 불수용성(소수성) 물질을 의미한다. 지질은 세포막의 구조적 구성 요소이며 에너지 저장이나 신호 분자로서 생명체에서 사용된다. 대부분의 생물학적 지질은 양친매성이며, 즉, 이들은 친유성 탄화수소 잔기 및 극성 친수성 헤드 그룹을 가지며, 이것은 물과 같은 극성 용매에서 미셀 또는 막을 형성하는 이유이다. 지질 그룹은 특히 지방산, 트리아실글리세라이드(지방 및 지방 오일), 왁스, 인지질, 스핑고리피드, 지질다당류 및 이소프레노이드(스테로이드, 카로티노이드 등)를 포함한다.
상기 프로브 영역은 바람직하게는 표적 분자 및/또는 주형 분자의 부분에 상보적(complementary)이다. 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 프로브 영역은 표적 분자 및/또는 주형 분자에 결합한다. 상기 결합은 표적 분자 및/또는 주형 분자에 대한 친화도를 가지기 때문에 매개체 프로브의 프로브 영역을 통해 일어난다. 매개체 결합 영역은 주형 분자에 대한 어떠한 친화도를 가질 필요가 없으며 상보적인 서열 세그먼트를 가질 필요가 없다.
상기 매개체는 바람직하게는 검출 분자의 섹션에 대한 상보적 영역을 갖는다. 상기 매개체는 검출 분자에 결합하여 검출 가능한 신호를 유발한다. 상기 검출 가능한 신호는 표적 분자 또는 주형 분자의 존재에 관해 결론을 도출하도록 한다. 주형 분자 자체는 검출될 표적 분자일 수 있고 또는 이는 표적 분자의 존재에 관한 정보가 상기 주형 분자를 통해 생성될 수 있도록 표적 분자와 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 검출 분자는 표적 분자가 간접적으로 상호 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드이며, 프로세싱에 의해 검출 반응을 일으킬 수 있다(예를 들어, 형광 신호, 전기 화학적 신호 또는 질량의 변화).
주형 분자는 본 발명의 검출 방법에 사용되는 시약, 예를 들어, 프라이머 또는 프로브 또는 본 발명의 매개체 프로브가 표적 분자와 직접 상호 작용할 수 없는 경우에 사용될 수 있는 핵산 분자이다. 그러므로 주형 분자는 표적 분자와 프라이머 또는 프로브 사이의 매개체로서 사용될 수 있다. 압타머는 일반적으로 주형 분자로 사용된다.
압타머(Aptamer)는 구조적 특성으로 인해 다른 분자 또는 분자 복합체와 상호 작용하거나 결합하는 올리고뉴클레오티드이다. 압타머에 의해 결합된 분자는 단백질, 펩티드, 당 분자, 지질 분자, 핵산 분자 또는 이들 분자로부터 형성된 분자 복합체일 수 있다. 압타머는 결합 및 결합되지 않은 상태에서 상이한 구조를 취할 수 있으므로, 예를 들어 압타머의 상이한 서열 영역은 구조에 따라 프라이머 또는 프로브와 같은 상보적 올리고뉴클레오티드와의 상호 작용을 위해 접근 가능하다.
본 발명의 의미에서 상호 작용(interaction)은 서로 다른 상호 작용 분자의 서로간의 상호 작용을 지칭한다. 이것은 예를 들어 두 분자 사이의 공유 결합 또는 비공유 결합, 또는 예를 들어 분자 복합체 내에서 하나 이상의 다른 분자에 의해 매개되는 간접 결합일 수 있다.
본 발명의 의미에서, 검출 가능한 신호는 물리적으로 또는 화학적으로 측정될 수 있은 임의의 종류의 변화를 나타낸다. 이러한 변화는 절단, 소화, 가닥 중복, 내부 하이브리드화, 인산화, 탈인산화, 아미드화, 화학 그룹의 결합 또는 절단, 형광, 인광 또는 발광 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 매개체 프로브의 바람직한 설계에서, 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드 및/또는 매개체는 신호 발생을 위한 마커를 포함하지 않는다. 이러한 비표지된(unlabeled) 매개체 프로브의 결정적인 이점은 새로운 분석을 최적화하기 위한 노동 및 비용의 필요없이 적어도 하나의 표적 분자의 검출을 위한 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다는 것이다. 최신 기술과는 달리, 매개체 프로브는 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 이는 형광 공여체 및/또는 형광 수용체 및 블록 그룹(block group)과 같은 기술적으로 복잡한 변형 없이 비용 효율적으로 합성될 수 있다.
용어 표지(label)는 검출 가능한 (바람직하게는 정량화 가능한) 신호를 제공하는데 사용될 수 있고 핵산 또는 단백질 또는 다른 생체 분자에 공유 결합 또는 비공유 결합할 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 우선적으로 지칭한다. 상기 표지는 산화 환원 반응, 발광, 형광, 방사능, 비색계, 중력계, X-선 회절 또는 흡수, 자력, 효소 활성 등으로 감지할 수 있는 신호를 제공할 수 있다.
바람직한 버전에서, 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드 및/또는 매개체는 신호 생성을 위한 하나 이상의 마커, 바람직하게는 형광 분자, 산화 환원 분자, 발광 분자 또는 다른 신호 발생 유닛을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 버전에서, 상기 매개체는 신호 생성을 위한 하나 이상의 마커, 바람직하게는 형광 분자, 산화 환원 분자, 발광 분자 또는 다른 신호 발생 분자 또는 다른 신호 발생 유닛을 포함한다. 본 발명에 따라, 매개체 프로브로부터의 치환 후, 상기 매개체는 신호 생성을 위한 적어도 하나의 표지를 또한 포함하는 검출 분자에 결합하여 검출 가능한 신호 변화를 일으킬 수 있다.
예를 들어, 상기 매개체 프로브에 결합된 매개체는 특정 파장 λ1에서 방출하는 형광 공여체/수용체로 표시할 수 있다. 매개체 프로브의 치환 후, 상기 매개체는 λ1과 다른 제2파장 λ2에서 방출되는 형광 수용체/공여체로 표지된 검출 분자에 결합할 수 있다. FRET 메커니즘을 통해 형광 공여체로부터 형광 수용체로의 에너지 전달은 형광 수용체의 방사선 세기의 검출 가능한 증가를 유도하여, λ2의 방출이 검출되도록 한다. 대안으로, 화학 발광 또는 생물 발광 공여체 분자가 사용될 수 있다. 비-방사성 형광 수용체는 또한 바람직한 설계에서 사용될 수 있다. 상이한 수의 뉴클레오티드를 갖는 검출 분자를 사용함으로써, 상이한 표적 분자는 용융 곡선 분석에 의해 하나의 샘플에서 동시에 구별될 수 있다.
매개체를 표시함으로써, 설명된 검출 방법의 보편적 특성은 상기 매개체가 보편적인 표적 서열 독립적 분자이기 때문에 손실되지 않는다. 추가의 설계에서, 표적 분자 당 복수의 프로브 또는 프라이머를 사용하여 표지된 매개체가 결합될 수 있고, 매개체와 표지의 서열이 상이할 수 있다. 예를 들어, 상이한 방출 파장을 갖는 형광 염료가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 매개체 프로브의 바람직한 버전은 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드로부터의 매개체의 방출은 매개체 프로브가 결합된 표적 분자 및/또는 주형 분자의 증폭 동안 발생하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 의미에서 증폭 또는 증폭 반응이라는 용어는 생체 분자, 바람직하게는 핵산 분자의 증폭을 의미한다. 핵산은 중합효소로 알려진 효소의 도움으로 증폭된다. 증폭에서, 초기 서열은 앰플리콘(amplicon)으로, 생성물은 앰플리케이트(amplificate)로 지칭된다.
본 발명에 따른 매개체 프로브의 바람직한 버전에서, 제1올리고뉴클레오티드는 1 내지 200개, 바람직하게는 20 내지 80개, 특히 바람직하게는 35 내지 65개 뉴클레오티드를 가지며, 상기 매개체는 1 내지 60개, 바람직하게는 10 내지 50개, 특히 바람직하게는 15개 내지 40개 뉴클레오티드를 가진다.
본 발명에 따른 매개체 프로브의 바람직한 버전에서, 표적 분자 및/또는 주형 분자는 핵산, DNA, RNA, 펩티드, 단백질, 압타머 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체 분자이다.
본 발명의 바람직한 실시 예에서, 상기 표적 분자는 주형 분자이다. 다른 바람직한 버전에서, 상기 표적 분자는 주형 분자와 상호 작용한다.
본 발명에 따른 매개체 프로브의 바람직한 버전에서, 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 증폭 반응의 시작점으로서 작용하여 프라이머로서 작용할 수 있다. 이것은 알려진 최신 기술 솔루션에 비해 결정적인 장점으로, 이유는 새로운 표적 분자에 대한 매개체 프로브가 완전히 재설계될 필요가 없으며 표적 분자의 프로브 영역이 선택되기 때문이며, 기존의 프라이머는 본 발명에 따른 매개체 프로브로서 기능할 수 있는 방식으로 용이하게 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 매개체 프로브의 또 다른 바람직한 버전에서, 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 증폭 반응의 시작점으로서 작용하지 않는다. 표적 분자가 없는 경우, 상응하는 매개체 프로브는 그것이 폐쇄형이고, 매개체가 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 결합되도록 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 상기 표적 분자의 존재하에서, 상기 매개체 프로브는 표적 분자 또는 주형 분자에 결합하고, 따라서 프라이머는 현재 개방된 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 적합한 효소 시스템으로 처리함으로써 부착된 프라이머를 연장시킬 수 있으며, 이에 의해 매개체 프로브가 매개체를 대체한다. 방출된 매개체는 특정 검출 분자의 도움을 받아 탐지할 수 있다. 바람직한 실시 예가 실시 예 18에 나와 있다.
바람직한 설계에서, 본 발명에 따른 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드는 압타머 영역, 매개체 결합 영역 및 프라이머 결합 영역을 포함할 수 있다. 검출될 표적 분자는 예를 들어, 단백질 또는 펩타이드일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 표적 분자가 존재하지 않는 경우, 프라이머는 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 프라이머 결합 영역에 결합할 수 있고 적절한 효소 시스템을 사용하여 프라이머의 3' 말단을 연장시킴으로써 상기 매개체는 매개체 프로브로부터 방출된다. 상기 방출된 매개체는 특정 검출 분자 또는 방법을 사용하여 검출 가능한 신호를 유발할 수 있다. 상기 표적 분자의 존재하에서, 상기 매개체 프로브의 압타머(aptamer) 영역은 표적 분자에 결합하고, 따라서 상기 프라이머 결합 영역에 부착된 프라이머는 연장될 수 없으며, 따라서 상기 매개체 프로브는 매개체를 방출하지 않는다. 상기 표적 분자가 존재하면, 표적 분자가 없는 것과 비교하여 신호 강하가 검출된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브 및 적어도 하나의 검출 분자를 포함하는 시스템에 관한 것으로, 상기 적어도 하나의 검출 분자는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 적어도 하나의 매개체와 상호 작용하는 적어도 하나의 제1영역을 포함하고, 상기 적어도 하나의 검출 분자는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 적어도 하나의 매개체와 상호 작용하는 적어도 하나의 제1영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
a) 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상에 결합하기 위한 화학적 그룹 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질(redox modification) 및/또는 발광 변화(luminescence modification)를 포함하는 제2영역, 및/또는
b) 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상에 결합하기 위한 화학적 그룹 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질(redox modification) 및/또는 발광 변화(luminescence modification)를 포함하는 제3영역,
또는
c) 형광 공여체 및/또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제1프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제4영역, 및/또는
d) 형광 공여체 및/또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제2프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제5영역
또는
e) 두 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 2개의 올리고뉴클레오티드 둘다 또는 둘 중 어느 하나는 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상에 결합하기 위한 화학적 그룹 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질(redox modification) 및/또는 발광 변화(luminescence modification)를 포함한다.
하나 이상의 검출 분자와 상호 작용하는 프로브는 본 발명의 의미에서 검출 분자의 성분으로 간주될 수 있다. 이 경우, 상기 검출 분자는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
여기에 기술된 검출 분자의 상이한 영역은 발명의 바람직한 버전에서 중복되거나 동일할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브 및 적어도 하나의 검출 분자를 포함하는 시스템에 관한 것으로, 상기 적어도 하나의 검출 분자는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 적어도 하나의 매개체와 상호 작용하는 적어도 하나의 제1영역을 포함하고, 상기 적어도 하나의 검출 분자는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 적어도 하나의 매개체와 상호 작용하는 적어도 하나의 제1영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
a) 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질 및/또는 발광 개질에 결합하기 위한 화학 그룹을 포함하는 제2영역, 및/또는
b) 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질 및/또는 발광 개질에 결합하기 위한 화학 그룹을 포함하는 제3영역,
또는
c) 형광 공여체 및/또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제1프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제4영역, 및/또는
d) 형광 공여체 및/또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제2프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제5영역.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브 및 적어도 하나의 검출 분자를 포함하는 시스템으로,
상기 적어도 하나의 검출 분자는 올리고뉴클레오티드이고, 적어도 하나의 매개체와 상호작용하는 적어도 하나의 제1영역, 및
a) 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상에 결합하기 위한 화학적 그룹 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질(redox modification) 및/또는 발광 변화(luminescence modification)를 포함하는 적어도 하나의 검출 분자의 5' 말단에서의는 제2영역, 및
b) 형광 공여체 또는 형광 수용체 및/또는 산화 환원 개질 및/또는 발광 변화 및/또는 고체상 및/또는 화학적 보호기에 대한 결합을 위한 화학적 그룹을 포함하는 제3영역,
또는
c) 형광 공여체 및/또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제1프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제4영역, 및/또는
d) 형광 공여체 및/또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제2프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제5영역을 포함한다.
본 발명에 따른 매개체 프로브의 보편적 적용성을 엄밀히 이용함으로써, 상이한 표적 분자의 검출에 본 시스템을 사용할 수 있다. 몇 가지 보편적 매개체 프로브를 사용하여 여러 표적 분자를 하나의 샘플에서 동시에 검출할 수 있다.
형광 공여체와 수용체는 보편적인 검출 분자에 결합하고 표적 서열-특이적 분자에 결합하지 않기 때문에 상기 형광 수율과 기본 신호는 표적 분자의 구조에 영향을 받지 않는다. 최신 기술과는 대조적으로 최적화된 검출 분자는 형광 수율 또는 기본 신호를 희생시키지 않고 다른 분석법에서 사용할 수 있다.
형광 수용체 또는 수용체 염료는 형광 공여체로부터 에너지를 흡수할 수 있는 분자이다. 형광 수용체는 또한 본 발명의 의미에서 소광제(quencher)로 기술될 수 있다. 상기 흡수 효율은 다른 것들 중에서 특히 형광 수용체와 형광 공여체 사이의 거리에 의존한다. 형광 수용체는 λ2의 방출을 위하여 λ1을 갖는 광자를 흡수함으로써 활성화될 수 있고 또는 비방출성일 수 있고 형광 퀸칭을 유도할 수 있다.
형광 공여체는 형광이 가능한 염료 분자 또는 형광단이다. 방사선에 의해 활성화되는 형광 공여체는 쌍극자-쌍극자 상호 작용을 통해 형광 수용체에 방사선 없이 에너지를 전달할 수 있다. 이것은 형광 공여체의 형광 신호를 ??칭(quench)시킨다. 대안적으로, 검출될 형광 공여체의 형광 신호는 정적 및 동적 퀸칭에 의해 영향을 받을 수 있다.
형광 물질(또는 형광단과 유사한 형광 색소)은 빛을 발산할 때 빛을 다시 방출할 수 있는 형광 화합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 표지로서 사용하기 위한 형광 물질은 로다민 및 Texas Red, Fluorescein, 5-브로모메틸 프루로레세인(5-bromomethyl fluorescein) Lucifer Yellow, IAEDANS, 7-Me2N-쿠마린-4-아세테이트, 7-OH-4-CH3-쿠마린 -3-아세테이트, 7-NH2-4CH3-쿠마린-3-아세테이트(AMCA), 모노브로모비만, Cascade Blue 와 같은 피렌트리설포네이트(pyrenetrisulfonate), 및 모노브로모트리메틸암모니오비만, FAM, TET, CAL Fluor Gold 540, HEX, JOE, VIC, CAL Fluor Orange 560, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TMR, CAL Fluor Red 590, ROX, LC red 610, CAL Fluor Red 610, Texas red, LC red 610, CAL Fluor Red 610, LC red 640, CAL Fluor Red 635, Cy5, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, LC red 705, Cy5.5, BODIPY FL, Oregon Green 488, Rhodamine Green, Oregon Green 514, Cal Gold, BODIPY R6Gj, Yakima Yellow, JOE, HEX, Cal Orange, BODIPY TMR-X, Quasar-570 /Cy3, TAMRA, Rhodamine Red-X, Redmond Red, BODIPY 581/591, Cy3.5, Cal Red/Texas Red, BODIPY TR-X, BODIPY 630/665-X, Pulsar-650, Quasar-670/Cy5과 같은 유도체를 포함한다.
