JP2021522818A - クラミジア・トラコマチスの増幅及び検出のためのポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、2018年5月9日に出願された米国仮出願第62/669,236号及び2018年5月10日に出願された米国非仮出願第15/976,733号の利益を主張し、これらの開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS−ウェブを介して提出されており且つ全体が本明細書で参照により組み込まれる配列表を含有する。2019年5月8日に作成された該ASCIIコピーは、TSM−045WO_CRF_sequencelisting.txtと名付けられ、サイズが、29,937バイトである。
本発明は、分子生物学及び核酸化学の分野に関する。本発明は、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)などの病原体を検出するための方法及び試薬を提供し、従って、医学的診断及び予測の分野にも関連する。特に、本発明は、クラミジア・トラコマチスを増幅及び検出するためのポリヌクレオチド及び方法に関する。
性感染症(STI)のための迅速で手頃なサンプルイン−アンサーアウトのポイントオブケア(POC)診断プラットフォームの開発に対する差し迫ったニーズがある。毎年世界中で15〜49歳の男性及び女性において、著しい罹患率及び死亡率を引き起こす治療可能なSTI、すなわち、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)(NG)、クラミジア・トラコマチス(CT)、トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)(TV)、及び梅毒によるものの4億9,900万人を超える新規患者が発生すると、世界保健機関(WHO)は推定する。サハラ以南のアフリカの女性における未処置の淋菌及びクラミジア感染症は、不妊症の介入を求める女性における不妊症の最大85%の原因に関係があるとされている。
本発明は、一部の実施形態では、セット1〜セット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物を包含する。一部の実施形態では、組成物はさらに、プローブを含む。一部の実施形態では、プローブは、標識を含む。一部の実施形態では、プローブは、標識ポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、標識は、好ましくは、ポリヌクレオチドの末端に共有結合しているフルオロフォアである。特に好ましい実施形態では、プローブまたはポリヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである。一実施形態では、フルオロフォアは、FAMであり、クエンチャーは、BHQ1である。代替の実施態様では、フルオロフォアは、ATTO565またはAlexa594であり、クエンチャーは、BHQ1またはBHQ2である。
低濃度の種(試料中の数個の分子または微生物まで)の検出は、医学における課題である。本発明は、クラミジア・トラコマチスの選択的検出に関する。特に、核酸増幅、特に、RT−LAMP、を利用する新しい検出方策、及びモレキュラービーコン検出に基づいて、クラミジア感染症は、本明細書に記載の方法及び試薬を使用して診断することができる。標的領域としてRNA(リボソームRNA(rRNA)またはメッセンジャーRNAのいずれか)を使用すると、C.トラコマチスゲノム毎の標的の複数のコピーが提供される。従って、これにより、ゲノム毎の複数のコピーで存在する場合であっても、ゲノムDNAを標的とする手法と比較して、本明細書に記載のアプローチを利用する試料中のC.トラコマチスの検出が容易になる。加えて、本明細書に記載のモレキュラービーコン検出試薬は、さらなる特異性を提供し、ほとんどの場合、オフターゲット増幅DNAに結合することができず、それにより、例えば、偽陽性の出現を最小限に抑える。この特異性は、とりわけ、以下に提供される実施例4に示される。本発明の他の多くの特徴も、本明細書に記載される。
細菌細胞におけるリボソーム遺伝子の構成的且つ高レベルの発現を考慮して、これらの遺伝子、特に、16S及び23S遺伝子を増幅アッセイの標的として選択した。
2つの異なる濃度(103IFU/mL及び10IFU/mL)の滴定されたC.トラコマチス(Z054株、D−UW3(Zeptometrix)またはATCC血清型D株VR−885)を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。標準的な抽出方法を使用して、核酸を抽出し、表2に記載されるLAMPプライマーセットを使用して、試料を増幅した。増幅産物の検出のために、YoPro(商標)色素(Life Technologies;緑色蛍光カルボシアニン核酸染色)を使用した。この例では、25μlの反応物は、4.8mMまたは6mMのMgCl2、1.4mMまたは1.6mMのdNTP、200nMのYO−PRO−1色素(Life Technologies)、プライマー(存在する場合、0.2μMのF3及びB3;1.6μMのFIP及びBIP;存在する場合、0.4〜0.8μMのLF及びLB)、8または12単位のBst2ポリメラーゼ(New England Biolabs)、7.5単位のRTx Warmstart(逆転写酵素;New England Biolabs)、ならびに抽出された核酸(テンプレートとして)または水(テンプレートなしの対照として)が補充された1Xの等温増幅緩衝液(New England Biolabs)を含有していた。反応物を63°または65℃でインキュベートし、RocheリアルタイムLightcycler96(Roche)を使用して、反応動態を監視した。
上記のプライマーセットの一部及びインターカレーション色素を含有する増幅反応物は、水もしくは陰性尿抽出物、またはアッセイ時間のカットオフウィンドウの可変間隔内の、時間の0%〜75%の範囲の頻度で、テンプレートとしてC.ニューモニエ(C.pneumoniae)もしくはC.シタッシ(C.psittaci)などの密接に関連する種のDNA(表4)を使用する場合、増幅産物の検出をもたらした。結果は、陽性になるまでの時間で分類される(「コールなし」は、増幅が全く検出されなかったことを示す)。
滴定されたC.トラコマチスまたは性感染症と一般に関連する生物(例えば、ナイセリア・ゴノレエ)もしくはC.トラコマチスに密接に関連する種(C.ニューモニア(C.pneumonia)もしくはC.シタッシ)を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。細菌ストックをPBSで連続希釈した後、尿マトリックスに所望の濃度で添加した。上記の実施例3に記載の方法に従って、LAMPプライマー及びモレキュラービーコンプローブを含有するRT−LAMP反応におけるテンプレートとして、試験種の対応する抽出された核酸またはDNAを使用した。NTは、未試験の反応を示す。
示されたプライマーセット/モレキュラービーコンの組み合わせの感度を評価するために、RNA分子標準を種々の濃度に希釈した(表8)。標準を、PBS中0.1mg/mLのポリAキャリアRNA(Sigma)で連続希釈し、RTLAMP反応における増幅のためのテンプレートとして使用した。反応の最終濃度は、40、8、または4コピー/uLであった。反応条件は、上記の実施例3に記載されたものと同等であった。増幅シグナルは、4コピー/uLという低い濃度で得られた(表8を参照のこと)。
Claims (104)
- セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
- プローブをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、請求項2に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、及び配列番号130のヌクレオチド6〜27からなる群より選択される配列を含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、請求項2に記載の組成物。
- 前記モレキュラービーコンが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、及び配列番号130のヌクレオチド6〜27からなる群より選択される配列を含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記モレキュラービーコンが、配列番号97〜101及び103〜130からなる群より選択される配列を含む、請求項6に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、請求項7に記載の組成物。
- フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、及び配列番号130のヌクレオチド6〜27からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号97〜101及び103〜130からなる群より選択される配列を含む、請求項9に記載のモレキュラービーコン。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、請求項10に記載の組成物。
- 前記フルオロフォアが、FAMであり、前記クエンチャーが、BHQ1である、請求項9に記載のモレキュラービーコン。
- 試験試料中のクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)の検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。 - 前記標的配列のステップ(b)の前記増幅が、約60℃〜約67℃で15分未満実施される、請求項13に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、10分未満実施される、請求項14に記載の方法。
