JP2020503030A - ２パートメディエータプローブ - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも１つの標的分子を検出するためのメディエータプローブに関する。本発明によるメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドは、プローブ領域およびメディエータ結合領域を含み、この場合プローブ領域は標的分子および／または鋳型分子に対して親和性を有し、メディエータ結合領域は、少なくとも１つのメディエータに対し親和性を有する。メディエータプローブの少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドは、メディエータ結合領域を介してメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに結合し、少なくとも１つの検出分子に対して親和性を有するメディエータである。メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドが検出分子と相互作用することによって放出された後に、メディエータは検出可能なシグナルを誘発する。本発明はさらに、本発明による少なくとも１つのメディエータプローブおよび少なくとも１つの検出モジュールを含むシステム、および少なくとも１つの標的分子を検出するための方法に関する。

Description

前書き
本発明は、少なくとも１つの標的分子を検出するための少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むメディエータプローブに関する。本発明によるメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドは、プローブ領域およびメディエータ結合領域を含み、この場合プローブ領域は標的分子および／または鋳型分子に対して親和性を有し、メディエータ結合領域は、少なくとも１つのメディエータに対して親和性を有する。メディエータプローブの少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドはメディエータであり、これはメディエータ結合領域を介してメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに結合され、少なくとも１つの検出分子に対する親和性を有し、これにおいてメディエータは、メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドからの放出後、検出分子と相互作用することにより検出可能なシグナルを誘発する。さらに、本発明は、本発明による少なくとも１つのメディエータプローブ、および少なくとも１つの検出分子を含むシステム、ならびに少なくとも１つの標的分子の検出方法に関する。

ＤＮＡの増幅は、とりわけ、疾患の調査のための臨床診断において使用されている。ＤＮＡの増幅は、最初は少量のＤＮＡが見えるようにすることができるように、所望の標的配列の多数のコピーを作製することを含む。

ＤＮＡの増幅は種々の方法で実施できる。約６０℃〜９５℃の間の熱サイクルを必要とするＰＣＲに加えて、ＬＡＭＰ（６２℃）またはＲＰＡ（３９℃）のような等温増幅法もまた使用されている。ＤＮＡの増幅をリアルタイムで追跡するため、また増幅産物を検出するために、様々なアプローチが利用可能である。とりわけ、生物発光、化学発光、濁度測定および蛍光に基づく検出方法により、検査されるべきＤＮＡの検出および定量化が可能になる。上記方法のほとんどは、試料の中の増幅されたＤＮＡの総量を検出することしかできず、異なる標的配列を区別することはできない。したがって、これらの方法は、いわゆるシングルプレックス検証にのみ適している。蛍光ベースの、ならびにルミネセンス、電気化学的および他の検出方法は、さらなる応用の可能性を切り開く。ＤＮＡ鎖と非特異的に相互作用する挿入検出分子に加えて、修飾オリゴヌクレオチドが使用される。後者は標的配列特異的分析に使用することができるが、インターカレートする検出分子が頻繁に非特異的副生成物の偽陽性検出をもたらす。

臨床分析およびインビトロでの診断において、例えば異なる細菌またはウイルスが様々な疾患の原因となり得るので、反応内のいくつかの標的分子を並行して検出できることは意味を成す。したがって、多検体検証は非常に重要であり、そのいくつかの例を以下に列挙する。例えば、ＡＢ０の遺伝子型の判定は、血液型の判定に関連するだけでなく、ヒト好中球抗原プロファイル（ＨＮＡ）の作成にも関連する。これは、輸血および組織輸血に対して判定すべきものである。ＨＩＶ変異体およびＢ型またはＣ型肝炎ウイルスについての献血者の試料の並行試験はまた、イムノアッセイまたは核酸に基づく技術を用いて日常的に行われている。病原体の特異的な検出は、短い分析時間後に得られる診断を可能にするために、いくつかのゲノム遺伝子座を判定することを必要とする。

異なるマーカーおよび対照遺伝子の活性判定により、発現プロファイルの作成が可能になる。これは、例えば、細胞分裂および細胞の分化に影響を及ぼし、したがって癌と密接に関連している癌遺伝子を同定するため、または患者の遺伝子型に応じて特定の薬物の有効性について予測する（オーダーメード医療）ために使用され得る。嚢胞性線維症（嚢胞性線維症）、フェニルケトン尿症（代謝性疾患）およびサラセミア（赤血球の分解）を含む、分子生物学的（出生前）診断においても、頻繁に現れる遺伝性疾患を検出することができる。さらに、プロカルシトニンまたはサイトカインなどの炎症マーカーの共同検出により、感染の重症度について結論を導き出すことができる。

上記の例のように、診断上の問題がいくつかの標的分子、遺伝子座または他のマーカーの分析、ならびに内的制御または参照を必要とする場合、分析ごとに単一のパラメータの判定しか可能にしない方法は通常あまり重要ではない。他方、いくつかのパラメータを記録するために異なる個々の分析が並行して行われる場合、これは不経済である。試料溶液を、異なる標的分子が検出されるいくつかの反応バッチに分割しなければならない。生じる問題は以下の通りである：試料溶液をｎ個のアリコートに分割することにより、個々の反応における物質の量が１／ｎの係数で減少し、それにより検出反応の感度がそれに応じて減少する。

これらの不利益を回避するために、異なる標的分子が並行して検出されるいくつかのパラメータを掴むための均一または不均一な反応アプローチが開発されている。検出のために標識された様々なオリゴヌクレオチドが使用され、それらは検出される標的分子に特異的に結合する。上記の標識オリゴヌクレオチドと標的分子との間の直接的な依存関係において、新たな実験的問題が生じる場合、例えば異なる遺伝子型のウイルスを検出することになる場合に、新たなプローブの使用が必要であるという問題が生じる。これは、それぞれの新しい実験的問題に対する検出のために新しい標識オリゴヌクレオチドを開発することを必要とする。これは検出に必要なオリゴヌクレオチドの修飾のために、時間がかかり高価である。

均一反応アプローチにおける異なる標的配列の並行検出の代替として、オリゴヌクレオチドを固相で検出（不均一検出）するために固定化することができる。固定相でのシグナル伝達位置に応じて、特定の標的配列の存在が推測され得る。標識されたオリゴヌクレオチドと標的分子との間の直接的な依存性は、やはり、固定化されたオリゴヌクレオチドを実験的問題に適合させなければならないという問題を引き起こす。それぞれの新しい実験的問題について、新しいオリゴヌクレオチドを固相に固定化しなければならない。これは複雑な製造工程のために非常に時間を要する。

検出用または固相の異なる位置の標識に関する標的配列特異的オリゴヌクレオチドの不利益な使用は、配列特異的でありながら費用効率が高いユニバーサルな検出方法が必要となる。ユニバーサルな方法では、シグナル発生オリゴヌクレオチド（検出分子）の配列は、検出される標的配列とは無関係である。同じ最適化シグナル発生オリゴヌクレオチドを異なる標的配列に使用することができる。結果として、シグナル発生オリゴヌクレオチドを各検出反応について再調整する必要がないので、作業時間、ひいては人件費を省くことができる。

配列特異的でユニバーサルな検出方法は既に知られているが、それらはいくつかの欠点を有する。特に、特定の増幅方法にしか適合しない酵素が使用される。特定の増幅方法は、ほとんどが非等温増幅方法である。これらには、例えば、２０１２年のＦａｌｔｉｎらによる多検体レポーターシステム、および２００８年のＹａｎｇらによるユニバーサルデュプレックスプローブの使用が含まれる。言及した方法では、ヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えばポリメラーゼが絶対的に必要であるが、ＬＡＭＰまたはＲＰＡで使用されるポリメラーゼはこのヌクレアーゼ活性を持たない。いわゆるビーチ置換ポリメラーゼは、配列特異的なユニバーサルな検出にはほとんど使用されていない。さらに、２００８年のＹａｎｇらによる手順は偽陽性シグナルを生成する危険がある。

国際公開第２０１３０７９３０７（Ａ１）号パンフレットは、メディエータプローブとユニバーサルレポーター分子とを備えるシステムを用いて少なくとも１つの標的分子を検出するためのユニバーサルに適用可能な方法を記載している。切断によるメディエータ放出はヌクレアーゼ活性を伴う酵素を必要とする。ＰＣＲにおいて、ポリメラーゼはほとんどの形態でこのヌクレアーゼ活性を有し、それがこの増幅方法にさらなる酵素が必要とされない理由である。しかし、ＬＡＭＰまたはＲＰＡのような等温増幅方法において、あるいはＰＣＤＲにおいて、使用されるポリメラーゼはこのヌクレアーゼ活性を持たない。結果として、切断によるメディエータの放出は、ヌクレアーゼ活性を示す酵素の添加によってのみ可能である。この不利な点は、追加の酵素が反応混合物の他の成分と相互作用し、それ故検出反応の効率に影響を及ぼし得ることである。さらに、追加の酵素の必要性は、検出反応のための反応混合物のコストを増大させる。さらに、追加の酵素を使用することは、変化した条件下で検出反応を最適化するためのさらなる作業の負荷をもたらす。

米国特許出願公開第２０１６／０３１２２７１（Ａ１）号明細書は、切断可能なプローブとユニバーサルな検出分子とを備えるシステムを用いて少なくとも１つの標的分子を検出するためのユニバーサルに適用可能な方法を記載している。米国特許出願公開第２０１６／０３１２２７１（Ａ１）号明細書による手順では、検出反応は、オリゴヌクレオチドの切断によって、国際公開第２０１３０７９３０７（Ａ１）号パンフレットと同様に引き起こされる。したがって、ヌクレアーゼ活性を伴う酵素が必要であるという同じ不都合が生じる。

ヘアピン形成配列、共有結合したフルオロフォアまたは結合した蛍光標識プローブを含む、プライマーを使用する最先端技術の手順も記載されている。さらに、第２の蛍光標識プローブが使用され、これはアンプリコンに結合し、第１のフルオロフォアと相互作用し得る。標的配列特異的ヘアピン形成配列および第２の標的配列特異的プローブは、フルオロフォアがユニバーサルな配列セクションに結合していないという不都合をもたらし、したがってこの方法はユニバーサルに使用することができない。それ故、シグナル発生は新しい検出反応のために別々に最適化させなければならない。加えて、鎖置換ポリメラーゼが使用される場合、プライマーに結合した第１のプローブが伸長され、したがって第２のプローブが置換され得るので、追加の第２のプローブはリスクをもたらす。

この時点で、２０１２年のＴａｎｎｅｒらによるＬＡＭＰ中の鎖置換ポリメラーゼを用いた増幅産物の配列特異的検出に言及する必要がある。この検出方法では、蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタは、標的配列特異的オリゴヌクレオチドに結合しており、そのため、この方法はユニバーサルではなく、したがって新しい検出反応ごとに検出を最適化しなければならないという欠点がある。

さらに、プライマー配列を含み、したがって標的配列特異的領域を有する、分子ビーコンに基づく検出方法が記載された。シグナル発生標識は標的配列特異的オリゴヌクレオチド上に位置するため、別の不利益が標的配列に依拠して生じる。これが、この検出方法がユニバーサルに適用可能ではない理由である。さらに、分子ビーコンの蛍光収率ならびに閉鎖型および開放型の立体配座のバランスは、プライマー配列に依存する。したがって、検出反応は、新しい検出反応ごとに別々に最適化させなければならない。

鎖置換ポリメラーゼを使用する文献に記載されているユニバーサルな技術もいくつかの欠点を有する。例えば、２００６年のＬｉらまたは中国特許出願公開第１０１３２８４９８（Ａ）号明細書に従ってプライマーにハイブリダイズした分子ビーコンを使用すると、分子ビーコンのヘアピン構造の安定性のために標的分子の非存在下で偽陽性シグナルが生成される危険性がある。（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００７）。さらに、この検出方法はこれまでＰＣＲによる増幅反応にしか使用されていない。等温増幅法の機能は証明されておらず、低温（ＬＡＭＰ、ＲＰＡ）で遥かに顕著であるヘアピン構造の安定性は、等温増幅と組み合わせてこの方法を使用することに異議を唱えるものである。１９９９年のＧ．Ｊ．Ｎｕｏｖｏらによるユニバーサル蛍光標識プライマーの使用は、ユニバーサルプライマーのハイブリダイゼーションがまた非特異的増幅産物において偽陽性シグナル発生をもたらし得るという危険性を、同様にして含む。

どの最先端の方法でも、試料の結合したＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質複合プロファイルを作成できる、タンパク質や核酸などの様々な分子や分子クラスを、１つの工程で並行して検出することはできない。

異なる物質のクラスから得るいくつかの異なる標的分子の分析を必要とする診断上の問題については、タンパク質や核酸などの異なる物質のクラスを平行して検出することができる検出方法が有利である。文献に記載されている、いくつかの分子クラスの同時の検出を可能にする検出方法は、ユニバーサルに適用可能な方法ではないか（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）、検出反応をいくつかの段階で行わなければならないというさらなる不都合を有する（Ｌｉｎａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．２０１６）。これは、実装中に多大な労力と時間を必要とする。

これは、同時にいくつかの分析物を検出することができ、最先端の方法の欠点を回避することができる、配列特異的なユニバーサルな検出方法に対する必要性をもたらす。さらに、後者が等温であるか非等温であるかにかかわらず、異なる増幅方法に使用することができる検出方法が必要とされる。

したがって、本発明は、メディエータプローブならびに少なくとも１つの標的分子を検出するためのシステムおよび方法を提供するという課題に基づいており、上記の最先端技術の不利点を示さない。したがって、その課題は、異なる分子クラスのいくつかの検体の同時、ユニバーサルおよび／または配列特異的検出を本質的に可能にするメディエータプローブおよび方法を提供することであった。

その課題は独立請求項によって解決される。実行する有利な形態は従属請求項から得られる。

本発明によれば、本技術的課題は、少なくとも１つの標的分子を検出するための２つの部分のメディエータプローブを提供することによって解決される。

少なくとも１つの標的分子を検出するための本発明のメディエータプローブは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドがプローブ領域およびメディエータ結合領域を含み、
ｉ．プローブ領域が標的分子および／または鋳型分子に対して親和性を有し、
ｉｉ．メディエータ結合領域が少なくとも１つのメディエータに対して親和性を有し、
ｂ）少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドは、
ｉ．メディエータ結合領域を介してメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに結合し、
ｉｉ．少なくとも１つの検出分子に対する親和性を有し、この場合メディエータは、検出分子との相互作用によってメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドから放出された後に、検出可能なシグナルを引き起こすメディエータである
ことを特徴とする。

したがって、本発明によるメディエータプローブは、メディエータ結合領域およびプローブ領域を含む第１の分子またはオリゴヌクレオチド、および第２の分子またはオリゴヌクレオチド、メディエータを含む。第１の分子のプローブ領域は標的および／または鋳型分子に対して親和性を有し、メディエータ結合領域は、１つまたは複数のメディエータに対して親和性を有する。プローブ領域が標的分子と直接相互作用できない場合は、鋳型分子が使用される。その結果、鋳型分子は、標的分子とプローブ領域との間のメディエータとして機能する。

プローブ領域を標的分子および／または鋳型分子に結合させた後、メディエータは分子、好ましくはＤＮＡ鎖分離効果を有する酵素、および特定のバージョンではさらなる重合効果、好ましくはビーチ置換ポリメラーゼによりメディエータ結合領域から置換される。メディエータと検出分子との相互作用は検出可能なシグナルを引き起こす。鎖置換ポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、増幅中に増幅した鎖に相補的な鎖を置換する。

メディエータプローブのユニバーサルな適用性を慎重に利用することによって、それを異なる標的分子の検出に使用することが可能であったことはまさに驚くべきことであった。驚くべきことに、本発明によるいくつかのメディエータプローブを用いて、１つの試料にていくつかの標的分子を同時に検出することが可能である。

本発明によるメディエータプローブは、標的分子および／または鋳型分子の任意の核酸配列のユニバーサルな配列依存的検出を可能にする。メディエータプローブの標的配列またはプローブ領域とは無関係に、固定の設計を有する検出分子を使用することができる。

驚くべきことに、メディエータの放出およびそれに続く検出分子との相互作用によるシグナル発生は、異なる増幅方法に適用することができ、特定のシステムに限定されないことが可能である。異なる増幅方法においてそれぞれの条件を慎重に利用することによって、上記のメディエータ放出はそれぞれのシステムに容易に適合させることができる。