"??칭(Quenching)"은 특정 물질의 형광 강도를 감소시키는 모든 과정을 의미한다. ??칭은 포스터 공명 에너지 전달(Forster resonance energy transfer;FRET) 분석의 기초이다. FRET은 공여체가 활성화된 상태에서 에너지 전달이 일어나기 때문에 동적인 소멸 메커니즘(extinguishing mechanism)이다. 소광제(quencher)는 광원에 의해 활성화될 때 형광 물질(fluorophore)에 의해 방출된 FRET을 통해 형광을 소멸시키는 분자이다. 본 발명의 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 프로브를 제조하는데 사용하기 위한 소광제는 바람직하게는 DDQ-I, Dabcyl, Eclipse, TAMRA, Iowa Black FQ, BHQ-1, QSY-7, BHQ-2, DDQ-II, Iowa Black RQ, QSY-21, BHQ-3, QSY-35, BHQ-0, QSY-9, ElleQuencher, Iowa Black을 포함한다. 전문가는 다음 문헌에서 설명한대로 적절한 기자 소광제 쌍을 선택할 수 있다; [Johansson, M.K. Methods in Molecular Biology 335, 17 - 29 (2006); Marras, S.A. Methods in Molecular Biology 335, 3-16 (2006)]
본 발명에 따른 시스템의 바람직한 버전에서, 상기 검출 분자는 헤어핀 구조를 갖는다. 여기서, 상기 헤어핀 구조는 내부 서열 부분에 상보적으로 하이브리드화하는 검출 분자의 5' 말단 및 짝없는(unpaired) 서열 부분을 포함하는 검출 분자의 3' 말단에 의해 형성될 수 있다.
또한, 검출 분자는 본 발명에 따라 5' 말단 및/또는 헤어핀 구조 내에 적어도 하나의 형광 변형(modification) 또는 산화 환원 변형 또는 발광 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 의미에서의 상기 헤어핀 구조는 내부 염기쌍에 의해 정렬된 서열 세그먼트를 포함하는 선형 핵산 분자 또는 올리고뉴클레오티드의 2차 구조를 의미한다. 이러한 구조는 (일반적으로 회문(palindromic) 염기 서열을 갖는) 동일 분자의 두 영역이 이중 나선을 형성할 때 발생하며, 이중 나선은 말단에서 짝없는(unpaired) 루프에 의해 종결된다.
헤어핀 구조의 형성 후에, 5' 말단의 형광 공여체 또는 형광 수용체(제2영역) 및 제3영역의 형광 공여체 또는 형광 수용체가 서로 상호 작용하여 형광 신호(FRET)를 억제할 수 있다. 제2 및 제3영역에서의 검출 분자의 형광 공여체 및 형광 수용체 변형에 대한 대안으로서, 산화 환원 분자, CRET(chemiluminescence resonance energy transfer) 쌍 및 인터칼레이팅 분자와 같은 (이에 제한되지 않음) 다른 신호 발생 변형(generating modification)이 사용될 수 있다.
방출 후, 상기 매개체는 반응 용액에 확산적으로 존재하며, 헤어핀-형 검출 분자의 3' 말단에서 짝없는 서열 섹션에 위치한 검출 분자의 제1영역과 상호 작용할 수 있다. 상기 검출 분자는 고체상에 고정되거나 용액 중에 존재할 수 있다. 상기 검출 분자에 결합된 매개체의 연장은 적합한 보조 분자, 예를 들어 비치 치환 중합효소에 의해 영향을 받을 수 있으며, 검출 분자의 내부 서열 섹션과 상보적으로 하이브리드화되고 따라서 헤어핀 구조를 형성하는 검출 분자의 제2영역(5' 말단)은 중합효소 또는 상기 매개체의 확장된 3' 말단에 의해 각각 치환된다. 이것은 5' 말단을 치환함으로써 형광 수용체와 형광 공여체 사이의 거리를 증가시키고 이전에 억제된 형광 공여자의 형광 신호를 회복시킨다. 대안적으로, 매개체 또는 그것의 연장 생성물 및 상기 검출 분자의 이합체 구조의 형성에 의하여 검출 분자의 5' 말단에서 산화 환원 분자의 거리는 검출 분자의 3' 말단 또는 CRET 변화의 효율 또는 분자의 인터칼레이션의 변화와 관련하여 변화한다. 혼성화된 5' 말단을 치환시킴으로써, 2차 구조 또는 헤어핀 구조의 형성이 제거된다. 이 경우, 매개체는 검출 분자의 5' 말단까지 기술된 보조 분자에 의해 상보적으로 연장될 수 있다.
본 발명에 따른 시스템의 바람직한 설계에 따르면, 상기 검출 분자는 분자 비콘(beacon)의 구조를 가지며 적어도 하나의 매개체 결합 영역을 포함한다. 상기 분자 비콘은 그들의 자연 상태(native state)에서 헤어핀 구조를 형성하는 자체-상보적 가닥 말단을 갖는 이중 표지(doubly labeled) 검출분자의 특수 부류(class)이다. 분자 비콘은 가닥 말단에 형광 공여체 및 형광 수용체와 같은 표지를 붙일 수 있으므로 상기 표지는 선호하는 버전에서 서로 상호 작용할 수 있다. 상기 헤어핀 구조는 형광 공여체와 형광 수용체를 서로 근접하게 이동시켜 형광 신호를 억제한다. 매개체와의 혼성화는 상기 매개체가 확장되는 증폭 반응의 일부로서, 형광 공여체와 형광 수용체를 공간적으로 분리하고, 형광 신호를 생성합니다. 내부 표지를 지닌 검출 분자에 대한 분자 비콘의 형태의 검출 분자의 이점은 말단 표지(예를 들어 형광 표지)에 대한 합성 비용이 낮다는 것이다.
또 다른 바람직한 설계에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브 및 적어도 하나의 검출 분자를 포함하는 시스템에 관한 것으로, 상기 하나 이상의 검출 분자는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
- 제1올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 매개체와 상호작용하는 제1영역 및 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상에 결합하기 위한 화학적 그룹 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질(redox modification) 및/또는 발광 변화(luminescence modification)를 포함하는 제2영역을 포함하고, 및
- 제2올리고뉴클레오티드는 형광 수용체 또는 형광 공여체 및/또는 고체상에 결합하기 위한 화학적 그룹 및/또는 화학적 보호기 및/또는 산화 환원 개질(redox modification) 및/또는 발광 변화(luminescence modification)를 포함하는 제3영역을 포함하고,
- 여기서 상기 제1 및 제2올리고뉴클레오티드는 서로 혼성화(hybridizing) 영역을 갖는다.
이러한 설계에 따르면, 검출 분자는 2개의 혼성화된 표지된 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 상기 2개의 올리고뉴클레오티드의 2개의 표지는 각각 올리고뉴클레오티드의 말단에 부착된 하나 이상의 형광 수용체 또는 형광 공여체일 수 있으며, 이에 의해 상기 2량체(dimer)의 형광 신호는 2개의 표지의 공간적 근접성에 의해 감쇠 또는 억제된다. 하나 또는 둘 모두의 올리고뉴클레오티드는 또한 매개체 결합 영역을 갖는다. 상기 매개체를 매개체 결합 영역에 부착시키고 이어서 연장시킴으로써, 상기 표지된 뉴클레오티드를 분리시키고 표지된 5' 및 3' 말단을 서로 공간적으로 분리하여 검출 가능한 신호 증가를 초래한다. 이 구조의 장점은 말단 및 단일 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 대한 합성 비용이 매우 낮다는 것이다. 상기 검출 분자의 이러한 디자인의 바람직한 변형이 도 19에 도시되어 있다.
본 발명의 시스템의 바람직한 설계에 따르면, 상기 검출 분자는 고체상 및/또는 화학적 보호기에 결합하기 위한 화학 그룹(chemical group)을 포함하는 검출 분자의 3' 말단에 제6영역을 포함한다.
본 발명의 의미에서의 상기 보호기(protective group)는 일시적으로 특정 관능기를 보호하고 따라서 바람직하지 않은 반응을 방지하기 위해 분자에 도입된 치환기를 말한다. 원하는 반응이 분자의 다른 곳에서 수행된 후에는 상기 보호기를 다시 분리할 수 있다.
바람직한 설계에서, 상기 검출 분자는 용액 중에 자유롭게 존재한다. 다른 바람직한 디자인에서, 상기 검출 분자는 고체상에 결합된다. 상기 검출 분자는 각각의 검출 방법에 적합한 반응 용기에서 고체상에 고정화된다. 요구되는 샘플 및 시약은 반응 용기에 첨가될 수 있고 혼합물은 적절한 조건하에서 배양될 수 있다. 샘플은 DNA, RNA 및/또는 펩타이드 또는 단백질로 구성될 수 있다. 상기 표적 분자가 존재하면, 매개체는 매개체 프로브에 의해 치환되거나 방출되고 반응 혼합물 내에서 고정화된 검출 분자로 확산될 수 있다.
본 발명의 바람직한 버전에서, 신호 변화는 매개체의 방출 후에 검출되고 고체상의 전기 화학적 검출에 의해 검출 분자에 결합한다. 상기 검출 분자는 고체 상을 동시에 나타내는 전극 상에 고정화된다. 상기 방출된 매개체는 검출 분자의 매개체 결합 영역에 혼성화될 수 있고, 예를 들어, 중합효소에 의해 연장될 수 있다. 성공적인 확장 후, 산화 환원 분자는 검출 분자 및 확장된 매개체의 이량체로 삽입되어 검출될 수 있는 전기 화학 신호를 생성할 수 있다.
또한, 충분히 긴 매개체가 검출 분자와 혼성화되고 연장되지 않을 수도 있다. 산화 환원 분자는 검출 분자와 매개체의 이량체로 삽입되어 전기 화학 신호를 생성할 수 있다. 이 설계의 변형이 도 20에 나와 있다.
추가의 버전에서, 상기 매개체 및/또는 검출 분자는 하나 이상의 산화 환원 분자로 표지된다. 매개체가 산화 환원 분자로 표시되어 있다면, 방출된 매개체의 고정화된 검출 분자에 결합은 산화 환원 변형과 전극 표면의 공간적 근접으로 인한 신호 변화를 유도한다. 이 형태의 발명의 변형이 도 21에 도시되어 있다.
더 강한 신호를 얻기 위해 표적 및/또는 주형 분자 당 다수의 매개체를 방출하는 것이 유리할 수 있다. 표적 분자 당 복수의 매개체의 방출은 예를 들어 매개체를 복수의 다른 프라이머에 부착함으로써 달성될 수 있다.
추가 버전에서, 예를 들어, 산화 환원 변형(redox modification)으로 표지된 매개체는 검출 분자와의 혼성화 후에 중합효소에 의해 연장될 수 있으며, 이에 의해 이중 가닥의 유리한 안정화가 달성될 수 있다(도 22).
다른 버전에서, 산화 환원 변형으로 표시된 매개체는 전극 표면으로부터 제거된 검출 분자의 가닥 말단에 결합할 수 있다. 상기 매개체는 더 긴 검출 분자에서 연장될 수 있거나 매개체는 이미 검출 분자와 유사한 길이를 가지며 연장되지 않는다. 산화 환원 분자와 전극 사이의 전하 이동은 DNA의 전기 전도도를 통해 일어나므로 이중 가닥이 형성됨으로써 전도도가 증가한다. 이러한 설계의 변형이 도 23에 나와 있다.
추가 버전에서, 상기 검출 분자는 산화 환원 분자를 가질 수 있고 매개체는 표지가 없을 수 있다. 방출된 매개체는 이제 검출 분자에 결합하여 도 24와 같이 확장될 수 있다. 대안으로, 이미 충분히 긴 매개체가 검출 분자에 결합할 수 있다. 이중 가닥의 형성은 가능한 분자 내 및 분자간 전하 이동 메커니즘으로 인해 DNA의 전기 전도성을 증가시킨다. 결과적으로, 전극에서의 신호 변화가 검출될 수 있다.
전기 화학적 검출은 임피던스 변화, 사이클로볼타메트리(cyclovoltammetry), 네모파전압전류법(square wave voltammetry) 또는 커패시턴스 변화와 같은 다양한 파라미터를 측정함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 버전에서, 상기 매개체의 방출 및 검출 분자에의 결합 후 신호 변화의 검출은 내부 전반사 형광 현미경(total reflection fluorescence microscopy, TIRF)을 통해 수행된다. 이 설계에서, 검출 분자는 TIRF 조명 장치 위의 고체상에 고정화된다. 전반사에 의해 형성된 소산장(evanescent field)은 시료 부피로 침투하고 검출 분자 및/또는 매개체 및/또는 프로브에 위치하거나 또는 이량체에 삽입되는 형광 분자를 촉발시키고, 이로써 형광 신호의 변화를 검출할 수 있다.
다른 바람직한 설계에서, 상기 방출된 매개체의 검출 분자에 결합은 표면 플라스몬 공명 분광법(surface plasmon resonance spectroscopy)에 의해 검출될 수 있다. 표면상에 고정화된 검출 분자에 대한 매개체의 방출 및 후속 결합에 의해, 시료 내의 굴절률의 변화가 검출될 수 있다. 상기 검출 분자는 플라즈몬이 활성화된 금속 표면에 직접 또는 예를 들어 금속 표면에 직접 위치한 멤브레인 내/상에 직접 고정될 수 있다.
검출 분자의 고체상으로의 결합 또는 고정화는 중력 측정(gravimetric measurement)에 의한 매개체의 검출 분자로의 방출 및 결합을 증명하는 데에도 유리하다. 예를 들어, 상기 검출 분자는 캐리어 표면 상에 고정화되고, 그 중량은 진동하는 석영(oscillating quartz)으로 결정될 수 있다. 따라서, 검출 분자에 대한 매개체의 결합으로 인한 중량 변화가 검출될 수 있다.
대안적으로, 상기 검출 분자는 자성 입자 상에 고정화될 수 있다. 이것은 자기 이완시간측정법(magnetic relaxometry)에 의해 표적 분자의 탐지를 가능하게 한다. 자기 이완시간측정법에서 자기 입자가 짧은 자기 펄스에 의해 자화되고 유도된 자기 모멘트의 시간적 저하(temporal degradation)가 감지된다. 매개체가 결합하고 입자에 고정화된 검출 분자를 통해 연장되는 입자의 유체역학 저항성은 더 크다, 즉 매개체가 결합하지 않은 입자의 유체역학 저항성. 매개체가 결합하고 선택적으로 확장되는 입자는 매개체가 결합하지 않는 입자보다 그들의 유도된 자기 모멘트를 더 천천히 저하시킨다. 따라서, 언급된 입자의 유도된 자기 모멘트의 이완 시간은 서로 다르므로, 상기 매개체의 방출이 검출될 수 있다. 자기 이완시간측정법과 용융 곡선 분석을 결합하여 한 샘플에서 다른 표적 분자를 나란히 감지할 수 있다.
본 발명에 따르면, 매개체 및/또는 검출 분자는 적어도 하나의 형광 분자, 산화 환원 분자, 발광 분자 또는 다른 신호 발생 분자로 표지될 수 있다.
상기 검출 분자는 본 발명에 따른 단일-가닥 핵산 분자 또는 핵산 유도체일 수 있다. 복수의 표지된 프로브가 그러한 검출 분자에 혼성화될 수 있다. 상기 매개체가 방출된 후, 그것은 검출 분자에 결합하고 연장된다. 이는 검출 분자에 혼성화된 표지된 프로브를 방출하여 프로브의 표지로부터 검출 가능한 신호 변화를 야기한다. 예를 들어, 형광 공여체 및 형광 수용체로 표지된 프로브의 방출은 형광 공여체와 형광 수용체의 공간적 분리로 인한 형광 증가를 유도한다. 상기 단일-가닥 검출 분자는 선형 또는 원형일 수 있고, 용액 중에서 균질할 수 있거나 또는 고체상에 고정화될 수 있으며, 다수의 매개체 결합 부위를 가질 수 있다. 이러한 형태의 발명은 바람직하게 표적 분자의 부재하에 표지된 프로브가 검출 분자에 결합하는 것을 보장하기 위해 등온 증폭 방법에 사용되고 예를 들어 PCR에 의해 생성된 높은 열 에너지 때문에 검출 분자로부터 해리되지 않는다. 여기에 나타낸 본 발명의 형태의 예가 실시 예 9에 제시되어 있다.
