JP2024028922A - クラミジア・トラコマチスの増幅及び検出のためのポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
【課題】試験試料中のクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)を検出するための方法及び組成物を提供する。【解決手段】試料中のクラミジア・トラコマチスの有無は、23Sリボソーム遺伝子または遺伝子転写物に結合するプライマー及び/またはプローブ及びまたはモレキュラービーコンを使用する核酸ベースの試験方法により決定される方法である。【選択図】図1
Description
関連出願との相互参照
本出願は、2018年5月9日に出願された米国仮出願第62/669,236号及び2018年5月10日に出願された米国非仮出願第15/976,733号の利益を主張し、これらの開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年5月9日に出願された米国仮出願第62/669,236号及び2018年5月10日に出願された米国非仮出願第15/976,733号の利益を主張し、これらの開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、EFS-ウェブを介して提出されており且つ全体が本明細書で参照により組み込まれる配列表を含有する。2019年5月8日に作成された該ASCIIコピーは、TSM-045WO_CRF_sequencelisting.txtと名付けられ、サイズが、29,937バイトである。
本出願は、EFS-ウェブを介して提出されており且つ全体が本明細書で参照により組み込まれる配列表を含有する。2019年5月8日に作成された該ASCIIコピーは、TSM-045WO_CRF_sequencelisting.txtと名付けられ、サイズが、29,937バイトである。
発明の分野
本発明は、分子生物学及び核酸化学の分野に関する。本発明は、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)などの病原体を検出するための方法及び試薬を提供し、従って、医学的診断及び予測の分野にも関連する。特に、本発明は、クラミジア・トラコマチスを増幅及び検出するためのポリヌクレオチド及び方法に関する。
本発明は、分子生物学及び核酸化学の分野に関する。本発明は、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)などの病原体を検出するための方法及び試薬を提供し、従って、医学的診断及び予測の分野にも関連する。特に、本発明は、クラミジア・トラコマチスを増幅及び検出するためのポリヌクレオチド及び方法に関する。
発明の背景
性感染症(STI)のための迅速で手頃なサンプルイン-アンサーアウトのポイントオブケア(POC)診断プラットフォームの開発に対する差し迫ったニーズがある。毎年世界中で15~49歳の男性及び女性において、著しい罹患率及び死亡率を引き起こす治療可能なSTI、すなわち、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)(NG)、クラミジア・トラコマチス(CT)、トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)(TV)、及び梅毒によるものの4億9,900万人を超える新規患者が発生すると、世界保健機関(WHO)は推定する。サハラ以南のアフリカの女性における未処置の淋菌及びクラミジア感染症は、不妊症の介入を求める女性における不妊症の最大85%の原因に関係があるとされている。
性感染症(STI)のための迅速で手頃なサンプルイン-アンサーアウトのポイントオブケア(POC)診断プラットフォームの開発に対する差し迫ったニーズがある。毎年世界中で15~49歳の男性及び女性において、著しい罹患率及び死亡率を引き起こす治療可能なSTI、すなわち、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)(NG)、クラミジア・トラコマチス(CT)、トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)(TV)、及び梅毒によるものの4億9,900万人を超える新規患者が発生すると、世界保健機関(WHO)は推定する。サハラ以南のアフリカの女性における未処置の淋菌及びクラミジア感染症は、不妊症の介入を求める女性における不妊症の最大85%の原因に関係があるとされている。
C.トラコマチス(C.trachomatis)は、米国で最も一般的な性感染症の原因である。クラミジアは、男性に尿道炎を、女性に骨盤内炎症性疾患、子宮外妊娠、及び不妊症を引き起こし得る。無症候性感染症は、男性及び女性で共に一般的であり、これは、疾患の蔓延を防ぐスクリーニングを必要とする(CDCにより推奨される)。
概要
本発明は、一部の実施形態では、セット1~セット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物を包含する。一部の実施形態では、組成物はさらに、プローブを含む。一部の実施形態では、プローブは、標識を含む。一部の実施形態では、プローブは、標識ポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、標識は、好ましくは、ポリヌクレオチドの末端に共有結合しているフルオロフォアである。特に好ましい実施形態では、プローブまたはポリヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである。一実施形態では、フルオロフォアは、FAMであり、クエンチャーは、BHQ1である。代替の実施態様では、フルオロフォアは、ATTO565またはAlexa594であり、クエンチャーは、BHQ1またはBHQ2である。
本発明は、一部の実施形態では、セット1~セット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物を包含する。一部の実施形態では、組成物はさらに、プローブを含む。一部の実施形態では、プローブは、標識を含む。一部の実施形態では、プローブは、標識ポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、標識は、好ましくは、ポリヌクレオチドの末端に共有結合しているフルオロフォアである。特に好ましい実施形態では、プローブまたはポリヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである。一実施形態では、フルオロフォアは、FAMであり、クエンチャーは、BHQ1である。代替の実施態様では、フルオロフォアは、ATTO565またはAlexa594であり、クエンチャーは、BHQ1またはBHQ2である。
一部の実施態様では、組成物は、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、及び配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号97~131からなる群より選択される配列を含み得る。特定の実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号97~131からなる群より選択される。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号97~131からなる群より選択される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、セット12、セット14~27、セット39、セット41~54、セット66、及びセット68~81からなる群より選択され、組成物は、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号128のヌクレオチド7~32、及び配列番号129のヌクレオチド4~27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。一部の実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129からなる群より選択される配列を含む。一部の実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129である。好ましい実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号115であり、ポリヌクレオチドのセットは、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される。さらにより好ましくは、ポリヌクレオチドのセットは、セット20またはセット24である。
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、セット12~27、セット39~54、及びセット66~81からなる群より選択され、組成物は、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、及び配列番号122のヌクレオチド7~34からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。より詳細には、標識ポリヌクレオチドは、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含み得る。特定の実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される。
一実施態様では、ポリヌクレオチドのセットは、セット12、セット14~18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41~45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68~72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択され、組成物は、配列番号125のヌクレオチド6~28、及び配列番号126のヌクレオチド7~28からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号125または配列番号126である。
別の実施態様では、ポリヌクレオチドのセットは、セット14~27、セット41~54、及びセット68~81からなる群より選択され、組成物は、配列番号113のヌクレオチド8~31、及び配列番号127のヌクレオチド3~27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号113または配列番号127である。
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、セット12~20、セット22~27、セット39~47、セット49~54、セット66~74、及びセット76~81からなる群より選択され、組成物は、配列番号130のヌクレオチド6~27を含む標識ポリヌクレオチドを含む。一部の実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号130を含む。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号130である。
一実施態様では、ポリヌクレオチドのセットは、セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択され、組成物は、配列番号102のヌクレオチド6~30、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含み得る。別の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号102または配列番号131である。
本発明の別の態様は、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンを提供し、ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、及び配列番号120のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む。
本発明のさらに別の態様は、試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する方法を提供し、方法は、(a)試験試料から核酸を抽出すること、(b)鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と、ステップ(a)で抽出された核酸を反応させることにより、標的配列を増幅すること(該配列特異的プライマーセットが、セット1~セット81からなる群より選択される)、ならびに、(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出すること(該増幅産物の存在が、試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す)を含む。一実施形態では、標的配列のステップ(b)の増幅は、約60℃~約67℃で30分未満実施される。好ましくは、増幅ステップは、15分未満、10分未満、または6分未満実施される。一部の実施態様では、反応混合物はさらに、逆転写酵素を含む。一部の実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、100IFU/mL以下、50IFU/mL以下、5IFU/mL以下、または2IFU/mL以下の濃度で試験試料中に存在する。一実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、5IFU/ml以下の濃度で試験試料中に存在し、増幅ステップは、15分未満実施される。別の実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、10IFU/ml以下の濃度で試験試料中に存在し、増幅ステップは、6分未満実施される。
特定の実施形態では、増幅産物の有無の検出は、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、増幅産物をハイブリダイズさせることを含む。好ましい実施態様では、標識は、好ましくは、ポリヌクレオチドの末端に共有結合しているフルオロフォアである。特に好ましい実施形態では、プローブまたはポリヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである。一実施形態では、フルオロフォアは、FAMであり、クエンチャーは、BHQ1である。代替の実施態様では、フルオロフォアは、ATTO565またはAlexa594であり、クエンチャーは、BHQ1またはBHQ2である。本方法は、本明細書に記載の、プライマーセット及び標識ポリヌクレオチドの任意の組み合わせ、例えば、モレキュラービーコン、を使用して実施することができる。図1は、各プライマーセットから得られたアンプリコンに結合することが可能であり、それ故、試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を検出するのに有用である標識ポリヌクレオチド配列、またはモレキュラービーコンを特定する。
本発明のさらに別の態様は、セット1~セット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットはさらに、鎖置換ポリメラーゼ、及び任意に逆転写酵素を含む。特定の実施形態では、キットは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンを含み、ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む。モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号97~配列番号131からなる群より選択される配列を含み得る。一部の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号97~配列番号131からなる群より選択される配列からなる。一実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号115からなり、ポリヌクレオチドのセットは、セット20またはセット24である。
本発明のさらに別の態様は、試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する方法を提供し、方法は、(a)試験試料から核酸を抽出すること、(b)鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と、ステップ(a)で抽出された核酸を10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに、(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出すること、を含み、該増幅産物の存在が、試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す。一部の実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、100IFU/mL以下、50IFU/mL以下、5IFU/mL以下、または2IFU/mL以下の濃度で試験試料中に存在する。特定の実施態様では、増幅ステップは、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と、ステップ(a)で抽出された核酸を反応させること、を含み、該配列特異的プライマーセットが、セット1~セット81からなる群より選択される。そのような実施態様では、増幅産物の有無の検出は、配列番号97~配列番号131からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、増幅産物をハイブリダイズさせることを含み得る。一部の実施態様では、増幅産物の有無の検出は、配列番号99~配列番号120からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、増幅産物をハイブリダイズさせることを含む。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、試験試料は、クラミジア・トラコマチスに加えて、1つ以上の他の微生物を含み、クラミジア・トラコマチス由来の標的配列が1つ以上の他の微生物由来のポリヌクレオチド配列よりも優先的に増幅される。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号1~96のいずれか1つと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%%、少なくとも99.1%、少なくとも99.2%、少なくとも99.3%、少なくとも99.4%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%同一の核酸配列、及び試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する、それらの核酸配列の使用方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、及び配列番号117のヌクレオチド5~30からなる群のうちのいずれか1つと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%%、少なくとも99.1%、少なくとも99.2%、少なくとも99.3%、少なくとも99.4%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%同一の核酸配列、ならびに試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する、それらの核酸配列の使用方法を提供する。
[本発明1001]
セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
[本発明1002]
プローブをさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、本発明1002の組成物。
[本発明1006]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1005の組成物。