- 前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、及び配列番号130のヌクレオチド6〜27からなる群より選択される配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97〜101及び103〜130からなる群より選択される配列を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115である、請求項19に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項13に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、5IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、15分未満実施される、請求項21に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、10IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、6分未満実施される、請求項21に記載の方法。
- 請求項1に記載の組成物を含む、キット。
- 鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項24に記載のキット。
- フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97〜101及び103〜130からなる群より選択される配列からなる、請求項24に記載のキット。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号115からなる、請求項26に記載のキット。
- 試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼならびにセット20及びセット24からなる群より選択される配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。 - 前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、及び配列番号130のヌクレオチド6〜27からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97〜101及び103〜130からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項28に記載の方法。
- セット1〜セット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
- プローブをさらに含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記プローブが、標識を含む、請求項32に記載の組成物。
- 前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、請求項33に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号102のヌクレオチド6〜30、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、及び配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、配列番号130のヌクレオチド6〜27、及び配列番号131のヌクレオチド8〜29からなる群より選択される配列を含む、請求項34に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97〜131からなる群より選択される配列を含む、請求項34に記載の組成物。
- 前記標識が、フルオロフォアである、請求項34に記載の組成物。
- 前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、請求項37に記載の組成物。
- 配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号128のヌクレオチド7〜32、及び配列番号129のヌクレオチド4〜27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12、セット14〜27、セット39、セット41〜54、セット66、及びセット68〜81からなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129からなる群より選択される配列を含む、請求項39に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115であり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、請求項40に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20またはセット24である、請求項41に記載の組成物。
- 配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、及び配列番号122のヌクレオチド7〜34からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12〜27、セット39〜54、及びセット66〜81からなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含む、請求項43に記載の組成物。
- 配列番号125のヌクレオチド6〜28及び配列番号126のヌクレオチド7〜28からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12、セット14〜18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41〜45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68〜72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択される配列を含む、請求項45に記載の組成物。
- 配列番号113のヌクレオチド8〜31及び配列番号127のヌクレオチド3〜27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット14〜27、セット41〜54、及びセット68〜81からなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む、請求項47に記載の組成物。
- 配列番号130のヌクレオチド6〜27を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12〜20、セット22〜27、セット39〜47、セット49〜54、セット66〜74、及びセット76〜81からなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130を含む、請求項49に記載の組成物。
- 配列番号102のヌクレオチド6〜30及び配列番号131のヌクレオチド8〜29からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含む、請求項51に記載の組成物。
- 前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、請求項52に記載の組成物。
- 前記モレキュラービーコンが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号102のヌクレオチド6〜30、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、及び配列番号130のヌクレオチド6〜27からなる群より選択される配列を含む、請求項53に記載の組成物。
- 前記モレキュラービーコンが、配列番号97〜配列番号130からなる群より選択される配列を含む、請求項54に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、請求項55に記載の組成物。
- フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号102のヌクレオチド6〜30、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、及び配列番号120のヌクレオチド8〜29からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号99〜配列番号120からなる群より選択される配列を含む、請求項57に記載のモレキュラービーコン。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号99〜配列番号120からなる群より選択される配列からなる、請求項58に記載のモレキュラービーコン。
- 前記フルオロフォアが、FAMであり、前記クエンチャーが、BHQ1である、請求項57に記載のモレキュラービーコン。
- 前記フルオロフォアが、ATTO565またはAlexa594であり、前記クエンチャーが、BHQ1またはBHQ2である、請求項57に記載のモレキュラービーコン。
- 試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット1〜セット81からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。 - 前記標的配列のステップ(b)の前記増幅が、約60℃〜約67℃で30分未満実施される、請求項62に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、15分未満実施される、請求項63に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、10分未満実施される、請求項64に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、6分未満実施される、請求項65に記載の方法。
