CN105803074A - 一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针，由两条5ˊ端序列完全互补的寡核苷酸链构成，中间为双链区，两端为单链臂。本发明探针结构简单、设计合理，在扩增反应中可同时充当扩增引物和信号探针用，无须对其3ˊ端进行化学修饰，避免了额外设计探针的过程。该探针利用核苷酸聚合酶的链置换活性，既可实现对核酸等温扩增如等温多自配引发扩增的高灵敏性实时荧光检测，又可结合离子指示剂如羟基萘酚蓝构建可视化双荧光的产物检测，并具备构建单管多重核酸等温扩增实时荧光检测的潜力，为生物、医学和化学等相关标志物诊断或检测研究提供了新的核酸荧光探针类型。

Description

一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种可被双向链置换的引物型核酸荧光探针。
背景技术
随着化学合成核酸技术的不断发展，利用核酸探针进行相关研究已成为当今生物和医学领域常用分子生物学技术之一。核酸荧光探针则是对特定的核酸探针进行荧光基团标记，通过记录荧光信号的变化来分析和检测对应目标分子的一种核酸探针形式。作为最常用的信号转导媒介，核酸荧光探针具备分析灵敏度高、检测手段简单和对生物分子影响较小等优点，现已用于检测蛋白质分子、核酸片段分子、生物小分子和无机离子等。到目前为止，核酸荧光探针多为寡核苷酸探针，长度一般在18～50个碱基之间，如TaqMan探针、分子信标(Molecularbeacon)探针、相邻探针等。
TaqMan探针是核酸扩增中使用最为广泛的一种核酸荧光探针类型，常用于实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timefluorescencequantitationpolymerasechainreaction，qPCR)，以实现高灵敏、高特异性的核酸定量检测。在TaqMan荧光探针中，寡核苷酸的5'末端标记有荧光报告基团，而3'末端连有淬灭基团。当探针处于完整状态时，报告基团被激发的荧光信号被淬灭基团所吸收，表现为荧光淬灭。随着qPCR的进行，ThermusaquaticusDNA聚合酶(Taq酶)的5'－3'外切酶活性(即具有5'－3'方向水解磷酸二酯键活性)将识别上模板的探针水解酶切而打破了探针的完整性，使荧光基团和淬灭基团分离，表现为荧光生成，并通过监测所生成的荧光信号，来实现信号的累积与qPCR产物形成的实时同步。TaqMan探针虽然被广泛应用于生物和医学相关的检测研究，但仍存在不足，主要体现在背景荧光值较高，因为荧光共振能量转移的效率易受寡核苷酸长度影响。此外，TaqMan探针不能应用到以BacillusstearothermophilusDNA聚合酶(Bst酶)链置换活性构建的核酸等温扩增方法中，因为Bst酶缺乏5'－3'的外切酶活性，无法酶切水解识别上模板的核酸链。同TaqMan探针类似，分子信标探针也是在两端分别标有荧光基团和淬灭基团的寡核苷酸链，但其一般呈茎-环结构，包含15～30个碱基的目标识别区(与目标序列互补)和两端自身互补配对的茎部。无目标序列时，分子信标两端标记的荧光基团由于配对与淬灭基团相近而被淬灭；当目标序列存在时，环与目标序列杂交配对，破坏其茎部双链，导致两端分离和荧光淬灭消失。分子信标探针的荧光共振能量转移效率较高，可实现对目标物的高灵敏、高特异的实时监测，但是该探针的设计要求高，需要相对繁琐的优化过程。虽然信标探针可应用于等温扩增检测，但由于酶的链置换作用，仪器所记录的荧光信号实质是一种混合信号，即识别目标时产生的正信号和被置换后再次呈茎-环结构时的负信号的信号净值，无法真正实时同步扩增产物的形成。相邻探针则是由两条标记的寡核苷酸链组成，其中一条标有荧光基团，另一条标有淬灭基团。无目标DNA分子存在时，探针处于游离状态，具有很强的荧光信号。当目标DNA分子不断累积时，两条探针在相邻位置处与目标DNA互补，其末端标记的荧光基团由于距离靠近被相邻的淬灭基团所淬灭，通过荧光信号的显著降低来分析目标分子。