[本発明1007]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
[本発明1010]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1009のモレキュラービーコン。
[本発明1011]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
前記フルオロフォアが、FAMであり、前記クエンチャーが、BHQ1である、本発明1009のモレキュラービーコン。
[本発明1013]
試験試料中のクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)の検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1014]
前記標的配列のステップ(b)の前記増幅が、約60℃~約67℃で15分未満実施される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記増幅ステップが、10分未満実施される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1017]
前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1013の方法。
[本発明1018]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1013の方法。
[本発明1022]
クラミジア・トラコマチスが、5IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、15分未満実施される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
クラミジア・トラコマチスが、10IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、6分未満実施される、本発明1021の方法。
[本発明1024]
本発明1001の組成物を含む、キット。
[本発明1025]
鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、本発明1024のキット。
[本発明1026]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列からなる、本発明1024のキット。
[本発明1027]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号115からなる、本発明1026のキット。
[本発明1028]
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼならびにセット20及びセット24からなる群より選択される配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1029]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1028の方法。
[本発明1031]
セット1~セット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
[本発明1032]
プローブをさらに含む、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
前記プローブが、標識を含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、及び配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97~131からなる群より選択される配列を含む、本発明1034の組成物。
[本発明1037]
前記標識が、フルオロフォアである、本発明1034の組成物。
[本発明1038]
前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、本発明1037の組成物。
[本発明1039]
配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号128のヌクレオチド7~32、及び配列番号129のヌクレオチド4~27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12、セット14~27、セット39、セット41~54、セット66、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1040]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129からなる群より選択される配列を含む、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115であり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20またはセット24である、本発明1041の組成物。
[本発明1043]
配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、及び配列番号122のヌクレオチド7~34からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12~27、セット39~54、及びセット66~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1044]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含む、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
配列番号125のヌクレオチド6~28及び配列番号126のヌクレオチド7~28からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12、セット14~18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41~45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68~72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1046]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択される配列を含む、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
配列番号113のヌクレオチド8~31及び配列番号127のヌクレオチド3~27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット14~27、セット41~54、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1048]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
配列番号130のヌクレオチド6~27を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12~20、セット22~27、セット39~47、セット49~54、セット66~74、及びセット76~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1050]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130を含む、本発明1049の組成物。
[本発明1051]
配列番号102のヌクレオチド6~30及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1052]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含む、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、本発明1052の組成物。
[本発明1054]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1053の組成物。
[本発明1055]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97~配列番号130からなる群より選択される配列を含む、本発明1054の組成物。
[本発明1056]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、及び配列番号120のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
[本発明1058]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号99~配列番号120からなる群より選択される配列を含む、本発明1057のモレキュラービーコン。
[本発明1059]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号99~配列番号120からなる群より選択される配列からなる、本発明1058のモレキュラービーコン。
[本発明1060]
前記フルオロフォアが、FAMであり、前記クエンチャーが、BHQ1である、本発明1057のモレキュラービーコン。
[本発明1061]
前記フルオロフォアが、ATTO565またはAlexa594であり、前記クエンチャーが、BHQ1またはBHQ2である、本発明1057のモレキュラービーコン。
[本発明1062]
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット1~セット81からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1063]
前記標的配列のステップ(b)の前記増幅が、約60℃~約67℃で30分未満実施される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記増幅ステップが、15分未満実施される、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記増幅ステップが、10分未満実施される、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記増幅ステップが、6分未満実施される、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1068]
前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1062の方法。
[本発明1069]
前記標識が、フルオロフォアである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、本発明1068の方法。
[本発明1072]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号128のヌクレオチド7~32、及び配列番号129のヌクレオチド4~27からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12、セット14~27、セット39、セット41~54、セット66、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1074]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129からなる群より選択される配列を含む、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115であり、前記配列特異的プライマーセットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記配列特異的プライマーセットが、セット20またはセット24である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、及び配列番号122のヌクレオチド7~34からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12~27、セット39~54、及びセット66~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1078]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含む、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125のヌクレオチド6~28及び配列番号126のヌクレオチド7~28からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12、セット14~18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41~45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68~72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1080]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択される配列を含む、本発明1079の方法。
[本発明1081]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113のヌクレオチド8~31及び配列番号127のヌクレオチド3~27からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット14~27、セット41~54、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1082]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130のヌクレオチド6~27を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12~20、セット22~27、セット39~47、セット49~54、セット66~74、及びセット76~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1084]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130を含む、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号102のヌクレオチド6~30及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含み、配列特異的プライマーセットが、セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1086]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含む、本発明1085の方法。
[本発明1087]
クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1062の方法。
[本発明1088]
クラミジア・トラコマチスが、50IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1087の方法。
[本発明1089]
クラミジア・トラコマチスが、5IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1088の方法。
[本発明1090]
クラミジア・トラコマチスが、2IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1089の方法。
[本発明1091]
クラミジア・トラコマチスが、5IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、15分未満実施される、本発明1087の方法。
[本発明1092]
クラミジア・トラコマチスが、10IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、6分未満実施される、本発明1087の方法。
[本発明1093]
本発明1031の組成物を含む、キット。
[本発明1094]
鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、本発明1093のキット。
[本発明1095]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、本発明1094のキット。
[本発明1096]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~配列番号131からなる群より選択される配列を含む、本発明1095のキット。
[本発明1097]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~配列番号131からなる群より選択される配列からなる、本発明1096のキット。
[本発明1098]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号115からなり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20またはセット24である、本発明1097のキット。
[本発明1099]
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1100]
クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1099の方法。
[本発明1101]
クラミジア・トラコマチスが、10IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1100の方法。
[本発明1102]
前記増幅ステップが、ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることを含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット1~セット81からなる群より選択される、本発明1099の方法。
[本発明1103]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97~配列番号131からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号99~配列番号120からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1102の方法。
[本発明1001]
セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
[本発明1002]
プローブをさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、本発明1002の組成物。
[本発明1006]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1005の組成物。
[本発明1007]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
[本発明1010]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1009のモレキュラービーコン。
[本発明1011]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
前記フルオロフォアが、FAMであり、前記クエンチャーが、BHQ1である、本発明1009のモレキュラービーコン。
[本発明1013]
試験試料中のクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)の検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1014]