검출 분자가 원형이고 몇몇 매개체 결합 사이트가 삽입되면, 상이한 부위에서 몇몇 매개체를 동시에 결합시킴으로써 신속한 검출 반응이 양호한 동적 범위에서 일어날 수 있다. 상기 검출 분자의 원형 구조는 감도의 추가적인 증가를 가능하게 하는데, 그 이유는 검출 분자상의 매개체의 혼성화 및 확장이 매개체가 결합하는 부위에 관계없이 모든 결합된 표지된 프로브를 방출하기 때문이다. 상이한 파장에서 방출하는 상이한 형광 공여체 및 형광 수용체를 갖는 프로브는 검출 분자에 결합될 수 있다. 상이한 농도로 사용될 수 있는 상이한 형광 염료를 조합함으로써 (검출 분자 당 표지된 프로브의 수에 의해 결정됨), 다중화의 정도가 증가될 수 있다. 특정 농도 비율이 정의된 검출 분자에 할당될 수 있다.
바람직한 설계에서, 본 발명에 따른 시스템은 또한 적어도 하나의 제1 및/또는 적어도 하나의 제2프로브가 검출 분자로부터 방출된 후에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 분자를 포함한다. 결합 분자는 방출된 프로브를 예방(prevent)하는데 사용될 수 있다, 즉 형광 공여체 또는 형광 수용체로 표지된 것들은 검출 분자에 다시 결합한다. 본 발명의 대응 예가 도 7에 도시되어 있다.
특정 형태에서, 상기 검출 분자는 복수의 올리고뉴클레오티드로 이루어지며, 이에 의해 비표지된 올리고뉴클레오티드는 보다 짧은 형광 표지된 올리고뉴클레오티드와 혼성화된다. 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드는 복수의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있다. 형광 수용체 및/또는 형광 공여체는 보다 짧은 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 이들은 형광단과 소광제가 공간적으로 서로 근접하는 방식으로 배열되어있다. 방출된 비표지된 매개체는 형광 표지된 검출 분자보다 비표지된 검출 분자에 더 높은 결합 에너지를 가지며, 따라서 예를 들어 소광제로 표지된 보다 짧은 올리고뉴클레오티드를 치환한다. 결합 에너지는 매개체가 반응 조건하에서 프라이머에 우선적으로 결합하고 검출 분자에 우선적으로 결합하지 않도록 조정될 수 있다. 본 발명의 대응 예가 도 25에 도시되어 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 하나 이상의 표적 분자의 검출 방법에 관한 것이다:
a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브 및/또는 제4항 또는 제5항에 따른 시스템을 제공하는 단계,
b) 상기 하나 이상의 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 프로브 영역을 주형 분자 및/또는 표적 분자의 서열에 결합시키는 단계,
c) 상기 적어도 하나의 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드 및/또는 상기 주형 분자 및/또는 상기 표적 분자를 증폭시키는 단계,
d) 하나 이상의 보조 분자에 의하여 하나 이상의 매개체의 방출시키는 단계,
e) 선택적으로, 적어도 하나의 방출된 매개체를 적어도 하나의 검출 분자에 결합시키는 단계,
f) 신호 변화 감지하는 단계.
본 발명에 따른 방법의 증폭 단계는 등온 및/또는 비등온 증폭 방법을 포함할 수 있이다.
등온 또는 등온 증폭에서, 각각의 반응은 스트랜드-쉬프트된 중합효소(strand-shifted polymerase)와 함께 일정한 온도(등온)에서 일어난다. 등온 증폭은 일정한 온도에서 수행되기 때문에, 기술적인 노력을 기울이지 않고도 수행할 수 있다. 가닥-치환 중합효소(strand-displacing polymeras), 예를 들면, 박테리오파지 Φ29의 Φ29 DNA 중합효소는 이중 가닥 DNA의 기존 두 번째 가닥을 치환하면서, 첫 번째 가닥을 사용하여 두 번째 가닥을 형성하는 동일한 서열을 갖는 새로운 가닥을 생산한다.
DNA의 등온 증폭을 위한 방법은 다중-치환 증폭(multi-displacement amplification), 등온 어셈블리(isothermal assembly), RPA(recombinase polymerase amplification), LAMP(loop-mediated isothermal amplification), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification), HAD(helicase-dependent amplification), NEAR(nicking enzyme amplification reaction), RCA(rolling circle amplification) 및 SDA(beach displacement amplification)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비-등온 증폭 방법에서는 반응 중에 온도가 변하기 때문에 열 안정성(thermostable) 중합효소가 사용된다. 이 목적으로 열 순환기를 사용할 수 있다. 비-등온 증폭 방법의 예로는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 실시간 PCR 및 중합효소 연쇄 치환 반응(PCDR)이 있다.
본 발명에 따른 방법의 중요한 이점은, 예를 들어 매개체와 검출 분자의 상호 작용에 의한 매개체 방출 및 후속 신호 생성이 상이한 증폭 방법에 적용될 수 있고 특정 증폭 시스템에 국한되지 않는다는 것이다. 상이한 증폭 방법에서 각각의 조건을 엄밀히 이용함으로써, 상기 언급된 매개체 방출은 각각의 시스템에 쉽게 적응될 수 있다.
본 발명의 바람직한 버전에서, 상기 매개체는 효소의 뉴클레아제 활성을 사용하여 매개체 프로브로부터 매개체를 분리시킴으로써 방출되지 않고, 치환(displacement)에 의해 방출된다. 이 경우, 공유 결합은 바람직하게는 매개체가 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 공유 결합되지 않기 때문에 절단되지 않는다. 바람직하게는, 상기 매개체는 올리고뉴클레오티드의 절단 없이 방출된다. 바람직하게는, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소의 사용은 본 발명 절차에서 요구되지 않는다.
상기 매개체는 본 발명에 따른 절차의 바람직한 버전에서 검출 분자의 제1영역에 결합하고, 이에 의해 상기 결합은 간접적인 또는 직접적인 상호 작용이 될 수 있다. 이러한 매개체와 검출 분자의 제1영역과의 상호 작용을 통해 물리적 또는 화학적으로 측정 가능한 검출 분자의 변화가 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 버전에서, 하나 이상의 매개체가 검출 분자의 제1영역에 결합하고 적어도 하나의 보조 분자에 의해 효소적으로 연장되며, 바람직하게는 상기 보조 분자는 결합된 매개체의 3' 말단에 결합하며, 이로써 검출 분자의 물리적 또는 화학적으로 측정 가능한 변화가 일어난다. 상기 검출 분자의 이러한 변화는 절단, 소화(digestion), 가닥 중복, 내부 혼성화, 인산화, 탈인산화, 아미드화, 화학 그룹의 결합 또는 절단, 형광, 인광 또는 발광 변화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 절차의 다른 바람직한 버전에 따르면, 적어도 하나의 매개체가 검출 분자의 제1영역에 결합하여, 물리적으로 또는 화학적으로 측정 가능한 검출 분자의 변화를 초래한다. 측정 가능한 변화를 생성하기 위해, 상기 매개체의 효소적 연장은 필요하지 않다.
매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 프로브 영역이 주형 분자 및/또는 표적 분자의 서열에 결합한 후에 보조 분자에 의해 우선적으로 효소적으로 연장된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 설계는 매개체 프로브 및/또는 주형 분자 및/또는 표적 분자의 제1올리고뉴클레오티드의 증폭이 등온 또는 비등온 증폭 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, PCR, PCDR 또는 실시간 PCR이 비등온 증폭 방법으로서 바람직하다. LAMP 또는 RPA가 선호되는 등온 증폭 방법이다.
PCR 또는 PCDR과 같은 비-등온 증폭 반응에서, 사용된 하나 이상의 프라이머는 매개체 프로브인 방식으로 변형될 수 있다. 샘플과 시약을 적절한 반응 용기에 넣고 혼합물을 배양하여 증폭이 일어날 수 있다. 이 과정에서, 신호 변화, 예를 들어 형광 신호가 반응 용기에서 검출된다.
본 발명에 따른 방법의 다른 버전에서, 상기 검출 분자는 적어도 하나의 형광 또는 발광 변형을 가지며, 보조 분자에 의해 적어도 하나의 매개체와의 반응 후에 형광 또는 발광 변형이 검출 분자로부터 절단(cleaved off)되고 및/또는 검출 분자의 헤어핀 구조의 5' 말단이 제거되고 및/또는 헤어핀 구조가 펼쳐지고 형광 또는 발광 신호의 변화가 검출 분자상에서 검출된다.
본 발명에 따른 절차의 바람직한 버전에서, 매개체 프로브 또는 복수의 프로브 당 복수의 매개체 및/또는 표적 분자당 복수의 검출 분자가 사용된다.
이것은 실험적 접근법에서 여러 분석물의 동시 검출을 가능하게 하는 복잡한 다중(multiplex)분석을 가능하게 한다. 다중 분석을 통해 반응 혼합물에서 복수의 다른 표적 분자 및/또는 주형 분자를 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 다중화 정도를 증가시키기 위해, n개의 상이한 매개체 프로브를 n 개의 상이한 표적 분자의 검출에 사용할 수 있다. 검출될 각각의 표적 분자는 그의 프로브 영역이 표적 분자 또는 주형 분자와 특이적으로 상호 작용하는 하나 이상의 매개체 프로브에 할당될 수 있다. 매개체 결합 영역 및 각각의 매개체 프로브의 매개체는 각각의 표적 분자 또는 주형 분자에 대해 아핀(affine) 또는 상보적이 아니다. 그러나 각각의 매개체는 정의된 검출 분자에 대한 특이적 상호 작용을 나타낸다. 따라서, 각각의 표적 분자는 매개체 프로브에 의해 할당된 하나 이상의 검출 분자에 간접적으로 할당된다. 상이한 표적 분자의 검출은 상이한 검출 분자를 필요로 한다.
매개체 프로브의 프로브 영역 및 매개체 결합 영역은 서로 독립적으로 자유롭게 결합될 수 있기 때문에, 검출 분자는 또한 매칭 매개체 결합 영역 및 매개체를 임의의 프로브 영역과 연결하고 합성함으로써 또 다른 표적 분자와 상호 관련될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 표적 분자가 검출 분자와 독립적으로 설계되도록 한다. 따라서, 표준화된 검출 분자 세트로, 상이한 표적 분자가 하나의 샘플에서 검출될 수 있고, 그에 의해 상기 반응은 매개체 프로브를 적응시키고 적절한 보조 분자(예를 들어, 프라이머 또는 압타머)를 사용함으로써 각각의 표적 분자에 비용 효과적으로 적용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 단일 매개체 프로브의 일부이고 매개체 프로브의 동일한 제1올리고뉴클레오티드의 매개체 결합 영역에 결합하는 복수의 매개체가 여러 다른 검출 분자에 결합할 수 있다. 매개체 프로브의 복수의 매개체를 상이한 검출 분자와 엄밀하게 결합함으로써, 본 발명에 따른 절차의 다중화 정도를 크게 증가시킬 수 있다. 전제 조건은 복수의 다른 검출 분자가 구별 가능하고 바람직하게는 유사시에 또는 동시에 검출될 수 있은 상이한 신호를 생성한다는 것이다.
예를 들어, 매개체 프로브 및 표적 분자 당 n개의 검출 분자 및 2개의 매개체를 사용함으로써, "n over 2" + n 개의 상이한 표적 분자가 검출될 수 있다. 상기 이항 계수는 주어진 수의 상이한 검출 분자에 대해 검출 가능한 표적 분자의 수를 계산하는데 사용될 수 있다. 표적 분자는 2개의 상이한 신호, 예를 들어 2개의 상이한 파장을 갖는 2개의 형광 신호를 생성함으로써뿐만 아니라 단일 신호를 생성함으로써 또한 식별될 수 있기 때문에, 검출 가능한 표적 분자의 최대 수를 계산하기 위해서는 이항 계수의 값을 n만큼 증가시켜야 한다. 4개의 다른 검출 분자를 사용하면 10개의 다른 표적 분자를 검출할 수 있지만 5개의 검출 분자는 15개의 표적 분자를 구별할 수 있다. 대응하는 예가 도 5a에 도시되어 있다.
대안으로, 복수의 매개체 프로브가 표적 분자마다 사용될 수 있으므로, 하나의 매개체 프로브는 하나의 매개체만을 포함할 수 있다.
동일한 표적 분자 또는 주형 분자에 결합하는 하나 이상의 매개체 프로브는 본 발명에 따른 절차의 바람직한 버전에서 사용될 수 있으며, 이에 의해 이러한 매개체 프로브의 매개체 또는 매개체들은 하나 이상의 검출 분자에 동시에 결합할 수 있다. 상기 검출 분자에서 매개체 결합 영역을 엄밀하게 결합함으로써, 예를 들어 단지 2개의 검출 분자를 사용하여 3개의 표적 분자를 구별하는 것이 가능하다. n개의 검출 분자와 검출 분자 당 적어도 2개의 매개체를 사용함으로써 "2n - 1"개의 상이한 표적 분자를 검출할 수 있다. 본 발명의 형태에 따르면, 검출 분자는 각각 적어도 2개의 상이한 매개체 결합 영역을 포함하며, 이에 의해 적어도 2개의 상이한 표적 서열에 연결된 적어도 2개의 매개체가 각각 하나의 특정 검출 분자에만 결합한다. 표적 분자마다 특정 신호가 생성된다. 본 발명에 따르면, 제3 또는 그 이상의(a third or more) 표적 서열에 연결된 제3 이상의(a third or more) 매개체는 적어도 2개의 검출 분자에 결합하여 적어도 2개의 상이한 신호를 유발할 수 있다. 2개의 방출된 매개체가 동시에 동일한 검출 분자에 동시에 결합할 확률을 위해, 방출된 매개체의 농도는 검출 분자의 농도의 순서이어야 한다. 대응하는 예가 도 5B에 도시되어 있다. 또한, 2개 이상의 상이한 매개체를 결합할 수 있는 검출 분자가 또한 사용될 수 있으며, 몇몇 상이한 매개체 프로브는 동일한 표적 분자에 결합할 수 있다.
표적 분자 또는 주형 분자마다 복수의 매개체 프로브를 사용함으로써 다수의 상이한 매개체가 표적 분자의 검출시 방출될 수 있다. 예를 들어, 각각이 공통 표적 분자 또는 주형 분자에 선택적으로 결합하는 복수의 매개체 프로브가 사용될 수 있으며, 이로써 이들 매개체 프로브의 매개체 또는 매개체들은 상이한 서열을 갖는다. 상이한 서열의 복수의 상이한 매개체가 하나의 동일한 검출 분자에 결합할 수 있으며, 이로써 검출 반응은 복수의 매개체를 결합시킴으로써만 유발될 수 있다. 신호-생성 반응은 방출된 매개체 간의 상호 작용을 활용하여 제어될 수 있고 따라서 검출 방법의 특이성을 증가시킨다. 특이성은 정확하게 음성으로 분류된 사건의 비율 또는 표적 분자의 부재가 또한 음성으로 분류될 확률을 가리킨다. 예를 들어, 상이한 매개체 프로브에 의해 방출된 2개의 매개체는 두 매개체가 검출 분자에 결합한 경우에만 검출 분자의 신호 변화가 일어나는 방식으로 검출 분자상에서 상호 작용할 수 있다. 대응하는 예가 도 5C에 도시되어 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 설계는 표적 분자 및/또는 주형 분자가 DNA, RNA, 펩티드, 단백질, 압타머 및/또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 생체 분자인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법의 주요 이점은 최신 기술과는 대조적으로, 단백질 및 핵산과 같은 상이한 분자 및 분자 종류의 병행 검출이 단일 단계 및 단일 반응 접근법 내에서 가능하다는 것이며, 따라서 샘플의 결합된 DNA-RNA- 단백질 프로파일을 생성할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 방법은 예를 들어, 표적 분자로서 특정 RNA 분자를 검출하는데 사용될 수 있고, 상기 RNA는 역전사(RT) 또는 다른 적합한 효소 시스템에 의해 cDNA로 전사된 다음 cDNA가 증폭되며 이로써 cDNA가 주형 분자로서 사용된다.