然而，相邻探针也存在荧光共振能量转移效率低、背景信号偏高、设计高效探针难度大的缺点。而且，相邻探针很难被应用于核酸等温扩增检测，需要对其3'端进行化学修饰以阻断延伸。在核酸扩增中，上述核酸荧光探针均属额外添加物，即既不参与扩增，也不引导扩增，只充当信号放大的媒介。因此，研究人员不仅要设计高效扩增所用的引物，还要合理设计信号指示用的荧光探针，这一定程度上增加了设计整体难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针，该探针由两条寡核苷酸链构成，二者5'端序列完全互补配对形成探针的双链区，而3'端序列无配对形成探针的两条单链臂，其中一条寡核苷酸链的5'端处某个核苷酸标记有荧光基团(或淬灭基团)，另一条寡核苷酸链的中间参与配对的某个核苷酸标记有淬灭基团(或荧光基团)，在扩增反应中可同时充当扩增引物和信号探针用。
作为优选结构，上述5'端处某个核苷酸是指5'端处最末尾核苷酸，上述参与形成双链区的某个核苷酸是指与5'端处最末尾核苷酸互补配对的核苷酸。
本发明的另一个目的是提供所述一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的制备方法，通过以下步骤实现：
(a)在60-65℃反应温度和反应缓冲液[其组成为0.8M甜菜碱、20mMTris-HCl(pH8.825℃)，50mMKCl，10mM(NH4)2SO4，8mMMgSO4，0.1％Tween-20和/或1.4mMdNTPs]的条件下，两条寡核苷酸链的5'端序列完全互补配对，形成探针的双链区，而没有配对的3'端序列各自形成探针的单链臂。单链臂序列与目标核酸序列的对应部分互补，即组成探针的两条寡核苷酸链可充当引物以启动扩增。在探针处于完整状态时，双链区的荧光基团与淬灭基团由于距离靠近而发生荧光共振能量转移，荧光被淬灭。
(b)当目标核酸序列存在时，探针的两条单链臂序列分别能与目标核酸序列的对应部分互补配对，以促发扩增；
(c)上游探针一端的单链臂识别目标核酸并在核苷酸聚合酶的作用下不断延伸，其延伸产物的下游序列可被下游探针的另一条单链臂识别并不断延伸；
(d)当其延伸至上游探针的双链区时，由于核苷酸聚合酶的链置换活性，上游探针中未识别模板的寡核苷酸链被置换出来，使得荧光基团与淬灭基团分离，淬灭消失，荧光产生；
(e)当上游探针中识别模板的寡核苷酸链的双链区序列与目标核酸序列中单链臂识别区之间的部分序列互补时，下游探针延伸产物的3'端序列可发生分子内回转杂交，促发自我连续延伸，以形成单链臂识别序列不断重复的扩增子，被探针识别，以产生不断累积的荧光信号。
由于探针两端的单链臂均能识别目标序列，即可实现两个方向的上述类似的链置换过程，且在反应中既充当引物又充当探针，故称之为“可被双向链置换的引物型核酸荧光探针”。
本发明的另一个目的是提供所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针在构建核酸等温扩增的实时和可视化检测中的应用。
当标记的荧光基团为FAM基团时，本发明的探针可与羟基萘酚蓝染料结合实现对扩增产物的双荧光可视化检测，即在蓝光激发下，扩增溶液在反应前由于探针的FAM信号被淬灭只呈现羟基萘酚蓝染料介导的红色荧光，当反应结束后，探针FAM信号显著增高，而羟基萘酚蓝染料介导的红色荧光因镁离子降低而变得微弱，整个溶液则呈现由FAM介导的绿色荧光，从而实现荧光由红色向绿色的双荧光可视化产物终点检测。
本发明提供的一种可被双向链置换的引物型核酸荧光探针，是对目前核酸荧光探针的改进和补充，具有结构简单、指示灵敏度高的特点，无须额外设计探针，可用于构建核酸等温扩增的实时和可视化检测。
当目标核酸序列存在时，上游探针一端的单链臂识别目标核酸并在核苷酸聚合酶的作用下不断延伸，其延伸产物的下游序列可被下游探针的另一条单链臂识别并不断延伸。当其延伸至上游探针的双链区时，由于核苷酸聚合酶的链置换活性，上游探针中未识别模板的寡核苷酸链被置换出来，使得荧光基团与淬灭基团分离，淬灭消失，荧光产生。由于探针两端的单链臂均能识别目标序列，即可实现两个方向的上述类似的链置换过程，且在反应中既充当引物又充当探针，故称之为“可被双向链置换的引物型核酸荧光探针”。