標識オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーに基づく標的核酸配列の検出のための様々な最先端のシステムがある。しかし、本発明によるシステムおよび本発明によるメディエータプローブに基づく、本明細書に記載の本発明による方法とは対照的に、これらの方法は、標的配列とは無関係な、異なる標的特異的分子を用いて実施することができるユニバーサルな検出方法ではない。

フルオロフォアおよびクエンチャーなどのシグナル発生修飾は、標的配列特異的オリゴヌクレオチド（プライマー）に頻繁に適用される。これらの場合、シグナル発生分子は、それが個々の標的分子に対して個々に設計され最適化されなければならないので、異なる検出反応に使用することができない。したがって、最先端の技術に対する本発明の大きな利点は、本発明によるメディエータプローブに関連して要求されるシグナル発生ユニバーサル検出分子のユニバーサルの適用性である。これらのユニバーサルなレポーター分子は、シグナル発生分子を含むが、標的配列特異的セグメントは含まない。ユニバーサルなレポーター分子は、レポーター分子を再設計または最適化する必要なしに、異なる標的分子を検出するために使用され得る。２つの部分のメディエータプローブのみを適合させる必要がある。本発明によるメディエータプローブはまた、単純化されたプライマーの設計を特徴とする。最先端のシステムとは対照的に、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、蛍光分子またはリンカー分子が可能な分子を含有する必要はなく、またそれらは第２の標的配列特異的領域を含有する必要もない。

増幅過程の間、フルオロフォア・クエンチャー標識の残りのプライマーは、鎖分散ポリメラーゼによって標的分子から置換され、したがってシグナルをその元の状態に回復させ、持続的なシグナルの変化を保証しない。さらに、多くの最先端の検出方法は、ポリメラーゼなどのヌクレアーゼ活性を有する酵素を必要とするが、ＬＡＭＰまたはＲＰＡの場合、本発明で使用されるポリメラーゼはこのヌクレアーゼ活性を持たない。本発明によれば、ヌクレアーゼ活性は必要ではないことが好ましく、これが等温増幅法が同様に使用される理由である。しかし、多くの最先端の検出方法は、ＬＡＭＰのような等温増幅方法と共に使用することができない。

最新技術の手順とは対照的に、本発明による手順は、メディエータプローブを分割しないことが好ましい。記載されたシステムとは対照的に、メディエータプローブは二部式であり、その結果、メディエータの放出は、置換によって共有結合を分割することなく行われ得る。これは、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが使用されない等温増幅反応において標的分子のリアルタイムでの検出を有利にも可能にする。さらに、メディエータプローブごとに複数のメディエータを使用することによって、検出信号を増幅することができ、プローブの異なるメディエータが異なる検出信号を生成することができる。本発明によれば、たとえいくつかのメディエータがメディエータプローブにつき使用されるとしても、標的分子への唯一の特異的結合部位が必要である。しかし、既知の最先端のシステムまたは手順では、いくつかのメディエータを放出しようとする場合には、いくつかの完全なメディエータプローブシステムを使用しなければならない。

標的分子特異的配列を有するプライマーを含み、フルオロフォア標識プローブとハイブリダイズすることができる最先端のシステムが知られている。しかし、これらの方法とは対照的に、本発明による２部分のメディエータプローブのメディエータは、好ましくはシグナル発生のためのいかなるマーキングも担持しない。フルオロフォアが別のプローブを介するハイブリダイゼーションによってプライマーに結合される場合、フルオロフォアは依然としてプライマーの標的配列に特異的な部分によって影響され得る。グアニン塩基がプライマー配列に存在する場合、フルオロフォアの蛍光収率はグアニン塩基によって悪影響を受ける可能性がある。したがって、プライマー配列の標的配列特異的部分による、別々のプローブに対するフルオロフォアの蛍光収率の影響／依存性が生じる。さらに、ほとんどの場合、ユニバーサルな配列を有する検出分子は使用されない。

最先端のプライマーはまた、共有結合またはハイブリダイズしたプローブによって結合されたヘアピン形成配列およびコリドロフォアと共に記載されている。ヘアピン形成配列は、第２の標的配列特異的領域を含む。しかし、好ましくは、本発明によるメディエータプローブの第１の部分は、ただ１つの標的配列特異的領域または配列を含む。さらに、本発明によるメディエータプローブは、ヘアピン形成配列、および１つのみの標的配列特異的領域を含まないことが好ましい。加えて、既知のシステムはプライマーおよび頻繁に２つの追加の標識プローブを必要とし、それによって少なくとも１つのプローブは標的配列特異的である。したがって、そのようなプライマー／プローブシステムは、標的分子特異的配列を有する２つまたは３つの分子からなる。対照的に、本発明のメディエータプローブは、標的分子特異的配列を有する１分子のみを有することが好ましい。さらに、特定のバージョンのメディエータプローブにはマーキングを含んでいない。メディエータはまた、好ましくは標的分子特異的配列を含まない。

本発明は、既知の最先端の技術を考慮して、完全に新しく、また驚くべき開発である。最先端の技術は、酵素の鎖分散活性を用いて機能する類似の検出システムを明らかにしていない。むしろ、鎖置換活性を有さないポリメラーゼを用いてＰＣＲ条件下で実施することができる検出方法を記載している。

鎖分散効果を有する酵素によるメディエータの能動的な置換を利用するために、本発明に従ってメディエータプローブ、システムおよび手順が開発されたことはまさに驚くべきことである。多くの最先端のプロセスは、絶対に必要な、使用されるポリメラーゼのヌクレアーゼ活性に基づいている。核分裂反応と置換反応の間に明確な関係はない。さらに、多数の反応条件を異なる方法で修正または再結合しなければならないので、それらが置換酵素と共に機能するようにポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を使用する既知の方法を適応させることは、専門家にとって、明白で些細なことではない。

ユニバーサルな検出原理を適用せずに、ハイブリダイズした標的配列特異的プライマーおよび標的配列特異的プローブを使用する既知の方法と既知のユニバーサルな検出方法を組み合わせることも、専門家にとって明白ではない。

本明細書に記載の本発明によるメディエータプローブの利点は、特に、メディエータプローブの実行の好ましいバージョン、本発明によるシステム、および本発明による手順に適用される。

本発明の文脈における標的分子の検出は、調査される試料の標的分子の存在が定量的または定性的に検出されることを意味する。本発明によれば、標的分子は、その存在が試料の中で検出されるべき分子である。それは、限定されるものではないが、核酸分子、タンパク質、ペプチド、糖分子、脂質、またはこれらの分子の組み合わせ、例えばグリコシル化タンパク質もしくは他のグリコシル化生体分子などの生体分子である。

本発明での核酸という用語の意味は、非限定的に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはＬＮＡなどの修飾ＲＮＡを含む。本発明における意味では、オリゴヌクレオチドは、約２００個までのヌクレオチドを含む比較的短い長さの核酸分子である。

オリゴヌクレオチドは、蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタおよびブロック基などの他の分子または化学基に共有結合していても、非共有結合であってもよい。

本発明での糖分子の意味には、特に炭水化物または糖類があり、単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類を含む。グリコシル化は、炭水化物がタンパク質、脂質または他のアグリコンに結合する一連の酵素的または化学的な反応を表す。得られた反応生成物は、糖タンパク質としてのタンパク質の場合にはグリコシドと呼ばれ、糖脂質としての脂質の場合にはペプチドグリカンと呼ばれる。

本発明の意味において、「脂質」という用語は、その低い極性のために、疎水性（または親油性）溶媒に非常によく溶解する、完全にまたは少なくとも大部分は水不溶性（疎水性）物質を指す。脂質は細胞膜の構造成分であり、エネルギー貯蔵またはシグナル分子として生体内でも使用されている。ほとんどの生物学的脂質は両親媒性であり、すなわちそれらは親油性炭化水素残基および極性親水性頭部基を有しており、そのためそれらは水などの極性溶媒でミセルまたは膜を形成する。脂質の群には、特に脂肪酸、トリアシルグリセリド（脂肪および脂肪油）、ワックス、リン脂質、スフィンゴ脂質、リポ多糖およびイソプレノイド（ステロイド、カロチノイドなど）が含まれる。

プローブ領域は、標的分子および／または鋳型分子の一部と相補的であることが好ましい。メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドのプローブ領域は、標的分子および／または鋳型分子に結合する。結合は、これが標的分子および／または鋳型分子に対して親和性を有するので、メディエータプローブのプローブ領域を介して起こる。メディエータ結合領域は鋳型分子に対していかなる親和性をも有する必要はなく、相補的配列セグメントを有する必要もない。

メディエータは、好ましくは、検出分子の一部分に対して相補的な領域を有する。メディエータは検出分子に結合し、検出可能なシグナルを誘発する。検出可能なシグナルにより、標的分子または鋳型分子の存在について結論を導き出すことが可能になる。鋳型分子自体が検出される標的分子であり得るか、それは、標的分子の存在についての情報が鋳型分子を介して生成され得るように、標的分子と会合し得る。

本発明による検出分子は、標的分子が間接的に相互作用することができ、処理（例えば、蛍光シグナル、電気化学的シグナルまたは質量の変化）によって検出反応を引き起こし得るオリゴヌクレオチドである。

鋳型分子は、本発明の検出方法に使用される試薬、例えば、プライマーまたはプローブまたは本発明のメディエータプローブが、標的分子と直接相互作用することはできない場合に使用できる核酸分子である。したがって、鋳型分子は、標的分子とプライマーまたはプローブとの間のメディエータとして使用することができる。アプタマーは通常鋳型分子として使用される。

アプタマーは、それらの構造的特性のために、他の分子または分子複合体と相互作用するか結合するオリゴヌクレオチドである。アプタマーによって結合された分子は、タンパク質、ペプチド、糖分子、脂質分子、核酸分子、またはこれらの分子から形成された分子複合体であり得る。アプタマーは、結合および非結合状態において異なる立体配座をとることができ、その結果、例えば、立体配座に応じて、アプタマーの異なる配列領域は、プライマーまたはプローブなどの相補的オリゴヌクレオチドとの相互作用に利用可能である。

本発明における相互作用の意味は、異なる相互作用分子の互いの作用を示す。これは、例えば、２つの分子間の共有結合もしくは非共有結合、または例えば分子複合体内の１つ以上の他の分子によって媒介される間接的な結合であり得る。

本発明の文脈において、検出可能なシグナルは、物理的または化学的に測定することができるあらゆる種類の変化を指す。これらの変化としては、限定されないが、切断、消化、鎖重複、内部ハイブリダイゼーション、リン酸化、脱リン酸化、アミド化、化学基の結合または切断、蛍光、リン光または発光の変化が挙げられる。

本発明によるメディエータプローブの好ましい設計において、メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドおよび／またはメディエータは、シグナル発生のためのマーカーを含まない。そのような非標識メディエータプローブの決定的な利点は、新しいアッセイを最適化するための労力と費用を必要とせずに少なくとも１つの標的分子を検出するため、本発明による方法において使用できることである。最先端の技術とは対照的に、メディエータプローブはオリゴヌクレオチドからなり、それは蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタおよびブロック基のような技術的に複雑な修飾なしに費用効果的に合成することができる。

標識という用語は、検出可能な（好ましくは定量化可能な）シグナルを提供するために使用することができ、核酸またはタンパク質または他の生体分子に共有結合または非共有結合させることができる任意の原子または分子を優先的に指す。標識は、酸化還元反応、発光、蛍光、放射能、比色分析、重量分析、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性などによって検出することができるシグナルを提供することができる。

好ましいバージョンでは、メディエータプローブおよび／またはメディエータの第１のオリゴヌクレオチドが、シグナル発生のための１つ以上のマーカー、好ましくは蛍光分子、レドックス分子、発光分子または他のシグナル発生ユニットを含む。

本発明の別の好ましいバージョンにおいて、メディエータは、シグナル発生のための１つ以上のマーカー、好ましくは蛍光分子、レドックス分子、発光分子または他のシグナル発生分子または他のシグナル発生ユニットを含む。本発明によれば、メディエータプローブからの置換後のメディエータは、シグナル発生のための少なくとも１つの標識をも含む検出分子に結合することができ、その結果、検出可能な信号の変化が生じる。

例えば、メディエータプローブに結合したメディエータは、特定の波長λ_１で発光する蛍光ドナー／アクセプタで標識することができる。メディエータプローブの置換後、メディエータは、λ_１とは異なる第２の波長λ_２で発光される蛍光アクセプタ／ドナーで標識された検出分子に結合することができる。ＦＲＥＴ機構を介した蛍光ドナーから蛍光アクセプタへのエネルギーの移動は、蛍光アクセプタの放射強度の検出可能な増加をもたらし、それによりλ_２の発光を検出することが可能になる。あるいは、化学発光または生物発光ドナー分子を使用することができる。非発光性である蛍光アクセプタも好ましい設計において使用することができる。異なる数のヌクレオチドを有する検出分子を使用することによって、融解曲線分析によって１つの試料で異なる標的分子を同時に識別することができる。

メディエータがユニバーサルな標的配列非依存性分子であるので、メディエータをマーキングすることによって、記載された検出方法のユニバーサルな特徴は失われない。さらなる設計では、標的分子あたりいくつかのプローブまたはプライマーを使用して標識メディエータを結合させることができ、それによってメディエータおよび標識の配列は異なり得る。例えば、異なる発光波長を有する蛍光染料を使用することができる。

本発明によるメディエータプローブの好ましいバージョンは、メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドからのメディエータの放出が、メディエータプローブが結合している標的分子および／または鋳型分子の増幅中に起こることを特徴とする。

増幅または増幅反応という用語の本発明における意味は、生体分子、好ましくは核酸分子の増幅を指す。核酸は、ポリメラーゼとして知られる酵素を用いて増幅される。増幅において、最初の配列はアンプリコンと呼ばれ、産物は増幅産物と呼ばれる。

本発明によるメディエータプローブの好ましいバージョンにおいて、第１のオリゴヌクレオチドは１〜２００、好ましくは２０〜８０、特に好ましくは３５〜６５ヌクレオチド、およびメディエータ１〜６０、好ましくは１０〜５０、特に好ましくは１５〜４０ヌクレオチドを有する。

本発明によるメディエータプローブの好ましいバージョンによれば、標的分子および／または鋳型分子は、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、アプタマーおよび／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される生体分子である。

本発明の好ましい態様において、標的分子は鋳型分子である。他の好ましいバージョンにおいて、標的分子は鋳型分子と相互作用する。

本発明によるメディエータプローブの好ましいバージョンでは、メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が増幅反応の開始点として働き、したがってプライマーとして作用することができる。これは公知の最先端の解決法を凌ぐ決定的な利点である。なぜなら、新しい標的分子用のメディエータプローブを完全に再設計する必要はなく、また選択された標的分子のプローブ領域を完全に再設計する必要がないが、既存のプライマーが本発明によるメディエータプローブとして機能できるように容易に修飾することができるからである。

本発明によるメディエータプローブの別の好ましいバージョンでは、メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が増幅反応の開始点として機能することができない。標的分子の非存在下では、対応するメディエータプローブは、それが閉じた形になるようにヘアピン構造を形成することができ、メディエータはメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに結合する。標的分子の存在下では、メディエータプローブは、標的分子または鋳型分子に結合し、それによってプライマーは今開いているメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに結合することができる。適切な酵素系で処理することによって、付着したプライマーを伸長させることができ、それによってメディエータプローブがメディエータを置換する。放出されたメディエータは、特定の検出分子に補助されて検出することができる。好ましい実行例を例１８に示す。

好ましい設計において、本発明によるメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドは、アプタマー領域、メディエータ結合領域およびプライマー結合領域を含み得る。検出される標的分子は、例えばタンパク質またはペプチドであり得るが、それに限定されない。標的分子が存在しない場合、プライマーはメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドのプライマー結合領域に結合することができ、適切な酵素系を用いてプライマーの３’末端を伸長することによって、メディエータはメディエータプローブから放出される。放出されたメディエータは、特異的検出分子または方法を用いて検出可能なシグナルを誘発することができる。標的分子の存在下では、メディエータプローブのアプタマー領域は標的分子に結合し、それによって、プライマーバインダ領域に結合したプライマーは延長することができず、したがってメディエータプローブはメディエータを放出しない。標的分子が存在する場合、標的分子が存在しない場合と比較してシグナルの減少が検出される。