본 발명에 따르면, 표적 분자-특이적 압타머는 표적 분자의 검출을 위한 주형 분자로서 사용될 수 있다. 상기 검출될 표적 분자는 예를 들어, 단백질 또는 펩타이드일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 압타머는 표적 분자에 결합하고 상호 작용 후에 압타머-특이적 매개체 프로브 및 프라이머가 상기 압타머에 부착될 수 있도록 그의 구조를 변화시킨다. 적합한 효소 시스템으로 처리함으로써, 상기 압타머에 부착된 프라이머는 연장되어, 상기 압타머의 단백질 결합 영역 외부에 있는 압타머 서열의 증폭을 초래할 수 있다. 본 발명에 따른 매개체 프로브는 압타머 또는 증폭된 압타머 서열과 상호 작용할 수 있다. 예를 들어, 선형 증폭 산물에 매개체 프로브를 결합시킴으로써, 프로브를 개방할 수 있고, 추가의 프라이머를 사용하여 매개체 프로브로부터 매개체를 치환시킬 수 있다. 방출된 매개체는 특정 검출 분자 또는 적절한 검출 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 분자-특이적 압타머는 프라이머 결합 영역이 측면에 위치하는(flanked) 표적 분자 결합 영역을 포함하는 표적 분자의 검출을 위한 주형 분자로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 적어도 하나의 매개체 프로브가 사용되며, 이의 프로브 영역은 압타머의 프라이머 결합 영역 중 하나에 특이적으로 결합한다. 표적 분자가 없는 경우, 매개체 프로브와 다른 프라이머를 이용하여 압타머의 표적 분자 결합 영역을 증폭시키고, 매개체 프로브로부터 매개체를 방출하고 신호 변화를 검출할 수 있다. 표적 분자가 존재하면, 압타머는 표적 분자에 결합하고, 매개체 프로브의 프라이머 또는 제1올리고뉴클레오티드는 압타머와 표적 분자 사이의 결합으로 인해 연장될 수 없고 상기 매개체는 방출되지 않는다. 표적 분자가 존재하면, 표적 분자가 없는 것과 비교하여 신호 강하(signal drop)가 검출된다. 본 발명에 따른 이 방법은 지수 검출 반응을 가능하게 한다.
본 발명의 방법의 또 다른 형태에 따르면, 상기 보조 분자는 중합효소, RNA 중합효소, DNA 중합효소, 리가아제(ligases), 리보자임(ribozymes), 촉매(catalysts), 단백질, 핵산, 천연 생성물, 효소, 효소 시스템, 세포 용해물, 세포 성분, 세포 성분으로부터 유도된 유도체 및/또는 합성 분자를 포함하는 군으로부터 선택된다. 상기 보조 분자는 바람직하게는 핵산 증폭 시스템 및/또는 제한(restriction) 효소 시스템으로부터의 분자이다.
리가아제가 DNA 가닥을 연결시키는 효소이다. 그들은 인산염 잔기와 당 디옥시리보스(sugar deoxyribose) 사이에 에스테르 결합을 형성합니다. 또한 리가아제가 또한 3' 말단에서 핵산 분자를 확장시키는 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.
리보자임(Ribozymes)은 효소와 같은 화학 반응을 촉매하는 촉매 활성 RNA 분자이다. 특정 리보자임은 중합효소와 유사하게 핵산 분자를 연장시키고 증폭시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 리보자임은 또한 펩타이드 결합의 결합 및 RNA 분자의 스플라이싱과 같은 다른 반응을 촉매할 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시 예에 따르면, 적어도 하나의 보조 분자는 DNA 가닥 분리 효과 및/또는 중합 효과를 가지며, 상기 보조 분자는 바람직하게는 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)이다.
놀랍게도, 가닥 치환 활성을 갖는 중합효소를 사용할 때, 뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 같은 부가적인 효소가 필요하지 않으며, 이는 최신 기술보다 큰 이점이다.
상이한 보조 분자가 본 발명에 따른 방법 내 다른 공정 단계에 사용될 수 있다. 보조 분자의 도움으로 수행될 수 있은 공정 단계는 본 발명에 따른 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 증폭, 표적 분자 및/또는 주형 분자의 증폭, 매개체 프로브로부터 매개체의 절단, 방출 또는 치환, 검출 분자에 결합한 후 매개체의 효소적 확장 및 검출 분자의 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
고정화 또는 비-고정화 검출 분자와 적어도 하나의 매개체 사이의 직접 또는 간접 상호 작용에 의해 본 발명에 따른 방법의 바람직한 버전에서 형광, 인광, 발광, 질량, 흡수, 빛의 산란, 전기 전도도, 효소 활성 및/또는 친화도, 전기 화학 전위 또는 신호, 굴절률, 표면 플라즈몬의 트리거링 또는 자기 이완의 측정 가능 변화가 발생한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 설계에서, 고정화 또는 비-고정화 검출 분자와 적어도 하나의 매개체 사이의 직접 또는 간접 상호 작용에 의해 형광, 인광, 발광, 질량, 흡수, 빛의 산란, 전기 전도도, 효소 활성 및/또는 친화도, 전기 화학 전위 또는 신호, 굴절률, 표면 플라즈몬의 트리거링 또는 자기 이완, 자기 특성, 임피던스 또는 커패시턴스의 측정 가능 변화가 발생한다.
본 발명에 따른 바람직한 설계는 적어도 하나의 매개체의 방출이 등온 또는 비등온 증폭 방법에 의한 적어도 하나의 매개체의 증폭에 의해 검출되는 것을 특징으로 한다. 상기 방출된 매개체는 예를 들어 상응하는 증폭 효소의 존재하에서 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)을 유발할 수 있다. 따라서, 표적 분자는 롤링 써클 증폭 산물의 검출에 의해 동정될 수 있다. 롤링 서클 증폭의 증폭 산물은 예를 들어 프로브를 통해 또는 pH 값 변화, 겔 전기 영동 또는 비색법(colorimetry)을 통해 서열 특이적으로 검출될 수 있다. 본 발명에 따른 절차의 바람직한 버전에 따라, 적어도 하나의 방출된 매개체는 시퀀싱에 의해 검출된다. 자유 매개체를 시퀀싱함으로써, 샘플 중의 임의의 수의 표적 분자를 동시에 동정할 수 있다.
시퀀싱은 핵산 분자, 특히 DNA에서 뉴클레오티드 서열의 결정이다. 본 발명의 의미 내의 서열 결정 방법은 Maxam and Gilbert 방법, Sanger didesoxy 방법, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 하이브리드화 시퀀싱(hybridization sequencing), 이온 반도체 DNA 시퀀싱 시스템(ion semiconductor DNA sequencing system), 가교 합성 시퀀싱(bridge synthesis sequencing), 2-염기 시퀀싱(two-base sequencing), 쌍 단부 시퀀싱(paired end sequencing) 및 나노포어 시퀀싱(nanopore sequencing)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
검출은 예를 들어 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)에 의해 입증될 수 있다. NGS 방법의 예는 나노포어 시퀀싱(nanopore sequencing)으로, 구멍이 뚫린 막의 포텐셜(potential) 변화는 핵산과 같은 분자가 상기 막을 통과할 때 측정되고 따라서 상기 핵산의 서열을 결정할 수 있다. 시퀀싱은 임의의 수의 매개체의 동시 방출을 검출하는데 사용될 수 있으며, 각각의 매개체는 특정 표적 분자의 존재를 신호한다. 다중화의 정도(degree of multiplexing)는 형광 측정과 같은 기존의 방법에 비해 상당히 증가한다. 상기 시퀀싱 방법은 나노포어 시퀀싱에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 버전에서, 적어도 하나의 방출된 매개체는 하이브리드화에 의해 검출 분자에 결합하고, 보조 분자에 의해 검출 분자에 결합한 후에 선택적으로 연장된 다음 용융 곡선 분석이 수행된다. 이것은 예를 들어 상이한 시그널링 분자로 표지된 상이한 검출 분자를 사용함으로써 다중화 정도를 추가로 증가시킬 수 있게 한다. 본 발명의 바람직한 버전에 따르면, 형광원(fluorogen) 및/또는 발색체(chromogen) 표지된 또는 형광 염료인 서열 특이적 또는 서열 비특이적 프로브는 매개체 및/또는 검출 분자와 상호 작용한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 버전에서, 하나 이상의 표적 분자는 RNA이고, 상기 RNA는 cDNA 내로 전사되고 cDNA는 주형 분자로서 작용한다. 서열 오버행(overhang)을 갖는 프라이머는 RNA의 cDNA 로의 재기록 반응(rewrite reaction)/역전사에 사용될 수 있고, 상기 매개체 프로브의 프로브 영역은 cDNA의 적어도 일부와 서열 오버행(overhang)의 일부를 모두 포함하는 영역에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 버전에 따르면, 하나 이상의 표적 분자는 펩타이드 또는 단백질이고, 주형 분자는 압타머이고, 여기서, 압타머는 펩타이드 또는 단백질에 결합하고, 상기 압타머를 표적 분자에 결합시킴으로써 압타머에서의 상기 매개체 프로브의 프로브 영역에 대한 결합 부위가 접근 가능하게 된다.
본 발명에 따르면, 서열-특이적 또는 서열-비특이적 프로브, 형광 염료 또는 산화 환원 분자는 적어도 하나의 매개체 및/또는 검출 분자와 상호 작용할 수 있다.
또한, 본 발명은 혼합물에서 하나 이상의 유사하거나 상이한 생체 분자를 검출하는 본 발명에 따른 시스템 및/또는 공정의 사용에 관한 것이다. 이 경우, 본 발명에 따른 검출 분자는 3' 말단 영역에 화학적 보호기를 가질 수 있고, 상기 보호기는 매개체와의 반응 후에 보조 분자에 의해 검출 분자로부터 분리되고, 3' 말단 OH 기가 생성된다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 검출 분자, 및 선택적으로 본 발명의 의미에서 적어도 하나의 매개체, 중합효소 및 dNTP를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이하, 본 발명은 도면 및 실시 예에 의해 설명될 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 실시 예에서 매개체 프로브의 구조의 개략도.
도 2: 비치 치환 중합효소(beach displacement polymerase)의 존재하에 증폭 과정 동안 매개체 치환의 개략도.
도 3: 가능한 검출 분자의 개략도.
도 4: 효소 매개체 확장의 개략도.
도 5: 복수의 매개체 및/또는 복수의 매개체 프로브 및/또는 표적 분자 당(per) 복수의 탐지 분자를 사용할 때의 배열 가능성.
도 6: 분자 비콘의 구조를 갖는 검출 분자의 구조.
도 7: 형광 공여체 및 형광 수용체가 표지된 혼성화된 프로브를 갖는 선형 또는 원형 검출 분자.
도 8: 고체상에서의 전기 화학 검출.
도 9: 비치 치환 중합효소의 존재하에 증폭 과정 동안 매개체 치환의 개략적 서열.
도 10: LAMP 동안 매개체 방출 및 후속 신호 생성의 메커니즘.
도 11: 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 대장균(W3110, 완전한 게놈)의 검출을 위한 LAMP의 표준화된 형광 플롯.
도 12는 본 발명의 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 HIV-1 RNA를 검출하기 위한 RT-LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 13: 프라이머로 기능하지 않는 매개체 프로브의 구조.
도 14: 표적 분자 특유 압타머(aptamer)에 의하여 표적 분자의 탐지를 위한 탐지 방법.
도 15: 압타머 영역 및 프라이머 바인더 영역을 추가로 함유하는 매개체 프로브에 의한 표적 분자 검출을 위한 발명된 검출 방법.
도 16: 프라이머로 작동하고 지수(exponential) 검출 반응을 가능하게 하는 매개체 프로브에 의하여 표적 분자의 검출을 위한 발명된 검출 방법.
도 17: 고체상에서 검출 분자의 고정화.
도 18: 전극 상에 표지된 검출 분자의 고정화.
도 19: 검출 분자는 2개의 표지된 혼성화된 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
도 20-24: 고체상에서의 전기 화학적 검출.
도 25: 탐지 분자는 몇몇 올리고뉴클레어티드로 이루어져 있다.
도 26: H. ducreyi의 검출을 위한 LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 27: T. pallidum의 검출을 위한 LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 28: HTLV-1 검출을 위한 RT-LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 29: TMV 검출을 위한 RT-LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 30: 100 pg G3PDH 단편의 검출을 위한 PCDR의 정규화된 형광 플롯.
도 31: 자기의 또는 자기화할 수 있는(magnetizable) 나노 입자에 대한 매개체의 결합.
도 32: 전기 활성 표지된 매개체의 전기 화학적 검출 증명.
도 1은 본 발명의 실시 예에서 매개체 프로브의 구조의 개략도.
도 2: 비치 치환 중합효소(beach displacement polymerase)의 존재하에 증폭 과정 동안 매개체 치환의 개략도.
도 3: 가능한 검출 분자의 개략도.
도 4: 효소 매개체 확장의 개략도.
도 5: 복수의 매개체 및/또는 복수의 매개체 프로브 및/또는 표적 분자 당(per) 복수의 탐지 분자를 사용할 때의 배열 가능성.
도 6: 분자 비콘의 구조를 갖는 검출 분자의 구조.
도 7: 형광 공여체 및 형광 수용체가 표지된 혼성화된 프로브를 갖는 선형 또는 원형 검출 분자.
도 8: 고체상에서의 전기 화학 검출.
도 9: 비치 치환 중합효소의 존재하에 증폭 과정 동안 매개체 치환의 개략적 서열.
도 10: LAMP 동안 매개체 방출 및 후속 신호 생성의 메커니즘.
도 11: 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 대장균(W3110, 완전한 게놈)의 검출을 위한 LAMP의 표준화된 형광 플롯.
도 12는 본 발명의 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 HIV-1 RNA를 검출하기 위한 RT-LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 13: 프라이머로 기능하지 않는 매개체 프로브의 구조.
도 14: 표적 분자 특유 압타머(aptamer)에 의하여 표적 분자의 탐지를 위한 탐지 방법.
도 15: 압타머 영역 및 프라이머 바인더 영역을 추가로 함유하는 매개체 프로브에 의한 표적 분자 검출을 위한 발명된 검출 방법.
도 16: 프라이머로 작동하고 지수(exponential) 검출 반응을 가능하게 하는 매개체 프로브에 의하여 표적 분자의 검출을 위한 발명된 검출 방법.
도 17: 고체상에서 검출 분자의 고정화.
도 18: 전극 상에 표지된 검출 분자의 고정화.
도 19: 검출 분자는 2개의 표지된 혼성화된 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
도 20-24: 고체상에서의 전기 화학적 검출.
도 25: 탐지 분자는 몇몇 올리고뉴클레어티드로 이루어져 있다.
도 26: H. ducreyi의 검출을 위한 LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 27: T. pallidum의 검출을 위한 LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 28: HTLV-1 검출을 위한 RT-LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 29: TMV 검출을 위한 RT-LAMP의 정규화된 형광 플롯.
도 30: 100 pg G3PDH 단편의 검출을 위한 PCDR의 정규화된 형광 플롯.
도 31: 자기의 또는 자기화할 수 있는(magnetizable) 나노 입자에 대한 매개체의 결합.
도 32: 전기 활성 표지된 매개체의 전기 화학적 검출 증명.
도 1은 본 발명의 바람직한 버전인 매개체 프로브의 가능한 구조의 개략도를 도시한다.
도 2는 DNA 증폭에서 프라이머 역할을 하는 매개체 프로브(mediator probe)로부터의 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)가 존재할 때 증폭 과정에서의 매개체 치환(displacement)의 개략적인 서열을 도시한다.
도 3(A)는 가능한 검출 분자의 선형 표현을 보여준다. (B) 2차 구조 형성 중 3'-고정된(immobilized) 검출 분자의 표현. 상호 작용이 검출 분자의 2차 구조를 생성하는 역-상보적 서열 세그먼트는 검은 영역으로 나타나고, 상기 매개체 결합 서열은 대각선으로 스트라이프된 영역으로 나타난다.
도 4는 효소 매개체 확장의 개략도를 보여준다. i) 검출 분자는 용액에서 자유롭거나 고체상에 고정되고 반응 조건하에서 정의된 2차 구조를 취한다. 두 개의 적절한 형광 변형 F 및 Q는 서로 상호 작용하여 F의 형광 신호가 억제된다. ii) 매개체는 정의된 위치(매개체 결합 영역, 영역 5) iii) - iv)에서 검출 분자와 상호 작용할 수 있으며, 이로 인해 효소적으로 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)에 의해 연장된다. 영역 1은 형광 수용체 분자 Q와 함께 검출 분자에 의해 치환되어 형광 공여체 F의 형광 강도를 회복시킨다. vi) 영역 1의 치환 후에, 상기 매개체는 더 연장될 수 있다.