当上游探针中识别模板的寡核苷酸链的双链区序列与目标核酸中单链臂识别区之间的部分序列互补时，下游探针延伸产物的3'端序列可发生分子内回转杂交，促发自我连续延伸，以形成单链臂识别序列不断重复的扩增子。这些扩增子同样可被探针识别，以产生不断累积的荧光信号。通过记录所生成的荧光信号，扩增产物的累积可被实时同步。特别地，除了探针外，额外加入一对加速引物和一对外引物可大大提高扩增效率和加快反应速度，使得荧光信号呈指数式增长。换言之，本发明的核酸荧光探针，特别适合用于IMSA的实时检测。有关IMSA的详细介绍，可见专利CN104388581A。
反应过程中，核苷酸被酶聚合产生的焦磷酸根离子能与体系中镁离子形成焦磷酸镁沉淀，导致游离镁离子下降，而离子指示剂HNB可随镁离子的减少出现肉眼可见的颜色变化(由蓝紫色向天蓝色转变)。通过波长为455nm的蓝光对含HNB的等温扩增溶液进行激发时，溶液可发出较强的红色荧光(在610nm处有最大发射光强)，且红色荧光的强度随镁离子下降而变弱。因此，含HNB的等温扩增溶液在反应前可被特定强度的蓝光激发呈现较强的红色荧光，而扩增反应后，溶液则呈较弱的红色荧光。与之相反，本发明的核酸荧光探针，在扩增前由于信号淬灭，荧光强度微弱，而扩增后淬灭不断消失，荧光强度显著增高。于此，当标记的荧光基团为FAM(其也能被波长为455nm的蓝光激发)基团时，本发明的探针可与HNB结合实现对扩增产物的双荧光可视化检测，即在蓝光激发下，扩增溶液在反应前由于探针的FAM信号被淬灭只呈现HNB介导的红色荧光；当反应结束后，探针FAM信号显著增高，而HNB介导的红色荧光因镁离子降低而变得微弱，整个溶液则呈现由FAM介导的绿色荧光，从而实现荧光由红色向绿色的转变。该可视化检测的最大优势在于，FAM标记的本探针和HNB可被固定波长的蓝光同时激发，无需另设激发通道。
上述上游探针和下游探针实为同一种探针，也可为同一个探针。
本发明的探针在构建实时或双荧光可视化IMSA扩增时，无须特定步骤，只需将探针、HNB、一对外引物、一对加速引物、核苷酸聚合酶、反应缓冲液等成分制成混合液，待混合液等份分配后加入目标核酸序列，在一定温度条件下维持一定时间，使探针充分发挥作用、引物与目标核酸序列结合充分、聚合酶充分发挥聚合和链置换活性即可。
本发明所述目标核酸为DNA或RNA构成的单链或双链序列或由二者组成的复合序列。
本发明所述探针是具特定结构的两条寡核苷酸序列，其5'端序列完全互补配对形成双链区，其3'端序列各自形成探针的单链臂。
上述两条寡核苷酸序列中，一条寡核苷酸链的5'端处某个核苷酸标记有荧光基团(或淬灭基团)，另一条寡核苷酸链中参与形成双链区的某个核苷酸标记有淬灭基团(或荧光基团)。在探针完整时，荧光基团与淬灭基团由于距离靠近而发生荧光共振能量转移，荧光被淬灭。
上述荧光基团包括但不限于FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、TET等，淬灭基团包括但不限于TAMRA、BHQ、Dabcyl等。
上述单链臂的序列与目标核酸序列的对应部分互补，能充当引物以启动扩增，并参与扩增。
上述双链区的序列可与目标核酸中单链臂识别区之间的部分序列互补，使其被延伸产物3'端序列发生分子内回转杂交，以促发自我连续延伸，继而形成单链臂识别序列不断重复的扩增子。该序列也可是与目标核酸序列无关的其他核酸序列。
本发明所述核苷酸聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶，包括但不限于Bst系列DNA聚合酶(大片段、Bst2.0、Bst2.0WarmStart和Bst3.0)、phi29聚合酶、Vent(exo-)聚合酶、KlenowDNA聚合酶等。
本发明所述反应缓冲液主要用于提供合适的反应环境，使聚合酶发挥聚合核苷酸和链置换功能，并维持核酸荧光探针结构的稳定。