前記標的配列のステップ(b)の前記増幅が、約60℃~約67℃で15分未満実施される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記増幅ステップが、10分未満実施される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1017]
前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1013の方法。
[本発明1018]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1013の方法。
[本発明1022]
クラミジア・トラコマチスが、5IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、15分未満実施される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
クラミジア・トラコマチスが、10IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、6分未満実施される、本発明1021の方法。
[本発明1024]
本発明1001の組成物を含む、キット。
[本発明1025]
鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、本発明1024のキット。
[本発明1026]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列からなる、本発明1024のキット。
[本発明1027]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号115からなる、本発明1026のキット。
[本発明1028]
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼならびにセット20及びセット24からなる群より選択される配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1029]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1028の方法。
[本発明1031]
セット1~セット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
[本発明1032]
プローブをさらに含む、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
前記プローブが、標識を含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、及び配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97~131からなる群より選択される配列を含む、本発明1034の組成物。
[本発明1037]
前記標識が、フルオロフォアである、本発明1034の組成物。
[本発明1038]
前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、本発明1037の組成物。
[本発明1039]
配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号128のヌクレオチド7~32、及び配列番号129のヌクレオチド4~27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12、セット14~27、セット39、セット41~54、セット66、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1040]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129からなる群より選択される配列を含む、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115であり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20またはセット24である、本発明1041の組成物。
[本発明1043]
配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、及び配列番号122のヌクレオチド7~34からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12~27、セット39~54、及びセット66~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1044]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含む、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
配列番号125のヌクレオチド6~28及び配列番号126のヌクレオチド7~28からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12、セット14~18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41~45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68~72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1046]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択される配列を含む、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
配列番号113のヌクレオチド8~31及び配列番号127のヌクレオチド3~27からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット14~27、セット41~54、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1048]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
配列番号130のヌクレオチド6~27を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット12~20、セット22~27、セット39~47、セット49~54、セット66~74、及びセット76~81からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1050]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130を含む、本発明1049の組成物。
[本発明1051]
配列番号102のヌクレオチド6~30及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択される、本発明1031の組成物。
[本発明1052]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含む、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、本発明1052の組成物。
[本発明1054]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、本発明1053の組成物。
[本発明1055]
前記モレキュラービーコンが、配列番号97~配列番号130からなる群より選択される配列を含む、本発明1054の組成物。
[本発明1056]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、及び配列番号120のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
[本発明1058]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号99~配列番号120からなる群より選択される配列を含む、本発明1057のモレキュラービーコン。
[本発明1059]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号99~配列番号120からなる群より選択される配列からなる、本発明1058のモレキュラービーコン。
[本発明1060]
前記フルオロフォアが、FAMであり、前記クエンチャーが、BHQ1である、本発明1057のモレキュラービーコン。
[本発明1061]
前記フルオロフォアが、ATTO565またはAlexa594であり、前記クエンチャーが、BHQ1またはBHQ2である、本発明1057のモレキュラービーコン。
[本発明1062]
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット1~セット81からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1063]
前記標的配列のステップ(b)の前記増幅が、約60℃~約67℃で30分未満実施される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記増幅ステップが、15分未満実施される、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記増幅ステップが、10分未満実施される、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記増幅ステップが、6分未満実施される、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1068]
前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1062の方法。
[本発明1069]
前記標識が、フルオロフォアである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、本発明1068の方法。
[本発明1072]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97~130からなる群より選択される配列を含む、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号128のヌクレオチド7~32、及び配列番号129のヌクレオチド4~27からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12、セット14~27、セット39、セット41~54、セット66、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1074]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号123、配列番号124、配列番号128、及び配列番号129からなる群より選択される配列を含む、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号115であり、前記配列特異的プライマーセットが、セット20、セット24、セット47、セット51、セット74、及びセット78からなる群より選択される、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記配列特異的プライマーセットが、セット20またはセット24である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、及び配列番号122のヌクレオチド7~34からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12~27、セット39~54、及びセット66~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1078]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含む、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125のヌクレオチド6~28及び配列番号126のヌクレオチド7~28からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12、セット14~18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41~45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68~72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1080]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択される配列を含む、本発明1079の方法。
[本発明1081]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113のヌクレオチド8~31及び配列番号127のヌクレオチド3~27からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット14~27、セット41~54、及びセット68~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1082]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130のヌクレオチド6~27を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット12~20、セット22~27、セット39~47、セット49~54、セット66~74、及びセット76~81からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1084]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号130を含む、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号102のヌクレオチド6~30及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含み、配列特異的プライマーセットが、セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1086]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含む、本発明1085の方法。
[本発明1087]
クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1062の方法。
[本発明1088]
クラミジア・トラコマチスが、50IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1087の方法。
[本発明1089]
クラミジア・トラコマチスが、5IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1088の方法。
[本発明1090]
クラミジア・トラコマチスが、2IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1089の方法。
[本発明1091]
クラミジア・トラコマチスが、5IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、15分未満実施される、本発明1087の方法。
[本発明1092]
クラミジア・トラコマチスが、10IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、6分未満実施される、本発明1087の方法。
[本発明1093]
本発明1031の組成物を含む、キット。
[本発明1094]
鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、本発明1093のキット。
[本発明1095]
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、配列番号130のヌクレオチド6~27、及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む、本発明1094のキット。
[本発明1096]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~配列番号131からなる群より選択される配列を含む、本発明1095のキット。
[本発明1097]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~配列番号131からなる群より選択される配列からなる、本発明1096のキット。
[本発明1098]
前記ポリヌクレオチドが、配列番号115からなり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット20またはセット24である、本発明1097のキット。
[本発明1099]
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
[本発明1100]
クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1099の方法。
[本発明1101]
クラミジア・トラコマチスが、10IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、本発明1100の方法。
[本発明1102]
前記増幅ステップが、ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることを含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット1~セット81からなる群より選択される、本発明1099の方法。
[本発明1103]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97~配列番号131からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号99~配列番号120からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、本発明1102の方法。
詳細な説明
低濃度の種(試料中の数個の分子または微生物まで)の検出は、医学における課題である。本発明は、クラミジア・トラコマチスの選択的検出に関する。特に、核酸増幅、特に、RT-LAMP、を利用する新しい検出方策、及びモレキュラービーコン検出に基づいて、クラミジア感染症は、本明細書に記載の方法及び試薬を使用して診断することができる。標的領域としてRNA(リボソームRNA(rRNA)またはメッセンジャーRNAのいずれか)を使用すると、C.トラコマチスゲノム毎の標的の複数のコピーが提供される。従って、これにより、ゲノム毎の複数のコピーで存在する場合であっても、ゲノムDNAを標的とする手法と比較して、本明細書に記載のアプローチを利用する試料中のC.トラコマチスの検出が容易になる。加えて、本明細書に記載のモレキュラービーコン検出試薬は、さらなる特異性を提供し、ほとんどの場合、オフターゲット増幅DNAに結合することができず、それにより、例えば、偽陽性の出現を最小限に抑える。この特異性は、とりわけ、以下に提供される実施例4に示される。本発明の他の多くの特徴も、本明細書に記載される。