도 5(A-C)는 표적 분자 당 복수의 매개체 및/또는 복수의 매개체 프로브 및/또는 복수의 탐지 분자를 사용할 때 여러 가지 가능한 배치를 보여준다. (A) 매개체 프로브 당 다수의 매개체 또는 표적 분자 당 다수의 매개체 프로브를 사용하여 검출 가능한 표적 분자의 수를 증가시키는 단계. 표적 분자 당 여러 매개체를 사용할 때 검출 분자의 수의 함수로서 검출 가능한 표적 분자의 최대 수는 2항 계수(binomial coefficient) 및 검출 분자의 수를 사용하여 계산될 수 있다. (B) 다중 매개체 결합 영역을 포함하는 검출 분자를 사용하여 검출 가능한 표적 분자의 수를 증가. (C) 표적 분자 당 다중 매개체를 사용하여 탐지 반응의 특이성 증가 및 매개체 사이의 상호 작용을 이용. 두 매개체의 방출은 그들이 서로간에 그리고 동시에 검출 분자와 상호 작용하여 매개체 중 하나를 연장(prolonging)하고 검출 반응을 촉발하게 한다. 단일 매개체의 상호 작용은 검출 반응을 일으키지 않는다.
도 6은 분자 비콘의 구조에 대응하는 검출 분자의 구조를 도시한다. 형광 수용체 및 형광 공여자는 5' 및 3' 말단에 부착되고 상기 매개체 결합 영역은 루프에 위치한다.
도 7은 형광 공여체 및 형광 수용체 표지된 프로브가 혼성화되는 선형 또는 원형 검출 분자를 도시한다. 상기 매개체를 검출 분자 및 연장부(extension)에 혼성화(hybridizing)시킴으로써, 표지된 프로브가 방출되고 신호 변화가 검출될 수 있다. 형광 공여체 또는 형광 수용체로 표지된 방출된 프로브가 검출 분자에 다시 결합하는 것을 방지하기 위해, 방출된 후에 표지된 프로브가 결합할 수 있는 결합 분자를 사용할 수 있다.
도 8은 전기 화학적 검출이 고체상에 사용되는 본 발명의 버전을 도시한다. 상기 검출 분자는 전극에 고정화되어 있다. 상기 검출 분자에서 매개체의 혼성화 및 연장 후에, 상기 용액에 존재하는 산화 환원 분자는 검출 분자 및 확장된 매개체의 이량체로 삽입(intercalate)되고, 따라서 전기 화학적 신호의 변화가 검출될 수 있다.
도 9는 DNA 증폭에서 프라이머로 작용하는 매개체 프로브로부터의 가닥 치환 중합효소의 존재하에서 증폭 동안의 매개체 치환의 개략적인 서열을 도시한다. 상기 매개체 및 검출 분자는 형광 염료로 각각 표지되며, FRET 에너지 전이에 의해 매개체가 상기 검출 분자와 혼성화되면 검출될 하나의 파장에서 형광 강도의 증가를 가능하게 한다. 상이한 수의 뉴클레오티드를 갖는 검출 분자를 사용할 때, 용융 곡선 분석을 사용하여 상이한 표적 분자를 구별할 수 있다.
도 10은 LAMP 동안 매개체 방출(release) 및 후속 신호 생성의 메커니즘을 도시한다. 상기 검출 분자에서 및 상기 매개체 프로브에서 상기 매개체 결합 영역은 Medc(매개체에 상보적인 서열에 상응함)로 약칭된다. 본 발명의 이 버전에서, 상기 매개체 프로브는 동시에 루프 프라이머로 작용한다; 따라서, 상기 매개체 프로브는 Medc(Loop_Medc)에 의해 연장된 루프 프라이머와 그것에 혼성화된 매개체(Med)로 구성된다. 초기 LAMP 단계 후에, 덤벨-유사 증폭 산물이 형성되어 매개체 프로브가 결합할 수 있다. 매개체 프로브를 확장시키고 프라이머를 다시 연결시킴으로써 매개체는 비치 치환 중합효소에 의해 치환된다. 상기 방출된 매개체는 검출 분자와 상호 작용함으로써 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다.
도 11은 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 대장균 DNA(W3110, 완전한 게놈)을 검출하기 위한 LAMP의 표준화된 형광 플롯을 나타낸다. 상기 플롯은 DNA 양과 형광 과정(course) 간의 상관관계를 보여준다. 형광 강도는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다. DNA 복제 수는 반응 당 복제수로 표시된다(예를 들어 10 cp는 총 부피가 10 μl인 반응 당 10개의 복제에 해당함). 음성 대조군은 반응 당 0 복제수(NTC, no template control)를 함유한다.
도 12는 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 HIV-1 RNA를 검출하기 위한 RT-LAMP의 표준화된 형광 플롯을 나타낸다. 형광 강도는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다. RNA 복제수는 반응 당 복제수으로 주어진다(3,400 cp는 총 부피가 10 μl인 반응 당 3,400개의 복제수에 해당함). 음성 대조군은 반응 당 0 복제수(NTC, no template control)를 함유한다.
도 13은 증폭을 위한 출발점으로서 작용하지 않는 매개체 프로브의 디자인을 도시한다.
도 14는 표적 분자-특이적 압타머(aptamer)에 의한 표적 분자의 검출을 위한 본 발명에 따른 검출 방법을 나타낸다.
도 15는 압타머 영역 및 프라이머 결합 영역을 추가로 포함하는 매개체 프로브에 의한 표적 분자 검출 방법용 본 발명에 따른 검출 방법을 나타낸다. 표적 분자가 없을 때, 상기 매개체 프로브는 증폭되고, 표적 분자의 존재하에, 상기 프라이머의 연장은 결합된 표적 분자에 의해 차단된다. 결과적으로, 표적 분자의 존재하에서 검출 가능한 신호가 유발되지 않고 검출 가능한 신호가 표적 분자의 부재하에 생성된다.
도 16은 프라이머로서 작용하여 지수 검출 반응을 가능하게 하는 매개체 프로브에 의한 표적 분자의 검출용 본 발명에 따른 검출 방법을 나타낸다. 표적 분자가 없는 경우 선형 압타머가 증폭되고 증폭하는 동안 매개체가 방출되는 반면 표적 분자의 존재시에는 프라이머의 확장이 결합된 표적 분자에 의해 차단된다. 결과적으로, 표적 분자의 존재하에서 검출 가능한 신호가 유발되지 않고 검출 가능한 신호가 표적 분자의 부재하에 생성된다.
도 17은 본 발명에 따른 검출 방법의 설계를 도시하는데, 여기서 검출 분자는 고형상의 적절한 반응 용기에 고정화된다.
도 18은 검출 분자가 전극 상에 고정화되어 있는 본 발명의 방법에 따른 검출 방법을 도시한다. 검출 분자에서 상기 매개체의 하이브리드화 및 확장을 통해, 상기 검출 분자에 결합된 산화 환원 분자는 전극 표면으로부터 공간적으로 분리되어 신호에서 변화를 발생시킨다. 반응식 a 및 b는 검출 분자의 2개의 상이한 영역에서 매개체의 가능한 결합 부위를 도식화한다.
도 19는 두 개의 표지된, 혼성화 올리고뉴클레오티드로 구성된 검출 분자를 도시한다. 형광 수용체 및 형광 공여체는 각각 5' 및 3' 말단에 부착되며; 또한, 2개의 올리고뉴클레오티드 중 하나는 매개체 결합 영역을 갖는다.
도 20은 고체상에서 전기 화학적 검출의 가능성을 도시한다. 검출 분자는 전극에 고정화(immobilized)되어 있다. 검출 분자에서 매개체의 하이브리드화 후, 용액에 존재하는 산화 환원 분자가 검출 분자 및 매개체의 이량체로 삽입(intercalate)될 수 있으며, 이로써 전기 화학적 신호의 변화가 검출될 수 있다.
도 21은 표시된 매개체를 사용하여 고체상에서 전기 화학적 검출을 보여준다. 검출 분자는 전극에 고정화되어 있다. 표지된 매개체를 검출 분자에 혼성화시킴으로써, 전기 화학적 신호의 변화가 검출될 수 있이다.
도 22는 고체상에서의 전기 화학적 검출을 도시한다. 검출 분자는 전극에 고정화되어 있다. 검출 분자상의 표지된 매개체의 하이브리드화 및 연장에 의해, 전기 화학적 신호의 변화가 검출될 수 있다.
도 23은 고체상에서 전기 화학적 검출의 가능성을 도시한다. 검출 분자는 전극에 고정화되어 있다. 검출 분자상의 표지된 매개체의 하이브리드화 및 연장에 의해, 전기 화학적 신호의 변화가 검출될 수 있다. 산화 환원 분자(redox molecule)와 전극 사이의 전기적 전하 수송은 이중 가닥의 형성에 의해 야기된다.
도 24는 고체상에서 전기 화학적 검출의 가능성을 도시한다. 검출 분자는 전극에 고정화되어 있다. 검출 분자상의 표지된 매개체의 하이브리드화 및 연장에 의해, 전기 화학적 신호의 변화가 검출될 수 있다. 산화 환원 분자(redox molecule)와 전극 사이의 전기적 전하 수송은 이중 가닥의 형성에 의해 야기된다.
도 25: 검출 분자는 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드가 짧은 형광-표지된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되는 복수의 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 형광 수용체 및/또는 형광 공여체는 보다 짧은 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 이들은 형광단(fluorophore)과 소광제(quencher)가 공간적으로 서로 근접하는 방식으로 배열되어 있다. 방출된 매개체는 표지되지 않은 검출 분자에 대해 더 높은 결합 에너지를 가지며, 따라서 예를 들어 소광제로 표지된 보다 짧은 올리고뉴클레오티드를 치환한다.
도 26은 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 Haemophilus ducreyi(H. ducreyi)의 검출을 위한 LAMP의 표준화된 형광 플롯을 나타낸다. 형광 강도는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다. 음성 대조군(NTC, no template control)은 H. ducreyi DNA를 함유하지 않고, 양성 대조군은 정제된 H. ducreyi DNA와 혼합하였다.
도 27은 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 Treponema pallidum(T. pallidum)의 검출을 위한 LAMP의 표준화된 형광 플롯을 나타낸다. 형광 강도는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다. 음성 대조군(NTC, no template control)은 T. pallidum DNA를 함유하지 않고, 양성 대조군은 정제된 T. pallidum DNA와 혼합하였다.
도 28은 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 HTLV-1의 검출을 위한 RT-LAMP의 표준화된 형광 플롯을 나타낸다. 형광 강도는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다. 음성 대조군(NTC, no template control)은 HTLV-1 RNA를 함유하지 않고, 양성 대조군은 정제된 HTLV-1 RNA와 혼합하였다.
도 29는 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 TMV의 검출을 위한 RT-LAMP의 표준화된 형광 플롯을 나타낸다. 형광 강도는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다. 음성 대조군(NTC, no template control)은 TMV RNA를 함유하지 않고, 양성 대조군은 정제된 TMV RNA와 혼합하였다.
도 30은 본 발명에 따른 매개체 프로브 및 검출 분자를 사용하여 100 pg 마우스 G3PDH DNA를 검출하기 위한 PCDR의 표준화된 형광 플롯을 나타낸다. 형광 강도는 0 사이클에서 초기 값으로 정규화 하였다.
도 31은 자성의(magnetic) 또는 자성화할 수 있는(magnetizable) 나노 입자에 결합한 매개체를 도시한다. 표적 분자의 존재하에서 방출 이후에, 상기 매개체는 검출 분자에 결합하여 고체상 표면의 자기 특성의 변화를 검출할 수 있다.
도 32는 전기 활성 표지된 매개체의 전기 화학적 검출의 기능적 증명을 나타낸다. 양성 대조군(대장균 DNA의 60,000 카피)에서, 상기 매개체는 LAMP 반응 동안 치환(displaced)되어 검출 분자에 혼성화될 수 있다. 표시된(여기서 메틸렌 블루) 매개체는 전극 표면에 축적되어 전기 화학적 분석(여기서는 구형파 전압 전류법)에서 -0.39V에서 특징적인 피크를 형성한다. 대조적으로, NTC에 피크가 없는 것은 매개체의 중요한 방출이 발생하지 않았음을 나타낸다.
설계 예시:
다음 설명에서, 몇몇 매개체는 본 발명에 따른 매개체 프로브의 특정 프라이머 또는 제1올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있고 및/또는 샘플에서 매개체 농도를 증가시키기 위해 여러 가지 다른 프라이머 및/또는 매개체 프로브가 상기 매개체와 함께 제공될 수 있다.
실시예 1: 매개체 프로브(Mediator probe)
본 발명의 설계 예시는 하나 이상의 표적 분자(target molecule)를 검출하기 위한 매개체 프로브를 포함하며, 여기서 상기 매개체 프로브는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 제1올리고뉴클레오티드는 매개체 결합 영역(mediator binding region) 및 프로브 영역(probe region)을 포함한다. 상기 매개체 결합 영역은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및 프로브 영역은 3' 말단에 위치한다. 제2 또는 수개의 추가의 올리고뉴클레오티드, 매개체(mediator) 또는 매개체들은 제1올리고뉴클레오티드의 매개체 결합 영역에 화학적, 생물학적 및/또는 물리적으로 결합한다. 매개체는 DNA, RNA, PNA 또는 LNA와 같은 변형된 RNA로 구성될 수 있다. 제1올리고뉴클레오티드의 프로브 영역은 표적 및/또는 주형(template) 분자에 대해 친 화도(affinity)를 가지며, 상기 매개체 결합 영역은 매개체 또는 매개체들에 대해 친화도를 갖는다(도 1). 상기 매개체 또는 매개체들은 적어도 하나의 검출 분자(detection molecule)에 친화도를 갖는다.
실시예 2: 매개체 치환 절차(Procedure of mediator displacement)
프로브 영역을 표적 분자 및/또는 주형 분자에 결합시킨 후, 상기 매개체는 예를 들어 비치 치환 중합효소를 사용하여 매개체 결합 영역에 의해 치환(displace)된다. 이 과정은 표적 분자 및/또는 주형 분자의 증폭 과정 중에 일어날 수 있다. 본 발명의 실시 예에서, 상기 매개체 프로브의 프로브 영역은 DNA 증폭에서 프라이머로서 작용할 수 있다. 상기 프로브 영역이 표적 분자 및/또는 주형 분자에 결합된 후, 상기 매개체 프로브가 연장된다. 그런 다음 제2프라이머가 확장된 매개체 프로브에 부착되고 연장될 수 있다. 증폭 과정에서, 상기 매개체 또는 매개체들은 상기 매개체 결합 영역에서 방출되어 하나 이상의 검출 분자와의 상호 작용을 통해 탐지 가능한 신호를 유발한다(도 2).
실시예 3: 6개의 영역을 가진 검출 분자
방출된, 표지되지 않은(unmarked) 매개체의 검출은 검출 반응의 도움으로 이루어진다. 후술하는 반응 메커니즘은 전술한 표적 분자 및/또는 주형 분자의 증폭과 병행하여 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 예에서, 검출 분자는 6개의 영역으로 분할된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있다(도 3). 영역 1은 서열 부분(sequence portion) 및 형광 수용체(fluorescence acceptor) Q로 이루어진 검출 분자의 5' 말단을 포함한다. 영역 3은 영역 1의 역-상보적 서열(reverse-complementary sequence)이고 영역 2에 의해 예리하게 분리된다. 영역 4는 매개체 분자와 특이적으로 상호 작용할 수 있는 영역 3과 영역 5를 분리한다. 영역 6은 3'-말단 서열 영역을 포함하고, 이는 화학적 변형을 일으켜 올리고뉴클레오티드의 방향을 고정화시킨다. 형광 공여체(fluorescence donor) F는 영역 2 내지 영역 6의 영역, 예컨대 영역 4와 적절한 방식으로 관련되어 있다. 검출 분자의 영역 1 및 영역 3은 5' 말단이 내부 서열 섹션에 혼성화되는 반응 조건하에서 정의된 2차 구조(헤어핀 구조)를 형성한다(도 3b). 이 구조를 형성한 후, 형광 공여체 F 및 형광 수용체 Q가 서로 상호 작용하고 상기 F의 형광 신호가 억제된다(FRET). 영역 1 및 영역 4에서 검출 분자의 형광 공여체 및 형광 수용체 변형에 대한 대안으로서, 산화 환원(redox) 분자, CRET(chemiluminescence resonance energy transfer) 쌍 및 삽입성 분자(intercalating molecules)와 같은 다른 신호 발생 변형이 사용될 수 있다.
실시예 4: 매개체 확장은 상기 검출 분자의 신호 변화를 유도한다.