- 前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、請求項62に記載の方法。
- 前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項62に記載の方法。
- 前記標識が、フルオロフォアである、請求項68に記載の方法。
- 前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、請求項69に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号102のヌクレオチド6〜30、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、配列番号130のヌクレオチド6〜27、及び配列番号131のヌクレオチド8〜29からなる群より選択される配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97〜130からなる群より選択される配列を含む、請求項71に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号128のヌクレオチド7〜32、及び配列番号129のヌクレオチド4〜27からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12、セット14〜27、セット39、セット41〜54、セット66、及びセット68〜81からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129からなる群より選択される配列を含む、請求項73に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115であり、前記配列特異的プライマーセットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、請求項74に記載の方法。
- 前記配列特異的プライマーセットが、セット20またはセット24である、請求項75に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、及び配列番号122のヌクレオチド7〜34からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12〜27、セット39〜54、及びセット66〜81からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125のヌクレオチド6〜28及び配列番号126のヌクレオチド7〜28からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12、セット14〜18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41〜45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68〜72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択される配列を含む、請求項79に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113のヌクレオチド8〜31及び配列番号127のヌクレオチド3〜27からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット14〜27、セット41〜54、及びセット68〜81からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む、請求項81に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130のヌクレオチド6〜27を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12〜20、セット22〜27、セット39〜47、セット49〜54、セット66〜74、及びセット76〜81からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130を含む、請求項83に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号102のヌクレオチド6〜30及び配列番号131のヌクレオチド8〜29からなる群より選択される配列を含み、配列特異的プライマーセットが、セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含む、請求項85に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項62に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、50IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項87に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、5IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項88に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、2IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項89に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、5IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、15分未満実施される、請求項87に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、10IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、6分未満実施される、請求項87に記載の方法。
- 請求項31に記載の組成物を含む、キット。
- 鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項93に記載のキット。
- フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5〜34、配列番号98のヌクレオチド5〜31、配列番号99のヌクレオチド3〜31、配列番号100のヌクレオチド5〜30、配列番号101のヌクレオチド6〜29、配列番号102のヌクレオチド6〜30、配列番号103のヌクレオチド5〜26、配列番号104のヌクレオチド4〜27、配列番号105のヌクレオチド7〜30、配列番号106のヌクレオチド5〜27、配列番号107のヌクレオチド6〜29、配列番号108のヌクレオチド6〜29、配列番号109のヌクレオチド6〜29、配列番号110のヌクレオチド6〜30、配列番号111のヌクレオチド8〜31、配列番号112のヌクレオチド6〜29、配列番号113のヌクレオチド8〜31、配列番号114のヌクレオチド5〜29、配列番号115のヌクレオチド5〜29、配列番号116のヌクレオチド4〜28、配列番号117のヌクレオチド5〜30、配列番号118のヌクレオチド8〜28、配列番号119のヌクレオチド8〜30、配列番号120のヌクレオチド8〜29、配列番号121のヌクレオチド4〜33、配列番号122のヌクレオチド7〜34、配列番号123のヌクレオチド9〜34、配列番号124のヌクレオチド8〜34、配列番号125のヌクレオチド6〜28、配列番号126のヌクレオチド7〜28、配列番号127のヌクレオチド3〜27、配列番号128のヌクレオチド7〜32、配列番号129のヌクレオチド4〜27、配列番号130のヌクレオチド6〜27、及び配列番号131のヌクレオチド8〜29からなる群より選択される配列を含む、請求項94に記載のキット。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号97〜配列番号131からなる群より選択される配列を含む、請求項95に記載のキット。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号97〜配列番号131からなる群より選択される配列からなる、請求項96に記載のキット。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号115からなり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20またはセット24である、請求項97に記載のキット。
- 試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。 - クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項99に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、10IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項100に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることを含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット1〜セット81からなる群より選択される、請求項99に記載の方法。
- 前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97〜配列番号131からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項102に記載の方法。
- 前記増幅産物の有無の検出が、配列番号99〜配列番号120からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項102に記載の方法。
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