低濃度の種(試料中の数個の分子または微生物まで)の検出は、医学における課題である。本発明は、クラミジア・トラコマチスの選択的検出に関する。特に、核酸増幅、特に、RT-LAMP、を利用する新しい検出方策、及びモレキュラービーコン検出に基づいて、クラミジア感染症は、本明細書に記載の方法及び試薬を使用して診断することができる。標的領域としてRNA(リボソームRNA(rRNA)またはメッセンジャーRNAのいずれか)を使用すると、C.トラコマチスゲノム毎の標的の複数のコピーが提供される。従って、これにより、ゲノム毎の複数のコピーで存在する場合であっても、ゲノムDNAを標的とする手法と比較して、本明細書に記載のアプローチを利用する試料中のC.トラコマチスの検出が容易になる。加えて、本明細書に記載のモレキュラービーコン検出試薬は、さらなる特異性を提供し、ほとんどの場合、オフターゲット増幅DNAに結合することができず、それにより、例えば、偽陽性の出現を最小限に抑える。この特異性は、とりわけ、以下に提供される実施例4に示される。本発明の他の多くの特徴も、本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「核酸」は、非標準ヌクレオチドを含有するDNA及びRNAを含む、DNA及びRNAの両方を含む。「核酸」は、少なくとも1つのポリヌクレオチド(「核酸鎖」)を含有する。「核酸」は、一本鎖または二本鎖であってよい。「核酸」という用語は、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)巨大分子及びリボ核酸(RNA)巨大分子を構成するヌクレオチド及びヌクレオシドを指す。最も一般的な核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)である。さらに、本発明が、とりわけ、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノ、ロックされた核酸(LNA)、グリコール核酸(GNA)、及びスレオース核酸(TNA)などの人工ヌクレオチドを含有する生物学的配列に使用することができることを理解すべきである。好ましくは、人工ヌクレオチドは、[アルファ]-L-LNAを含むロックされた核酸分子である。LNAは、リボース環が、少なくとも1つのLNAモノマーを含有する2’-酸素及び4’-炭素間のメチレンブリッジ、すなわち、オリゴヌクレオチド、つまり、1つの2’-O,4’-C-メチレン-β-D-リボフラノシルヌクレオチド、により「ロック」されるリボ核酸アナログを含む。LNA塩基は、標準的なワトソン-クリック塩基対を形成するが、ロックされた構成により、塩基対反応の速度及び安定性が向上する(Jepsen et al.,Oligonucleotides,14,130-146(2004))。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び/またはそれらのアナログを含有する2つ以上のヌクレオチド、例えば、修飾骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)もしくはホスホロチオエート)または修飾塩基を含有するもの、を含有するポリマー鎖を指す。「ポリヌクレオチド」は、プライマー、オリゴヌクレオチド、核酸鎖などを含む。ポリヌクレオチドは、標準または非標準ヌクレオチドを含有してもよい。従って、用語は、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、DNA、cDNA、組み換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。通常は、ポリヌクレオチドは、鎖の一端に5’リン酸を含有し(「5’末端」)、他端に3’ヒドロキシル基を含有する(「3’末端」)。ポリヌクレオチドのほとんどの5’ヌクレオチドは、本明細書では、ポリヌクレオチドの「5’末端ヌクレオチド」と呼ばれてもよい。ポリヌクレオチドのほとんどの3’ヌクレオチドは、本明細書では、ポリヌクレオチドの「3’末端ヌクレオチド」と呼ばれてもよい。本発明の核酸は、RNAの形態をとる場合、5’キャップを有しても、有さなくてもよい。
LAMPは、Bst DNAポリメラーゼまたは他の鎖置換ポリメラーゼにより実施される自動サイクル鎖置換DNA合成に依存する核酸増幅法である。増幅産物は、標的のいくつかの反復配列を有するステムループ構造であり、複数のループを有する。本方法の主なメリットは、DNAテンプレートの変性が必要とされないので、LAMP反応が(60~67℃の範囲の)等温条件下で実施することができることである。LAMPは、標的配列内の6つの異なるハイブリダイゼーション部位を認識する1つの酵素及び4種のプライマーのみを必要とする。2つの追加プライマーを追加することにより、反応を促進することができる。本方法は、大量の増幅産物を生成して、反応混合物の濁度または蛍光の視覚的判断による検出などの、より容易な検出をもたらす。
簡単に言うと、反応は、一対の『ループ形成』プライマー(順方向及び逆方向内側プライマー、それぞれ、FIP及びBIP)のアニーリング及び伸長、続いて、一対の隣接プライマーのアニーリング及び伸長(F3及びB3)により開始される。これらのプライマーの伸長は、ループ形成要素の鎖置換をもたらし、これは、折りたたまれて、末端ヘアピンループ構造を形成する。これらのキー構造が出現すると、増幅プロセスは、自立的になり、反応混合物中のヌクレオチドの全て(dATP、dTTP、dCTP、及びdGTP)が増幅DNAに組み込まれるまで、一定の温度で(PCRのような周期的ではなく)連続的及び指数関数的に進行する。任意に、反応を加速するプライマーのさらなる対が含まれる可能性がある。ループプライマーと呼ばれるこれらのプライマーは、内部プライマーのダンベル型産物の非内部プライマー結合末端ループにハイブリダイズする。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、核酸鎖(テンプレート)に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼなどの重合剤の存在下、ならびに好適な温度及びpHに置かれる場合に、合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。
LAMPは、多くの場合、最速のリアルタイムPCR試験に相当する30分未満の反応時間で、PCRよりも高い感度及び特異性での標的DNA配列の増幅を可能にする。増幅される標的配列は通常、長さが200~300塩基対(bp)であり、反応は、増幅プロセス中に、同時にいくつかのプライマーが、この配列の120bp~160bpを認識することに依存する。この高レベルのストリンジェンシーにより、増幅が非常に特異的になり、その結果、反応における増幅DNAの出現は、標的配列全体が最初に存在した場合にのみ生じる。
LAMPの応用はさらに、逆転写酵素(RT)の追加によるRNA分子の検出を含むように拡張されている。RNA検出を含むことにより、LAMPを適用することができる標的のタイプも拡張され、RNAベースのウイルス、重要な調節非コードRNA(sRNA、miRNA)、及び特定の疾患または生理学的状態と関連しているRNA分子をさらに標的とする能力を追加する。RNAを検出する能力は、例えば、高度に発現され、安定した、及び/または豊富なメッセンジャーRNA(mRNA)またはリボソームRNA(rRNA)標的を選択する際に、アッセイ感度を向上させる可能性も有する。増幅のこの予備段階は、RNA分子の相補的DNA(cDNA)への逆転写を含む。次に、cDNAは、鎖置換DNAポリメラーゼのテンプレートとして機能する。熱安定性RT酵素の使用(すなわち、NEB RTx)により、反応が単一の温度及び1ステップの単一混合反応で完了することが可能になる。
本明細書で使用される「標的配列」は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのうちの1つ以上を使用して増幅されるか、検出されるか、または増幅及び検出されるクラミジア・トラコマチスまたはその補体の核酸配列を意味する。さらに、標的配列という用語は場合により、二本鎖核酸配列を指すこともあるが、当業者らは、標的配列が、一本鎖、例えば、RNAでもあり得ることを理解するであろう。特定の生物に多少特異的である標的配列が選択されてもよい。例えば、標的配列は、属全体、複数の属、種もしくは亜種、血清群、栄養要求型、血清型、株、分離株、または生物の他のサブセットに特異的であってよい。
本明細書に記載のプライマー/プローブ組成物及び方法の速度、特異性、及び感度は、いくつかの態様から生じる。本発明による組成物及び方法で使用される例示的なプライマーは、以下を含む。
LAMP増幅産物の検出は、様々な方法で達成することができる。好ましい実施形態では、産物の検出は、蛍光標識プローブをプライマー混合物に添加することにより行われる。本明細書で使用される「プローブ」という用語は、標的配列と相補的または実質的に相補的な部分(複数可)を含む一本鎖核酸分子を指す。特定の実施態様では、蛍光標識プローブは、モレキュラービーコンである。
本明細書で使用される場合、「モレキュラービーコン」は、溶液中の特定の核酸の存在を報告するように設計された一本鎖ヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブを指す。モレキュラービーコンは、4つの構成要素:ステム、ヘアピンループ、端に標識されたフルオロフォア、及び反対端に標識されたクエンチャーからなる(Tyagi et al.,(1998)Nature Biotechnology 16:49-53)。ヘアピン様ビーコンが標的に結合していない場合、フルオロフォア及びクエンチャーは、互いに近くにあり、蛍光は、抑制される。相補的な標的ヌクレオチド配列の存在下では、ビーコンのステムは、標的にハイブリダイズするように開いている。これにより、フルオロフォア及びクエンチャーが分離されて、フルオロフォアが蛍光を発することが可能になる。あるいは、モレキュラービーコンは、端に標識されたドナーの近くで発光するフルオロフォアも含む。「波長シフトモレキュラービーコン」は、フルオロフォアがより強く発光することを可能にするさらなるハーベスターフルオロフォアを組み込む。モレキュラービーコンの現在の概説は、Wang et al.,2009,Angew Chem Int Ed Engl,48(5):856-870;Cissell et al.,2009,Anal Bioanal Chem 393(1):125-35;Li et al.,2008,Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61;及びCady,2009,Methods Mol Biol 554:367-79を含む。
一実施態様では、モレキュラービーコンは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、及び配列番号120のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号99~配列番号120からなる群より選択される配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号99~配列番号120からなる群より選択される配列からなる。上記の配列を有するポリヌクレオチドは、1つ以上の非天然ヌクレオシドまたは結合、例えば、とりわけ、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノ、ロックされた核酸(LNA)、グリコール核酸(GNA)、及びトレオース核酸(TNA)を含み得る。一部の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチドは、1~6つのロックされた核酸を含む。好ましい実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチドは、3つのロックされた核酸を含む。別の好ましい実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチドは、4つのロックされた核酸を含む。
モレキュラービーコンは、好ましくは、配列特異的LAMPプライマーのセットも含む組成物で使用される。一実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号102のヌクレオチド6~30、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む。そのような実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号97~配列番号130からなる群より選択される配列を含み得る。より好ましくは、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号97~配列番号130からなる群より選択される配列からなる。特に好ましい実施態様では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号115である。
セット12~27、セット39~54、及びセット66~81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物に含まれる場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、及び配列番号122のヌクレオチド7~34からなる群より選択される配列を含む。より詳細には、モレキュラービーコンは、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される配列を含み得る。特定の実施態様では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号106、配列番号110、配列番号112、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群より選択される。
セット12、セット14~18、セット20、セット24、セット27、セット39、セット41~45、セット47、セット51、セット54、セット66、セット68~72、セット74、セット78、及びセット81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物に含まれる場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号125のヌクレオチド6~28、及び配列番号126のヌクレオチド7~28からなる群より選択される配列を含む。特定の実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号125及び配列番号126からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号125または配列番号126である。
セット14~27、セット41~54、及びセット68~81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットと組み合わせて使用される場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号113のヌクレオチド8~31及び配列番号127のヌクレオチド3~27からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、モレキュラービーコンの標識ポリヌクレオチドは、配列番号113及び配列番号127からなる群より選択される配列を含む。他の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号113または配列番号127である。
セット12~20、セット22~27、セット39~47、セット49~54、セット66~74、及びセット76~81からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物に含まれる場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号130のヌクレオチド6~27を含む。一部の実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号130を含む。他の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号130である。
セット13、セット40、及びセット67からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットと組み合わせて使用される場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号102のヌクレオチド6~30及び配列番号131のヌクレオチド8~29からなる群より選択される配列を含む。そのような実施形態では、モレキュラービーコンは、配列番号102及び配列番号131からなる群より選択される配列を含み得る。別の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号102または配列番号131である。
本明細書で使用される「標識」という用語は、検出することが可能な、任意に、定量化することが可能な、特性または特徴を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば(且つ限定されないが)放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子などと同様に、直接的に検出することができるか、または、例えば、特定の結合メンバーと同様に、間接的に検出され得る。直接的に検出可能な標識は、標識の検出及び/または定量化を可能にするために、例えば、基質、トリガー試薬、消光部分、光などの追加の構成要素を必要とし得ることが理解されるであろう。間接的に検出可能な標識は、使用される場合、通常、「コンジュゲート」と組み合わせて使用される。コンジュゲートは通常、直接的に検出可能な標識に結合または連結されている特定の結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は、当該技術分野で周知であり、例えば、特定の結合メンバーの特定の結合性または標識の検出可能な特性を破壊しない任意の化学的手段及び/または物理的手段を含み得る。本明細書で使用される場合、「特異的結合メンバー」は、結合対のメンバー、すなわち、分子の一方が、例えば、化学的または物理的手段を介して、他方の分子に特異的に結合する2つの異なる分子、を意味する。抗原及び抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、アビジン及びビオチン;ハプテン及びハプテンに特異的な抗体;相補的ヌクレオチド配列;酵素補因子または基質及び酵素;などが含まれるが、これらに限定されることは意図されない。
モレキュラービーコンは、DNAまたはRNAなどの核酸のみで構成することができるか、またはペプチド核酸(PNA)コンジュゲートで構成することができる。フルオロフォアは、任意の蛍光有機色素または単一量子ドットであり得る。消光部分は、望ましくは、フルオロフォアの発光を消光する。フルオロフォアの発光を消光する任意の好適な消光部分を使用することができる。フルオロフォアは、当該技術分野で既知の任意の蛍光マーカー/色素であり得る。好適な蛍光マーカーの例としては、Fam、Hex、Tet、Joe、Rox、Tamra、Max、Edans、Cy5などのCy色素、フルオレセイン、クマリン、エオシン、ローダミン、Bodipy、Alexa、Cascadeブルー、Yakima Yellow、ルシファーイエロー、Texas Red、及びATTO色素のファミリーが挙げられるが、これらに限定されない。クエンチャーは、当該技術分野で既知の任意のクエンチャーであり得る。クエンチャーの例としては、Dabcyl、Dark Quencher、Eclipse Dark Quencher、ElleQuencher、Tamra、BHQ、及びQSYが挙げられるが、これらに限定されない(それらの全ては、登録商標である)。当業者は、プローブを設計する場合、色素/クエンチャーのどの組み合わせが適切であるかを知っているであろう。例示的な実施形態では、フルオレセイン(FAM)は、Blackhole Quencher(商標)(BHQ(商標))(Novato、カリフォルニア州)と組み合わせて使用される。次に、モレキュラービーコンの増幅産物への結合を、直接視覚的に評価することができる。あるいは、感度を向上させるために、蛍光レベルを分光法で測定することができる。