방출 후, 상기 매개체는 반응 용액에서 확산적으로 존재하며 상기 검출 분자의 매개체 결합 서열(영역 5)과 상호 작용할 수 있다(도 4 i) + ii)). 상기 검출 분자는 고체상에 고정되거나 용액 중에 존재할 수 있다. 매개체는 적당한 보조(auxiliary) 분자, 예를 들어 비치 치환 중합효소에 의해 연장되며, 따라서 상기 검출 분자의 영역 1은 중합효소에 의해 치환된다. 형광 수용체 Q와 형광 공여체 F 사이의 거리는 5' 말단의 치환(displacement)에 의해 증가되고 이전에 억제된 형광 공여체 F의 형광 신호가 복원된다(도 4 iii) + iv)). 대안적으로, 검출 분자의 5' 말단에서 산화 환원 분자의 거리가 검출 분자의 3' 말단과 관련하여 변하거나, CRET의 효율성이 변화하거나, 매개체 또는 그의 연장 생성물과 검출 분자의 이합체의 형성으로 인해 분자의 인터칼레이션(intercalation)이 변화한다. 설명된 치환이 영역 1과 영역 3의 상호 작용을 방지하면 2차 구조의 형성이 취소된다. 이 경우, 상기 매개체는 검출 분자의 새로 형성된 5' 말단까지 특정 조건하에서 변형된 보조 분자에 의해 연장될 수 있다(도 4 V) + Ⅵ)). 이러한 완전한 확장은 연장된 매개체에 검출 분자의 영역 1, 2 및 영역 3에 대해상보적인 서열 세그먼트를 제공한다.
상기 검출 반응은 매개체와 대조적으로, 초기 매개체 프로브가 신호 생성 반응을 일으키지 않으므로 잘못된 결과가 생성되지 않도록 설계되어야 한다. 초기에, 상기 매개체는 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드, 예를 들어 수소 결합에 결합되어 있다. 매개체를 상기 검출 분자에 결합시킴으로써 신호 발생 반응을 방지하기 위해, 상기 매개체를 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 결합시키는 것과 상기 매개체를 검출 분자에 결합시키는 것 사이의 균형은 그에 따라 조정될 수 있다.
상기 매개체와 검출 분자와의 상호 작용 사건은 국부적인, 검출 가능한 신호를 생성한다. 충분한 수의 검출 분자가 상기 매개체 확장에 의해 활성화되어 5' 말단의 치환이 생기면, 상기 신호는 증폭되고 적절한 검출 장치를 사용하여 검출될 수 있다. 이는 반응 혼합물의 존재하에서 검출을 가능하게 하고 임의의 처리 단계를 필요로하지 않는다.
실시예 5: 다중 분석(Multiplex analyses)
다중 분석은 반응 혼합물에서 여러 가지 분석물의 검출을 필요로 한다. 본 발명에 따른 반응의 다중화 정도(degree of multiplexing)를 증가시키기 위해, n 개의 상이한 표적 분자에 대한 n 개의 상이한 매개체 프로브의 사용이 계획된다. 검출될 각각의 표적 분자는 표적 분자 또는 주형 분자와 특이적으로 상호 작용하는 프로브 영역을 갖는 매개체 프로브로 지정될 수 있다. 각각의 매개체 프로브의 매개체 결합 영역 및 매개체는 아핀(affine)이 아니거나 표적 또는 주형 분자에 상보적이 아니다. 그러나 매개체는 정의된 검출 분자에 대한 특정 상호 작용 파트너(specific interaction partner)를 나타낸다. 따라서, 각각의 표적 분자는 간접적으로 매개체 프로브에 의해 지정된 검출 분자로 지정된다. 상이한 표적 분자의 검출은 상이한 검출 분자를 필요로 한다.
상기 매개체 프로브의 프로브 영역 및 매개체 결합 영역은 서로 독립적으로 자유롭게 결합될 수 있기 때문에, 검출 분자는 또한 매칭 매개체 결합 영역 및 매개체를 임의의 프로브 영역과 연결하고 합성함으로써 또 다른 표적 분자와 상호 관련될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 표적 분자가 검출 분자와 독립적으로 디자인되도록 한다. 따라서, 표준화된 검출 분자 세트와 함께, 상이한 표적 분자가 하나의 샘플에서 검출될 수 있고, 따라서 매개체 프로브를 채택하고 적절한 보조 분자(예를 들어 프라이머 또는 압타머)를 사용함으로써 반응을 비용 효율적으로 각 표적 분자에 적응시킬 수 있다.
본 발명의 예는 표적 분자 당 복수의 매개체 및/또는 복수의 매개체 프로브 및/또는 복수의 검출 분자를 포함할 수 있다. 다음 무리(constellation)가 가능하다.
A. 동일한 매개체 프로브에 결합하는 복수의 매개체가 복수의 검출 분자에 결합할 수 있다. 매개체 프로브의 복수의 매개체를 서로 다른 검출 분자와 정확히 결합시킴으로써 분석의 다중화 정도를 크게 높일 수 있다. 전제 조건은 상기 검출 분자가 서로 다른 파장의 형광 신호를 생성한다는 것이다. 매개체 프로브와 표적 분자 당 n개의 검출 분자와 2개의 매개체를 사용함으로써 "n over 2" + n개의 서로 다른 표적 분자가 검출될 수 있다. 이항 계수(binomial coefficient)는 주어진 수의 상이한 검출 분자에 대해 검출 가능한 표적 분자의 수를 계산하는데 사용될 수 있다. 표적 분자는 두 개의 상이한 파장을 갖는 두 개의 형광 신호를 생성할뿐만 아니라 단일 형광 신호를 생성함으로써 식별될 수 있기 때문에, 검출 가능한 표적 분자의 최대 수를 계산하기 위해서는 이항 계수의 값을 n만큼 증가시켜야 합니다. 4개의 다른 검출 분자를 사용하면 10개의 다른 표적 분자를 검출할 수 있지만 5개의 검출 분자만으로 15개의 표적 분자를 구별할 수 있다(도 5A). 유사하게, 여러 매개체 프로브가 표적 분자마다 사용될 수 있으며, 하나의 매개체 프로브에는 하나의 매개체만 포함될 수 있다.
B. 동일한 표적 또는 주형 분자에 결합하는 하나 이상의 매개체 프로브가 사용될 수 있고, 그러한 매개체 프로브의 매개체 또는 매개체들은 하나 이상의 검출 분자에 동시에 결합할 수 있다. 검출 분자에서 매개체 결합 영역을 엄밀하게 결합함으로써, 예를 들어 단지 2개의 검출 분자를 사용하여 3개의 표적 분자를 구별하는 것이 가능하다. 검출 분자 당 n개의 검출 분자와 적어도 2개의 매개체를 사용함으로써 "2n - 1"개의 상이한 표적 분자를 검출할 수 있다. 복수의 다른 매개체 프로브가 동일한 표적 분자에 결합할 수 있다. 3개의 표적 분자가 단지 2개의 검출 분자를 사용하여 구별될 수 있는 상기 예에서, 상기 검출 분자는 각각 2개의 상이한 매개체 결합 영역을 포함할 수 있다. 2개의 상이한 표적 서열에 연결된 2개의 매개체는 각각 하나의 특정 검출 분자에만 결합한다. 표적 분자마다 특정 신호가 생성된다. 제3표적 서열에 연결된 제3매개체는 두 검출 분자에 결합하여 두 개의 상이한 신호를 유발한다. 두 개의 방출된 매개체가 동일한 검출 분자에 동시에 결합할 확률이 충분히 높다는 것을 보장하기 위해, 상기 방출된 매개체의 농도는 검출 분자의 농도의 순서 여야 한다(도 5b). 또한, 2개 이상의 상이한 매개체를 결합할 수 있는 검출 분자가 또한 사용될 수 있다.
C. 공통된 표적 분자 또는 주형 분자에 각각 결합하는 다수의 매개체 프로브를 사용할 수 있으며, 이러한 매개체 프로브의 매개체 또는 매개체들은 서로 다른 서열을 포함한다. 여러 가지 매개체가 하나의 동일한 검출 분자에 결합할 수 있으며, 검출 반응은 오직 여러 매개체를 결합함으로써 촉발될 수 있다. 이 방법은 검출 반응의 특이성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 가능한 반응 순서는 도 5c에 도시되어 있다. 두 개의 방출된 매개체가 동일한 검출 분자에 동시에 결합할 확률이 충분히 높다는 것을 보장하기 위해, 상기 방출된 매개체의 농도는 검출 분자의 농도의 순서이어야 한다.
실시예 6: 용융 곡선 분석(Melt curve analysis)
본 발명의 특정 버전에서, 연장된 매개체와 하이브리드화된 검출 분자의 용융 곡선 분석(melting curve analysis)은 증폭 반응 후에 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어 상이한 시그널링 분자로 표지된 상이한 검출 분자를 사용함으로써 다중화 정도를 추가로 증가시킬 수 있게 한다.
실시예 7: 분자 비콘 형태의 검출 분자
본 발명의 가능한 형태에서, 상기 검출 분자는 매개체 결합 영역이 루프 내에 위치하는 분자 비콘(molecular beacon)의 구조를 갖는다(도 6). 상기 기술된 검출 분자에 대한 매개체의 부착 및 후속 연장에 의해, 상기 분자 비콘(molecular beacon)이 열리고 표지된 5' 와 3' 말단이 분리되어 검출 가능한 신호가 증가한다. 지금까지 고려한 구조(도 3)에 비해 이 구조의 장점은 말단 형광 표식에 대한 합성 비용이 낮다는 것이다.
실시예 8: 2개의 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성된 검출 분자
본 발명의 또 다른 버전에서, 상기 검출 분자는 복수의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 소광제(quencher)와 형광단(fluorophore)으로 표지된 2개의 올리고뉴클레오티드는 서로 혼성화될 수 있고 매개체와 상호 작용할 때 분리될 수 있으므로 신호 변화가 검출될 수 있다. 기술된 검출 분자는 도 19에 도시된 바와 같이 구성될 수 있다.
실시예 9: 혼성화된 프로브를 포함하는 단일 가닥 DNA로부터의 검출 분자
이러한 설계에서, 검출 분자는 형광 공여체 및 형광 수용체로 표지된 여러 프로브가 혼성화되는 단일 가닥 DNA로 이루어질 수 있다. 상기 매개체가 방출된 후, 상기 매개체는 검출 분자에 결합하고 연장되어, 표지된 프로브는 방출되고 형광 공여체와 형광 수용체는 공간적으로 서로 분리되어 형광을 증가시킨다. 복수의 표지된 프로브와 검출 분자의 다중 혼성화는 신호 생성의 증식(multiplicatio) 효과를 유도한다. 검출 분자는 선형 또는 원형일 수 있고, 용액 중에서 균질할 수 있거나 또는 고체상에 고정화될 수 있으며, 다수의 매개체 결합 부위를 가질 수 있다. 검출 분자 원형이고 여러 매개체 결합 부위가 삽입되어 있으면, 신속한 검출 반응은 상이한 부위에서 복수의 매개체를 동시에 결합시킴으로써 양호한 동적 범위에서 일어날 수 있다. 검출 분자의 원형 구조는 감도의 추가적인 증가를 가능하게 하는데, 그 이유는 검출 분자상의 매개체의 혼성화 및 확장이 매개체가 결합하는 부위에 관계없이 모든 결합된 표지된 프로브를 방출하기 때문이다. 상이한 파장에서 방출하는 상이한 형광 공여체 및 형광 수용체를 갖는 프로브는 검출 분자에 결합될 수 있다. 상이한 농도로 사용될 수 있는 상이한 형광 염료를 조합함으로써 (검출 분자 당 표지된 프로브의 수에 의해 결정됨), 다중화의 정도가 증가될 수 있다. 특정 농도 비율은 정의된 검출 분자에 할당될 수 있다. 방출 후 표지된 프로브가 결합할 수 있는 결합 분자(도 7)는 형광 공여체 또는 형광 수용체로 표지된 방출 프로브가 장기적으로 검출 분자에 다시 결합하는 것을 방지하는 데 사용할 수 있다. 상기 설명된 설계는 바람직하게 등온 증폭 방법에 사용되며, 따라서 표지된 프로브가 표적 분자의 부재하에 상기 검출 분자에 결합하고 예를 들어, PCR에 의해 생성되는 높은 열 에너지로 인해 상기 검출 분자로부터 해리되지 않도록 보장한다.
바람직한 설계에서, 상기 형광 기증자 및 형광 수용체로 표지된 프로브는 상기 매개체를 확장시킴으로써 검출 분자로부터 분리되지 않지만, 방출된 매개체 존재하에 평형을 조정함으로써 대체된다. 상기 방출된 매개체는 표지된 프로브 보다 표지되지 않은 검출 분자에 더 높은 결합 에너지를 가지며, 따라서 형광 수용체로 표지된 더 짧은 프로브를 대체한다(도 25).
실시예 10: 내부 전반사 형광 현미경(TIRF) 또는 표면 플라스몬 공명 분광법을 통한 검출
전기 화학적 검출과 유사하게, 내부 전반사 형광 현미경(total reflection fluorescence microscopy, TIRF)에 의한 검출은 특정 설계에서 수행될 수 있다. 이 방법에서, 상기 검출 분자는 TIRF 조명기 위의 유리 또는 폴리머 테스트 캐리어 상에 고정화된다. 전반사에 의해 형성된 소멸장(evanescent field)은 샘플 부피를 통과하여 검출 분자 및/또는 매개체 및/또는 프로브에 위치하거나 이량체에 삽입된 형광 분자를 활성화시키며, 따라서 형광 신호의 변화를 감지할 수 있다. 추가 버전에서, 매개체와 검출 분자의 결합은 표면 플라스몬 공명 분광법에 의해 검출된다. 방출 및 후속적으로 표면에 고정화된 검출 분자 매개체에 결합함으로써, 샘플의 굴절률의 변화를 검출할 수 있다. 상기 검출 분자는 플라즈몬이 활성화된 금속 표면에 직접 또는 예를 들어 금속 표면에 직접 위치한 멤브레인 내/위에 직접 고정될 수 있다.
실시예 11: 중량 측정(gravimetric measurement)에 의한 검증
본 발명의 바람직한 버전에서, 상기 매개체의 방출 및 검출 분자로의 결합은 중량 측정(gravimetric measurement)에 의해 증명될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출 분자는 캐리어 표면 상에 고정화되고, 그 중량은 진동 석영(oscillating quartz)으로 결정될 수 있다. 따라서, 검출 분자에 대한 매개체의 결합으로 인한 중량 변화가 검출될 수 있다.
실시예 12: 롤링 서클 증폭의 증명(Proof of rolling circle amplification)
본 발명의 바람직한 버전에서, 적절한 증폭 효소가 있는 상태에서 방출된 매개체는 롤링 서클 증폭(rolling-circle amplification)을 일으킬 수 있으므로 상기 표적 분자는 롤링 서클 증폭 산물의 검출로 확인할 수 있다. 롤링 서클 증폭의 증폭 산물은 예를 들어 프로브를 통해 또는 pH값 변화, 겔 전기 영동 또는 비색법을 통해 서열 특이적으로 검출될 수 있다.
실시예 13: 시퀀싱을 통한 감지
본 발명의 바람직한 버전에서, 상기 방출된 매개체는 서열 분석에 의해 분석되어 확인할 수 있다. 차세대 시퀀싱의 예로는 나노포어 시퀀싱(nanopore sequencing)이 있으며, 핵산과 같은 분자가 포어가 있는 멤브레인을 통해 흐를 때 그의 잠재적인 변화가 측정되며, 따라서 핵산의 서열을 결정할 수 있다. 시퀀싱은 임의의 수의 매개체의 동시 방출을 검출하는데 사용될 수 있으며, 각각의 매개체는 특정 표적 분자의 존재를 신호한다. 형광 측정과 같은 기존의 방법과 비교하여 다중화의 정도가 증가한다. 시퀀싱 방법은 방출된 매개체의 검출을 위해 임의의 시퀀싱 방법이 선택될 수 있기 때문에 나노 크기 시퀀싱에 국한되지 않는다.
실시예 14: 선택된 매개체 사용
본 발명의 바람직한 버전에서, 매개체 프로브에 결합된 매개체는 특정 파장 λ1에서 방출하는 형광 공여체/형광 수용체로 표시될 수 있다. 상기 매개체 프로브 치환(displacement) 후에, 매개체는 λ1과는 다른 제2파장 λ2에서 방출되는 형광 수용체/형광 공여체로 표지된 검출 분자에 결합할 수 있다. FRET 메커니즘을 통해 형광 공여체에서 형광 수용체로의 에너지 전달은 형광 수용체의 방사 강도(radiation intensity)의 검출 가능한 증가를 유도하여, λ2의 방출이 검출되도록 한다. 다른 버전에서, 화학 발광 또는 생물 발광 공여 분자가 사용될 수 있다. 비-방출형인 형광 수용체 또한 디자인에 사용할 수 있다. 상이한 수의 뉴클레오티드를 갖는 검출 분자를 사용함으로써, 상이한 표적 분자는 용융 곡선 분석에 의해 하나의 표본에서 동시에 구별될 수 있다. 상기 매개체를 표시함으로써, 상기 기술된 검출 방법의 보편적 특성은 손실되지 않으며, 이는 상기 매개체가 표적 서열과 독립적인 보편적 분자이기 때문이다. 추가 디자인에서, 표적 분자 당 복수의 프로브 또는 프라이머를 사용하여 형광 염료로 표지된 매개체가 결합되고, 따라서 상기 매개체의 서열 및 형광 염료의 방출 파장이 다를 수 있다(도 9).
