CN101886122B - 环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简单快速、检测效率高的环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒，主要方案步骤为设计了引物组序列，采用利用检测试剂盒对待检样品进行环介导恒温扩增反应，其环介导恒温扩增产物检测方法包括：室温10,000g离心5分钟后阳性结果在试管底部可见白色沉淀；加入显色剂，阳性结果为绿色；1.5％琼脂糖凝胶电泳结果有梯状电泳条带；可以选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。该方法具有检测准确、灵敏度高、特异性强、简便、快速的特点，检测灵敏度为100ccu/ml，可以快速准确地鉴定特异的目标菌，从而解决了传统检测方法无法满足临床检测发展要求的现状。

Description

环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及细菌的快速检测技术，具体的说是涉及一种环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒。

背景技术

肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，CPn)是1989年新定名和分类的第三种衣原体，是引起人类急性呼吸道感染的重要致病原，临床上不仅可引起呼吸系统感染性疾病(肺炎、支气管炎、鼻窦炎和咽炎)，而且在心血管疾病、哮喘、结节病患者中也发现较高的抗体水平，近年又发现Cpn与AS有密切相关。

目前，肺炎衣原体的病原学检查主要有以下方法，一是从气管或鼻咽吸取物做细胞培养，此培养法，由于肺炎衣原体只能在活细胞内生长繁殖，分离培养方法复杂，所需时间长，对操作人员要求高，而且敏感性不高，不便于临床快速诊断。二是用荧光结合的肺炎衣原体特异性单克隆抗体来鉴定细胞培养中的肺炎衣原体，值得注意的是，荧光显微镜的质量及操作熟练程度会影响免疫荧光试验的结果。三是用PCR检测标本中肺炎衣原体DNA，此方法检测程序相对复杂且对实验室的环境要求较高，此方法容易产生假阳性。

环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年开发出的一种新的核酸扩增技术，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。现已被广泛应用于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域，如何运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎衣原体在临床诊断技术发展中具有重大意义，因此开发一种简单快速、检测效率高的运用环介导恒温扩增技术来检测肺炎衣原体的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单快速、检测效率高的环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒，本方法提高了肺炎衣原体的诊断效率，解决传统检测方法无法满足临床诊断的发展要求。

本发明所采用的技术方案是：首先通过实验测序得到肺炎衣原体的P1基因序列如序列表NO.5所示，并通过专业软件设计用于环介导恒温扩增技术检测的特异性寡核苷酸引物，以引物序列组扩增待测样品模板，进行目的基因片段的特异性扩增，其检测方法的步骤包括：

(1)基因提取步骤，从待检样品中提取模板DNA；

(2)环介导恒温扩增反应步骤，将上述模板DNA加入反应体系中进行扩增反应，其中所使用的引物序列如下：

F3 5-AGCCAAGCCTACTGGATC-3

B3 5-AACGAGATTGAACGCTGT-3

FIP 5-ACCACTCTGCATCGTGTAAATGTACTACTGCCGTAGATAGACC-3

BIP 5-GGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGAGAGTTTCCTCTAATGTAACCAT-3；

(3)结果检测步骤，选择以下三种扩增产物检测方法中的任意一种进行检测：

A：将扩增产物离心目测白色沉淀来检测结果；

B：加入显色液观察反应液颜色来检测结果；

C：1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳带形分析检测结果。

上述步骤(2)中环介导恒温扩增反应条件为：

60～65℃    45～90分钟；

80～95℃    3～5分钟。

其中采用A方法检测时，阳性结果会产生白色沉淀。在环介导恒温扩增过程中，dNTP不断添加进新合成的核苷酸链，同时会生成大量的副产物——焦磷酸镁。焦磷酸镁是一种白色沉淀物，由于整个扩增试验都是在61℃左右进行，所以焦磷酸镁沉淀无法溶解，最终，随着阳性核苷酸链的增加，焦磷酸镁沉淀也在不断积累。从而在反应结束后可以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。

采用B方法检测时，阳性结果如果加入SYBR Green染料，溶液变为绿色。阳性的环介导恒温扩增会合成大量的核苷酸链。反应后，向阳性反应产物中加入SYBR Green染料后，SYBR Green分子会大量嵌入核苷酸链中，从而使SYBR Green分子产生绿色荧光。而阴性结果由于没有目的基因片段，无法扩增出核苷酸链，SYBR Green也无法同核苷酸链结合，结果只能是橙色。

如采用C方法检测时，阳性结果在电泳中表现为阶梯状电泳条带。环介导恒温扩增的原理是，FIP引物杂交在目标DNA的F2C区段，启动互补链合成，导致DNA哑铃状结构的产生。此哑铃状结构很快以自身为模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，该茎-环结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎一环结构的DNA。因此随着扩增的不断进行，积累了以这一环状结构为基数的核苷酸链，反映在电泳中即表现为形成阶梯状电泳条带。

本发明还公开了一种用于上述检测方法的检测试剂盒，包括以下成分：

成分               浓度              加样量

扩增体系预混合物   2×               12.5μL

引物F3             5～15pmol/μL     1μL

引物B3             5～15pmol/μL     1μL

引物FIP            20～40pmol/μL    1μL

引物BIP            20～40pmol/μL    1μL

Bst DNA聚合酶      8U/μL            1μL

双蒸水                               5.5μL；

上述的扩增体系预混合物中含有2.5μL 10×ThermoPol反应缓冲液、4μL10mmol/L dNTP、1μL 100mmol/L硫酸镁、5μL 5mol/L甜菜碱；

其中，10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100；其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1。