Abingdon Health(英国;www.abingdonhealth.com)、Attostar(米国ミネソタ州;www.attostar.com)、Biolegio(オランダ;www.biolegio.com)、Biomers.net(ドイツ;www.biomers.net)、Biosearch Technologies(米国カリフォルニア州;www.biosearchtech.com)、Eurogentec(ベルギー;www.eurogentec.com)、Gene Link(米国ニューヨーク州;www.genelink.com)、Integrated DNA Technologies(米国アイオワ州;www.idtdna.com)、Isogen Life Science(オランダ;www.isogen-lifescience.com)、Midland Certified Reagent(米国テキサス州;www.oligos.com)、Eurofins(ドイツ;www.eurofinsgenomics.eu)、Sigma-Aldrich(米国テキサス州;www.sigmaaldrich.com)、Thermo Scientific(米国マサチューセッツ州;www.thermoscientific.com)、TIB MOLBIOL(ドイツ;www.tib-molbiol.de)、TriLink Bio Technologies(米国カリフォルニア州;www.trilinkbiotech.com)を含む様々な商用サプライヤーが、標準及びカスタムモレキュラービーコンを製造する。Stratagene(La Jolla、カリフォルニア州)製のSentinel(商標)モレキュラービーコン対立遺伝子識別キットならびにEurogentec SA(ベルギー、eurogentec.com)及びIsogen Bioscience BV(オランダ、isogen.com)製の種々のキットなどのモレキュラービーコンを利用する様々なキットも市販されている。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、任意に、当該技術分野で既知の本質的にあらゆる手法を使用して調製される。特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、例えば、参照により組み込まれるBeaucage and Caruthers(1981),Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862で記載される固相ホスホルアミダイトトリエステル法、または例えば、参照により組み込まれるNeedham-VanDevanter et al.(1984)Nucleic Acids Res.12:6159-6168に記載される自動合成を使用する当該技術分野で既知の別の合成手法によるものを含む、本質的にあらゆる核酸合成法を使用して化学的に合成される。自動オリゴヌクレオチド合成のための多種多様な装置が市販されている。マルチヌクレオチド合成アプローチ(例えば、トリヌクレオチド合成など)も任意に利用される。さらに、本明細書に記載のプライマー核酸は、任意に、種々の修飾を含む。さらに説明するために、プライマーはまた、任意に、例えば、参照により組み込まれる1999年12月14日に発行された米国特許第6,001,611号に記載される増幅反応の特異性を改善するように修飾される。プライマー及びプローブはまた、本明細書に記載されるか、または別途当該技術分野で知られる種々の他の修飾を用いて合成することができる。
さらに、本質的にあらゆる核酸(及び、標準であれ非標準であれ、実質上あらゆる標識核酸)は、Integrated DNA Technologies、Midland Certified Reagent Company、Eurofins、Biosearch Technologies、Sigma Aldrich、及び他の多くのものなどの様々な商用供給元のいずれかにカスタムまたは標準で注文することができる。
試験試料は一般に、クラミジア感染症と疑われる対象、通常は、哺乳動物対象、より一般的には、ヒト対象、に由来するか、またはそれらから単離される。例示的な試料または標本としては、血液、血漿、血清、尿、滑液、精液、精漿、前立腺液、膣液、頸管粘液、子宮液、頸管擦過物、羊水、肛門擦過物、粘液、痰、組織などが挙げられる。例えば、擦過、静脈穿刺、スワビング、生検、または当該技術分野で既知の他の手法を含む、これらの試料を取得するための本質的にあらゆる手法が任意に利用される。
本明細書で使用される「試験試料」という用語は、標的配列を含有すると疑われるか、または潜在的に含有する生物または生体液から採取された試料を意味する。試験試料は、任意の生物学的供給源、例えば、組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、頸管スワブ、膣スワブ、泌尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼レンズ液、脳脊髄液、乳、腹水、滑液、腹腔液、羊水、発酵ブロス、細胞培養物、化学反応混合物などから採取することができる。試験試料は、(i)供給元から入手されるものとしてすぐに、または(ii)前処理後に試料の特性を改変するために使用することができる。従って、試験試料は、例えば、血液から血漿または血清を調製すること、細胞またはウイルス粒子を破壊すること、固体材料から液体を調製すること、粘性流体を希釈すること、液体を濾過すること、液体を蒸留すること、液体を濃縮すること、干渉成分の不活化、試薬の添加、核酸の精製などにより、使用前に前処理することができる。
有利なことに、本発明は、尿試料などの臨床試料中のクラミジア・トラコマチスの信頼できる迅速な検出を可能にする。
さらに、説明するために、本明細書に記載の標的核酸を分析する前に、それらの核酸は、異なる成分の複雑な混合物を通常含む試料から精製または単離されてもよい。収集された試料中の細胞は通常、細胞の内容物を放出するために溶解される。例えば、特定の試料中のC.トラコマチス及び他の細胞は、それらを種々の酵素、化学物質と接触させることにより溶解させることができ、及び/または、例えば、細菌の細胞壁を分解する当該技術分野で既知の他のアプローチにより溶解させることができる。一部の実施形態では、核酸は、細胞溶解物において直接分析される。他の実施形態では、核酸はさらに、検出の前に細胞溶解物から精製または抽出される。本質的にあらゆる核酸抽出方法は、本発明の方法で利用される試料中の核酸を精製するために、使用することができる。核酸を精製するために使用することができる例示的な手法としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、固体支持体に固定化されたプローブへのハイブリダイゼーション、液液抽出(例えば、フェノール-クロロホルム抽出など)、沈殿(例えば、エタノールなどを使用する)、濾紙を用いる抽出、ミセル形成試薬(例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドなど)を用いる抽出、固定化されたインターカレーション色素(例えば、臭化エチジウム、アクリジンなど)への結合、シリカゲルもしくは二原子土への吸着、カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子もしくは有機シラン粒子への吸着、及び/または同類のものが挙げられる。試料処理はまた、例えば、米国特許第5,155,018号、同第6,383,393号、及び同第5,234,809号(これらはそれぞれ、参照により組み込まれる)に記載される。
試験試料は、任意に、増幅効率及び/または定性的精度及び/または定量的精度を改善するために、当業者が既知の任意の手法に従って処理及び/または精製されていることがある。従って、試料は、精製、単離、または化学合成により得られたかどうかに関わらず、排他的または本質的に核酸(複数可)からなってもよい。試験試料からDNAなどの核酸を単離または精製したい当業者は、例えば、頸管擦過物のDNAを単離または精製するための手段を利用可能である(例えば、QIAamp-DNA Mini-Kit;Qiagen、ドイツ、ヒルデン)。
実施例1:標的の選択及びプライマープローブの設計
細菌細胞におけるリボソーム遺伝子の構成的且つ高レベルの発現を考慮して、これらの遺伝子、特に、16S及び23S遺伝子を増幅アッセイの標的として選択した。
細菌細胞におけるリボソーム遺伝子の構成的且つ高レベルの発現を考慮して、これらの遺伝子、特に、16S及び23S遺伝子を増幅アッセイの標的として選択した。
C.トラコマチスの複数の血清型、クラミドフィラ・ニューモニエ(Chlamydophila pneumoniae)及びクラミジア・シタッシ(Chlamydia psittaci)などの密接に関連する種、ならびに尿または膣液に一般に見られる他の種の16S及び23S遺伝子配列をNCBIデータベースから取得した。Clustal omega(Sievers,et al.2011.Molecular Systems Biology 7:539)を使用して、配列をアラインし、C.トラコマチス種に固有の特定の塩基を有する領域を特定した。LAMPデザイナー(Premier Biosoft)を使用して、ループ媒介増幅プライマーを設計した。特異性を高めるために、増幅産物を標的とするモレキュラービーコンまたはプローブを手動でまたはビーコンデザイナー(Premier Biosoft)を使用して設計した。さらに、ヒトゲノム及びNCBIヌクレオチドデータベースに対してBLASTを使用して、設計されたプライマーセット及びビーコンを特異性について分析した。種々のプライマーセット及びプローブを設計し、反応速度についてスクリーニングした。
本発明のプライマーセットは、表2にまとめられ、これは、少なくとも、フォワードインナープライマー(FIP)及びバックワードインナープライマー(BIP)を含む。さらに、プライマーセットは通常、フォワードアウタープライマー(F3)、バックワードアウタープライマー(B3)、フォワードループプライマー(LF)、及びバックワードループプライマー(LB)から選択される少なくとも2つの追加のプライマーも含む。
実施例2:増幅反応動態
2つの異なる濃度(103IFU/mL及び10IFU/mL)の滴定されたC.トラコマチス(Z054株、D-UW3(Zeptometrix)またはATCC血清型D株VR-885)を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。標準的な抽出方法を使用して、核酸を抽出し、表2に記載されるLAMPプライマーセットを使用して、試料を増幅した。増幅産物の検出のために、YoPro(商標)色素(Life Technologies;緑色蛍光カルボシアニン核酸染色)を使用した。この例では、25μlの反応物は、4.8mMまたは6mMのMgCl2、1.4mMまたは1.6mMのdNTP、200nMのYO-PRO-1色素(Life Technologies)、プライマー(存在する場合、0.2μMのF3及びB3;1.6μMのFIP及びBIP;存在する場合、0.4~0.8μMのLF及びLB)、8または12単位のBst2ポリメラーゼ(New England Biolabs)、7.5単位のRTx Warmstart(逆転写酵素;New England Biolabs)、ならびに抽出された核酸(テンプレートとして)または水(テンプレートなしの対照として)が補充された1Xの等温増幅緩衝液(New England Biolabs)を含有していた。反応物を63°または65℃でインキュベートし、RocheリアルタイムLightcycler96(Roche)を使用して、反応動態を監視した。
2つの異なる濃度(103IFU/mL及び10IFU/mL)の滴定されたC.トラコマチス(Z054株、D-UW3(Zeptometrix)またはATCC血清型D株VR-885)を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。標準的な抽出方法を使用して、核酸を抽出し、表2に記載されるLAMPプライマーセットを使用して、試料を増幅した。増幅産物の検出のために、YoPro(商標)色素(Life Technologies;緑色蛍光カルボシアニン核酸染色)を使用した。この例では、25μlの反応物は、4.8mMまたは6mMのMgCl2、1.4mMまたは1.6mMのdNTP、200nMのYO-PRO-1色素(Life Technologies)、プライマー(存在する場合、0.2μMのF3及びB3;1.6μMのFIP及びBIP;存在する場合、0.4~0.8μMのLF及びLB)、8または12単位のBst2ポリメラーゼ(New England Biolabs)、7.5単位のRTx Warmstart(逆転写酵素;New England Biolabs)、ならびに抽出された核酸(テンプレートとして)または水(テンプレートなしの対照として)が補充された1Xの等温増幅緩衝液(New England Biolabs)を含有していた。反応物を63°または65℃でインキュベートし、RocheリアルタイムLightcycler96(Roche)を使用して、反応動態を監視した。
この例は、このプライマーのセット及びループ媒介増幅法の使用により、高速増幅動態を達成することを示す。結果は、表3にまとめられ、陽性になるまでの時間(Tp)を機器で計算した。NTは、未試験の濃度を示す。結果は、陽性になるまでの時間で分類される(NTは、「未試験」を意味し、「コールなし(no call)」は、増幅が全く検出されなかったことを示す)。
実施例3:アッセイ動態に対するビーコン設計位置の影響
上記のプライマーセットの一部及びインターカレーション色素を含有する増幅反応物は、水もしくは陰性尿抽出物、またはアッセイ時間のカットオフウィンドウの可変間隔内の、時間の0%~75%の範囲の頻度で、テンプレートとしてC.ニューモニエ(C.pneumoniae)もしくはC.シタッシ(C.psittaci)などの密接に関連する種のDNA(表4)を使用する場合、増幅産物の検出をもたらした。結果は、陽性になるまでの時間で分類される(「コールなし」は、増幅が全く検出されなかったことを示す)。
上記のプライマーセットの一部及びインターカレーション色素を含有する増幅反応物は、水もしくは陰性尿抽出物、またはアッセイ時間のカットオフウィンドウの可変間隔内の、時間の0%~75%の範囲の頻度で、テンプレートとしてC.ニューモニエ(C.pneumoniae)もしくはC.シタッシ(C.psittaci)などの密接に関連する種のDNA(表4)を使用する場合、増幅産物の検出をもたらした。結果は、陽性になるまでの時間で分類される(「コールなし」は、増幅が全く検出されなかったことを示す)。
特異性を高めるために、C.トラコマチス標的のシグナルのみが確実に検出されるように、これらのプライマーセットに沿って、モレキュラービーコンを設計した(表5に示された配列)。標的特異的蛍光検出を提供するために含まれた5’フルオロフォア/3’クエンチャー修飾(6-カルボキシフルオレセイン(FAM)及びBlack Hole Quencher 1(BHQ1))を用いて、各モレキュラービーコンプローブを設計した。
2つの異なる濃度(103IFU/mL及び10IFU/mL)の滴定されたC.トラコマチス(Z054株、D-UW3(Zeptometrix)またはATCC血清型D株VR-885)を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。標準的な抽出方法を使用して、核酸を抽出し、LAMPプライマーセット(表2で)を使用して、試料を増幅し、モレキュラービーコン(表4で)の1つを増幅産物の検出のために使用した。この例では、25μlの反応物は、4.8mMまたは6mMのMgCl2、1.4mMまたは1.6mMのdNTP、200nMのモレキュラービーコン(Sigma-Aldrich)、プライマー(存在する場合、0.2μMのF3及びB3;1.6μMまたは2μMのFIP及びBIP;存在する場合、0.4~0.8μMのLF及びLB)、8または12単位のBst2ポリメラーゼ(New England Biolabs)、7.5単位のRTx Warmstart(逆転写酵素;New England Biolabs)、ならびに抽出された核酸(テンプレートとして)または水(テンプレートなしの対照として)が補充された1Xの等温増幅緩衝液(New England Biolabs)を含有していた。反応物を63℃でインキュベートし、RocheリアルタイムLightcycler96(Roche)を使用して、反応動態を監視した。各プライマー-プローブの組み合わせが陽性になるまでの時間は、表6に示される。結果は、以下の通り、反応開始から、陽性になるまでの時間(Tp)で分類される:「NT」は、この組み合わせが未試験であったことを示し、「コールなし」は、増幅が全く検出されなかったことを示す。
検出にモレキュラービーコンを使用すると、反応Tpがわずかに増加したが、アッセイの特異性が大幅に向上し、妥当なトレードオフが得られ、45分の試験期間内に水試料または近縁の種のDNAにおいて増幅は全く観察されなかった(実施例4、表7を参照のこと)。
実施例4:特異性試験
滴定されたC.トラコマチスまたは性感染症と一般に関連する生物(例えば、ナイセリア・ゴノレエ)もしくはC.トラコマチスに密接に関連する種(C.ニューモニア(C.pneumonia)もしくはC.シタッシ)を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。細菌ストックをPBSで連続希釈した後、尿マトリックスに所望の濃度で添加した。上記の実施例3に記載の方法に従って、LAMPプライマー及びモレキュラービーコンプローブを含有するRT-LAMP反応におけるテンプレートとして、試験種の対応する抽出された核酸またはDNAを使用した。NTは、未試験の反応を示す。
滴定されたC.トラコマチスまたは性感染症と一般に関連する生物(例えば、ナイセリア・ゴノレエ)もしくはC.トラコマチスに密接に関連する種(C.ニューモニア(C.pneumonia)もしくはC.シタッシ)を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。細菌ストックをPBSで連続希釈した後、尿マトリックスに所望の濃度で添加した。上記の実施例3に記載の方法に従って、LAMPプライマー及びモレキュラービーコンプローブを含有するRT-LAMP反応におけるテンプレートとして、試験種の対応する抽出された核酸またはDNAを使用した。NTは、未試験の反応を示す。
この実施例は、CT23Sアッセイ及びその反応製剤が、非常に特異的に設計され、密接に関連する生物及び性感染症に一般に関連する生物の配列との交差反応性を制限することができることを示す。
実施例5:感度試験
示されたプライマーセット/モレキュラービーコンの組み合わせの感度を評価するために、RNA分子標準を種々の濃度に希釈した(表8)。標準を、PBS中0.1mg/mLのポリAキャリアRNA(Sigma)で連続希釈し、RTLAMP反応における増幅のためのテンプレートとして使用した。反応の最終濃度は、40、8、または4コピー/uLであった。反応条件は、上記の実施例3に記載されたものと同等であった。増幅シグナルは、4コピー/uLという低い濃度で得られた(表8を参照のこと)。
示されたプライマーセット/モレキュラービーコンの組み合わせの感度を評価するために、RNA分子標準を種々の濃度に希釈した(表8)。標準を、PBS中0.1mg/mLのポリAキャリアRNA(Sigma)で連続希釈し、RTLAMP反応における増幅のためのテンプレートとして使用した。反応の最終濃度は、40、8、または4コピー/uLであった。反応条件は、上記の実施例3に記載されたものと同等であった。増幅シグナルは、4コピー/uLという低い濃度で得られた(表8を参照のこと)。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> TALIS BIOMEDICAL CORPORATION
<120> POLYNUCLEOTIDES FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF CHLAMYDIA
TRACHOMATIS
<150> US 62/669,236
<151> 2018-05-09
<150> US 15/976,733
<151> 2018-05-10
<160> 131
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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primer
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 26
ctgctgaata ctacgctctc ctac 24
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
ccaacattcc aactgtcttc gaatcatcac tcagcccaga ccgccg 46