本发明提供了一种可被双向链置换的引物型核酸荧光探针，在反应中既可充当扩增引物，又可基于荧光共振能量转移在酶的链置换作用下发挥探针功效。该探针无须额外探针设计过程，特别适合用于IMSA的实时荧光检测。此外，荧光报告基团标记为FAM的探针能结合离子指示剂HNB建立双荧光(红色与绿色的转变)可视化产物检测。通过标记不同荧光报告基团，该探针还具备构建单管多重核酸等温扩增实时荧光检测的潜力，为相关检测研究提供了新的核酸荧光探针类型。
本发明基于荧光共振能量转移构建了一种可被双向链置换的引物型核酸荧光探针。该探针结构简单、设计难度低，在扩增反应中可同时充当扩增引物和信号探针用，无须对其3'端进行化学修饰，也避免了额外设计探针的过程。该探针利用了核苷酸聚合酶的链置换活性，既可实现对核酸等温扩增如等温多自配引发扩增(Isothermalmultiple-self-matching-initiatedamplification，IMSA)的高灵敏性实时荧光检测，又可结合离子指示剂如羟基萘酚蓝(Hydroxynaphtholblue，HNB)建立双荧光可视化产物检测，并具备构建单管多重核酸等温扩增实时荧光检测的潜力，为生物、医学和化学等相关标志物诊断或检测研究提供了新的核酸荧光探针类型。
附图说明
图1为本发明所述探针的结构示意图(以优选结构为例)。箭头代指延伸方向，下同。图中A为荧光报告基团在5'端最末尾核苷酸；B为淬灭基团在5'端最末尾核苷酸。
图2为本发明探针作用机制示意图(以优选结构且荧光基团在5'端最末尾核苷酸为例，下同)。图中A为上下游探针为两个同类探针，且识别一条目标核酸序列时的作用机制；B为上下游探针为同一个探针，且识别一条目标核酸序列时的作用机制；C为上下游探针为同一个探针，但识别两条目标核酸序列时的作用机制。特注，上下游探针为两个同类探针，且分别识别目标核酸序列时的作用机制同A、B、C类似，故略去。
图3为实施例1中本发明探针所发出的荧光信号随温度变化的实时强度变化及其速率图。
图4为实施例2中本发明探针介导的IMSA针对不同浓度目标核酸序列及其他非目标核酸序列进行扩增的实时荧光强度图。其中1～8指代每反应管分别为5.8×107～5.8×100拷贝数(cpt)的目标核酸序列的扩增相对荧光强度变化，9指代含HPV基因组DNA的阴性指控组相对荧光强度变化，10指代含人类基因组DNA的阴性指控组相对荧光强度变化，11指代含无菌水的空白组相对荧光强度变化，12指代含PBS缓冲液的空白组相对荧光强度变化。
图5为实施例3中本发明探针结合HNB介导的IMSA实时荧光变化图及其扩增产物荧光成像图。图中A为实时荧光变化图，其中阳性测试1～4为对同一浓度目标核酸序列(每反应管5.8×107拷贝数)的四次重复测试，空白对照1～4为对以无菌水作为模板的四次重复测试；B为荧光成像图，其中左边四个孔对应阳性测试1～4，右边四个孔对应空白对照1～4。
具体实施方式
本发明结合附图，通过具体实施例来具体说明本发明。本领域的技术人员应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
在实施例中，待扩增目标核酸序列为基于pUC57质粒人工构建的含280bp乙型肝炎(HBV)S基因的克隆DNA。通过实时荧光信号变化验证时，可被双向链置换的引物型探针(简称为探针，下同)所标记的荧光基团为FAM和淬灭基团为Dabcyl。本实施例子选用的探针结构，其组成参见图1。
具体实施如下：
实施例1(探针稳定性验证)
本验证实例中通过对两条含标记基团的引物(一条标记为FAM荧光基团，另一条标记为Dabcyl淬灭基团，分别记为FAM-primer-1和Dabcyl-primer-1)进行熔解曲线分析来判断探针在60～65℃的等温反应体系中的稳定性。本探针结构组成参见附图1，具体步骤如下：
步骤1：取5个EP管，各加入21μL反应缓冲液，分别标号为A、B、C、D、E；
步骤2：往5管内各加入2.0μLFAM-primer-1，其体系终浓度为1.6μM；
步骤3：往5管内各加入2.0μLDabcyl-primer-1，其体系终浓度为1.6μM；