실시예 15: 등온 증폭 방법의 사용
이 실시 예에서, 본 발명에 따른 검출 방법은 등온 증폭 방법(isothermal amplification method), 예를 들어 LAMP에서 DNA를 검출하는데 사용된다. LAMP 동안의 매개체 방출 메커니즘은 도 10에 자세히 나와있다. LAMP의 초기 증폭 단계는 중간 증폭 산물의 덤벨과 같은 구조를 초래한다. 이 실시 예에서 프라이머로서 작용하는 매개체 프로브는 이 중간 증폭 산물에 결합할 수 있고 다음 단계에서 연장될 수 있다. 중간 증폭 산물을 치환시킴으로써, 또 다른 프라이머가 상기 연장된 매개체 프로브에 결합하여 연장될 수 있다. 이 과정에서 매개체는 비치 치환 중합효소에 의해 옮겨진다. 방출된 매개체는 이제 헤어핀 구조를 갖는 검출 분자에 결합할 수 있으며 또한 연장될 수 있다. 매개체의 연장 동안, 검출 분자의 폐쇄된 헤어핀 구조의 5' 말단이 상보적인 영역으로부터 치환되어 형광 신호를 생성한다.
샘플과 시약을 적절한 반응 용기에 넣고 혼합물을 배양한다(약 62℃에서 10분에서 60분 사이). 이 과정에서 형광은 반응 용기에서 검출된다. 다음은 LAMP 예제를 사용하여 설명된 실행에 대해 자세히 설명한다.
대장균 DNA(W3110, 완전한 게놈)의 실시간 LAMP 검출을 위해, 표 1에 열거된 프라이머를 사용하였다. LAMP 프라이머는 (Tanner et al. 2012)에서 취해서 부분적으로 수정했다. 상기 매개체 프로브는 프라이머의 5' 말단에 매개체와 혼성화할 수 있는 매개체 결합 영역을 추가함으로써 LoopF 프라이머와 결합되었다. 매개체, 매개체 결합 영역을 갖는 LoopF 및 검출 분자는 VisualOMP(DNA Software, USA)를 사용하여 수동으로 제조하였다. 표 1의 합성 올리고뉴클레오티드는 Biomers(biomers.net, Ulm, Germany)에 의해 합성되었다.
| FIP | CTGCCCCGACGATAGGCTTAATCGTGGTCTGGTGAAGTTCTACGG |
| c | CCAGTGCGACCTGCTGGGTGGGTATTGTTCGCCGCCAGTAC |
| F3 | GATCACCGATTTCACCAACC |
| B3 | CTTTTGAGATCAGCAACGTCAG |
| LoopF | TGCGCCATGTCCCGCT |
| LoopB | TGAGTTAACCCACCTGACG |
| 매개체 | TCCGCAGCAAGTGGGCTCTACGACC |
| 매개체 결합 서열을 포함하는 LoopF | GGTCGTAGAGCCCACTTGCTGCGGATGCGCCATGTCCCGCT |
| 검출 분자 | BHQ-2-GACCGGCCAAGACGCGCCGGT(dC-Cy5)TGTTGGTCGTAGAGCCCAGAACGA |
LAMP 반응은 1x 등온 증폭 버퍼(New England Biolabs, Frankfurt, Germany)에서 Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소로 수행하였다. 1x 등온 증폭 버퍼는 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4 및 0.1 % Tween® 20(25℃에서 pH 8.8)을 포함한다. 또한 완충액에 MgSO4(New England Biolabs, Frankfurt, Germany), 최종 농도 8.0 mM 및 dNTP Mix(Qiagen, Hilden, Germany), 최종 농도 1.4 mM을 첨가 하였다. 상기 LAMP 반응은 1.6 μM FIP 및 BIP, 0.2 μM F3 및 B3, 0.8 μM LoopB, 0.6 μM LoopF, 0.2 μM 매개체 결합 영역을 포함하는 LoopF, 0.1 μM 매개체, 0.05 μM 검출 분자, 320 U/ml Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, 1x Isothermal Amplification Buffer 및 1 g/l BSA을 포함한다. 반응은 62℃에서 3회 반복하여 로터 유전자 6000(Corbett, Mortlake, Australia, 현재 Qiagen, Hilden, Germany)에서 수행 하였다. 형광 데이터는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다(도 11).
이 검출 방법은 Haemophilus ducreyi(H. ducreyi)와 Treponema pallidum(T. pallidum)의 LAMP에서도 사용되었다. 성능 및 반응 조건은 상기 설명한 E. coli의 LAMP와 동일 하나, H. ducreyi 및 T. pallidum에 대한 서열 특이적 프라이머를 사용하였다. 형광 데이터는 0분에서 초기 값으로 표준화 되었다(도 26 및 27).
실시예 16: RT-LAMP를 이용한 본 발명에 따른 절차
추가 예에서, 본 발명의 방법에 따른 검출은 RNA를 검출하기 위해 사용되며, 상기 RNA는 역전사(RT) 또는 다른 적합한 효소 시스템을 사용하여 cDNA로 전사되고 상기 cDNA는 증폭된다. 다음은 RT-LAMP를 사용한 실행 예를 자세히 설명한다.
표 2에 열거된 프라이머는 HIV-1 RNA 검출을 위한 RT-LAMP에 사용되었다. RT-LAMP 프라이머 는 Curtis et al. (2008)에서 취하여 부분적으로 수정하였다. 상기 매개체 프로브는 프라이머의 5' 말단에 매개체와 혼성화할 수 있는 매개체 결합 영역을 추가함으로써 LoopF 프라이머와 결합되었다. 매개체, LoopF와 매개체 결합 영역 및 검출 분자는 VisualOMP를 사용하여 수동으로 제조되었다. 합성 올리고뉴클레오티드 매개체, 매개체 결합 서열을 갖는 LoopF 및 검출 분자는 Biomers(biomers.net, Ulm, Germany)에 의해 합성되었다. 프라이머 FIP, BIP, F3, B3, LoopF 및 LoopB는 Ella Biotech(Martinsried, Germany)에 의해 합성되었다. 주형 RNA(HIV, VR-3245SD)는 ATCC, LGC Standards GmbH(독일, Wesel)에 의해 합성되었다.
| FIP | CAGCTTCCTCCTCATTGATGGTTTTTTTTTTTTTTAACACCATGCTAAACACACAGT |
| BIP | TGTTGCACCAGGCCAGATAATTTTT GTACTGGTAGTTCCTGCTATTTG |
| F3 | ATTATCAGAAGGAGGAGACCACC |
| B3 | CATCCTATTTGTTCCTGAAGG |
| LoopF | TTTAACATTTGCATGGCTGCTTGAT |
| LoopB | GAGATCCAAGGGGAAGTGA |
| 매개체 | CCATGCCTCAGGAGGAGCTCAGTTCGGTCAGTG |
| 매개체 결합 서열을 포함하는 LoopF | CACTGACCGAACTGAGCTCCTGAGGGCATGGTTTAACATTTTTGCATGGCTGCTTGAT |
| 검출 분자 | BMN-Q-535-CACCGGGCCAAGACGCGCCGGGG(dT-Atto-647N)GTGTTCACT-GACCGAACTGGGAGCA |
상기 RT-LAMP 반응은 1x Isothermal Amplification Buffer(New England Biolabs, Frankfurt, Germany)에서 Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase(New England Biolabs, Frankfurt, Germany) 및 Transcriptor Reverse Transcriptase(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)와 함께 수행하였다. 1x Isothermal Amplification Buffer 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4 및 0.1 % Tween® 20(pH 8.8 at 25℃)를 포함한다. 또한, MgSO4 (New England Biolabs, Frankfurt, Germany), 최종 농도 8.0 mM, 및 dNTP Mix (Qiagen, Hilden, Germany), 최종 농도 1.4 mM를 상기 버퍼에 첨가하였다. 상기 LAMP 반응은 1.6 μM FIP 및 BIP, 0.2 μM F3 및 B3, 0.8 μM LoopB, 0.6 μM LoopF, 0.2 μM 매개체 결합 영역을 포함하는 LoopF, 0.1 μM 매개체, 0.05 μM 검출 분자, 320 U/ml Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, 1x Isothermal Amplification Buffer 및 1 g/l BSA을 포함한다. 반응은 62℃에서 3회 반복하여 로터 유전자 6000(Corbett, Mortlake, Australia, 현재 Qiagen, Hilden, Germany)에서 수행 하였다. 양성 대조군은 합성 HIV-1 RNA의 3,400 카피/반응을 함유하고, 음성 대조군은 HIV-1 RNA를 함유하지 않았다. 형광 데이터는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다(도 12).
검출 방법은 또한 인간 T-림프성 바이러스(HTLV-1) 및 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus, TMV) RNA의 RT-LAMP에도 성공적으로 적용되었다. 성능 및 반응 조건은 HIV-1의 이미 기술된 RT-LAMP와 동일하지만, HTLV-1 및 TMV에 대한 서열 특이적 프라이머와 동일하다. 형광 데이터는 0분에서 초기 값으로 표준화되었다(도 28 및 29).
실시예 17: 비-등온 증폭 반응을 이용한 본 발명에 따른 방법
본 발명의 추가의 실시 예에서, 본 발명에 따른 검출 방법은 PCR 또는 PCDR과 같은 비-등온 증폭 반응에서 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 이것은 매개체 프로브를 나타내는 방식으로 하나 이상의 프라이머를 변형시키는 것을 포함한다. 적합한 반응 용기에서, 샘플 및 필요한 시약을 넣고 혼합물을 항온 처리한다. 이 과정에서 형광은 반응 용기에서 검출된다. 다음은 PCDR을 사용하는 실행 예제를 자세히 설명한다:
표 3에 나열된 프라이머는 마우스 DNA의 real-time PCDR 검출에 사용되었다. G3PDH DNA의 증폭을 위한 PCDR 프라이머는 (Ignatov et al., 2014)에서 취하여 부분적으로 수정하였다. 상기 매개체 프로브는 프라이머의 5' 말단에 매개체와 혼성화될 수 있는 매개체 결합 영역을 추가함으로써 F3 프라이머를 사용하여 제조되었다. 매개체, 매개체 결합 영역을 갖는 F3 및 검출 분자는 VisualOMP를 사용하여 수동으로 제조되었다. 합성 올리고뉴클레오티드 매개체, 매개체 결합 서열을 갖는 F3 및 검출 분자뿐만 아니라 프라이머는 Biomers(biomers.net, Ulm, Germany)에 의해 합성되었다. 증폭될 마우스 G3PDH DNA 서열은 Ignatov et al. (2014)에서 취하였고 G3PDH 단편은 Integrated DNA Technologies(IDT, Coralville, IA)에 의해 합성되었다.
| F1 | GTGAAGGTCGGTGTGAACGGA |
| F2 | TTCTGCCGATGCCCATGT |
| F3 | GCATCCTGCACCACCAACTG |
| R1 | GGTTTCTTACTCCTTGGAGGC |
| R2 | CAGATCCACGACGGACACATT |
| R3 | GAGCTTCCCGTTCAGCTCTG |
| 매개체 | TAAAGCCATAGCCGTACTAGCTGCTCCAGTTCGGTCAGTG |
| 매개체 결합 서열을 포함하는 F3 | CACTGACCGAACTGGACTGGAGCAGCTAGTACGGCTATGGCTTTAGCATCCTGCACCACCAACTG |
| 검출 분자 | BMN-Q-535-CACCGGGCCAAGACGCGCCGGGG(dT-Atto-647N)GTGTTCACTGACCGAACTGGGAGCA |
PCDR은 SD Hotstart DNA Polymerase in 1x SD buffer(Bioron, Ludwigshafen, Germany)로 수행되었다. 또한, MgCl2(Bioron, Ludwigshafen, Germany), 최종 농도 2.75 mM, 및 dNTPs(New England Biolabs, Frankfurt, Germany), 최종 농도 0.25 mM가 버퍼에 첨가되었다. 상기 PCDR 반응은 0.1 μM F3 및 각각의 매개체 결합 영역을 포함하는 F3, 0.2 μM R3, 0.1 μM F2 및 R2, 0.05 μM F1 및 R1, 0.05 μM 매개체, 0.05 μM 검출 분자, 200 U/ml SD Hotstart DNA Polymerase 및 1x SD buffer를 포함한다. 상기 반응은 다음 프로토콜(Ignatov et al. 2014)에 따라 rotor gene 6000(Corbett, Mortlake, Australia, 현재 Qiagen, Hilden, Germany)에서 수행되었다: 92℃에서 2분간 초기 변성시킨 후, 92℃(15초) 및 66℃(40초)에서 45 사이클. 형광 데이터는 0 사이클에서 초기 값으로 표준화되었다(도 30). 양성 대조군은 반응 당 100 pg G3PDH 단편을 포함하고, 음성 대조군은 주형 DNA를 함유하지 않았다.
실시예 18: 프라이머로 작용하지 않는 발명된 매개체 프로브
추가의 예에서, 본 발명의 방법에 따른 검출은 증가된 특이성을 갖는 DNA 또는 RNA의 검출에 사용될 수 있다. 프라이머는 매개체 프로브 역할을 하지 않지만 증폭을 위한 시작점으로 사용되지 않는 특별한 프로브가 사용된다. 표적 분자가 없을 때, 프로브는 닫힌다. 표적 분자가 반응 혼합물에 존재하자마자, 상기 매개체 프로브는 표적 분자 또는 주형 분자에 결합하고, 프라이머는 현재 개방된 매개체 프로브의 3' 말단에 결합할 수 있다. 적합한 효소 시스템으로 처리함으로써 부착된 프라이머를 연장시킬 수 있고, 동일한 매개체가 매개체 프로브에 의해 치환될 수 있다. 방출된 매개체는 특정 검출 분자의 도움을 받아 검출할 수 있다. 효소 증폭 과정은 등온 공정(도 13)을 포함할 수 있으나 이에 국한되지는 않는다.
실시예 19: 표적 분자-특이적 압타머의 사용
다른 버전에서, 표적 분자-특이적 압타머(aptamer)에 의한 표적 분자의 검출을 위한 본 발명에 따른 검출 방법을 적용할 수 있다. 표적 분자-특이적 압타머, 조사될 표본 및 검출 분자를 적합한 반응 용기에 넣는다. 검출될 표적 분자는 예를 들어, 단백질 또는 펩타이드일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상호 작용 후 압타머 특이적 매개체 프로브 및 프라이머가 부착될 수 있도록 압타머는 표적 분자에 결합하고 그의 구조를 변화시킨다. 적합한 효소 시스템으로 처리함으로써, 압타머에 부착된 프라이머(도 14: 압타머의 흰색 마커)는 연장될 수 있으며, 이는 단백질 결합 영역 밖의 압타머 서열의 증폭을 야기한다. 선형 증폭 산물에 매개체 프로브를 결합시킴으로써, 상기 프로브를 열고, 추가의 프라이머를 사용하여 매개체 프로브로부터 매개체를 치환시킨다. 방출된 매개체는 특정 검출 분자 또는 적절한 검출 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 효소 증폭 과정은 등온 공정(도 14)을 포함할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다.
실시예 20: 압타머 영역, 매개체 결합 영역 및 프라이머 결합 영역을 포함하는 변형된 매개체 프로브.
