JP6265905B2 - 普遍的リアルタイム多分析物検出用の二官能性オリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents
普遍的リアルタイム多分析物検出用の二官能性オリゴヌクレオチドプローブ Download PDFInfo
- Publication number
- JP6265905B2 JP6265905B2 JP2014540506A JP2014540506A JP6265905B2 JP 6265905 B2 JP6265905 B2 JP 6265905B2 JP 2014540506 A JP2014540506 A JP 2014540506A JP 2014540506 A JP2014540506 A JP 2014540506A JP 6265905 B2 JP6265905 B2 JP 6265905B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- molecule
- mediator
- region
- detection
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 366
- 239000012491 analyte Substances 0.000 title description 11
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title description 7
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 title description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 353
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 194
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 120
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 111
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 110
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 69
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 47
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 44
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 42
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 42
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 42
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 40
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 40
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 33
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 31
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 20
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 83
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 80
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 68
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 62
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 62
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 40
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 38
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 38
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 37
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 33
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 16
- 241000388169 Alphapapillomavirus 7 Species 0.000 description 15
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 15
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 14
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 12
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 11
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 11
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 9
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 4
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 4
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000013039 cover film Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 2
- 101150077062 pal gene Proteins 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101100020619 Arabidopsis thaliana LATE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101100215371 Homo sapiens ACTB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000641175 Human papillomavirus type 18 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran thf Chemical compound C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Description
a.蛍光アクセプタ若しくは蛍光ドナー、及び/又は固相に結合する化学基及び/又は保護化学基を有する上記検出分子の5’末端の第1の領域と、
b.上記メディエーター領域と相互作用する第2の領域と、
c.蛍光ドナー若しくは蛍光アクセプタ、及び/又は保護化学基を有する第3の領域と、
を有することを特徴とする、系に関する。
d.固相に結合する化学基及び/又は保護化学基を含む上記検出分子の3’末端の第4の領域、
を有することが有利である。
e.上記メディエータープローブのプローブ領域を、鋳型分子及び/又は標的分子の配列に結合させる工程と、
f.上記鋳型分子及び/又は上記標的分子を増幅する工程と、
g.上記メディエータープローブを少なくとも1つの補助分子によって切断部位で切り離す工程と、
h.上記メディエータープローブの切断したメディエーター領域を検出分子に結合させる工程と、
を含む、方法に関する。
メディエーター領域のフラグメント及びプローブ領域のフラグメント、又は、
メディエーター領域及びプローブ領域のフラグメント、又は、
メディエーター領域、及び連続したフラグメントとしてのプローブ領域の一部分、及びプローブ領域のフラグメント、又は、
メディエーター領域のフラグメント、ロック領域及び/又はロック領域のフラグメント、並びにプローブ領域のフラグメント、又は、
メディエーター領域、並びにロック領域及び/又はロック領域のフラグメント、並びにプローブ領域のフラグメント、又は、
メディエーター領域、並びに連続したフラグメントとしてのプローブ領域の一部分、並びにロック領域及び/又はロック領域のフラグメント、並びにプローブ領域のフラグメント。
また、例示的な実施形態を図9に概略的に示す。好ましい核酸検出の簡単な実証は以下の通りに行うことができる。分析対象のサンプル中の細菌DNAの検出については、検出分子を好適な反応容器内に固定化する。しかしながら、検出分子は溶液中に存在していてもよい。次に、サンプル及び所要の試薬を反応容器に添加し、95℃での初期温度保持工程の後、混合物を周期的に加熱及び冷却する。このプロセスにおいて、反応容器における蛍光をサイクルの規定の時点で検出する。この例示的な実施形態を下記に詳細に説明する。
第2の実施例では、RNAを標的分子として使用した。RNAを逆転写又は別の好適な酵素系によってcDNAへと転写した。この工程は別個の反応容器で行い、1つのアリコートを例示的な実施形態i)による検出反応に供した。代替的には、例示的な実施形態i)によって逆転写及び後続の増幅を同じ反応容器で行うことができた。この実施例では、1つ又は複数の遺伝子の発現分析が実験目標として最大の関心事であった。
サンプル中のDNA及びRNAの並行検出は、好適な酵素系を組み合わせることによって行うことができる。そのようにして、規定の5’配列オーバーハングを有するプライマーを用いて検出対象のRNAを増幅する(図9を参照されたい)。この検出に使用されるメディエータープローブを、配列オーバーハング、プライマー及び伸長プライマーの一部に部分的に結合するように設計する。この規定の遺伝子座のために、RNAから生じたcDNAのみが特異的メディエータープローブによって検出され、RNAを転写したゲノム遺伝子座は検出されないことが確実である。反応バッチにおけるゲノムDNAの検出については、この配列のみに相補的なメディエータープローブを使用する。このようにしてcDNAを生成し、ゲノムDNAの特異的なセグメントを続いて任意に行われる増幅反応において増幅し、遺伝子座特異的なメディエータープローブを切断し、メディエーターを局所的に分解された固定化検出分子上での好適な検出方法によって検出することができる。
標的分子特異的なアプタマーを含む試薬及び分析対象のサンプルを、検出分子が局所的に分解された形で固定化されているか(図9を参照されたい)、又は溶液中に存在する好適な反応容器に入れる。検出対象の標的分子は例えばタンパク質又はペプチドであり得るが、これらに限定されない。アプタマーは標的分子に結合し、相互作用が成功した後にアプタマー特異的なメディエータープローブ及びプライマーがアニールすることができるようにその構造を変化させる。好適な酵素系での処理によって、アニールしたプライマーが伸長することができ、その際にメディエータープローブが切り離される。このようにして放出されたメディエーターを、特異的な検出分子を用いて検出することができる。酵素増幅プロセスは等温方法を含み得るが、これに限定されない。
特別な実施形態の例では、DNA、RNA並びにペプチド及び/又はタンパク質、又は上述の物質群の別の組合せを、本明細書に記載の方法i)〜iv)によって1つのバッチにおいて並行して検出する。この方法は等温増幅方法を含むが、これに限定されない。この実施形態を図9に示す。
検出のタイプに関わらず、反応容器は、例えば確立され、普及しているマイクロタイタープレートフォーマット(96ウェルプレート)を有し、これとともに市販の温度調節及び読出しデバイス及び/又はこれら2つの機能を組み合わせたデバイスを使用することができる。いずれの場合においても、検出分子を局所的に分解された形態(アレイ)で固定化する。フローセルも有力な反応容器とみなすことができ、分析を行った後に任意に洗浄及び再使用することができる。特別な実施形態では、反応容器はカートリッジであり、検出分子は固定化形態で存在し得る。反応空間は修飾した顕微鏡スライド及び好適なフレームを用いることによっても規定することができる。この実施形態は、好適な材料への検出分子の固定化が従来技術に記載されている、好適な粘着フレーム(Peqlab in situ粘着フレーム、PeqlabBiotechnologie,Erlangen,Germany)、並びに熱的に調節可能な処理容器(Peqlab PeqStar in situ、Peqlab Biotechnologie,Erlangen,Germany)及びリーダーデバイス(BioAnalyzer、LaVisionBioTec GmbH,Bielefeld,Germany)が市販されているという有利な特性を有する。カートリッジのフォーマットは規定されず、利用者の希望に従って任意に作製することができる。カートリッジは、読取り範囲にわたるTIRFを用いて表面近くのフルオロフォアの励起用の統合プリズムにより入力光線を導くことができる。さらに、このカートリッジは、温度調節デバイスと蛍光シグナルの励起及び検出用の光学部品とを有する機器と組み合わせて使用することができる。カートリッジは任意にマイクロ流体構造、例えば充填口及びベント口、能動素子の接続部、混合チャンバ、測定チャンバ及びアリコーティングチャンバ、チャネル若しくは構造、又は他の目的で使用することができる構造を有し得る。系はポンプ又は他のアクチュエータを有してもよく、それを用いて液体を処理することができる。加えて、他の試薬を使用してもよい。