さらに、本発明は、本発明による少なくとも１つのメディエータプローブおよび少なくとも１つの検出分子を含むシステムに関し、少なくとも１つの検出分子が１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのメディエータと相互作用する少なくとも１つの第１の領域を含み、少なくとも１つの検出分子が１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのメディエータと相互作用する少なくとも１つの第１の領域を含むことを特徴とする。

ａ）蛍光アクセプタまたは蛍光ドナーおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学的保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第２の領域、および／または
ｂ）蛍光ドナーもしくは蛍光アクセプタおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第３の領域、
または
ｃ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを有する少なくとも１つの第１のプローブと相互作用する少なくとも１つの第４の領域、および／または
ｄ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを含む少なくとも１つの第２のプローブと相互作用する少なくとも１つの第５の領域、
または
ｅ）２つのオリゴヌクレオチドからなり、蛍光アクセプタもしくは蛍光ドナーおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学的保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を有する２つのオリゴヌクレオチドの両方または一方のみからなるもの。

少なくとも１つの検出分子と相互作用するプローブは、本発明の意味において検出分子の成分と見なすことができる。この場合、検出分子は複数のオリゴヌクレオチドを含む。

本明細書に記載される検出分子の異なる領域は、本発明の好ましいバージョンにおいて重複し得る、または同一であり得る。

さらに、本発明は、本発明による少なくとも１つのメディエータプローブおよび少なくとも１つの検出分子を含むシステムに関し、少なくとも１つの検出分子が１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのメディエータと相互作用する少なくとも１つの第１の領域を含み、少なくとも１つの検出分子が１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのメディエータと相互作用する少なくとも１つの第１の領域を含むことを特徴とする。

ａ）蛍光アクセプタまたは蛍光ドナーおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学的保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第２の領域、および／または
ｂ）蛍光ドナーもしくは蛍光アクセプタおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第３の領域、
または
ｃ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを有する少なくとも１つの第１のプローブと相互作用する少なくとも１つの第４の領域、および／または
ｄ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを含む少なくとも１つの第２のプローブと相互作用する少なくとも１つの第５の領域。

さらに、本発明は、本発明による少なくとも１つのメディエータプローブ、および少なくとも１つの検出分子を含むシステムに関し、少なくとも１つの検出分子がオリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つのメディエータと相互作用する少なくとも１つの第１の領域、ならびに
ａ）蛍光アクセプタまたは蛍光ドナーおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学的保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む少なくとも１つの検出分子の５’末端の第２の領域、および
ｂ）蛍光ドナーもしくは蛍光アクセプタおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第３の領域、
または
ｃ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを有する少なくとも１つの第１のプローブと相互作用する少なくとも１つの第４の領域、および／または
ｄ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを含む少なくとも１つの第２のプローブと相互作用する少なくとも１つの第５の領域
を含む。

本発明によるメディエータプローブのユニバーサルな適用可能性を慎重に利用することによって、異なる標的分子の検出のために本システムを使用することが可能である。いくつかのユニバーサルメディエータプローブを使用して、いくつかの標的分子を１つの試料で同時に検出することができる。

蛍光ドナーおよびアクセプタはユニバーサルな検出分子に結合しており、標的配列特異的分子には結合していないので、蛍光収率および基本シグナルは標的分子の構造によって影響されない。最先端の技術とは対照的に、最適化された検出分子は、蛍光収率や基本的なシグナルを犠牲にすることなく、様々なアッセイに使用できる。

蛍光アクセプタまたはアクセプタ色素は、蛍光ドナーからエネルギーを吸収することができる分子である。蛍光アクセプタはまた、本発明の意味においてクエンチャーとして記載され得る。吸収効率は、とりわけ、蛍光アクセプタと蛍光ドナーとの間の距離に依存する。蛍光アクセプタは、λ_１を有する光子の吸収によりλ_２を有する発光へと活性化され得るか、非発光性であり得、蛍光の消光をもたらし得る。

蛍光ドナーは、蛍光が可能な色素分子またはフルオロフォアである。放射線によって活性化される蛍光ドナーは、双極子−双極子相互作用を介して蛍光アクセプタに放射線なしでエネルギーを移動することができる。これは蛍光ドナーの蛍光シグナルを消光する。あるいは、検出されるべき蛍光ドナーの蛍光シグナルは、静的および動的消光によって影響され得る。

フルオロフォア（または発色団と同様の蛍光色素）は、光を誘発すると再発光することができる蛍光化合物である。本発明の標識オリゴヌクレオチドを構築する際の標識として使用するためのフルオロフォアは、ローダミンおよび誘導体、例えばテキサスレッド、フルオレセインおよび誘導体、例えば５−ブロモメチルフルオレセイン、ルシファーイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセタート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセタート、７−ＮＨ２−４ＣＨ３−クマリン−３−アセタート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビマン、カスケードブルーなどのピレントリスルホネート、およびモノブロモトリメチルアンモニオビマン、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０、Ｃｙ３、ＮＥＤ、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、ＴＭＲ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０、ＲＯＸ、ＬＣレッド６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＬＣレッド６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、ＬＣレッド６４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５、Ｃｙ５、ＬＣレッド６７０、Ｑｕａｓａｒ ６７０、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、ＬＣレッド７０５、Ｃｙ５．５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｃａｌ Ｇｏｌｄ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇｊ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、Ｃａｌ Ｏｒａｎｇｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、Ｑｕａｓａｒ−５７０／Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、Ｃｙ３．５、Ｃａｌ Ｒｅｄ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６６５−Ｘ、Ｐｕｌｓａｒ−６５０、Ｑｕａｓａｒ−６７０／Ｃｙ５を好ましくは含む。

「消光」とは、特定の物質の蛍光強度を低下させる任意の過程を指す。消光は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの基礎である。エネルギーの移動はドナーが活性化状態にある間に起こるので、ＦＲＥＴは動的消火機構である。クエンチャーは、光源によって活性化されたときにフルオロフォアによって放出されるＦＲＥＴを介して蛍光を消す分子である。本発明の標識オリゴヌクレオチドまたはプローブを構築する際に標識として使用するためのクエンチャーは、好ましくはＤＤＱ−Ｉ、ダブシル、エクリプス、ＴＡＭＲＡ、アイオワブラックＦＱ、ＢＨＱ−１、ＱＳＹ−７、ＢＨＱ−２、ＤＤＱ−ＩＩ、アイオワブラックＲＱ、ＱＳＹ−２１、ＢＨＱ−３、ＱＳＹ−３５、ＢＨＱ−０、ＱＳＹ−９、ＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、アイオワブラックを含む。専門家は、文献に記載されているように適切なレポータークエンチャー対を選択することができる［Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｍ．Ｋ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３５、１７−２９（２００６）；Ｍａｒｒａｓ、Ｓ．Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３５，３−１６（２００６）］。

本発明によるシステムの好ましいバージョンにおいて、検出分子はヘアピン構造を有する。ここで、ヘアピン構造は、内部の配列部分と相補的にハイブリダイズする検出分子の５’末端、および不対配列部分を含む検出分子の３’末端によって形成され得る。

さらに、本発明によれば、検出分子は、５’末端および／またはヘアピン構造内に少なくとも１つの蛍光修飾またはレドックス修飾または発光修飾を含み得る。

本発明におけるヘアピン構造の意味は、内部塩基対合によって整列した配列セグメントを有する線状核酸分子またはオリゴヌクレオチドの二次構造を意味する。これらの構造は、同じ分子の２つの領域−通常はパリンドロームヌクレオチド配列を有する−が二重らせんを形成し、末端が不対ループで終わっている場合に発生する。

ヘアピン構造の形成後、５’末端の蛍光ドナーまたは蛍光アクセプタ（第２の領域）と第３の領域の蛍光ドナーまたは蛍光アクセプタとが相互作用して、蛍光シグナル（ＦＲＥＴ）を抑制することができる。第２および第３の領域における検出分子の蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタ修飾の代替として、非限定的に、レドックス分子、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）対、および挿入分子などの他のシグナル発生修飾を使用してもよい。

放出後、メディエータは反応溶液に拡散して存在し、ヘアピン型検出分子の３’末端の不対配列部分に位置する検出分子の第１の領域と相互作用することができる。検出分子は、固相に固定化されていても、溶液に存在していてもよい。検出分子に結合したメディエータの伸長は、適切な補助分子、例えばビーチ置換ポリメラーゼによって達成することができ、この場合検出分子の第２領域（５’末端）は、検出分子の内部の配列部分と相補的にハイブリダイズし、したがってヘアピン構造を形成し、それぞれポリメラーゼまたはメディエータの伸長した３’末端によって置換される。これは、蛍光アクセプタと蛍光ドナーとの間の距離を、５’末端の置換によって増加し、蛍光ドナーの以前に抑制された蛍光シグナルが回復される。あるいは、検出分子の５’末端におけるレドックス分子の距離は、検出分子の３’末端に対して変化するか、ＣＲＥＴの効率が変化するか、分子のインターカレーションがメディエータの二本鎖構造の形成またはその伸長産物および検出分子により変化する。ハイブリダイズした５’末端を置換することによって、二次構造またはヘアピン構造の形成が排除される。この場合、メディエータは、記載した補助分子によって検出分子の５’末端まで相補的に伸長することができる。

本発明によるシステムの好ましい設計によれば、検出分子は分子ビーコンの構造を有し、少なくとも１つのメディエータ結合領域を含む。分子ビーコンは、それらの自然な状態でヘアピン構造を形成する自己相補鎖末端を有する二重標識検出分子の特別なクラスである。分子ビーコンは、鎖の末端に蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタなどの標識を担持することができ、それによって標識は好ましいバージョンで互いに相互作用することができる。ヘアピン構造は、蛍光ドナーと蛍光アクセプタを互いに非常に接近させ、それによって蛍光シグナルを抑制する。メディエータとのハイブリダイゼーションは、おそらくメディエータが伸長される増幅反応の一部として、蛍光ドナーと蛍光アクセプタを空間的に分離し、蛍光シグナルを生成する。内部標識を担持する検出分子を超える分子ビーコンの形態の検出分子の利点は、蛍光標識のような末端標識のためのより低い合成コストである。

別の好ましい設計において、本発明は、少なくとも１つの本発明によるメディエータプローブと少なくとも１つの検出分子とを含むシステムに関し、少なくとも１つの検出分子が２つのオリゴヌクレオチドを含み、
−第１のオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのメディエータと相互作用する第１の領域、および蛍光アクセプタまたは蛍光ドナーおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学的保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第２の領域を含み、また
−第２のオリゴヌクレオチドは、蛍光ドナーもしくは蛍光アクセプタおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を有する第３の領域を含み、
−第１および第２のオリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイズする領域を有する
ことを特徴とする。

この設計によれば、検出分子は２つのハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドからなることができ、それによって２つのオリゴヌクレオチドの２つの標識はそれぞれオリゴヌクレオチドの末端に結合した少なくとも１つの蛍光アクセプタまたは蛍光ドナーであり得、それにより２つのラベルが空間的に近接していることにより二量体の蛍光シグナルは、減衰または抑制される。一方または両方のオリゴヌクレオチドもメディエータ結合領域を有する。メディエータをメディエータ結合領域に付着させ、続いて伸長させることによって、標識ヌクレオチドが分離され、標識された５’末端および３’末端が互いに空間的に分離され、検出可能なシグナル増加をもたらす。この構造の利点は、そのような末端および単一蛍光標識オリゴヌクレオチドについての非常に低い合成コストにある。この設計の検出分子の好ましい変形は図１９に示される。

本発明のシステムの好ましい設計によれば、検出分子は、固相に結合するための化学基および／または化学的保護基を有する検出分子の３’末端に第６の領域を含む。

本発明における保護基の意味は、特定の官能基を一時的に保護し、したがって望ましくない反応を防止するために分子に導入される置換基を指す。所望の反応が分子の他の場所で行われた後に、保護基を再び分離することができる。

好ましい設計において、検出分子は溶液に自由に存在する。別の好ましい設計において、検出分子は固相に結合している。検出分子は、それぞれの検出方法に適した反応容器中の固相に固定化される。必要とされる試料および試薬を反応容器に添加することができ、次いで混合物を適切な条件下でインキュベートすることができる。試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはペプチドまたはタンパク質からなり得る。標的分子が存在する場合、メディエータはメディエータプローブによって置き換えられるか放出され、反応混合物で固定化された検出分子に拡散し得る。

本発明の好ましいバージョンにおいて、シグナルの変化は、メディエータの放出および固相の電気化学的検出による検出分子への結合の後に検出される。検出分子は電極に固定化され、それは同時に固相を表現する。放出されたメディエータは、検出分子のメディエータ結合領域とハイブリダイズし、例えばポリメラーゼによって伸長することができる。成功裏の伸長後、レドックス分子は検出分子および伸長したメディエータの二量体にインターカレートして、検出可能な電気化学的シグナルを生成することができる。

さらに、十分に長いメディエータが検出分子とハイブリダイズし伸長されないことも可能である。レドックス分子は検出分子およびメディエータの二量体にインターカレートして、電気化学的シグナルを生成することができる。この設計の変形を図２０に示す。

さらなるバージョンにおいて、メディエータおよび／または検出分子は１つ以上のレドックス分子で標識されている。メディエータがレドックス分子で標識されている場合、固定化された検出分子への放出されたメディエータの結合は、レドックス修飾と電極表面との空間的近接性による信号変化をもたらす。本発明のこの形態の変形を図２１に示す。

より強いシグナルを得るために、標的および／または鋳型分子あたり複数のメディエータを放出することが有利であり得る。標的分子あたりのいくつかのメディエータの放出は、例えば、メディエータをいくつかの異なるプライマーに結合させることによって達成することができる。

さらなるバージョンでは、例えばレドックス修飾で標識されたメディエータは、検出分子とのハイブリダイゼーション後にポリメラーゼによって伸長させることができ、それによって二本鎖の有利な安定化を達成することができる（図２２）。

他のバージョンでは、レドックス修飾でマークされているメディエータは、電極表面から取り除かれた検出分子の鎖末端に結合することができる。メディエータは、より長い検出分子で伸長することができ、またはメディエータは既に検出分子と同様の長さを有し、伸長されない。レドックス分子と電極との間の電荷の移動は、ＤＮＡの導電性を介して起こり、それによって、導電性は二本鎖の形成を通じて増加する。このような設計の変形例を図２３に示す。

さらなるバージョンにおいて、検出分子はレドックス分子を担持し得、メディエータは無標識であり得る。放出されたメディエータは、今や検出分子に結合し、図２４に示すように伸長することができる。あるいは、既に十分に長いメディエータが検出分子に結合することができる。二本鎖の形成は、分子内および分子間の電荷移動メカニズムの可能性のために、ＤＮＡの電気伝導度を増加させる。その結果、電極における信号変化を検出することができる。

電気化学的検出は、インピーダンスの変化、サイクリックボルタンメトリー、方形波ボルタンメトリーまたは静電容量変化などの様々なパラメータを測定することによって実行することができる。

本発明の好ましいバージョンでは、メディエータの放出および検出分子への結合後のシグナル変化の検出は、内部全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）を介して行われる。この設計では、検出分子はＴＩＲＦ照明装置の固相に固定化されている。全反射によって形成されたエバネセント場は、試料体積部に侵入して、検出分子および／またはメディエータおよび／またはプローブに位置するか、二量体にインターカレートされている蛍光分子を誘発し、それにより、蛍光シグナルの変化を検出することができる。

他の好ましい設計において、放出されたメディエータの検出分子への結合は、表面プラズモン共鳴分光法によって検出することができる。表面上に固定化された検出分子へのメディエータの放出およびその後の結合によって、試料中の屈折率の変化を検出することができる。検出分子は、プラズモンが活性化される金属表面上に直接、または例えば金属表面上に直接配置された膜の中／上に直接固定化することができる。

検出分子の固相への結合または固定化は、重量測定によってメディエータの検出分子への放出および結合を証明するのにも有利である。例えば、検出分子は担体表面に固定化されており、その重量は振動水晶で測定することができる。メディエータの検出分子への結合による重量の変化は、このようにして検出することができる。