바람직한 설계에서, 독창적인 검출 방법은 압타머 영역, 매개체 결합 영역 및 프라이머 결합 영역을 포함하는 변형된 매개체 프로브를 사용하여 표적 분자를 검출하는데 사용될 수 있다. 검출될 표적 분자는 예를 들어, 단백질 또는 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표적 분자가 없는 경우, 프라이머는 매개체 프로브에 결합하고 적절한 효소 시스템으로 처리함으로써 매개체 프로브로부터 매개체를 대체함으로써 연장될 수 있다. 방출된 매개체는 특정 검출 분자 또는 방법을 사용하여 검출 가능한 신호를 유발할 수 있다. 표적 분자가 존재하면, 상기 매개체 프로브의 압타머 영역은 표적 분자에 결합하고, 따라서 프라이머 결합 영역에 부착된 프라이머는 연장될 수 없다(도 15). 표적 분자가 존재하면, 표적 분자가 없는 것과 비교하여 신호 강하가 검출된다. 효소 증폭 공정은 등온 공정을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 21: 프라이머 결합 영역에 의해 측면으로 배치된 단백질 결합제 영역을 포함하는 압타머의 용도
지수 검출 반응을 생성하기 위해, 5' 말단에 매개체 혼성화 서열을 갖는 프라이머 및 그것에 혼성화된 매개체로 구성된 매개체 프로브가 사용된다. 또한, 프라이머 결합 영역 측면에 배치된(flanked by) 단백질 결합 영역인 압타머(aptamer)가 사용된다. 표적 분자가 존재하면, 상기 압타머는 표적 분자에 결합한다. 상기 압타머에 결합하는 프라이머는 표적 분자와의 결합으로 인해 연장될 수 없다. 결과적으로, 상기 매개체가 방출되지 않고, 표적 분자가 존재할 때, 표적 분자가 없는 것과 비교하여 신호의 떨어짐이 검출된다. 표적 분자가 없는 경우, 프라이머는 압타머에 결합하여 연장될 수 있으며, 이는 매개체 방출을 통한 신호 증가를 유도한다. 효소 증폭 과정은 등온 방법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(도 16).
실시예 22: 검출 분자의 고정화
본 발명에 따른 검출 방법의 다른 바람직한 버전에서, 상기 검출 분자는 고체상(solid phase)의 적합한 반응 용기에 고정화될 수 있다. 이어서, 샘플 및 필요한 시약을 반응 용기에 첨가하고 혼합물을 적절한 조건하에서 배양한다. 샘플은 DNA, RNA 및/또는 펩타이드 또는 단백질로 구성될 수 있다. 표적 분자가 존재하는 경우, 상기 매개체는 매개체 프로브에 의해 치환되고 반응 혼합물 내에서 고정된 검출 분자로 확산될 수 있다. 상기 절차에는 등온 증폭 절차가 포함되나 이에 국한되지 않는다(도 17).
실시예 23: 이완시간측정법(relaxometry)의 사용
추가의 버전에서, 본 발명의 방법에 따른 검출은 표적 분자의 검출을 위한 자기 이완시간측정법(magnetic relaxometry)과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 검출 분자는 자성 입자에 결합되어 자기 이완시간측정법(magnetic relaxometry)에 의한 검출을 가능하게 한다. 자기 이완시간측정법(magnetic relaxometry)에서 자기 입자가 짧은 자기 펄스(magnetic pulse)에 의해 자기화(magnetized)되고 유도된 자기 모멘트의 시간적 저하(temporal degradation)가 감지된다. 매개체가 결합하고 입자에 고정화된 분자 검출을 통해 연장되는 입자의 유체 저항, 즉 어떤 매개체가 결합하지 않은 입자의 유체 저항이 커진다. 매개체가 결합하고 연장되는 입자는 매개체가 결합하지 않은 입자보다 유도된 자기 모멘트를 더 천천히 저하시킨다. 따라서, 언급된 입자의 유도된 자기 모멘트의 이완 시간은 서로 다르며, 따라서 매개체의 방출을 검출할 수 있다. 자기 이완시간측정법(magnetic relaxometry)와 용융 곡선 분석을 결합하여 하나의 샘플에서 다른 표적 분자를 나란히 감지할 수 있다. 이 과정은 등온 증폭 과정을 포함 하나 이에 한정되지 않는다.
실시예 24: 자성 또는 자성화될 수 있는 입자의 사용
다른 설계에서, 본 발명의 방법에 따른 검출은 표적 분자를 검출하기 위해 자성 또는 자성화될 수 있는 입자와 조합하여 사용될 수 있다(도 31). 상기 매개체는 자성 또는 자성화될 수 있는 나노입자에 결합되어 있다. 복수의 매개체가 동시에 한 입자에 결합될 수 있다. 본 발명에 따라, 상기 매개체는 초기에 프라이머와 혼성화한다. 표적 또는 주형 분자의 증폭 동안, 상기 매개체는 프라이머에 의해 치환되고 이어서 고체상에 고정화된 검출 분자와 혼성화될 수 있다. 방출된 매개체와 검출 분자 사이의 결합은 나노입자를 고체상의 표면으로 가져와 자기 특성의 변화를 감지할 수 있게 한다. 고체상 표면상의 신호 변화를 검출하기 위하여, 갈바노-마그네틱(galvano-magnetic), 자기-저항식(magneto-resistive), 자기-광학(magneto-optical) 효과 또는 조셉슨 효과를 기초로 하는, 그러나 이에 제한되지 않는 것 중에서 자기장 센서가 사용될 수 있다. 고체상에 비-방출된 매개체/입자 유닛의 축척으로 인한 위양성 신호(false positive signal)를 방지하기 위해, 방출되지 않은 매개체/입자 유닛은 약한 자기장을 가함으로써 고체상으로부터 분리될 수 있다.
실시예 25: 헤어핀 구조를 갖는 검출 분자를 이용한 전기 화학적 검출
추가 버전에서, 본 발명의 방법에 따른 검출은 전기 화학적(electrochemical) 검출과 조합하여 표적 분자를 검출할 수 있다. 이 버전에서, 상기 검출 분자는 동시에 고체상을 나타내는 전극 상에 고정화된다. 방출된 매개체는 매개체 결합 영역에서 검출 분자와 혼성화될 수 있고 중합효소에 의해 연장될 수 있다. 상기 매개체 결합 영역은 검출 분자의 상이한 영역에 위치할 수 있다. 검출 분자는 헤어핀 구조를 가질 수 있고 5' 말단에 산화 환원(redox) 분자로 표시될 수 있다. 매개체의 연장은 검출 분자의 5' 말단을 치환하고 후자를 개방한다. 표시된 5' 말단의 치환로 인해, 산화 환원 분자와 전극 표면 사이의 거리가 증가하여 검출 가능한 신호 변화를 일으킨다. 절차는 등온 증폭 절차를 포함하지만 이에 국한되지 않는다(도 18).
실시예 26: 고체상에서의 전기 화학적 검출에 의한 증명
이러한 바람직한 설계에서, 전기 화학적 검출에 의한 검출은 고체상에서 일어날 수 있다. 이 버전에서, 상기 검출 분자는 전극 상에 고정되고, 동시에 고체상에 제시된다. 방출된 매개체는 매개체 결합 영역에서 검출 분자와 혼성화될 수 있고 중합효소에 의해 연장될 수 있다. 확장 후, 산화 환원 분자는 검출 분자와 확장된 매개체의 이량체에 삽입되어 검출될 수 있는 전기 화학 신호를 생성할 수 있다(도 8). 신호 생성은 도 20에 따라 매개체를 확장하지 않고도 발생할 수 있다. 상기 매개체는 라벨이 없으며 삽입형 산화 환원 분자가 사용될 수 있고 및/또는 매개체가 하나 이상의 산화 환원 분자로 표지될 수 있다. 상기 매개체가 산화 환원 분자로 표지되어 있다면, 방출된 매개체의 결합 및 필요한 경우 검출 분자로의 매개체의 계속적인 확장은 도 21-23에서 설명한대로 신호 생성을 유도한다. 다른 버전에서, 상기 검출 분자는 하나 이상의 산화 환원 분자로 표시된다. 방출된 매개체의 결합 및 이후의 매개체의 검출 분자로의 연장은 도 24에 따른 신호 변화를 유도한다. 더 강한 신호를 얻기 위해 표적 분자 및/또는 앰플리콘(amplicon) 당 여러 매개체를 방출하는 것이 유리할 수 있다. 표적 분자 당 복수의 매개체의 방출은 예를 들어 매개체를 여러 개의 다른 매개체 프로브에 부착함으로써 성취될 수 있다.
이하, 도 21에 따른 전기 화학적 검출이 논의될 것이다. 상기 매개체는 (a) 산화 환원 분자로 표지되고 증폭 중에 방출된다. 이 버전에서, 표지되지 않은 검출 분자는 전극 상에 고정화되며, 이는 동시에 고체상을 나타내며, 상기 방출된 매개체는 매개체 결합제 영역에서 검출 분자와 혼성화할 수 있다. 매개체 상의 산화 환원 분자와 전극 표면 사이의 공간적 근접성으로 인해 신호 변화가 감지될 수 있다. 검출은 증폭 반응 동안 실시간으로 또는 증폭 생성물을 전극 표면으로 전달함으로써 종말점 검출(endpoint detection)로서 일어날 수 있다. 실시 예는 E. coli의 LAMP의 증폭 산물의 전기 화학적 종말점 검출(endpoint detection)을 사용하여 하기에 상세히 설명된다:
LAMP 반응은 실시 예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그러나 전기 화학적 검출 매개체의 경우, 매개체 결합 서열 및 검출 분자를 포함하는 LoopF가 적절하게 적용되었다(표 4). 매개체 결합 서열 및 검출 분자를 포함하는 LoopF는 Biomer(biomers.net, Ulm, Germany)에 의하여, 상기 메틸렌 블루 유도체(Atto MB2)로 변형된 매개체는 IBA Lifesciences(Gottingen, Germany)에 의해 합성되었다.
| 매개체 | Atto MB2-TCGTTCTGGGGCTCTACGACC |
| 매개체 결합 서열을 포함하는 LoopF | GGTCGTAGAGAGCCCAGAACGATGCGCCATGTCCCGCT |
| 검출 분자 | TTTTTTTTTTTTGGTCGTAGAGCCCAGAACGA |
실시 예 15에 기재된 바와 같이 대장균 DNA의 LAMP를 수행한 후, 반응 혼합물을 검출 분자가 고정화된 전극이 있는 챔버로 옮겼다. 양성 대조군 반응(E.coli DNA의 60,000 카피)에서 방출된 매개체의 전기 화학적 검출은 네모파전압전류법(square wave voltammetry)에 의해 수행되었다(도 32). 양성 대조군에서, 상기 매개체는 LAMP 반응 중에 옮겨지고, 반응 혼합물을 전극 챔버로 옮긴 후에 검출 분자에 혼성화할 수 있다. 표시된 (여기서 메틸렌 블루) 매개체는 전극 표면에 축적되어 전기 화학적 분석 (여기서는 네모파전압전류법)에서 -0.39V에서 특징적인 피크를 형성한다. 대조적으로, 음성 대조군(NTC)에서 피크가 없는 것은 매개체의 유의적인 방출이 없음을 나타낸다. 전기 화학적 검출과 함께 본 발명에 따른 검출 방법의 적용은 증폭 반응 후에 추가의 변형 또는 반응 단계를 수행할 필요가 없기 때문에 특히 유리하다.
실시예 27: DNA, RNA, 펩티드 및/또는 단백질의 동시 검출
본 발명에 따른 방법의 바람직한 버전에서, DNA, RNA 및 펩타이드 또는 단백질 또는 전술한 물질 군의 다른 조합은 하나의 접근법으로 기술된 방법에 의해 동시에 검출된다. 이 과정은 등온 증폭 과정을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
참조
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 45
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<220>
<223> primer
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<220>
<223> primer
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gatcaccgat ttcaccaacc 20
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<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<220>
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cagatccacg acggacacat t 21
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<212> DNA
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<223> primer
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taaagccata gccgtactag ctgctccagt tcggtcagtg 40
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<223> First Part of a Mediator Probe
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<223> First Part of a Mediator Probe
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<400> 30
tttttttttt ggtcgtagag cccagaacga 30
Claims (18)
- 하기의 단계를 포함하는 표적 분자를 검출하는 방법:
a) 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 매개체 프로브를 제공하는 단계, 여기서
i. 제1올리고뉴클레오티드는 프로브 영역 및 매개체-결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 프로브 영역은 상기 표적 분자 또는 주형 분자에 대한 친화도를 가지며, 상기 매개체-결합 영역은 적어도 하나의 매개체에 대한 친화도를 가지며, 및 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드는 신호 발생을 위한 표지(label)를 포함하지 않음,
ii. 적어도 하나의 추가의 올리고뉴클레오티드는 상기 매개체-결합 영역을 통해 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드에 결합하고, 적어도 하나의 검출 분자에 대해 친화도를 갖는 매개체이고, 여기서 상기 매개체는 검출 분자와의 상호 작용에 의해 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드로부터 방출된 후 검출 가능한 신호를 유발함;
b) 검출 분자를 제공하는 단계, 여기서 상기 검출 분자는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고
i. 적어도 하나의 매개체와 상호작용하는 적어도 하나의 제1영역, 및
ii. 형광 수용체 또는 형광 공여체 또는 고체상 또는 화학적 보호기 또는 산화 환원 개질 또는 발광 개질에 결합하기 위한 화학 그룹을 포함하는 제2영역, 또는
iii. 형광 수용체 또는 형광 공여체 또는 고체상 또는 화학적 보호기 또는 산화 환원 개질 또는 발광 개질에 결합하기 위한 화학 그룹을 포함하는 제3영역,
또는
iv. 형광 공여체 또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제1프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제4영역, 또는
v. 형광 공여체 또는 형광 수용체를 포함하는 적어도 하나의 제2프로브와 상호 작용하는 적어도 하나의 제5영역을 포함함;
c) 상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 프로브 영역을 주형 분자 또는 표적 분자의 서열에 결합시키는 단계;
d) 상기 매개체 프로브 또는 주형 분자 또는 표적 분자의 제1올리고뉴클레오티드를 증폭하는 단계;
e) 적어도 하나의 보조 분자에 의해 상기 매개체를 방출시키는 단계;
f) 상기 방출된 매개체와 상기 검출 분자의 제1영역에 결합시키는 단계; 및
g) 신호 변화를 감지하는 단계,
여기서 상기 신호 변화는
상기 검출 분자의 제1영역에 결합된 상기 방출된 매개체를 상기 하나 이상의 보조 분자에 의해 효소적으로 연장되고, 상기 보조 분자는 상기 결합된 매개체의 3' 말단에 결합하고, 이로써 검출 분자의 물리적 또는 화학적으로 측정 가능한 변화가 일어남.
- 제1항에 있어서,
상기 매개체는 신호 생성을 위한 마커를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 매개체는 신호 생성을 위한 하나 이상의 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 검출 분자는 헤어핀 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 주형 분자 또는 표적 분자의 서열에 대한 매개체 프로브의 제1올리고뉴클레오티드의 프로브 영역의 결합 후에 보조 분자에 의해 효소적으로 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
매개체 프로브 또는 주형 분자 또는 표적 분자의 제1올리고뉴클레오티드의 증폭은 등온 또는 비-등온 증폭 방법에 의하여 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 검출 분자는 적어도 하나의 형광 또는 발광 개질(luminescence modification)을 포함하고, 하나 이상의 매개체와의 반응 후에, 상기 형광 또는 발광 개질이 보조 분자에 의해 검출 분자로부터 절단되고 또는 상기 검출 분자의 헤어핀 구조의 5' 말단이 제거되고 또는 헤어핀 구조가 펼져지고 형광 신호 또는 발광 신호의 변화가 상기 검출 분자 상에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
매개체 프로브 또는 복수의 매개체 프로브 또는 표적 분자 당 복수의 검출 분자마다 복수의 매개체가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
적어도 하나의 보조 분자는 DNA 가닥 분리 효과 또는 중합 효과를 가지며, 상기 보조 분자는 가닥 변위 중합 효소(strand displacement polymerase)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 표적 분자 또는 주형 분자는 DNA, RNA, 펩티드, 단백질, 압타머 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 보조 분자는 중합 효소, 촉매, 단백질, 핵산, 천연 물질, 효소, 효소 시스템, 세포 용해물, 세포 성분, 세포 성분으로부터 유래된 유도체 또는 합성 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서,
형광, 인광, 발광, 질량, 흡수, 빛의 산란, 전기 전도성, 효소 활성 또는 친화도, 전기 화학 포텐셜 또는 신호, 굴절률, 표면 플라즈몬(surface plasmons)의 트리거링, 자기 이완, 자기 특성, 임피던스 또는 커패시턴스에서의 측정 가능한 변화는 고정된 또는 비-고정된 검출 분자와 적어도 하나의 매개체 사이의 직접적 또는 간접적인 상호 작용에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
적어도 하나의 매개체의 방출은 등온 또는 비-등온 증폭 방법에 의한 적어도 하나의 매개체의 증폭에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 방출된 적어도 하나의 매개체는 시퀀싱에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 방출된 매개자는 혼성화에 의해 검출 분자에 결합하고, 상기 검출 분자에 결합한 후에 보조 분자에 의해 선택적으로 연장되며, 이어서 용융 곡선 분석이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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