此外为了测试本试剂盒的检测灵敏度，还可取不同稀释度的模板DNA，浓度分别为10⁵、10⁴、10³、10²ccu/ml，按上述步骤进行反应和检测，结果显示本检测试剂盒的检测灵敏度为100ccu/ml。

本发明的有益效果是：本发明的检测方法和传统生理生化检测方法相比，基于环介导恒温扩增的鉴定方法更适用于直接从患者含菌体液、体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次环介导恒温扩增反应就能够检测肺炎衣原体是否存在，大大提高了检测效率。相比较其他PCR方法，本方法仅需要简单是设备——恒温水浴箱、离心机或普通电泳设备(电泳仪)即可，大大提高了性价比节约了成本。环介导恒温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高、简便、快速的特点，可以快速、准确的鉴定目标菌。环介导恒温扩增鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法准确。本发明试剂盒是根据肺炎衣原体的P1基因序列为肺炎衣原体各不同菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不用来源的肺炎衣原体的可靠性；以及本试剂盒的检测灵敏度为100ccu/ml，既提供了结果观察直观、简便快速的检测途径也保证了检测的特异性和灵敏度。

附图说明

图1是环介导恒温扩增产物离心后待测样品目测沉淀结果：试管底部可见明显白色沉淀，阴性对照没有沉淀；其中1：阴性对照；2：阳性结果；

图2是环介导恒温扩增产物加入SYBR Green后染色结果：待测样品溶液呈现绿色，阴性对照为橙色；其中1：阴性对照；2：阳性结果；

图3是环介导恒温扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后检测结果：待测样品出现阶梯状条带，阴性对照没有条带；其中1：marker；2：阴性对照；3：阳性结果；

图4是本试剂盒的灵敏度检测试验结果；其中M：marker；N：阴性对照；1：模板浓度为10⁵ccu/ml；2：模板浓度为10⁴ccu/ml；3：模板浓度为10³ccu/ml；4：模板浓度为10²ccu/ml。

具体实施方式

下面就具体实施例对本发明作进一步阐述：

采用本发明的环介导恒温扩增快速检测试剂盒对临床样品进行检测，检测程序包括下列步骤：

1、待检样品DNA提取：

(1)取200μL待检样品或100μL菌培养液置于1.5mL无菌离心管中，加入600μL悬浮液(15％Chelex100树脂、100mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.1mmol/L EDTA、0.1％叠氮钠)，振荡器上充分混匀30秒；

(3)于沸水浴中煮沸10分钟，后于冰上迅速冷却；

(4)放入离心机10000转/分钟离心5～10分钟，取上清到无菌离心管中，即为待检模板DNA。

2、肺炎衣原体的环介导恒温扩增反应：

(1)其中用于环介导恒温扩增反应的试剂盒包括：

环介导恒温反应管，它包括12.5μL的扩增体系预混合物、1μL 5～15pmol/μL的引物F3、1μL 5～15pmol/μL的引物B3、1μL 20～40pmol/μL的引物FIP、1μL 20～40pmol/μL的引物BIP、5.5μL的无菌双蒸水。

其中，扩增体系预混合物中含有2.5μL 10×ThermoPol反应缓冲液、4μL10mmol/L dNTP、1μL 100mmol/L硫酸镁、5μL 5mol/L甜菜碱；10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100；

其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1。

以及8U/μL的Bst DNA聚合酶。

(2)在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶。

(3)于恒温水浴箱或金属浴中60～65℃放置45～90分钟。

(4)于80～95℃放置3～5分钟中止反应，取出观察结果。

3、结果观察：

(1)室温10,000g离心5分钟，阳性结果在试管底部可见白色沉淀(图1)；

(2)加入显色剂，阳性结果为绿色(图2)；

(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳，阳性结果有梯状电泳条带(图3)。

选择以上三种检测方法中的任意一种方法进行检测。

4、灵敏度检测：

取不同稀释度的模板DNA，浓度分别为10⁵、10⁴、10³、10²ccu/ml，按上述步骤进行检测，结果显示(如图4所示)本检测试剂盒的检测灵敏度为100ccu/ml。

SEQUENCE LISTING

<110>珠海市银科医学工程有限公司

<120>环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>F3序列

<400>1

agccaagcctactggatc                            18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>B3序列

<400>2

aacgagattgaacgctgt                                     18

<210>3

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(43)

<223>FIP序列

<400>3

accactctgcatcgtgtaaa tgtactactg ccgtagatag acc         43

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(47)

<223>BIP序列

<400>4

ggcttcattg ccttaaacat ttggagagtt tcctctaatg taaccat    47

<210>5

<211>220

<212>DNA

<213>肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，CPn)

<400>5

ttctatggga gccaagccta ctggatccgc tgctgcaaac tatactactg ccgtagatag    60

acctaacccg gcctacaata agcatttaca cgatgcagag tggttcacta atgcaggctt    120

cattgcctta aacatttggg atcgctttga tgttttctgt actttaggag cttctaatgg    180

ttacattaga ggaaactcta cagcgttcaa tctcgttggt                          220

Claims (3)

1.一种用于环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的引物，其特征在于，包括引物F3、引物B3、引物FIP以及引物BIP，序列分别如下：

F3：5-AGCCAAGCCTACTGGATC-3

B3：5-AACGAGATTGAACGCTGT-3

FIP：5-ACCACTCTGCATCGTGTAAATGTACTACTGCCGTAGATAGACC-3

BIP：5-GGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGAGAGTTTCCTCTAATGTAACCAT-3。

2.一种包括权利要求1所述的引物用于环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其中扩增体系预混合物中含有2.5μL 10×ThermoPol反应缓冲液、4μL 10mmol/L dNTP、1μL100mmol/L硫酸镁、5μL 5mol/L甜菜碱。

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