あるいは、検出分子を磁性粒子に固定化することができる。これにより、磁気緩和測定による標的分子の検出が可能になる。磁気緩和測定では、磁性粒子は短い磁気パルスによって磁化され、誘起された磁気モーメントの時間的劣化が検出される。メディエータが結合し、粒子上に固定化された検出分子を介して広がる粒子の流体力学的抵抗、すなわちメディエータが結合しない粒子の流体力学的抵抗はより大きい。メディエータが結合および任意選択的に伸長する粒子は、それ故それらの誘導磁気モーメントを、メディエータが結合しない粒子よりもゆっくり劣化させる。それ故、言及した粒子の誘導磁気モーメントの緩和時間は互いに異なり、それによってメディエータの放出を検出することができる。磁気緩和測定を融解曲線分析と組み合わせることによって、異なる標的分子を１つの試料中に並べて検出することができる。

本発明によれば、メディエータおよび／または検出分子は、少なくとも１つの蛍光分子、レドックス分子、発光分子または他のシグナル発生分子で標識することができる。

本発明によれば、検出分子は一本鎖核酸分子または核酸誘導体であり得る。いくつかの標識プローブをそのような検出分子にハイブリダイズさせることができる。メディエータの放出後、それは検出分子に結合し延長される。これにより、検出分子にハイブリダイズした標識プローブが放出され、その結果、プローブの標識から発せられる検出可能なシグナルの変化が生じる。例えば、蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタで標識されたプローブの放出は、蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタの空間的な隔たりに起因して、蛍光の増加をもたらす。一本鎖検出分子は直鎖状または環状であり得、溶液中で均一であり得るか固相上に固定化され得、いくつかのメディエータ結合部位を有し得る。本発明のこの形態は、標識されたプローブが標的分子の非存在下で検出分子に結合し、例えばＰＣＲによって生成される高い熱エネルギーのために検出分子から解離しないことを確実にする等温増幅方法において好ましく使用される。ここに示される本発明の形態の例は、例９に示す。

検出分子が環状であり、いくつかのメディエータ結合部位が挿入されている場合、異なる部位でいくつかのメディエータを同時に結合することによって、良好なダイナミックレンジで迅速な検出反応が起こり得る。検出分子上のメディエータのハイブリダイゼーションおよび伸長は、メディエータが結合する部位にかかわらず、すべての結合した標識プローブを放出するので、検出分子の環状構造は、感度のさらなる増加を達成することを可能にする。異なる波長で発光する、異なる蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタを有するプローブを、検出分子に結合させることができる。異なる濃度で使用することもできる（検出分子当たりの標識プローブの数によって判定される）異なる蛍光色素を組み合わせることによって、多重度を高めることができる。特定の濃度比を規定の検出分子に割り当てることができる。

好ましい設計において、本発明によるシステムはまた、少なくとも１つの第１のプローブおよび／または少なくとも１つの第２のプローブが検出分子からの放出後に結合することができる少なくとも１つの結合分子を含む。結合分子は、放出されたプローブ、例えば蛍光ドナーまたは蛍光アクセプタで標識されたものが、検出分子に再び結合するのを防ぐために使用され得る。本発明の対応する例を図７に示す。

特定の形態において、検出分子は、それにより非標識オリゴヌクレオチドがより短い蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするいくつかのオリゴヌクレオチドからなる。非標識オリゴヌクレオチドは、いくつかの蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る。蛍光アクセプタおよび／または蛍光ドナーはより短いオリゴヌクレオチドに結合している。これらは、フルオロフォアとクエンチャーが空間的に互いに近接するように配置されている。放出された非標識メディエータは、非標識検出分子に対して蛍光標識検出分子よりも高い結合エネルギーを有し、したがって、例えばクエンチャーで標識されたより短いオリゴヌクレオチドを置換する。結合エネルギーは、メディエータが反応条件下で優先的にプライマーに結合し、検出分子には結合しないように調整することができる。本発明の対応する例を図２５に示す。

さらに、本発明は、以下の工程を含む、少なくとも１つの標的分子の検出方法に関する。
ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の少なくとも１つのメディエータプローブおよび／または請求項４または５に記載のシステムを準備する工程、
ｂ）少なくとも１つのメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドのプローブ領域を、鋳型分子および／または標的分子の配列へ結合する工程、
ｃ）少なくとも１つのメディエータプローブおよび／または鋳型分子および／または標的分子の第１のオリゴヌクレオチドを増幅する工程、
ｄ）少なくとも１つの補助分子によって少なくとも１つのメディエータを放出する工程、
ｅ）少なくとも１つの放出されたメディエータの少なくとも１つの検出分子への任意選択の結合工程、および
ｆ）信号の変化を検出する工程。

本発明による方法の増幅工程は、等温および／または非等温増幅方法を含み得る。

等温または等温増幅では、それぞれの反応は鎖シフトのポリメラーゼを用いて、一定温度（等温）で起こる。等温増幅は一定の温度で実施されるので、それはまた、いかなる大きな技術的装置努力もなしに実施され得る。鎖置換ポリメラーゼ、例えばバクテリオファージΦ２９からのΦ２９ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡの既存の第２鎖を置換する一方、第２鎖を形成するために同じ配列を有する新しい鎖を生成するために第１鎖を使用する。

ＤＮＡの等温増幅のための方法は、多置換増幅、等温アセンブリ、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）およびビーチ置換増幅（ＳＤＡ）を含むがこれらに限定されない。

非等温増幅法では、反応中に温度が変化するため、熱安定性ポリメラーゼが使用される。この目的のためにサーマルサイクラーを使用することができる。非等温増幅法の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲおよびポリメラーゼ連鎖置換反応（ＰＣＤＲ）である。

本発明による方法の重要な利点は、例えばメディエータと検出分子との相互作用によるメディエータの放出およびその後のシグナル発生が、異なる増幅方法に適用され得、特定の増幅系に限定されないことである。異なる増幅方法においてそれぞれの条件を慎重に利用することによって、上記のメディエータ放出はそれぞれのシステムに容易に適合させることができる。

本発明の好ましいバージョンにおいて、メディエータは、酵素のヌクレアーゼ活性を用いてメディエータをメディエータプローブから分離することによってではなく、置換によって放出される。この場合、メディエータはメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに共有結合していないので、共有結合は切断されないことが好ましい。好ましくは、メディエータはオリゴヌクレオチドの切断なしに放出される。好ましくは、ヌクレアーゼ活性を有する酵素の使用は本発明の手順において必要とされない。

メディエータは、本発明による手順の好ましいバージョンにおいて検出分子の第１の領域に結合し、それにより、結合は間接的または直接的相互作用であり得る。メディエータと検出分子の第１の領域とのこの相互作用を通して、検出分子の物理的または化学的に測定可能な変化が起こり得る。

本発明による方法の好ましいバージョンでは、少なくとも１つのメディエータが検出分子の第１の領域に結合し、少なくとも１つの補助分子によって酵素により伸長され、補助分子が好ましくは結合されたメディエータの３’末端に結合し、それによって検出分子において物理的または化学的に測定可能な変化が起こる。検出分子のこれらの変化は、非限定的に、切断、消化、鎖重複、内部ハイブリダイゼーション、リン酸化、脱リン酸化、アミド化、化学基の結合または切断、蛍光、リン光または発光の変化が挙げられる。

本発明による手順の別の好ましいバージョンによれば、少なくとも１つのメディエータが検出分子の第１の領域に結合し、それにより検出分子の物理的または化学的に測定可能な変化がもたらされる。測定可能な変化を生じさせるために、メディエータの酵素による伸長は必要ではない。

メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が、メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドのプローブ領域が鋳型分子および／または標的分子の配列と結合した後、補助分子によって酵素により伸長される。

本発明による方法の好ましい設計は、メディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドおよび／または鋳型分子および／または標的分子の増幅が等温または非等温増幅法によって行われることを特徴とする。

本発明によれば、ＰＣＲ、ＰＣＤＲまたはリアルタイムＰＣＲが非等温増幅方法として好ましい。ＬＡＭＰまたはＲＰＡが好ましい等温増幅方法である。

ＰＣＲまたはＰＣＤＲなどの非等温増幅反応では、使用される１つまたは複数のプライマーは、それがメディエータプローブであるように修飾することができる。試料および試薬を適切な反応容器に入れ、混合物をインキュベートし、そこで増幅が起こり得る。この過程の間に、例えば蛍光シグナルのシグナル変化が反応容器で検出される。

本発明による方法のさらなるバージョンでは、検出分子が少なくとも１つの蛍光または発光修飾を有し、補助分子による少なくとも１つのメディエータとの反応の後、蛍光または発光修飾が検出分子から補助分子により切断され、および／または検出分子のヘアピン構造の５’末端が除去され、および／またはヘアピン構造が広げられ、蛍光または発光シグナルの変化が検出分子で検出される。

本発明による手順の好ましいバージョンにおいて、メディエータプローブあたりいくつかのメディエータおよび／または標的分子あたりいくつかのメディエータプローブおよび／またはいくつかの検出分子が使用される。

これにより、実験的アプローチにおいて、いくつかの分析物を同時に検出することを可能にする複雑な多重分析が可能になる。多重分析は、反応混合物のいくつかの異なる標的分子および／または鋳型分子の検出を可能にする。本発明による方法の多重度を高めるために、ｎ個の異なる標的分子の検出のためにｎ個の異なるメディエータプローブを使用することができる。検出される各標的分子には、そのプローブ領域が標的分子または鋳型分子と特異的に相互作用する少なくとも１つのメディエータプローブを割り当てることができる。それぞれのメディエータプローブのメディエータ結合領域およびメディエータは、それぞれの標的分子または鋳型分子に対してアフィンでも相補的でもない。しかし、各々のメディエータは、定義された検出分子に対する特異的な相互作用パートナーを表す。したがって、各標的分子は、メディエータプローブによって割り当てられる少なくとも１つの検出分子に間接的に割り当てられる。異なる標的分子の検出は異なる検出分子を必要とする。

メディエータプローブのプローブ領域とメディエータ結合領域は互いに独立して自由に組み合わせることができるので、一致するメディエータ結合領域とメディエータを任意のプローブ領域と連結して合成することによって、検出分子を別の標的分子と相関させることもできる。したがって、本発明による方法は、標的分子を検出分子とは無関係に設計することを可能にする。したがって、標準化された一組の検出分子を用いて、異なる標的分子を１つの試料中で検出することができ、それによってメディエータプローブを適合させ適切な補助分子（例えばプライマーまたはアプタマー）を用いることによって反応をそれぞれの標的分子に費用効果的に適合させる。

本発明によれば、単一のメディエータプローブの一部であり、メディエータプローブの同じ第１のオリゴヌクレオチドのメディエータ結合領域に結合するいくつかの異なるメディエータは、いくつかの異なる検出分子に結合することができる。メディエータプローブのいくつかのメディエータを異なる検出分子と慎重に組み合わせることによって、本発明による手順の多重度を大幅に高めることができる。前提条件は、いくつかの異なる検出分子が、識別可能であり、好ましくは並行してまたは同時に検出することができる異なるシグナルを生成することである。

例えば、メディエータプローブおよび標的分子あたりｎ個の検出分子および２個のメディエータを使用することによって、「２より多いｎ」＋ｎ個の異なる標的分子を検出することができる。二項係数を使用して、所与の数の異なる検出分子について検出可能な標的分子の数を計算することができる。２つの異なるシグナル、例えば２つの異なる波長を有する２つの蛍光シグナルを生成することだけでなく、単一のシグナルを生成することによっても、標的分子を識別できるので、検出可能な標的分子の最大数を計算するために、二項係数の値をｎだけ増加させなければならない。４つの異なる検出分子を用いると、１０の異なる標的分子を検出することができるが、５つの検出分子のみが１５の標的分子を識別することができる。対応する例を図５Ａに示す。

あるいは、標的分子ごとにいくつかのメディエータプローブを使用することができ、それによって１つのメディエータプローブは１つのメディエータのみを含むことができる。

同じ標的分子または鋳型分子に結合する１つ以上のメディエータプローブは、本発明による手順の好ましいバージョンにおいて使用することができ、それによってこれらのメディエータプローブの１つまたは複数のメディエータは、１つ以上の検出分子に同時に結合することができる。検出分子のメディエータバインダ領域を厳密に組み合わせることによって、例えば、２つの検出分子のみを使用して３つの標的分子を区別することが可能である。ｎ個の検出分子および１検出分子あたり少なくとも２つのメディエータを使用することによって、「２ｎ−１」個の異なる標的分子を検出することができる。本発明のこの形態によれば、検出分子はそれぞれ少なくとも２つの異なるメディエータ結合領域を含み、それによって少なくとも２つの異なる標的配列に結合している少なくとも２つのメディエータはそれぞれ１つのみの特異的検出分子に結合する。標的分子ごとに特異的シグナルが生成される。本発明によれば、第３以上の標的配列に結合している第３以上のメディエータは、少なくとも２つの検出分子に結合することができ、したがって少なくとも２つの異なるシグナルを誘発することができる。２つの放出されたメディエータが同じ検出分子に同時に結合する確率を十分高くするために、放出されたメディエータの濃度は検出分子の濃度程度であるべきである。対応する例を図５Ｂに示す。さらに、３つ以上の異なるメディエータに結合することができる検出分子も使用することができ、いくつかの異なるメディエータプローブが同じ標的分子に結合することができる。

標的分子または鋳型分子あたりいくつかのメディエータプローブを使用することによって、いくつかの異なるメディエータを、標的分子の検出時に放出することができる。例えば、それぞれが共通の標的分子または鋳型分子に選択的に結合するいくつかのメディエータプローブを使用することができ、それによってこれらのメディエータプローブの１つまたは複数のメディエータは異なる配列を有する。異なる配列のいくつかの異なるメディエータは、１つの同じ検出分子に結合することができ、それによって、検出反応は、いくつかのメディエータを結合することによってのみ引き起こされ得る。放出されたメディエータ間の相互作用を慎重に利用し、それによって検出方法の特異度を高めることによって、シグナル発生反応を制御することができる。特異度とは、陰性として正しく分類された事象の割合、または標的分子が存在しないことも陰性として分類される確率を指す。例えば、異なるメディエータプローブによって放出された２つのメディエータは、両方のメディエータが検出分子に結合した場合にのみ検出分子のシグナル変化が起こるように、検出分子で相互作用することができる。対応する例を図５Ｃに示す。

本発明による方法の好ましい設計は、標的分子および／または鋳型分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、アプタマーおよび／またはそれらの組み合わせを含む群から選択される生体分子であることを特徴とする。

本発明による方法の主な利点は、最先端の技術とは対照的に、タンパク質や核酸などの異なる分子および分子クラスの並行検出が、単一の工程および単一反応アプローチ内で可能であり、したがって試料の組み合わされたＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質プロフィールの作成を可能にすることである。

本発明による検出方法は、例えば、標的分子として特定のＲＮＡ分子を検出するために使用することができ、それによって逆転写（ＲＴ）または他の適切な酵素系によってＲＮＡがｃＤＮＡに転写され、次いでｃＤＮＡが増幅され、それにより、ｃＤＮＡは鋳型分子として使用される。

本発明によれば、標的分子特異的アプタマーを標的分子の検出用の鋳型分子として使用することができる。検出される標的分子は、例えばタンパク質またはペプチドであり得るが、それに限定されない。アプタマーは標的分子に結合してその構造を変化させるので、相互作用後にアプタマー特異的メディエータプローブおよびプライマーはアプタマーに付着することができる。適切な酵素系で処理することにより、アプタマーに付着したプライマーを延長することができ、その結果、アプタマーのタンパク質結合領域の外側にあるアプタマー配列の増幅がもたらされる。本発明によるメディエータプローブは、アプタマーまたは増幅アプタマー配列と相互作用することができる。例えば、メディエータプローブを線形増幅産物に結合させることにより、プローブを開くことができ、さらなるプライマーを用いてメディエータをメディエータプローブから置換する。放出されたメディエータは、特定の検出分子または適切な検出方法を用いて検出することができる。本発明によれば、標的分子特異的アプタマーは、プライマー結合領域が隣接する標的分子結合領域を含む標的分子の検出のための鋳型分子として使用することができる。さらに、本発明による少なくとも１つのメディエータプローブが使用され、そのプローブ領域はアプタマーのプライマーバインダ領域の１つに特異的に結合する。標的分子の非存在下では、アプタマーの標的分子結合領域は、メディエータプローブおよび他のプライマーを使用して増幅され、メディエータプローブからメディエータを解放し、信号変化を検出することができる。標的分子の存在下では、アプタマーは標的分子に結合し、アプタマーと標的分子との間の結合のためにメディエータプローブのプライマーまたは第１のオリゴヌクレオチドは延長できず、メディエータは放出されない。標的分子が存在する場合、標的分子が存在しない場合と比較してシグナルの減少が検出される。本発明によるこの方法は指数関数的な検出反応を可能にする。