步骤4：将5管溶液充分混合后，置于37℃孵育10分钟。然后，放置于ABI7900HT实时荧光定量分析仪中，进行熔解曲线分析(温度从50℃不断梯度升至94℃)。
步骤5：记录与分析实验结果，绘制熔解曲线图。
上面所述反应缓冲液组成为0.8M甜菜碱、1.4mMdNTPs、1×等温扩增缓冲液、6mMMgSO4和无菌水9.5μL；
上面所述1×等温扩增缓冲液组成为20mMTris-HCl(pH8.825℃)，50mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Tween-20，下同。
上述组成探针的FAM-primer-1和Dabcyl-primer-1的序列信息如下：
FAM-primer-1，
5'-FAM-AGGTTTTGCATGGTCCGGTG -3'(SEQIDNo.1)(下划线显示为形成探针双链区的序列，FAM为标记在碱基上的荧光基团，黑体字母显示为可识别目标核酸序列的单链臂，下同)；
Dabcyl-primer-1，
5'-CACCGGACCATGCAAAACC(Dabcyl-T) -3'(SEQIDNo.2)(Dabcyl为标记在碱基上的淬灭基，下同)；
熔解曲线结果即本发明探针所发出的荧光信号随温度变化的实时强度变化及其速率图，如附图3所示。由图可见，等量的探针引物FAM-primer-1和Dabcyl-primer-1在50℃以下时其相对荧光强度几乎为零，即表明双链区可充分形成。当温度升至65℃时，荧光信号出现急剧上升，说明双链区正在被破坏。当温度达到约68℃时，荧光信号的速率达到最大，即本探针的熔解温度。而后随着温度的升高，信号变化速度变慢，在72℃附近时信号强度达到最大，说明探针的双链区被完全解链。随着温度的继续升高，荧光强度由于标记基团与淬灭基团分子活力加剧，随机碰撞淬灭概率增加，而出现下降趋势。
上述结果说明，本发明探针的熔解温度约为68℃。因此，在扩增温度为60～65℃时，大部分探针的双链结构仍稳定存在，且其完全解链即72℃时的荧光强度要高出60～65℃时近5倍左右。
实施例2(本发明探针介导的IMSA)
本实施例的目的是验证本发明探针介导的IMSA针对不同浓度目标核酸序列及其他非目标核酸序列进行扩增的实时检测能力，即其分析灵敏度与特异性能力。本实施例中探针结构组成参见附图1，探针的作用机制见附图2，而IMSA的反应原理图详见专利CN104388581A。
具体步骤如下：
步骤1：取1个EP管，加入13μLFAM-primer-2(浓度为20μM)和13μLDabcyl-primer-2(浓度为20μM)，混匀后制成探针溶液，避光置于37℃孵育约10分钟。
步骤2：取12个EP管，各加入20.5μL反应混合液，标号为1～12；往各管各加入2μL上述探针溶液；
步骤3：往1～8管内分别依次加入2.5μL以十倍为梯度进行稀释的目标核酸序列Target，其浓度分布为每反应管5.8×107～5.8×100拷贝数(cpt)，9号管加入2.5μLHPV基因组DNA，10号管加入2.5μL人类基因组DNA，11号管加入2.5μL无菌水，12号管加入2.5μLPBS缓冲液。
步骤4：将上述12管溶液置于ABI7900HT实时荧光定量分析仪中63℃孵育90分钟，并记录实时荧光信号图。
步骤5：记录与分析实验结果，绘制实时荧光曲线图。
上述反应混合组成为但不限于无菌水4μL、0.8M甜菜碱、1.4mMdNTPs、1×等温扩增缓冲液、6mMMgSO4、0.32U/μLBstDNA聚合酶、终浓度均为0.2μM的外引物DsF和DsR、终浓度均为1.6μM的加速引物SteF和SteR。
上述目标核酸序列Target为基于pUC57质粒人工构建的含乙型肝炎(HBV)S基因的克隆DNA(NCBI中序列ID为KM455695.1，范围从第221中核苷酸至500个核苷酸)。
上述探针组成引物FAM-primer-2和Dabcyl-primer-2的序列同实施例1中的FAM-primer-1和Dabcyl-primer-1。而IMSA外引物(DsF和DsR)和加速引物(SteF和SteR)序列如下所示：
DsF，