本発明による好ましいメディエータープローブを用いてPCRを行う(図11も参照されたい)。増幅反応については、通常のオリゴヌクレオチドプライマー及びTaqポリメラーゼを使用する。本発明の意味において、メディエータープローブは二官能性オリゴヌクレオチドであり、PCRのリアルタイム検出を可能にする。本発明と従来技術とを比較するために、これらの実験を従来技術の加水分解プローブと並行して行う。
黄色ブドウ球菌(Genomic Research Laboratory;Prof. Jacques Schrenzel,Geneva,Switzerland)に由来するDNAサンプルをこの実験に使用した。サンプルは、表皮剥脱毒素Bのゲノム遺伝子座(Gene Bankアクセッション番号AP003088)を含有していた。pBR322プラスミドはヒトパピローマウイルス18(HPV18)ゲノムを含有し、GenolD(Budapes,Hungary)から入手可能であった。ペプチドグリカン結合リポタンパク質のゲノム遺伝子座(Gene Bankアクセッション番号65796)を含有する大腸菌(Escherichia coli)K12 DH5_Z1 DNAを、磁気ビーズに基づくDNA単離キットを用いて単離した。ヒトゲノムDNAを、QIAamp DNA Blood Miniキット(Qiagen)を用いて全血から単離した。二重鎖PCR反応については、市販のDNAを使用した(Roche Diagnostics)。DNAサンプルを0.2×Tris−EDTAバッファーで希釈し、10ng/μLのサケ精子DNA(Invitrogen)を添加して、反応容器へのDNA標的の非特異的な吸着を防止した。
以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
CCGCAG*A*A*GATGAGATC(dTFAM)GCGGTGTTGGTCGTAGAGCCCAGAACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
修飾:5’:DABCYL;3’:C6NH2
*=ホスホチオエート
CCGCAG*A*A*GATGAGATC(dT-Cy5)GCGGTGTTCACTGACCGAACTGGAGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
修飾:5’:BHQ-2;3’:C6NH2
フォワードプライマー:GGCAATTGCGGCATGTTCTTCC
リバースプライマー:TGTTGCATTTGCAGACGAGCCT
加水分解プローブ:ATGCGAACGGCGGCAACGGCAACATGT
修飾:5’:6-FAM;3’:BHQ-1
メディエータープローブ:AAATCGTTCTGGGCTCTACGCGAACGGCGGCAACGGCAACATGT
修飾:3’:PH
フォワードプライマー:AGATGCACGTACTGCTGAAATGAG
リバースプライマー:AATAAAGTACGGATCAACAGCTAAAC
加水分解プローブ:CCGCCTACTCCTGGACCAGG
修飾:5’:6-FAM;3’:BBQ
メディエータープローブ:AAATCGTTCTGGGCTCTACGGTATTCACAGTGGTAAAGGCGGACAACA
修飾:3’:PH
フォワードプライマー:GCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTG
リバースプライマー:GGTCAGGTAACTGCACCCTAA
加水分解プローブ:GGTTCCTGCAGGTGGTGGCA
修飾:5’:6-FAM;3’:BHQ-1
メディエータープローブ:AATCGTTCTGGGCTCTACGGTTCCTGCAGGTGGTGGCA
修飾:3’:PH
フォワードプライマー:TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA
リバースプライマー:CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG
加水分解プローブ01:ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT
修飾:5’:6-FAM;3’:DDQ-1
加水分解プローブ02:ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT
修飾:5’Cy5;3’:DDQ-2
メディエータープローブ01:AAATCGTTCTGGGCTCTACGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT
修飾:3’:PH
メディエータープローブ02:ATGCTCCAGTTCGGTCAGTGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT
修飾:3’:PH
好適なフルオロフォア色素及びクエンチャーラジカルの選択は、高い消光効率及び特に少量の核酸の検出に対する分析感度を可能にするのにとりわけ重要である。消光効率を決定するために、DNase I処理の有無による蛍光放射を各々の二重標識加水分解プローブ及び検出分子について決定した。消光効率(Eq)を以下の通りに決定する:
Eq=1−(I未消化/I消化)×100
(式中、I未消化は未消化サンプルの蛍光放射であり、I消化はDNaseIで処理したサンプルの蛍光放射である)。
メディエータープローブPCRの反応バッチは1×PCRバッファー(GenolD,Budapest,Hungary)、0.1U/μLのHot StarTaqプラスポリメラーゼ(Qiagen)、200μmol/Lのデオキシリボヌクレオチド(Qiagen)、300nmol/Lの検出分子(IBAによって合成)、300nmol/Lの標的特異的プライマー対及び200nmol/Lのメディエータープローブ(biomers.netによって合成)を含有する。加水分解プローブPCRの反応バッチは、加水分解プローブ(200nmol/L、biomers.netによって合成)に置き換えたメディエータープローブ以外は同量の試薬を含有する。さらに、検出分子を添加しなかった。次に、DNA鋳型分子を両方のバッチに添加した(陰性対照においては、同量のH2Oを代わりに添加した)。反応容量は10μLとした。