本発明のプロセスの他の形態によれば、補助分子は、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、リボザイム、触媒、タンパク質、核酸、天然物質、酵素、酵素系、細胞溶解物、細胞成分、細胞成分から誘導される誘導体、および／または合成分子からなる群から選択される。補助分子は、好ましくは核酸増幅系および／または制限酵素系由来の分子である。

リガーゼはＤＮＡ鎖をつなぐ酵素である。それらはリン酸残基と糖デオキシリボースとの間にエステル結合を形成する。リガーゼはまた、それらの３’末端で核酸分子を伸長する能力を有することも知られている。

リボザイムは、酵素のような化学反応を触媒する触媒活性のあるＲＮＡ分子である。ポリメラーゼと同様に、ある種のリボザイムは核酸分子を延長し増幅することができることが知られている。リボザイムはまた、ペプチド結合の結合およびＲＮＡ分子のスプライシングなどの他の反応も触媒し得る。

本発明の方法の好ましいバージョンによれば、少なくとも１つの補助分子はＤＮＡ鎖分離効果および／または重合効果を有し、補助分子は好ましくは鎖置換ポリメラーゼである。

驚くべきことに、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用する場合、ヌクレアーゼ活性を有する酵素のような追加の酵素は必要とされず、これは最先端の技術を超える大きな利点である。

本発明によるプロセスの範囲内で、異なる補助分子を異なるプロセスの段階に使用することができる。補助分子の補助にて実施することができるプロセスの段階は、限定するものではないが、本発明によるメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドの増幅、標的分子および／または鋳型分子の増幅、開裂、メディエータプローブからのメディエータの放出または置換、検出分子への結合後のメディエータの酵素による伸長、および検出分子の修飾を含む。

蛍光、リン光、発光、質量、吸収、光の散乱、導電率、酵素活性および／または親和性、電気化学ポテンシャルもしくはシグナル、屈折率の測定可能な変化が、表面プラズモン誘発または磁気緩和の測定可能な変化は、固定化または非固定化検出分子と少なくとも１つのメディエータとの間の直接的または間接的相互作用によって、本発明による方法の好ましいバージョンにおいて生じる。

本発明による方法の好ましい設計において、蛍光、リン光、発光、質量、吸収、光の散乱、導電率、酵素活性および／または親和性、電気化学ポテンシャルもしくはシグナル、屈折率の測定可能な変化が、表面プラズモン、磁気緩和、磁気特性、インピーダンスまたは静電容量を誘発し、固定化または非固定化検出分子と少なくとも１つのメディエータとの間の直接的または間接的相互作用によって起こる。

本発明による好ましい設計は、少なくとも１つのメディエータの放出が、等温または非等温増幅方法による少なくとも１つのメディエータの増幅によって検出されることを特徴とする。放出されたメディエータは、例えば、対応する増幅酵素の存在下でローリングサークル増幅を引き起こすことができる。したがって、標的分子は、ローリングサークル増幅産物の検出によって同定することができる。ローリングサークル増幅の増幅産物は、例えば、プローブを介してまたはｐＨ値の変化、ゲル電気泳動または比色分析を介して配列特異的に検出することができる。

本発明による手順の好ましいバージョンによれば、少なくとも１つの放出されたメディエータは配列決定によって検出される。遊離メディエータを配列決定することによって、試料の任意の数の標的分子を同時に同定することができる。

配列決定は、核酸分子、特にＤＮＡのヌクレオチド配列の決定である。本発明の範囲内の配列決定法の意味としては、限定されないが、マキサム・ギルバート法、サンガージデオキシ法、パイロシーケンシング、ハイブリダイゼーション配列決定、イオン半導体ＤＮＡ配列決定システム、ブリッジ合成配列決定、二塩基配列決定、ペアエンド配列決定およびナノポア配列決定が挙げられる。

検出は、例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって実証することができる。ＮＧＳ法の例は、ナノポア配列決定であり、それにおいて、孔を有する膜の潜在的な変化が、核酸などの分子が膜を通って流れるときに測定でき、したがって核酸の配列を判定することができる。配列決定を用いて、それぞれ特定の標的分子の存在を知らせる任意の数のメディエータの同時放出を検出することができる。多重度は、蛍光測定のような従来の方法と比較してかなり増加する。配列決定の方法は、ナノポア配列決定に限定されない。

本発明による方法の好ましいバージョンでは、少なくとも１つの放出されたメディエータがハイブリダイゼーションによって検出分子に結合し、補助分子によって検出分子に結合した後に任意選択的に伸長され、次いで融解曲線分析が行われる。これにより、例えば、異なるシグナル伝達分子で標識されている異なる検出分子を使用することによって、多重度のさらなる増加を達成することが可能になる。本発明の好ましいバージョンによれば、蛍光色素および／または色素原標識または蛍光色素である配列特異的プローブまたは配列非特異的プローブは、メディエータおよび／または検出分子と相互作用する。

本発明による方法の好ましいバージョンにおいて、少なくとも１つの標的分子はＲＮＡであり、そのＲＮＡはｃＤＮＡに転写され、そのｃＤＮＡは鋳型分子として働く。ＲＮＡのｃＤＮＡへの書き換え反応／逆転写に配列オーバーハングを有するプライマーを使用することができ、メディエータプローブのプローブ領域は、ｃＤＮＡの少なくとも一部と配列オーバーハングの一部の両方を含む領域に結合することができる。

本発明による方法の別の好ましいバージョンによれば、少なくとも１つの標的分子はペプチドまたはタンパク質であり、鋳型分子はアプタマーであり、この場合アプタマーはペプチドまたはタンパク質に結合し、アプタマーを標的分子に結合することによって、アプタマーにおけるメディエータプローブのプローブ領域のための結合部位が接近可能になる。

本発明によれば、配列特異的または配列非特異的プローブ、蛍光染料またはレドックス分子は、少なくとも１つのメディエータおよび／または検出分子と相互作用し得る。

さらに、本発明は、本発明によるシステムの使用および／または混合物の１つ以上の類似または異なる生体分子を検出するための方法に関する。この場合、本発明による検出分子は、３’末端領域に化学的保護基を有することができ、保護基は、メディエータとの反応後に補助分子によって検出分子から分離され、３’末端のＯＨ基が生成されている。

さらに、本発明は、少なくとも１つの検出分子、および本発明の意味における任意の少なくとも１つのメディエータ、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含むキットに関する。

以下では、本発明を図面および例によって説明するが、これに限定されるものではない。

本発明の実施形態におけるメディエータプローブの構造の概略図である。 ビーチ置換ポリメラーゼの存在下での増幅過程でのメディエータ置換の概略的な順序である。 可能な検出分子の概略図である。 酵素のメディエータ伸長の概略図である。 標的分子あたりいくつかのメディエータおよび／またはいくつかのメディエータプローブおよび／またはいくつかの検出分子を使用する場合の可能な配置を示す。 分子ビーコンの構造の検出分子の構造を示す。 蛍光ドナー・蛍光アクセプタ標識プローブハイブリダイズプローブを有する線状または環状検出分子を示す。 固相での電気化学的検出を示す。 ビーチ置換ポリメラーゼの存在下での増幅過程でのメディエータ置換の概略的な順序である。 ＬＡＭＰ間のメディエータ放出およびそれに続くシグナル発生のメカニズムを示す。 本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を用いた大腸菌（Ｗ３１１０、完全ゲノム）の検出のためのＬＡＭＰの正規化蛍光プロットを示す。 本発明のメディエータプローブおよび検出分子を用いたＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＬＡＭＰの正規化蛍光プロットを示す。 プライマーとして機能しないメディエータプローブの構造を示す。 標的分子特異的アプタマーによる標的分子の検出のための検出方法を示す。 アプタマー領域およびプライマー結合剤領域をさらに含むメディエータプローブによる標的分子の検出のための発明された検出方法を示す。 プライマーとして作用し指数関数的な検出反応を可能にするメディエータプローブによる標的分子の検出のための発明された検出方法を示す。 固相への検出分子の固定化を示す。 電極への標識検出分子の固定化を示す。 ２つの標識ハイブリダイズオリゴヌクレオチドからなる検出分子を示す。 固相での電気化学的検出を示す。 固相での電気化学的検出を示す。 固相での電気化学的検出を示す。 固相での電気化学的検出を示す。 固相での電気化学的検出を示す。 いくつかのオリゴヌクレオチドからなる検出分子を示す。 Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉの検出のためのＬＡＭＰの正規化蛍光プロットを示す。 Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの検出のためのＬＡＭＰの正規化蛍光プロットを示す。 ＨＴＬＶ−１の検出のためのＲＴ−ＬＡＭＰの正規化蛍光プロットを示す。 ＴＭＶの検出のためのＲＴ−ＬＡＭＰの正規化蛍光プロットを示す。 １００ｐｇのＧ３ＰＤＨフラグメントの検出のためのＰＣＤＲの正規化蛍光プロットを示す。 磁性または磁化可能ナノ粒子にメディエータが結合していることを示す。 電気活性標識メディエータの電気化学的検出の証明を示す。

図１は、本発明の好ましいバージョンであるメディエータプローブの可能な構造の概略図を示す。

図２は、ＤＮＡの増幅においてプライマーとして作用するメディエータプローブからの鎖置換ポリメラーゼの存在下での増幅中のメディエータ置換の概略的な配列を示す。

図３（Ａ）は、可能な検出分子の線形表現を示す。図３（Ｂ）は、二次構造の形成中の３’固定化検出分子の表現を示す。その相互作用が検出分子の二次構造を生成する逆相補的配列セグメントは、黒い領域として示され、メディエータ結合配列は斜めの縞状領域として示される。

図４は、酵素メディエータ伸長の概略図を示す。ｉ）検出分子は溶液に遊離しているか固相上に固定化されており、反応条件下で規定の二次構造をとる。２つの適切な蛍光修飾ＦおよびＱは、互いに相互作用し、それによってＦの蛍光シグナルが抑制される。ｉｉ）メディエータは、規定の位置（メディエータ結合領域、領域５）で検出分子と相互作用することができ、ｉｉｉ）〜ｉｖ）はそれによって鎖置換ポリメラーゼによって酵素で伸長される。蛍光アクセプタ分子Ｑと共に領域１は検出分子によって置換され、それによって蛍光ドナーＦの蛍光強度を回復させる。ｖｉ）領域１の置換後、メディエータはさらに拡大され得る。

図５（Ａ〜Ｃ）は、標的分子あたりいくつかのメディエータおよび／またはいくつかのメディエータプローブおよび／またはいくつかの検出分子を使用する場合のいくつかの可能な配置を示す。（Ａ）１つのメディエータプローブにつき複数のメディエータを、または１つの標的分子につき複数のメディエータプローブを使用して、検出可能な標的分子の数を増やす。標的分子あたりいくつかのメディエータを使用する場合の検出分子の数の関数としての検出可能な標的分子の最大数は、二項係数および検出分子の数を使用して計算することができる。（Ｂ）複数のメディエータ結合領域を有する検出分子を用いて、検出可能な標的分子の数を増やす。（Ｃ）標的分子につき複数のメディエータを使用し、メディエータ間の相互作用を利用して検出反応の特異度を高める。両方のメディエータの放出は、それらが互いに検出分子と同時に相互作用することを可能にし、メディエータの一方を延長し、検出反応を引き起こす。単一のメディエータの相互作用は検出反応につながらない。

図６は、分子ビーコンの構造に対応する検出分子の構造を示す。蛍光アクセプタおよび蛍光ドナーは５’および３’末端に結合しており、メディエータ結合領域はループ内に位置している。

図７は、蛍光ドナー・蛍光アクセプタ標識プローブがハイブリダイズしている、線状または環状検出分子を示す。メディエータを検出分子および伸長とハイブリダイズさせることによって、標識プローブが放出され、シグナル変化を検出することができる。蛍光ドナーまたは蛍光アクセプタで標識された放出されたプローブが検出分子に再結合するのを防ぐために、標識されたプローブが放出後に結合することができる結合分子を使用することができる。

図８は、電気化学的検出が固相で使用される本発明のバージョンを示す。検出分子は電極に固定化されている。検出分子でのメディエータのハイブリダイゼーションおよび伸長の後、溶液に存在するレドックス分子は検出分子および伸長したメディエータの二量体にインターカレートすることができ、それによって電気化学的シグナルの変化を検出することができる。

図９は、ＤＮＡの増幅においてプライマーとして作用するメディエータプローブからの鎖置換ポリメラーゼの存在下での増幅中のメディエータ置換の概略的な配列を示す。メディエータおよび検出分子はそれぞれ蛍光色素で標識されており、これにより、メディエータがＦＲＥＴエネルギー移動によって検出分子とハイブリダイズした場合に、ある波長での蛍光強度の増加を検出することが可能になる。異なる数のヌクレオチドを有する検出分子を使用する場合、融解曲線分析を使用して異なる標的分子を区別することができる。

図１０は、ＬＡＭＰの間のメディエータの放出およびその後のシグナル発生のメカニズムを示す。検出分子およびメディエータプローブ内のメディエータ結合領域は、Ｍｅｄｃと略される（メディエータに相補的な配列に対応する）。本発明のこのバージョンにおいて、メディエータプローブはループプライマーとして同時に機能する。したがって、メディエータプローブは、Ｍｅｄｃによって伸長されたループプライマー（Ｌｏｏｐ＿Ｍｅｄｃ）、およびそれにハイブリダイズしたメディエータ（Ｍｅｄ）からなる。最初のＬＡＭＰ工程の後、メディエータプローブが結合することができるダンベル様増幅産物が形成される。メディエータプローブを伸長させ、それにプライマーを再接続することによって、メディエータはビーチ置換ポリメラーゼによって置換される。次いで放出されたメディエータは、検出分子と相互作用することによって検出可能なシグナルを生成することができる。

図１１は、本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を用いた大腸菌ＤＮＡ（Ｗ３１１０、完全ゲノム）の検出のためのＬＡＭＰの標準化蛍光プロットを示す。プロットは、ＤＮＡの量と蛍光の経過との間の相関関係を示す。蛍光強度を０分で初期値に標準化した。ＤＮＡのコピー数は、反応当たりのコピー数で表される（例えば、１０ｃｐは、総容量１０μｌでの反応当たり１０コピーに対応する）。陰性対照は反応あたり０コピーを含む（ＮＴＣ、鋳型対照なし）。

図１２は、本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を用いたＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＬＡＭＰの標準化蛍光プロットを示す。蛍光強度を０分で初期値に標準化した。ＲＮＡのコピー数は、反応当たりのコピー数で得られる（３，４００ｃｐは、総容量１０μｌでの反応当たり３，４００コピーに対応する）。陰性対照は反応あたり０コピーを含む（ＮＴＣ、鋳型対照なし）。

図１３は、増幅の出発点として機能しないメディエータプローブの設計を示す。

図１４は、標的分子特異的アプタマーによる標的分子の検出のための、本発明による検出を示す。

図１５は、アプタマー領域およびプライマーバインダ領域をさらに含むメディエータプローブによる標的分子の検出のための本発明に記載の方法による検出を示す。標的分子の非存在下では、メディエータプローブは増幅され、一方では標的分子の存在下では、プライマーの伸長は結合した標的分子によって阻害される。その結果、標的分子の存在下では検出可能なシグナルは引き起こされず、標的分子の非存在下では検出可能なシグナルが生成される。

図１６は、プライマーとして作用し、指数関数的な検出反応を可能にするメディエータプローブによる標的分子の検出のための本発明による検出方法を示す。標的分子の非存在下では、線状アプタマーは増幅され、メディエータは増幅中に放出され、一方で、標的分子の存在下では、プライマーの伸長は結合標的分子によって阻害される。その結果、標的分子の存在下では検出可能なシグナルは引き起こされず、標的分子の非存在下では検出可能なシグナルが生成される。