5'-TTGTTGATGATCCTGGAATTAGAGGGCCTCATCTTCTTGTTGGT-3(SEQIDNo.3)；
DsR，
5'-GCACAACTCCTGCTCAAGGGATGGGATGGGAATACAGG-3(SEQIDNo.4)；
SteF，
5'-TTGTTGATGATCCTGGAATTAGAGG-3(SEQIDNo.5)；
SteR，
5'-GCACAACTCCTGCTCAAGG-3(SEQIDNo.6)；
实时荧光结果如图4所示，
本探针介导的IMSA能对低至5.8×100拷贝数每反应管的目标核酸序列进行扩增，表现为1～8管内本探针发出的荧光信号均呈现指数式增长，而9-10管内的非目标核酸分子和11-12管内的无核酸分子的对照组均呈现水平直线式荧光变化图。
该结果说明，本探针可介导IMSA方法对目标核酸序列进行高灵敏度和特异性的实时荧光检测。
实施例3(本发明探针结合HNB介导的IMSA)
本实施例的目的是验证本发明探针结合HNB可建立对IMSA进行实时荧光检测及其扩增产物的双荧光可视化检测。本实施例中探针结构组成参见附图1，探针的作用机制见附图2，而IMSA的反应原理图详见专利CN104388581A。双荧光建立的机制，详见发明内容。
具体步骤如下：
步骤1：取1个EP管，加入9μLFAM-primer-2(浓度为20μM)和9μLDabcyl-primer-2(浓度为20μM)，混匀后制成探针溶液，避光置于37℃孵育约10分钟。
步骤2：取8个EP管，各加入20.5μL反应混合液和，标号为1～8；往各管各加入2μL上述探针溶液；
步骤3：往1～4管内分别加入2.5μL目标核酸序列Target，其浓度为每反应管5.8×107拷贝数；5～8号管加入2.5μL无菌水。
步骤4：将上述8管溶液置于ABI7900HT实时荧光定量分析仪中63℃孵育90分钟，并记录实时荧光信号图。
步骤5：将上述扩增完成后的8管溶液置于CRI小动物成像装置进行荧光成像图拍摄，并记录与分析实验结果，绘制实时荧光曲线图。
上述反应混合组成为但不限于120μMHNB、无菌水4μL、0.8M甜菜碱、1.4mMdNTPs、1×等温扩增缓冲液、6mMMgSO4、0.32U/μLBstDNA聚合酶、终浓度均为0.2μM的外引物DsF和DsR、终浓度均为1.6μM的加速引物SteF和SteR。
上述目标核酸序列Target、探针组成引物FAM-primer-2和Dabcyl-primer-2以及IMSA外引物(DsF和DsR)和加速引物(SteF和SteR)序列均同于实施例2。
结果如附图5A所示，1～4管内呈现指数式荧光变化图，四条曲线分布比较集中，而5～8管内呈现水平直线式荧光变化图。而荧光成像图(附图5B示)显示，1～4管扩增后溶液均呈明亮的绿色荧光，而5～8管扩增后溶液均呈微弱的红色荧光。
该结果说明，本探针结合HNB介导的IMSA方法既可进行实时荧光检测且重复性测试差异小，又可实现对扩增产物进行双荧光的可视化检测。
通过上述实施例表明，本发明探针可在等温扩增所需温度下稳定形成，可介导IMSA方法对目标核酸序列进行高灵敏度和特异性的实时荧光检测。同时也表明，本发明探针结合离子型指示剂HNB可介导IMSA方法既可进行实时荧光检测，又可实现对扩增产物进行双荧光的可视化检测。该发明探针结构简单、设计难度低，无须额外的复杂设计，也无须考虑对探针进行除标记基团以外的任何末端修饰，在扩增反应中可同时充当扩增引物和信号探针用，是对目前核酸荧光探针的改进和补充，可用于构建核酸等温扩增的实时和可视化检测，并具备构建单管多重核酸等温扩增实时荧光检测的潜力，为生物、医学和化学等相关标志物诊断或检测研究提供了新的核酸荧光探针。

Claims (10)

1.一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针，其特征在于，该探针是由两条寡核苷酸链构成，二者5'端序列完全互补配对形成探针的双链区，而3'端序列无配对形成探针的两条单链臂，而且其中一条寡核苷酸链的5'端处某个核苷酸标记有荧光基团或淬灭基团，另一条寡核苷酸链的中间参与配对的某个核苷酸标记有淬灭基团或荧光基团，在扩增反应中可同时充当扩增引物和信号探针用。