<210> 28
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 28
gcgtaacagc tcaccaatcg agaatcattg tcttatcgac acacccgc 48
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 29
ttacccactt agcataaaat tagggacctt aa 32
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 30
acgggactaa gcataaaacc gaca 24
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 31
agaagcgagt ccgggagat 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 32
ccggtacacc ttctctgctg 20
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 33
aagccaacat tccaactgtc ttcgaatcat cagcccagac cgccg 45
<210> 34
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 34
gcgtaacagc tcaccaatcg agaatcattg tcttatcgac acacccgc 48
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 35
ttacccactt agcataaaat tagggacctt aa 32
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 36
acgggactaa gcataaaacc gaca 24
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 37
cacaggtggg cgagatgaat at 22
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 38
ctgacatatc cctttaacct tttggc 26
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 39
atagtcaccc taaaaggctc cccttattcc aggcgcgcga gataacttt 49
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 40
agaaatggcc caggcgactg tttaggcagg cgtcacacca tatact 46
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 41
gggataattt gccgagttcc ttaacg 26
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 42
aaaacacagc actatgcaaa cctctaag 28
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 43
cacaggtggg cgagatgaat 20
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 44
ctgacatatc cctttaacct tttggc 26
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 45
atagtcaccc taaaaggctc cccttattcc aggcgcgcga gataacttt 49
<210> 46
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 46
agaaatggcc caggcgactg tttaggcagg cgtcacacca tatact 46
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 47
gggataattt gccgagttcc ttaacg 26
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 48
aaaacacagc actatgcaaa cctctaag 28
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 49
attcgaagac agttggaatg t 21
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 50
tattatcggc gcaatgattc tcgaggctta gaggcagcaa tc 42
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 51
gtgagctgtt acgcactct 19
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 52
tcgttactta tgccatggat c 21
<210> 53
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 53
taaacgggac taagcataaa accgaccttc tctgctgaat actacg 46
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 54
gataagacac gcggtaggag 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 55
cttaccaacg gaaatcaaac tc 22
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 56
cacttagcat aaaattaggg accttaatcg gggggctaag cttcgt 46
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 57
gcggtctggg ctgttc 16
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 58
tatcggcgca atgattctc 19
<210> 59
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 59
tgggtaagga agtgatgatt cgaagggtga gctgttacgc ac 42
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 60
tggcttagag gcagcaatc 19
<210> 61
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 61
atcggcgcaa tgattctcga tggcttagag gcagcaatc 39
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 62
cgttacttat gccatggatc t 21
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 63
taagacacgc ggtaggaga 19
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 64
gaaatcgaag agattccctg tg 22
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 65
ggtgttgagg tcggtctt 18
<210> 66
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 66
ttatcctcaa tcctacaacc ccgagtagcg gcgagcgaaa g 41
<210> 67
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 67
ggatcaggac tcctagttga acacactcct ttcgtctacg ggac 44
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 68
ccttatcagc tcggtttagg c 21
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 69
ggaaagatgg atgatacagg gtg 23
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 70
gttgtaggat tgaggataaa ggatc 25
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 71
tactggttca ctatcggtca tt 22
<210> 72
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 72
tcggtctttc tctcctttcg tctactccta gttgaacaca tctggaa 47
<210> 73
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 73
cctcaacacc tgagtaggac tagacgcctt ggagagtggt ctc 43
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 74
ggactatcac cctgtatcat cca 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 75
cgtgaaacct agtctgaatc tgg 23
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 76
tattcccctt tcgctcgc 18
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 77
ggctattccc ctttcgctc 19
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 78
ttaggctatt cccctttcgc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 79
gctattcccc tttcgctcgc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 80
gtttaggcta ttcccctttc 20
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 81
ctgaaacatc ttagtaagca gagg 24
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 82
gtgtctagtc ctactcaggt g 21
<210> 83
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 83
cctacaaccc cgagccttat caagagattc cctgtgtagc g 41
<210> 84
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 84
ggactcctag ttgaacacat ctggattctc tcctttcgtc tacgg 45
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 85
gctcggttta ggctattccc 20
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 86
aagatggatg atacagggtg atagt 25
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 87
cgaactgaaa catcttagta agcag 25
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 88
ctcctttcgt ctacgggact a 21
<210> 89
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 89
atcagctcgg tttaggctat tcccgaaaag aaatcgaaga gattccctg 49
<210> 90
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 90
gctcggggtt gtaggattga ggatacctgt atcatccatc tttccagat 49
<210> 91
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 91
ctttcgctcg ccgctac 17
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 92
ggatcaggac tcctagttga acac 24
<210> 93
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 93
cctacaaccc cgagccttat cagaaaagaa atcgaagaga ttccctg 47
<210> 94
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 94
atcagctcgg tttaggctat tcccagagat tccctgtgta gcg 43
<210> 95
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 95
gctcggggtt gtaggattga ggatattctc tcctttcgtc tacgg 45
<210> 96
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 96
gctcggggtt gtaggattga ggatactgta tcatccatct ttccagatgt 50
<210> 97
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 97
cgcgcacatc tggaaagatg gatgatacag ggtgcgcg 38
<210> 98
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 98
cgtccaggac tcctagttga acacatctgg acg 33
<210> 99
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 99
ccggatcagg actcctagtt gaacacatct gatccgg 37
<210> 100
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 100
cggccaggac tcctagttga acacatctgg ccg 33
<210> 101
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 101
cgtccggatc aggactccta gttgaacacc ggacg 35
<210> 102
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 102
ctcgccacgt gaaacctagt ctgaatctgg cgag 34
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 103
ccgtggatga tacagggtga tagtccacgg 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 104
cgtgggatga tacagggtga tagtcccacg 30
<210> 105
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 105
cggctcgaga ttccctgtgt agcggcgagc cg 32
<210> 106
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 106
cgccaggatc aggactccta gttgaacctg gcg 33
<210> 107
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 107
caccgggatg atacagggtg atagtcccgg tc 32
<210> 108
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 108
caccgggatg atacagggtg atagtcccgg tg 32
<210> 109
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 109
tcgcgggatg atacagggtg atagtcccgc gg 32
<210> 110
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 110
cagcgggatc aggactccta gttgaacccg ctg 33
<210> 111
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 111
cacgctcgag attccctgtg tagcggcgag cgtg 34
<210> 112
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 112
caggcggatc aggactccta gttgaacacc gcctg 35
<210> 113
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 113
cagcgacaga aatcgaagag attccctgtg tcgctg 36
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 114
cacgggatga tacagggtga tagtcccgtc 30
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 115
cacgggatga tacagggtga tagtcccgtg 30
<210> 116
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 116
cacgatggat gatacagggt gatagtccat cgtg 34
<210> 117
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 117
caccgatgga tgatacaggg tgatagtccc atcggtg 37
<210> 118
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 118
cgcgatcgag gataaaggat caggactcga tcgcg 35
<210> 119
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 119
cgcgatcatt gaggataaag gatcaggact gatcgcg 37
<210> 120
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 120
cgcgatcctc ctagttgaac acatctggag atcgcg 36