図１７は、検出分子が適切な反応容器中で固相に固定化されている、本発明による検出方法の設計を示す。

図１８は、検出分子が電極に固定化されている本発明の方法による検出のバージョンを示す。検出分子でのメディエータのハイブリダイゼーションおよび伸長を通して、検出分子に結合したレドックス分子は、電極の表面から空間的に分離し、信号に変化を生じさせる。スキームａおよびｂは、検出分子の２つの異なる領域における、メディエータの可能な結合部位を図式化したものである。

図１９は、２つの標識ハイブリダイズオリゴヌクレオチドからなる検出分子を示す。蛍光アクセプタおよび蛍光ドナーは、それぞれ５’および３’末端に結合している。さらに、２つのオリゴヌクレオチドのうちの１つはメディエータ結合領域を有する。

図２０は、固相での電気化学的検出が可能であることを示す。検出分子は電極に固定化されている。検出分子でのメディエータのハイブリダイゼーション後、溶液に存在するレドックス分子は検出分子および伸長したメディエータの二量体にインターカレートすることができ、それによって電気化学的シグナルの変化を検出することができる。

図２１は、マーキングのなされたメディエータを用いた固相での電気化学的検出を示す。検出分子は電極に固定化されている。標識メディエータを検出分子にハイブリダイズさせることによって、電気化学的シグナルの変化を検出することができる。

図２２は、固相での電気化学的検出を示す。検出分子は電極に固定化されている。標識メディエータを検出分子にハイブリダイズおよび伸長させることによって、電気化学的シグナルの変化を検出することができる。

図２３は、固相での電気化学的検出が可能であることを示す。検出分子は電極に固定化されている。標識メディエータを検出分子にハイブリダイズおよび伸長させることによって、電気化学的シグナルの変化を検出することができる。レドックス分子と電極との間の電荷の輸送が、二本鎖の形成によって引き起こされる。

図２４は、固相での電気化学的検出を示す。検出分子は電極に固定化されている。メディエータを標識検出分子にハイブリダイズおよび伸長させることによって、電気化学的シグナルの変化を検出することができる。レドックス分子と電極との間の電荷の輸送が、二本鎖の形成によって引き起こされる。

図２５：検出分子は、非標識オリゴヌクレオチドがより短い蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしているいくつかのオリゴヌクレオチドからなる。蛍光アクセプタおよび／または蛍光ドナーはより短いオリゴヌクレオチドに結合している。これらは、フルオロフォアとクエンチャーが空間的に互いに近接するように配置されている。放出されたメディエータは、非標識検出分子に対してより高い結合エネルギーを有し、したがって、例えばクエンチャーで標識されたより短いオリゴヌクレオチドを置換する。

図２６は、本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を用いたヘモフィルス・デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）の検出のためのＬＡＭＰの標準化蛍光プロットを示す。蛍光強度を０分で初期値に標準化した。陰性対照（ＮＴＣ、鋳型対照なし）は、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ ＤＮＡを含まず、陽性対照は、精製したＨ．ｄｕｃｒｅｙｉ ＤＮＡと混合した。

図２７は、本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を用いた梅毒トレポネーマ（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）の検出のためのＬＡＭＰの標準化蛍光プロットを示す。蛍光強度を０分で初期値に標準化した。陰性対照（ＮＴＣ、鋳型対照なし）は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＤＮＡを含まず、陽性対照は、精製したＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＤＮＡと混合した。

図２８は、本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を用いたＨＴＬＶ−１の検出のためのＲＴ−ＬＡＭＰの標準化蛍光プロットを示す。蛍光強度を０分で初期値に標準化した。陰性対照（ＮＴＣ、鋳型対照なし）は、ＨＴＬＶ−１ ＲＮＡを含まず、陽性対照は、精製したＨＴＬＶ−１ ＲＮＡと混合した。

図２９は、本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を用いたＴＭＶの検出のためのＲＴ−ＬＡＭＰの標準化蛍光プロットを示す。蛍光強度を０分で初期値に標準化した。陰性対照（ＮＴＣ、鋳型対照なし）は、ＴＭＶ ＲＮＡを含まず、陽性対照は、精製したＴＭＶ ＲＮＡと混合した。

図３０は、本発明によるメディエータプローブおよび検出分子を使用して１００ｐｇのマウスＧ３ＰＤＨ ＤＮＡを検出するためのＰＣＤＲの標準化蛍光プロットを示す。蛍光強度を０サイクルで初期値に正規化した。

図３１は、磁性または磁化可能ナノ粒子に結合したメディエータを示す。標的分子の存在下で放出された後、メディエータは、検出分子に結合して固相表面の磁気特性の変化を検出することができる。

図３２は、電気活性標識メディエータの電気化学的検出の機能の説明を示す。陽性対照（６０，０００コピーのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ）では、メディエータがＬＡＭＰ反応中に置換され、その後検出分子とハイブリダイズすることが可能である。したがって、マーキングされた（ここではメチレンブルーの）メディエータが電極の表面に蓄積し、それは電気化学的分析（ここでは方形波ボルタンメトリー）において−０．３９Ｖで特徴的なピークの形成をもたらす。対照的に、ＮＴＣにピークが存在しないことは、メディエータの顕著な放出が起こらなかったことを示す。

設計例
以下の説明では、いくつかのメディエータが本発明によるメディエータプローブの特別なプライマーまたは第１のオリゴヌクレオチドに結合することができ、および／または試料のメディエータ濃度を高めるためにいくつかの異なるプライマーおよび／またはメディエータプローブにメディエータを設けることができる。

例１：メディエータプローブ
本発明の設計例は、少なくとも１つの標的分子を検出するためのメディエータプローブを含み、メディエータプローブは少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。第１のオリゴヌクレオチドは、メディエータ結合領域およびプローブ領域を有する。メディエータ結合領域はオリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、プローブ領域は３’末端に位置する。第２のまたはいくつかのさらなるオリゴヌクレオチド、１つまたは複数のメディエータは、第１のオリゴヌクレオチドのメディエータ結合領域に化学的、生物学的および／または物理的に結合している。メディエータは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または修飾ＲＮＡ、例えばＬＮＡから構成することができる。第１のオリゴヌクレオチドのプローブ領域は標的および／または鋳型分子に対して親和性を有し、メディエータ結合領域は、１つまたは複数のメディエータに対して親和性を有する（図１）。１つまたは複数のメディエータは、少なくとも１つの検出分子に対して親和性を有する。

例２：メディエータ置換手順
プローブ領域を標的分子および／または鋳型分子に結合させた後、メディエータは、例えばビーチ置換ポリメラーゼを用いて、メディエータ結合領域によって置換される。この過程は、標的分子および／または鋳型分子の増幅過程の間に起こり得る。本発明の例において、メディエータプローブのプローブ領域は、ＤＮＡの増幅においてプライマーとして作用することができる。プローブ領域を標的分子および／または鋳型分子に結合させた後、メディエータプローブを伸長させる。次いで、第２のプライマーを伸長メディエータプローブに結合させて伸長させることができる。増幅プロセスの間、１つまたは複数のメディエータはメディエータ結合領域から放出され、１つまたは複数の検出分子との相互作用を通じて検出可能なシグナルを誘発する（図２）。

例３：６つの領域を有する検出分子
放出された、マークのないメディエータの検出は、検出反応の補助を借受けて行われる。下記の反応機構は、上記の標的分子および／または鋳型分子の増幅と並行して実施することができる。

本発明の好ましいバージョンにおいて、検出分子は、６つの領域に分割されたオリゴヌクレオチドからなり得る（図３）。領域１は、配列部分および蛍光アクセプタＱからなる検出分子の５’末端を含む。領域３は領域１の逆相補的配列であり、それから領域２によって隔てられている。領域４は領域３と領域５を分離し、これらはメディエータ分子と特異的に相互作用することができる。領域６は３’末端配列領域を含み、これは化学的な修飾を施していてもよく、したがってオリゴヌクレオチドの方向性の固定化を可能にする。蛍光ドナーＦは、領域２から領域６の領域、例えば領域４と適切に結合している。検出分子の領域１および領域３は、反応条件下で規定の二次構造（ヘアピン構造）を形成し、この場合５’末端は、内部配列部分にハイブリダイズする（図３Ｂ）。この構造の形成後、蛍光ドナーＦと蛍光アクセプタＱは互いに相互作用し、Ｆの蛍光シグナルは抑制される（ＦＲＥＴ）。領域１および領域４における検出分子の蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタ修飾の代替として、レドックス分子、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）対、および挿入分子などの他のシグナル発生修飾を使用してもよい。

例４：メディエータの伸長は検出分子のシグナル変化をもたらす
放出後、メディエータは反応溶液に拡散的に存在し、検出分子のメディエータ結合配列（領域５）と相互作用することができる（図４ｉ）＋ｉｉ））。検出分子は、固相に固定化されていても、溶液に存在していてもよい。メディエータは、適切な補助分子、例えばビーチ置換ポリメラーゼ、これにより、検出分子の領域１がポリメラーゼによって置換される。蛍光アクセプタＱと蛍光ドナーＦとの間の距離は、５’末端の置換によって増加し、蛍光ドナーＦの以前に抑制された蛍光シグナルが回復される（図４ｉｉｉ）＋ｉｖ））。あるいは、検出分子の５’末端におけるレドックス分子の距離は、検出分子の３’末端に対して変化するか、ＣＲＥＴの効率が変化するか、分子のインターカレーションがメディエータの二本鎖の形成またはその伸長産物および検出分子により変化する。説明した変位が領域１と領域３の相互作用を妨げる場合、二次構造の形成は取り消される。この場合、メディエータは、特定の条件下で、検出分子の新たに形成された５’末端まで、記載の補助分子によって相補的に伸長することができる（図４ｖ）＋ｖｉ））。この完全な伸長は、検出分子の領域１、２および領域３に相補的な配列セグメントを有する伸長メディエータをもたらす。

検出反応は、メディエータとは対照的に、最初のメディエータプローブがシグナル発生反応を引き起こさず、したがって偽陽性の結果が生じないように設計されなければならない。最初に、メディエータは、例えば水素結合によってメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに結合される。メディエータを検出分子に結合させることによってシグナル発生反応を防止するために、メディエータをメディエータプローブの第１のオリゴヌクレオチドに結合させることと、メディエータを検出分子に結合させることとの間のバランスを、それに応じて調整することができる。

メディエータと検出分子との相互作用事象は局所的な検出可能なシグナルを生じる。十分な数の検出分子がメディエータの伸長によって活性化され、その結果５’末端が変位すると、シグナルが増幅され、適切な検出装置を用いて検出することができる。これは反応混合物の存在下での検出を可能にし、いかなる処理工程も必要としない。

例５：多重分析
多重分析は、反応混合物中のいくつかの異なる分析物の検出を必要とする。本発明による反応の多重度を増大させるために、ｎ個の異なる標的分子に対するｎ個の異なるメディエータプローブの使用が計画されている。検出される各標的分子には、そのプローブ領域が標的分子または鋳型分子と特異的に相互作用するメディエータプローブを割り当てることができる。それぞれのメディエータプローブのメディエータ結合領域およびメディエータは、標的または鋳型分子に対してアフィンでも相補的でもない。しかし、メディエータは、定義された検出分子に対する特異的な相互作用パートナーを表す。したがって、各標的分子は、メディエータプローブによって割り当てられる検出分子に間接的に割り当てられる。異なる標的分子の検出は異なる検出分子を必要とする。

メディエータプローブのプローブ領域とメディエータ結合領域は互いに独立して自由に組み合わせることができるので、一致するメディエータ結合領域とメディエータを任意のプローブ領域と連結して合成することによって、検出分子を別の標的分子と相関させることもできる。したがって、本発明による方法は、標的分子を検出分子とは無関係に設計することを可能にする。したがって、標準化された一組の検出分子を用いて、異なる標的分子を１つの試料中で検出することができ、それによってメディエータプローブを適合させ適切な補助分子（例えばプライマーまたはアプタマー）を用いることによって反応をそれぞれの標的分子に費用効果的に適合させる。

本発明を実施する例は、標的分子当たり複数のメディエータおよび／または複数のメディエータプローブおよび／または複数の検出分子を含み得る。以下の配置が可能である。

Ａ．同じメディエータプローブに結合するいくつかのメディエータは、いくつかの検出分子に結合することができる。メディエータプローブのいくつかのメディエータを異なる検出分子と慎重に組み合わせることによって、アッセイの多重度を大幅に高めることができる。前提条件は、検出分子が異なる波長を有する蛍光シグナルを生成することである。メディエータプローブおよび標的分子あたりｎ個の検出分子および２個のメディエータを使用することによって、「２より多いｎ」＋ｎ個の異なる標的分子を検出することができる。二項係数を使用して、所与の数の異なる検出分子について検出可能な標的分子の数を計算することができる。２つの異なる波長を有する２つの蛍光シグナルを生成することだけでなく、単一の蛍光シグナルを生成することによっても、標的分子を識別できるので、検出可能な標的分子の最大数を計算するために、二項係数の値をｎだけ増加させなければならない。４つの異なる検出分子を用いると、１０の異なる標的分子を検出することができ、一方５つの検出分子のみが１５の標的分子の識別を可能にする（図５Ａ）。同様に、標的分子ごとにいくつかのメディエータプローブを使用することができ、それによって１つのメディエータプローブは１つのメディエータのみを含むことができる。

Ｂ．同じ標的または鋳型分子に結合する１つ以上のメディエータプローブを使用してもよく、そのようなメディエータプローブの１つまたは複数のメディエータは１つ以上の検出分子に同時に結合してもよい。検出分子のメディエータバインダ領域を厳密に組み合わせることによって、例えば、２つの検出分子のみを使用して３つの標的分子を区別することが可能である。ｎ個の検出分子および１検出分子あたり少なくとも２つのメディエータを使用することによって、「２ｎ−１」個の異なる標的分子を検出することができる。いくつかの異なるメディエータプローブが同じ標的分子に結合することができる。上記の例において、２つの検出分子のみを用いて３つの標的分子を識別することができる場合、検出分子はそれぞれ２つの異なるメディエータ結合領域を含み得る。２つの異なる標的配列に連結している２つのメディエータは、それぞれ１つの特異的検出分子にのみ結合する。標的分子ごとに特異的シグナルが生成される。第３の標的配列に結合している第３のメディエータは、両方の検出分子に結合し、したがって２つの異なるシグナルを引き起こす。２つの放出されたメディエータが同じ検出分子に同時に結合する確率が十分に高いことを確実にするために、放出されたメディエータの濃度は検出分子の濃度程度であるべきである（図５Ｂ）。さらに、３つ以上の異なるメディエータに結合することができる検出分子もまた使用することができる。

Ｃ．それぞれ共通の標的分子または鋳型分子に選択的に結合するいくつかのメディエータプローブを使用することができ、それによってこれらのメディエータプローブの１つまたは複数のメディエータは異なる配列を有する。複数の異なるメディエータが１つの同じ検出分子に結合することができ、それによって、検出反応は、いくつかのメディエータを結合することによってのみ引き起こされ得る。この方法は、検出反応の特異度を高めるために使用され得る。考えられる反応シーケンスを図５Ｃに示す。２つの放出されたメディエータが同じ検出分子に同時に結合する確率が十分に高いことを確実にするために、放出されたメディエータの濃度は検出分子の濃度程度であるべきである。

例６：融解曲線分析
本発明の特定のバージョンでは、増幅メディエータとハイブリダイズした検出分子の融解曲線分析を、増幅反応の後に実施することができる。これにより、例えば、異なるシグナル伝達分子で標識されている異なる検出分子を使用することによって、多重度のさらなる増加を達成することが可能になる。

例７：分子ビーコンの形態の検出分子
本発明の可能な形態において、検出分子は、メディエータ結合領域がループ内に位置する分子ビーコンの構造を有する（図６）。記載された検出分子へのメディエータの結合およびその後の伸長によって、分子ビーコンが開かれ、標識された５’末端および３’末端が分離され、検出可能なシグナルの増加をもたらす。これまで考えられてきた構造（図３）を超えるこの構造の利点は、末端蛍光マーキングの合成コストが低いことである。