2.根据权利要求1所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针，其特征在于，所述5'端处某个核苷酸是指5'端处最末尾核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(a)在60-65℃反应温度和反应缓冲液[其组成为0.8M甜菜碱、20mMTris-HCl(pH8.825℃)，50mMKCl，10mM(NH4)2SO4，8mMMgSO4，0.1％Tween-20和/或1.4mMdNTPs]的条件下，两条寡核苷酸链的5'端序列完全互补配对，形成探针的双链区，而没有配对的3'端序列各自形成探针的单链臂，在探针处于完整状态时，双链区的荧光基团与淬灭基团由于距离靠近而发生荧光共振能量转移，荧光被淬灭；
(b)当目标核酸序列存在时，探针的两条单链臂序列分别能与目标核酸序列的对应部分互补配对，以促发扩增；
(c)上游探针一端的单链臂识别目标核酸并在核苷酸聚合酶的作用下不断延伸，其延伸产物的下游序列可被下游探针的另一条单链臂识别并不断延伸；
(d)当其延伸至上游探针的双链区时，由于核苷酸聚合酶的链置换活性，上游探针中未识别模板的寡核苷酸链被置换出来，使得荧光基团与淬灭基团分离，淬灭消失，荧光产生；
(e)当上游探针中识别模板的寡核苷酸链的双链区序列与目标核酸序列中单链臂识别区之间的部分序列互补时，下游探针延伸产物的3'端序列可发生分子内回转杂交，促发自我连续延伸，以形成单链臂识别序列不断重复的扩增子，被探针识别，以产生不断累积的荧光信号。
4.根据权利要求3所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的制备方法，其特征在于，所述探针是由两条寡核苷酸链构成，含双链区和单链臂两个部分；所述双链区由5'端序列完全互补配对形成，所述单链臂由3'端序列各自形成。
5.根据权利要求3所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的制备方法，其特征在于，所述目标核酸为DNA或RNA构成的单链或双链序列或由二者组成的复合序列。
6.根据权利要求3所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的制备方法，其特征在于，5'端部分的序列与目标核酸序列相同或互补或无关，3'端部分的序列均与目标核酸序列的某一位点互补配对，以进行引物延伸。
7.根据权利要求3所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光基团包括但不限于FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、TET，所述淬灭基团包括但不限于TAMRA、BHQ、Dabcyl。
8.根据权利要求3所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的制备方法，其特征在于，所述核苷酸聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶，包括但不限于Bst系列DNA聚合酶、phi29聚合酶、Vent(exo-)聚合酶、KlenowDNA聚合酶，其中Bst系列DNA聚合酶为大片段、Bst2.0、Bst2.0WarmStart和Bst3.0。
9.根据权利要求1所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针在构建核酸等温扩增的实时和可视化检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针的应用，其特征在于，所述检测是基于FAM基团标记的探针与羟基萘酚蓝染料结合加入到扩增溶液中建立，被同一波长的激发光同时激发。
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