<210> 121
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 121
cgcgatcagg actcctagtt gaacacatct ggatcgcg 38
<210> 122
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 122
cgcgactcag gactcctagt tgaacacatc tggagtcgcg 40
<210> 123
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 123
cgcgatccgg ataaaggatc aggactccta gttgggatcg cg 42
<210> 124
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 124
cgcgagtagg attgaggata aaggatcagg actcgcg 37
<210> 125
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 125
cgcgatccct gtgtagcggc gagcgagatc gcg 33
<210> 126
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 126
cgcgatcctg tgtagcggcg agcgaaagat cgcg 34
<210> 127
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 127
cggctcgggg ttgtaggatt gaggatacga gccg 34
<210> 128
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 128
ccggagccta caaccccgag ccttatcagc tccgg 35
<210> 129
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 129
gcgcagctcg gtttaggcta ttcccctgcg cg 32
<210> 130
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 130
cgcggtctct cctttcgtct acgggaccgc g 31
<210> 131
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 131
cgcagtgaga gaaagaccga cctcaacact gcg 33
SEQUENCE LISTING
<110> TALIS BIOMEDICAL CORPORATION
<120> POLYNUCLEOTIDES FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF CHLAMYDIA
TRACHOMATIS
<150> US 62/669,236
<151> 2018-05-09
<150> US 15/976,733
<151> 2018-05-10
<160> 131
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 1
cgaaggaatg acggagta 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 2
cgccttagaa tattcatctc g 21
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 3
gcgacctgat cttatgttag cgcgattgga agagtccgta 40
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 4
gaaccgatgg tgtggagccc acctgtgtcg gtt 33
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 5
ctactaaccg ttctcatcgc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 6
ctgttgatgg tgaccgtac 19
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 7
aaaactatag cgaaggaatg acgga 25
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 8
taatttgccg agttccttaa cgaaag 26
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 9
ccccgaagat tccccttgat cgccgtagag cgatgagaac ggtt 44
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 10
ggtgtggagc gaggctttca agaaataata ttcatctcgc ccacctgtg 49
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 11
tgatcttatg ttagcggatt tgcctact 28
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 12
tttctagctg ttgatggtga ccgt 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 13
aactatagcg aaggaatgac ggag 24
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 14
taatttgccg agttccttaa cgaaag 26
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 15
ccccgaagat tccccttgat cgccgtagag cgatgagaac ggtt 44
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 16
ggtgtggagc gaggctttca agaaataata ttcatctcgc ccacctgtg 49
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 17
tgatcttatg ttagcggatt tgcctact 28
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 18
gttgatggtg accgtaccaa aacc 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 19
atagcgaagg aatgacggag taag 24
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 20
taatttgccg agttccttaa cgaaag 26
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 21
ccccgaagat tccccttgat cgccgtagag cgatgagaac ggtt 44
<210> 22
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 22
ggtgtggagc gaggctttca agaaataata ttcatctcgc ccacctgtg 49
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 23
gacctgatct tatgttagcg gatttgc 27
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 24
tttctagctg ttgatggtga ccgt 24
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 25
agaagcgagt ccgggagat 19
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 26
ctgctgaata ctacgctctc ctac 24
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
ccaacattcc aactgtcttc gaatcatcac tcagcccaga ccgccg 46
<210> 28
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 28
gcgtaacagc tcaccaatcg agaatcattg tcttatcgac acacccgc 48
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 29
ttacccactt agcataaaat tagggacctt aa 32
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 30
acgggactaa gcataaaacc gaca 24
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 31
agaagcgagt ccgggagat 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 32
ccggtacacc ttctctgctg 20
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 33
aagccaacat tccaactgtc ttcgaatcat cagcccagac cgccg 45
<210> 34
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 34
gcgtaacagc tcaccaatcg agaatcattg tcttatcgac acacccgc 48
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 35
ttacccactt agcataaaat tagggacctt aa 32
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 36
acgggactaa gcataaaacc gaca 24
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 37
cacaggtggg cgagatgaat at 22
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 38
ctgacatatc cctttaacct tttggc 26
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 39
atagtcaccc taaaaggctc cccttattcc aggcgcgcga gataacttt 49
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 40
agaaatggcc caggcgactg tttaggcagg cgtcacacca tatact 46
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 41
gggataattt gccgagttcc ttaacg 26
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 42
aaaacacagc actatgcaaa cctctaag 28
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 43
cacaggtggg cgagatgaat 20
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 44
ctgacatatc cctttaacct tttggc 26
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 45
atagtcaccc taaaaggctc cccttattcc aggcgcgcga gataacttt 49
<210> 46
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 46
agaaatggcc caggcgactg tttaggcagg cgtcacacca tatact 46
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 47
gggataattt gccgagttcc ttaacg 26
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 48
aaaacacagc actatgcaaa cctctaag 28
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 49
attcgaagac agttggaatg t 21
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 50
tattatcggc gcaatgattc tcgaggctta gaggcagcaa tc 42
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 51
gtgagctgtt acgcactct 19
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 52
tcgttactta tgccatggat c 21
<210> 53
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 53
taaacgggac taagcataaa accgaccttc tctgctgaat actacg 46
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 54
gataagacac gcggtaggag 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 55
cttaccaacg gaaatcaaac tc 22
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 56
cacttagcat aaaattaggg accttaatcg gggggctaag cttcgt 46
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 57
gcggtctggg ctgttc 16
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 58
tatcggcgca atgattctc 19
<210> 59
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 59
tgggtaagga agtgatgatt cgaagggtga gctgttacgc ac 42
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 60
tggcttagag gcagcaatc 19
<210> 61
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 61
atcggcgcaa tgattctcga tggcttagag gcagcaatc 39
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 62
cgttacttat gccatggatc t 21
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 63
taagacacgc ggtaggaga 19
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 64
gaaatcgaag agattccctg tg 22
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 65
ggtgttgagg tcggtctt 18
<210> 66
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 66
ttatcctcaa tcctacaacc ccgagtagcg gcgagcgaaa g 41
<210> 67
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 67
ggatcaggac tcctagttga acacactcct ttcgtctacg ggac 44
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 68
ccttatcagc tcggtttagg c 21
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 69
ggaaagatgg atgatacagg gtg 23
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 70
gttgtaggat tgaggataaa ggatc 25
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 71
tactggttca ctatcggtca tt 22
<210> 72
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 72
tcggtctttc tctcctttcg tctactccta gttgaacaca tctggaa 47
<210> 73
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 73
cctcaacacc tgagtaggac tagacgcctt ggagagtggt ctc 43
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 74
ggactatcac cctgtatcat cca 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 75
cgtgaaacct agtctgaatc tgg 23
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 76
tattcccctt tcgctcgc 18
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 77
ggctattccc ctttcgctc 19
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 78
ttaggctatt cccctttcgc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 79
gctattcccc tttcgctcgc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 80
gtttaggcta ttcccctttc 20
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 81
ctgaaacatc ttagtaagca gagg 24
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 82
gtgtctagtc ctactcaggt g 21
<210> 83
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 83