例８：２つの標識オリゴヌクレオチドからなる検出分子
本発明の他のバージョンにおいて、検出分子はいくつかの蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる。クエンチャーおよびフルオロフォアで標識された２つのオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズし得、メディエータと相互作用するときに分離され得、したがってシグナル変化が検出され得る。記載された検出分子は、図１９に示されるように構造化され得る。

例９：ハイブリダイズしたプローブを用いた一本鎖ＤＮＡからの検出分子
この設計において、検出分子は、蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタで標識されたいくつかのプローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡからなってもよい。メディエータの放出後、メディエータは検出分子に結合して延長され、それによって標識プローブが放出され、蛍光ドナーと蛍光アクセプタが互いに空間的に分離され、蛍光が増加する。検出分子といくつかの標識プローブとの多重ハイブリダイゼーションは、シグナル発生の増倍効果をもたらす。検出分子は直鎖状または環状であり得、溶液中で均一であり得るか固相上に固定化され得、いくつかのメディエータ結合部位を有し得る。検出分子が環状であり、いくつかのメディエータ結合部位が挿入されている場合、異なる部位でいくつかのメディエータを同時に結合することによって、良好なダイナミックレンジで迅速な検出反応が起こり得る。検出分子上のメディエータのハイブリダイゼーションおよび伸長は、メディエータが結合する部位にかかわらず、すべての結合した標識プローブを放出するので、検出分子の環状構造は、感度のさらなる増加を達成することを可能にする。異なる波長で発光する、異なる蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタを有するプローブを検出分子に結合させることができる。異なる濃度で使用することもできる（検出分子当たりの標識プローブの数によって判定される）異なる蛍光色素を組み合わせることによって、多重度を高めることができる。特定の濃度比を規定の検出分子に割り当てることができる。標識プローブが放出後に結合することができる結合分子（図７）は、蛍光ドナーまたは蛍光アクセプタで標識された放出プローブが長期間検出分子に再結合するのを防ぐために使用することができる。記載された設計は、好ましくは等温増幅法と共に使用され、それにより標識プローブが標的分子の非存在下で検出分子に結合し、例えばＰＣＲによって生成される高い熱エネルギーのために検出分子から解離しないことを確実にする。

好ましい設計では、蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタで標識されたプローブは、メディエータを伸長させることによって検出分子から分離されるのではなく、放出されたメディエータの存在下で平衡を調整することによって置換される。放出されたメディエータは、標識プローブよりも非標識検出分子に対して高い結合エネルギーを有し、したがって、例えば、蛍光アクセプタで標識されたより短いプローブを置換する（図２５）。

例１０：内部の全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）または表面プラズモン共鳴分光法による検出
電気化学的検出と同様に、内部の全反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦ）による検出は、特定の設計において実施することができる。この方法では、検出分子はＴＩＲＦ照明器の上のガラスまたはポリマー試験担体に固定化される。全反射によって形成されたエバネセント場は、試料体積部に侵入して、検出分子および／またはメディエータおよび／またはプローブに位置するか、二量体にインターカレートされている蛍光分子を活性化し、それにより、蛍光シグナルの変化を検出することができる。さらなるバージョンにおいて、メディエータの検出分子への結合は、表面プラズモン共鳴分光法によって検出される。表面上に固定化された検出分子へのメディエータの放出およびその後の結合によって、試料中の屈折率の変化を検出することができる。検出分子は、プラズモンが活性化される金属表面上に直接、または例えば金属表面上に直接配置された膜の中／上に直接固定化することができる。

例１１：重量測定による検証
本発明の好ましいバージョンでは、メディエータの検出分子への放出および結合は、重量測定によって実証することができる。例えば、検出分子は担体表面に固定化されており、その重量は振動水晶で測定することができる。メディエータの検出分子への結合による重量の変化は、このようにして検出することができる。

例１２：ローリングサークル増幅の証明
本発明の好ましいバージョンでは、適切な増幅酵素の存在下で放出されたメディエータはローリングサークル増幅を引き起こすことができ、したがって標的分子はローリングサークル増幅産物の検出によって同定することができる。ローリングサークル増幅の増幅産物は、例えば、プローブを介してまたはｐＨ値の変化、ゲル電気泳動または比色分析を介して配列特異的に検出することができる。

例１３：配列決定による検出
本発明の好ましいバージョンでは、放出されたメディエータを配列決定により分析し、それ故同定することができる。次世代配列決定の例は、ナノポアシークエンシングであり、それにおいて、孔を有する膜の潜在的な変化が、核酸などの分子がそれを通って流れるときに測定され、したがって核酸の配列を判定することができる。配列決定を用いて、それぞれ特定の標的分子の存在を知らせる任意の数のメディエータの同時放出を検出することができる。多重度は、蛍光測定のような従来の方法と比較してかなり増加する。放出されたメディエータの検出のために任意の配列決定方法を選択することができるので、配列決定法はナノポアシークエンシングに限定されない。

例１４：選択されたメディエータを使用する
本発明の好ましいバージョンでは、メディエータプローブに結合したメディエータは、特定の波長λ_１で発光する蛍光ドナー／蛍光アクセプタで標識することができる。メディエータプローブの置換後、メディエータは、λ_１とは異なる第２の波長λ_２で発光される蛍光アクセプタ／蛍光ドナーで標識された検出分子に結合することができる。ＦＲＥＴ機構を介した蛍光ドナーから蛍光アクセプタへのエネルギーの移動は、蛍光アクセプタの放射強度の検出可能な増加をもたらし、それによりλ_２の発光を検出することが可能になる。さらなるバージョンでは、化学発光または生物発光ドナー分子を使用することができる。非発光性である蛍光アクセプタも設計に使用することができる。異なる数のヌクレオチドを有する検出分子を使用することによって、融解曲線分析によって１つの試料で異なる標的分子を同時に識別することができる。メディエータをマーキングすることによって、記載された検出方法のユニバーサルな性質は失われない。なぜなら、メディエータは標的配列とは無関係のユニバーサルな分子であるからである。さらなる設計では、標的分子あたりいくつかのプローブまたはプライマーを使用して蛍光色素で標識されたメディエータを結合させることができ、それによってメディエータの配列および蛍光色素の発光波長が異なり得る（図９）。

例１５：等温増幅法の使用
この例では、本発明による検出方法は、等温増幅法、例えばＬＡＭＰにおけるＤＮＡの検出に使用される。ＬＡＭＰの間のメディエータ放出のメカニズムは図１０に詳述されている。ＬＡＭＰの初期増幅工程は、中間増幅産物のダンベル様構造をもたらす。この例においてプライマーとして作用するメディエータプローブは、この中間増幅産物に結合し、次の工程で伸長され得る。中間増幅産物を置換することによって、別のプライマーが伸長メディエータプローブに結合して伸長することができる。この過程で、メディエータはビーチ置換ポリメラーゼによって置換される。放出されたメディエータは、今やヘアピン構造を有する検出分子に結合することができ、また伸長することができる。メディエータが伸長している間、検出分子の閉じたヘアピン構造の５’末端は相補的領域から変位し、蛍光シグナルを発生する。

試料と試薬を適切な反応容器に入れ、混合物をインキュベートする（約６２℃で１０分から６０分の間）。この過程の間に蛍光が反応容器で検出される。以下では、ＬＡＭＰの例を使用して説明された実行を詳細に説明する。

大腸菌のＤＮＡ（Ｗ３１１０、完全ゲノム）のリアルタイムでのＬＡＭＰ検出のために、表１に列挙したプライマーを使用した。ＬＡＭＰプライマーは（Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１２）から得られ、部分的に修飾されていた。メディエータプローブは、メディエータとハイブリダイズすることができるプライマーの５’末端にメディエータ結合領域を付加することによって、ＬｏｏｐＦプライマーと組み合わされた。メディエータ、メディエータ結合領域を有するＬｏｏｐＦ、および検出分子を、ＶｉｓｕａｌＯＭＰ（ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国）を使用して手動で作成した。表１に由来すする合成オリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｍｅｒｓ（ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ、Ｕｌｍ、独国）によって合成された。

ＬＡＭＰ反応は、１×等温増幅緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、独国）のＢｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。１×等温増幅緩衝液は、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）_２ＳＯ４、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４および０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（２５℃でｐＨ８．８）を含有する。さらに、最終的な濃度が８．０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、独国）、および最終的な濃度が１．４ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎヒルデン、独国）を緩衝液に加えた。ＬＡＭＰ反応は、１．６μＭのＦＩＰおよびＢＩＰ、０．２μＭのＦ３およびＢ３、０．８μＭのＬｏｏｐＢ、０．６μＭのＬｏｏｐＦ、０．２μＭのＭｅｄｉａｔｏｒ結合領域を有するＬｏｏｐＦ、０．１μＭのＭｅｄｉａｔｏｒ、０．０５μＭの検出分子、３２０Ｕ／ｍｌのＢｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１×等温増幅緩衝液、および１ｇ／ｌのＢＳＡからなっていた。反応は、ローター遺伝子６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、オーストラリア、現在はＱｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）で、６２℃で３回行った。蛍光データを０分の初期値に対して正規化した（図１１）。

検出方法はまた、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）および梅毒トレポネーマ（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）のＬＡＭＰでも使用された。能力および反応条件は、上記の大腸菌のＬＡＭＰと同じであるが、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉおよびＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに対する配列特異的プライマーを用いた。蛍光データを０分の初期値に対して正規化した（図２６および２７）。

例１６：ＲＴ−ＬＡＭＰを用いた本発明による手順
さらなる例では、本発明の方法による検出を使用してＲＮＡを検出することができ、それによって逆転写（ＲＴ）または他の適切な酵素系を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、次いでｃＤＮＡを増幅する。以下では、ＲＴ−ＬＡＭＰを使用して実行した例について詳しく説明する。

表２に列挙したプライマーをＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出用のＲＴ−ＬＡＭＰに使用した。ＲＴ−ＬＡＭＰプライマーは（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．２００８）から得られ、部分的に修飾されていた。メディエータプローブは、メディエータとハイブリダイズすることができるプライマーの５’末端にメディエータ結合領域を付加することによって、ＬｏｏｐＦプライマーと組み合わされた。メディエータ、メディエータバインダ領域を有するＬｏｏｐＦ、および検出分子を、ＶｉｓｕａｌＯＭＰを使用して手動で作成した。合成オリゴヌクレオチドＭｅｄｉａｔｏｒ、メディエータ結合配列を有するＬｏｏｐＦ、および検出分子は、Ｂｉｏｍｅｒｓ（ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ、Ｕｌｍ、独国）によって合成され、プライマーＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬｏｏｐＦおよびＬｏｏｐＢは、Ｅｌｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、独国）によって合成された。鋳型ＲＮＡ（ＨＩＶ、ＶＲ−３２４５ＳＤ）は、ＡＴＣＣ、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ（Ｗｅｓｅｌ、独国）によって合成された。

ＲＴ−ＬＡＭＰ反応は、１ｘ等温増幅緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、独国）のＢｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、独国）、およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、独国）を用いて実施した。１×等温増幅緩衝液は、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）_２ＳＯ４、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４および０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（２５℃でｐＨ８．８）を含有する。さらに、最終的な濃度が８．０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、独国）、および最終的な濃度が１．４ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎヒルデン、独国）を緩衝液に加えた。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応は、１．６μＭのＦＩＰおよびＢＩＰ、０．２μＭのＦ３およびＢ３、０．８μＭのＬｏｏｐＢ、０．６μＭのＬｏｏｐＦ、メディエータ結合領域を有する０．２μＭのＬｏｏｐＦ、０．１μＭのＭｅｄｉａｔｏｒ、０．０５μＭの検出分子、３２０Ｕ／ｍｌのＢｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、４００Ｕ／ｍｌのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、および１×等温増幅緩衝液からなった。反応は、ローター遺伝子６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、現在はＱｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）で、６３℃で３回行った。陽性対照は３，４００コピー／反応の合成ＨＩＶ−１ ＲＮＡを含み、陰性対照はＨＩＶ−１ ＲＮＡを含まなかった。蛍光データを０分の初期値に対して正規化した（図１２）。

検出方法はまた、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ＲＮＡのＲＴ−ＬＡＭＰにも首尾よく適用された。能力および反応条件は、ＨＩＶ−１の既に記載されたＲＴ−ＬＡＭＰと同一であったが、ＨＴＬＶ−１およびＴＭＶに対する配列特異的プライマーを用いた。蛍光データを０分の初期値に対して正規化した（図２８および図２９）。

例１７：非等温増幅反応を用いる本発明による手順
本発明のさらなる例において、本発明による検出方法は、ＰＣＲまたはＰＣＤＲなどの非等温増幅反応においてＤＮＡを検出するために使用することができる。これは、それらがメディエータプローブを表すように１つ以上のプライマーを修飾することを含む。適切な反応容器に、試料と必要な試薬を入れて混合物をインキュベートする。この過程の間に蛍光が反応容器で検出される。以下では、ＰＣＤＲを使用して実行した例を詳細に説明する。

表３に列挙したプライマーをマウスＤＮＡのリアルタイムＰＣＤＲ検出に使用した。Ｇ３ＰＤＨ ＤＮＡの増幅のためのＰＣＤＲプライマーは（Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１４）から得て、部分的に修飾されていた。メディエータプローブは、メディエータとハイブリダイズすることができるプライマーの５’末端にメディエータバインダ領域を結合することによって、Ｆ３プライマーを使用して作製された。メディエータ、メディエータ結合領域を有するＦ３、および検出分子は、ＶｉｓｕａｌＯＭＰを使用して手動で作成した。プライマーならびに合成オリゴヌクレオチドメディエータ、メディエータ結合配列を有するＦ３、および検出分子は、Ｂｉｏｍｅｒｓ（ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ、Ｕｌｍ、独国）によって合成された。増幅されるマウスＧ３ＰＤＨ ＤＮＡ配列は（Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１４）から得られ、Ｇ３ＰＤＨの断片は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。

１×ＳＤ緩衝液（Ｂｉｏｒｏｎ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、独国）のＳＤ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＤＲを実施した。さらに、ＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｒｏｎ、ルートヴィヒスハーフェン、独国）、最終的な濃度２．７５ｍＭ、およびｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、独国）、最終的な濃度０．２５ｍＭを緩衝液に加えた。ＰＣＤＲ反応は、０．１μＭのＦ３、およびメディエータ結合領域をそれぞれ有するＦ３、０．２μＭのＲ３、０．１μＭのＦ２およびＲ２、０．０５μＭのＦ１およびＲ１、０．０５μＭのメディエータ、０．０５μＭの検出分子、２００Ｕ／ｍｌのＳＤ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび１×ＳＤ緩衝液からなっていた。以下のプロトコール（Ｉｇｎａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１４）に従って、ローター遺伝子６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、現在はＱｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）で反応を行った。９２℃で２分間の初期の変性、その後９２℃（１５秒）および６６℃（４０秒）で４５サイクルが続いた。蛍光データを０サイクルで初期値に対して正規化した（図３０）。陽性対照は反応あたり１００ｐｇのＧ３ＰＤＨフラグメントを含み、陰性対照は鋳型ＤＮＡを含まなかった。

例１８：プライマーとして作用しない本発明のメディエータプローブ
さらなる例において、本発明の方法による検出は、特異度が増加したＤＮＡまたはＲＮＡの検出のために使用され得る。プライマーはメディエータプローブとしては機能しないが、増幅の出発点としては機能しない特別なプローブが使用される。標的分子が存在しない場合、プローブは閉じている。標的分子が反応混合物にあるとすぐに、メディエータプローブは標的分子または鋳型分子に結合し、それによってプライマーは、今開いているメディエータプローブの３’末端に結合することができる。適切な酵素系で処理することによって、付着したプライマーを伸長させることができ、それによってメディエータはメディエータプローブによって置き換えられる。放出されたメディエータは、特定の検出分子に補助されて検出することができる。酵素増幅プロセスは、等温プロセスを含み得るが、これに限定されない（図１３）。