95℃で5分間の初期ポリメラーゼ活性化、
95℃で15秒間の変性による45サイクル、及び、
60℃で45秒間のアニーリング及び伸長の複合工程。
HPV18検出の検出限界(LOD)を以下の通りに決定した。
消光効率
分解における全ての蛍光分子の蛍光放射は未消化プローブと比較して増大した。特異的加水分解プローブの観察されたEq値は、54.5%(3.1%)(Cy5/2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノ−1,4−ベンゾキノン−2(DDQ−2))〜92.7%(0.5%)(FAM/ジ−tert−ブチル−ヒドロキノン−1(BHQ−1))であった。しかしながら、検出分子の消光効率は83.7%(1.4%)(Cy5/BHQ−2)〜90.9%(0.4%)(FAM/Dabcyl)であった。これらの結果は、最適条件下でのFAM/Dabcyl(80%〜91%)、FAM/BHQ−1(88%〜93%)及びCy5/BHQ−2(91%〜96%)の既知のEq値に相当する。
本実験においては、メディエータープローブPCRを加水分解プローブPCRと比較した。初めに、反応効率、LOD、アッセイ間変動、アッセイ内変動及び二重化特性を分析した。これらの実験については、種々の濃度のHPV18 DNA(他に記載のない限り、1反応当たり102コピー、103コピー、104コピー、105コピー及び106コピー)を、両方の技法を併用して増幅した。次に、種々の標的を2つの技法を併用して増幅した。
LODを、95%確率で陽性増幅をもたらすDNA濃度として決定した。プロビット分析によって、メディエータープローブPCRについては1反応当たり78.3コピー(1反応当たり95%CI:47.0コピー〜372.5コピー)、加水分解プローブPCRについては1反応当たり85.1コピー(95%CI:1反応当たり55.7コピー〜209.4コピー)の分析感度が明らかとなった(図12A)。
5つの濃度のHPV18 DNA希釈系列(1反応当たり102コピー、103コピー、104コピー、105コピー及び106コピー)を、8回の反復実験で増幅した。0.975(メディエータープローブPCR)及び0.983(加水分解プローブPCR)というR2値が優れた線形性を示した(図12B)。1反応当たり102コピー〜106コピーの増幅のCV率は、55.1%〜9.9%(メディエータープローブPCR)及び38.3%〜10.7%(加水分解プローブPCR)であった。精度は+21.6%〜−8.1%(メディエータープローブPCR)及び+19.4%〜−9.8%(加水分解プローブPCR)の範囲である。
別個に調製した5つのバッチを、5つの濃度のHPV18 DNA希釈系列(1反応当たり102コピー、103コピー、104コピー、105コピー及び106コピー)の増幅に使用した。各々の濃度で3回調製した。0.940(メディエータープローブPCR)及び0.954(加水分解プローブPCR)というR2値が増幅の線形性を示した(図12C)。1反応当たり102〜106のコピー数についてのアッセイ間分散は、25%〜8.7%(メディエータープローブPCR)及び34.7%〜12.7%(加水分解プローブPCR)であった。精度は+3.4%〜−7%(メディエータープローブPCR)及び−2%〜−12.4%(加水分解プローブPCR)の範囲である。
HPV18 DNA(102個、103個、104個、105個及び106個の元のコピー)を含有するプラスミドのフラグメントを、300コピーのホモ・サピエンスゲノムと共増幅した。それぞれの反応を三連のバッチで行った。HPV18に対する加水分解プローブをFAM/BHQ−1で標識し、βアクチン(ACTB)に対するプローブをCy5/DDQ−2で標識した。二重鎖PCRについては、検出分子01をFAM/Dabcylで標識し、検出分子02をCy5/BHQ−2で標識した。図12Dは、メディエータープローブPCR(R2=0.998)及び加水分解プローブPCR(R2=0.988)についての種々のDNA濃度に対するHPV18増幅の線形性を示す。ACTB値の算出は、二重鎖実験に1つの濃度しか使用しなかったため行うことができなかった。サイクル値(定量化サイクル;Cq)を、メディエータープローブPCR及び加水分解プローブPCRについての赤チャネルにおいて0.02の閾値で決定した。共増幅したACTB及びHPV18 DNAサンプルの平均Cq値は、メディエータープローブPCR及び加水分解プローブPCRについて33.0(0.5)及び31.8(0.4)であった。
メディエータープローブPCRの普遍的性質が、4つの臨床的に関連する標的を用いた試験によって示された。比較のために、加水分解プローブPCRを各々の標的について並行して行った。各々の標的及び各々の増幅技法について入力コピー数と算出された出力コピー数との間の線形性を決定した(図13)。HPV18 L1遺伝子(メディエータープローブPCR R2=0.999/加水分解プローブPCR R2=0.975)、黄色ブドウ球菌表皮剥脱毒素B遺伝子(0.991/0.988)、大腸菌ペプチドグリカン結合リポタンパク質(大腸菌pal)遺伝子(0.996/0.988)及びヒトβアクチン遺伝子(0.991/0.993)の希釈系列の検出結果は、2つのPCR方法間で高い相関を示す。
bコピー数の定量化は実現可能ではない。ACTBの閾値を0.02に設定し、得られたCq値を提示する。
本明細書に示される試験の優れた特徴は、標準的検出分子の使用を可能にする増幅と蛍光検出との分離である。メディエーター領域及び検出分子の配列をBLAST検索に従ってコンピューター内で設計したが、標的とのいかなる一致も示されない。検出分子はヘアピン二次構造を有するため、最適FRET消光条件(>90%(FAM/Dabcyl)、>80%(Cy5/BHQ−2))を示す。ヘアピン構造内でフルオロフォア及びクエンチャーが空間的に近接していることにより高い一定の消光効率が示される。本明細書に示される結果とは対照的に、従来技術のFAM標識加水分解プローブは、種々の消光ラジカル及びドナーとアクセプタとの距離に応じて60%〜93%の消光効率を規則的にもたらす。Cy5/DDQ−2標識加水分解プローブは、僅か55%という低いEq値を有する。
Claims (15)
- 少なくとも1つの標的分子を検出する方法であって、
プローブ領域とメディエーター領域とを含む少なくとも1つの標的分子の検出用のメディエータープローブであって、該メディエータープローブがオリゴヌクレオチドであり、前記プローブ領域が該オリゴヌクレオチドの3’末端にあり、前記メディエーター領域が該オリゴヌクレオチドの5’末端にあり、前記領域間に化学的、生物学的及び/又は物理的な切断部位が存在し、前記プローブ領域が鋳型分子に対して親和性を有し、前記メディエーター領域が検出分子に対して別の親和性を有し、該メディエータープローブが前記切断部位での前記鋳型分子の増幅プロセス中に切断され、切断された該メディエーター領域と前記検出分子との相互作用が検出可能なシグナルを誘発することを特徴とする、メディエータープローブ、及び