cctacaaccc cgagccttat caagagattc cctgtgtagc g 41
<210> 84
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 84
ggactcctag ttgaacacat ctggattctc tcctttcgtc tacgg 45
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 85
gctcggttta ggctattccc 20
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 86
aagatggatg atacagggtg atagt 25
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 87
cgaactgaaa catcttagta agcag 25
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 88
ctcctttcgt ctacgggact a 21
<210> 89
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 89
atcagctcgg tttaggctat tcccgaaaag aaatcgaaga gattccctg 49
<210> 90
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 90
gctcggggtt gtaggattga ggatacctgt atcatccatc tttccagat 49
<210> 91
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 91
ctttcgctcg ccgctac 17
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 92
ggatcaggac tcctagttga acac 24
<210> 93
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 93
cctacaaccc cgagccttat cagaaaagaa atcgaagaga ttccctg 47
<210> 94
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 94
atcagctcgg tttaggctat tcccagagat tccctgtgta gcg 43
<210> 95
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 95
gctcggggtt gtaggattga ggatattctc tcctttcgtc tacgg 45
<210> 96
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 96
gctcggggtt gtaggattga ggatactgta tcatccatct ttccagatgt 50
<210> 97
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 97
cgcgcacatc tggaaagatg gatgatacag ggtgcgcg 38
<210> 98
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 98
cgtccaggac tcctagttga acacatctgg acg 33
<210> 99
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 99
ccggatcagg actcctagtt gaacacatct gatccgg 37
<210> 100
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 100
cggccaggac tcctagttga acacatctgg ccg 33
<210> 101
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 101
cgtccggatc aggactccta gttgaacacc ggacg 35
<210> 102
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 102
ctcgccacgt gaaacctagt ctgaatctgg cgag 34
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 103
ccgtggatga tacagggtga tagtccacgg 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 104
cgtgggatga tacagggtga tagtcccacg 30
<210> 105
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 105
cggctcgaga ttccctgtgt agcggcgagc cg 32
<210> 106
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 106
cgccaggatc aggactccta gttgaacctg gcg 33
<210> 107
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 107
caccgggatg atacagggtg atagtcccgg tc 32
<210> 108
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 108
caccgggatg atacagggtg atagtcccgg tg 32
<210> 109
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 109
tcgcgggatg atacagggtg atagtcccgc gg 32
<210> 110
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 110
cagcgggatc aggactccta gttgaacccg ctg 33
<210> 111
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 111
cacgctcgag attccctgtg tagcggcgag cgtg 34
<210> 112
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 112
caggcggatc aggactccta gttgaacacc gcctg 35
<210> 113
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 113
cagcgacaga aatcgaagag attccctgtg tcgctg 36
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 114
cacgggatga tacagggtga tagtcccgtc 30
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 115
cacgggatga tacagggtga tagtcccgtg 30
<210> 116
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 116
cacgatggat gatacagggt gatagtccat cgtg 34
<210> 117
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 117
caccgatgga tgatacaggg tgatagtccc atcggtg 37
<210> 118
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 118
cgcgatcgag gataaaggat caggactcga tcgcg 35
<210> 119
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 119
cgcgatcatt gaggataaag gatcaggact gatcgcg 37
<210> 120
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 120
cgcgatcctc ctagttgaac acatctggag atcgcg 36
<210> 121
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 121
cgcgatcagg actcctagtt gaacacatct ggatcgcg 38
<210> 122
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 122
cgcgactcag gactcctagt tgaacacatc tggagtcgcg 40
<210> 123
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 123
cgcgatccgg ataaaggatc aggactccta gttgggatcg cg 42
<210> 124
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 124
cgcgagtagg attgaggata aaggatcagg actcgcg 37
<210> 125
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 125
cgcgatccct gtgtagcggc gagcgagatc gcg 33
<210> 126
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 126
cgcgatcctg tgtagcggcg agcgaaagat cgcg 34
<210> 127
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 127
cggctcgggg ttgtaggatt gaggatacga gccg 34
<210> 128
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 128
ccggagccta caaccccgag ccttatcagc tccgg 35
<210> 129
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 129
gcgcagctcg gtttaggcta ttcccctgcg cg 32
<210> 130
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 130
cgcggtctct cctttcgtct acgggaccgc g 31
<210> 131
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 131
cgcagtgaga gaaagaccga cctcaacact gcg 33
Claims (27)
- (i) 配列番号:87を含むフォワードアウタープライマー、配列番号:82を含むバックワードアウタープライマー、配列番号:94を含むフォワードインナープライマー、配列番号:84を含むバックワードインナープライマー、配列番号:76を含むフォワードループプライマー、及び配列番号:86を含むバックワードループプライマーを含むプライマーセット、
(ii) 配列番号:87を含むフォワードアウタープライマー、配列番号:82を含むバックワードアウタープライマー、配列番号:94を含むフォワードインナープライマー、及び配列番号:84を含むバックワードインナープライマーを含むプライマーセット、ならびに
(iii) 配列番号:94を含むフォワードインナープライマー、及び配列番号:84を含むバックワードインナープライマーを含むプライマーセット
からなる群より選択されるプライマーのセットを含む、試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出のための組成物。 - プローブをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、請求項2に記載の組成物。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、請求項2に記載の組成物。
- 前記モレキュラービーコンが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記モレキュラービーコンが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、請求項6に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号115からなる、請求項7に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物を含む、キット。
- 鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項9に記載のキット。
- フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列からなる、請求項9に記載のキット。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号115からなる、請求項11に記載のキット。
- 前記プライマーのセットが、
(i)配列番号:87からなるフォワードアウタープライマー、配列番号:82からなるバックワードアウタープライマー、配列番号:94からなるフォワードインナープライマー、配列番号:84からなるバックワードインナープライマー、配列番号:76からなるフォワードループプライマー、及び配列番号:86からなるバックワードループプライマーからなるプライマーセット、
(ii)配列番号:87からなるフォワードアウタープライマー、配列番号:82からなるバックワードアウタープライマー、配列番号:94からなるフォワードインナープライマー、及び配列番号:84からなるバックワードインナープライマーからなるプライマーセット、ならびに
(iii)配列番号:94からなるフォワードインナープライマー、及び配列番号:84からなるバックワードインナープライマーからなるプライマーセット
からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。 - 試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、
(i) 配列番号:87を含むフォワードアウタープライマー、配列番号:82を含むバックワードアウタープライマー、配列番号:94を含むフォワードインナープライマー、配列番号:84を含むバックワードインナープライマー、配列番号:76を含むフォワードループプライマー、及び配列番号:86を含むバックワードループプライマーを含むプライマーセット、
(ii) 配列番号:87を含むフォワードアウタープライマー、配列番号:82を含むバックワードアウタープライマー、配列番号:94を含むフォワードインナープライマー、及び配列番号:84を含むバックワードインナープライマーを含むプライマーセット、ならびに
(iii) 配列番号:94を含むフォワードインナープライマー、及び配列番号:84を含むバックワードインナープライマーを含むプライマーセット
からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。 - 前記標的配列のステップ(b)の前記増幅が、約60℃~約67℃で15分未満実施される、請求項14に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、10分未満実施される、請求項15に記載の方法。
- 前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択される配列を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択される配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記標識ポリヌクレオチドの配列が、配列番号115である、請求項20に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、100IFU/mL以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項14に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、5IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、15分未満実施される、請求項22に記載の方法。
- クラミジア・トラコマチスが、10IFU/ml以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、6分未満実施される、請求項22に記載の方法。
- 試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
(a)前記試験試料から核酸を抽出すること、
(b)ステップ(a)で抽出された前記核酸を、鎖置換DNAポリメラーゼならびに配列番号:87を含むフォワードアウタープライマー、配列番号:82を含むバックワードアウタープライマー、配列番号:94を含むフォワードインナープライマー、配列番号:84を含むバックワードインナープライマー、配列番号:76を含むフォワードループプライマー、及び配列番号:86を含むバックワードループプライマーを含む配列特異的LAMPプライマーセットを含む反応混合物と10分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
(c)ステップ(b)の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。 - 前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97のヌクレオチド5~34、配列番号98のヌクレオチド5~31、配列番号99のヌクレオチド3~31、配列番号100のヌクレオチド5~30、配列番号101のヌクレオチド6~29、配列番号103のヌクレオチド5~26、配列番号104のヌクレオチド4~27、配列番号105のヌクレオチド7~30、配列番号106のヌクレオチド5~27、配列番号107のヌクレオチド6~29、配列番号108のヌクレオチド6~29、配列番号109のヌクレオチド6~29、配列番号110のヌクレオチド6~30、配列番号111のヌクレオチド8~31、配列番号112のヌクレオチド6~29、配列番号113のヌクレオチド8~31、配列番号114のヌクレオチド5~29、配列番号115のヌクレオチド5~29、配列番号116のヌクレオチド4~28、配列番号117のヌクレオチド5~30、配列番号118のヌクレオチド8~28、配列番号119のヌクレオチド8~30、配列番号120のヌクレオチド8~29、配列番号121のヌクレオチド4~33、配列番号122のヌクレオチド7~34、配列番号123のヌクレオチド9~34、配列番号124のヌクレオチド8~34、配列番号125のヌクレオチド6~28、配列番号126のヌクレオチド7~28、配列番号127のヌクレオチド3~27、配列番号128のヌクレオチド7~32、配列番号129のヌクレオチド4~27、及び配列番号130のヌクレオチド6~27からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記増幅産物の有無の検出が、配列番号97~101及び103~130からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項25に記載の方法。
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