例１９：標的分子特異的アプタマーの使用
さらなるバージョンにおいて、標的分子特異的アプタマーによる標的分子の検出のための本発明による方法を適用することができる。標的分子特異的アプタマー、調査されるべき試料および検出分子は、適切な反応容器に入れられる。検出される標的分子は、例えばタンパク質またはペプチドであり得るが、それに限定されない。アプタマーは標的分子に結合し、その構造を変化させるので、アプタマー特異的メディエータプローブおよびプライマーは相互作用後に付着することができる。適切な酵素系で処理することによって、アプタマーに結合したプライマー（図１４：アプタマーの白いマーカー）を延長することができ、タンパク質結合領域外のアプタマー配列の増幅をもたらす。メディエータプローブを線形増幅産物に結合させることにより、プローブを開き、さらなるプライマーを用いてメディエータをメディエータプローブから置換する。放出されたメディエータは、特定の検出分子または適切な検出方法を用いて検出することができる。酵素増幅プロセスは、等温プロセスを含み得るが、これらに限定されない（図１４）。

例２０：アプタマー領域、メディエータ結合領域およびプライマー結合領域を有する修飾メディエータプローブ。
好ましい設計において、独創的な検出方法は、アプタマー領域、メディエータ結合領域およびプライマー結合領域を有する修飾メディエータプローブを使用して標的分子を検出するために使用され得る。検出される標的分子は、例えばタンパク質またはペプチドであり得るが、これに限定されない。標的分子が存在しない場合、プライマーはメディエータプローブに結合し、適切な酵素系で処理してメディエータをメディエータプローブから移動させることによって延長することができる。放出されたメディエータは、特異的検出分子または方法を用いて検出可能なシグナルを誘発することができる。標的分子が存在する場合、メディエータプローブのアプタマー領域は標的分子に結合し、それによってプライマーバインダ領域に結合したプライマーを伸長することはできない（図１５）。標的分子が存在する場合、標的分子が存在しない場合と比較してシグナルの減少が検出される。酵素増幅プロセスは、等温プロセスを含み得るが、これらに限定されない。

例２１：プライマーバインダ領域が隣接するタンパク質バインダ領域を含むアプタマーの使用
指数関数的な検出反応を生じさせるために、５’末端にメディエータハイブリダイゼーション配列を有するプライマーおよびそれにハイブリダイズしたメディエータからなるメディエータプローブが使用される。さらに、アプタマーが使用され、これはプライマー結合領域が隣接するタンパク質結合領域である。標的分子の存在下では、アプタマーは標的分子に結合する。アプタマーに結合するプライマーは、標的分子への結合のために伸長することができない。その結果、メディエータは放出されず、標的分子の存在下では、標的分子の非存在下と比較してシグナルの低下が検出される。標的分子の不在下では、プライマーはアプタマーに結合して延長されることが可能であり、これはメディエータの放出を介してシグナルを増加させる。酵素増幅プロセスは、等温法を含み得るが、これに限定されない（図１６）。

例２２：検出分子の固定化
本発明による検出方法の他の好ましいバージョンにおいて、検出分子は適切な反応容器で固相に固定化することができる。次いで試料および必要な試薬を反応容器に添加し、混合物を適切な条件下でインキュベートする。試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはペプチドまたはタンパク質からなり得る。標的分子が存在する場合、メディエータはメディエータプローブによって置き換えられ、反応混合物で固定化された検出分子に拡散し得る。この手順には、等温増幅手順が含まれるが、これに限定されない（図１７）。

例２３：リラクソメトリーの使用
さらなるバージョンでは、本発明の方法による検出は、標的分子の検出のために磁気緩和測定と組み合わせて使用することができる。検出分子は磁性粒子に結合させることができ、磁気緩和測定による検出を可能にする。磁気緩和測定では、磁性粒子は短い磁気パルスによって磁化され、誘起された磁気モーメントの時間的劣化が検出される。メディエータが結合し、粒子上に固定化された検出分子を介して広がる粒子の流体力学的抵抗、すなわちメディエータが結合しない粒子の流体力学的抵抗はより大きい。メディエータが結合および伸長する粒子は、それ故それらの誘導磁気モーメントを、メディエータが結合しない粒子よりもゆっくり劣化させる。それ故、言及した粒子の誘導磁気モーメントの緩和時間は互いに異なり、それによってメディエータの放出を検出することができる。磁気緩和測定を融解曲線分析と組み合わせることによって、異なる標的分子を１つの試料中に並べて検出することができる。この手順は等温増幅手順を含むがこれに限定されない。

例２４：磁性粒子または磁化可能粒子の使用
他の設計では、本発明の方法による検出は、標的分子を検出するために磁性粒子または磁化可能粒子と組み合わせて使用することができる（図３１）。メディエータは、磁性または磁化可能なナノ粒子に結合している。複数のメディエータを同時に１つの粒子に結合できる。本発明によれば、メディエータは最初にプライマーとハイブリダイズする。標的または鋳型分子の増幅中に、メディエータはプライマーによって置換され、次いで固相に固定化された検出分子とハイブリダイズすることができる。放出されたメディエータと検出分子との間の結合は、ナノ粒子を固相の表面にもたらし、それによって磁気特性の変化を検出することが可能になる。固相の表面の信号の変化を検出するために、とりわけ、例として非排他的に、ガルバノ磁気、磁気抵抗、磁気光学効果またはジョセフソン効果に基づく磁場センサを使用することができる。非放出メディエータ／粒子ユニットの固相への沈着による偽陽性シグナルを防ぐために、弱い磁場を印加することにより、非放出メディエータ／粒子ユニットを固相から分離することができる。

例２５：ヘアピン構造を有する検出分子による電気化学的検出
さらなるバージョンでは、本発明の方法による検出は、標的分子を検出するための電気化学的検出と組み合わせて使用することができる。このバージョンでは、検出分子は電極に固定化され、それは同時に固相を表現する。放出されたメディエータは、メディエータ結合領域において検出分子とハイブリダイズし得、ポリメラーゼによって伸長され得る。メディエータ結合領域は、検出分子の異なる領域に位置していてもよい。検出分子はヘアピン構造を有していてもよく、５’末端にレドックス分子でマーキングされていてもよい。メディエータの伸長は検出分子の５’末端を置換して、後者を開く。マークされた５’末端の変位のために、レドックス分子と電極表面との間の距離が増大し、その結果検出可能なシグナルの変化が生じる。この手順には、等温増幅手順が含まれるが、これに限定されない（図１８）。

例２６：固相での電気化学的検出による証明
この好ましい設計では、電気化学的検出による検出は固相で行うことができる。このバージョンでは、検出分子は電極に固定化され、それは同時に固相を表現する。放出されたメディエータは、メディエータ結合領域において検出分子とハイブリダイズし得、ポリメラーゼによって伸長され得る。伸長後、レドックス分子は検出分子および伸長したメディエータの二量体にインターカレートして、検出可能な電気化学的シグナルを生成することができる（図８）。図２０によれば、メディエータを伸長することなくシグナル発生を行うこともできる。メディエータは無標識であり得、レドックス分子のインターカレートを使用し得、および／またはメディエータは１つ以上のレドックス分子で標識され得る。メディエータがレドックス分子で標識されている場合、放出されたメディエータの結合、および必要であればその後のメディエータの検出分子への伸長は、図２１〜図２３に記載されるようにシグナル発生をもたらす。別のバージョンでは、検出分子は１つ以上のレドックス分子でマークされている。放出されたメディエータの結合およびおそらくその後のメディエータの検出分子への伸長は、図２４によるシグナル変化をもたらす。より強いシグナルを得るために、標的分子および／またはアンプリコンあたりいくつかのメディエータを放出することが有利であり得る。標的分子あたりのいくつかのメディエータの放出は、例えば、メディエータをいくつかの異なるメディエータプローブに結合させることによって達成することができる。

以下では、図２１による電気化学的検出について説明する。メディエータはレドックス分子で標識され、増幅中に放出される。このバージョンでは、標識されていない検出分子は電極に固定化され、それは同時に固相を表現し、放出されたメディエータはメディエータバインダ領域の検出分子とハイブリダイズすることができる。メディエータのレドックス分子と電極表面とが空間的に近接しているため、シグナルの変化を検出することができる。検出は、増幅反応中にリアルタイムで、または増幅生成物を電極表面に移動させることによるエンドポイントの検出として行うことができる。実行した例は、大腸菌のＬＡＭＰの増幅産物の電気化学的なエンドポイントの検出を用いて、以下に詳細に記載される。

ＬＡＭＰ反応は例１５に記載のようにして行った。しかし、電気化学的検出メディエータについては、メディエータ結合配列を有するＬｏｏｐＦ、および検出分子を、それに応じて適合させた（表１）。メディエータ結合配列を有するＬｏｏｐＦおよび検出分子は、Ｂｉｏｍｅｒｓ（ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ、Ｕｌｍ、独国）およびメチレンブルー誘導体（Ａｔｔｏ ＭＢ２）で合成されたメディエータ、ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、独国）によって合成された。

例１５に記載のように大腸菌ＤＮＡのＬＡＭＰを実施した後、反応混合物を、検出分子が固定化されている電極を有するチャンバに移した。陽性対照反応において放出されたメディエータ（６０，０００コピーの大腸菌ＤＮＡ）の電気化学的検出を方形波ボルタンメトリーによって行った（図３２）。陽性対照では、メディエータはＬＡＭＰ反応中に置換され、反応混合物を電極チャンバに移した後に検出分子とハイブリダイズすることができる。したがって、マーキングされた（ここではメチレンブルーの）メディエータが電極の表面に蓄積し、それは電気化学的分析（ここでは方形波ボルタンメトリー）において−０．３９Ｖで特徴的なピークの形成をもたらす。対照的に、陰性対照（ＮＴＣ）にピークが存在しないことは、メディエータの実質的な放出がなかったことを示している。本発明による検出方法を電気化学的検出と組み合わせて適用することは、増幅反応の後にさらなる修正または反応工程を実施する必要がないので、ここでは特に有利であることが証明されている。

例２７：ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび／またはタンパク質の並行検出
本発明による方法の好ましいバージョンでは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチドもしくはタンパク質、または言及された物質クラスの別の組み合わせは、１つのアプローチにおいて記載された方法によって並行して検出される。この手順は等温増幅手順を含むがこれに限定されない。

参考文献

配列表１〜６、１０〜１５、１９〜２４ ＜２２３＞プライマー
配列表７、１６、２５、２８ ＜２２３＞メディエータ
配列表９、１８、２７、３０ ＜２２３＞検出分子
配列表１７ ＜２２３＞第１の部分のメディエータプローブ
配列表２６、２９ ＜２２３＞メディエータプローブの第１の部分

Claims (18)

1. 少なくとも１つの標的分子を検出するためのメディエータプローブであって、
   ａ）第１のオリゴヌクレオチドがプローブ領域およびメディエータ結合領域を含み、
   ｉ．前記プローブ領域が標的分子および／または鋳型分子に対して親和性を有し、
   ｉｉ．前記メディエータ結合領域が少なくとも１つのメディエータに対して親和性を有し、また
   ｂ）少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドは、
   ｉ．前記メディエータ結合領域を介して前記メディエータプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドに結合し、また
   ｉｉ．少なくとも１つの検出分子に対する親和性を有し、この場合前記メディエータは、前記検出分子との相互作用によって前記メディエータプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドから放出された後に、検出可能なシグナルを引き起こす
   メディエータである
   ことを特徴とする、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むメディエータプローブ。
2. メディエータプローブおよび／またはメディエータの前記第１のオリゴヌクレオチドがシグナル発生のためのマーカーを含まないことを特徴とする、請求項１に記載のメディエータプローブ。
3. メディエータプローブおよび／またはメディエータの前記第１のオリゴヌクレオチドが、シグナル発生のための１つ以上のマーカー、好ましくは蛍光分子、レドックス分子、発光分子または他のシグナル発生ユニットを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のメディエータプローブ。
4. 前記少なくとも１つの検出分子が１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのメディエータと相互作用する少なくとも１つの第１の領域、ならびに
   ａ）蛍光アクセプタまたは蛍光ドナーおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学的保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第２の領域、および／または
   ｂ）蛍光ドナーもしくは蛍光アクセプタおよび／または固相に結合するための化学基および／または化学保護基および／またはレドックス修飾および／または発光修飾を含む第３の領域、
   または
   ｃ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを有する少なくとも１つの第１のプローブと相互作用する少なくとも１つの第４の領域、および／または
   ｄ）蛍光ドナーおよび／または蛍光アクセプタを含む少なくとも１つの第２のプローブと相互作用する少なくとも１つの第５の領域
   を含むことを特徴とする、請求項１〜３の一項に記載の少なくとも１つのメディエータプローブおよび少なくとも１つの検出分子を含むシステム。
5. 前記検出分子がヘアピン構造を有することを特徴とする、請求項４に記載のシステム。
6. 以下の工程、
   ａ）請求項１〜３に記載の少なくとも１つのメディエータプローブおよび／または請求項４または５に記載のシステムを準備する工程、
   ｂ）前記少なくとも１つのメディエータプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドの前記プローブ領域を、前記鋳型分子および／または前記標的分子の配列へ結合する工程、
   ｃ）前記少なくとも１つのメディエータプローブおよび／または前記鋳型分子および／または前記標的分子の前記第１のオリゴヌクレオチドを増幅する工程、
   ｄ）少なくとも１つの補助分子によって少なくとも１つのメディエータを放出する工程、
   ｅ）前記少なくとも１つの放出されたメディエータの前記少なくとも１つの検出分子への任意選択の結合工程、および
   ｆ）信号の変化を検出する工程
   を含む、少なくとも１つの標的分子を検出する方法。
7. 少なくとも１つのメディエータが前記検出分子の前記第１の領域に結合し、少なくとも１つの補助分子によって酵素により伸長され、前記補助分子が好ましくは前記結合されたメディエータの前記３’末端に結合し、それによって前記検出分子において物理的または化学的に測定可能な変化が起こることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記メディエータプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドの前記３’末端が、前記メディエータプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドの前記プローブ領域が前記鋳型分子および／または前記標的分子の配列と結合した後、補助分子によって酵素により伸長されることを特徴とする、請求項６または７の一項に記載のプロセス。
9. 前記メディエータプローブの前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記鋳型分子および／または標的分子の前記増幅が等温または非等温増幅法によって行われることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載のプロセス。
10. 前記検出分子が少なくとも１つの蛍光または発光修飾を有し、前記少なくとも１つのメディエータとの前記反応の後、前記蛍光または発光修飾が前記検出分子から補助分子により切断され、および／または前記検出分子の前記ヘアピン構造の前記５’末端が除去され、および／または前記ヘアピン構造が広げられ、前記蛍光シグナルまたは発光シグナルの変化が前記検出分子で検出されることを特徴とする、請求項６〜９の一項に記載の方法。
11. いくつかのメディエータが、メディエータプローブにつき使用され、および／またはいくつかのメディエータプローブおよび／またはいくつかの検出分子が、標的分子につき使用されることを特徴とする、請求項６〜１０の一項に記載の方法。
12. 前記少なくとも１つの補助分子がＤＮＡ鎖分離効果および／または重合効果を有し、前記補助分子が好ましくは鎖置換ポリメラーゼであることを特徴とする、請求項６〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記標的分子および／または前記鋳型分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、アプタマーおよび／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される生体分子であることを特徴とする、請求項６〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記補助分子が、ポリメラーゼ、触媒、タンパク質、核酸、天然物質、酵素、酵素系、細胞溶解物、細胞成分、細胞成分から誘導される誘導体、および／または合成分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６〜１３のいずれかに記載のプロセス。
15. 蛍光、リン光、発光、質量、吸収、光の散乱、導電率、酵素活性および／または親和性、電気化学ポテンシャルもしくはシグナル、屈折率の測定可能な変化が、表面プラズモン、磁気緩和、磁気特性、インピーダンスまたは静電容量を誘発し、固定化または非固定化検出分子と少なくとも１つのメディエータとの間の直接的または間接的相互作用によって起こることを特徴とする、請求項６〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記少なくとも１つのメディエータの前記放出が、等温または非等温増幅方法による前記少なくとも１つのメディエータの増幅によって検出されることを特徴とする、請求項６〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記少なくとも１つの放出されたメディエータが配列決定によって検出されることを特徴とする、請求項６〜１６の一項に記載の方法。
18. 前記少なくとも１つの放出されたメディエータがハイブリダイゼーションによって前記検出分子に結合し、前記検出分子に結合した後に補助分子によって任意選択的に伸長され、次いで融解曲線分析が行われることを特徴とする、請求項６〜１７の一項に記載のプロセス。