検出分子であって、前記検出分子がオリゴヌクレオチドであり、少なくとも、
a.蛍光アクセプタ及び蛍光ドナーのいずれか1を有する、前記検出分子の5’末端の第1の領域と、
b.前記メディエーター領域と相互作用する第2の領域と、
c.蛍光ドナー及び蛍光アクセプタの他方の1を有する第3の領域と、
を有することを特徴とする、検出分子
を含み、
I.前記メディエータープローブのプローブ領域を、鋳型分子及び/又は標的分子の配列に結合させる工程と、ここで該標的分子がDNA配列である場合には該標的分子が該鋳型分子であり、及び該標的分子がDNA配列ではない場合には該鋳型分子がオリゴヌクレオチドアプタマーであって、
II.前記鋳型分子及び/又は前記標的分子を、5’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより増幅する工程と、ここで該標的分子がDNA配列である場合には該標的分子が増幅され、及び該標的分子がDNA配列ではない場合には該ヌクレオチドアプタマーが増幅され、
III.工程IIの間に、前記メディエータープローブを、前記ポリメラーゼによって切断部位で切断する工程と、及び
IV.前記メディエータープローブの切断したメディエーター領域を検出分子に結合させる工程
を含む、方法。 - 前記メディエータープローブを切断することが、分子量、酵素活性、親和性若しくは結合力を含む結合特性、化学的反応性、化学基の存在、伝導性、分極率若しくは電荷を含む電気特性、及び/又は光の吸収及び放出を含む光学的特性を含む群から選択される、前記メディエータープローブの少なくとも1つの領域の物理的特性及び/又は化学的特性の変化を誘導することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記メディエーター領域が、前記検出分子の第2の領域に結合することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記検出分子の第2の領域に結合した前記メディエーター領域が、ポリメラーゼによって酵素的に伸長し、前記検出分子が結合した前記メディエーター領域の3’末端に結合することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型分子及び/又は前記標的分子の増幅が、PCR若しくはリアルタイムPCRによって達成されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出分子が、二次構造の変化、蛍光、リン光、質量、吸収、光の散乱、電気伝導性、酵素活性及び/又は親和性の変化を含む、前記メディエーター領域との直接的又は間接的な相互作用の結果として修飾されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出分子の物理的又は化学的に測定可能な変化が、前記メディエーター領域と前記検出分子の第2の領域との直接的又は間接的な相互作用によって起こることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 配列特異的又は配列非特異的な蛍光プローブ及び/又は発色プローブ又は蛍光色素が、前記メディエータープローブ及び/又は前記検出分子の少なくとも1つの領域と相互作用することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出分子が、切断、消化、鎖二重化、内部ハイブリダイゼーション、化学基の結合若しくは切断、又は蛍光、リン光若しくは発光の変化を含む、ポリメラーゼによる前記メディエーター領域との相互作用によって修飾されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出分子が、5’末端領域上及び/又はヘアピン構造内に少なくとも1つの蛍光修飾を有し、前記メディエーター領域との反応後に、前記蛍光修飾がポリメラーゼによって前記検出分子から切り離され、及び/又は前記検出分子の前記ヘアピン構造の5’末端が除去され、及び/又は前記ヘアピン構造がアンフォールドし、前記検出分子上で蛍光シグナルの変化が検出されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的分子がRNAであり、該RNAがcDNAへと転写され、該cDNAが前記鋳型分子であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 配列オーバーハングを有するプライマーを転写反応に使用し、前記メディエータープローブのプローブ領域がcDNAとオーバーハング配列とを含む領域に結合することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的分子がペプチド又はタンパク質であり、前記鋳型分子がアプタマーであり、該アプタマーが前記ペプチド又は前記タンパク質に結合し、結合部位に前記メディエータープローブのプローブ領域が接近可能であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 混合物中の1つ又は複数の同様の又は異なる生体分子の検出への請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 制限酵素の活性を使用し、検出分子が3’末端領域に、ポリメラーゼによるメディエーター領域との反応後に検出分子から切り離される化学保護基を有し、3’末端OH基が生成することを特徴とする、請求項14に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102011055247A DE102011055247A1 (de) | 2011-11-10 | 2011-11-10 | Multianalyt-Reportersystem |
DE102011055247.2 | 2011-11-10 | ||
PCT/EP2012/072402 WO2013079307A1 (de) | 2011-11-10 | 2012-11-12 | Bifunktionale oligonukleotidsonde zur universellen echtzeit multianalytdetektion |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014533107A JP2014533107A (ja) | 2014-12-11 |
JP6265905B2 true JP6265905B2 (ja) | 2018-01-24 |
Family
ID=47324049
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014540506A Active JP6265905B2 (ja) | 2011-11-10 | 2012-11-12 | 普遍的リアルタイム多分析物検出用の二官能性オリゴヌクレオチドプローブ |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11293053B2 (ja) |
EP (1) | EP2776585B8 (ja) |
JP (1) | JP6265905B2 (ja) |
CN (1) | CN103946397B (ja) |
CA (1) | CA2854427A1 (ja) |
DE (1) | DE102011055247A1 (ja) |
ES (1) | ES2698903T3 (ja) |
IN (1) | IN2014DN04645A (ja) |
WO (1) | WO2013079307A1 (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102012100824A1 (de) | 2012-02-01 | 2013-09-05 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Gemultiplexte Digital PCR |
CA2904545A1 (en) * | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Universite Laval | A nucleic acid detection method comprising target specific indexing probes (tsip) comprising a releasable segment to be detected via fluorescence when bound to a capture probe |
US20140272959A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of Hybridizing Probes to Genomic DNA |
EP3521452B1 (en) * | 2013-06-19 | 2021-08-04 | Luminex Corporation | Real-time multiplexed hydrolysis probe assay |
EP3034619B1 (de) * | 2014-12-16 | 2018-10-17 | microBIOMix GmbH | Modifizierte Oligonukleotide und Verfahren zum Einschleusen von Primern oder Kontrollmolekülen oder Sonden in geschlossene PCR-Systeme |
AU2016219943A1 (en) * | 2015-02-18 | 2017-10-12 | Singular Bio, Inc. | Assays for single molecule detection and use thereof |
KR101875662B1 (ko) * | 2015-12-01 | 2018-08-02 | 에스디 바이오센서 주식회사 | 등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법 |
CN107024583B (zh) * | 2016-01-29 | 2019-03-08 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 硫黄素t适配体、其筛选方法及应用 |
EP3559275A1 (de) * | 2016-12-23 | 2019-10-30 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Zweiteilige mediatorsonde |
CN108823287B (zh) | 2017-04-28 | 2019-04-12 | 厦门大学 | 一种检测靶核酸序列的方法 |
GB201713251D0 (en) * | 2017-08-18 | 2017-10-04 | Lgc Genomics Ltd | Methods and kits for detection of nucleic acid molecules |
CN111100935B (zh) * | 2018-10-26 | 2023-03-31 | 厦门大学 | 一种细菌耐药基因检测的方法 |
WO2022090521A1 (en) * | 2020-10-29 | 2022-05-05 | Biocartis Nv | Generic cartridge and method for multiplex nucleic acid detection |
CN116356075A (zh) * | 2021-12-27 | 2023-06-30 | 迈克生物股份有限公司 | 一种用于检测的引物探针、引物探针组及其应用 |
EP4265735A1 (de) | 2022-04-22 | 2023-10-25 | Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. | Pcr-multiplexing durch zielsequenz-unabhängige-reportermoleküle mit unterscheid-baren signalstäken |
WO2023203227A1 (de) | 2022-04-22 | 2023-10-26 | Hahn-Schickard-Gesellschaft Für Angewandte Forschung E. V. | Pcr-multiplexing durch zielsequenz-unabhängige-reportermoleküle mit unterscheidbaren signalstärken |
WO2023203230A1 (de) | 2022-04-22 | 2023-10-26 | Hahn-Schickard-Gesellschaft Für Angewandte Forschung E. V. | Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes |
EP4265734A1 (de) | 2022-04-22 | 2023-10-25 | Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. | Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes |
EP4372100A1 (en) | 2022-11-15 | 2024-05-22 | Stilla Technologies | Data analysis method for multiplex digital pcr using color-combination |
CN117144067A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于多重化核酸检测的组合物和方法 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4751177A (en) * | 1985-06-13 | 1988-06-14 | Amgen | Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays |
US5846708A (en) | 1991-11-19 | 1998-12-08 | Massachusetts Institiute Of Technology | Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection |
US6099803A (en) | 1994-07-07 | 2000-08-08 | Nanogen, Inc. | Advanced active electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics |
US5641658A (en) | 1994-08-03 | 1997-06-24 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support |
GB9615516D0 (en) * | 1996-07-24 | 1996-09-04 | Jsd Tech Ltd | Bacillus cereus |
US6238869B1 (en) | 1997-12-19 | 2001-05-29 | High Throughput Genomics, Inc. | High throughput assay system |
AU2849800A (en) | 1999-01-15 | 2000-08-01 | Ljl Biosystems, Inc. | Methods and apparatus for detecting polynucleotide hybridization |
US6300070B1 (en) | 1999-06-04 | 2001-10-09 | Mosaic Technologies, Inc. | Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids |
DE60040335D1 (de) * | 1999-07-14 | 2008-11-06 | Packard Bioscience Co | Derivatisierte nukleinsäuren und deren verwendung |
US6380377B1 (en) * | 2000-07-14 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
DE60131903T2 (de) * | 2000-10-24 | 2008-11-27 | The Board of Trustees of the Leland S. Stanford Junior University, Palo Alto | Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna |
CA2473865A1 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | Amersham Biosciences Ab | Compositions and methods for rolling circle amplification |
GB0230238D0 (en) * | 2002-12-28 | 2003-02-05 | Fu Guoliang | Combined exponential and linear amplification |
DE10316159A1 (de) | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Klapproth, Holger, Dr. | 5`-3`-Exonuklease Assay zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren |
JP5520449B2 (ja) | 2007-03-06 | 2014-06-11 | 株式会社ビー・エム・エル | 核酸の検出方法 |
BRPI0908748A2 (pt) * | 2008-03-15 | 2015-07-28 | Hologic Inc | Composições e métodos para análise de moléculas de ácido nucleico durante reações de amplificação |
MX340258B (es) | 2011-01-11 | 2016-07-01 | Seegene Inc | Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto. |
-
2011
- 2011-11-10 DE DE102011055247A patent/DE102011055247A1/de not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-11-12 WO PCT/EP2012/072402 patent/WO2013079307A1/de active Application Filing
- 2012-11-12 JP JP2014540506A patent/JP6265905B2/ja active Active
- 2012-11-12 IN IN4645DEN2014 patent/IN2014DN04645A/en unknown
- 2012-11-12 CN CN201280055550.2A patent/CN103946397B/zh active Active
- 2012-11-12 CA CA2854427A patent/CA2854427A1/en not_active Abandoned
- 2012-11-12 US US14/357,574 patent/US11293053B2/en active Active
- 2012-11-12 EP EP12798176.9A patent/EP2776585B8/de active Active
- 2012-11-12 ES ES12798176T patent/ES2698903T3/es active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2776585B1 (de) | 2018-08-22 |
EP2776585B8 (de) | 2019-04-10 |
ES2698903T3 (es) | 2019-02-06 |
US20140315747A1 (en) | 2014-10-23 |
DE102011055247A1 (de) | 2013-05-16 |
EP2776585A1 (de) | 2014-09-17 |
CN103946397B (zh) | 2021-03-16 |
CN103946397A (zh) | 2014-07-23 |
JP2014533107A (ja) | 2014-12-11 |
WO2013079307A1 (de) | 2013-06-06 |
US11293053B2 (en) | 2022-04-05 |
IN2014DN04645A (ja) | 2015-05-08 |
CA2854427A1 (en) | 2013-06-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6265905B2 (ja) | 普遍的リアルタイム多分析物検出用の二官能性オリゴヌクレオチドプローブ | |
JP6591521B2 (ja) | ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法 | |
JP5099920B2 (ja) | 核酸試験用対照 | |
US20230407376A1 (en) | Two-part mediator probe | |
Karami et al. | Conventional PCR assisted single-component assembly of spherical nucleic acids for simple colorimetric detection of SARS-CoV-2 | |
US20120107820A1 (en) | Multiplexed Quantitative PCR End Point Analysis of Nucleic Acid Targets | |
US20190338347A1 (en) | Nicking and extension amplification reaction (near) of streptococcus species | |
SK12212000A3 (sk) | Metóda na detekciu cieľovej nukleovej kyseliny pomocou PCR | |
US20140017689A1 (en) | Method for detecting nucleic acids | |
US20210403990A1 (en) | Digital amplification for protein detection | |
US20200172958A1 (en) | Multiplex probes | |
Rondelez et al. | Multiplex digital microRNA detection using cross-inhibitory DNA circuits | |
JP2011530296A (ja) | Pcrアッセイのための検出アルゴリズム | |
JP2009261406A (ja) | β2アドレナリン多型検出 | |
Jauset-Rubio et al. | Solid-phase primer elongation using biotinylated dNTPs for the detection of a single nucleotide polymorphism from a fingerprick blood sample | |
WO2021236850A1 (en) | Devices, assays and methods for detection of nucleic acids | |
Yang et al. | An amplification-free detection method of nucleic acids by a molecular beacon probe based on endonuclease activity | |
JP5681217B2 (ja) | 分枝状dna複合体の形成促進を通じた核酸検出方法 | |
US20210381031A1 (en) | Pre-amplification assay | |
US9175332B2 (en) | Generic PCR | |
Zeng et al. | Strand displacement amplification for multiplex detection of nucleic acids | |
US20170283888A1 (en) | Use of rnase h for the selective amplification of viral dna | |
Fenati et al. | Single nucleotide polymorphism discrimination with and without an ethidium bromide intercalator | |
Santiago-McRae et al. | Rapid Nucleic Acid Reaction Circuits for Point-of-care Diagnosis of Diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151110 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160913 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161212 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170517 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170814 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171121 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6265905 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |